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図面 (5)

課題

RNA医薬等の送達性や細胞膜透過性に寄与できるRNA導入試薬を提供する。

解決手段

RNA導入試薬は、2個以上の細胞性接着モチーフ単位と、1個以上のスペーサー単位と、を備え、前記1個以上のスペ−サー単位が前記2個以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している。

概要

背景

がんをはじめ、遺伝子変異遺伝子発現異常が原因又は関連している遺伝子関連疾患は多数知られている。がん細胞を始めとして各種細胞は、その表面に細胞接着因子発現している。例えば、がん細胞の表面には細胞接着因子としてインテグリンαvβ3が強く発現していることが知られている。

siRNA等のRNA医薬は、mRNA直接作用する薬剤であって、細胞へ浸透後は、標的分子に対する特異性が高く、細胞質で働くため核内ゲノムDNAへの影響が少なく、しかも作用メカニズムも明確である。このためRNA医薬は、遺伝子関連疾患への適用が期待されている。

一方、RNA医薬は、標的選択性は高いものの、標的組織までの選択的輸送及び細胞膜透過が困難であるほか分解されやすいため、リポソームなどのリピッドナノパーティクル(Lipid Nano Particle、LNP)を用いてRNA複合体を調製し、RNA医薬に、細胞選択能、送達機能、細胞膜透過機能及び保護機能を持たせようとする開発や、有効性強化のためリボース環への修飾などがこれまで進められてきている(特許文献1〜4)。

概要

RNA医薬等の送達性や細胞膜透過性に寄与できるRNA導入試薬を提供する。RNA導入試薬は、2個以上の細胞性接着モチーフ単位と、1個以上のスペーサー単位と、を備え、前記1個以上のスペ−サー単位が前記2個以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している。なし

目的

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請求項1

RNA導入試薬であって、2個以上の細胞性接着モチーフ単位と、1個以上のスペーサー単位と、を備え、前記1個以上のスペ−サー単位が前記2個以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している、RNA導入試薬。

請求項2

前記細胞性接着モチーフ単位はペプチドを含んでいる、請求項1に記載の試薬。

請求項3

前記細胞接着性モチーフ単位はRGDペプチドを含む、請求項1又は2に記載の試薬。

請求項4

前記スペーサー単位は、ポリオキシアルキレン基を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の試薬。

請求項5

前記スペーサー単位は、前記2個以上の細胞接着性モチーフ単位を、少なくとも2nm以上離間する、請求項1〜4のいずれかに記載の試薬。

請求項6

ぺプチド誘導体であって、2個以上のペプチド単位と、1個以上の非ペプチド性単位と、を備え、前記ペプチド単位は、任意の2個以上のアミノ酸残基を有し、前記1個以上の非ペプチド単位が、前記2個以上のペプチド単位を互いに離間している、誘導体。

請求項7

前記ペプチド単位はRGDモチーフを含み、前記非ペプチド単位は、ポリアルキレンオキシ基を含む、請求項5に記載の誘導体。

請求項8

オリゴリボヌクレオチド誘導体であって、オリゴリボヌクレオチドと、2個以上の細胞性接着モチーフ単位と、1個以上のスペーサー単位と、を備え、前記1個以上のスペーサー単位が前記2個以上細胞接着性モチーフ単位を互いに離間する、細胞接着領域と、を備える、誘導体。

請求項9

前記オリゴリボヌクレオチドは、以下の式(1)又は(2)に示すヌクレオシド誘導体を含む、請求項8に記載の誘導体。(式(1)中、R1は、水酸基水素原子アルキル基又はアルケニル基置換された水酸基又は保護された基を表し、式(2)中、Xは、ハロゲン原子を表す。式(1)及び式(2)中、R2及びR4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基リン酸基、保護されたリン酸基、又は−P(=O)nR5R6(nは0又は1を示し、R5及びR6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、nが1のときには、R5及びR6が共に水素原子となることはない。)を示し、R3は、それぞれ連結基を有するNHR7(R7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。)、アジド基アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Bは、プリン−9−イル基、2−オキソ−ピリミジン−1−イル基、置換プリン−9−イル基、又は置換2−オキソ−ピリミジン−1−イル基のいずれかを表す。)

技術分野

0001

本明細書は、RNA導入試薬及びその利用に関する。

背景技術

0002

がんをはじめ、遺伝子変異遺伝子発現異常が原因又は関連している遺伝子関連疾患は多数知られている。がん細胞を始めとして各種細胞は、その表面に細胞接着因子発現している。例えば、がん細胞の表面には細胞接着因子としてインテグリンαvβ3が強く発現していることが知られている。

0003

siRNA等のRNA医薬は、mRNA直接作用する薬剤であって、細胞へ浸透後は、標的分子に対する特異性が高く、細胞質で働くため核内ゲノムDNAへの影響が少なく、しかも作用メカニズムも明確である。このためRNA医薬は、遺伝子関連疾患への適用が期待されている。

0004

一方、RNA医薬は、標的選択性は高いものの、標的組織までの選択的輸送及び細胞膜透過が困難であるほか分解されやすいため、リポソームなどのリピッドナノパーティクル(Lipid Nano Particle、LNP)を用いてRNA複合体を調製し、RNA医薬に、細胞選択能、送達機能、細胞膜透過機能及び保護機能を持たせようとする開発や、有効性強化のためリボース環への修飾などがこれまで進められてきている(特許文献1〜4)。

先行技術

0005

HELVATICACHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151
The Journal of Organic Chemistry 2012, 77, 3233-3245
Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672
The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962

発明が解決しようとする課題

0006

しかしながら、こうした試みにもかかわらず、RNA医薬の有効性の一層の向上が求められている。特に、RNA医薬の細胞選択性、送達性や細胞膜透過性に関し、LNPを用いる送達では、リポソームの粒子径の均一化や微小化が課題となっているが、未だ十分な細胞選択性、送達性や細胞膜透過性が達成されていないという問題があった。

0007

本明細書は、RNA医薬等の送達性や細胞膜透過性に寄与できるRNA導入試薬及びその利用を開示する。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、RNAの送達性や細胞膜透過性の向上に関して、細胞接着性モチーフの利用に着目した。本発明者らが種々検討したところ、こうした細胞接着性モチーフを複数個用いる場合に、複数個の当該モチーフを複数個スペーサーで互いに離間して備える化合物でRNAを修飾することで、RNAの細胞膜透過性が高まるという知見を得た。本明細書によれば、かかる知見に基づき以下の手段が提供される。

0009

[1]RNA導入試薬であって、
2個以上の細胞性接着モチーフ単位と、
1個以上のスペーサー単位と、
を備え、
前記1個以上のスペ−サー単位が前記2個以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している、RNA導入試薬。
[2]前記細胞性接着モチーフ単位はペプチドを含んでいる、[1]に記載の試薬。
[3]前記細胞接着性モチーフ単位はRGDペプチドを含む、[1]又は[2]に記載の試薬。
[4]前記スペーサー単位は、ポリアルキレンオキシ基を含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の試薬。
[5]前記スペーサー単位は、前記2個以上の細胞接着性モチーフ単位を、少なくとも2nm以上離間する、[1]〜[4]のいずれかに記載の試薬。
[6]ペプチド誘導体であって、
2個以上のペプチド単位と、
1個以上の非ペプチド性単位と、
を備え、
前記ペプチド単位は、任意の2以上のアミノ酸残基を有し、
前記1個以上の非ペプチド単位が、前記2個以上のペプチド単位を互いに離間している、誘導体
[7]前記ペプチド単位はRGDモチーフを含み、前記非ペプチド単位は、ポリオキシアルキレン基を含む、[5]に記載の誘導体。
[8]オリゴリボヌクレオチド誘導体であって、
オリゴリボヌクレオチドと、
2個以上の細胞性接着モチーフ単位と、1個以上のスペーサー単位と、を備え、前記1個以上のスペーサー単位が前記2個以上の細胞接着性モチーフ単位を互いに離間する、細胞接着領域と、を備える、誘導体。
[9]前記オリゴリボヌクレオチドは、以下の式(1)に示すヌクレオシド誘導体を含む、[8]に記載の誘導体。
(式(1)中、R1は、水酸基水素原子アルキル基又はアルケニル基置換された水酸基又は保護された基を表し、式(2)中、Xは、ハロゲン原子を表す。式(1)及び式(2)中、R2及びR4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基リン酸基、保護されたリン酸基、又は−P(=O)nR5R6(nは0又は1を示し、R5及びR6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、nが1のときには、R5及びR6が共に水素原子となることはない。)を示し、R3は、それぞれ連結基を有するNHR7(R7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。)、アジド基アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Bは、プリン−9−イル基、2−オキソ−ピリミジン−1−イル基、置換プリン−9−イル基、又は置換2−オキソ−ピリミジン−1−イル基のいずれかを表す。)

図面の簡単な説明

0010

RNA導入用試薬の構成要素を示す図である。
RNA導入用試薬の概要を示す図である。
細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーに対して細胞接着性モチーフ単位を導入するスキームを示す図である。なお、スキームの最後の化合物には、2個の細胞接着性モチーフ単位と3個のスペーサー単位が導入された状態を示す。
コンジュゲートによる細胞膜透過性の評価結果を示す図である。
コンジュゲートによる遺伝子発現抑制の評価結果を示す図である。

0011

本明細書の開示は、RNA医薬等に好適である、RNAの細胞への導入試薬及びその利用に関する。図1及び図2に例示するように、本明細書に開示されるRNA導入試薬(以下、本試薬ともいう。)は、2以上の細胞接着性モチーフ単位が1以上のスペーサー単位で離間した構造を有することができる。推論であって本開示を必ずしも拘束するものではないが、このような離間構造を有するため、2以上の細胞接着性モチーフ単位が、細胞表面において多数かつ流動的に存在すると考えられるインテグリンなどの細胞接着分子との間で相互作用を生じやすくなり、その結果、本試薬と複合体を形成するオリゴリボヌクレオチドが細胞表面と相互作用しやすくなり、その結果、オリゴリボヌクレオチドの細胞内への導入効率が高まるものと考えられる。

0012

本試薬は、2以上の細胞接着性モチーフ単位を、1以上のスペーサー単位を介在させるようにしてこれらの単位を直列して連結させた直鎖状構造を有することができる。本発明者らによれば、分岐した骨格の先端部に細胞接着性モチーフ単位を並列的に有する分岐状構造よりも、既述の直鎖状構造を有するようにすることで、離間構造の設計の自由度が高いため、容易にかつ高い自由度で離間構造を設計できるとともに、意外にも細胞表面の細胞接着分子と相互作用する確率を確保又は向上できることを見出している。なお、本試薬は、少なくとも直鎖状構造を有していることが好ましいが、こうした直鎖状構造を複数分岐又は並列して備える分枝状構造を有していてもよい。

0013

本試薬のいずれかの末端にオリゴリボヌクレオチドを共有結合により結合して複合体とするか、あるいはかかる直鎖状構造体とオリゴリボヌクレオチドと共有結合以外の相互作用で複合化して複合体とすることで、オリゴリボヌクレオチドの細胞内への導入効率を高めることができる。

0014

以下、本明細書の開示の各種実施形態について詳細に説明する。

0015

(RNA導入試薬)
本試薬は、2以上の細胞性接着モチーフ単位と、1以上のスペーサー単位と、とを備えることができる。

0016

(細胞接着性モチーフ単位)
細胞接着性モチーフ単位は、細胞表面に発現する細胞接着分子に対して相互作用して結合することができる分子を有するモチーフであって、細胞接着分子との相互作用に寄与するモチーフ(以下、細胞接着性モチーフともいう。)を含むことができる。

0017

細胞接着性モチーフは、例えば、公知の細胞接着分子に結合するリガンド由来することができる。例えば、細胞接着分子は、概してタンパク質であり、細胞外タンパク質であってもよいし、細胞膜タンパク質であってもよい。また、細胞接着分子は、細胞−細胞接着を担うものであってもよく、細胞−細胞外マトリックス接着を担うものであってもよい。

