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図面 (12)

課題

細胞侵入および形質導入のための代替経路を利用するために、多重グリカン結合能を有するウイルスベクターの提供。

解決手段

AVカプシドタンパク質中に新規のグリカン結合部位を導入するために、1つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質を有するウイルスベクター。前記アミノ酸置換は、特定の配列を有するAAV2中のアミノ酸266、アミノ酸463〜475およびアミノ酸499〜502に存在するか、または、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8もしくはAAV10における対応するアミノ酸位置中に存在する。

概要

背景

ウイルスグリカン相互作用は、宿主細胞侵入の重要な決定因子である。シアル酸、ガ
グリオシドまたはヘパラン硫酸などの細胞表面炭水化物は、膨大な数のウイルス、例え
インフルエンザヘルペスウイルスSV40ポリオーマウイルスパピローマウイ
ルスおよび他の病原体によって利用されている1、2。ほとんどの場合、単一のクラスの
グリカンが、ウイルスに対する細胞表面結合因子として主に作用し、細胞侵入のための他
受容体共受容体の連続的または並行した係合をもたらす。アデノ随伴ウイルス(AA
V)は、細胞表面結合のための主な受容体として、ヘパラン硫酸(HS)、ガラクトース
(Gal)またはシアル酸(Sia)を利用する、ヘルパー依存的パルボウイルスである
3、4。例えば、AAV血清型2および3bは、HSを利用し、AAV1、4および5は
、異なる連結特異性でSiaに結合し、一方、AAV9は、宿主細胞結合のためにGal
を利用する。異なるAAV株は、細胞取り込みのために、共受容体、例えばインテグリン
αVβ5もしくはα5β1線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)、血小板由来増殖因
子受容体(PDGFR)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子受容体(H
GFR)またはラミニン受容体との引き続く相互作用もまた必要とする3、4。

特定のAAV株と単一のクラスの炭水化物との間の1対1の(monogamous)
関係からの顕著な例外は、SiaおよびHSの両方を認識するAAV血清型6である5。
しかし、Siaのみが、ウイルス形質導入に必須であることが示されている。構造研究に
より、現在、AAV6カプシドのVP3サブユニット中のR488、K528およびK5
33と合わせたK531残基が、HSグリコサミノグリカン静電気的認識のための連続
塩基性パッチを形成することが確立されている6〜8。同様に、AAV2およびAAV
3bによるHS認識の構造的基礎は、周知であり、三回対称軸に位置する塩基性アミノ酸
残基の類似のクラスターに帰せられる9〜12。AAV1、AAV4、AAV5およびA
AV6についてのSia結合フットプリントは、いまだ決定されていない。より最近、A
AV9カプシドによるGal認識に関与する重要なアミノ酸残基が、分子ドッキングおよ
部位特異的変異誘発の組み合わせを使用することによって同定された13。細胞侵入お
よび形質導入のための代替経路を利用するために、多重グリカン結合能を有するウイル
ベクターが必要とされている。

本発明は、複数のグリカン結合部位を有する改変されたカプシドタンパク質、これらの
カプシドタンパク質を含むAAVベクター、および治療ベクターとしてのそれらの使用の
ための方法を提供することによって、当該分野における以前の欠陥を克服するものである

概要

細胞侵入および形質導入のための代替的経路を利用するために、多重グリカン結合能を有するウイルスベクターの提供。AAVカプシドタンパク質中に新規のグリカン結合部位を導入するために、1つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質を有するウイルスベクター。前記アミノ酸置換は、特定の配列を有するAAV2中のアミノ酸266、アミノ酸463〜475およびアミノ酸499〜502に存在するか、または、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8もしくはAAV10における対応するアミノ酸位置中に存在する。

目的

本発明は、複数のグリカン結合部位を有する改変されたカプシドタンパク質、これらの
カプシドタンパク質を含むAAVベクター、および治療ベクターとしてのそれらの使用の
ための方法を提供する

効果

実績

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0件
牽制数
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請求項1

1つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質であって、前記置換が、前記AAVカプシドタンパク質中に新規グリカン結合部位を導入する、アデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質。

請求項2

前記アミノ酸置換が、AAV2中のアミノ酸266、アミノ酸463〜475およびアミノ酸499〜502、またはAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8もしくはAAV10における対応するアミノ酸位置に存在する、請求項1に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項3

前記新規のグリカン結合部位が、ヘキソース結合部位であり、前記ヘキソースが、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)、グルコース(Glu)またはフコース(fuc)である、請求項1に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項4

前記新規のグリカン結合部位が、シアル酸(Sia)結合部位であり、Sia残基が、N−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)またはN−グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)である、請求項1に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項5

前記新規のグリカン結合部位が、二糖結合部位であり、前記二糖が、Sia(α2,3)GalまたはSia(α2,6)Galの形態の、ガラクトースに連結されたシアル酸である、請求項1に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項6

前記新規のグリカン結合部位が、ガラクトース結合部位である、請求項2に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項7

前記置換が、第1のAAV血清型由来の新規のグリカン結合部位を、前記第1のAAV血清型とは異なる第2のAAV血清型のカプシドタンパク質中に導入する、請求項1に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項8

前記第2のAAV血清型の血清型が、AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3a(AAV3a)、AAV血清型3b(AAV3b)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)またはAAV血清型10(AAV10)である、請求項7に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項9

前記新規のグリカン結合部位が、AAV血清型9(AAV9)由来のガラクトース結合部位である、請求項7に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項10

前記AAVカプシドタンパク質が、AAV2由来であり、a)アミノ酸266における前記置換がA266Sであり、b)アミノ酸463〜475における前記置換が、SQAASDIRDQSR463〜475SX1AGX2SX3X4X5X6QX7Rであり、式中、X1〜7は、任意のアミノ酸であり得、かつc)アミノ酸499〜502における前記置換が、EYSW499〜502EX8X9Wであり、式中、X8〜9は、任意のアミノ酸であり得る、請求項2に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項11

X1がVであり、X2がPであり、X3〜6がNMAVであり、X7がGである、請求項10に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項12

X8がFであり、X9がWである、請求項10に記載のAAVカプシドタンパク質。

請求項13

請求項1〜12のいずれか1項に記載のAAVカプシドタンパク質を含む、AAVカプシド。

請求項14

(a)請求項13に記載のAAVカプシドと、(b)少なくとも1つの末端反復配列を含む核酸と、を含むウイルスベクターであって、前記核酸が、前記AAVカプシドによってカプシド封入されている、ウイルスベクター。

請求項15

薬学的に許容される担体中に、請求項1〜12のいずれか1項に記載のAAVカプシドタンパク質、請求項13に記載のAAVカプシドまたは請求項14に記載のウイルスベクターを含む、組成物

請求項16

細胞を請求項14に記載のウイルスベクターと接触させるステップを含む、細胞中に核酸を導入する方法。

請求項17

前記細胞が対象中に存在する、請求項16記載の方法。

請求項18

前記対象がヒト対象である、請求項17に記載の方法。

技術分野

0001

優先権の申立]
本出願は、米国特許法第119(e)の下で、その全内容が参照により本明細書の一部
をなす2013年3月15日出願の米国仮特許出願第61/802,111号の利益を主
張する。

0002

政府支援の明示]
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第R01HL089221号、第
P01HL112761号および第R01AI072176号の下で、政府の支援により
行われたものである。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。

0003

[発明の分野]
本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)由来改変されたカプシドタンパク質、それ
を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクター、ならびにそれらの使用の方法に関する

背景技術

0004

ウイルスグリカン相互作用は、宿主細胞侵入の重要な決定因子である。シアル酸、ガ
グリオシドまたはヘパラン硫酸などの細胞表面炭水化物は、膨大な数のウイルス、例え
インフルエンザヘルペスウイルスSV40ポリオーマウイルスパピローマウイ
ルスおよび他の病原体によって利用されている1、2。ほとんどの場合、単一のクラスの
グリカンが、ウイルスに対する細胞表面結合因子として主に作用し、細胞侵入のための他
受容体共受容体の連続的または並行した係合をもたらす。アデノ随伴ウイルス(AA
V)は、細胞表面結合のための主な受容体として、ヘパラン硫酸(HS)、ガラクトース
(Gal)またはシアル酸(Sia)を利用する、ヘルパー依存的パルボウイルスである
3、4。例えば、AAV血清型2および3bは、HSを利用し、AAV1、4および5は
、異なる連結特異性でSiaに結合し、一方、AAV9は、宿主細胞結合のためにGal
を利用する。異なるAAV株は、細胞取り込みのために、共受容体、例えばインテグリン
αVβ5もしくはα5β1線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)、血小板由来増殖因
子受容体(PDGFR)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子受容体(H
GFR)またはラミニン受容体との引き続く相互作用もまた必要とする3、4。

0005

特定のAAV株と単一のクラスの炭水化物との間の1対1の(monogamous)
関係からの顕著な例外は、SiaおよびHSの両方を認識するAAV血清型6である5。
しかし、Siaのみが、ウイルス形質導入に必須であることが示されている。構造研究に
より、現在、AAV6カプシドのVP3サブユニット中のR488、K528およびK5
33と合わせたK531残基が、HSグリコサミノグリカン静電気的認識のための連続
塩基性パッチを形成することが確立されている6〜8。同様に、AAV2およびAAV
3bによるHS認識の構造的基礎は、周知であり、三回対称軸に位置する塩基性アミノ酸
残基の類似のクラスターに帰せられる9〜12。AAV1、AAV4、AAV5およびA
AV6についてのSia結合フットプリントは、いまだ決定されていない。より最近、A
AV9カプシドによるGal認識に関与する重要なアミノ酸残基が、分子ドッキングおよ
部位特異的変異誘発の組み合わせを使用することによって同定された13。細胞侵入お
よび形質導入のための代替経路を利用するために、多重グリカン結合能を有するウイル
ベクターが必要とされている。

0006

本発明は、複数のグリカン結合部位を有する改変されたカプシドタンパク質、これらの
カプシドタンパク質を含むAAVベクター、および治療ベクターとしてのそれらの使用の
ための方法を提供することによって、当該分野における以前の欠陥を克服するものである

0007

一態様では、本発明は、1つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス(A
AV)カプシドタンパク質を提供し、前記置換は、このAAVカプシドタンパク質中に新
規のグリカン結合部位を導入する。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸置換は、AA
V2中のアミノ酸266、アミノ酸463〜475およびアミノ酸499〜502、また
は、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8もしくは
AAV10における対応するアミノ酸位置中に存在する。

0008

いくつかの実施形態では、新規のグリカン結合部位は、ヘキソース結合部位であり得、
前記ヘキソースは、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)、グルコース(Gl
u)またはフコース(fuc)である。

0009

いくつかの実施形態では、前記新規のグリカン結合部位は、シアル酸(Sia)結合部
位であり得、前記Sia残基は、N−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)またはN−
グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)である。

0010

いくつかの実施形態では、前記新規のグリカン結合部位は、二糖結合部位であり得、前
記二糖は、Sia(α2,3)GalまたはSia(α2,6)Galの形態の、ガラ
トースに連結されたシアル酸である。

0011

いくつかの実施形態では、前記置換は、第1のAAV血清型由来の新しいグリカン結合
部位を、この第1のAAV血清型とは異なる第2のAAV血清型のカプシドタンパク質中
に導入する。

0012

本発明は、本発明のAAVカプシドタンパク質を含むAAVカプシドもまた提供する。

0013

本発明のAAVカプシドを含むウイルスベクター、ならびに薬学的に許容される担体
に本発明のAAVカプシドタンパク質、AAVカプシドおよび/またはウイルスベクター
を含む組成物が、本明細書中でさらに提供される。

0014

本発明は、細胞を本発明のウイルスベクターと接触させるステップを含む、細胞中に核
酸を導入する方法をさらに提供する。この細胞は、対象中に存在し得、いくつかの実施形
態では、この対象はヒト対象であり得る。

