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課題・解決手段

ブタサーコウイルス3型(PCV3)と呼ばれる新種サーコウイルスが、通常はPCV2感染症に関連する臨床症状を有する雌ブタおよび流産胎児から確認された。分子分析および血清学的分析により、PCV3が、米国のブタの間で広く広まっていることが示唆された。本開示は、免疫学的組成物、およびその製造方法および投与に関する方法を提供する。

概要

背景

ブタサーコウイルス2型(PCV2)は、1990年代中盤カナダで、離乳後多臓器消耗症候群(PMWS)に罹患したブタにおいて、初めて散発的に確認された。PCV2に関連する重度全身性疾患流行病は、その後、アメリカヨーロッパ、およびアジアで確認された。市販ワクチンの広範な使用により、PMWS、肺炎豚皮膚炎腎症症候群(PDNS)、および生殖障害を含むPCV2関連疾患(PCVAD)は効果的に抑制された。後ろ向き調査により、PCV2は、臨床疾患が広範囲に広まる前に、ブタの間で何十年も気付かれずに広まることが実証された。PCV2aからPCV2bへの顕性遺伝子の遺伝子型シフトは、PCVADの重度に対応すると思われる。近年、ブタサーコウイルス3型(PCV3)と呼ばれる新種サーコウイルスが、通常はPCV2感染症に関連する臨床症状を有する雌ブタおよび流産胎児から確認された。

概要

ブタサーコウイルス3型(PCV3)と呼ばれる新種のサーコウイルスが、通常はPCV2感染症に関連する臨床症状を有する雌ブタおよび流産胎児から確認された。分子分析および血清学的分析により、PCV3が、米国のブタの間で広く広まっていることが示唆された。本開示は、免疫学的組成物、およびその製造方法および投与に関する方法を提供する。なし

目的

免疫原性組成物、その製造方法、およびその使用方法


本開示の一態様は、組換えPCV3 ORF2タンパク質を製造および/または回収する方法であって、(1)培地中の多数の感受性細胞を、PCV3タンパク質をコードする組換えウイルスベクターに感染させるステップと、(2)組換えウイルスベクターによってPCV3タンパク質を発現させるステップと、(3)PCV3タンパク質を回収するステップと、(4)発現したPCV3タンパク質から細胞片を分離するステップと、を含む方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

ORF1、ORF2、およびORF3からなる群より選択される少なくとも1つのブタサーコウイルス3型タンパク質と、溶媒分散媒被覆剤、安定剤、希釈剤防腐剤抗菌剤抗真菌剤等張剤、および吸収遅延剤からなる群より選択される獣医学的に許容される担体と、を含む組成物

請求項2

前記タンパク質は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項3

前記タンパク質は、配列番号4、配列番号6、配列番号8、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有することを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項4

前記獣医学的に許容される担体は、安定剤および/または防腐剤および/または抗菌剤を含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項5

前記タンパク質は、最終組成物内に、0.2−400μg/mlの範囲の量で存在することを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項6

免疫刺激剤をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項7

ブタにおける別の病原体に対する少なくとも1つの別の免疫学的活性成分をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項8

前記別の病原体は、アクチノバチルスプルニューモニアアデノウイルスアルファウイルス(例えば東部ウマ脳炎ウイルス)、気管支敗血症菌ブラキスピラ属(好ましくは、ブラキスピラヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピオシコリ)、ブタ流産菌(好ましくは、生物型1、2、および3)、ブタコレラウイルスクロストリジウム属(好ましくは、クロストリジウムディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンスA、BおよびC型、クロストリジウム・ノーヴィ、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・テタニ)、コロナウイルス(好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス)、エペリスロゾーノシス・スイス、エリシペロスリクスルシオパシエ大腸菌ヘモフィルスパラスイス(好ましくは、亜型1、7、および14)、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルスローソニアイントラセルラリスレプトスピラ属(好ましくは、レプトスピラ・アウストラリス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリッポチフォサ、レプトスピラ・イクテロヘモラジカエ、プトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・タラソビ)、マイコバクテリウム属(好ましくは、マイコバクテリウムアビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・ボビス)、マイコプラズマハイオニューモニエパスツレラマルトシダブタサイトメガロウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群PRRS)ウイルス、仮性狂犬病ウイルスロタウイルスサルモネラ属(好ましくは、サルモネラティフィムリウム、サルモネラ・コレラスイス)、スタフィロコッカス・ヒイクス、スタフィロコッカス属(好ましくはストレプトコッカス属、好ましくはストレプトコッカス・スイス)、ブタヘルペスウイルスブタインフルエンザウイルスブタポックスウイルス水疱性口内炎ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、レプトスピラ・ハルジョー、およびマイコプラズマ・ハイオシノビエからなる群より選択されることを特徴とする請求項7に記載の組成物。

請求項9

ORF1をコードするヌクレオチド配列、ORF2をコードするヌクレオチド配列、およびORF3をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも1つのブタサーコウイルス3型ヌクレオチド配列と、溶媒、分散媒、被覆剤、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤からなる群より選択される獣医学的に許容される担体と、を含む組成物。

請求項10

前記ヌクレオチド配列は、配列番号4、配列番号6、配列番号8、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有する配列をコードすることを特徴とする請求項9に記載の組成物。

請求項11

前記ヌクレオチド配列は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有することを特徴とする請求項9に記載の組成物。

請求項12

前記獣医学的に許容される担体は、安定剤および/または防腐剤および/または抗菌剤を含むことを特徴とする請求項9に記載の組成物。

請求項13

前記ヌクレオチド配列は、最終組成物内に、0.2−400μg/mlの範囲の量で存在することを特徴とする請求項9に記載の組成物。

請求項14

免疫刺激剤をさらに含むことを特徴とする請求項9に記載の組成物。

請求項15

ブタにおける別の病原体に対する少なくとも1つの別の免疫学的活性成分をさらに含むことを特徴とする請求項9に記載の組成物。

請求項16

前記別の病原体は、アクチノバチルス・プルロニューモニア、アデノウイルス、アルファウイルス(例えば東部ウマ脳炎ウイルス)、気管支敗血症菌、ブラキスピラ属(好ましくは、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピオシコリ)、ブタ流産菌(好ましくは、生物型1、2、および3)、ブタコレラウイルス、クロストリジウム属(好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンスA、BおよびC型、クロストリジウム・ノーヴィ、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・テタニ)、コロナウイルス(好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス)、エペリスロゾーノシス・スイス、エリシペロスリクス・ルシオパシエ、大腸菌、ヘモフィルス・パラスイス(好ましくは、亜型1、7、および14)、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ローソニア・イントラセルラリス、レプトスピラ属(好ましくは、レプトスピラ・アウストラリス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリッポチフォサ、レプトスピラ・イクテロヘモラジカエ、プトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・タラソビ)、マイコバクテリウム属(好ましくは、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・ボビス)、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、ブタサイトメガロウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ロタウイルス、サルモネラ属(好ましくは、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・コレラスイス)、スタフィロコッカス・ヒイクス、スタフィロコッカス属(好ましくはストレプトコッカス属、好ましくはストレプトコッカス・スイス)、ブタヘルペスウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、レプトスピラ・ハルジョー、およびマイコプラズマ・ハイオシノビエからなる群より選択されることを特徴とする請求項15に記載の組成物。