0018

細胞接着分子としては種々知られている。動物細胞において、細胞−細胞接着を担う細胞接着分子としては、カドヘリン免疫グロブリンスーパーファミリーネクチン等が挙げられる。また、細胞−細胞外マトリックス接着を担う細胞接着分子(細胞側:レセプター、タンパク質)としては、インテグリン、サルコグリカン、βジストログリカンが挙げられ、タンパク質である細胞接着分子(細胞外マトリックス側:リガンド)としては、フィルブロネクチン、ラミニンビトロネクチンコラーゲンテネイシンフィブリノゲンオステオポンチンネトリントロンボスポンジンエンクチン、αジストログリカン等が挙げられ、プロテオグリカンである細胞接着分子(細胞外マトリックス側:リガンド)としては、アグリンアグレカンシンデカンニューロカンバーシカンブレビカン等が挙げられる。

0019

また、動物も、植物も、昆虫も、細胞接着に関して、それぞれ特定のタンパク質や複合多糖類あるいは糖タンパクを細胞間介在物として利用している。それらの構造体中の機能性ペプチドオリゴ糖をRNA医薬に結合させることにより、動物薬、農薬殺虫薬として適用させることができる。

0020

これらのうち、本明細書において用いる細胞接着性モチーフが由来する細胞接着分子としては、特に限定するものではないが、RNA医薬を導入すべき細胞において多数あるいは特異的に発現している細胞接着分子に対する細胞外マトリックスリガンドである細胞接着部分子とすることができる。また、本明細書において用いる細胞接着性モチーフが由来する細胞接着性の機能性分子としては、タンパク質やペプチドやオリゴ糖であってもよいし、プロテオグリカンなどの糖タンパク質であってもよい。さらに、細胞接着性を有することが知られているビタミン、脂質、コレステロールなどの脂質などであってもよい。

0021

細胞接着性モチーフとしては、例えば、インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリIgSF)をレセプターとして細胞接着を担う細胞外マトリックスリガンドであるフィブロネクチン、ラミニン、ICAM(Intercellular Adhesion Molecule)等が好適である。ある種のインテグリンやラミニンは、例えば、がん細胞などの細胞表面において多数発現しており、がん細胞をターゲットとするRNA医薬を適用すべき細胞として有用であるからである。また、ある種のインテグリンやラミニンは、神経細胞等の表面において多数又は特異的に発現しており、神経細胞をターゲットとするRNA医薬を適用すべき細胞として有用であるからである。このほか、RNAがターゲットとする細胞表面における細胞接着因子の発現状態や種類に応じて、細胞接着性モチーフが由来する細胞接着因子を適宜選択できる。

0022

細胞接着性モチーフとしては、免疫学的抗原性を減じることができるため、分子量が小さいペプチドであることが好ましい。こうした細胞接着性モチーフとしては、例えば、フィブロネクチン中のRGD(アルファベットは、アミノ酸一文字表記を示す。以下、同様である。)配列、REDV配列、LDV配列、NGR配列、PRAQ配列、KLDAPT配列、AGEGIP配列、KNEEDD配列、PHSRN配列、EDGIHEL配列、PRARI配列、IDAPS配列等が挙げられる。また、ラミニン中のYIGSR配列等が挙げられる。また、細胞接着性モチーフはターゲットとする細胞において発現している膜タンパク質レセプターに結合する細胞外マトリックスリガンドのアミノ酸配列に基づいて複数のペプチド断片を合成して、スクリーニングすることによっても適宜決定することができる。こうしたスクリーニングは、当業者において周知である。

0023

また、例えば、細胞接着性モチーフは、当該モチーフがペプチドの外部に露出されるように環状化されていてもよい。例えば、RGDモチーフについては、F(フェニルアラニン)やC(システイン)などを介して環状化されたペプチドが商業的に入手可能である。

0024

細胞接着性モチーフに含まれるアミノ酸残基数は、特に限定するものではないが、概して、3個〜20個程度であり、上記したアミノ酸配列に対して、上記アミノ酸配列に基づく細胞接着性を完全に損なわない範囲でアミノ酸を付加することができる。

0025

一つの細胞接着性モチーフ単位は、こうした細胞接着性モチーフを1個又は2個以上を含むことができるが、好ましくは1個〜5個程度であり、また例えば1個〜4個であり、また例えば1個〜3個であり、また例えば1個又は2個であり、また例えば1個である。

0026

本試薬は、2個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えることができる。また例えば、本試薬は、3個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えていてもよいし、4個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えていてもよい。細胞接着性モチーフ単位の上限は特に限定するものではないが、例えば、10個以下とすることができる。

0027

本試薬が備える2個以上の細胞接着性モチーフ単位は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよいが、スペーサー単位を介して隣接する細胞接着性モチーフ単位には、同一の細胞接着性モチーフが含まれていることが好ましい。こうすることで、隣接する細胞接着性モチーフ単位中の同一の細胞接着性モチーフ間の距離が概ねスペーサー単位で規定されることになるからである。

0028

図2に示すように、細胞接着性モチーフ単位は、例えば、固相合成法で使用できる例えば、DNA、RNA、GNA、PNAなどの骨格に対して、ペプチド性リンカーや非ペプチド性の領域等を用いて、GNA骨格に対する側鎖などとして備えられることができる。

0029

(スペーサー単位)
本試薬は、2以上の細胞接着性モチーフ単位を離間するように1以上のスペーサー単位を備えることができる。すなわち、スペーサー単位は、2個の細胞接着性モチーフ単位間に介在して当該モチーフ単位が備える細胞接着性モチーフを、概ねスペーサー単位の長さに基づいて離間することができる。

0030

スペーサー単位の長さは、本試薬における細胞接着性モチーフ単位あるいは細胞接着性モチーフを離間しようとする距離等に応じて適宜決定される。例えば、ターゲットとする細胞において発現する細胞膜レセプター距離情報が取得できる場合には、当該距離を参考にしてスペーサー単位の長さを決定することができる。また、例えば、スペーサー単位の長さは、あるターゲットレセプターに対して接着することがわかっている細胞接着性モチーフに種々の長さのスペーサー単位を付与して、好適なスペーサー単位を選択するスクリーニングによっても決定できる。

0031

スペーサー単位で離間する細胞接着性モチーフ単位の距離は、特に限定するものではないが、例えば、少なくとも2nm以上離間することができる。また例えば、3nm以上とすることができ、また例えば4nm以上とすることができ、また例えば5nm以上とすることができる。なお、スペーサー単位によって離間する細胞接着性モチーフ単位間距離、あるいはスペーサー単位の長さは、当業者であれば、スペーサー単位を構成する分子構造に基づいて取得することができる。

0032

スペーサー単位を構成する構造や物質については特に限定するものではないが、一般的なリンカーほか、各種公知のタンパク質とタンパク質とを連結するリンカー、タンパク質とヌクレオチドヌクレオシド)とを連結するリンカー、ヌクレオシドとヌクレオシドとを連結するリンカー等を適宜用いることができる。

0033

スペーサー単位としては、特に限定するものではないが、非ペプチド性であることが好ましい。細胞接着レセプターはタンパク質であるため、スペーサー単位がペプチドを含むことにより、意図しない接着が生じる可能性もあるからである。プロテアーゼなどタンパク分解酵素により分解されることを防ぐためにも非ペプチド性であることが望ましい。
また、スペーサーは、例えば、ポリエチレングリコール鎖などタンパク質や脂肪など細胞表面に存在する物質と無差別に結合しない素材よりなるものが好ましい。

0034

スペーサー単位は、特に限定するものではないが、自由回転可能な連結基を備えることも好適である。例えば、スペーサー単位は、一重結合を含む直鎖状構造を有することが好ましい。一重結合としては、例えば、炭素−炭素一重結合、炭素−酸素一重結合、炭素−窒素一重結合、S−S一重結合などが挙げられる。スペーサー単位は、こうした一重結合を主体とすることが好ましい。なお、スペーサー単位は、一重結合を含む限り一部に芳香環あるいはシクロアルカンを含んでいてもよい。

0035

スペーサー単位としては、置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状連結構造は、細胞接着性モチーフ単位間距離の設計が容易であり、かつ全体として回転運動が可能であるからである。

0036

こうしたスペーサー単位としては、例えば、以下の式(1)で表されるスペーサー単位が挙げられる。なお、以下の式(1)及び(2)においては、一例として、リン酸ジエステル結合を介してスペーサー単位が連結されている態様として示す。
5’−O−CmH2m−O−3’ 式(1)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、mは2以上の整数を表す。)

0037

式(1)においてmは、好ましくは2以上40以下であり、より好ましくは3以上20以下である。式(1)中のHの置換基は、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は1〜8であることが好ましく、より好ましくは1〜4である。また、2以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。

0038

また、他のスペーサー単位としては、以下の式(2)で表される単位が挙げられる。
5’−(OCnH2n)l−3’ 式(2)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、nは2以上4以下の整数を表し、lは、2以上の整数を表す。)

0039

式(2)において(n+1)×lは、好ましくは2以上40以下であり、より好ましくは3以上20以下である。式(2)中のHの置換基は、式(1)中の置換基と同様の態様が適用される。

0040

スペーサー単位は、2以上の細胞接着性モチーフ単位を離間するのに必要な個数を細胞接着性モチーフ単位間に備えることができる。したがって、本試薬が備える細胞接着性モチーフ単位の数に応じ必要なスペーサー単位を備えることができる。例えば、本試薬が細胞接着性モチーフ単位を3個備える場合には、スペーサー単位は、これらを離間するために少なくとも2個必要であり、同様に、細胞接着性モチーフ単位を4個備える場合には、これらの離間のために少なくとも3個必要であり、細胞接着性モチーフ単位を5個備える場合には、これらを離間するために少なくとも4個必要である。

0041

図2に示すように、スペーサー単位は、例えば、DNAやRNA等の固相合成法を利用して、側鎖というよりもむしろ骨格として備えられることができる。

0042

図1及び図2に示すように、本試薬は、1以上のスペーサー単位が前記2以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している。例えば、本試薬は、2個の細胞接着性モチーフ単位を、1個のスペーサー単位を介在させるようした構造単位を直列して連結させた直鎖状構造を有することができる。

0043

本試薬は、特に限定するものではないが、例えば、細胞接着性モチーフ単位を3個以上備えることが好ましく、また例えば、同単位を4個以上備えることが好ましく、同単位を5個以上備えることが好ましく、また例えば、同単位を6個以上備えることが好ましい。これらのいずれもが、スペーサー単位で離間されていることが好ましい。多数個の細胞接着性モチーフ単位をスペーサー単位で離間して備えることで、細胞表面のレセプターとの相互作用確率を向上させることができ、細胞内への取り込みが向上する。

0044

本試薬は、こうした直鎖状構造部分を1つのみ有していてもよいし、2以上有していてもよい。例えば、分岐するリンカーを用いて各リンカーに対してこうした直鎖状構造部分を連結してもよい。本試薬の直鎖状構造部分の末端や非末端以外の細胞接着性を損なわない個所にリンカーの枝を架橋反応等によって連結することができる。こうした分岐するリンカー化合物は、種々の化合物が当業者に周知である。かかる分岐リンカーとしては、例えば、公知の種々の2官能性又は3官能性以上の架橋剤等が挙げられる。

0045

このような構造を有する本試薬を合成するためには、特に限定されないで公知の種々の方法で合成することができるが、例えば、細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位との選択の自由度や連結形態の自由度を考慮すると、オリゴリボヌクレオチドの固相合成方法を用いることができる。なお、本試薬の製造方法については、後段で詳述するが、医薬品製造などにおいて産業応用が容易な方法が望ましい。