0015

本発明のこれらおよび他の態様は、以下に示す本発明の説明においてより詳細に扱われ
る。

図面の簡単な説明

0016

AAV1、AAV2、AAV6、AAV8およびAAV9のVP3モノマーの構造的アラインメントを示す図である。(a)ループI〜IXが標識され、対称軸が示された、AAV1(青紫色)、AAV2(藍色)、AAV6(明るいマゼンタ)、AAV8(緑色)およびAAV9(色)のVP3モノマーの重ね合わせ。(b)AAV9上のガラクトース結合部位ならびにAAV1、AAV2、AAV6およびAAV8上の等価な残基のオーバーレイクローズアップ図。アミノ酸残基は、(a)中の色コードマークされている。座標は、VPモノマーのX線結晶学構造から得た(PDB受託番号:AAV1−3NG9、AAV2−1LP3、AAV6−3OAH、AAV8−2QA0、AAV9−3UX1)。構造的アラインメントを実施し、PyMOLを使用して可視化した。
G−変異体が、インビトロで細胞を形質導入するための新規グリカン受容体としてGalを利用することを示す図である。(a)チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株に対するAAV1、1G9およびAAV9の形質導入効率。Pro5およびLec2細胞を、4℃で60分間の1000vg/細胞のMOIでのAAV−CBA−ルシフェラーゼ感染の前に、4℃に30分間予め冷却した。氷冷PBSによる3回の洗浄によって未結合ビリオンを除去した後、感染細胞を、37℃インキュベーター中で24時間培養した。発光分析を実施して、細胞溶解物からのルシフェラーゼ導入遺伝子発現効率を定量した。(b)Pro5およびLec2細胞に対するAAV2i8、2i8G9およびAAV9の形質導入効率。(c)Pro5およびLec2細胞に対するAAV6、6G9およびAAV9の形質導入効率。(d)Pro5およびLec2細胞に対するAAV8、8G9およびAAV9の形質導入効率。結果は、平均±標準誤差として示される(n=4)。統計的有意性を、片側スチューデントt検定を使用して評価した(n.s.、有意性なし;*p<0.05;**p<0.01)。
二重グリカン結合性AAV2G9キメラならびにその親株AAV2およびAAV9の三次元モデルを示す図である。(A)それぞれ紫色および橙色に着色した既存のHSおよび「移植された」Gal結合部位を有する、インタクトなAAV2G9カプシドの三次元構造モデル。(B〜D)AAV2(B)、AAV9(C)およびAAV2G9(D)カプシドの三回対称軸におけるVP3トリマー三次元表面モデル図解。HS結合に関与する残基(AAV2 VP1の番号付け:R487、K527、K532、R585、R588)およびGal結合に関与する残基(AAV9 VP1の番号付け:D271、N272、Y446、N470、A472、V473、W503)は、(A)と同様に強調している。黒色三角形は、三回対称軸を示す。
二重グリカン結合性AAV2G9キメラのインビトロ特徴付けを示す図である。(A〜C)FITCECLおよび可溶性ヘパリンを用いた、CHO Lec2細胞に対するAAV2(A)、AAV9(B)およびAAV2G9(C)形質導入の阻害。CHO Lec2細胞を、4℃で予め冷却し、CBA−ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子カセットパッケージングするAAV2、AAV9またはAAV2G9による感染の前に、FITC−ECL、可溶性ヘパリンまたはその両方と共にインキュベートした。形質導入効率を、相対的光単位(RLU)でのルシフェラーゼ活性として、感染の24時間後に測定した。導入遺伝子発現の百分率を、対照由来のRLUに対して形質導入効率を正規化することによって計算した。結果は、平均±標準誤差として示される(n=4)。(D〜F)FITC−ECLおよび可溶性ヘパリンを用いた、CHO Lec2細胞に対するAAV2(D)、AAV9(E)およびAAV2G9(F)の細胞表面結合の競合的阻害。異なるAAV粒子を、4℃で予め冷却した細胞に結合させ、未結合ビリオンを、冷PBSによる洗浄によって除去した。結合ビリオンを、ウイルスゲノム抽出後にqPCRを使用して定量した。結合ビリオンの百分率を、対応する対照のものに対して、結合ビリオンの数を正規化することによって決定した。結果は、平均±標準誤差として示される(n=5)。統計的有意性を、片側スチューデントt検定を使用して分析した(*p<0.05;**p<0.01)。
感染後時間(hpi)0時間における、Lec2細胞表面上の結合ビリオンの免疫蛍光を示す図である。CHO Lec2細胞を、5×104細胞/カバーガラス密度で、12mmカバーガラス上で一晩プレートした。4℃で30分間予め冷却した後に、Lec2細胞に、4℃で30分間、1000vg/細胞のMOIで、AAV2、AAV2G9およびAAV9を感染させた。未結合ビリオンの除去後、細胞を、1×PBS中2%パラホルムアルデヒドで固定した。対応するハイブリドーマ培養物培地上清として得られたモノクローナル抗体(AAV2/AAV2G9についてはA20およびAAV9についてはADK9)を、免疫蛍光洗浄緩衝液(IFWB)中1:10希釈で使用して、インタクトなビリオンを検出した。Alexa Fluor 594(登録商標ヤギ抗マウスIgGを、免疫蛍光検出のための二次抗体として、IFWB中1:1000の希釈で利用した。次いで、カバーガラスを、DAPIと共にProlong(登録商標)Gold退色防止試薬中で、スライドガラス上に乗せた。蛍光顕微鏡写真を、63×油浸対物レンズおよびスペクトル検出ステムを備えたZeiss(登録商標)710共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得した。画像処理を、LSM(登録商標)ビューアーおよびImage J(登録商標)ソフトウェアを使用して実施した。白色のスケールバーは、10μmを示す。
AAV2カプシドまたはAAV9カプシドによるLec2細胞に対するAAV2G9形質導入の競合的阻害を示す図である。Lec2細胞を、AAV2G9−CBA−Luc粒子(MOI=1000vg/細胞)による感染の前に、2時間にわたって500〜100,000vg/細胞の範囲の感染多重度(MOI)で、(A)AAV2または(B)AAV9−CBA−tdTomatoと共に予めインキュベートした。AAV2G9形質導入の百分率阻害を、未処理対照のものに対してルシフェラーゼ導入遺伝子発現レベルを正規化することによって計算した。結果は、平均±標準誤差として示される(n=4)。統計的有意性を、片側スチューデントt検定を使用して分析した(*p<0.05;**p<0.01)。
感染後の示された時点での、Lec2細胞に対する、親AAV2およびAAV9と比較したAAV2G9の形質導入効率プロファイル動態を示す図である。予め冷却したLec2細胞に、記載したように、1000vg/細胞のMOIで、AAV2、AAV2G9またはAAV9−CBA−ルシフェラーゼベクターを感染させた。感染後の示された時点(18、24、28、42および54時間)において、細胞を、発光分析前に溶解させた。ルシフェラーゼ導入遺伝子発現を、相対的光単位(RLU)での細胞溶解物のルシフェラーゼ活性によって測定した(n=5)。統計的有意性を、片側スチューデントt検定を使用して評価した(*p<0.05;**p<0.01)。
AAV2G9が、インビボの迅速な開始および増強された導入遺伝子発現を媒介することを示す図である。(A)CBA−ルシフェラーゼ導入遺伝子カセットをパッケージングするAAV2、AAV2G9およびAAV9ベクターのインビボ導入遺伝子発現動態。BALB/cマウス(n=4)に、1×1011vg/動物の用量で、尾静脈を介してAAVベクターを投与し、生物発光画像を、Xenogen(登録商標)Lumina画像化システムを使用して、注射の3日後、7日後および18日後に収集した。代表的生動物画像は、虹色スケールで生物発光で示される(1×105〜1×106フォトン/秒/cm2/ステラジアン)。AAV2G9は、AAV2の肝指向性を維持するが、両方の親AAV株よりも迅速かつ強いルシフェラーゼシグナルを実証する。(BおよびC)光シグナルアウトプット(フォトン/秒/cm2/ステラジアンとして表される)の動態の定量を、異なる時間間隔において得た(B)肝臓領域および(C)動物全体の画像の周囲に関心領域(ROI)をマークすることによって実施した(n=4)。統計的有意性を、片側スチューデントt検定を使用して評価した(n.s.、有意性なし;*p<0.05;**p<0.01)。
マウスにおけるAAV2G9の導入遺伝子発現の定量および生体内分布プロファイルを示す図である。(A)3日目および18日目におけるAAV2(黒色)、AAV2G9(灰色)またはAAV9(白色)処理動物の心臓および肝臓組織溶解物からのルシフェラーゼ導入遺伝子発現の定量(n=4)。(B)3日目および18日目におけるAAV2(黒色)、AAV2G9(灰色)またはAAV9(白色)を投与したBALB/cマウスから得た肝臓および心臓の溶解物におけるベクターゲノムの生体内分布(n=4)。示された時点において、宿主ゲノムDNAおよびウイルスゲノムを、組織溶解物から単離し、マウスラミン遺伝子およびルシフェラーゼ導入遺伝子に特異的なプライマーセットを用いたqPCRを使用して定量した。結果は、平均±標準誤差として示される(n=4)。統計的有意性を、片側スチューデントt検定を使用して評価した(n.s.、有意性なし;*p<0.05;**p<0.01)。
CBA−ルシフェラーゼ導入遺伝子カセットをパッケージングするAAV2i8、2i8G9およびAAV9ベクターのインビボ導入遺伝子発現動態を示す図である。BALB/cマウス(n=4)に、1×1011vg/動物の用量で、尾静脈を介してAAVベクターを投与し、生物発光画像を、Xenogen(登録商標)Lumina画像化システムを使用して、注射後3日目、7日目および18日目に収集した。代表的生動物画像は、虹色スケールで表される生物発光で示される(105〜106フォトン/秒/cm2/ステラジアン)。
新生児マウスにおける代表的AAV「G9」株のCNS指向性プロファイルを示す図である。生後0(P0)子(n=3)に、ハイブリッドニワトリβアクチン(CBh)プロモーターによって駆動されるGFP導入遺伝子を含む3.5×10e9のAAVベクターゲノムを、左脳室中に片側性に注射した。注射の2週間後、GFP免疫組織化学により、マウス脳内の各AAV「G9」株についての示差的伝播、領域的指向性および細胞指向性が明らかになった。

0017

本発明は、本発明の代表的な実施形態が示された添付の図面を参照してここに記載され
る。しかし本発明は、異なる形態で具体化してもよく、本明細書中に示される実施形態に
限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ
完全となり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように提供されるものである。

0018

特に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発
明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中
で発明の説明において使用される術語は、特定の実施形態だけを記載することを目的とし
ており、本発明を限定することを意図しない。本明細書中で言及される全ての刊行物、特
許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

0019

本発明は、グリカン認識フットプリントを規定するAAVカプシドタンパク質上の「ポ
ケット」の発見に基づいている。このポケットを規定する特定のアミノ酸は同定されてお
り、例えばAAV9のガラクトース結合部位について、本明細書中に記載されている。本
発明では、このAAV9ガラクトース結合フットプリントをAAV2カプシドタンパク質
鋳型中に移植し、その結果、移植されたAAV2カプシドタンパク質鋳型における新しい
グリカン結合部位を導入した。このAAVガラクトース結合フットプリントは、例えば、
本明細書の表3に示される対応するアミノ酸を置換することによって、任意の他のAAV
血清型中に導入され得る。

0020

従って、本発明は、構造モデル化研究によって手引きされ、部位特異的変異誘発によっ
て達成される、1つのAAV株から別のAAV株へのグリカン認識フットプリントの分子
移植に関する。レポーターカセットをパッケージングする(これらの新しい株から誘導
た)組換えベクターは、細胞培養物および動物モデルにおいて、迅速な開始および増強さ
れた導入遺伝子発現を示す。鋳型として天然に存在する血清型/単離体を使用して、この
普遍的戦略は、ヒト遺伝子療法臨床試験において観察された用量依存免疫毒性などの課
題に取り組むことができる合成二重グリカン結合性AAV株のパネルを生成するために適
用され得る。

0021

従って、一態様では、本発明は、1つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイ
ルス(AAV)カプシドタンパク質を提供し、これらの置換は、AAVカプシドタンパク
質中に新しいグリカン結合部位を導入する。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸
置換は、AAV2中のアミノ酸266、アミノ酸463〜475およびアミノ酸499〜
502、またはAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV
8、AAV10もしくは表3中に同定される任意の他のAAV血清型中の対応するアミノ
酸位置中に存在する。

0022

いくつかの実施形態では、新しいグリカン結合部位は、ヘキソース結合部位であり得、
ヘキソースは、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)、グルコース(Glu)
またはフコース(fuc)である。

0023

いくつかの実施形態では、新しいグリカン結合部位は、シアル酸(Sia)結合部位で
あり得、Sia残基は、N−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)またはN−グリコ
ノイラミン酸(Neu5Gc)である。

0024

いくつかの実施形態では、新しいグリカン結合部位は、二糖結合部位であり得、二糖は
、Sia(α2,3)GalまたはSia(α2,6)Galの形態の、ガラクトースに
連結されたシアル酸である。

0025

いくつかの実施形態では、これらの置換は、第1のAAV血清型のカプシドタンパク質
(「ドナー」)由来の新しいグリカン結合部位を、第1のAAV血清型とは異なる第2の
AAV血清型のカプシドタンパク質(「鋳型」)中に導入する。

0026

本発明は、本発明のAAVカプシドタンパク質を含むAAVカプシドもまた提供する。

0027

本発明のAAVカプシドを含むウイルスベクター、ならびに薬学的に許容される担体中
に本発明のAAVカプシドタンパク質、AAVカプシドおよび/またはウイルスベクター
を含む組成物が、本明細書中でさらに提供される。

0028

本発明は、細胞を本発明のウイルスベクターと接触させるステップを含む、細胞中に核
酸を導入する方法をさらに提供する。この細胞は、対象中に存在し得、いくつかの実施形
態では、この対象はヒト対象であり得る。

0029

いくつかの例示的な実施形態では、AAVカプシドタンパク質ドナーは、AAV血清型
9であり得、AAVカプシドタンパク質鋳型は、AAV血清型1(AAV1)、AAV血
清型2(AAV2)、AAV血清型3a(AAV3a)、AAV血清型3b(AAV3b
)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AA
V6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)またはAAV血清型
10(AAV10)であり得る。

0030

いくつかの例示的な実施形態では、AAVカプシドタンパク質鋳型は、AAV2由来で
あり得、a)アミノ酸266における置換は、A266Sであり;b)アミノ酸463〜
475における置換は、SQAGASDIRDQSR463〜475SX1AGX2SX
3X4X5X6QX7Rであり、式中、X1〜7は、任意のアミノ酸であり得;かつc)
アミノ酸499〜502における置換は、EYSW499〜502EX8X9Wであり、
式中、X8〜9は、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、X1はVであ
り得;X2はPであり得;X3〜6はNMAVであり得;X7はGであり得、配列SV
GPSNMAVQGRを生じる。いくつかの実施形態では、X8はFであり得、X9はW
であり得、配列EFAWを生じる。

0031

上記例は、AAV9ドナー由来のガラクトース結合部位をAAV2鋳型中に導入するこ
とが可能な置換を実証するために提供される。表3は、これらの対応するアミノ酸が同定
されたいくつかのAAV血清型、およびAAV9のガラクトース結合部位を導入するため
にこれらの血清型の各々においてなされ得る例示的置換を列挙している。特定のアミノ酸
位置が保存され、他のアミノ酸位置が置換されることが、表3中に示され、本明細書中に
詳細に記載される。置換が示される場合、表3に示される置換セットが、これらの残基位
置においてなされ得る種々の置換の例示である。本発明の実施形態は、AAV9以外の他
のドナーAAV血清型およびガラクトース結合部位以外の他のグリカン結合部位を包含
ることが、企図される。

0032

表2は、AAVの非限定的な例示的血清型および本発明によって包含され得るゲノムお
よびカプシド配列の受託番号を列挙する。ドナーおよび鋳型のAAV血清型は、ヒトAA
Vに限定されないが、これには、非ヒトAAV、例えば、トリAAVまたはウシAAV、
ならびに非ヒト霊長類AAVが含まれ得、これらの例は、表1中に示される。