請求項17

ブタサーコウイルス1型DNAの一部およびブタサーコウイルス3型DNAの一部を含有するプラスミドDNAを含むキメラDNA分子と、溶媒、分散媒、被覆剤、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤からなる群より選択される獣医学的に許容される担体と、を含む組成物。

請求項18

前記ブタサーコウイルス3型DNAは、配列番号3、配列番号5、配列番号7、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有することを特徴とする請求項17に記載の組成物。

請求項19

前記ブタサーコウイルス3型DNAは、配列番号4、配列番号6、配列番号8、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする請求項17に記載の組成物。

請求項20

前記獣医学的に許容される担体は、安定剤および/または防腐剤および/または抗菌剤を含むことを特徴とする請求項17に記載の組成物。

請求項21

前記タンパク質は、最終組成物内に、0.2−400μg/mlの範囲の量で存在することを特徴とする請求項17に記載の組成物。

請求項22

免疫刺激剤をさらに含むことを特徴とする請求項17に記載の組成物。

請求項23

ブタにおける別の病原体に対する少なくとも1つの別の免疫学的活性成分をさらに含むことを特徴とする請求項17に記載の組成物。

請求項24

前記別の病原体は、アクチノバチルス・プルロニューモニア、アデノウイルス、アルファウイルス(例えば東部ウマ脳炎ウイルス)、気管支敗血症菌、ブラキスピラ属(好ましくは、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピオシコリ)、ブタ流産菌(好ましくは、生物型1、2、および3)、ブタコレラウイルス、クロストリジウム属(好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンスA、BおよびC型、クロストリジウム・ノーヴィ、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・テタニ)、コロナウイルス(好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス)、エペリスロゾーノシス・スイス、エリシペロスリクス・ルシオパシエ、大腸菌、ヘモフィルス・パラスイス(好ましくは、亜型1、7、および14)、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ローソニア・イントラセルラリス、レプトスピラ属(好ましくは、レプトスピラ・アウストラリス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリッポチフォサ、レプトスピラ・イクテロヘモラジカエ、プトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・タラソビ)、マイコバクテリウム属(好ましくは、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・ボビス)、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、ブタサイトメガロウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ロタウイルス、サルモネラ属(好ましくは、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・コレラスイス)、スタフィロコッカス・ヒイクス、スタフィロコッカス属(好ましくはストレプトコッカス属、好ましくはストレプトコッカス・スイス)、ブタヘルペスウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、レプトスピラ・ハルジョー、およびマイコプラズマ・ハイオシノビエからなる群より選択されることを特徴とする請求項23に記載の組成物。

請求項25

ブタサーコウイルス3型に対する免疫学的応答誘導する方法であって、請求項1に記載の組成物、請求項9に記載の組成物、請求項17に記載の組成物、請、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される組成物を投与するステップを含む方法。

請求項26

前記投与される組成物は、請求項1に記載の組成物を含み、請求項1に記載の前記タンパク質は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされることを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項27

前記投与される組成物は、請求項9に記載の組成物を含み、請求項9に記載の前記ヌクレオチド配列は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有することを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項28

前記投与される組成物は、請求項25に記載の組成物を含み、請求項25に記載のDNA分子は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項29

請求項1に記載の前記タンパク質は、配列番号4、配列番号6、配列番号8、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有することを特徴とする請求項26に記載の方法。

請求項30

前記獣医学的に許容される担体は、安定剤および/または防腐剤および/または抗菌剤を含むことを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項31

請求項1に記載の前記タンパク質は、最終組成物内に、0.2−400μg/mlの範囲の量で存在することを特徴とする請求項26に記載の方法。

請求項32

免疫刺激剤をさらに含むことを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項33

ブタにおける別の病原体に対する少なくとも1つの別の免疫学的活性成分をさらに含むことを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項34

前記別の病原体は、アクチノバチルス・プルロニューモニア、アデノウイルス、アルファウイルス(例えば東部ウマ脳炎ウイルス)、気管支敗血症菌、ブラキスピラ属(好ましくは、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピオシコリ)、ブタ流産菌(好ましくは、生物型1、2、および3)、ブタコレラウイルス、クロストリジウム属(好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンスA、BおよびC型、クロストリジウム・ノーヴィ、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・テタニ)、コロナウイルス(好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス)、エペリスロゾーノシス・スイス、エリシペロスリクス・ルシオパシエ、大腸菌、ヘモフィルス・パラスイス(好ましくは、亜型1、7、および14)、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ローソニア・イントラセルラリス、レプトスピラ属(好ましくは、レプトスピラ・アウストラリス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリッポチフォサ、レプトスピラ・イクテロヘモラジカエ、プトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・タラソビ)、マイコバクテリウム属(好ましくは、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・ボビス)、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、ブタサイトメガロウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ロタウイルス、サルモネラ属(好ましくは、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・コレラスイス)、スタフィロコッカス・ヒイクス、スタフィロコッカス属(好ましくはストレプトコッカス属、好ましくはストレプトコッカス・スイス)、ブタヘルペスウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、レプトスピラ・ハルジョー、およびマイコプラズマ・ハイオシノビエからなる群より選択されることを特徴とする請求項33に記載の方法。

請求項35

前記免疫学的応答は、ブタサーコウイルス3型感染症重症度の低減、またはブタサーコウイルス3型感染症の臨床兆候発生率の低減を含むことを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項36

前記投与される組成物は、該組成物が単回投与された動物において、免疫学的応答を誘導するのに有効であることを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項37

前記投与される組成物は、全身投与されることを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項38

請求項17に記載の前記キメラDNA分子によりコードされるタンパク質と、溶媒、分散媒、被覆剤、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤からなる群より選択される獣医学的に許容される担体と、を含む組成物。

請求項39

前記タンパク質の一部は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有するブタサーコウイルス3型DNAによりコードされることを特徴とする請求項38に記載の組成物。

請求項40

前記ブタサーコウイルス3型DNAは、配列番号4、配列番号6、配列番号8、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列に対して少なくとも90%の配列相同性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする請求項39に記載の組成物。

