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課題

表皮細胞増殖機能を高める中分子量ヒアルロン酸またはその塩を利用することで表皮の機能を十分に改善できる表皮改善剤などを提供することを課題とする。

解決手段

本発明の表皮改善剤等は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下であり、ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が50,000以上400,000以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、40%以上であることを特徴としている。

概要

背景

従来、表皮の機能を改善する表皮改善剤として、(A)リン脂質誘導体および/又はリン脂質重合体、(B)加水分解ヒアルロン酸および/又はその塩、(C)ビルベリー抽出物、並びに(D)非イオン性界面活性剤および/又はシリコーン系界面活性剤を含有してなる表皮改善剤が知られている(特許文献1)。

特許文献1に記載の表皮改善剤は、平均分子量が1万以下の加水分解ヒアルロン酸(B)や、その他の上記成分を含むため、表皮の角質層を十分に保湿でき、加齢等によって低下した表皮の機能をやや改善できる。

ところが、特許文献1に記載の表皮改善剤は、角質層を形成する表皮細胞が増殖する機能の指標となるKi−67の陽性細胞数を十分には増やせない。斯かる陽性細胞数を十分に増やせないことから、表皮細胞増殖機能を十分に高めることができず、低下した表皮の機能を必ずしも十分に改善できないという問題を有する。

概要

表皮細胞増殖機能を高める中分子量ヒアルロン酸またはその塩を利用することで表皮の機能を十分に改善できる表皮改善剤などを提供することを課題とする。 本発明の表皮改善剤等は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下であり、ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が50,000以上400,000以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、40%以上であることを特徴としている。 なし

目的

本発明は、上記問題点等に鑑み、表皮細胞増殖機能の指標マーカーであるKi−67の陽性細胞数を十分に増やすことで、表皮細胞増殖機能を高め、低下した表皮の機能を十分に改善できる表皮改善剤及び皮膚外用組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ヒアルロン酸又はその塩を含み、前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が50,000以上400,000以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、40%以上である、表皮改善剤

請求項2

ヒアルロン酸又はその塩を含み、前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下である、表皮改善剤。

請求項3

ヒアルロン酸又はその塩を含み、前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下であり、前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が50,000以上400,000以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、40%以上である、表皮改善剤。

請求項4

請求項1〜3のいずれか1項に記載の表皮改善剤を含有する、皮膚外用組成物

請求項5

アスコルビン酸誘導体トコフェロールの誘導体、キチンの誘導体、及び、キトサンの誘導体からなる群から選択された少なくとも1種をさらに含む、請求項4に記載の皮膚外用組成物。

請求項6

更年期における皮膚の老化を抑制するための、請求項4又は5に記載の皮膚外用組成物。

技術分野

0001

本発明は、表皮改善剤、及び、該表皮改善剤を含む皮膚外用組成物に関する。

背景技術

0002

従来、表皮の機能を改善する表皮改善剤として、(A)リン脂質誘導体および/又はリン脂質重合体、(B)加水分解ヒアルロン酸および/又はその塩、(C)ビルベリー抽出物、並びに(D)非イオン性界面活性剤および/又はシリコーン系界面活性剤を含有してなる表皮改善剤が知られている(特許文献1)。

0003

特許文献1に記載の表皮改善剤は、平均分子量が1万以下の加水分解ヒアルロン酸(B)や、その他の上記成分を含むため、表皮の角質層を十分に保湿でき、加齢等によって低下した表皮の機能をやや改善できる。

0004

ところが、特許文献1に記載の表皮改善剤は、角質層を形成する表皮細胞が増殖する機能の指標となるKi−67の陽性細胞数を十分には増やせない。斯かる陽性細胞数を十分に増やせないことから、表皮細胞増殖機能を十分に高めることができず、低下した表皮の機能を必ずしも十分に改善できないという問題を有する。

先行技術

0005

特開2009−149624号公報

発明が解決しようとする課題

0006

本発明は、上記問題点等に鑑み、表皮細胞増殖機能の指標マーカーであるKi−67の陽性細胞数を十分に増やすことで、表皮細胞増殖機能を高め、低下した表皮の機能を十分に改善できる表皮改善剤及び皮膚外用組成物を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0007

本発明に係る表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が50,000以上400,000以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、40%以上であることを特徴としている。