0033

上記例は、AAV9ドナー由来のガラクトース結合部位の導入のためのAAV2鋳型中
の可能なアミノ酸置換を示す。別の例では、鋳型は、AAV1またはAAV6であり得、
AAV2の463〜475位に対応するアミノ酸位置における置換は、SX1X2X3P
X4X5MX6VQX7X8であり得、式中、X1〜8は、任意のアミノ酸であり得る。
特定の一実施形態では、X1〜3はVAGであり;X4はSであり;X5はNであり;X
6はAであり;X7はGであり、X8はRであり、配列SVAGPSNMAVQGRを生
じる。さらなる実施形態では、AAV2中の499〜502位に対応するアミノ酸位置に
おける置換は、X9FX10Wであり得、式中、X9およびX10は、任意のアミノ酸で
あり得る。特定の一実施形態では、X9はEであり、X10はWであり、配列EFAWを
生じる。

0034

別の例では、鋳型はAAV3aまたはAAV3bであり得、AAV2の463〜475
位に対応するアミノ酸位置における置換は、SX1AGPX2X3MX4X5QX6Rで
あり得、式中、X1〜6は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X1は
Vであり;X2はSであり;X3はNであり;X4はAであり;X5はNであり;X6は
Gであり、配列SVAGPSNMAVQGRを生じる。さらなる実施形態では、AAV2
中の499〜502位に対応するアミノ酸位置における置換は、X7FX8Wであり得、
式中、X7およびX8は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X7はE
であり、X8はWであり、配列EFAWを生じる。

0035

別の例では、鋳型はAAV4であり得、AAV2の463〜475位に対応するアミノ
酸位置における置換は、X1X2X3X4PX5NX6X7X8X9X10X11であり
得、式中、X1〜11は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X1はS
であり;X2はVであり;X3はAであり;X4はGであり;X5はSであり;X6はM
であり;X7はAであり;X8はVであり;X9はQであり;X10はGであり;X11
はRであり、配列SVAGPSNMAVQGRを生じる。さらなる実施形態では、AAV
2中の499〜502位に対応するアミノ酸位置における置換は、X12X13X14X
15であり得、式中、X12〜15は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態で
は、X12はEであり;X13はFであり;X14はAであり;X15はWであり、配列
EFAWを生じる。

0036

別の例では、鋳型はAAV5であり得、AAV2の463〜475位に対応するアミノ
酸位置における置換は、X1X2X3X4X5X6X7X8AX9X10X11X12で
あり得、式中、X1〜12は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X1
はSであり;X2はVであり;X3はAであり;X4はGであり;X5はPであり;X6
はSであり;X7はNであり;X8はMであり;X9はVであり;X10はQであり;X
12はGであり;X12はRであり、配列SVAGPSNMAVQGRを生じる。さらな
る実施形態では、AAV2中の499〜502位に対応するアミノ酸位置における置換は
、X13X14AX15であり得、式中、X13〜15は、任意のアミノ酸であり得る。
特定の一実施形態では、X13はEであり;X14はFであり;X15はAであり;X1
6はWであり、配列EFAWを生じる。

0037

別の例では、鋳型はAAV7であり得、AAV2の463〜475位に対応するアミノ
酸位置における置換は、X1X2X3GPSX4MAX5QX6X7であり得、式中、X
1〜7は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X1はSであり;X2は
Vであり;X3はAであり;X4はNであり;X5はVであり;X6はGであり;X7は
Rであり、配列SVAGPSNMAVQGRを生じる。さらなる実施形態では、AAV2
中の499〜502位に対応するアミノ酸位置における置換は、X8FAWであり得、式
中、X8は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、式中、X8はEであり
、配列EFAWを生じる。

0038

別の例では、鋳型はAAV8であり得、AAV2の463〜475位に対応するアミノ
酸位置における置換は、SX1X2GPX3X4MAX5QX6X7であり得、式中、X
1〜7は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X1はVであり;X2は
Aであり;X3はSであり;X4はNであり;X5はVであり;X6はGであり;X7は
Rであり、配列SVAGPSNMAVQGRを生じる。さらなる実施形態では、AAV2
中の499〜502位に対応するアミノ酸位置における置換は、X8FAWであり得、式
中、X8は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X8はEであり得、配
列EFAWを生じる。

0039

別の例では、鋳型はAAV10であり得、AAV2の463〜475位に対応するアミ
ノ酸位置における置換は、X1X2AGPX3NMX4X5QX6X7であり得、式中、
X1〜7は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X1はSであり;X2
はVであり;X3はSであり;X4はAであり;X5はVであり;X6はGであり;X7
はRであり、配列SVAGPSNMAVQGRを生じる。さらなる実施形態では、AAV
2中の499〜502位に対応するアミノ酸位置における置換は、X8FAWであり得、
式中、X8は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、X8は、Eであり得
、配列EFAWを生じる。

0040

上記例は、AAV9由来のガラクトース結合部位の、AAV2、AAV3a、AAV3
b、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8またはAAV10であり得るカプシドタン
パク質鋳型中への導入を記載する。限定することを意図しないこれらの例は、本明細書中
に記載される「ポケット」を規定する残基を改変することによって、ドナーAAV血清型
由来のグリカン結合部位が、異なるAAV血清型(例えば、表3中に列挙される)のカプ
シドタンパク質鋳型中に導入され得るというこの普遍的原理を実証している。新規のグリ
カン結合部位を含む、かかる改変されたまたはキメラのカプシドタンパク質は、増加した
細胞表面結合ならびにより迅速かつ増強されたインビボ導入遺伝子発現の有益な表現型
有するウイルスベクターとして使用され得るウイルス粒子を構成するカプシドへとアセン
ブルされ得る。

0041

本明細書中で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」(AAV)には、1型AAV
2型AAV、3型AAV(3A型および3B型を含む)、4型AAV、5型AAV、6
型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、トリA
AV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、クレードF AAV、およ
び現在公知のまたは後に発見される任意の他のAAVが含まれるが、これらに限定されな
い。例えば、BERNARD N.FIELDSら、VIROLOGY、第2巻、第69
章(第4版、Lippincott−Raven Publishers)を参照のこと
。多数の比較的新しいAAV血清型およびクレードが同定されている(例えば、Gaoら
(2004)J.Virology 78:6381〜6388頁;および表1を参照の
こと)。

0042

AAVの種々の血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端反復(TR)、Repタ
ンパク質およびカプシドサブユニットの配列が、当該分野で公知である。かかる配列の例
示的ではあるが非限定的な例は、文献中またはGenBank(登録商標)データベース
などの公的データベース中で見出され得る。例えば、GenBank(登録商標)データ
ベース受託番号NC_002077.1、NC_001401.2、NC_001729
.1、NC_001863.1、NC_001829.1、NC_006152.1、N
C_001862.1、AF513851.1、AF513852.1を参照のこと;そ
の開示は、パルボウイルスおよびAAVの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために
、参照により本明細書中に組み込まれる。例えば以下もまた参照のこと:Srivist
avaら(1983)J.Virology 45:555頁;Chioriniら(1
998)J.Virology 71:6823頁;Chioriniら(1999)J
.Virology 73:1309頁;Bantel−Schaalら(1999)J
.Virology 73:939頁;Xiaoら(1999)J. Virology
73:3994頁;Muramatsuら(1996)Virology 221:2
08頁;Shadeら(1986)J.Virol.58:921頁;Gaoら(200
2)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854頁;国際特許公開
公報WO 00/28061、WO 99/6160およびWO 98/11244;な
らびに米国特許第6,156,303号;これらの開示は、パルボウイルスおよびAAV
の核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書の一部をなすもの
とする。

0043

自律的パルボウイルスおよびAAVのカプシド構造は、BERNARD N.FIEL
DSら、Virology、第2巻、第69章および第70章(第4版、Lippinc
ott−Raven Publishers)中により詳細に記載されている。AAV2
(Xieら(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405〜10
頁)、AAV4(Padronら(2005)J.Virol.79:5047〜58頁
)、AAV5(Waltersら(2004)J.Virol.78:3361〜71頁
)およびCPV(Xieら(1996)J.Mol.Biol.6:497〜520頁お
よびTsaoら(1991)Science 251:1456〜64頁)の結晶構造
説明もまた参照のこと。

0044

[定義]
単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数
形も同様に含むことが意図される。

0045

さらに、用語「約」は、本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド配列の長さ、用量、時間、温度などの量などの測定可能な値をいう場合、特定された
量の±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%またはさらには±0.1%の変動
を包含することを意味する。

0046

また、本明細書中で使用する場合、「および/または」は、関連する列挙された項目
うち1つまたは複数の、任意のおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに代替として解釈
される場合(「または」)には組み合わせの欠如をいい、かつこれらを包含する。

0047

文脈が他を示さない限り、本明細書中に記載される本発明の種々の特徴が任意の組み合
わせで使用され得ることが、具体的に意図される。

0048

さらに、本発明は、本明細書中に示される本発明のいくつかの実施形態、任意の特徴ま
たは特徴の組み合わせが排除または割愛できることも企図している。

0049

例えば、特定のアミノ酸がA、G、I、Lおよび/またはVから選択できることを本明
細書が示す場合をさらに説明するために、この言葉は、各かかる下位の組み合わせが本明
細書中に明示的に示されるかのように、例えばA、G、IまたはL;A、G、IまたはV
;AまたはG;Lのみなどの、これらの(1つまたは複数の)アミノ酸の任意のサブセッ
トからアミノ酸を選択できることもまた示す。さらに、かかる言葉は、1つまたは複数の
特定されたアミノ酸が放棄され得ることもまた示す。例えば、特定の実施形態では、各か
かる可能な放棄が明示的に示されるかのように、アミノ酸は、A、GまたはIではなく;
Aではなく;GまたはVではない、など。

0050

本明細書中で使用する場合、用語「低下する(reduce/reduces)」、「
低下」および類似の用語は、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、35
%、50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、10
0%またはそれ以上の減少を意味する。

0051

本明細書中で使用する場合、用語「増強する(enhance/enhances)」
「増強」および類似の用語は、少なくとも約10%、20%、25%、50%、75%、
100%、150%、200%、300%、400%、500%またはそれ以上の増加を
示す。

0052

本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、特に示さない限り、ペプチド
よびタンパク質の両方を包含する。

0053

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、RNA、DNAまたはDN
A−RNAハイブリッド配列(天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌク
レオチドの両方を含む)であり得るが、代表的な実施形態では、一本鎖または二本鎖のい
ずれかのDNA配列である。

0054

本明細書中で使用する場合、「単離された」ポリヌクレオチド(例えば、「単離された
DNA」または「単離されたRNA」)は、天然に存在する生物またはウイルスの他の成
分、例えば、そのポリヌクレオチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイル
スの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも
部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された
」ヌクレオチドは、出発材料と比較して、少なくとも約10倍、100倍、1000倍、
10,000倍またはそれ以上富化されている。

0055

同様に、「単離された」ポリペプチドとは、天然に存在する生物またはウイルスの他の
成分、例えば、そのポリペプチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイルス
の構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部
分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」ポリ
ペプチドは、出発材料と比較して、少なくとも約10倍、100倍、1000倍、10,
000倍またはそれ以上富化されている。

0056

本明細書中で使用する場合、ウイルスベクターを「単離する」もしくは「精製する」(
または文法等価物)とは、そのウイルスベクターが、出発材料中の他の成分の少なくと
もいくつかから少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的な実施形態では、
「単離された」または「精製された」ウイルスベクターは、出発材料と比較して、少なく
とも約10倍、100倍、1000倍、10,000倍またはそれ以上富化されている。

0057

治療用ポリペプチド」は、細胞または対象中のタンパク質の非存在または欠損から生
じる症状を緩和、低下、予防、遅延および/または安定化できるポリペプチド、ならびに
/あるいは抗がん効果または移植生存率における改善などの利益を他の方法で対象に付与
するポリペプチドである。

0058

用語「治療する(treat/treating)」または「〜の治療」(およびその
文法的な変形)は、対象の状態の重症度が低下され、少なくとも部分的に改善または安定
化されること、および/あるいは少なくとも1つの臨床症状における幾分かの緩和、軽減
、減少または安定化が達成されること、および/あるいは疾患または障害の進行の遅延が
存在することを意味する。

0059

用語「予防する(prevent/preventing)」および「予防」(および
その文法的な変形)とは、対象における疾患、障害および/または(複数の)臨床症状の
発症の予防および/または遅延、ならびに/あるいは本発明の方法の非存在下で生じるも
のと比較した、疾患、障害および/または(複数の)臨床症状の発症の重症度における低
下をいう。予防は、疾患、障害および/または(複数の)臨床症状の完全な非存在のよう
に、完全であり得る。予防は部分的でもあり得、その結果、対象における疾患、障害およ
び/または(複数の)臨床症状の出現ならびに/あるいは発症の重症度は、本発明の非存
在下で生じるものよりも低くなる。

0060

「治療有効」または「有効」量は、本明細書中で使用する場合、いくらかの改善または
利益を対象に提供するのに充分な量である。代替的に述べると、「治療有効」または「有
効」量は、対象における少なくとも1つの臨床症状におけるいくらかの緩和、軽減、減少
または安定化を提供する量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、治療効果
完全である必要も治癒的である必要もないことを、当業者は理解するであろう。

0061

「予防有効」量は、本明細書中で使用する場合、対象における疾患、障害および/また
は臨床症状の発症を予防および/または遅延するのに充分な量、ならびに/あるいは本発
明の方法の非存在下で生じるものと比較して、対象における疾患、障害および/または臨
床症状の発症の重症度を低下および/または遅延させるのに充分な量である。いくらかの
利益が対象に提供される限り、予防のレベルが完全である必要がないことを、当業者は理
解するであろう。

0062

用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書中で互換的に使用され
、ウイルス中に天然には存在しない配列をいう。一般に、異種核酸は、対象のポリペプチ
ドまたは非翻訳RNA(例えば、細胞または対象への送達のための)をコードするオープ
リーディングフレームを含む。

0063

本明細書中で使用する場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子
送達ベクター」とは、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされ
たベクターゲノム(例えば、ウイルスDNA[vDNA])を含む、ウイルス(例えば、
AAV)粒子をいう。あるいは、いくつかの文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲ
ノム/vDNA単独をいうために使用され得る。