0046

(本試薬の製造)
本試薬は、細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位の種類と配列とに応じて適宜製造することができる。特に限定するものではないが、本試薬は、例えば、DNAやRNAの固相合成法を利用して合成することができる。具体的には、細胞接着性モチーフ単位及びスペーサー単位等を、固相合成のための誘導体、例えば、ホスホロアミダイト誘導体として準備することなどにより、任意の組合せで本試薬を製造することができる。

0047

一般的なオリゴリボヌクレオチドの固相合成法は、概して、オリゴリボヌクレオチドの3’末端側のリボヌクレオチド単位であって塩基、リン酸基及び水酸基等が適宜保護されたリボヌクレオチド単位がリンカー等を介してビーズなどの固相担体を準備し(固相担体準備工程(A))、その後、5’末端水酸基を脱保護し(脱保護工程(B))、その後、適宜保護された所望のリボヌクレオチドのアミダイト誘導体を供給して、5'末端水酸基に所望のリボヌクレオチドをカップリング(カップリング工程(C))していくというものである。工程(A)後に、(B)及び(C)を繰り返していき、最終的に塩基部分の脱保護と固相担体からの分離によって所望のオリゴリボヌクレオチドを得ることができる。本試薬は、この固相合成方法の工程(A)、(B)及び(C)を利用し、リボヌクレオチドに替えて、種々の公知の核酸アナロググリコール核酸(GNA)、ロック核酸(LNA)、架橋型核酸(BNA)等)にその他の類似骨格に細胞接着性モチーフ単位やスペーサー単位を任意の配列で連結することで得ることができる。

0048

また、本試薬の製造に適用するホスホロアミダイトなどを用いるアミイト法等においては、適宜、例えば、リン酸ジエステル部分の酸素原子の一つを硫黄原子メチル基などの低級アルキル基ボラノ基で置換するほか、モルホリノホスホロジアミデート修飾、3’位の酸素原子を窒素原子に替えたN3’−P5ホスホロアデート型修飾など、公知の修飾態様を適用することができる。

0049

以下、オリゴリボヌクレオチドの3’末端側に導入する本試薬の合成例について例示する。例えば、3’末端側から、細胞接着性モチーフ単位/スペーサー単位/細胞接着性モチーフ単位/スペーサー単位という配列を有する本試薬を得る場合には、各単位の前駆体となる以下の3種のモノマーを準備する。

0050

(細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー)
まず、以下のスキーム1に示す方法で、末端にトリフルオロアセチル基を有するホスホロアミダイト誘導体モノマーを準備する。このモノマーは、末端のトリフルオロアセチル基を介した共有結合により細胞接着性モチーフ単位を導入することができる。以下のスキームに示すように、アミノヘキサン酸[2]のアミノ基に、トリフルオロアセチル基を導入し(化合物[3])、次いで、カルボキシル基の水酸基を保護するために、ジメトキシトリチル基(DMTr基)を導入し(化合物[4])、2−シアノエチルN,N-ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイトを添加して、細胞接着性モチーフ単位導入用のモノマーとして化合物[5]を得ることができる。

0051

0052

後述するように、トリフルオロアセチル基に対して二官能性架橋剤によりマレイミド基が導入され、当該マレイミド基を介して細胞接着性モチーフ単位が導入されるが、必要に応じて、上記のように、固相合成法における骨格部分となるGNAから細胞接着性モチーフ単位がある程度離間されるようにすることができる。

0053

(細胞接着性モチーフ単位導入用固相担体)
次に、以下に示すスキーム2で、オリゴリボヌクレオチドの3’末端に細胞接着性モチーフ単位を導入するための固相担体を得る。スキーム1で得た化合物[4]と無水コハク酸とN,N-ジメチル4−アミノピリジンDMAP)とをピリジンに溶解して室温で撹拌後、酢酸エチルと水で抽出後、有機層脱水し、最終的にスクシニル体を取得し、このスクシニル体に、不活性雰囲気下で、[1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)とCPG樹脂とを加えて静置し、DMTr基で保護された水産基と、トリフルオロアセチル基と、CPGと、を備える、3’末端に細胞接着性モチーフ単位導入するための細胞接着性モチーフ単位導入用固相担体を得ることができる。

0054

0055

(スペーサー単位導入用モノマー)
さらに、以下のスキーム3で、スペーサー単位導入用のホスホロアミダイト誘導体モノマーを準備する。このモノマーは、スペーサー単位を予め含有することができる。以下に示すスキーム3では、ヘキサエチレングリコール鎖をスペーサー単位としている。不活性雰囲気下で、ヘキサエチレングリコール酸をピリジンに溶解後、DMTrClを加えて室温で撹拌後、酢酸エチルと水で抽出した有機層を脱水し、減圧濃縮することで、スペーサー単位と、DMTr基で保護した水酸基と、ホスホロアミダイト基とを備えるスペーサー単位導入用モノマーを得ることができる。

0056

0057

なお、細胞接着性モチーフ単位は、例えば、図3に示すように、トリフルオロアセチル基等を介してマレイミド基を導入し、当該マレイミド基と、細胞接着性モチーフ単位に付与したチオール基との間で反応を生じさせてモノマーや固相担体に導入される。こうした細胞接着性モチーフ単位は、カップリング工程前のモノマーや固相担体に予め導入されていてもよいし、すべてのモノマーをカップリング後に一括して導入されてもよい。同一の細胞接着性モチーフ単位を導入する場合には、後修飾で一括して導入することが好都合である。

0058

こうした2種のモノマーと1種類の固相担体を用いることで、本試薬の前駆体ポリマー及び本試薬を得ることができる。

0059

以下、後修飾により細胞接着性モチーフ単位を備える本試薬の合成例について説明する。まず、スキーム2で得た固相担体のDMTr基を除去して、5’−OH基活性化後、スキーム3で得たスペーサー単位導入用モノマーのホスホロアミダイト基をカップリングさせて、当該モノマーを、固相担体の5’−OH基に連結させる。

0060

次いで、残存する5’−OH基をキャッピングし、3価のリンから5価のリンによるホスホジエステル結合を形成するように酸化する。

0061

引き続き、カップリングしたスペーサー単位導入用モノマーのDMTr基を除去し、スキーム1で合成した細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーのカップリング等を行う。さらに、導入したモノマーのDMTr基を除去に、スキーム3で合成したスペーサー単位導入用モノマーのカップリングを行った後は、酸化してDMTr基を除去後は、固相担体から細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー/スペーサー単位導入用モノマー/細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー/スペーサー単位が重合したポリマーであって、細胞接着性モチーフ単位が導入されていない本試薬の前駆体を分離精製する。

0062

次いで、例えば、図3に示すように、こうして得られたポリマーに対して、N—(6−マレイミドプロキシオキシスクシンミド(EMCS)などを適用して、トリフルオロアセチル基を介して細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーの末端にマレイミド基を導入する。このマレイミド化したポリマーに、チオール基を備えた、例えば、商業的に入手可能である環状RGDペプチドなどの細胞接着性モチーフ単位を含む化合物を反応させることで、細胞接着性モチーフ単位/スペーサー単位/細胞接着性モチーフ単位/スペーサー単位からなる本試薬を得ることができる。

0063

なお、以上の説明においては、本試薬の前駆体を固相担体から分離後に、細胞接着性モチーフ単位を導入したが、固相担体に本試薬前駆体が分離されていない状態で細胞接着性モチーフ単位を導入することも可能である。

0064

また、以上の説明においては、予め細胞接着性モチーフ単位を備える細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーを用いる場合には、細胞接着性モチーフ単位による後修飾を要しない。また、2種類以上の細胞接着性モチーフ単位を用いる場合には、予め細胞接着性モチーフ単位を備えるモノマーを用いた前導入形態を採用することが好適であるが、前導入と後修飾とを組み合わせることもできる。

0065

さらに、以上の説明においては、オリゴリボヌクレオチドの3’末端側に本試薬を備えるようにすることを想定して説明したが、オリゴリボヌクレオチドの5’末端側に本試薬を備えるように本試薬を合成することも当業者であれば適宜実施可能である。

0066

さらにまた、以上の説明においては、各モノマーは、リン酸ジエステル結合により連結されているが、モノマーの連結形態は、これに限定するものではなく、既述のように公知の技術に基づいて、種々の連結形態を適宜選択することができる。

0067

このように、アミダイト法などの固相合成法を用いることで、任意の細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位とを備える本試薬を容易に合成することができる。しかも、本試薬を適用するオリゴリボヌクレオチドの合成と同時に本試薬も合成することができる。

0068

本試薬は、上記のようにDNAやRNAの合成に広く用いられているアミダイト固相合成法ほか、当業者であれば、公知のDNAやRNAの合成手法を適宜適用して合成することができる。細胞接着性モチーフ単位を導入用モノマーに導入する方法は、上記したほか、種々の公知の二価性試薬を用いて、モノマーと細胞接着性モチーフ単位とを連結することができる。また、当業者は、適宜、かかる二価性試薬を導入可能な官能基をモノマーに付与することができる。さらにまた、当業者は、スペーサー単位導入用モノマーにおけるスペーサーを公知のスペーサーから適宜選択することができる。

0069

本試薬によれば、細胞接着性モチーフ単位を、スペーサー単位を介在させて任意の距離離間させることができる。細胞接着性モチーフ単位は、スペーサー単位によって予め所定距離を離間しているため、細胞表面に離間して存在している細胞接着レセプターに対して、効果的に結合できる。すなわち、個々の相互作用が弱くても全体として、すなわち、複数の細胞接着性モチーフが複数のレセプターに結合可能であるため、より強く相互作用して細胞表面に接着することができる。しかも、細胞接着性モチーフ単位間距離を、例えば、細胞表面における、細胞接着性モチーフが結合するレセプター間距離に対応させることができる。さらに、細胞接着性モチーフ単位の離間距離は、スペーサー単位が介在されることによって付与されるため、確実にかつ容易に付与されているとともに、スペーサー単位を介して直列的に細胞接着性モチーフ単位が離間されているために、細胞接着性モチーフ単位のレセプターに対するアクセス自由度も高くなっている。したがって、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、簡易にかつ効果的に本試薬はターゲット細胞の表面に接着することができる。また、直列に並んだスペーサー単位と細胞接着性モチーフ単位は細胞膜上を浮遊するレセプターを捜索し、複数個を結合し、抱き込み、クラスター化することができると考えられる。

0070

また、本試薬は、スペーサー単位を介して直列的に、例えば、好ましくはリンカーを介してスペーサー単位が連続する方向及び/又はオリゴリボヌクレオチドにおける鎖長方向に対して側鎖状に細胞接着性モチーフ単位を備えることができる。このため、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、比較的嵩高い細胞接着性モチーフ単位であっても、ターゲットとなる細胞表面に対して近接しやすくなっている。この点においても、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、簡易にかつ効果的に本試薬はターゲット細胞の表面に接着することができる。

0071

本試薬は、上記例示において用いられたポリエチレングリコール鎖などのスペーサー単位と、細胞接着性モチーフ単位と、を、タンデム(交互に)等で並んだ状態を採ることができ、これらの単位をそれぞれ任意の数繰り返すことができる構造になっている。したがって、本試薬は、一定の距離を離間できるスペーサー単位で細胞接着性モチーフ単位を離間する繰り返し構造を有するものであってもよいし、2以上の異なる距離を離間するように2種類以上のスペーサー単位又は複数のスペーサー単位によって細胞接着性モチーフ単位を離間する構造を有するものとしてもよい。このように、本試薬は、細胞接着性モチーフ単位の配置を容易に最適化することができる。

0072

さらに、本試薬は、スペーサー単位として、ポリエチレングリコール鎖などのある種の細胞選択性を発揮する化合物単位を細胞接着性モチーフ単位を離間する直鎖部分として備えることができる。このため、かかるスペーサー単位に、細胞選択性等の機能など、本試薬によるターゲティング補助することができる。