0008

本発明に係る表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下であることを特徴としている。

0009

本発明に係る表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下であり、
前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が50,000以上400,000以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、40%以上であることを特徴としている。

0010

本発明に係る皮膚外用組成物は、上記のいずれかの表皮改善剤を含有することを特徴としている。

0011

本発明に係る皮膚外用組成物は、アスコルビン酸誘導体トコフェロールの誘導体、キチンの誘導体、及び、キトサンの誘導体からなる群から選択された少なくとも1種をさらに含むことが好ましい。

0012

本発明に係る皮膚外用組成物は、更年期における皮膚の老化を抑制するためのものであることが好ましい。

発明の効果

0013

本発明の表皮改善剤及び皮膚外用組成物は、表皮細胞増殖機能の指標マーカーであるKi−67の陽性細胞数を十分に増やすことで、低下した表皮細胞増殖機能を高め、表皮の機能を十分に改善できるという効果を奏する。

図面の簡単な説明

0014

角質層のタンパク質の量を指標にして角質強度を評価した結果を示すグラフ
水分蒸散量(TEWL)を指標にして角質強度を評価した結果を示すグラフ。

0015

本発明に係る表皮改善剤の実施形態について以下に説明する。

0016

本実施形態の表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、該ヒアルロン酸又はその塩の総量に対して、分子量が50,000以上400,000以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、40%以上である。
又は、本実施形態の表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、該ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下である。
本実施形態の表皮改善剤は、上記のヒアルロン酸又はその塩を含むことから、表皮細胞増殖機能の指標マーカーを高めて、表皮細胞増殖機能を十分に高めることができる。よって、低下した表皮の機能を十分に改善できる。

0017

本実施形態の表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下であり、且つ、前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が50,000以上400,000以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、40%以上であることが好ましい。

0018

上記のヒアルロン酸は、N−アセチルグルコサミングルクロン酸とが結合した二糖単位がつながった鎖状構造を有する、ムコ多糖高分子化合物である。上記の中分子量ヒアルロン酸又はその塩は、一般的な方法によって得ることができる。例えば、数平均分子量が100万程度の高分子量ヒアルロン酸又はその塩を、酵素希酸によって加水分解した後に、透析処理することによって得ることができる。具体的には、数平均分子量が100万程度の高分子量ヒアルロン酸(キューピー社、製品名「ヒアルロンサンHA」)を希塩酸によって室温で加水分解処理した後、得られた低分子物を透析処理によって取り除くことで、上記の中分子量ヒアルロン酸を含む表皮改善剤を調製できる。
上記の中分子量ヒアルロン酸の製造方法は、特に限定されず、中分子量ヒアルロン酸として市販品を用いることもできる。市販品としては、例えば、キッコーマバイオケミファ社製、製品名「ヒアルロン酸Na−FCHSU」が挙げられる。

0019

ヒアルロン酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩カリウム塩アンモニウム塩マグネシウム塩カルシウム塩亜鉛塩アルミニウム塩などが挙げられる。ヒアルロン酸の塩の分子量は、後述するGPC測定によって得られる値である。

0020

本実施形態の表皮改善剤において、ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下である。詳しくは、上記の表皮改善剤に含まれるヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、100,000以上300,000以下である。
数平均分子量が100,000以上300,000以下であることにより、表皮細胞増殖機能を十分に高め、低下した表皮の機能を十分に改善できる。

0021

上記の数平均分子量は、100,000よりも大きく200,000以下であることが好ましい。150,000以上であることがより好ましい。これにより、表皮細胞増殖機能をより十分に高め、低下した表皮の機能をより十分に改善できるという利点がある。

0022

上記の数平均分子量は、後述するGPC測定において、分子量が5,000以上400万以下の範囲におけるヒアルロン酸の数平均分子量である。

0023

本実施形態の表皮改善剤は、分子量が50,000未満のヒアルロン酸又はその塩をさらに含んでもよく、また、分子量が400,000よりも大きいヒアルロン酸又はその塩をさらに含んでもよい。

0024

上記の分子量及び数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって測定される。上記の分子量は、標準プルラングルコース換算値である。なお、平均分子量の値については、重量平均分子量ではなく、数平均分子量の値を採用する。上記の分子量及び数平均分子量の測定方法については、実施例において詳しく説明する。