0064

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報WO00/28004および
Chaoら、(2000)Molecular Therapy 2:619頁に記載さ
れるように、「標的化された」ウイルスベクター(例えば、指向性指向性を有する)およ
び/または「ハイブリッド」パルボウイルス(即ち、ウイルスTRおよびウイルスカプシ
ドが異なるパルボウイルスに由来するもの)であり得る。

0065

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報WO01/92551(その
開示は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする)に記載されるように、
二重鎖パルボウイルス粒子であり得る。従って、いくつかの実施形態では、二本鎖(二重
鎖)ゲノムが、本発明のウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。

0066

[ウイルスベクターを生成する方法]
本発明は、本発明の改変されたカプシドタンパク質およびカプシドを含むウイルスベク
ターもまた包含する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクタ
ー(例えば、パルボウイルスカプシドおよび/またはベクターゲノムを含んでいる)、例
えば、AAVベクター(例えば、AAVカプシドおよび/またはベクターゲノムを含んで
いる)である。代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、本発明の改変されたカプシ
ドサブユニットを含む改変されたAAVカプシドとベクターゲノムとを含む。

0067

例えば、代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、(a)本発明の改変されたカプ
シドタンパク質を含む改変されたウイルスカプシド(例えば、改変されたAAVカプシド
)と、(b)末端反復配列(例えば、AAV−TR)を含む核酸とを含み、この末端反復
配列を含む核酸は、改変されたウイルスカプシドによってカプシド封入されている。核酸
は、2つの末端反復(例えば、2つのAAV−TR)を任意選択で含み得る。

0068

代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、対象のポリペプチドまたは機能的RNA
をコードする異種核酸を含む組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは
、以下により詳細に記載される。

0069

特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、改変されたカプシドタンパク質な
しのウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して、肝臓の形質導入が減少してい
る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、筋肉に対する全身性形質導入を有し、例
えば、ベクターは、体中の複数の骨格筋群を形質導入し、任意選択で、心筋および/また
横隔膜筋を形質導入する。

0070

本発明の改変されたカプシドタンパク質、ウイルスカプシドおよびウイルスベクターは
、そのネイティブ状態において特定の位置に示されたアミノ酸を有するカプシドタンパク
質、カプシドおよびウイルスベクター(即ち、変異体ではない)を排除することが、当業
者に理解されるであろう。

0071

本発明は、本発明のウイルスベクターを生成する方法をさらに提供する。1つの代表的
な実施形態では、本発明は、ウイルスベクターを生成する方法を提供し、この方法は、(
a)少なくとも1つのTR配列(例えば、AAV−TR配列)を含む核酸鋳型と、(b)
核酸鋳型の複製およびAAVカプシド中へのカプシド封入に充分なAAV配列(例えば、
本発明のAAVカプシドをコードするAAV−rep配列およびAAV−cap配列)と
を、細胞に提供するステップを含む。任意選択で、核酸鋳型は、少なくとも1つの異種核
酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、核酸鋳型は2つのAAV−ITR配列を含み
、これらは、(存在する場合)異種核酸配列に対して5’側および3’側に位置するが、
異種核酸配列と直接隣接している必要はない。

0072

核酸鋳型ならびにAAV−repおよびcap配列は、AAVカプシド内にパッケージ
ングされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞中で生成されるような条件下で提供さ
れる。この方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含み得る。ウ
イルスベクターは、培地からおよび/または細胞を溶解することによって回収され得る。

0073

細胞は、AAVウイルスの複製を許容する細胞であり得る。当該分野で公知の任意の適
切な細胞が使用され得る。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の選択肢
として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス補完性
(trans−complementing)パッケージング細胞株、例えば、293細
胞または他のE1aトランス補完性細胞であり得る。

0074

AAV複製およびカプシド配列は、当該分野で公知の任意の方法によって提供され得る
。現在のプロトコールは典型的に、単一のプラスミド上のAAV−rep/cap遺伝子
発現する。AAV複製およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、
一緒に提供するのが簡便であり得る。AAV−repおよび/またはcap配列は、任意
のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、rep/
cap配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提
供され得る(例えば、欠失型アデノウイルスベクターのE1a領域またはE3領域中に挿
入される)。EBVベクターもまた、AAV−capおよびrep遺伝子を発現するため
に使用され得る。この方法の1つの利点は、EBVベクターがエピソームであるが、連続
的な細胞分裂の間中、高コピー数をなおも維持することである(即ち、「EBVベースの
核エピソーム(EBV based nuclear episome)」と称される染
色体外エレメントとして細胞中に安定に組み込まれる、Margolski(1992)
Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67頁を参照のこと)。

0075

さらなる代替として、rep/cap配列は、細胞中に安定に取り込まれ得る。

0076

典型的には、AAV−rep/cap配列は、これらの配列のレスキューおよび/また
はパッケージングを防止するために、TRと隣接して配置されない。

0077

核酸鋳型は、当該分野で公知の任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、鋳
型は、非ウイルスベクター(例えば、プラスミド)またはウイルスベクターによって供給
され得る。特定の実施形態では、核酸鋳型は、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノ
イルスベクターによって供給される(例えば、欠失型アデノウイルスのE1a領域または
E3領域中に挿入される)。別の説明として、Palomboら(1998)J.Vir
ology 72:5025頁は、AAV−TRが隣接するレポーター遺伝子を保有する
バキュロウイルスベクターを記載している。EBVベクターもまた、rep/cap遺伝
子に関して上記したように、鋳型を送達するために使用され得る。

0078

別の代表的な実施形態では、核酸鋳型は、複製するrAAVウイルスによって提供され
る。なお他の実施形態では、核酸鋳型を含むAAVプロウイルスは、細胞の染色体中に安
定に組み込まれる。

0079

ウイルス力価を増強するために、増殖性AAV感染を促進するヘルパーウイルス機能(
例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス)が、細胞に提供され得る。AAV複製
に必要なヘルパーウイルス配列は、当該分野で公知である。典型的には、これらの配列は
ヘルパーアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される
。あるいは、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列は、例えば、Ferrar
iら(1997)Nature Med.3:1295頁;ならびに米国特許第6,04
0,183号および同第6,093,570号によって記載されるような、効率的なAA
V生成を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニラス
ドとして、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって提供され得る。

0080

さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体中に埋め込まれたまたは安定な染色体外エレ
メントとして維持されるヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る
。一般に、ヘルパーウイルス配列は、AAVビリオン中にパッケージングすることはでき
ず、例えば、TRが隣接していない。

0081

単一のヘルパー構築物上のAAV複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配
列(例えば、アデノウイルス配列)を提供することが有利であり得ることを、当業者は理
解するであろう。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物でもウイルス構築物でもよい
。1つの非限定的説明として、ヘルパー構築物は、AAV−rep/cap遺伝子を含む
ハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。

0082

1つの特定の実施形態では、AAV−rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパ
ー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは
、核酸鋳型をさらに含み得る。AAV−rep/cap配列および/またはrAAV鋳型
は、アデノウイルスの欠失した領域(例えば、E1a領域またはE3領域)中に挿入され
得る。

0083

さらなる実施形態では、AAV−rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配
列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれ
ば、rAAV鋳型は、プラスミド鋳型として提供され得る。

0084

別の例示的実施形態では、AAV−rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー
配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、rAAV鋳型は、プ
ロウイルスとして細胞中に取り込まれる。あるいは、rAAV鋳型は、染色体外エレメン
ト(例えば、EBVベースの核エピソーム)として細胞内で維持されるEBVベクターに
よって提供される。

0085

さらなる例示的な実施形態では、AAV−rep/cap配列およびアデノウイルスヘ
ルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。rAAV鋳型は、別
個の複製するウイルスベクターとして提供され得る。例えば、rAAV鋳型は、rAAV
粒子または第2の組換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。

0086

上述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的に、アデノウイル
スの複製およびパッケージングに充分なアデノウイルスの5’および3’のシス配列(即
ち、アデノウイルス末端反復およびPAC配列)を含む。AAV−rep/cap配列お
よび存在する場合にはrAAV鋳型は、アデノウイルス骨格中に埋め込まれ、5’および
3’のシス配列がそれに隣接しており、その結果これらの配列は、アデノウイルスカプシ
ド中にパッケージングされ得る。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびAA
V−rep/cap配列には一般に、これらの配列がAAVビリオン中にパッケージング
されないように、TRが隣接していない。

0087

Zhangら((2001)Gene Ther.18:704〜12頁)は、アデノ
ウイルスならびにAAV−repおよびcap遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載
している。

0088

ヘルペスウイルスもまた、AAVパッケージング法においてヘルパーウイルスとして使
用され得る。AAV−Repタンパク質(複数でもよい)をコードするハイブリッドヘル
ペスウイルスは、拡大縮小可能なAAVベクター生成スキームを有利に促進し得る。AA
V−2のrepおよびcap遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスI型
HSV−1)ベクターが、Conwayら(1999)Gene Therapy 6:
986頁およびPCT公開公報WO00/17377号に記載されている。

0089

さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えばUrabeら(2002)
Human Gene Therapy 13:1935〜43頁に記載されるように、
rep/cap遺伝子およびrAAV鋳型を送達するためのバキュロウイルスベクターを
使用して昆虫細胞中で生成され得る。

0090

混入するヘルパーウイルスを含まないAAVベクターストックは、当該分野で公知の任
意の方法によって得られ得る。例えば、AAVおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づ
いて容易に識別され得る。AAVはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づいて、ヘル
パーウイルスから分離され得る(Zolotukhinら(1999)Gene The
rapy 6:973頁)。任意の混入するヘルパーウイルスが複製コンピテントになら
ないように、欠失型複製欠損ヘルパーウイルスが使用され得る。アデノウイルス初期遺伝
子発現のみがAAVウイルスのパッケージングを媒介するために必要なので、さらなる代
替として、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが使用され得る。後期遺伝子発
現が欠損したアデノウイルス変異体は当該分野で公知である(例えば、ts100Kおよ
びts149アデノウイルス変異体)。

0091

[組換えウイルスベクター]
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボおよびインビボで細胞に核酸を
送達するために有用である。特に、ウイルスベクターは、例えば哺乳動物細胞を含む動物
細胞に核酸を送達または移入するために有利に使用され得る。

0092

対象の任意の異種核酸配列(複数であってもよい)は、本発明のウイルスベクター中で
送達され得る。対象の核酸には、治療用(例えば、医療用途または獣医学用途のため)ポ
リペプチドまたは免疫原性(例えば、ワクチンのため)ポリペプチドを含むポリペプチド
をコードする核酸が含まれる。

0093

治療用ポリペプチドには以下が含まれるがこれらに限定されない:嚢胞性線維症膜貫通
制御タンパク質(cystic fibrosis transmembrane re
gulator protein(CFTR))、ジストロフィン(ミニジストロフィン
およびマイクロジストロフィンが含まれる。例えば、Vincentら(1993)Na
ture Genetics 5:130頁;米国特許公開公報2003017131号
;PCT公開公報WO/2008/088895号、Wangら Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 97:13714〜13719頁(2000);およびGr
egorevicら Mol.Ther.16:657〜64頁(2008)を参照のこ
と)、ミオスタチンプロペプチドフォリスタチンアクチビンII型可溶性受容体、I
GF−1、抗炎症性ポリペプチド(例えば、Iκ優性変異体)、サルコスパン、ユート
フィン(Tinsleyら(1996)Nature 384:349頁)、ミニユー
トロフィン、凝固因子(例えば、第VIII因子、第IX因子、第X因子など)、エリス
ロポエチンアンジオスタチンエンドスタチンカタラーゼチロシンヒドロキシラ
ゼ、スーパーオキシドジスムターゼレプチンLDL受容体リポタンパク質リパーゼ
オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α
1−アンチトリプシンアデノシンデアミナーゼヒポキサンチングアニンホスホリボ
トランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼスフィンゴミエリナーゼリソ
ームヘキソサミニダーゼA分岐鎖ケト酸脱水素酵素、RP65タンパク質、サイトカイ
ン(例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、イ
ンターロイキン−2、インターロイキン−4、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
リンホトキシンなど)、ペプチド増殖因子神経栄養因子およびホルモン(例えば、ソマ
トロピンインスリンインスリン様増殖因子1および2、血小板由来増殖因子、上皮
増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子−3および−4、脳由来神
栄養因子、骨形態形成(bone morphogenic)タンパク質[RANKL
およびVEGFが含まれる]、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子−αおよび−βな
ど)、リソソームα−グルコシダーゼα−ガラクトシダーゼA、受容体(例えば、腫
壊死増殖因子α可溶性受容体)、S100A1、パルブアルブミンアデニリルシクラ
ーゼ6型、カルシウムハンドリングモジュレートする分子(例えば、SERCA2A、
PP1のインヒビター1およびそれらの断片[例えば、PCT公開公報WO2006/0
29319号およびWO2007/100465号])、短縮型の構成的に活性なbAR
KctなどのGタンパク質共役型受容体キナーゼ2型ノックダウンをもたらす分子、IR
APなどの抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質アスパルトアシラーゼモノクロ
ナル抗体単鎖モノクローナル抗体が含まれる;例示的なMabは、Hercepti
n(登録商標)Mabである)、ニューロペプチドおよびその断片(例えば、ガラニン
ニューロペプチドY(米国特許第7,071,172号を参照のこと)、バソヒビンなど
血管新生インヒビターならびに他のVEGFインヒビター(例えば、バソヒビン2[P
CT公開公報WO:JP2006/073052号を参照のこと])。他の例示的な異種
核酸配列は、自殺遺伝子産物(例えば、チミジンキナーゼシトシンデアミナーゼジフ
リア毒素、および腫瘍壊死因子)、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付
与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物(例えば、p53、Rb、Wt−1)、TRAI
L、FAS−リガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果を有する任意の他
のポリペプチドをコードする。AAVベクターは、モノクローナル抗体および抗体断片
例えば、ミオスタチンに対する抗体または抗体断片を送達するためにも使用され得る(例
えば、Fangら Nature Biotechnology 23:584〜590
頁(2005)を参照のこと)。

0094

ポリペプチドをコードする異種核酸配列には、レポーターポリペプチド(例えば酵素
をコードする異種核酸配列が含まれる。レポーターポリペプチドは当該分野で公知であり
緑色蛍光タンパク質β−ガラクトシダーゼアルカリホスファターゼルシフェラー
ゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるがこれらに
限定されない。