請求項41

前記獣医学的に許容される担体は、安定剤および/または防腐剤および/または抗菌剤を含むことを特徴とする請求項38に記載の組成物。

請求項42

前記タンパク質は、最終組成物内に、0.2−400μg/mlの範囲の量で存在することを特徴とする請求項38に記載の組成物。

請求項43

免疫刺激剤をさらに含むことを特徴とする請求項38に記載の組成物。

請求項44

ブタにおける別の病原体に対する少なくとも1つの別の免疫学的活性成分をさらに含むことを特徴とする請求項38に記載の組成物。

請求項45

前記別の病原体は、アクチノバチルス・プルロニューモニア、アデノウイルス、アルファウイルス(例えば東部ウマ脳炎ウイルス)、気管支敗血症菌、ブラキスピラ属(好ましくは、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピオシコリ)、ブタ流産菌(好ましくは、生物型1、2、および3)、ブタコレラウイルス、クロストリジウム属(好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンスA、BおよびC型、クロストリジウム・ノーヴィ、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・テタニ)、コロナウイルス(好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス)、エペリスロゾーノシス・スイス、エリシペロスリクス・ルシオパシエ、大腸菌、ヘモフィルス・パラスイス(好ましくは、亜型1、7、および14)、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ローソニア・イントラセルラリス、レプトスピラ属(好ましくは、レプトスピラ・アウストラリス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリッポチフォサ、レプトスピラ・イクテロヘモラジカエ、プトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・タラソビ)、マイコバクテリウム属(好ましくは、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・ボビス)、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、ブタサイトメガロウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ロタウイルス、サルモネラ属(好ましくは、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・コレラスイス)、スタフィロコッカス・ヒイクス、スタフィロコッカス属(好ましくはストレプトコッカス属、好ましくはストレプトコッカス・スイス)、ブタヘルペスウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、レプトスピラ・ハルジョー、およびマイコプラズマ・ハイオシノビエからなる群より選択されることを特徴とする請求項44に記載の組成物。

技術分野

0001

(関連出願)
本出願は、2015年10月16日出願の米国特許仮出願第62/242、866号に基づく優先権を主張するものである。上記仮出願の開示内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

0002

配列表
本出願は、書面形式またはコンピュータ読み取り可能な形式の配列表を含み、その教示および内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術

0003

ブタサーコウイルス2型(PCV2)は、1990年代中盤カナダで、離乳後多臓器消耗症候群(PMWS)に罹患したブタにおいて、初めて散発的に確認された。PCV2に関連する重度全身性疾患流行病は、その後、アメリカヨーロッパ、およびアジアで確認された。市販ワクチンの広範な使用により、PMWS、肺炎豚皮膚炎腎症症候群(PDNS)、および生殖障害を含むPCV2関連疾患(PCVAD)は効果的に抑制された。後ろ向き調査により、PCV2は、臨床疾患が広範囲に広まる前に、ブタの間で何十年も気付かれずに広まることが実証された。PCV2aからPCV2bへの顕性遺伝子の遺伝子型シフトは、PCVADの重度に対応すると思われる。近年、ブタサーコウイルス3型(PCV3)と呼ばれる新種サーコウイルスが、通常はPCV2感染症に関連する臨床症状を有する雌ブタおよび流産胎児から確認された。

課題を解決するための手段

0004

慢性的繁殖行動低下を有し、PDNSに一致する臨床症状で急死した、飼育場由来の4匹の雌ブタから組織採集した。雌ブタの組織の病理学検査により、出血および白血球血管周囲への蓄積に関連する真皮および表皮急性壊死による紫色の皮膚病変が指摘された。腎臓は、間質および糸球体内のリンパ球およびマクロファージクラスターによる尿細管拡張、および尿細管上皮細胞における軽度異形成を示した。肉眼的および顕微鏡的な病変は一般的にPCV2感染症を伴って見られるにも関わらず、免疫組織学的および定量的PCR(qPCR)は、PCV2だけでなくブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスPRRSV)およびインフルエンザAウイルス(IAV)に対しても陰性であった。同時に、同じ飼育場由来の同様の皮膚病変を有する流産した雌ブタから、ミイラ化胎児採取した。同様に、qPCRは、PCV2だけでなくブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)およびブタパルボウイルス(PPV)に対しても陰性であった。

0005

組織ホモジネートプールを3つのミイラから調製し、上述したように、ウイルスメタゲノムシーケンシングを行った。採集した989、478個のリードのうちの926、380個のリードを参照イノシシ(Sus scrofa)ゲノムに対してマッピングした。アッセンブル化されていないリードのde novoアセンブリにより、27個のコンティグが得られた。1246bpコンティグにマッピングされたリードの過半数(54%)は、BLAST分析によれば、メタゲノムシーケンシングによって市販のブタ肉において検出されたサーコウイルス部分ゲノムに対して98%の類似性を示した。残りのリードは、既知真核生物ウイルスに対して類似性を示さなかった。次に、ミイラプールDNAに対してローリングサークル増幅を実施し、その後、XhoI部位とオーバーラップするプライマーを使用して逆PCRを実施した。アガロースゲル電気泳動により、約2kbの単一のバンドが確認された。2000bpゲノム(配列番号1)が、全ゲノムにわたるオーバーラップ・アンプリコンサンガー・シーケンシングにより決定された。

0006

遺伝子解析により、BLASTN分析によればサーコウイルスPorkNW2/USA/2009(受入番号ADU77001、221、aa)の部分レプリカーゼ(rep)タンパク質に対して96%の同一性を示し、中国のコウモリサーコウイルス由来の293アミノ酸(aa)repタンパク質(受入番号AIF76248)に対して54%の同一性を示す予測296アミノ酸タンパク質(配列番号4)をコードするオープンリーディングフレーム(ORF1:配列番号3)が確認された。保存ウイルスrepおよびヘリカーゼドメインが、それぞれ、配列番号1のアミノ酸9−93および162−251から確認された。PorkNW2/USA/2009と同様に、適切な開始コドンは確認されず、上流ATGに由来する別のGTC開始コドンまたはスプライシング提示された。逆方向の第2のORF(ORF2:配列番号5)は、PorkNW2/USA/2009の部分カプシド(cap)配列(110aa)に対して87%の同一性を示し、PCV2およびアヒルサーコウイルス(それぞれ、233および257aa)のカプシドに対して36−37%の同一性を示す予測214アミノ酸タンパク質(配列番号6)をコードする。他のサーコウイルスcapタンパク質と同様に、N末端は、約32aaの長さの非常にアルギニンリッチな領域から構成される。予測233aaタンパク質をコードする第3のORF(ORF3:配列番号7)は、牛ひき肉から検出された部分サーコウイルスゲノムにおいて確認されたものに対して94%の同一性を有し、機能不明のネズミヘルペスウイルスタンパク質に対して39%の同一性を有する。予測される複製起点は、repをコードするストランドのrepおよびcap間に位置する、PCV1、TAGTATTAC(配列番号15)と同一のループナノマーを有するステムループ構造体を含む。サーコウイルス属のメンバーに対する全般的な遺伝子的および構造的な類似性、およびカプシドaaの他の種に対する70%未満の同一性を考慮して、本明細書では、この種をブタサーコウイルス3(PCV3)と称する。