0025

本実施形態の表皮改善剤において、ヒアルロン酸及びその塩の全体に対して、分子量が5万〜40万の範囲のヒアルロン酸(中分子量ヒアルロン酸)が占める割合(含有率)は、40%以上である。これにより、表皮細胞増殖機能の指標マーカーであるKi−67の陽性細胞数を十分に増やすことができ、表皮を活性化し、低下した表皮機能を十分に改善できる。斯かる割合は、55%以上であることが好ましく、65%以上であることがより好ましい。

0026

上記の中分子量ヒアルロン酸の割合(含有率)は、GPC測定で得られた結果を基にして、下記のような方法によって決定される。
GPC測定によって得られた分子量分布曲線を基にして、積分分布を示すスライスデータを求める。スライスデータを基にして、5万〜40万の指定分子量範囲分画し、上記の割合(含有率)を算出する。

0027

上記の表皮改善剤は、中分子量ヒアルロン酸又はその塩を0.02質量%以上5質量%以下含むことが好ましい。

0028

上記の表皮改善剤は、分子量が50,000以上400,000以下のヒアルロン酸又はその塩(中分子量ヒアルロン酸)を多く含むため、表皮細胞増殖マーカーであるKi−67の発現を十分に高めることができ、表皮の機能を十分に改善することができる。ところで、女性ホルモンエストラジオール)も、表皮細胞増殖マーカーであるKi−67の発現を促進できるが、上記のヒアルロン酸又はその塩に比べて、刺激性が高い。そのため、女性ホルモンを累積的に人体等に使用すると、副作用が生じ得る

0029

なお、皮膚の老化によって、皮膚コラーゲンが減少し、表皮が薄くなることが知られている。これに対して、皮膚の老化に伴って上昇するコルチゾール修飾酵素阻害することで、表皮細胞増殖マーカーであるKi−67陽性細胞を増加させることができ、Ki−67陽性細胞の増加に伴って、表皮が肥厚するとともに、表皮が改善されることが報告されている(コスメトロジー研究報告Vol.22, 123-129、2014)。

0030

上記の表皮改善剤は、Ki−67などの表皮細胞増殖因子の発現を促進できる他、デスモグレイン(デスモグレイン−1)の細胞接着作用を高めることもできる。これにより、上記の表皮改善剤は、更年期において皮膚の表皮の機能が低下して角質強度が低下することを抑制することができる。即ち、上記の表皮改善剤は、角質強度を高める作用を有する。これによっても、表皮(角質層)の機能を十分に改善することができる。

0031

角質強度とは、角質層内部のintegrity(整合性)を示し、その強度は角質細胞同士の接着状態に依存している。角質強度は、角質層に対してテープストリッピングをした後に、角質層のタンパク質の量や水分蒸散量(TEWL)を測定し、その結果を指標にして、推定できる。

0032

上記の表皮改善剤は、更年期の年齢に達して女性ホルモンの分泌が減少した女性に適用することによって、更年期において表皮機能が低下したり、角質強度が減少(角質層結合力が減少)したりする、表皮の老化を抑制できる。上記の表皮改善剤は、例えば簡略更年期指数SMI)が20以上の女性に適用されることにより、適用された女性に高い満足度を与えることができる。更年期障害に伴う皮膚の老化については、下記のような研究が行われている。

0033

更年期は、女性においては、女性ホルモンの分泌量が急激に低下する時期であり、おおむね45〜55の時期である。更年期には、皮膚のタルミカサツキハリの低下、皮膚弾性の低下などが目立つようになり、更年期における皮膚は、老化現象を起こすと考えられている。近年、卵巣摘出したマウス更年期モデルとして活用して研究を行った結果、更年期になると、皮膚の萎縮や角質強度の低下がマウスでも起こることが報告されている。一般的に、更年期の女性では、女性ホルモンの分泌が急激に減少することが知られている。これに伴い、皮膚の老化が進行して、皮膚のタルミが増加し、ハリが低下し、皮膚弾性が低下することが報告されている(日本更年期医学雑誌、第8巻、p.33-40 [2000])。このような現象が起こる原因の一つとして、更年期に女性ホルモンの分泌量が低下することに伴って、皮膚のコラーゲン等の量が減少することが報告されている(Maturitus 15 p.113-119 1992, Br J ObstetGynecol 100 p.154-156 1993)。しかしながら、更年期にコラーゲン量が減少するメカニズムは、解明されていない。
これに対して、コラーゲン量の減少を防止する方法として、女性ホルモンを女性に投与する方法が知られているが、それ以外の有効な方法は、特に見出されていない。一方で、女性ホルモンを投与すると、副作用が発生するという危惧があり、女性ホルモンを配合した製剤を製品として販売することは、安全性の点で制限される場合が多く、現実的でない。