0073

以上説明したように、本試薬は、よりしなやかに細胞接着性モチーフ単位を保持し、しかも、細胞接着性モチーフ単位の嵩高さに係わらず独立して細胞表面のレセプターと相互作用可能であるために、本試薬と複合化されたオリゴリボヌクレオチドを細胞表面に効率的に近接させることができ、オリゴリボヌクレオチドの細胞内導入を促進することができる。

0074

本試薬の細胞接着性モチーフ単位が細胞接着性モチーフとしてペプチド性のモチーフを有する場合、本試薬は、2個のペプチド性モチーフ単位が、少なくとも1個の非ペプチド性のスペーサー単位で離間されたペプチド誘導体と理解することができる。かかるペプチド誘導体は、新規化合物である。

0075

細胞導入コンジュゲート)
本明細書に開示される細胞導入コンジュゲート(以下、単に、本コンジュゲートともいう。)は、2個以上の細胞性接着モチーフ単位と、1以上のスペーサー単位と、を備え、前記1以上のスペーサー単位が前記2個以上の細胞接着性モチーフ単位を互いに離間する、細胞接着領域(以上、本試薬に相当する。)と、オリゴリボヌクレオチドと、を備え、共有結合によって本試薬とオリゴリボヌクレオチドとが複合化されているコンジュゲートである。本コンジュゲートによれば、本試薬によって、オリゴリボヌクレオチドが非特定の血中タンパク質からのトラップを回避して細胞表面に近接され相互作用しやすくなる。このため、オリゴリボヌクレオチドが細胞内に導入されやすくなる。

0076

本コンジュゲートは、細胞接着領域、すなわち、本試薬とオリゴリボヌクレオチドとを共有結合によって複合化されていてもよい。なお、かかる形態の本コンジュゲートは、オリゴリボヌクレオチド誘導体であるといえる。本試薬とオリゴリボヌクレオチドとの共有結合は、オリゴリボヌクレオチドの5’末端及び/又は3’末端に対して本試薬を結合することが好ましい。例えば、siRNAとして用いる場合には、細胞質内RISC複合体を形成してRNA干渉に作用するのはアンチセンス鎖であるため、例えば、センス鎖の3’末端及び/又は5’末端に対して本試薬を備えることが好ましい。

0077

本試薬とオリゴリボヌクレオチドとの結合は、別々に準備したオリゴリボヌクレオチドと本試薬とを、いわゆるバイオコンジュゲートなどを用いて共有結合させることができる。例えば、一方に反応性の高い架橋反応基を導入して、他方にかかる架橋性官能チオールを導入することで、両者を連結することができる。このような結合形態としては、この他、バイオコンジュゲーションとして知られている、本試薬中に備えることができる第1級アミノ基、カルボキシ基スルフヒドリル基カルボニル基と、カルボジイミド基、マレイミド、NHSエステルイミドエステルなどとの間による架橋反応を利用できる。

0078

また、既に説明したように、本試薬をオリゴリボヌクレオチドの固相合成法に準じて合成する場合には、固相合成法を用いて、本試薬の前駆体となる細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーとスペーサー単位導入用モノマーとを含むポリマー鎖の合成を伴ってオリゴリボヌクレオチドを合成することで、本コンジュゲートを合成することができる。固相合成による場合においても、本試薬をオリゴリボヌクレオチドの3’末端に付与することもできるし、5’末端に付与することもできる。

0079

本コンジュゲートに用いるオリゴリボヌクレオチドは、以下の式(1)又は(2)で表されるヌクレオシド誘導体(以下、単に、本ヌクレオシド誘導体ともいう。)又はその塩を含むことができる。本ヌクレオシド誘導体は、当業者の周知の方法で、オリゴヌクレオチド部分構造に含めることができる。

0080

(式(1)中、R1は、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式(2)中、Xは、ハロゲン原子を表す。式(1)及び式(2)中、R2及びR4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−P(=O)nR5R6(nは0又は1を示し、R5及びR6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、nが1のときには、R5及びR6が共に水素原子となることはない。)を示し、R3は、それぞれ連結基を有するNHR7(R7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。)、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Bは、プリン−9−イル基、2−オキソ−ピリミジン−1−イル基、置換プリン−9−イル基、又は置換2−オキソ−ピリミジン−1−イル基のいずれかを表す。)

0081

本ヌクレオシド誘導体は、リボースの第4’位に塩基性を有する置換基を備えることで、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドにおいて、オリゴリボヌクレオチドが有するリン酸基などに起因する負電荷の少なくとも一部を中和することができるという電荷調節能を備えることができる。

0082

また、本ヌクレオシド誘導体は、当該部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドの細胞膜透過性を向上させることができる。さらに、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドにおいて、リボヌクレアーゼ耐性を向上することができる。

0083

このようなオリゴリボヌクレオチドと本試薬とのコンジュゲートによれば、オリゴリボヌクレオチドは、本試薬によって細胞表面に近接しやすくなり、しかも、ヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性が向上されているため、一層細胞内に導入されやすくなっている。

0084

明細書中構造式等で表される化合物における置換基における「低級」の意は、該置換基を構成する炭素数が、最大10個までであることを意味している。例えば、通常は炭素数1〜6個、又は炭素数1〜5個が例示され、さらには炭素数1〜4個、又は炭素数1〜3個であることが好ましい例として挙げられる。

0085

以下、本ヌクレオシド誘導体又はその塩及びこれらの利用について説明する。

0086

(ヌクレオシド誘導体及びその塩)
本ヌクレオシド誘導体又はその塩の一つの態様は、以下の式(1)で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。

0087

0088

また、本ヌクレオシド誘導体又はその塩の他の一つの態様は、以下の式(2)で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。

0089

0090

[R1について]
式(1)中、R1は水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表す。

0091

[Xについて]
式(2)中、Xは、ハロゲン原子を表す。ハロゲン原子としては、特に限定するものではないが、塩素原子ヨウ素原子フッ素原子及び臭素原子等が挙げられる。R1がハロゲン原子のとき、本ヌクレオシド誘導体は、デオキシリボヌクレオシド誘導体である。なお、ハロゲン原子は、式(2)からも明らかなように、リボースの2’位の炭素原子に対する結合方向は特に限定するものではないが、天然のリボースの水酸基に相当するようにハロゲン原子が結合することが好適である。

0092

(アルキル基)
本明細書中、アルキル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数1〜6個の低級アルキル基、又は炭素数1〜5個の低級アルキル基がより好ましい例として挙げられ、さらに炭素数1〜4個又は炭素数1〜3個の低級アルキル基が特に好ましい例として挙げられる。直鎖状の炭素数1から4までのアルキル基としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、又n−ブチル基等が好適な例として挙げられ、このうち、メチル基、エチル基、n−プロピル基が好ましく、また例えばメチル基、エチル基が好ましく、また例えばメチル基が好ましい。また分枝状の炭素数1から4までのアルキル基としては、イソプロピル基イソブチル基、s−ブチル基、t−ブチル基等が挙げられ、このうち、イソプロピル基が特に好ましい例として挙げられる。又、環状の炭素数1から4までのアルキル基としては、シクロプロピル基シクロブチル基、又はシクロプロピルメチル基等が挙げられる。

0093

(アルケニル基)
本明細書中、アルケニル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルケニル基が好ましく、低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、1−プロペニル基、2−プロペニル基、1−メチル−2−プロペニル基、1−メチル−1−プロペニル基、2−メチル−1−プロペニル基、1−ブテニル基、2−ブテニル基などが挙げられる。

0094

(水酸基の保護基又は保護された水酸基)
本明細書において、水酸基の保護基としては、当業者に周知であって、例えばProtective Groups in Organic Synthesis(John Wiley and Sons、2007年版)を参考にすることができる。水酸基の保護基としては、代表的な例を挙げると、例えば、脂肪族アシル基芳香族アシル基、低級アルコキシメチル基、適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基、適宜の置換基があってもよいテトラチオラニル基、合わせて1から3個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基(但し前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン原子、又はシアノ基を意味する。)、又はシリル基、等が例示される。

0095

なお、本明細書中、アルコキシ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルエーテル基が挙げられる。低級アルコキシ基が好ましく、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数1〜6個の低級アルコシキ基、又は炭素数1〜5個の低級アルコシキ基が挙げられ、さらには炭素数1〜4個、又は炭素数1〜3個のアルコキシ基が好ましく、炭素数1〜4個のアルコキシ基が特に好ましい。炭素数1〜4個のアルコキシ基としては、メトキシ基エトキシ基、n−プロポキシ基、又はn−ブトキシ基等が好ましい例として挙げられる。また、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、s−ブトキシ基、又はt−ブトキシ基等も好ましい例として挙げられる。また、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基も好ましく、シクロプロピルメトキシ基も好ましい例として挙げられる。

0096

本明細書中、アルキルチオ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルチオ基が挙げられる。低級アルキルチオ基が好ましく、低級アルキルチオ基としては、例えば炭素数1〜6個の低級アルキルチオ基、又は炭素数1〜5個の低級アルキルチオ基が好ましく、さらには炭素数1〜4個の低級アルキルチオ基、又は炭素数1〜3個までのアルキルチオ基が特に好ましい例として挙げられる。炭素数1〜4個の飽和アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチオルチオ基、n−プロピルチオ基、n−ブチルチオ基等が好ましい例として例示される。またイソプロピルチオ基、イソブチルチオ基、s−ブチルチオ基、又はt−ブチルチオ基等も好ましい例として例示される。またシクロプロピルチオ基、又はシクロブチルチオ基が好ましい例として挙げられ、さらにシクロプロピルメチルチオ基がさらに好ましい例として例示される。
る。)

0097

これらのうち、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基が特に好ましい例として挙げられる。また、合わせて1から3個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基(但しその置換アリールにおける置換基は、前述の通り)も好ましい例として挙げられる。

0098

上記の脂肪族アシル基としては、例えば、アルキルカルボニル基カルボキシアルキルカルボニル基、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基、又は低級アルコキシ低級アルキルカルボニルが挙げられる。

0099

なお、前記アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。すなわち、アルキルカルボニル基としては、例えばホルミル基アセチル基プロピオニル基ブチリル基イソブチリル基ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、3−メチルノナノイル基、8−メチルノナノイル基、3−エチルオクタノイル基、3,7−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、1−メチルペンタデカノイル基、14−メチルペンタデカノイル基、13,13−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、15−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、1−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、又はヘナイコサイル基が挙げられる。このうち、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基が好ましい例として挙げられ、さらにはアセチル基が特に好ましい例として挙げられる。また前記カルボキシ化アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。カルボキシ化の置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、カルボキシ化アルキルカルボニル基としては、例えばスクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基が挙げられる。

0100

前記ハロゲノ低級アルキルカルボニル基における、ハロゲン、低級、及びアルキルについては前述の説明の通りである。ハロゲンの置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基としては、例えばクロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基が挙げられる。

0101

前記低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基における、アルコキシ及びアルキル、さらに低級については前述の説明の通りである。低級アルコキシが置換する位置などについても適宜選択できる。すなわち、低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基として、例えばメトキシアセチル基が挙げられる。

0102

上記の芳香族アシル基としては、例えば、アリールカルボニル基、ハロゲノアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシ化アリールカルボニル基、カルボキシ化アリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、又はアリール化アリールカルボニル基が挙げられる。

0103

前記アリールカルボニル基としては、例えばベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基が挙げられ、さらに好ましくはベンゾイル基が挙げられる。前記ハロゲノアリールカルボニル基としては、例えば、2−ブロモベンゾイル基、4−クロロベンゾイル基が挙げられる。前記低級アルキル化アリールカルボニル基としては、2,4,6−トリメチルベンゾイル基、4−トルオイル基、3−トルオイル基、2−トルオイル基が挙げられる。前記低級アルコキシ化アリールカルボニル基としては、例えば4−アニソイル基、3−アニソイル基、2−アニソイル基が挙げられる。