0095

任意選択的に、異種核酸は、分泌型ポリペプチド(例えば、そのネイティブ状態で分泌
型ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば当該分野で公知の分泌シグナル配列
作動可能な関連によって分泌されるように操作されたポリペプチド)をコードする。

0096

あるいは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸リボザイム
(例えば、米国特許第5,877,022号に記載される)、スプライソソーム介在性
トランススプライシングをもたらすRNA(Puttarajuら(1999)Natu
re Biotech.17:24頁6;米国特許第6,013,487号;米国特許第
6,083,702号を参照のこと)、遺伝子サイレンシング仲介するsiRNA、s
hRNAまたはmiRNAを含む干渉RNA(RNAi)(Sharpら(2000)S
cience 287:2431頁を参照のこと)および「ガイド」RNAなどの他の非
翻訳RNA(Gormanら(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA
95:4929頁;Yuanらに対する米国特許第5,869,248号)などをコー
ドし得る。例示的な非翻訳RNAには、多剤耐性(MDR)遺伝子産物に対するRNAi
(例えば、腫瘍を治療および/もしくは予防するため、ならびに/または化学療法による
損傷を予防するために心臓に投与するため)、ミオスタチンに対するRNAi(例えば、
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため)、VEGFに対するRNAi(例えば、腫瘍を
治療および/または予防するため)、ホスホランバンに対するRNAi(例えば、心血管
疾患を治療するため、例えば、Andinoら J.Gene Med.10:132〜
142頁(2008)およびLiら Acta Pharmacol Sin.26:5
1〜55頁(2005)を参照のこと);ホスホランバンS16Eなどのホスホランバン
阻害分子またはドミナントネガティブ分子(例えば、心血管疾患を治療するため、例えば
、Hoshijimaら Nat.Med.8:864〜871頁(2002)を参照の
こと)、アデノシンキナーゼに対するRNAi(例えば、癲癇のため)、ならびに病原性
生物およびウイルス(例えば、B型および/またはC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイ
ルス、CMV、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど)に対するRNAi
が含まれる。

0097

さらに、選択的スプライシングを指示する核酸配列が送達され得る。説明するために、
ストロフィンエクソン51の5’および/または3’スプライス部位相補的アンチ
ンス配列(または他の阻害配列)が、このエクソンの読み飛ばしを誘導するためにU1ま
たはU7低分子核内(sn)RNAプロモーターと合わせて送達され得る。例えば、アン
センス/阻害配列(複数可)に対して5’側に位置するU1またはU7−snRNAプ
モーターを含むDNA配列は、本発明の改変されたカプシド中にパッケージングされて
送達され得る。

0098

ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座相同性共有し、宿主染色体上の遺伝
子座と組み換わる異種核酸もまた含み得る。このアプローチは、例えば、宿主細胞中の遺
伝的欠陥を修正するために利用され得る。

0099

本発明は、例えばワクチン接種のための免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベク
ターもまた提供する。核酸は、ヒト免疫不全ウイルスHIV)、サル免疫不全ウイルス
(SIV)、インフルエンザウイルス、HIVまたはSIVのgagタンパク質、腫瘍抗
原、がん抗原細菌抗原ウイルス抗原など由来の免疫原が含まれるがこれらに限定され
ない、当該分野で公知の対象の任意の免疫原をコードし得る。

0100

ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当該分野で公知である(例えば、M
iyamuraら、(1994)Proc.Nat.Acad.Sci USA 91:
8507頁;Youngらに対する米国特許第5,916,563号、Mazzaraら
に対する米国特許第5,905,040号、米国特許第5,882,652号、Samu
lskiらに対する米国特許第5,863,541号を参照のこと)。抗原は、パルボウ
イルスカプシド中に存在し得る。あるいは、抗原は、組換えベクターゲノム中に導入され
た異種核酸から発現され得る。本明細書中に記載されるおよび/または当該分野で公知の
対象の任意の免疫原は、本発明のウイルスベクターによって提供され得る。

0101

免疫原性ポリペプチドは、免疫応答惹起するのに適した、ならびに/または微生物
細菌、原生動物寄生生物真菌および/もしくはウイルスの感染および疾患が含まれる
がこれらに限定されない感染および/もしくは疾患に対して対象を保護するのに適した任
意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス
免疫原(例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニンHA表面タンパク質もしく
はインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原など
の、インフルエンザウイルス免疫原)もしくはレンチウイルス免疫原(例えば、HIVも
しくはSIVのエンベロープGP160タンパク質、HIVもしくはSIVのマトリック
ス/カプシドタンパク質ならびにHIVもしくはSIVのgag、polおよびenv遺
伝子産物などの、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス(SIV)免疫
原またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)免疫原)であり得る。免疫原性ポリペプチドは
アレナウイルス免疫原(例えば、ラッサ熱ウイルス核カプシドタンパク質および/また
ラッサ熱エンベロープ糖タンパク質などのラッサ熱ウイルス免疫原)、ポックスウイル
ス免疫原(例えば、ワクシニアL1またはL8遺伝子産物などのワクシニアウイルス免疫
原)、フラビウイルス免疫原(例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス
疫原)、フィロウイルス免疫原(例えば、NPおよびGP遺伝子産物などの、エボラウイ
ルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原)、ブニヤウイルス免疫原(例えば、RV
FV、CCHFおよび/またはSFSウイルス免疫原)、またはコロナウイルス免疫原(
例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などの感染性ヒトコロナウイルス
免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ感染性気管支炎ウイルス免疫
原)でもあり得る。免疫原性ポリペプチドはさらに、ポリオ免疫原、ヘルペスウイルス免
疫原(例えば、CMV、EBV、HSV免疫原)ムンプスウイルス免疫原、麻疹ウイルス
免疫原、風疹ウイルス免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳
原、肝炎(例えば、A型肝炎B型肝炎C型肝炎など)免疫原、および/または当該分
野で現在公知のまたは免疫原として後に同定される任意の他のワクチン免疫原であり得る

0102

あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍細胞またはがん細胞の抗原であり得る
。任意選択で、腫瘍抗原またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現される。例示的なが
んおよび腫瘍細胞の抗原は、S.A.Rosenberg(Immunity 10:2
81頁(1991))に記載されている。他の例示的ながん抗原および腫瘍抗原には、以
下が含まれるがこれらに限定されない:BRCA1遺伝子産物、BRCA2遺伝子産物、
gp100、チロシナーゼ、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY−
ESO−1、CDK−4、β−カテニン、MUM−1、カスパーゼ−8、KIAA020
5、HPVE、SART−1、PRAME、p15、メラノーマ腫瘍抗原(Kawaka
miら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515頁
;Kawakamiら(1994)J.Exp.Med.180:347頁;Kawak
amiら(1994)Cancer Res.54:3124頁)、MART−1、gp
100 MAGE−1、MAGE−2、MAGE−3、CEA、TRP−1、TRP−2
、P−15、チロシナーゼ(Brichardら(1993)J.Exp.Med.17
8:489頁);HER−2/neu遺伝子産物(米国特許第4,968,603号)、
CA125、LK26、FB5(エンドシアリン)、TAG72、AFP、CA19−9
、NSE、DU−PAN−2、CA50、SPan−1、CA72−4、HCG、STN
シアリルTn抗原)、c−erbB−2タンパク質、PSA、L−CanAg、エス
ゲン受容体、乳脂肪グロブリン、p53腫瘍抑制因子タンパク質(Levine、(1
993)Ann.Rev.Biochem.62:623頁);ムチン抗原(PCT公開
公報WO 90/05142号);テロメラーゼ核マトリックスタンパク質;前立腺
ホスファターゼパピローマウイルス抗原;および/あるいは現在公知のまたは以下の
がんに関連することが後に発見される抗原:メラノーマ、腺がん腫、胸腺腫リンパ腫
例えば、非ホジキンリンパ腫ホジキンリンパ腫)、肉腫肺がん肝臓がん結腸がん
白血病子宮がん乳がん前立腺がん卵巣がん子宮頚がん膀胱がん腎臓がん
膵臓がん、脳がん、および現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性
状態(例えば、Rosenberg、(1996)Ann.Rev.Med.47:48
1〜91頁を参照のこと)。

0103

さらなる代替として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボまたはインビボにおいて細
胞中で生成されることが望ましい任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルス
ベクターは、培養細胞中に導入され得、発現された遺伝子産物がそこから単離される。

0104

対象の異種核酸(複数でもよい)が適切な制御配列と作動可能に関連し得ることが、当
業者に理解されよう。例えば、異種核酸は、発現制御エレメント、例えば転写翻訳制御
シグナル複製起点ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位(IRES)
、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどと、作動可能に関連し得る。

0105

さらに、対象の異種核酸(複数でもよい)の調節された発現は、転写後レベルで、例え
ば、オリゴヌクレオチド、小分子および/または特定の部位におけるスプライシング活性
を選択的に遮断する他の化合物(例えば、PCT公開公報WO 2006/119137
号に記載される)の存在または非存在によって、異なるイントロンの選択的スプライシン
グを調節することによって、達成され得る。

0106

種々のプロモーター/エンハンサーエレメントが、所望されるレベルおよび組織特異的
発現に依存して使用され得ることを、当業者は理解するであろう。プロモーター/エン
ンサーは、所望の発現パターンに依存して、構成的または誘導性であり得る。プロモータ
ー/エンハンサーは、ネイティブまたは外来であり得、天然配列または合成配列であり得
る。外来とは、転写開始領域が、その転写開始領域が導入される野生型宿主において見出
されないものであることを意図する。

0107

特定の実施形態では、プロモーター/エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療
される対象にとってネイティブであり得る。代表的な実施形態では、プロモーター/エン
ハンサーエレメントは、異種核酸配列にとってネイティブであり得る。プロモーター/エ
ンハンサーエレメントは一般に、対象の標的細胞(複数でもよい)において機能するよう
に選択される。さらに、特定の実施形態では、プロモーター/エンハンサーエレメントは
哺乳動物のプロモーター/エンハンサーエレメントである。プロモーター/エンハンサ
ーエレメントは、構成的でも誘導性でもよい。

0108

誘導性発現制御エレメントは典型的に、異種核酸配列(複数でもよい)の発現の調節を
提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモータ
ー/エンハンサーエレメントは、組織特異的プロモーター/エンハンサーエレメントまた
は好ましいプロモーター/エンハンサーエレメントであり得、筋特異的または好ましい(
心筋、骨格筋および/または平滑筋特異的または好ましいものが含まれる)、神経組織
異的または好ましい(脳特異的または好ましいものが含まれる)、眼特異的または好まし
い(網膜特異的および角膜特異的なものが含まれる)、肝臓特異的または好ましい、骨髄
特異的または好ましい、膵臓特異的または好ましい、脾臓特異的または好ましい、および
/あるいは特異的または好ましいプロモーター/エンハンサーエレメントが含まれる。
他の誘導性プロモーター/エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性エレメントおよ
び金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモーター/エンハンサーエレメ
ントには、Tetオンオフエレメント、RU486誘導性プロモーター、エクジソン
導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモータ
ーが含まれるが、これらに限定されない。

0109

異種核酸配列(複数であってもよい)が標的細胞において転写され、次いで翻訳される
実施形態では、特異的開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的
な翻訳のために含まれる。ATG開始コドンおよび隣接配列を含み得るこれらの外因性
訳制御配列は、天然および合成の両方の、種々の起源のものであり得る。

0110

本発明に従うウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞中に異
種核酸を送達する手段を提供する。ウイルスベクターは、例えば、インビトロでポリペプ
チドを生成するためまたはエクスビボの遺伝子療法のために、対象の核酸をインビトロで
細胞に送達するために使用され得る。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性もしくは治
療用ポリペプチドまたは機能的RNAを発現するために、それを必要とする対象に核酸を
送達する方法において、さらに有用である。この様式で、ポリペプチドまたは機能的RN
Aは、対象中においてインビボで生成され得る。対象は、ポリペプチドの欠乏症を有する
ので、そのポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能
的RNAの生成は、いくらかの有益な効果を付与し得るので、この方法が実施され得る。

0111

ウイルスベクターは、(例えば、スクリーニング方法と合わせて、例えばポリペプチド
を生成するためまたは対象に対する機能的RNAの影響を観察するためのバイオリアクタ
として対象を使用して)培養細胞または対象において対象のポリペプチドまたは機能的R
NAを生成するためにも使用され得る。