0034

上記の表皮改善剤は、通常、皮膚の表皮(角質層)に塗布されて使用される。上記の表皮改善剤は、経口投与されて使用されてもよい。

0035

次に、本発明に係る皮膚外用組成物の実施形態について説明する。

0036

本実施形態の皮膚外用組成物は、上記の表皮改善剤を含む。本実施形態の皮膚外用組成物は、上記の表皮改善剤以外に、アスコルビン酸(ビタミンC)やトコフェロール(ビタミンE)の誘導体などの活性酸素ラジカル消去剤、キチンの誘導体、キトサンの誘導体、高級アルコール液状油乳化剤、又は、水溶性高分子化合物などをさらに含むことが好ましい。

0037

上記の皮膚外用組成物は、分子量を問わずヒアルロン酸又はその塩を0.04質量%以上10質量%以下含むことが好ましい。上記の皮膚外用組成物は、上記の中分子量ヒアルロン酸又はその塩を0.02質量%以上5質量%以下含むことが好ましい。
上記の皮膚外用組成物は、中分子量ヒアルロン酸よりも分子量が大きいヒアルロン酸や、中分子量ヒアルロン酸よりも分子量が小さい加水分解ヒアルロン酸等をさらに含んでもよい。上記の皮膚外用組成物においては、本実施形態のように、ヒアルロン酸及びその塩の全体に対して、分子量が5万〜40万の範囲のヒアルロン酸(中分子量ヒアルロン酸)が占める割合(含有率)が40%以上であることが好ましい。これにより、表皮を十分に活性化でき、低下した表皮機能を十分に改善することができる。

0038

本実施形態の皮膚外用組成物は、アスコルビン酸の誘導体、トコフェロールの誘導体、キチンの誘導体、及び、キトサンの誘導体からなる群から選択された少なくとも1種をさらに含むことがより好ましい。

0039

アスコルビン酸の誘導体は、両親媒性を示すものであることが好ましい。アスコルビン酸の誘導体としては、例えば、パルミチン酸アスコルビルリン酸3Na、アスコルビン酸セチルエーテルグリセリルアスコルビン酸ミリスチル3−グリセリルアスコルビン酸等が挙げられる。

0040

トコフェロールの誘導体は、両親媒性を示すものであることが好ましい。トコフェロールの誘導体としては、例えば、ニコチン酸トコフェロールリン酸トコフェロールナトリウム塩、コハク酸トコフェロールトコフェリルリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。

0041

キチンの誘導体としては、例えば、カルボキシメチルキチン、硫酸化キチン、ミリストイル化キチン塩等が挙げられる。

0042

キトサンの誘導体としては、例えば、カルボキシメチルキトサン、キトサン乳酸塩、又は、部分ミリストイル化カルボキシメチルキトサン等の部分アシル化カルボキシメチルキトサン、カルボキシメチルキトサンサクシナミド、カルボキシメチルキトサンミリスタミド、ヒドロキシプロピルキトサン、カルボキシメチルキトサンラウラミド等が挙げられる。

0043

上記の高級アルコールは、炭素数が10以上24以下の脂肪族アルコールである。具体的に、高級アルコールとしては、ベヘニルアルコールアラキジルアルコールステアリルアルコールパルミチルアルコールミリスチルアルコールラウリルアルコールヒドロキシステアリルアリコールの少なくとも1種が好ましい。本実施形態の皮膚外用組成物が、高級アルコールとアルキルグルコシドとの複合体(SEPPIC社、MONTANOVシリーズ)を含むことにより、上記の中分子量ヒアルロン酸又はその塩の作用が高まる。斯かる複合体を含む皮膚外用組成物は、更年期における皮膚の老化を抑制するための組成物として好ましい。