0104

前記カルボキシル化アリールカルボニル基としては、例えば2−カルボキシベンゾイル基、3−カルボキシベンゾイル基、4−カルボキシベンゾイル基が挙げられる。前記ニトロ化アリールカルボニル基としては、例えば、4−ニトロベンゾイル基、3−ニトロベンゾイル基、2−ニトロベンゾイル基が挙げられる。前記アリール化アリールカルボニル基としては、例えば、4−フェニルベンゾイル基が挙げられる。

0105

低級アルコキシメチル基としては、例えばメトキシメチル基、1,1−ジメチル−1−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、t−ブトキシメチル基が挙げられる。特に好ましくはメトキシメチル基が挙げられる。

0106

適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基、又はアルケニルオキシカルボニル基が挙げられる。

0107

前記低級アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基エトキシカルボニル基、t−ブトキシカルボニルイソブトキシカルボニル基が挙げられる。前記ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基としては、2,2−トリクロロエトキシカルボニル基、2−(トリメチルシリル)エトキシカルボニル基が挙げられる。

0108

前記アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基が挙げられる。上記の、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基としては、例えばテトラヒドロピラン−2−イル基、又は、3−ブロモテトラヒドロピラン−2−イル基が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはテトラヒドロピラン−2−イル基が挙げられる。

0109

適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基としては、例えばテトラヒドロチオピラン−2−イル基、4−メトキシテトラヒドロチオピラン−4−イル基が挙げられ、さらに好ましくはテトラヒドロチオピラン−2−イル基が挙げられる。合わせて1から3個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基、においては、前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、又はシアノ基を意味する。

0110

合わせて1から3個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基としては、例えばベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基が挙げられ、好ましくはベンジル基、トリフェニルメチル基が挙げられる。その他に、例えば9−アンスリルメチル4−メチルベンジル基、2,4,6−トリメチルベンジル基、3,4,5−トリメチルベンジル基が挙げられ、好ましくは、2,4,6−トリメチルベンジル基、3,4,5−トリメチルベンジル基が挙げられる。その他の種類として、例えば4−メトキシベンジル基、4−メトキシフェニルジフェニルメチル基、4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられ、好ましくは4−メトキシベンジル基、4−メトキシフェニルジフェニルメチル基、4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられる。さらには、例えば4−クロロベンジル基、4−ブロモベンジル基が挙げられる。またその他に、例えば4−シアノベンジル基も好ましい例として挙げられる。

0111

本明細書中、シリル基としては、トリメチルシリル基トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−t−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリルフェニルジイソプロピルシリル基が挙げられる。このなかでさらに好ましくは、トリメチルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられ、特に好ましくは、トリメチルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられる。

0112

本明細書における水酸基の保護基としては、化学的方法(例えば、加水素分解加水分解電気分解、又は光分解など)、又は生物学的方法(例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など)、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。水酸基の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。なお、保護された水酸基は、かかる保護基で水素原子が置換された水酸基ということができる。

0113

[R2及びR4について]
式(1)及び式(2)中、R2及びR4は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−P(=O)n(R5)R6を表す。水酸基の保護基は既に説明したとおりである。

0114

(保護されたリン酸基)
保護されたリン酸基における保護基は当業者公知であり、上述の参考文献や説明を参考にすることができる。

0115

リン酸基の保護基としては、例えば、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、シリル基で置換されたエチル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、シクロアルキル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、アラルキル基ニトロ基アリール環が置換されたアラルキル基、ハロゲンでアリール環が置換されたアラルキル基、低級アルキル基で置換されたアリール基、ハロゲンで置換されたアリール基、又はニトロ基で置換されたアリール基が挙げられる。

0116

前記の低級アルキル基としては、前述したとおりである。前記のシアノ基で置換された低級アルキル基としては、例えば2−シアノエチル基、2−シアノ−1、1−ジメチルエチル基が挙げられ、特に好ましくは、2−シアノエチル基が挙げられる。前記のシリル基で置換されたエチル基としては、例えば2−メチルジフェニルシリルエチル基、2−トリメチルシリルエチル基、2−トリフェニルシリルエチル基が挙げられる。

0117

前記のハロゲンで置換された低級アルキル基としては、例えば2,2,2−トリクロロエチル基、2,2,2−トリブロモエチル基、2,2,2−トリフルオロエチル基、2,2,2−トリクロロエチル基が挙げられ、特に好ましくは、2,2,2−トリクロロエチル基が挙げられる。前記の低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、1−プロペニル基、2−プロペニル基、1−メチル−2−プロペニル基、1−メチル−1−プロペニル基、2−メチル−1−プロペニル基、1−ブテニル基、2−ブテニル基などが挙げられる。

0118

前記のシアノ基で置換された低級アルケニル基としては、例えば2−シアノエチル基、2−シアノプロピル基、2−シアノブテニル基が挙げられる。前記のアラルキル基としては、例えばベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、インデニルメチル基、フェナンスニルメチル基、アントラセニルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、1−フェネチル基、2−フェネチル基、1−ナフチルエチル基、2−ナフチルエチル基、1−フェニルプロピル基、2−フェニルプロピル基、3−フェニルプロピル基、1−ナフチルプロピル、2−ナフチルプロピル、3−ナフチルプロピル、1−フェニルブチル基、2−フェニルブチル基、3−フェニルブチル基、4−フェニルブチル基が挙げられ、さらに好ましくは、ベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、1−フェネチル基、2−フェネチル基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基が挙げられる。

0119

前記のニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基としては、2−(4−ニトロフェニル)エチル基、0−ニトロベンジル基、4−ニトロベンジル基、2,4−ジニトロベンジル基、4−クロロ−2−ニトロベンジル基などが挙げられる。

0120

本明細書においてリン酸の保護基としては、化学的方法(例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など)、又は生物学的方法(例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など)、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。リン酸の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。

0121

(−P(=O)n(R5)R6)
本発明のヌクレオシド類縁体のR2及びR4は、−P(=O)n(R5)R6となる場合がある。nは0又は1を示し、R5及びR6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、nが1のときには、R5及びR6が共に水素原子となることはない。保護された水酸基及び低級アルコキシ基については、既に説明したとおりである。

0122

(保護されたメルカプト基)
保護されたメルカプト基は、当業者において周知である。保護されたメルカプト基としては、例えば上記水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばアルキルチオ基、アリールチオ基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられ、特に好ましくは、芳香族アシル基が挙げられる。アルキルチオ基としては、低級アルキルチオ気が好ましく、例えば、メチルチオ、エチルチオ、t−ブチルチオ基が好ましい例として挙げられる。アリールチオ基としては、例えばベンジルチオが挙げられる。また芳香族アシル基としてはベンゾイル基が挙げられる。

0123

前記のシアノ低級アルコキシ基としては、例えば、シアノ基が置換した直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである炭素数1〜5個のアルコキシ基(なお、シアノ基中の炭素の数を含めずに数えた場合)が好ましい例として挙げられ、具体的には例えば、シアノメトキシ、2−シアノエトキシ、3−シアノプロポキシ、4−シアノブトキシ、3−シアノ—2−メチルプロポキシ、又は1−シアノメチル−1,1−ジメチルメトキシ等が挙げられ、特に好ましくは、2−シアノエトキシ基が挙げられる。

0124

R5及びR6として、置換されたアミノ基が選択できる。そのアミノ基の置換基は、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、又は低級アルキル基のいずれかを示す。なお前記R5及びR6が共に、置換されたアミノ基である場合では、該置換されたアミノ基として互いに異なった置換されたアミノ基であってもよい。前記の低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、及び低級アルキル基は、前述に説明された通りである。

0125

−P(=O)n(R5)R6としては、より具体的には、ホスホロアミダイド基、H−ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられ、ホスホロアミダイド基が特に好ましい例として挙げられる。

0126

−P(=O)n(R5)R6において、nが0であり、R5及びR6の少なくとも一方が置換されたアミノ基であり、他方は何であってもよい場合には、ホスホロアミダイド基となる。ホスホロアミダイド基としては、R5及びR6の一方が置換されたアミノ基であり、他方が低級アルコキシ基、又はシアノ低級アルコキシ基であるホスホロアミダイド基が、縮合反応反応効率が良好であり、特に好ましい。その置換されたアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはジイソプロピルアミノ基が例示される。また、R5及びR6の他方の置換基における低級アルコキシ基としては、メトキシキ基が好ましい例として挙げられる。また、シアノ低級アルコキシ基としては、2−シアノエチル基が好ましい例として挙げられる。ホスホロアミダイド基としては、具体的には、−P(OC2H4CN)(N(CH(CH3)2)、又は−P(OCH3)(N(CH(CH3)2)が好ましい例として挙げられる。

0127

−P(=O)n(R5)R6において、nが1であり、R5及びR6の少なくとも一方が水素原子であり、他方は水素原子以外であれば何であってもよい場合には、H−ホスホネート基となる。その、水素以外の置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、メチル基、メトキシ基、チオール基等が挙げられ、特に好ましくはヒドロキシル基が例示される。

0128

また、−P(=O)n(R5)R6において、nが1であり、R5及びR6が共に低級アルコキシ基である場合には、ホスホニル基となる。なお、R5及びR6における低級アルコキシ基は互いに同一でも相違していてもよい。その低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が好ましい例として挙げられる。ホスホニル基としては、具体的には、−P(=O)(OCH3)2が挙げられる。

0129

本ヌクレオシド誘導体におけるR2としては、例えば、−P(=O)n(R5)R6であることが特に好ましい。−P(=O)n(R5)R6としては、ホスホロアミダイド基、H−ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。R2としては、その他にリン酸基、又は保護されたリン酸基であることも好ましい。さらにR2としては、水素原子、又は水酸基の保護基であることも好ましい。

0130

R2の具体的な他の例示としては、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、p−メトキシベンジル基、トリメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、−P(OC2H4CN)(N(CH(CH3)2)、−P(OCH3)(N(CH(CH3)2)、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。

0131

本ヌクレオシド誘導体におけるR4としては、例えば、水素原子又は水酸基の保護基が好ましい。また例えば、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−P(=O)n(R5)R6であることも好ましい。R4としての具体的な例示を挙げると、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、p−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、又はトリメチルシリル基が好ましい例として挙げられる。

0132

[R3について]
式(1)及び式(2)中、R3は、それぞれ連結基を有するNHR7、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表すことができる。すなわち、NHR7、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基は、それぞれが連結基を介して4’位の炭素原子に結合している。

0133

連結基としては、例えば、炭素数1個以上の2価炭化水素基を表すことができる。すなわち、2価の炭化水素基としては、炭素数1〜8個以下のアルキレン基、炭素数2〜8個以下のアルケニレン基などが挙げられる。

0134

連結基としてのアルキレン基としては、直鎖状、分枝状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数1〜6個の低級アルキル基、また例えば、炭素数2〜6個の低級アルキル基が好ましく、また例えば、炭素数2〜4個又は炭素数2〜3個の低級アルキル基が好ましい。直鎖状の炭素数1から4までのアルキル基としては、メチレン基エチレン基プロパンー1、3−ジイル基、n−ブタン−1,1−ジイル基、n−ペンチル−1−5,−ジイル基、n−ヘキシル−1,6−ジイル基等が挙げられる。また、例えば、ブタン−1,2−ジイル基等が挙げられる。また例えば、エチレン基、プロパンー1、3−ジイル基、n−ブタン−1,1−ジイル基が特に好ましい例として挙げられる。

0135

連結基としてのアルケニレン基としては、直鎖状、分枝状であり、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルケニレン基が好ましく、低級アルケニレン基としては、例えば、エテン−1,2−ジイル基、プロペンー1,3−ジイル基、ブテン−1,4−ジイル基等が挙げられる。

0136

式(1)で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数2以上のアルキレン基などの2価炭化水素基であることがオリゴヌクレオチド誘導体のヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。また、式(2)で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数1以上のアルキレン基などの2価炭化水素基であってもヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。