0007

ClustalWによりアライメントされた配列を用いて、MEGAにおいて系統解析を実施した。系統は、最適LGを、500個のブートストラップ複製により確認された樹形を有するガンマ分布モデルと共に使用する最尤法を用いて推定した(図2)。アミノ酸の変化数を表すスケールが示されている。遺伝子銀行の受入番号が、カッコ内に示されておる。図2において、CaCVはカナリアサーコウイルスであり、GuCVはカモメサーコウイルスであり、FiCVはフィンチ(finch)サーコウイルスであり、StCVはムクドリサーコウイルスであり、PiCVはハトサーコウイルスであり、BFDはくちばし羽毛病ウイルスであり、DuCVはアヒルサーコウイルスであり、GoCVはガチョウサーコウイルスであり、SwCVはハクチョウサーコウイルスであり、BtCVはコウモリサーコウイルスであり、PCV1はブタサーコウイルス1型であり、PCV2はブタサーコウイルス2型である。図示のように、PCV3は、PorkNW2/USA/2009と共にクラスター(集団)を構成しており、これらは、中国のコウモリサーコウイルスに最も密接に関係する。興味深いことに、PCV1およびPCV2もまた、ミャンマーの別のコウモリコウイルスに進化的に関係する。

0008

3つの個別のミイラに由来する組織ホモジネートと、PDNSで死んだ4匹の雌ブタに由来する肺ホモジネートを、PCV3rep遺伝子を標的とするqPCR分析法を用いて分析した。ミイラは全て陽性であり、サイクル閾値Ct値)は16.7−21.3であった。4匹の雌ブタのうちの3匹もまた陽性であり、Ct値は27.7−29.7であった。

0009

PCV3の発生を判定するために、診断検査のために提出された合計で271個のブタのスワブ口腔液、または肺ホモジネートのサンプルを、repおよびcap遺伝子を標的とするマルチプレックスTaqman分析法を用いてスクリーニングした。34個(12.5%)のサンプルは、両分析法に対して陽性であり、Ct値は同様であった。2個のサンプルは、PCV3capを標的とする分析に対してのみ陽性であった。陽性サンプルのCt値は、20.3−35.8であった。

0010

配列番号1のアミノ酸35−214を包含するペプチドは、大腸菌におけるN末端6xヒスチジン融合タンパク質として発現し、親和クロマトグラフィにより精製した。変性電気泳動は、PCV2に見られるのと同様に、タンパク質が二量体として発現したことを示す。ELISAを、上述したようにして実施した。特定病原体に感染していない集団に由来する3週齢のブタから採取した18個の血清サンプル陰性対照として使用し、平均光学密度は4.9とした。陽性についてのカットオフは、平均値よりも大きい3つの標準偏差に設定した(OD>0.87)。同一の飼育場由来の10匹の2回以上出産した雌ブタから採取した血清サンプルは全て陽性であり、平均ODは1.2であった。雌ブタ飼育場に補充動物を供給する未経産ブタ飼育場由来の雌ブタから採取した27個の血清サンプルも試験し、そのうちの17個(63%)が陽性であった。そして、複数の州から診断検査のために提出された83個の血清サンプル(動物の週齢は不明)のうちの46個(55%)は陽性であった。

図面の簡単な説明

0011

以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本開示のいくつかの態様をさらに示すために含められる。本開示は、本明細書中に提示される特定の実施形態と組み合わせて、1以上のこれらの図面を参照することにより、より良く理解できるであろう。

0012

ブタサーコウイルス3型のゲノム構成
サーコウイルスレプリカーゼタンパク質の系統樹

0013

本明細書中では、配列番号1は、PCV3ゲノムのヌクレオチド配列であり、配列番号2は、PCV3ゲノムのアミノ酸配列であり、配列番号3は、PCV3のレプリカーゼ(ORF1)のヌクレオチド配列であり、配列番号4は、PCV3のレプリカーゼ(ORF1)のアミノ酸配列であり、配列番号5は、PCV3のカプシド(ORF2)のヌクレオチド配列であり、配列番号6は、PCV3のカプシド(ORF2)のアミノ酸配列であり、配列番号7は、PCV3のORF3のヌクレオチド配列であり、配列番号8は、PCV3のORF3のアミノ酸配列であり、配列番号9は、プライマー1PCV3レプリカーゼのヌクレオチド配列であり、配列番号10は、プライマー2PCV3レプリカーゼのヌクレオチド配列であり、配列番号11は、プローブPCV3レプリカーゼのヌクレオチド配列であり、配列番号12は、プライマー1PCV3カプシドのヌクレオチド配列であり、配列番号13は、プライマー2PCV3カプシドのヌクレオチド配列であり、配列番号14は、プローブPCV3カプシドのヌクレオチド配列であり、配列番号15は、ループナノマーを有するステムループ構造を含む複製起点であり、配列番号16は、内在性cap遺伝子プライマーであり、配列番号17は、内在性cap遺伝子プライマーであり、配列番号18は、PCV3遺伝子におけるアミノ酸(aa)をコードする部分のためのプライマーであり、配列番号19は、PCV3遺伝子におけるアミノ酸(aa)をコードする部分のためのプライマーである。

実施例

0014

以下の詳細な説明および例は、本開示にしたがって用いられる好ましい材料および手順を示す。しかしながら、これらの例は説明目的でのみ提示したものであり、本開示の全体範囲を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。

0015

免疫原性組成物、その製造方法、およびその使用方法

0016

本開示の一態様は、組換えPCV3 ORF2タンパク質を製造および/または回収する方法であって、(1)培地中の多数の感受性細胞を、PCV3タンパク質をコードする組換えウイルスベクターに感染させるステップと、(2)組換えウイルスベクターによってPCV3タンパク質を発現させるステップと、(3)PCV3タンパク質を回収するステップと、(4)発現したPCV3タンパク質から細胞片を分離するステップと、を含む方法を提供する。

0017

本開示の別の態様では、免疫原性または免疫学的組成物においてワクチンとして使用されるPCV3タンパク質を回収する前にウイルスベクター不活性化するために、不活性化ステップを含むこと好ましい。不活性化ステップは、ステップ(5)として、上記のステップ(1)−(4)に加えて実施することができる。

0018

いくつかの形態では、不活性化ステップは、フィルタまたは分離ステップ直前または直後のいずれかに実施される。本開示の目的のために、任意の従来の不活性化方法を用いることができる。したがって、不活性化は、化学的および/または物理的処理によって実施することができる。或る代表的な不活性化方法は、環化バイナリーエチレンイミンBEI)の添加を含む。