0047

本実施形態の皮膚外用組成物は、上記の他にも、一般的な化粧料外用剤等に配合される成分を、本実施形態の効果や機能を阻害しない範囲で、含み得る。本実施形態の皮膚外用組成物が含み得る成分としては、例えば、ジプロピレングリコール、グリセリン、ペンチレングリコール、プロピレングリコール、ジグリセリン等の多価アルコール類トリメチルシロキシケイ酸メチルフェニルポリシロキサン等のシリコーン化合物類パーフルオロポリエーテル等のフッ素化合物類等の液状油剤が挙げられる。また、本実施形態の皮膚外用組成物が含み得る成分としては、例えば、保湿柔軟化剤抗酸化剤収斂剤美白剤抗菌剤抗炎症剤紫外線吸収剤紫外線散乱剤水溶性ビタミン類油溶性ビタミン類、酵素等の医薬部外品原料規格化粧品種別配合成分規格、化粧品原料基準日本薬局方食品添加物公定書規格等に記載の成分が挙げられる。

0048

本実施形態の皮膚外用組成物は、更年期における皮膚の老化(老化症状)を抑制するためのものであることが好ましい。更年期における皮膚の老化症状としては、例えば、皮膚のタルミ、カサツキ、ハリの低下、皮膚弾性の低下などが挙げられる。

0049

本実施形態の皮膚外用組成物は、例えば、固形状、溶液エマルジョンなどの液状、粉末状(パウダー)、ゲル状などの状態になり得る。

0050

本実施形態の皮膚外用組成物の具体的な用途は、例えば、化粧料である。化粧料の具体例は、1)局所又は全身用皮膚洗浄料又は皮膚塗布用化粧料、2)頭皮頭髪に適用する薬用及び/又は化粧用頭髪用化粧料、3)浴湯に投じて使用する浴用化粧料、4)皮膚貼付用シート化粧用シート化粧用コットンウェットティッシュなどの皮膚貼付用化粧料などである。より具体的な例としては、ローション乳液クリーム軟膏ジェル美容液オイルなどの基礎化粧料、又は、ファンデーション口紅アイシャドウアイライナーマスカラなどのメークアップ化粧料などが挙げられる。また、例えば、顔面含浸パックなどのシートミスト用などのスプレーアンプルなどにおいて、皮膚外用組成物が用いられる。

0051

本実施形態の皮膚外用組成物は、皮膚(頭皮を含む)の表皮に塗布するなどして適用されることが可能な皮膚外用剤などであり、薬事法上の化粧料、医薬部外品、医薬品等分類には特に拘束されず、様々な分野に適用される。

0052

本発明の表皮改善剤及び皮膚外用組成物は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の実施形態に限定されるものではない。また、本発明では、一般の表皮改善剤及び皮膚外用組成物において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。

0053

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

0054

(実施例1,2)
実施例1の表皮改善剤として、製品名「ヒアルロン酸Na−FCHSU」(キッコーマンバイオケミファ社製)を用意した。実施例2の表皮改善剤として、製品名「ヒアルロンサンHA−LQH」(キューピー社製)を希塩酸に溶解した後、室温で2時間処理し、透析処理後、凍結乾燥することによって調製したものを用意した。

0055

(比較例1〜4)
比較例1の表皮改善剤として、製品名「ヒアルロン酸Na−FCH60」(キッコーマンバイオケミファ社製)を用意した。比較例2の表皮改善剤として、製品名「ヒアルロンサンHA−LQ」(キューピー社製)を用意した。比較例3の表皮改善剤として、製品名「ヒアロオリゴ」(キューピー社製)を用意した。比較例4の表皮改善剤として、製品名「マイクロヒアルロン酸」(キッコーマンバイオケミファ社製)を用意した。

0056

ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を利用して、各実施例、各比較例に含まれるヒアルロン酸(ナトリウム塩)の数平均分子量を、以下のようにして求めた。また、下記の条件により、GPC測定を行い、分子量分布曲線から、分子量が5万〜40万の範囲の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が、全ヒアルロン酸又はその塩に占める割合(含有率)を求めた。

0057

<ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)による分子量の測定>
(1)前処理方法
試料溶離液にて溶解後、0.45μmメンブランフィルターでろ過したものを測定溶液として調製した。
(2)測定条件
測定機器島津製作所社製製品名「GPC−HPLCコントローラーSCL−10AVP
カラム:TSKgelGMPWXL×2+G2500PWXL×1
(7.8mm I.D.×300mm×3本)
溶離液:200mM硝酸ナトリウム水溶液
流量:1.0 mL/min.
検出器RI検出器(Viscotek LR125 Laser Refractometer)
カラム温度:40℃
注入量:200μL
分子量標準:標準プルラン・グルコース(American Polymer StandardsCorp.社製)
(3)分子量及び数平均分子量の測定
分子量:上記の標準プルラン・グルコースの換算値
数平均分子量:付属ソフトウェアデータ解析ソフト「マルチステーションGPC−8020」(東ソー社製)