0137

R7としては、水素原子、アルキル基又はアルケニル基又はアミノ基の保護基が挙げられる。アルキル基は、既に説明したアルキル基のほか、低級アルキル基が好ましく挙げられる。アルケニル基としては、既に説明したアルケニル基のほか、低級アルケニル基が好ましく挙げられる。R7が水素原子などこれらの基であるとき、連結基は、炭素数2以上、また例えば3以上、また例えば4以上で、例えば6以下、また例えば5以下、また例えば4以下のアルキレン基であることが好適である。

0138

また、R7が水素原子のとき、R3は、連結基を有するNH2(アミノ基)、すなわち、連結基がアルキレン基やアルケニレン基のときには、アミノアルキル基やアミノアルケニル基などとなる。式(1)及び式(2)中、R3がアミノアルキル基などであることにより、本ヌクレオシド誘導体及び本ヌクレオシド誘導体に由来するモノマーユニットを備えるオリゴヌクレオチド誘導体は、周囲のpH環境において電荷が変化するという特徴を伴う電荷付与性を発揮することができる。例えば、酸性下ではカチオニックであり、生理的条件下中性ではプラス電荷が減少して電荷ゼロとなりうる。すなわち、かかる電荷調節能によれば、pH環境を変化させることで、必要時にヌクレオシド誘導体の電荷をダイナミックに変化させたり、所望の電荷を付与したりすることができる。したがって、このような本ヌクレオシド誘導体によれば、オリゴヌクレオチドの電荷を従来とは異なる態様であるいは従来よりも一層高い自由度で調整できるようになる。以上のことから、R3がかかるアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体は、オリゴヌクレオチド等に対する電荷(正電荷付与剤又は電荷調節剤として有用である。

0139

R3としては、それぞれ連結基を有する、アジド基、アミジノ基、すなわち、CH3(NH)C(NH)−(アミジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの)、グアニジノ基、すなわち、NH2(NH)C(NH)−(グアニジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの)が挙げられる。なかでも、グアニジノ基が挙げられる。R3が、これらの基を有するとき、連結基は、炭素数1以上、また例えば2以上などのアルキレン基又はアルケニレン基などとすることができる。なお、R3が、連結基を有するアミジノ基、グアニジノ基のときには、既述のアミノアルキル基などのときとは異なり、常にカチオニックとなる。かかる本ヌクレオシド誘導体は、R3がアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体と組み合わせて用いるのに有用である。

0140

アミノ基に対する保護基は、当業者に周知されており、前述の参考文献を参照することができる。具体的には、上記にて水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばベンジル基、メチルベンジル基、クロロベンジル基、ジクロロベンジル基、フルオロベンジル基、トリフルオロメチルベンジル基、ニトロベンジル基、メトキシフェニル基、メトキシメチル(MOM)基、N−メチルアミノベンジル基、N,N−ジメチルアミノベンジル基、フェナシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、フタルイミド基アリルオキシカルボニル基、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブトキシカルボニル(Boc)基、1−メチル−1−(4−ビフェニルエトキシカルボニル(Bpoc)基、9−フルオレニルメトキシカルボニル基ベンジルオキシメチル(BOM)基、又は2−(トリメチルシリル)エトキシメチル(SEM)基などが挙げられる。さらに好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル(TFA)基、ピバロイル基、ベンゾイル基、t−ブトキシカルボニル(Boc)基、1−メチル−1−(4−ビフェニル)エトキシカルボニル(Bpoc)基、9−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル(BOM)基、又は2−(トリメチルシリル)エトキシメチル(SEM)基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシメチル基が挙げられる。

0141

本発明においてアミノ基の保護基としては、化学的方法(例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など)、又は生物学的方法(例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など)、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基がアミノ基の保護基として好ましい。

0142

[B:塩基について]
本ヌクレオシド誘導体におけるB:塩基としては、公知の天然塩基ほか、人工塩基が挙げられる。例えば、Bとしては、プリン−9−イル基、2−オキソ−ピリミジン−1−イル基、置換プリン−9−イル基、又は置換2−オキソ−ピリミジン−1−イル基が選択できる。

0143

すなわち、Bとしては、プリン−9−イル基、又は2−オキソ−ピリミジン−1−イル基が挙げられるほか、2,6−ジクロロプリン−9−イル、又は2−オキソ−ピリミジン−1−イルが挙げられる。さらに、2−オキソ−4−メトキシ−ピリミジン−1−イル、4−(1H−1,2,4−トリアゾール‐1−イル)−ピリミジン−1−イル、又は2,6−ジメトキシプリン−9−イルが挙げられる。

0144

さらに、アミノ基が保護された2−オキソ−4−アミノ−ピリミジン−1−イル、アミノ基が保護された2−アミノ−6−ブロモプリン−9−イル、アミノ基が保護された2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル、アミノ基及び/又は水酸基が保護された2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル、アミノ基が保護された2−アミノ−6−クロロプリン−9−イル、アミノ基が保護された6−アミノプリン−9−イル、又はアミノ基が保護された4−アミノ−5−メチル−2−オキソ−ピリミジン−1−イル基が挙げられる。なお、水酸基及びアミノ基の各保護基については、既に説明したとおりである。

0145

さらに、6−アミノプリン−9−イル(アデニン)、2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル(グアニジン)、2−オキソ−4−アミノ−ピリミジン−1−イル(シトシン)、2−オキソ−4−ヒドロキシ−ピリミジン−1−イル(ウラシル)、又は2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチルピリミジン−1−イル(チミン)が挙げられる。

0146

さらにまた、4−アミノ−5−メチル−2−オキソ−ピリミジン−1−イル(メチルシトシン)、2,6−ジアミノプリン−9−イル、6−アミノ−2−フルオロプリン−9−イル、6−メルカプトプリン−9−イル、4−アミノ−2−オキソ−5−クロロ−ピリミジン−1−イル、又は2−オキソ−4−メルカプト−ピリミジン−1−イルが挙げられる。

0147

また、6−アミノ−2−メトキシプリン−9−イル、6−アミノ−2−クロロプリン−9−イル、2−アミノ−6−クロロプリン−9−イル、又は2−アミノ−6−ブロモプリン−9−イルが挙げられる。

0148

置換プリン−9−イル基、又は置換2−オキソ−ピリミジン−1−イル基それぞれにおける置換基は、水酸基、保護された水酸基、低級アルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、低級アルキル基で置換されたアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシメチル基、又はハロゲン原子のいずれか一つ、又はそれらの複数の組み合わせのいずれかである。これらの置換基は、既に説明したとおりである。

0149

本ヌクレオシド誘導体におけるBとしては、置換プリン−9−イル基、又は置換2−オキソ−ピリミジン−1−イル基における置換基が既述の各置換基が好ましいが、これに加えてさらに、トリアゾール基、低級アルコキシメチル基が加わることも好ましい。

0150

置換プリン−9−イル基の好ましい例としては、例えば、6−アミノプリン−9−イル、2,6−ジアミノプリン−9−イル、2−アミノ−6−クロロプリン−9−イル、2−アミノ−6−ブロモプリン−9−イル、2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル、6−アミノ−2−メトキシプリン−9−イル、6−アミノ−2−クロロプリン−9−イル、6−アミノ−2−フルオロプリン−9−イル、2,6−ジメトキシプリン−9−イル、2,6−ジクロロプリン−9−イル、又は6−メルカプトプリン−9−イル等が挙げられる。上述の置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基及び/又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。

0151

置換2−オキソ−ピリミジン−1−イルとしては、例えば2−オキソ−4−アミノ−ピリミジン−1−イル、1H−(1,2,4−トリアゾール−1−イル)−ピリミジン−1−イル、4−1H−1,4−アミノ−2−オキソ−5−クロロ−ピリミジン−1−イル、2−オキソ−4−メトキシ−ピリミジン−1−イル、2−オキソ−4−メルカプト−ピリミジン−1−イル、2−オキソ−4−ヒドロキシ−ピリミジン−1−イル、2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチルピリミジン−1−イル、又は4−アミノ−5−メチル−2−オキソ−ピリミジン−1−イル等が挙げられる。
また、2−オキソ−4−メトキシ−ピリミジン−1−イル、又は4−(1H−1,2,4−トリアゾール‐1−イル)−ピリミジン−1−イルが好ましい例として挙げられる。

0152

こうしたBのうち、置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。

0153

本ヌクレオシド誘導体は、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、一般的には酸付加塩が例示され、分子内対イオンの形態をとっていてもよい。又は置換基の種類によっては塩基付加塩が形成される場合もある。塩としては、薬学的に許容される塩が好ましい。薬学的に許容しうる塩を形成する酸及び塩基の種類は当業者には周知であり、例えばJ.Pharm.Sci.,1−19(1977)に記載しているものなどを参考にすることができる。例えば、酸付加塩としては、鉱酸塩有機酸塩が挙げられる。また、一個以上の置換基が酸性部分を含有する場合、塩基付加塩も好ましい例として挙げられる。

0154

鉱酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩ヨウ化水素酸塩、硝酸塩硫酸塩、硫酸水素酸塩リン酸塩リン酸水素酸塩などが挙げられる。通常は、塩酸塩、リン酸塩、が好ましい例として挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩トリフルオロ酢酸塩グルコン酸塩乳酸塩サリチル酸塩クエン酸塩酒石酸塩アスコルビン酸塩コハク酸塩マレイン酸塩フマル酸塩ギ酸塩安息香酸塩メタンスルホン酸塩エタンスルホン酸塩、又はp−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。通常は、酢酸塩等が好ましい例として挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ金属の塩、アルカリ土類金属の塩、有機アミン塩、アミノ酸の付加塩が挙げられる。

0155

前記のアルカリ金属の塩としては、例えばナトリウム塩カリウム塩などが挙げられる。また、アルカリ土類金属の塩としては、例えば、マグネシウム塩カルシウム塩などが挙げられる。有機アミン塩としては、例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン塩等が例示される。また、アミノ酸の付加塩としては、例えば、アルギニン塩リジン塩オルニチン塩、セリン塩、グリシン塩アスパラギン酸塩グルタミン酸塩などが挙げられる。

0156

本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあり、これらの物質も本明細書の開示の範囲に含まれる。本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、後述の合成例や公知の方法に準じて、当業者は容易に製造することができる。

0157

本ヌクレオシド誘導体は、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも一部としてオリゴリボヌクレオチドに導入することで、一本鎖としてのオリゴリボヌクレオチド、二本鎖オリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させうることができるほか、哺乳動物細胞等の細胞膜透過性を向上させることができる。すなわち、本ヌクレオシド誘導体は、それ自体は、ヌクレアーゼ耐性向上剤及び/又は細胞膜透過性付与剤として有用である。また、本ヌクレオシド誘導体は、4’に塩基性の置換基を備えることができる。これにより、オリゴリボヌクレオチド等におけるリン酸基などに由来する負電荷を調整することができるという電荷調節剤又は正電荷付与剤として機能することができる。

0158

なお、本明細書に開示されるオリゴリボヌクレオチドは、式(3)及び式(4)で表される部分構造を少なくとも1個含有することができる。式(3)及び式(4)で表される部分構造は、それぞれ、式(1)及び式(2)で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩に基づいて取得されうる。

0159

0160

式(3)及び式(4)で表される部分構造におけるR1、X,R3及びBについては、式(1)及び式(2)におけるのとそれぞれ同義である。

0161

式(3)及び式(4)で表される部分構造は、オリゴリボヌクレオチド中において2個以上含んでいてもよい。その場合、これらの部分構造は、互いに同一であっても異なっていてもよい。また、オリゴリボヌクレオチドに含まれる部分構造の全体は、式(3)で表される部分構造のみから構成されていてもよいし、式(4)で表される部分構造のみから構成されていてもよい。また、式(3)で表される部分構造1又は2以上有し、かつ式(4)で表される部分構造を1又は2以上有していてもよい。