0019

任意選択で、上述した本方法はまた、上記のステップ(5)の後に、中和ステップを含む。例えば、不活性化剤がBEIである場合には、チオ硫酸ナトリウム当量まで添加することが好ましい。好ましくは、チオ硫酸ナトリウムは、不活性化のために添加されたBEIに対する当量で添加される。

0020

「免疫原性または免疫学的組成物」は、対象の組成物またはワクチンに対する細胞性および/または抗体媒介免疫応答免疫学的応答をホストにおいて誘起する少なくとも1つの抗原を含む組成物を指す。通常、「免疫学的応答」は、これに限定しないが、とりわけ、対象の組成物またはワクチンに含まれる抗原に対して特異的に誘導される、抗体、B細胞ヘルパーT細胞サプレッサーT細胞、および/または細胞傷害性T細胞、および/またはydT細胞の産生または活性化のうちの1以上を含む。好ましくは、ホストは、治療的または予防的な免疫学的応答のいずれかを示し、この結果、新規の感染症に対する抵抗力強化され、および/またはその疾患の臨床的重症度が低減されるであろう。このような予防は、感染したホストが通常示す症状の重症度または罹患率の低減、さらには該症状の欠如、迅速な回復期間、および/またはウイルス力価の減少によって示されるであろう。

0021

好ましい形態、とりわけ、ワクチンなどの免疫原性組成物において組換えPCV3タンパク質を使用する形態では、採取されたPCV3タンパク質の各ロットまたは選択されたロットだけが、不活性について検査される。したがって、本開示のさらなる態様は、組換えウイルスベクターの不活性化の有効性を判定するための不活性化検査方法であって、(1)組換えウイルスベクターを含有する培養液の少なくとも一部を不活性化剤に接触させるステップと、(2)不活性化剤を中和するために中和剤を添加するステップと、(3)残存感染力を判定するステップと、を含む方法に関する。

0022

好ましい形態では、PCV3 DNAを含有し、細胞を感染させるのに使用されるPCV3タンパク質を発現する組換えウイルスベクターは、クローニングされたPCV3遺伝子を有しているトランスファーベクターをウイルスベクター内にトランスフェクトすることによりが生成される。好ましくは、トランスファーベクターにおける所望のPCV3 DNA(例えば、ORF1、ORF2、またはORF3をコードするDNA)を含む部分だけをウイルスベクター内にトランスフェクトする。

0023

「ウイルスベクター内にトランスフェクトされる」は、異種DNAをウイルスベクター(例えばバキュロウイルスベクター)内に「導入する」または「クローニング」することを意味し、かつ同義語として使用される。「トランスファーベクター」は、少なくとも1つの複製起点と、異種遺伝子(本発明ではPCV3 DNA)と、異種遺伝子をウイルスベクター内にクローニングすることを可能にするDNA配列とを含むDNA分子を意味する。好ましくは、異種遺伝子をウイルスベクター内にクローニングすることを可能にするDNA配列は、異種遺伝子に隣接(フランキング)している。より好ましくは、これらのフランキング配列は、ウイルスベクターの配列に対して少なくとも部分的に相同性を有する。この配列相同性により、異種遺伝子を含む組換えウイルスベクターを生成するための両分子(ウイルスベクターおよびトランスファーベクター)の組換えが可能となる。

0024

より好ましい形態では、本開示の方法は、PCV3 DNAの分離から開始される。任意のPCV3遺伝子を、本開示の目的のために使用することができる。PCV3遺伝子は、好ましくは、PCR法を用いて増幅される。この結果、DNDは、トランスファーベクター内にクローニングされる。

0025

したがって、本開示の一態様では、PCV3 DNAを含有する組換えウイルスベクターを構築する方法が提供される。この方法は、概して、(1)少なくとも1つの組換えPCV3遺伝子をトランスファーベクター内にクローニングするステップと、(2)トランスファーベクターにおける組換えPCV3遺伝子を含有している部分をウイルスベクター内にトランスフェクトして組換えウイルスベクターを生成するステップと、を含む。上述したように、PCV3遺伝は、ORF1、ORF2、またはORF3をコードすることができる。

0026

さらなる態様によれば、PCV3 DNAは、上記のステップ(1)の前に、インビトロで増幅させ、かつPCV3 DNAのフランキング配列を改変することができる。PCV3 DNAを増幅させ、フランキング配列を改変し、インビトロで増幅されたPCV3 DNAをトランスファーベクターおよび適切なトランスファーベクター内にクローニングするインビトロ方法は、上述したか、または当業者に既知である。したがって、さらなる態様では、本開示は、PCV3 DNAを含有し、所望のPCV3タンパク質を発現する組換えウイルスベクターを構築する方法であって、(1)PCV3 DNAをインビトロで増幅させ、かつPCV3 DNAのフランキング配列を改変するステップと、(2)増幅させたPCV3 ORF2 DNAをトランスファーベクター内にクローニングするステップと、(3)トランスファーベクターまたは該ベクターにおける組換えPCV3 DNAを含有している部分をウイルスベクター内にトランスフェクトして組換えウイルスベクターを生成するステップと、を含む方法に関する。いくつかの態様では、PCV3 DNAのフランキング配列の改変は、5´コザック配列および/またはEcoR1部位を導入することにより実施される。

0027

本開示のさらなる態様は、PCV3タンパク質と不活性化されたウイルスベクターとを含む組成物の製造方法に関する。この方法は、概して、(1)増幅されたPCV3 DNAをトランスファーベクター内にクローニングするステップと、(2)トランスファーベクターにおける組換えPCV3 DNAを含有している部分をウイルス内にトランスフェクトするステップと、(3)培地中の細胞をトランスファーベクターに感染させるステップと、(4)トランスフェクトされたウイルスベクターにPCV3 DNA由来の組換えタンパク質を発現させるステップと、(5)上清から細胞を分離するステップと、(6)発現したPCV3タンパク質を回収するステップと、(7)組換えウイルスベクターを不活性化させるステップと、を含む。好ましい形態では、上述したように、上記のステップ(7)の後に、中和ステップ(8)が実施される。当然ながら、上述したように、上記のステップ(1)の前に、PCV3 DNAは、好ましくはPCV3 DNAのフランキング配列と共に、インビトロで増幅させることができる。

0028

本開示の別の態様では、PCV3に対する免疫応答を誘起するための組成物、好ましくはワクチンなどの免疫原性組成物の製造方法が提供される。概して、この方法は、(1)PCV3のORF由来の組換えDNAを含む構築物をウイルスにトランスフェクトするステップと、(2)増殖培地中の細胞をトランスフェクトされたウイルスに感染させるステップと、(3)ウイルスに、PCV3由来の組換えORFタンパク質を発現させるステップと、(4)発現した組換えORFタンパク質を回収するステップと、(5)回収したタンパク質を適切なアジュバントおよび/または他の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって組成物を製造するステップと、を含む。いくつかの好ましい形態では、本組成物はまた、PCV3 ORFタンパク質を発現するウイルスベクターの少なくとも一部、および/または培養上清の一部を含む。