0112

一般に、本発明のウイルスベクターは、治療用ポリペプチドまたは機能的RNAを送達
することが有利な任意の疾患状態を治療および/または予防するために、ポリペプチドま
たは機能的RNAをコードする異種核酸を送達するために使用され得る。例示的な疾患状
態には、以下が含まれるがこれらに限定されない:嚢胞性線維症(嚢胞性線維症膜貫通制
御タンパク質)および他の肺の疾患、血友病A(第VIII因子)、血友病B(第IX因
子)、サラセミア(β−グロビン)、貧血エリスロポエチン)および他の血液障害、ア
ルツハイマー病(GDF;ネプリライシン)、多発性硬化症(β−インターフェロン)、
パーキンソン病グリア細胞株由来神経栄養因子[GDNF])、ハンチントン病(反復
を除去するためのRNAi)、筋萎縮性側索硬化症、癲癇(ガラニン、神経栄養因子)お
よび他の神経学的障害、がん(エンドスタチン、アンジオスタチン、TRAIL、FAS
−リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン;VEGFまたは多剤耐性遺伝子産物
に対するRNAiを含むRNAi、mir−26a[例えば、肝細胞癌腫のため])、真
糖尿病(インスリン)、デュシェンヌ型(ジストロフィン、ミニジストロフィン、イン
スリン様増殖因子I、サルコグリカン[例えば、α、β、γ]、ミオスタチンに対するR
NAi、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンII型可溶性受容体、
抗炎症性ポリペプチド、例えば、IκB優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミ
ニユートロフィン、エクソン読み飛ばしを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプ
ライスジャンクションに対するアンチセンスまたはRNAi[例えば、PCT公開公報W
O/2003/095647号を参照のこと]、エクソン読み飛ばしを誘導するためのU
7−snRNAに対するアンチセンス[例えば、PCT公開公報WO/2006/021
724号を参照のこと]、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する
抗体または抗体断片)およびベッカー型を含む筋ジストロフィーゴーシェ病グルコ
レブシダーゼ)、ハーラー病(α−L−イズロニダーゼ)、アデノシンデアミナーゼ欠
乏症(アデノシンデアミナーゼ)、糖原貯蔵疾患(例えば、ファブリー病[α−ガラクト
シダーゼ]およびポンペ病[リソソーム酸α−グルコシダーゼ])および他の代謝障害
先天性肺気腫(α1−アンチトリプシン)、レッシュ・ナイハン症候群(ヒポキサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ)、ニーマンピック病スフィンゴミエリ
ナーゼ)、テイサックス病(Tays Sachs disease)(リソソームヘ
キソサミニダーゼA)、メープルシロップ尿症(分岐鎖ケト酸脱水素酵素)、網膜変性
患(ならびに眼および網膜の他の疾患;例えば、黄斑変性症についてPDGF、および/
あるいは例えばI型糖尿病における網膜障害を治療/予防するためのバソヒビンもしくは
VEGFの他のインヒビターまたは他の血管新生インヒビター)、固形臓器の疾患、例え
ば脳(パーキンソン病[GDNF]、星状細胞腫[エンドスタチン、アンジオスタチン、
および/またはVEGFに対するRNAi]、膠芽腫[エンドスタチン、アンジオスタ
ン、および/またはVEGFに対するRNAi]が含まれる)、肝臓、腎臓、うっ血性
不全または末梢動脈疾患PAD)を含む心臓(例えば、プロテインホスファターゼイン
ヒビターI(I−1)およびその断片(例えば、I1C)、serca2a、ホスホラン
バン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Barkct、β2アドレナリン
容体、β2アドレナリン受容体キナーゼ(BARK)、ホスホイノシチド−3キナーゼ(
PI3キナーゼ)、S100A1、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ6型、短縮
型の構成的に活性なbARKctなどのGタンパク質共役型受容体キナーゼ2型ノック
ウンをもたらす分子;カルサルシン(calsarcin)、ホスホランバンに対するR
NAi;ホスホランバンS16Eなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガ
ィブ分子などを送達することによる)、関節炎(インスリン様増殖因子)、関節障害(イ
ンスリン様増殖因子1および/または2)、内膜過形成(例えば、enos、inosを
送達することによる)、心臓移植物の生存の改善(スーパーオキシドジスムターゼ)、A
IDS(可溶性CD4)、筋消耗(インスリン様増殖因子I)、腎臓欠損症(kidne
y deficiency)(エリスロポエチン)、貧血(エリスロポエチン)、関節炎
(IRAPおよびTNFα可溶性受容体などの抗炎症性因子)、肝炎(α−インターフェ
ロン)、LDL受容体欠乏症(LDL受容体)、高アンモニア血症オルニチントランス
カルバミラーゼ)、クラッベ病(ガラクトセレブロシダーゼ)、バッテン病、SCA1、
SCA2およびSCA3を含む脊髄性大脳性運動失調症(spinal cerebra
l ataxias)、フェニルケトン尿症フェニルアラニンヒドロキシラーゼ)、自
免疫疾患など。本発明はさらに、移植の成功率を増加させるためおよび/または臓器
植もしくは補助療法の負の副作用を低下させるために、臓器移植後に使用され得る(例え
ば、サイトカイン生成を遮断するために免疫抑制剤または阻害核酸を投与することによっ
て)。別の例として、骨形態形成タンパク質(BNP2、7など、RANKLおよび/ま
たはVEGFを含む)が、例えば、がん患者における破壊(break)または外科的除
去後に、骨同種移植片と共に投与され得る。

0113

本発明は、誘導多能性幹細胞(iPS)を生成するためにも使用され得る。例えば、本
発明のウイルスベクターは、例えば成人線維芽細胞皮膚細胞肝臓細胞腎細胞脂肪
細胞、心臓細胞神経細胞上皮細胞内皮細胞などの非多能性細胞中に、幹細胞関連核
酸(複数であってもよい)を送達するために使用され得る。幹細胞に関連する因子をコー
ドする核酸は、当該分野で公知である。かかる幹細胞および多能性に関連する因子の非限
定的な例には、Oct−3/4、SOXファミリー(例えば、SOX1、SOX2、SO
X3および/またはSOX15)、Klfファミリー(例えば、Klf1、Klf2、K
lf4および/またはKlf5)、Mycファミリー(例えば、C−myc、L−myc
および/またはN−myc)、NANOGおよび/またはLIN28が含まれる。

0114

本発明はまた、代謝障害、例えば糖尿病(例えば、インスリン)、血友病(例えば、第
IX因子または第VIII因子)、リソソーム蓄積症、例えば、ムコ多糖症障害(例えば
スライ症候群[β−グルクロニダーゼ]、ハーラー症候群[α−L−イズロニダーゼ]
シャイエ症候群[α−L−イズロニダーゼ]、ハーラー・シャイエ症候群[α−L−イ
ズロニダーゼ]、ハンター症候群イズロン酸スルファターゼ]、サンフィリポ症候群
ヘパランスルファミダーゼ]、B[N−アセチルグルコサミニダーゼ]、C[アセチル
CoA:α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ]、D[N−アセチルグルコ
サミン6−スルファターゼ]、モルキオ症候群A[ガラクトース−6−硫酸スルファター
ゼ]、B[β−ガラクトシダーゼ]、マロトー・ラミー症候群[N−アセチルガラクトサ
ミン−4−スルファターゼ]など)、ファブリー病(α−ガラクトシダーゼ)、ゴーシェ
病(グルコセレブロシダーゼ)、または糖原貯蔵障害(例えば、ポンペ病;リソソーム酸
α−グルコシダーゼ)を治療および/または予防するために実施され得る。

0115

遺伝子移入は、疾患状態のための療法を理解および提供するためのかなり有望な用途を
有する。欠損した遺伝子が既知でありクローニングされている多数の遺伝性疾患が存在す
る。一般に、上記疾患状態は2つのクラスに入る(劣性様式で一般に遺伝する、通常は酵
素の欠乏状態、および、調節タンパク質または構造タンパク質が関与し得、典型的には優
性様式で遺伝するバランスを欠いた状態)。欠乏状態の疾患について、遺伝子移入は、補
充療法のために罹患組織中に正常な遺伝子をもたらすため、ならびにアンチセンス変異を
使用して疾患の動物モデルを創出するために使用され得る。バランスを欠いた疾患状態に
ついて、遺伝子移入は、モデル系において疾患状態を創出するために使用され得、このモ
デル系は次いで疾患状態に対抗するための試みにおいて使用され得る。従って、本発明に
従うウイルスベクターは、遺伝疾患の治療および/または予防を可能にする。

0116

本発明に従うウイルスベクターは、機能的RNAをインビトロまたはインビボで細胞に
提供するためにも使用され得る。細胞における機能的RNAの発現は、例えば、細胞によ
る特定の標的タンパク質の発現を減少させ得る。従って、機能的RNAは、それを必要と
する対象において特定のタンパク質の発現を減少させるために投与され得る。機能的RN
Aはまた、遺伝子発現および/または細胞生理学を調節するため、例えば、細胞もしくは
組織培養系を最適化するために、またはスクリーニング方法において、インビトロで細胞
に投与され得る。

0117

さらに、本発明に従うウイルスベクターは、診断方法およびスクリーニング方法におい
て用途を見出し、それにより、対象の核酸が、細胞培養系において、あるいはトランスジ
ニック動物モデルにおいて、一過的にまたは安定に発現される。

0118

本発明のウイルスベクターは、当業者に明らかなように、遺伝子の標的化、クリアラ
ス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコールにおける使用が含まれるがこれらに限
定されない種々の非治療的目的のためにも使用され得る。ウイルスベクターは、安全性(
伝播、毒性、免疫原性など)を評価する目的のためにも使用され得る。かかるデータは、
例えば、臨床的効性の評価の前に、通常の承認プロセスの一部として、米国食品医薬
局によって検討される。

0119

さらなる態様として、本発明のウイルスベクターは、対象において免疫応答を生成する
ために使用され得る。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核
酸配列を含むウイルスベクターが対象に投与され得、その免疫原性ポリペプチドに対する
能動免疫応答が、対象によって開始される。免疫原性ポリペプチドは、本明細書中で上記
したとおりである。いくつかの実施形態では、防御免疫応答が惹起される。

0120

あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与され得、変更された細胞が対
象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターが細胞中に導入され、その細胞が対象
に投与され、ここで、免疫原をコードする異種核酸が発現され得、対象においてその免疫
原に対する免疫応答を誘導し得る。特定の実施形態では、細胞は抗原提示細胞(例えば、
樹状細胞)である。

0121

「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の
関与」を特徴とし、「これは、抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発生またはそれら両
方を導く、リンパ細網組織における免疫担当細胞分化および増殖に関与する。」Her
bert B.Herscowitz、Immunophysiology:Cell
Function and Cellular Interactions in An
tibody Formation、IMMUNOLOGY:BASICPROCES
SES117(Joseph A.Bellanti編、1985)。代替的に述べる
と、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主によって開
始される。能動免疫は受動免疫と対比され得、受動免疫は、「能動免疫された宿主から非
免疫宿主への、予め形成された物質(抗体、トランスファー因子胸腺移植片、インター
ロイキン−2)の移入」を介して達成される(同文献)。

0122

防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書中で使用される場合、疾患の発生率
を予防するまたは低下させるという点で、免疫応答が対象にいくらかの利益を付与するこ
とを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんまたは腫瘍の治療
および/または予防において有用であり得る(例えば、がんまたは腫瘍の形成を予防する
ことによって、がんまたは腫瘍の退縮を引き起こすことによって、および/あるいは転移
を予防することによって、および/あるいは転移性小結節の増殖を予防することによって
)。防御効果は、治療の利益がその任意の不利益を上回る限り、完全でも部分的でもよい

0123

特定の実施形態では、異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、本明細書中に記
載される免疫原的に有効な量で投与され得る。

0124

本発明のウイルスベクターは、1つまたは複数のがん細胞抗原(または免疫学的に類似
の分子)あるいはがん細胞に対する免疫応答を生成する任意の他の免疫原を発現するウイ
ルスベクターの投与によるがん免疫療法のためにも投与され得る。説明するために、例え
ばがんを有する患者を治療するためおよび/または対象においてがんの発生を予防するた
めに、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによっ
て、対象においてがん細胞抗原に対する免疫応答が生成され得る。ウイルスベクターは、
本明細書中で記載されるように、インビボでまたはエクスビボ方法を使用することによっ
て、対象に投与され得る。あるいは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現さ
れ得るか、またはウイルスカプシドと他の方法で関連し得る(例えば、上記されるように
)。

0125

別の代替として、当該分野で公知の任意の他の治療的核酸(例えば、RNAi)または
ポリペプチド(例えば、サイトカイン)が、がんを治療および/または予防するために投
与され得る。

0126

本明細書中で使用する場合、用語「がん」は、腫瘍形成がんを包含する。同様に、用語
がん性組織」は腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は腫瘍抗原を包含する。

0127

用語「がん」は、当該分野で理解される意味を有し、例えば、身体の離れた部位に伝播
する能力を有する組織の制御されない増殖(即ち、転移)である。例示的ながんには、メ
ラノーマ、腺癌腫、胸腺腫、リンパ腫(例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫
)、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣
がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんならびに現在公知のまたは後
に同定される任意の他のがんまたは悪性状態が含まれるが、これらに限定されない。代表
的な実施形態では、本発明は、腫瘍形成がんを治療および/または予防する方法を提供す
る。

0128

用語「腫瘍」もまた、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として、当該分野
で理解される。腫瘍は悪性または良性であり得る。代表的な実施形態では、本明細書中に
開示される方法は、悪性腫瘍を予防および治療するために使用される。

0129

用語「がんを治療する」、「がんの治療」および等価な用語は、がんの重症度が低下さ
れもしくは少なくとも部分的に排除されること、ならびに/または疾患の進行が減速され
るおよび/もしくは制御されること、ならびに/または疾患が安定化されることを意図す
る。特定の実施形態では、これらの用語は、がんの転移が予防もしくは低下もしくは少な
くとも部分的に排除されること、ならびに/または転移性小結節の増殖が予防もしくは低
下もしくは少なくとも部分的に排除されることを示す。

0130

用語「がんの予防」または「がんを予防する」および等価な用語は、その方法が、がん
の発症の発生率および/または重症度を、少なくとも部分的に排除または低下および/ま
たは遅延させることを意図する。代替的に述べると、対象におけるがんの発症は、尤度
しくは確率において低下され得る、および/または遅延され得る。

0131

特定の実施形態では、細胞は、がんを有する対象から取り出され得、本発明に従うがん
細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触され得る。次いで、改変された細胞が対象に
投与され、それにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が惹起される。この方法は、イン
ビボで充分な免疫応答を開始できない(即ち、充分な量で促進抗体を生成できない)易感
染性対象と共に有利に使用され得る。

0132

免疫応答は、免疫調節性サイトカイン(例えば、α−インターフェロン、β−インター
フェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、イン
ターロイキン−1α、インターロイキン−1β、インターロイキン−2、インターロイキ
ン−3、インターロイキン−4、インターロイキン5、インターロイキン−6、インター
ロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10
、インターロイキン−11、インターロイキン12、インターロイキン−13、インター
ロイキン−14、インターロイキン−18、B細胞増殖因子、CD40リガンド、腫瘍壊
死因子−α、腫瘍壊死因子−β、単球走化性因子タンパク質−1、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子およびリンホトキシン)によって増強され得ることが、当該分野で公知
である。従って、免疫調節性サイトカイン(好ましくは、CTL誘導性サイトカイン)が
、ウイルスベクターと合わせて対象に投与され得る。

0133

サイトカインは、当該分野で公知の任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカ
インが対象に投与され得るか、あるいはサイトカインをコードする核酸が適切なベクター
を使用して対象に送達され得、サイトカインがインビボで生成され得る。