0162

また、式(3)及び式(4)で表される部分構造の配置としては、互いに隣り合ってもよいし、離れて存在してもよい。例えば、オリゴリボヌクレオチドは、前記部分構造を少なくとも3個備えることができる。この場合、各部分構造を、オリゴリボヌクレオチドの5’末端側、中央部及び3’末端側に略均等に備えることができる。部分構造をオリゴリボヌクレオチドのこれら各部に略均等に備える、とは、これらの各部において、同数個を必ずしも部分構造を備えることを限定するものではなく、これら各部に少なくとも1個をそれぞれ備えることを少なくとも充足すれば足りる。例えば、各部に1〜3個程度の部分構造を備える場合には、略均等ということができる。部分構造は、オリゴリボヌクレオチドにおいて、少なくとも6個備えることができる。

0163

式(3)で表される部分構造は、糖鎖部分がリボース又はデオキシリボースに由来していることから、オリゴリボヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドであってもよいし、オリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。また、オリゴリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとのキメラであってもよい。

0164

オリゴリボヌクレオチドは、それ自体一本鎖であるが、オリゴリボヌクレオチド、及びオリゴデオキシリボ/リボヌクレオチド(キメラ鎖)とのハイブリッド、すなわち、二本鎖の形態を採ることもできる。

0165

オリゴリボヌクレオチドは、式(3)及び式(4)で表される部分構造以外の部分構造としては、その他の天然のヌクレオチド、又は公知のヌクレオシド誘導体及び/又はヌクレオチド誘導体などに該当する部分構造を備えることができる。本明細書において規定する部分構造及びその他の部分構造は、互いに、例えば、リン酸ジエステル結合、リン酸モノエステル結合、チオリン酸エステル結合等によって結合されうる。

0166

オリゴリボヌクレオチドは、部分構造及びその他のヌクレオシド誘導体の個数を単位として、少なくとも2個以上、さらには8個以上であることが好ましく、特に好ましくは15個以上であることが挙げられる。上限としては特に限定されないが、例えば100個以下であり、また例えば、80個以下であり、また例えば、60個以下であり、また例えば、50個以下であり、また例えば、40個以下であり、また例えば、30個以下であり、また例えば、20個以下であってもよい。

0167

オリゴリボヌクレオチドは、式(3)及び式(4)で表される部分構造ほか、その他の部分構造において、一個以上の不斉中心を有する場合があり、立体異性体が存在する場合も同様であって、立体異性体の任意の混合物、又はラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また互変異性体として存在しうる場合もある。

0168

オリゴリボヌクレオチドは、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、薬学的に許容される塩が好ましい例として挙げられる。塩については、既述の本ヌクレオシド誘導体における塩の態様を適用することができる。オリゴリボヌクレオチド又はその塩としては、水和物や溶媒和物であってもよく、これらも本発明の範囲に含まれる。

0169

(本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドの製造)
本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドは、当業者であれば、後段の具体的な合成例のほか、本願出願時において公知のヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドについての合成技術に基づいて、容易に合成されうる。

0170

本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドは、例えば下記の方法により製造できるが、本発明のヌクレオシド類縁体又はオリゴリボヌクレオチドの製造方法は下記の方法に限定されるものではない。

0171

それぞれの反応において、反応時間は特に限定されないが、後述の分析手段により反応の進行状態を容易に追跡できるため、目的物の収量が最大となる時点で終了すればよい。また、それぞれの反応は必要により、例えば、窒素気流下又はアルゴン気流下などの不活性ガス雰囲気下で行うことができる。それぞれの反応において、保護基による保護及びその後の脱保護が必要な場合は、後述の方法を利用することにより適宜反応を行うことができる。

0172

なお、本明細書においては、Bnはベンジル基を示し、Acはアセチル基を示し、Bzはベンゾイル基を示し、PMBはp−メトキシベンジル基を示し、Trはトリフェニルメチル基を示し、THAは、トリフルオロアセチル基を示し、TsOは、トシルオキシ基を示し、MMTrは4−メトキシトリフェニルメチル基を示し、DMTrは4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル基を示し、TMSはトリメチルシリル基を示し、TBDMSはtert−ブチルジメチルシリル基を示し、TBDPSはtert−ブチルジフェニルシリル基を示し、MOMはメトキシメチル基を示し、BOMはベンジルオキシメチル基を示し、SEMは2−(トリメチルシリル)エトキシメチル基を示す。

0173

例えば、本ヌクレオシド誘導体の一例は、以下のスキームに従い合成することができる。なお、以下のスキームは、グルコース出発物質として、チミンリボヌクレオシド誘導体を合成し、オリゴリボヌクレオチドの合成のためのホスホロアミダイト剤を合成するまでのスキームの一例である。

0174

0175

0176

常法に従い、グルコース1から、上記化合物2を取得した。化合物2から、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672, The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962,HELVATICACHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151等のほか、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672の記載に基づいて化合物3ないし化合物20を得ることができる。

0177

式(3)及び(4)で表される部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドは、式(1)又は(2)で表される各種の本ヌクレオシド誘導体を、アミダイト剤等として利用することで容易に製造できる。すなわち、こうしたヌクレオシド誘導体を用いることで、公知のDNA合成機を用いて合成することができ、得られるオリゴヌクレオチド誘導体は、カラムを用いて精製し、生成物純度逆相HPLCやMALDI−TOF−MSで分析することにより、精製されたオリゴリボヌクレオチドを得ることができる。なお、オリゴリボヌクレオチドを酸付加塩とする方法は、当業者に周知である。

0178

オリゴリボヌクレオチドによれば、リボース4’位に連結基を介して所定のN含有基を備えることで、RNA干渉能等の生体におけるRNA機能を維持しつつ、RNAの実質電荷量を調節でき、脂溶性ファンデルワールス分子間力)を増強し、dsRNA溶融温度をさげることを実現できる。これにより、リボヌクレアーゼ耐性を向上させることができるほか、細胞膜透過性を向上させることができる。さらに、リン酸基等によるマイナス電荷を中和し、全体としての電荷を調節することもできる。

0179

オリゴリボヌクレオチドにおいては、本部分構造を少なくとも2個備えることができる。本部分構造を複数個備えることで、細胞膜透過性、リボヌクレアーゼ耐性等を確実に向上させ、また調整することができる。また、オリゴリボヌクレオチドは、本部分構造を少なくとも3個備えることもできる。

0180

オリゴリボヌクレオチドにおいては、1個又は2個以上の本部分構造の備える部位は特に限定するものではないが、例えば、5’末端側及び3’末端側のいずれか及び双方に備えることができる。5’末端側及び3’末端側とは、それぞれ、本オリゴヌクレオチドのポリマー鎖の各末端から適数個の範囲の領域をいい、それぞれ、ポリマー鎖の全構成単位の、例えば30%を超えない構成単位からなる領域をいう。上記末端からの範囲の割合は、ポリマー鎖の全長によっても異なるが、例えば25%以下、また例えば20%以下、また例えば10%以下、また例えば5%以下などとすることができる。より具体的には、5’末端側及び3’末端側とは、例えば各末端から1個〜30個、また例えば例えば1個〜25個、また例えば1個〜20個、また例えば1個〜15個、また例えば1個〜10個、また例えば1個〜8個、また例えば1個〜6個、また例えば1個〜5個、また例えば1個〜4個、また例えば1〜3個、また例えば例えば1〜2個のヌクレオシド誘導体由来の構成単位の領域とすることができる。オリゴリボヌクレオチドは、こうした末端領域のいずれかに1個又は2個以上の本部分構造を備えることができる。好ましくは、2個以上備えることができる。また、オリゴリボヌクレオチドは、5’末端及び3’末端(すなわち、各末端から1個目の構成単位)のいずれか又は双方に本部分構造を備えることもできる。

0181

オリゴリボヌクレオチドにおいては、1個又は2個以上の本部分構造を、5’末端側及び3’末端側以外の部分である中央部に備えることもできる。オリゴリボヌクレオチドが、中央部に本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の向上や調整が一層容易になる。また、オリゴヌクレオチド全体の電荷の調整もより容易になる。

0182

オリゴリボヌクレオチドは、5’末端側及び3’末端側のいずれか又は双方と中央部に本部分構造を備えることもできる。好ましくは5’末端側、3’末端側及び中央部の各部に1個又は2個以上の本部分構造を備えることができる。このように、全体として、おおよそ均等にあるいは分散して本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性を向上させることができる。オリゴリボヌクレオチドの中央部には、本部分構造を2個以上備えることが、特性向上の観点から有用である。

0183

オリゴリボヌクレオチドにおける本部分構造としては、式(3)で表されるリボヌクレオシド誘導体由来する部分構造、式(4)で表されるデオキシリボヌクレオチド誘導体に由来する部分構造を用いることができる。なお、式(3)で表されるリボヌクレオシド誘導体及び式(4)の部分構造は、Bの塩基として、RNAにおける塩基であるウラシル(U)他を備えることで、リボヌクレオシド誘導体の代替物として用いることができる。

0184

また、本部分構造は、式(3)及び(4)におけるR3が、炭素数1又は2以上のアルキレン基を連結基として、NHR7を有することが、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性の観点から好適である。この場合、R7は、水素原子であってもよいし、炭素数1〜6程度のアルキル基を有するアシル基であってもよい。当該アルキレン基は、エチレン基、プロピレン基ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などとすることができる。また、例えばエチレン基、プロピレン基、ブチレン基などとすることができる。また例えば例えばエチレン基、プロピレン基などとすることができる。エチレン基、プロピレン基を連結基とすることで、メチレン基を用いた場合に比較して高いリボヌクレアーゼ耐性と細胞膜透過性さらには電荷調節性とを得ることができる。

0185

また、本部分構造は、連結基を備えるアミジノ基、アジド基及びグアニジノ基であってもよい。かかる官能基を備えることでも、高いリボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性を得ることができる。この場合、連結基は、炭素数1以上のアルキレン基であってもよい。

0186

また、本部分構造は、式(3)及び式(4)のR3の連結基が炭素数1〜6程度のアルキル基、さらに、例えば、炭素数の下限が2以上、また例えば3以上であることが好適である。かかる構造は、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性に有効である。

0187

オリゴリボヌクレオチドは、少なくとも本部分構造を少なくとも6個備えることが好適である。6個以上備えることで、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性、さらには電荷調節性に有利である。

0188

本コンジュゲートにおけるオリゴリボヌクレオチドにおいては、細胞質内において実質的に機能するRNA鎖ではないRNA鎖やその部分において、本部分構造を備えることが好適である。例えば、本コンジュゲートが、オリゴリボヌクレオチドの二重鎖を備えるsiRNAを意図する場合には、センス鎖に本部分構造を備えることで、本コンジュゲートの細胞透過性とヌクレアーゼ耐性とを期待することができる。また、siRNA以外の短鎖RNAへの導入に関しては、RNAの立体構造上表面に位置する箇所へは本部分構造を備えるようにし、5’末端及び/又は3‘末端へは、本試薬を備えるようにすることが好ましい。

0189

本コンジュゲートは、例えば、siRNAとして利用できる。すなわち、オリゴリボヌクレオチド二重鎖を備える本コンジュゲートは、生体内成分(RISCタンパク質)と複合体を形成して、配列特異的にmRNAを切断することにより、mRNA上の情報がリボソームにより特定のタンパク質へ翻訳されることをできなくする。また、miRNAを構成する構成物として、あるいはまたアプタマーRNAの構成物としても取り込まれて、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性向上の特徴を生かしつつ、利用できると考えられる。さらに、他の化合物と連結してコンジュゲートを構成することもできる。さらにまた、本コンジュゲートは、リボザイムの構成物としても利用できる。

0190

これらのことから本コンジュゲートは、天然ヌクレオチドにはない特徴を生かして、抗腫瘍剤抗ウイルス剤をはじめとする遺伝子の働きを阻害して疾病治療する種々のRNA医薬品の構成物として、天然ヌクレオチドに優る有用性が期待される。すなわち、本コンジュゲートは、こうしたRNA医薬のほか、その原料又は中間体試薬として有用である。

0191

本コンジュゲートにおけるオリゴリボヌクレオチドの電荷調節性、リボヌクレアーゼ耐性、細胞膜透過性、電荷調節能ならびにオリゴリボヌクレオチドを含む種々のRNAの生物活性については、当業者であれば、適宜、後述する実施例や本願出願時における当業者の周知の手法を参照することで容易に評価することができる。

0192

以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。

0193

(アミノ修飾アミダイトの合成)
本実施例では、以下のスキームに従い、細胞接着性モチーフ(RGDモチーフ)単位導入用モノマーとして以下の化合物5を合成した。

0194

0195

6-trifluoroacetamido-hexanoic acid (3)
アルゴン雰囲気下、6−aminohexanoic acid(2)(0.60g,4.57mmol)をMeOH(15mL)に溶解させた。続いてTEA(1.0mL、6.86mmol)、CF3COOEt(0.8mL,6.86mmol)を加え室温で一晩撹拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、化合物3(0.45g,1.98mmol,43%)を得た。
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 6.36 (s, 1H), 3.39 (dd, 2H, J = 6.9), 2.39 (t, 2H, J = 7.3), 1.70-1.60 (m, 4H), 1.16-1.09 (m, 2H).