0029

本明細書で使用するとき、「アジュバント(補助剤)」は、水酸化アルミニウムリン酸アルミニウムサボニン、例えば、Quil A、QS−21(マサチューセッツケンブリッジ、ケンブリッジ・バイオテック社(Cambridge Biotech Inc.)製)、GPI−0100(アラバマ州バーミンガム、ガレニカ・ファーマシューティカルズ社(Galenica Pharmaceuticals, Inc.)製)、油中水型エマルジョン水中油型エマルジョン水中油中水エマルジョンを含むことができる。エマルジョンは、特に、軽質液状パラフィン油(欧州薬局方式);イソプレノイド油、例えば、アルケン、とりわけイソブテンまたはデセンオリゴマー化により得られるスクアランまたはスクアレンなど;直鎖アルキル基を含有する酸またはアルコールエステル、より具体的には、植物油オレイン酸エチルプロピレングリコールジ(カプリラート/カプラート)、グリセリルトリ(カプリラート/カプラート)、またはプロピレングリコールジオレアート;分枝鎖脂肪酸またはアルコールのエステル、とりわけイソステアリン酸エステル、に基づくことができる。油を乳化剤と組み合わせて使用することにより、エマルジョンが形成される。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、とりわけ、ソルビタンマンニド(例えばアンヒドロマンニトールオレアート)、グリコールポリグリセロール、プロピレングリコール、オレイン酸イソステアリン酸リシノール酸、またはヒドロキシステアリン酸(これらは任意選択でエトキシル化されている)とのエステル、並びに、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンコポリマーブロック、とりわけプルロニック社の製品、特にL121である。「Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)」を参照されたい。

0030

例えば、「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995」の147ページに記載されているSPTエマルジョンおよび同書の183ページに記載されているエマルジョンMF59を使用可能である。

0031

アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸ポリマー、あるいは、無水マレイン酸およびアルケニル誘導体コポリマーから選択される化合物である。好適なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールポリアルケニルエーテル架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーと呼ばれている(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996)。当業者であれば、少なくとも3個、好ましくは8個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも3個のヒドロキシル基の水素原子が、少なくとも2個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカル置換されたポリヒドロキシル化化合物で架橋されたアクリルポリマーが記載されている米国特許第2,909,462号明細書も参照することができる。好ましいラジカルは、2ないし4個の炭素原子を含有するラジカルであり、例えば。ビニルアリル、および他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体が、他の置換基、例えばメチルを含有することができる。カルボポル(米国オハイオ州、BFグッドリッチ(BF Goodrich)社製)という名称販売されている製品が特に好適である。カルボポルは、アリルスクロースまたはアリルペンエリスリトールで架橋されている。それらの中では、カルボポル974P、934Pおよび971Pが好適である。無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のコポリマーの中では、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマーであるコポリマーEMA(モンサント(Monsanto)社製)も好適である。これらのポリマーを水に溶解させると酸性液が生じるが、その酸性液は、アジュバント溶液に免疫原性、免疫学的、またはワクチン組成物を組み込むために、生理学的なpHに中和することが好ましい。

0032

さらなる適切なアジュバントは、これに限定しないが、とりわけ、RIBIアジュバントシステム(リビ(Ribi)社製)、ブロックコポリマージョージア州アトランタ、サイトレックス(SytRx)社製)、SAF−M(カリフォルニアエメリービルシロン(Chiron)社製)、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質−アミンアジュバント大腸菌由来熱不安定性エンテロトキシン組換え型または他のもの)、コレラ毒素IMS 1314、またはムラミルジペプチドを含む。

0033

好ましくは、アジュバントは、1用量当たり約100μg−約10mgの量で添加される。より好ましくは、アジュバントは、1用量当たり約100μg−約10mgの量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは、1用量当たり約500μg−約5mgの量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは、1用量当たり約750μg−約2.5mgの量で添加される。最も好ましくは、アジュバントは、1用量当たり約1mgの量で添加される。

0034

本開示の別の態様では、PCV3に対する免疫応答を誘起するための、例えばワクチンなどの免疫原性組成物を製造する方法は、(1)PCV3 ORFを発現させ、発現したPCV3 ORFを回収するステップと、(2)回収したタンパク質を適切なアジュバントと混合するステップと、を含む。好ましくは、上記のステップ(1)は、PCV3タンパク質の製造および回収について説明したステップを含む。この方法における別の任意選択のステップは、増幅させたPCV3 ORF DNAを第1のベクター内にクローニングするステップと、この第1のベクターからORF DNAを切除するステップと、この切除したPCV3 ORF DNAを、トランスファーベクター内にクローニングするのに使用するステップと、を含む。好ましくは、この方法の上記の回収ステップはまた、細胞および細胞片から培地を分離するステップを含む。このことは、任意の従来の方法を用いて実施することができる。好ましい一方法は、細胞、細胞片、および増殖培地を、約0.45−1.0μMの範囲のサイズの孔を有するフィルタを用いてフィルタリングするステップを含む。この態様では、最終的に、回収した組換えPCV3ORFタンパク質を組成物中に組み合わせるステップの前に、ウイルスを不活性化させるステップを含むことが好ましい。不活性化ステップを含む場合、上述したように、中和ステップをさらに含むことが好ましい。

0035

加えて、本発明に係る組成物は、1以上の薬学的に許容される担体または獣医学的に許容される担体を含むことができる。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」または「獣医学的に許容される担体」は、溶媒分散媒被覆剤、安定剤、希釈剤防腐剤抗菌剤抗真菌剤等張剤、または吸収遅延剤のいずれかまたは全てを含む。好ましい一形態では、本発明に係る組成物は、PCV3 ORF DNAを含有しPCV3ORFタンパク質を発現する組換えウイルスベクターに感染させたインビトロ培養細胞から回収したPCV3 ORFタンパク質を含む。この細胞培養物は、ウイルスベクターを不活性化するように処理されている。この細胞培養物には、当量濃度の中和剤が添加され、また、アジュバントおよび生理食塩水も添加される。他の態様と同様に、PCV3 ORFタンパク質は、ORF1、ORF2、またはORF3を含むことができる。生理食塩水を含む場合、生理食塩水の量は、好ましくは約50ないし90%(v/v)、より好ましくは約60ないし80%(v/v)、さらに好ましくは約70%(v/v)である。任意選択で、本方法はまた、保護剤をさらに含むことができる。本明細書で使用するとき、「保護剤」は、例えばゲンタマイシンメルチオラートなどの抗微生物活性剤を指す。とりわけ、保護剤の添加は、複数回投与組成物の調製において最も好ましい。抗微生物活性剤は、本組成物の微生物汚染からの保護、または本組成物中での微生物の増殖の抑制に有効な濃度で添加される。