0058

実施例1及び2、比較例1〜4の表皮改善剤について、上記のようにしてGPC測定を行った。測定結果を表1に示す。
なお、GPC測定において、5,000以上400万以下の分子量範囲における、数平均分子量を求めた。また、5,000以上400万以下の分子量範囲のヒアルロン酸の量を基準にして、分子量が5万〜40万の範囲の中分子量ヒアルロン酸の含有率を求めた。

0059

0060

<表皮細胞増殖機能に関わる評価>
次元ヒト皮膚モデルクラボウ社製、EFT−400、表皮モデル)の表面に、下記の各液(50μL)をそれぞれ添加し、37℃、5容量%CO2存在下で、皮膚モデルを培養した。培地として、皮膚モデル用培地「EFT−400MM」(クラボウ社製)を用いた。
PBS(−):コントロール
・実施例1,2及び比較例1〜4の各ヒアルロン酸の1.0質量%水溶液
・エストラジオール製剤(市販品製品名「エストロジェル」)陽性対照
β−エストラジオール(シグマE2758)の0.06重量%水溶液
(エストラジオール分散のためのエタノールを1%含む)
4日間培養後、皮膚モデルの表面を生理食塩水で10回洗浄した。その後、4%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、定法に従い薄切切片を作製した。以下の方法で免疫染色を行い、Ki−67陽性細胞の数を確認した。

0061

(Ki−67陽性細胞の数の確認)
薄切切片を脱パラフィン処理した後に、Blockingone(ナカライテスク社製#03953095)に室温で15分間浸漬し、非特異タンパクブロッキングを行った。生理食塩水で洗浄した後、一次抗体であるAnti-Human Ki-67 Mouse monoclonal antibody clone:MIB-1(DAKO社製 #M7240)を500倍希釈したものに、4℃で一晩浸漬した後、生理食塩水で洗浄した。次に、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGポリクロナール抗体(ニチレイ社製#424134)と、室温で30分間反応させた。さらに、3-Amino-9-ethyl-arbazole(AEC)と室温で20分間接触させて、発色させた後、ヘマトキシリン(Mayer社製)を用いて対比染色した。この皮膚切片像の拡大画像から、Ki−67陽性細胞の数を測定した。結果を表2に示す。

0062

0063

<角質強度を評価する試験
表2からも明らかなように、各実施例のヒアルロン酸(表皮改善剤)によって、皮膚表皮に見られるKi−67陽性細胞の数が、コントロールと比較して2.23〜2.65倍に増えた。このことから、各実施例のヒアルロン酸が、Ki−67陽性細胞数を増やし、表皮細胞増殖機能を高める作用を有することが確認された。その作用は、各比較例のヒアルロン酸よりも優れ、エストラジオールを女性ホルモンとして含有するエストラジオール製剤と同等かそれ以上であった。一方、陽性対照のエストラジオール含有製剤は、Ki−67陽性細胞を増殖させる高い作用を有するが、皮膚細胞に対して毒性を示した。

0064

続いて、角質層に対してテープストリッピングをした後に、角質層のタンパク質の量を測定すること、また、水分蒸散量(TEWL)を測定することによって、角質強度を評価した。
角質強度は、角質層内部のintegrity(整合性)を示す。角質強度は、角質細胞同士の接着状態に依存する。角質細胞同士は、コルネオデスモソームによって接着している。角質層では、角質細胞が外側へ移動するに従ってコルネオデスモソームが分解され、角質細胞が最外層剥離する。角質強度が弱い状態とは、角質層内部においてコルネオデスモソームによって接着している角質細胞同士の接着が弱いために、角質細胞が剥がれやすい状態である。そこで、テープストリッピングを行うと、最外層の角質細胞だけでなく、内側の角質細胞も重なった状態で剥がれ(重層剥離が起こり)、テープストリッピング後の水分蒸散量が多くなる。従って、角質層に対してテープストリッピングをした後に、テープ側に付着した角質層のタンパク質の量(重層剥離量)を測定することによって、角質強度を評価することができる。また、テープストリッピング前後の水分蒸散量(TEWL)の差によって、角質強度を評価することができる。