0134

[対象、医薬製剤および投与様式]
本発明に従うウイルスベクターおよびカプシドは、獣医学適用および医療適用の両方に
おいて用途を見出す。適切な対象には、トリおよび哺乳動物の両方が含まれる。用語「ト
リ」には、本明細書中で使用する場合、ニワトリ、アヒルガチョウウズラ、シチメン
チョウキジオウム、インコなどが含まれるがこれらに限定されない。用語「哺乳動物
」には、本明細書中で使用する場合、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、
ネコ、イヌ、ウサギなどが含まれるがこれらに限定されない。ヒト対象には、新生児、乳
幼児若年、成人および老人の対象が含まれる。

0135

代表的な実施形態では、対象は、本発明の方法「を必要とする」、従っていくつかの実
施形態では、「それを必要とする対象」であり得る。

0136

特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクタ
ーおよび/またはカプシドを含み、任意選択で、他の薬剤、医薬品、安定化剤緩衝剤
担体、補助剤希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注射について、担体は典型的
には液体である。他の投与方法について、担体は固体または液体のいずれかであり得る。
吸入投与について、担体は呼吸用であり、任意選択で、固体または液体の粒状形態であり
得る。

0137

「薬学的に許容される」とは、毒性でなくその他の点でも望ましくない材料、即ち、そ
の材料が、望ましくない生物学的影響をいずれも引き起こすことなしに対象に投与され得
ることを意味する。

0138

本発明の一態様は、核酸をインビトロで細胞に移入する方法である。ウイルスベクター
は、特定の標的細胞に適した標準的な形質導入法に従って、適切な感染多重度で細胞中に
導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞の型および数、ならびに特
定のウイルスベクターに依存して変動し得、過度実験なしに当業者によって決定され得
る。代表的な実施形態では、少なくとも約103感染単位、任意選択で少なくとも約10
5感染単位が、細胞に導入される。

0139

ウイルスベクターが導入される細胞(複数でもよい)は、任意の型の細胞であり得、以
下が含まれるがこれらに限定されない:神経細胞(末梢神経系および中枢神経系の細胞、
特に、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトなどの脳細胞が含まれる)、肺細胞、眼の
細胞(網膜細胞網膜色素上皮および角膜細胞が含まれる)、上皮細胞(例えば、腸およ
呼吸器の上皮細胞)、筋細胞(例えば、骨格筋細胞心筋細胞平滑筋細胞および/ま
たは横隔膜筋細胞)、樹状細胞、膵臓細胞島細胞が含まれる)、肝細胞、心筋細胞、骨
細胞(例えば、骨髄幹細胞)、造血幹細胞脾臓細胞ケラチノサイト、線維芽細胞、内
皮細胞前立腺細胞生殖細胞など。代表的な実施形態では、細胞は任意の前駆細胞であ
り得る。さらなる実施形態として、細胞は幹細胞(例えば、神経幹細胞肝臓幹細胞)で
あり得る。なおさらなる実施形態として、細胞はがん細胞または腫瘍細胞であり得る。さ
らに、細胞は、上で示したような任意の種起源であり得る。

0140

ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細
胞中に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、対象から取り出されたものであり、
ウイルスベクターがその細胞に導入され、次いでその細胞が対象中に戻し投与される。エ
クスビボでの操作のために対象から細胞を取り出し、その後対象中に戻し導入する方法は
、当該分野で公知である(例えば、米国特許第5,399,346号を参照のこと)。あ
るいは、組換えウイルスベクターは、ドナー対象由来の細胞中に、培養細胞中に、または
任意の他の適切な供給源由来の細胞中に導入され得、この細胞が、それを必要とする対象
(即ち、「レシピエント」対象)に投与される。

0141

エクスビボ核酸送達に適した細胞は上記のとおりである。対象に投与する細胞の投薬量
は、対象の年齢、状態および種、細胞の型、細胞が発現する核酸、投与様式などに応じて
変動する。典型的には、少なくとも約102〜約108細胞または少なくとも約103〜
約106細胞が、1投薬当たり薬学的に許容される担体中で投与される。特定の実施形態
では、ウイルスベクターで形質導入された細胞は、医薬担体と組み合わせて、治療有効量
または予防有効量で対象に投与される。

0142

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが細胞中に導入され、(例えば、導入遺伝
子として発現されたまたはカプシド中にて)送達されたポリペプチドに対する免疫原性応
答を惹起するために、その細胞が対象に投与され得る。典型的には、免疫原的に有効な量
のポリペプチドを発現する細胞の量が、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与され
る。「免疫原的に有効な量」は、医薬製剤が投与される対象において、そのポリペプチド
に対する能動免疫応答を誘起するのに充分な、発現されたポリペプチドの量である。特定
の実施形態では、投薬量は、(上で定義したような)防御免疫応答を生成するのに充分で
ある。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がその任意の不利益を上回る限り、付
与される保護の程度は、完全または永続的である必要はない。

0143

本発明のさらなる態様は、ウイルスベクターおよび/またはウイルスカプシドを対象に
投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への、本発明に従うウイルス
ベクターおよび/またはカプシドの投与は、当該分野で公知の任意の手段によってであり
得る。任意選択で、ウイルスベクターおよび/またはカプシドは、薬学的に許容される担
体中で、治療有効用量または予防有効用量で送達され得る。

0144

本発明のウイルスベクターおよび/またはカプシドはさらに、(例えば、ワクチンとし
て)免疫原性応答を惹起するために投与され得る。典型的には、本発明の免疫原性組成物
は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、免疫原的に有効な量のウイルスベクターお
よび/またはカプシドを含む。任意選択で、投薬量は、(上で定義したような)防御免疫
応答を生成するのに充分である。

0145

対象に投与されるウイルスベクターおよび/またはカプシドの投薬量は、投与様式、治
療および/または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクタ
ーまたはカプシド、送達される核酸などに依存し、慣用的な様式で決定され得る。治療効
果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約105、106、107、108、1
09、1010、1011、1012、103、1014、1015形質導入単位、任意
選択的に約108〜1013形質導入単位の力価である。

0146

特定の実施形態では、1回より多い投与(例えば、2回、3回、4回またはそれ以上の
投与)が、例えば、毎日、週1回、月1回、年1回などの種々の間隔の期間にわたって、
所望のレベルの遺伝子発現を達成するために使用され得る。

0147

例示的な投与様式には、経口、直腸、経粘膜鼻腔内、吸入(例えば、エアロゾルを介
して)、頬側(例えば、下)、髄腔内、眼内、経皮子宮内(または内)、非経
口(例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内[骨格筋、横隔膜筋および/または心筋への投与
が含まれる]、皮内、胸膜内、脳内および関節内)、外用(例えば、気道表面を含む皮膚
表面および粘膜表面の両方への、ならびに経皮投与)、リンパ内など、ならびに直接的な
組織または臓器への注射(例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への)が含ま
れる。投与は、腫瘍への投与であり得る(例えば、腫瘍またはリンパ節の中または近傍)
。任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療および/または予防される状態の性
質および重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存する。

0148

本発明に従う骨格筋への投与には、四肢(例えば、上腕前腕大腿および/または下
)、背部頚部、頭部(例えば、舌)、胸郭腹部骨盤会陰部および/または指の
骨格筋への投与が含まれるが、これらに限定されない。適切な骨格筋には以下が含まれる
がこれらに限定されない。小指外転筋(手の)、小外転筋(足の)、母趾外転筋、第五
中足骨外転筋(abductor ossis metatarsi quinti)、
短母指外転筋長母指外転筋短内転筋母趾内転筋長内転筋大内転筋母指内転筋
肘筋前斜角筋膝関節筋上腕二頭筋大腿二頭筋上腕筋腕橈骨筋頬筋烏口
腕筋、皺眉筋三角筋口角下制筋下唇下制筋顎二腹筋背側骨間筋(手の)、背側
骨間筋(足の)、短橈側手根伸筋長橈側手根伸筋尺側手根伸筋小指伸筋指伸筋
短趾伸筋、長趾伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋短母指伸筋長母指伸筋、橈
側手屈筋尺側手根屈筋短小指屈筋(手の)、短小趾屈筋(足の)、短趾屈筋、長趾
屈筋、深指屈筋浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋長母指屈筋前頭筋
腓腹筋オトガイ舌骨筋大臀筋中臀筋、小臀筋薄筋腸肋筋腰腸肋筋
肋筋腸骨筋(illiacus)、下双子筋下斜筋下直筋棘下筋棘間筋横突
間筋(intertransversi)、外側翼突筋外直筋広背筋口角挙筋、上
挙筋上唇鼻翼挙筋上眼瞼挙筋肩甲挙筋長回旋筋(long rotators
)、頭最長筋、頸最長筋胸最長筋頭長筋、頸長筋、虫様筋(手の)、虫様筋(足の)
咬筋内側翼突筋内直筋中斜角筋多裂筋顎舌骨筋、下頭斜筋上頭斜筋、外閉
鎖筋、内閉鎖筋後頭筋肩甲舌骨筋小指対立筋母指対立筋眼輪筋口輪筋掌側
骨間筋、短掌筋長掌筋恥骨筋大胸筋小胸筋短腓骨筋長腓骨筋第三腓骨筋
梨状筋底側骨間筋足底筋広頸筋膝窩筋後斜角筋方形回内筋円回内筋、大
筋、大腿方形筋足底方形筋前頭直筋外側頭直筋、大後頭直筋小後頭直筋、大腿直
筋、大菱形筋小菱形筋笑筋縫工筋、最小斜角筋半膜様筋頭半棘筋、頸半棘筋
胸半棘筋半腱様筋前鋸筋短回旋筋(short rotators)、ヒラメ筋
頭棘筋、頸棘筋胸棘筋頭板状筋、頸板状筋胸鎖乳突筋胸骨舌骨筋胸骨甲状筋
茎突舌骨筋鎖骨下筋肩甲下筋上双子筋上斜筋上直筋回外筋棘上筋側頭筋
大腿筋膜張筋大円筋小円筋胸部の筋、甲状舌骨筋前脛骨筋後脛骨筋僧帽筋
上腕三頭筋中間広筋外側広筋内側広筋大頬骨筋および小頬骨筋、ならびに当該
分野で公知の任意の他の適切な骨格筋。

0149

ウイルスベクターおよび/またはカプシドは、静脈内投与動脈内投与、腹腔内投与
四肢灌流(任意選択で、下肢および/または腕の孤立した四肢灌流;例えば、Arrud
aら(2005)Blood 105:3458〜3464頁を参照のこと)、および/
または直接的筋内注射によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、ウイルスベ
クターおよび/またはカプシドは、四肢灌流、任意選択で孤立した四肢灌流(例えば、静
脈内投与または関節内投与による)によって、対象(例えば、DMDなどの筋ジストロフ
ィーを有する対象)の四肢(腕および/または下肢)に投与される。本発明の実施形態で
は、本発明のウイルスベクターおよび/またはカプシドは、「水力学的」技術を使用する
ことなく有利に投与され得る。ベクターの組織送達(例えば、筋肉への)は、脈管構造中
の圧力を増加させ、内皮細胞障壁を横切るベクターの能力を促進する水力学的技術(例え
ば、大容量での静脈内/静脈内投与)によって増強されることが多い。特定の実施形態で
は、本発明のウイルスベクターおよび/またはカプシドは、高容量注入および/または上
昇した血管内圧力(例えば、正常な収縮期血圧より高い、例えば、血管内圧力における5
%以下、10%以下、15%以下、20%以下、25%以下の、正常な収縮期血圧を超え
た増加)などの水力学的技術の非存在下で投与され得る。かかる方法は、浮腫神経損傷
および/またはコンパートメント症候群などの、水力学的技術に関連する副作用を低下ま
たは回避し得る。

0150

心筋への投与には、左心房右心房左心室右心室および/または中隔への投与が含
まれる。ウイルスベクターおよび/またはカプシドは、静脈内投与、大動脈内投与などの
動脈内投与、直接的心臓注射(例えば、左心房、右心房、左心室、右心室中への)および
/または冠状動脈灌流によって、心筋に送達され得る。

0151

横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与および/または腹腔内投与を含む任意の
適切な方法によるものであり得る。

0152

標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび/またはカプシドを含むデポーを送達す
ることによっても達成され得る。代表的な実施形態では、ウイルスベクターおよび/また
はカプシドを含むデポーは、骨格筋、心筋および/または横隔膜筋組織中に移植され、あ
るいは組織が、ウイルスベクターおよび/またはカプシドを含むフィルムまたは他のマト
リックスと接触され得る。かかる移植可能マトリックスまたは基材は、例えば米国特許
第7,201,898号中に記載されている。

0153

特定の実施形態では、本発明に従うウイルスベクターおよび/またはウイルスカプシド
は、(例えば、筋ジストロフィー、心臓疾患[例えば、PADまたはうっ血性心不全]を
治療および/または予防するために)骨格筋、横隔膜筋および/または心筋に投与される

0154

代表的な実施形態では、本発明は、骨格筋、心筋および/または横隔膜筋の障害を治療
および/または予防するために使用される。

0155

代表的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを
治療および/または予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量または予防有効量の
本発明のウイルスベクターを哺乳動物対象に投与するステップを含み、このウイルスベク
ターは、以下をコードする異種核酸を含む。ジストロフィン、ミニジストロフィン、ミク
ロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンII型可溶
性受容体、IGF−1、抗炎症性ポリペプチド、例えば、IκB優性変異体、サルコスパ
ン、ユートロフィン、ミクロジストロフィン、ラミニン−α2、α−サルコグリカン、β
−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、IGF−1、ミオスタチ
ンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片、および/あるいはミオ
スタチンに対するRNAi。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書中の別
の箇所に記載するように、骨格筋、横隔膜筋および/または心筋に投与され得る。