0036

本開示の方法はまた、産物の有効期間を延ばすおよび/または維持するために、および/または、安定性を高めるために、例えば、サッカリドトレハロース、マンニトール、サッカロースなどの任意の安定剤の添加を含むことができる。

0037

本開示の別の態様では、上述した方法により得られた産物が提供される。とりわけ、本開示は、組換えで発現したPCV3ORFタンパク質を含む組成物に関する。いくつかの好ましい形態では、本組成物はまた、ウイルスベクターの不活性化に適した物質を含む。このような産物は、免疫応答を誘導する、より好ましくはPCV感染症の臨床兆候に対する予防免疫を付与する免疫原性組成物として有用である。本組成物は、抗原成分として、概して、PCV3のORF1、ORF2、ORF3、またはそれらの任意の組み合わせにより発現されるポリペプチドまたはその断片を含む。当然ながら、本開示に係る免疫原性組成物において使用されるPCV3 ORFポリペプチドは、分離および精製、標準的なタンパク質合成、および組換え方法を含む任意の方法で誘導することができることを理解されたい。

0038

PCV3感染症の臨床兆候は、離乳後の約6−8週齢と、成長期および仕上期の12−14週齢との両方において生じ、他の週齢群においても散発的に生じる。臨床兆候は、胸部腹部大腿部、および前脚における、広範囲の、様々なサイズおよび形状の赤紫色の若干隆起した斑点出現を含む。時間が経つと、斑点は、黒ずんだ外皮で覆われ、その後、傷痕を残して消える。加えて、ブタは、元気がなくなり、高熱を出し、動いたり食事をしたりすることに消極的になり、体重が減少し、苦しそうに息をするかまたは呼吸困難になり、四肢またはまぶたの周り浮腫または浮腫液が見られ、表在リンパ節肥大し、毛深くなり、皮膚が青白くなり、黄疸が発現し、下痢を起こし得る。全体の死亡率は高いとはいえ、皮膚病変を有するブタのほとんどは死亡する。PCV3感染症のさらなる形跡は、および腸に存在する胃潰瘍および出血、腹部に存在する液体扁桃腺脾臓肝臓、および腎臓に見られる病変、すなわち皮膚を通して見える多数の小出血を伴う腫れ、青白さ、まだらとして見ることができる。

0039

いかなるPCV3 ORFも、本開示で使用されるPCV3 ORF DNAおよび/またはポリペプチドのソースとして有効である。好ましい形態では、ORF DNAは、ORF2である。好ましいPCV3 ORF2タンパク質は、配列番号6のものであるが、この配列、並びに、ORF1およびORF3の配列は、配列相同性において最大で10%異なることができ、免疫原性組成物中で有用な抗原性を依然として保持することは、当業者には理解されよう。免疫原性組成物の抗原性は、例えば、チャレンジ実験によって推定することができる。さらに、改変抗原が、配列番号3、5、または7のポリヌクレオチド配列によってコードされるPCV3ORFタンパク質と比べて少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%の予防免疫を付与する場合、改変抗原の抗原性は依然として維持される。いくつかの形態では、PCV3 ORFタンパク質の免疫原性部分が、本組成物の抗原成分として用いられる。本明細書で用いるとき、「免疫原性部分」は、PCV3 ORF2タンパク質および/またはポリヌクレオチドの切断および/または置換型、または断片をそれぞれ指す。好ましくは、このような切断および/または置換型、または断片は、完全長ORFポリペプチドに由来する少なくとも6個の連続アミノ酸を含む。より好ましくは、このような切断もしくは置換型、または断片は、完全長のORFポリペプチドに由来する少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、より好ましくは少なくとも19個の連続アミノ酸を有する。さらに、このような配列は、より大きな断片または切断型の一部であり得ることを理解されたい。好ましくは、このような切断もしくは置換型、または断片は、(例えば、配列番号3、5、または7の)完全長ORFヌクレオチド配列に由来する少なくとも18個の連続ヌクレオチドを含む。より好ましくは、このような切断もしくは置換型、または断片は、完全長のORヌクレオチド配列に由来する少なくとも30個、好ましくは少なくとも45個、より好ましくは少なくとも57個の連続アミノ酸を有する。

0040

当分野で知られている「配列同一性」は、2以上のポリペプチド配列または2以上のポリヌクレオチド配列間、すなわち参照配列とその参照配列と比較される所与の配列との間の関係を指す。配列同一性は、所与の配列および参照配列を最高度の配列類似性(これらの配列のストリング間の一致によって決定される)が得られるように最適にアライメントさせた後に、所与の配列を参照配列と比較することにより決定される。このようなアライメント時に、配列同一性は1つ1つの位置毎に確認される。例えば、特定の位置においてヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合は、その配列はその位置において「同一」である。このような位置同一性を有する位置の総数を参照配列中のヌクレオチドまたは残基の総数で割り算することにより、配列同一性のパーセントが決定される。配列同一性は、これに限定しないが、「Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988)」、「Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)」、「Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)」、「Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)」、「Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)」、および「Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)」に記載された公知の方法を用いて容易に算出することができる(これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる)。配列同一性を決定する好ましい方法は、検査される配列間で最大の一致が得られるように設計される。配列同一性を決定する方法は、所与の配列間の配列同一性を決定することができる公共的入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。このようなプログラムの例は、これに限定しないが、GCプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))を含む(これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる)。BLASTXプログラムは、NCBIおよび他の供給源から公共的に入手可能である(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVINLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、この教示は、参照により本明細書に含まれる)。これらのプログラムは、デフォルトギャップ重み付けを用いて所与の配列と参照配列とを最適にアライメントさせることにより、所与の配列と参照配列との間の最高レベルの配列同一性を得る。例えば、所与のポリヌクレオチドが、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有する場合、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であり、ただし、所与のポリヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチド毎に15まで、好ましくは10まで、より好ましくは5までの点突然変異を含み得ることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでは、参照配列中の15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレオチドで置換し得るか、あるいは、参照配列中のヌクレオチドの総数の15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の5´または3´末端位置、あるいは、これらの末端位置間における、参照配列のヌクレオチド間に個別に散在するか、または参照配列の1以上の連続基内に散在する任意の場所で行われ得る。同様に、所与のポリペプチドが、参照アミノ酸配列に対して少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する場合、所与のポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であり、ただし、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列の100アミノ酸毎に15まで、好ましくは10まで、より好ましくは5までのアミノ酸改変を含み得ることを意味する。換言すれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%の配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るためには、参照配列中の15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までのアミノ酸残基が欠失または別のアミノ酸で置換し得るか、あるいは、参照配列中のアミノ酸残基の総数の15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までの数のアミノ酸が参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置、あるいは、これらの末端位置間における、参照配列の残基間に個別に散在するか、または参照配列の1以上の連続基内に散在する任意の場所で行われ得る。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、保存的置換は、配列同一性を決定するときには一致に含まれない。