0065

更年期である45〜55歳の女性21名を2群に分けた。一方の群を、プラセボローション使用群(10名)とし、他方の群を、実施例1のヒアルロン酸を固形分で1質量%含有するローション使用群(11名)とした。各ローションを1日2回(および晩)左腕に塗布した。試験開始前と、4週間経過後とにおいて、角質層のタンパク質の量、及び、水分蒸散量を以下の方法にて測定した。

0066

0067

(1.角質層のタンパク質の量の測定)
前腕内側部の角質層に、角質層採取用テープであるD−Squame(CuDerm社製)を貼り付け、同社加圧装置を10秒間押し当てた後に、テープを剥がし取った。角質層タンパク質量測定装置SquameScan850(CuDerm社製)に、剥がし取ったテープをセットして、テープにおける角質層のタンパク質の量を測定した。この装置では、赤外線(850nm)吸収率からタンパク質の量を数値化できる。角質強度が弱い角質層は、角質層内部の接着が弱いため、テープストリッピングによって重層剥離する。このため、角質強度が弱い程、剥がれ取られるタンパク質の量は、多くなる。
試験を開始する前の角質層のタンパク質の量を100とした。各モニターの4週間後における角質層のタンパク質の量を測定し、角質層のタンパク質の量の変化量を、下記の式によって算出した。結果を比較したグラフを図1に示す。
角質強度(角質層タンパク質の変化量)=
4週間使用後の吸収率(A850)/試験前の吸収率(A850)
図1から把握されるように、ヒアルロン酸含有ローション使用群では、テープストリッピング後の角質層タンパク質の量が、プラセボローション使用群よりも、有意に少なくなった。

0068

(2.水分蒸散量ΔTEWLの測定)
前腕を洗浄した後、23℃、湿度50%環境下にて20分間安静にした。その後、前腕内側部の水分蒸散量(TEWL)を、携帯型閉チャンバー方式水分蒸散量測定装置APSCAN AS−VT100RS(アサヒバイオメッド社製)を用いて測定した。
測定後、角質層採取用テープであるD−Squame(CuDerm社製)を前腕に貼り付け、同社の加圧装置を10秒間押し当てた後に、テープを剥がし取った。同様にして合計10回、角質層を取り、10回目の角質層を取った後の水分蒸散量(TEWL)を測定した。角質強度は、下記の式から算出した値(ΔTEWL)を基にして評価した。なお、角質強度は、角質層を取った後の水分蒸散量(TEWL)と、角質層を取る前の水分蒸散量(TEWL)との差が大きいほど弱く、差が小さいほど強い。結果を図2に示す。
ΔTEWL=4週間使用後の角質層を剥がす前のTEWL−
4週間使用後の10回角質層を剥がした後のTEWL
図2から把握されるように、テープストリッピング前後の水分蒸散量の差(ΔTEWL)も、ヒアルロン酸含有ローション使用群の方で、プラセボローション使用群よりも有意に少なくなった。

0069

<更年期における皮膚症状改善作用の評価>
更年期障害の重症度を示す指標としては、クッパーマン指数、簡略更年期指数(SMI)、日本産婦人科学会による更年期症状評価表等がある。本評価では、日本人を対象として作成され、且つスコア化が可能なSMI更年期指数を用いた。SMIとは、簡略更年期指数[小山ら(1992)]の質問票に従って、更年期の重症度をスコア化したものである。50点以下においては、食事運動などの生活習慣を整える程度での改善が見込まれるが、51点以上においては、医療機関受診する必要がある。受診を必要とするレベルか否かの区切りとなるSMIスコア51点を境界として、モニターを2つのセグメントに分けた。

0070

下記に示す組成の美容液を、以下の方法により調製した。下記の処方例は、美容液の処方の一例である。組成を下記に示す。

0071

(美容液の組成)
配合成分 配合量(質量%)
油相
ミネラルオイル2.8
ポリオキシエチレン(20E.O)ステアリンソルビタン0.7
モノステアリン酸ソルビタン0.2
アラキルアルコール1.5
アラキルグルコシド0.5
ベヘニルアルコール0.5
シア脂1.5
水相
実施例1のヒアルロン酸(固形分) 0.5
グリセリン5.0
1,3−ブチレングリコール4.0
カルボキシメチルキトサンミリスタミド 0.1
パルミチン酸アスコルビルリン酸3Na 0.1
精製水残量(合計:100にする)