0156

あるいは、本発明は、骨格筋、心筋または横隔膜筋に核酸を送達するために実施され得
、これらの筋肉は、正常に血中を循環するポリペプチド(例えば、酵素)または機能的R
NA(例えば、RNAi、マイクロRNA、アンチセンスRNA)の生成のための、ある
いは障害(例えば、代謝障害、例えば糖尿病[例えば、インスリン]、血友病[例えば、
第IX因子または第VIII因子]、ムコ多糖障害[例えば、スライ症候群、ハーラー症
候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフリポ症候
群A、B、C、D、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群など]、またはリソソーム
蓄積症、例えば、ゴーシェ病[グルコセレブロシダーゼ]もしくはファブリー病[α−ガ
ラクトシダーゼA]、またはポンペ病[リソソーム酸αグルコシダーゼ]などの糖原貯蔵
障害)を治療および/または予防するための他の組織への全身送達のための、プラット
ォームとして使用される。代謝障害を治療および/または予防するのに適した他のタンパ
ク質は、本明細書中に記載されている。対象の核酸を発現するためのプラットフォーム
しての筋肉の使用は、米国特許公開公報20020192189号に記載されている。

0157

従って、一態様として、本発明はさらに、それを必要とする対象において代謝障害を治
療および/または予防する方法を包含し、この方法は、治療有効量または予防有効量の本
発明のウイルスベクターを対象の骨格筋に投与するステップを含み、このウイルスベクタ
ーはポリペプチドをコードする異種核酸を含み、この代謝障害は、ポリペプチドの欠乏
よび/または欠損の結果である。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする異種
核酸は、本明細書中に記載されている。任意選択的に、ポリペプチドは分泌される(例え
ば、そのネイティブ状態で分泌されたポリペプチドであるポリペプチド、あるいは例えば
当該分野で公知の分泌シグナル配列との作動可能な関連によって分泌されるように操作さ
れたポリペプチド)。本発明の任意の特定の理論に限定されず、この実施形態によれば、
骨格筋への投与は、全身循環中へのポリペプチドの分泌および標的組織(複数でもよい)
への送達を生じ得る。ウイルスベクターを骨格筋に送達する方法は、本明細書中でより詳
細に記載される。

0158

本発明は、全身送達のためのアンチセンスRNA、RNAiまたは他の機能的RNA(
例えば、リボザイム)を生成するためにも実施され得る。

0159

本発明は、それを必要とする対象において先天性心不全またはPADを治療および/ま
たは予防する方法もまた提供し、この方法は、治療有効量または予防有効量の本発明のウ
イルスベクターを哺乳動物対象に投与するステップを含み、このウイルスベクターは、例
えば以下をコードする異種核酸を含む。筋小胞体(sarcoplasmic endo
reticulum)Ca2+−ATPase(SERCA2a)、血管新生因子、ホス
ファターゼインヒビターI(I−1)およびその断片(例えば、I1C)、ホスホランバ
ンに対するRNAi;ホスホランバンS16Eなどのホスホランバン阻害分子またはドミ
ナンネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、
β2アドレナリン受容体、β2アドレナリン受容体キナーゼ(BARK)、PI3キナ
ゼ、カルサルカン(calsarcan)、βアドレナリン受容体キナーゼインヒビター
(βARKct)、プロテインホスファターゼ1のインヒビター1およびその断片(例え
ば、I1C)、S100A1、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ6型、短縮型の
構成的に活性なbARKctなどのGタンパク質共役型受容体キナーゼ2型ノックダウン
をもたらす分子、Pim−1、PGC−1α、SOD−1、SOD−2、EC−SOD、
カリクレイン、HIF、チモシン−β4、mir−1、mir−133、mir−206
、mir−208および/またはmir−26a。

0160

注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射の前に液体中で溶液もしくは懸濁液にするの
に適した固体形態、または乳濁液のいずれかとして、従来の形態で調製され得る。あるい
は、本発明のウイルスベクターおよび/またはウイルスカプシドを、全身様式ではなく局
所様式で、例えば、デポー製剤または徐放性製剤で、投与し得る。さらに、ウイルスベク
ターおよび/またはウイルスカプシドは、外科的に移植可能なマトリックスに付着して送
達され得る(例えば、米国公開公報20040013645号に記載される)。

0161

本明細書中に開示されるウイルスベクターおよび/またはウイルスカプシドは、対象が
吸入する、ウイルスベクターおよび/またはウイルスカプシドから構成される呼吸用粒子
のエアロゾル懸濁液を任意選択で投与することによって、任意の適切な手段で対象の肺に
投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であり得る。ウイルスベクターおよび/ま
たはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動式エアロゾルネブライザ
ーまたは超音波ネブライザーなどの任意の適切な手段によって、当業者に公知のように生
成され得る。例えば、米国特許第4,501,729号を参照のこと。ウイルスベクター
および/またはカプシドを含む固体粒子のエアロゾルも同様に、医薬分野で公知の技術に
よって、任意の固体粒状医薬エアロゾル生成器を用いて生成され得る。

0162

ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、中枢神経系(CNS)の組織(例えば、
脳、眼)に投与され得、本発明の非存在下で観察されるものよりも広い分布のウイルスベ
クターまたはカプシドを有利に生じ得る。

0163

特定の実施形態では、本発明の送達ベクターは、遺伝性障害、神経変性障害精神障害
および腫瘍を含むCNSの疾患を治療するために投与され得る。CNSの例示的疾患には
、以下が含まれるがこれらに限定されない。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチ
トン病、カナバン病、リー病レフサム病トゥレット症候群原発性側索硬化症、筋
萎縮性側索硬化症進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症
筋無力症ビンスワンガー病、脊髄および頭部の損傷に起因する外傷、テイ・サックス病
、レッシュ・ナイハン病(Lesch−Nyan disease)、癲癇、脳梗塞、気
分障害(例えば、うつ病双極性感情障害持続性感情障害、二次的気分障害)、統合
調症、薬物依存性(例えば、アルコール依存症および他の物質の依存性)、神経症(例え
ば、不安症、強迫障害、身体表現性障害、解離性障害悲嘆産後うつ病)、精神病(例
えば、幻覚および妄想)、認知症パラノイア注意欠陥障害精神性的障害、睡眠障害
疼痛性障害摂食障害もしくは体重障害(例えば、肥満症悪液質神経性食欲不振症
および過食症(bulemia))を含む精神障害、ならびにCNSのがんおよび腫瘍(
例えば、原発性腫瘍)。

0164

CNSの障害には、網膜、後方路(posterior tract)および視神経
関与する眼科障害(例えば、網膜色素変性症糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患
ブドウ膜炎加齢性黄斑変性症緑内障)が含まれる。

0165

全部ではないが殆どの眼科の疾患および障害は、3つの型の指標のうち1つまたは複数
と関連する:(1)血管新生、(2)炎症および(3)変性。本発明の送達ベクターは、
抗血管新生因子;抗炎症性因子;細胞変性を遅延させ、細胞温存(sparing)を促
進し、または細胞増殖を促進する因子、および上述の組み合わせを送達するために使用さ
れ得る。

0166

例えば、糖尿病性網膜症は、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼
内(例えば、硝子体中)または眼窩周囲(例えば、テノン下領域中)のいずれかに、1つ
または複数の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。1つまたは複数の神
経栄養因子もまた、眼内(例えば、硝子体内)または眼窩周囲のいずれかに同時送達され
得る。

0167

ブドウ膜炎は炎症に関与する。1つまたは複数の抗炎症因子が、本発明の送達ベクター
の眼内(例えば、硝子体または前房)投与によって投与され得る。

0168

比較として、網膜色素変性症は、網膜変性によって特徴付けられる。代表的な実施形態
では、網膜色素変性症は、1つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼
内(例えば、硝子体)投与によって治療され得る。

0169

加齢性黄斑変性症は、血管新生および網膜変性の両方に関与する。この障害は、1つま
たは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内(例えば、硝子体)に
、および/あるいは1つまたは複数の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクター
を眼内または眼窩周囲(例えば、テノン下領域中)に投与することによって、治療され得
る。

0170

緑内障は、眼圧の増加および網膜神経節細胞喪失によって特徴付けられる。緑内障の
治療には、本発明の送達ベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する1つまたは
複数の神経保護剤の投与が含まれる。かかる薬剤には、眼内に、任意選択で硝子体内に送
達される、N−メチル−D−アスパラギン酸NMDAアンタゴニスト、サイトカイン
および神経栄養因子が含まれる。

0171

他の実施形態では、本発明は、発作を治療するため、例えば、発作の発症、発生率およ
び/または重症度を低下させるために使用され得る。発作の治療的処置効力は、行動的
手段(例えば、眼または口の震えチック(tick))および/または電気記録手段(
殆どの発作は、顕著な電気記録の異常を有する)によって評価され得る。従って、本発明
は、経時的な複数の発作を特徴とする癲癇を治療するためにも使用され得る。

0172

1つの代表的な実施形態では、ソマトスタチン(またはその活性断片)が、下垂体腫瘍
を治療するために、本発明の送達ベクターを使用して脳に投与される。この実施形態によ
れば、ソマトスタチン(またはその活性断片)をコードする送達ベクターは、微量注入
よって下垂体中に投与される。同様に、かかる治療は、先端巨大症(下垂体からの異常な
成長ホルモン分泌)を治療するために使用され得る。ソマトスタチンの核酸配列(例えば
GenBank受託番号J00306)およびアミノ酸配列(例えば、GenBank
受託番号P01166;プロセシングされた活性ペプチドソマトスタチン−28およびソ
マトスタチン−14を含む)は、当該分野で公知である。

0173

特定の実施形態では、ベクターは、例えば米国特許第7,071,172号に記載され
分泌シグナルを含み得る。

0174

本発明の代表的な実施形態では、ウイルスベクターおよび/またはウイルスカプシドは
、CNSに(例えば、脳にまたは眼に)投与される。ウイルスベクターおよび/またはカ
プシドは、脊髄、脳幹延髄脳橋)、中脳視床下部視床視床上部、下垂体、黒質
松果体)、小脳終脳線条体後頭葉皮質側頭葉皮質、頭頂葉皮質および前頭葉
質、基底核海馬ならびに扁桃体(portaamygdala)を含む大脳)、辺縁系
新皮質、線条体、大脳および/または下丘中に導入され得る。ウイルスベクターおよび
/またはカプシドは、網膜、角膜および/または視神経などの眼の異なる領域にも投与さ
れ得る。

0175

ウイルスベクターおよび/またはカプシドは、送達ベクターのより分散した投与のため
に、脳脊髄液中に(例えば、腰椎穿刺によって)送達され得る。ウイルスベクターおよび
/またはカプシドはさらに、血液脳関門撹乱された状況(例えば、脳腫瘍または脳梗塞
)において、CNSに血管内投与され得る。

0176

ウイルスベクターおよび/またはカプシドは、髄腔内、脳内、脳室内、静脈内(例えば
マンニトールなどの糖の存在下)、鼻腔内、耳内、眼内(例えば、硝子体内、網膜下
前房)および眼窩周囲(例えば、テノン下領域)送達、ならびに運動ニューロンへの逆行
性送達と合わせた筋内送達が含まれるがこれらに限定されない当該分野で公知の任意の経
路によって、CNSの所望の領域(複数であってよい)に投与され得る。

0177

特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび/またはカプシドは、CNS中の所望の
領域または区画への直接的注射(例えば、定位注射)によって、液体製剤で投与される。
他の実施形態では、ウイルスベクターおよび/またはカプシドは、所望の領域への外用適
用によって、またはエアロゾル製剤鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、
液滴の外用適用によるものであり得る。さらなる代替として、ウイルスベクターおよび/
またはカプシドは、固体の持続放出製剤として投与され得る(例えば、米国特許第7,2
01,898号を参照のこと)。

0178

なおさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、運動ニューロンに関与する疾患およ
び障害(例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)など)を治
療および/または予防するための逆行性輸送に使用され得る。例えば、ウイルスベクター
は、筋肉組織に送達され得、そこからニューロン中に移動し得る。

0179

本発明を説明してきたが、同内容は以下の実施例においてさらに詳細に説明され、以下
の実施例は、本発明の説明目的のためだけに本明細書中に含まれるものであり、本発明を
限定する意図ではない。

0180

[二重グリカン結合性AAVの操作]
構造モデル化。AAV2およびAAV9のウイルスタンパク質(VP)結晶構造につい
ての座標を、RCSB Protein Databankから得た(それぞれ、PDB
受託番号1LP3および3UX1)30、31。SWISS−MODELタンパク質構造
モデル化サーバー(http://swissmodel.expasy.org/)3
2を使用して、2G9−VP3モノマーの相同性モデルを、AAV2−VP3の結晶構造
を鋳型として用いて生成した。インタクトな2G9カプシドの三次元正二十面体モデルを
、VIPERdb−Virus Particle ExploreR2においてOli
gomer Generatorユーティリティを使用して創出した33。同様に、AA
V2−VP3トリマー、2G9トリマーおよびAAV9トリマーの図解を、Oligom
er Generatorユーティリティを使用して得た。全ての構造モデルを、それぞ
れ橙色および紫色で強調したガラクトース結合部位を形成する残基(AAV9−VP1で
の番号付け:D271、N272、Y446、N470、A472、V473、W503
)13およびヘパラン硫酸結合部位を形成する残基(AAV2−VP1での番号付け:R
487、K527、K532、R585、R588)10〜12、34と共にPyMOL
を使用して可視化した。異なるモノマーを、淡緑色、明るい青色および明るい色で着色
した。

0181

二重グリカン結合性AAV株の生成。ヘルパープラスミドpXR1、2、6、8および
9を、UNCベクターコアから得た。AAV9カプシドタンパク質サブユニット上のGa
認識部位に直接関与するまたは隣接するアミノ酸残基を、AAV2のカプシドサブユ
ット上の対応する残基上に置換することによって(AAV2 VP1の番号付け:A26
6S、Q464V、A467P、D469N、I470M、R471A、D472V、S
474G、Y500F、S501A)、原型pXR2G9キメラプラスミド構築物を生成
した。置換を、以下のプライマー(IDT)を使用し、QuikChange(登録商標
)Lightning部位特異的変異誘発キット(Agilent)を使用して生成した
:5’−GGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCGTTT TCT
GTGGCCG GACCCAGTAACATGGCTGTC CAGGGAAGGA
ACTGGCTTCCT GGACCCTGTT ACCGC−3’および5’−GA
CATCTGCG GATAACAACA ACAGTGAATTTGCTTGGAC
TG GAGCTACCAA GTACCACCT−3’。CBA−Luc導入遺伝子カ
セットをパッケージングする組換えAAVベクターを、以前に記載されたように生成した
14。ウイルス力価を、定量的PCRによって得た。

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