0196

(S)-3-[(6-trifluoroacetamido)hexanamido]-1-(4,4’-dimethoxytrityloxy)-2-propanol (4)
アルゴン雰囲気下、化合物3(0.45g,1.98mmol)をDMF(5mL)に溶解させた。続けてTEA(0.4mL,1.98mmol)、DMF(5mL)に溶解させた化合物11,2(0.65g,1.65mmol)、EDCl(0.38g,1.98mmol)、DMAP(0.24g,1.98mmol)を加え室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとH2Oで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液飽和食塩水洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒エバポレータにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィークロロホルムメタノール=30:1)にて精製することで、化合物4(0.78g,1.28mmol,78%)を得た。

0197

(S)-3-[(6-trifluoroacetamido)hexanamido]-1-(4,4’-dimethoxytrityloxy)propyl-2-O-[(2-cyanoethyl)(N,N-diisopropylamino)]phosphoramidite (5)
アルゴン雰囲気下、化合物4(0.64g,1.06mmol)をCH2Cl2に溶解させた。続けてDIPEA(0.7mL,4.24mmol)、2−CyanoethylN,N−diisopropylchlorophosphoramidite(0.5mL,2.12mmol)を加え室温で1時間撹拌した。生成物をクロロホルムとH2Oで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒エバポレーターにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:2)にて精製し、化合物5(0.43g,0.54mmol,51%)を得た。
31P NMR(242MHz, CDCl3) δ 149.7, 149.0.

0198

(固相担体の合成)
本実施例では、以下のスキームに従い、細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーが結合された固相担体として以下の化合物を合成した。

0199

0200

実施例1で合成した化合物4(0.10g,0.17mmol)、succinicanhydride(0.10g,1.00mmol)、DMAP(61mg,0.50mmol)をpyridine(2mL)に溶解し、室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとH2Oで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒をエバポレーターで減圧濃縮し、スクシニル体を得た。続けて、Ar雰囲気下でスクシニル体をDMF(1.7mL)に溶解し、EDC(32mg,0.17mmol)、CPG樹脂(0.26g,0.04mmol)を加えて室温で3日間静置した。CPG樹脂をフィルターに移し、Pyridineで洗浄した後、Ar雰囲気下でpyridine(5mL)、DMAP(0.18g,1.47mmol)、Aceticanhydride(1.5mL,15.87mmol)を加え一晩静置した。CPG樹脂をフィルターに移し、Pyridine、EtOH、MeCNで洗浄後、樹脂を乾燥し目的の固相担体を導入効率25.8μmol/gで得た。

0201

(スペーサーアミダイトの合成)
本実施例では、以下のスキームに従い、スペーサー単位導入用モノマーとして、以下の化合物8を合成した。

0202

0203

18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol (7)
Ar雰囲気下、Hexaethylenglycol(6)(1.7mL,5.31mmol)をpyridine(30mL)に溶解し、DMTrCl(1.36g,4.00mmol)を加えて室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとH2Oで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒をエバポレーターで減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=20:1)で精製し、化合物7(1.49g,2.55mmol,48%)で得た。
1H NMR(600MHz, CDCl3) δ 7.46 (d, 2H, J = 7.56), 7.35-7.33 (m, 4H), 7.28 (d, 2H, J = 7.56), 7.20 (t, 1H, J= 7.56), 6.83-6.80 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.70 (m, 2H,), 3.69-3.63 (m, 17H), 3.59 (t, 2H, J = 4.80), 3.22 (t, 2H, J= 5.46), 1.99 (s, 1H).

0204

18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol-1-[(2-cyanoethyl)(N,N-diisopropylamino)]phosphoramidite (8)
アルゴン雰囲気下、化合物7(1.49g,2.55mmol)をCH2Cl2に溶解させた。続けてDIPEA(1.8mL,10.20mmol)、2−CyanoethylN,N−diisopropylchlorophosphoramidite(1.1mL,5.10mmol)を加え室温で1時間撹拌した。生成物をクロロホルムとH2Oで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性の溶媒をエバポレーターにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:2)にて精製し、化合物8(1.08g,1.38mmol,54%)を得た。
31P NMR(242MHz, CDCl3) δ 149.9, 148.9.

0205

(オリゴヌクレオチド誘導体の合成)
核酸自動合成機を用いてホスホロアミダイト法に従い、実施例1〜3で合成した細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー、固相担体及びスペーサー単位導入用モノマー及び各種ヌクレオチドを用いて、0.2μmolスケールでオリゴヌクレオチド誘導体を合成した。塩基の脱保護と樹脂からの切り出しは、NH4OH:EtOH=3:1溶液1mL中で55°C、4時間インキュベートにより行った。糖部2’−位のTBDMS基の脱保護は、DMSO100μL、TEA・3HF125μL溶液中で65°C、1.5時間インキュベートにより行った。更に、7M ureaを含む20%PAGEを用いて精製を行い、目的の配列のオリゴヌクレオチドを合成した。

0206

以下の表中、0N1、3及び7がRecQL1RNAの化学修飾したガイド鎖であり、ON2、4、5及び6が、RecQL1RNAの天然及び化学修飾したパッセンジャー鎖であり、ON8がルシフェラーゼRNAの天然ガイド鎖であり、ON9がルシフェラーゼのRGD修飾したパッセンジャー鎖である。

0207

0208

なお、表中、小文字の塩基は2’−OMeヌクレオチドを表し、アンダーバーの塩基はリボースの2’−Fヌクレオチドを表し、pは、PEGスペーサー単位導入用モノマーを表し、Xは細胞接着性モチーフ単位としてcRGDを有する細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーを表し、「・」は、ホスホロチオエート結合を表す。

0209

(cRGDコンジュゲートオリゴヌクレオチドの合成)
実施例4で合成したオリゴヌクレオチド誘導体(20nmol)を320μLの0.1Mリン酸緩衝液(pH=7.4)に溶解し、50mM 6−maleimidohexanoicacidN−hydroxysuccinimideester(EMCS)/DMSO溶液を80μL(400nmol)加え、室温で一晩インキュベートした。マレイミド化したオリゴヌクレオチドをHPLCで分取し、回収した溶液に、50mMcRGD(フナコシ株式会社製、構造式を以下に示す。)/DMSO溶液16μL(80nmol)を直接加えた。室温で一晩インキュベートして、マイケル付加反応により、オリゴリボヌクレオチド誘導体のマレイミド基と、cRGDのチオール基とを連結させた後、反応液をHPLCで精製し、目的のcRGDオリゴヌクレオチドコンジュゲートを得た。

0210

0211

蛍光顕微鏡による観察)
メラノーマ細胞A2058を0.3×105cell/mLで35mmガラスボトムディディッシュ播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した。培地を除去した後、ディッシュをOPTI−MEMで洗浄し、実施例4及び5で調製したオリゴリボヌクレオチド誘導体250nMを用いてsiRNAコンジュゲートM/OPTI−MEM溶液を添加した。なお、用いたsiRNAは、以下の組合せとした。

0212

siRNA(1):ON3/ON2:cRGDモチーフ単位及びスペーサー単位を備えない
siRNA(2):ON3/ON4:cRGDモチーフ3個を備えスペーサー単位を備えない
siRNA(3):ON3/ON5:cRGDモチーフ3個を備えスペーサー単位1個を備える
siRNA(4):ON3/ON6:cRGDモチーフ3個とスペーサー単位3個を交互に備える

0213

ディッシュにsiRNAを添加後、CO2インキュベーターで18時間培養し、その後Hoechst33342を終濃度25μg/mLとなるように添加した。CO2インキュベーターで10分間培養した後、染色試薬を除去し、ディッシュをPBSで洗浄した。ディッシュにPBSを添加し、蛍光顕微鏡で細胞を観察した。結果を図4に示す。

0214

図4に示すように、cRGDモチーフとスペーサー単位とを組み合わせることによって、細胞内取り込みが向上していることがわかった。特に、cRGDモチーフとスペーサー単位とを交互に3個備えて、cRGDモチーフ間がスペーサー単位で離間された構造を備えるsiRNA(4)は、高い細胞内取り込み率を示した。

0215

ウェスタンブロッティング
メラノーマ細胞A2058を0.3×105cell/mLで6wellプレートに播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した。培地を除去した後、6wellプレートをOPTI−MEMで洗浄し、実施例4及び5で合成したオリゴリボヌクレオチド誘導体を用いた50nMまたは250nMのsiRNAコンジュゲート/OPTI−MEM溶液を添加した。CO2インキュベーターで18時間培養した後、全細胞を回収し、lysis buffer(10mMTris−HCl(pH7.4),1%NP−40,0.1%deoxycholicacid,0.1%SDS,150mMNaCl,1mMEDTA,1%Protease Inhibitor Cocktail)を加えて20分間上に静置した。

0216

siRNA(4):ON7/ON2:cRGDモチーフ単位及びスペーサー単位を備えない
siRNA(5):ON8/ON9:cRGDモチーフ3個とスペーサー単位3個を交互に備える
siRNA(6):ON7/ON6:cRGDモチーフ3個とスペーサー単位3個を交互に備える

0217

得られた細胞懸濁液を4°C、13000rpm、20分間遠心し、上清タンパク溶液として回収した。溶液中の濃度はDCproteinassaykit(Biorad,Hercules)で測定した。10μgのタンパク溶液を12.5%SDS−PAGEで分離し、PVDFメンブレン上にブロッティングした。メンブレンを5%スキムミルク溶液でブロッキング処理し、RecQL1抗体溶液中、4°Cで一晩静置した。メンブレンを洗浄し、HRP結合2次抗体を加えて1時間浸透した後、AmmershamECLPlusWesternBlottingDetectionReagents(GEHealthcare)をメンブレン上に直接添加し、RecQL1タンパクを検出した。結果を図5に示す。

実施例

0218

図5に示すように、siRNA(4)(si−RecQL1)とsiRNA(6)(si−RecQL1+RGD)を比較すると、+RGDでのみタンパク質の発現量の減少が見られた。これはRGD修飾がなければsiRNAが細胞内に取り込めないのに対し、本試薬によるRGD修飾によってsiRNAが効率的に細胞内に取り込まれたことを示している。さらに、siRNA(5)(si−Luciferase+cRGD)とsiRNA(6)(si−RecQL1+RGD)とを比較すると、Luciferaseの方ではタンパク質の発現量に変化が見られていない。このことから、si−RecQL1+RGDはRecQL1mRNAに対して選択的に働き、si−RecQL1のRNAi活性によってタンパク質の発現が抑制されたことが明らかとなった。以上のことから、本試薬によるRGD修飾様式によってsiRNAの効率的な細胞内取り込み及びRISC形成を介したRNAi活性による標的遺伝子発現抑制を可能にすることが示された。

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