0072

美容液は、次のようにして調製した。油相を80℃で加熱して溶解させた後、実施例1のヒアルロン酸(有効成分)を含む水相に、溶解させた油相を徐々に添加し、ホモミキサーで均一に分散(3000rpm、2分処理)させた。さらに、脱気しつつ、30℃まで冷却しながら、ホモミキサー(3000rpm、2分処理)で均一に分散させた。そして、濾過することにより、美容液(乳化物)を調製した。
また、ヒアルロン酸を配合しない点以外は、同様にして、比較用の美容液を調製した。

0073

簡略更年期指数(SMI)が26〜50である、45〜55の女性ボランティア20名を被験者とした。年齢及びSMI値が均等になるように、被験者を2群(中分子量ヒアルロン酸を含む美容液の使用群:10名、中分子量ヒアルロン酸を含有しない美容液の使用群:10名)に分けた。左右の頬部に、上記のごとく調製した美容液を1日に2回塗布し、8週間使用してもらった。終了後、自己評価によって、使用前と比較することで、肌の改善効果を評価した。
上記のごとく調製した中分子量ヒアルロン酸を含む美容液の使用群に関する結果を下記に示す。
使用前に比べて、
肌の状態が改善 (改善+やや改善:70%)
肌のカサツキが改善 (改善+やや改善:80%)
肌のハリ弾力が改善 (改善+やや改善:50%)
肌のかゆみが改善 (改善+やや改善:50%)

0074

一方、中分子量ヒアルロン酸を含有しない美容液の使用群に関する結果を下記に示す。
使用前に比べて、
肌の状態が改善 (改善+やや改善:50%)
肌のカサツキが改善 (改善+やや改善:40%)
肌のハリ弾力が改善 (改善+やや改善:20%)
肌のかゆみが改善 (改善+やや改善:30%)

0075

実施例1のヒアルロン酸を含有する製剤は、改善+やや改善の回答率が50〜80%を示したのに対して、比較用美容液を用いた場合、ほとんどの項目において、改善+やや改善の回答率が50%以下であった。本発明の皮膚外用組成物は、更年期の皮膚改善に有用であることが示唆された。

0076

次に、簡略更年期指数(SMI)が51以上である、45〜55才の女性ボランティア20名を被験者にして評価を同様に遂行した。年齢及びSMI値が均等になるように、被験者を2群(中分子量ヒアルロン酸を含む美容液の使用群:10名、中分子量ヒアルロン酸を含有しない美容液の使用群:10名)に分けた。左右の頬部に、上記のごとく調製した美容液を1日に2回塗布し、8週間使用してもらった。終了後、自己評価によって、使用前と比較することで、肌の改善効果を評価した。
上記のごとく調製した中分子量ヒアルロン酸を含む美容液の使用群に関する結果を下記に示す。
使用前に比べて、
肌の状態が改善 (改善+やや改善:80%)
肌のカサツキが改善 (改善+やや改善:90%)
肌のハリ弾力が改善 (改善+やや改善:70%)
肌のかゆみが改善 (改善+やや改善:60%)

0077

一方、中分子量ヒアルロン酸を含有しない美容液の使用群に関する結果を下記に示す。
使用前に比べて、
肌の状態が改善 (改善+やや改善:40%)
肌のカサツキが改善 (改善+やや改善:40%)
肌のハリ弾力が改善 (改善+やや改善:20%)
肌のかゆみが改善 (改善+やや改善:20%)

実施例

0078

実施例1のヒアルロン酸を含有する製剤は、改善+やや改善の回答率が60〜90%を示したのに対して、比較用美容液を用いた場合、ほとんどの項目において、改善+やや改善の回答率が40%以下であった。
簡略更年期指数(SMI)が51以上を示すモニターに対して、更に高い有用性を示すことが示唆された。

0079

本発明の表皮改善剤及び皮膚外用組成物は、例えば、皮膚外用剤として皮膚に塗布されて、表皮の角化を改善するために、好適に使用できる。
表皮の角化を改善することにより、皮膚のタルミ、カサツキ、ハリの低下、皮膚弾性の低下を抑制することが期待できる。

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