0041

本明細書で使用するとき、「配列相同性」は、2つの配列の関連性を判定する方法に関連する。配列相同性を決定するために、2以上の配列が最適にアライメントされ、必要であればギャップが導入される。しかしながら、「配列同一性」とは対照的に、保存的アミノ酸置換は配列相同性を決定するときには一致として数えられる。換言すれば、参照配列に対して95%の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの85%、好ましくは90%、より好ましくは95%が一致するか、または別のアミノ酸もしくはヌクレオチドによる保存的置換を含まなければならない。あるいは、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチド(保存的置換は含まない)の総数の15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までのアミノ酸またはヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。好ましくは、相同配列は、少なくとも50、好ましくは100、より好ましくは250、さらに好ましくは500の一続きのヌクレオチドを含む。

0042

「保存的置換」は、全体的な機能性が著しく変化しないような、サイズ、疎水性などを含む類似の特性または特徴を有する別のアミノ酸残基またはヌクレオチドでのアミノ酸残基またはヌクレオチドの置換を指す。

0043

「単離されている」とは、「人の手によって」その自然状態から変更されたことを意味し、すなわち自然界に存在する場合には元の環境から変更または除去されているかその両方である。例えば、生体内天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ここで用語が採用されているとおり「単離されている」。

0044

本開示のさらなる態様において、PCV3ORFタンパク質を含むPCV3感染に関連する臨床症状の重症度を軽減するのに有効な免疫原性組成物が提供される。好ましくは、PCV3 ORF2タンパク質は、以下のグループから選択される。
1)配列番号4,6,8またはそれらの任意の組み合わせの配列を含むポリペプチド、
2)1)のポリペプチドに対して少なくとも90%相同である任意のポリペプチド、
3)1)および2)またはこれらのいずれか一方のポリペプチドの任意の免疫原性部分、
4)配列番号4,6または8の配列に含まれる少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む3)の免疫原性部分、
5)配列番号3,5または7の配列を含むDNAによってコードされるもの(遺伝コード縮重のため)に相当するポリペプチド、
6)5)のポリヌクレオチドと少なくとも80%相同であるポリヌクレオチドによってコードされる任意のポリペプチド、
7)5)および6)またはこれらのいずれか一方のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの任意の免疫原性部分、
または、
8)前記免疫原性部分をコードするポリヌクレオチドが、配列番号3,5または7の配列に含まれる少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含む、7)の免疫原性部分。

0045

好ましい形態では、これらの免疫原性部分は、配列番号3,5または7の配列によってコードされるPCV3ORFタンパク質の免疫原性特徴を有する。

0046

さらなる態様によれば、PCV3 ORF2タンパク質は、所望の免疫応答を誘導するために有効な抗原封入レベルで、すなわちPCV3感染に起因する臨床兆候の発生率を低下させるかまたはその重症度を低下させるのに有効な免疫組成物中に提供される。好ましくは、PCV3 ORF2タンパク質封入レベルは、最終免疫原性組成物の少なくとも0.2μg抗原/ml、より好ましくは約0.2−約400μg/mlである。

0047

このポリペプチドは、PCV3感染に弱い動物に投与することができる組成物に組み込まれる。好ましい形態では、組成物はまた、当業者に公知の追加の成分を含み得る(Remington's Pharmaceutical Sciencesも参照のこと、1990年、18th ed. Mack Publ.Easton)。

0048

当業者は、本明細書の組成物が既知の注射可能で生理学的に許容される滅菌溶液を組み込むことができることを理解するであろう。非経口注射または点滴のためにすぐに使用できる溶液を調製するために、等張性水溶液、例えば、生理食塩水または対応する血漿タンパク質溶液は容易に入手可能である。さらに、本開示の免疫原性およびワクチン組成物は、希釈剤、等張剤、安定化剤、またはアジュバントを含み得る。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロースエタノールグリセロールおよびその類を含み得る。等張剤は、中でも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含むことができる。安定剤には、中でも、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸アルカリ塩が含まれる。適切なアジュバントは、上記のものである。

0049

さらなる態様によれば、本開示の免疫原性組成物は、薬学的に許容される塩、好ましくは生理学的に許容される濃度のリン酸塩をさらに含む。好ましくは、前記免疫原性組成物のpHは、約6.5−7.5の生理学的pHに調整される。

0050

本明細書に記載の免疫原性組成物は、1つ以上の他の免疫調節剤、例えば、インターロイキンインターフェロン、または他のサイトカインが挙げられる。免疫原性組成物はまた、ゲンタマイシンおよびメルチオレートを含み得る。別の好ましい実施形態において、本開示は、約1μg/ml−約60μg/mlの抗生物質、より好ましくは約30μg/ml未満の抗生物質を含むワクチン組成物を考えている。

0051

本明細書で提供される組換えPCV3ORFタンパク質を含む免疫原性組成物は、PCV3感染に関連する臨床兆候の重症度または発生率をそのような兆候の予防を含むまで低減する上で非常に有効であることが見出される。

0052

本開示の別の態様は、キットに関する。一般にキットは、本明細書で提供されるPCV3ORFタンパク質の免疫原性組成物の少なくとも1用量を含む容器を含み、1用量は少なくとも2μgのPCV3 ORFタンパク質を含む。前記容器は、1−250用量の免疫原性組成物を含むことができる。いくつかの好ましい形態において、容器は、PCV3 ORFタンパク質の免疫原性組成物の1,10,25,50,100,150,200または250用量を含む。好ましくは、複数の用量のPCV3 ORFタンパク質の免疫原性組成物を含む容器のそれぞれは、抗微生物活性剤をさらに含む。これらの薬剤は、例えば、ゲンタマイシンおよびメルチオレートの類の抗生物質である。したがって、本開示の1つの態様は、1用量が少なくとも2μgのPCV3 ORFタンパク質とゲンタマイシンおよびMerthiolateまたはこれらのいずれか一方とを含む、PCV3 ORFタンパク質の免疫原性組成物1−250用量を含む容器に関し、好ましくは約1μg/ml−約60μg/mlの抗生物質、これは、より好ましくは約30μg/ml未満である。好ましい形態では、キットはまた、臨床症状の発生率および重症度またはこれらのいずれか一方を軽減するために、PCV3 ORFタンパク質の免疫原性組成物の少なくとも1用量の動物、好ましくはブタおよび子ブタへの筋肉内投与のための情報を含む、取扱説明書も含むPCV3感染に関連する。その上、さらなる態様によれば、前記使用説明書は、PCV3 ORF2の免疫原性組成物の少なくとも1回の投与の第2回目またはそれ以上の投与の情報を含み、第2回投与またはさらなる投与は、最初のまたは以前の投与から少なくとも14日後である。いくつかの好ましい形態では、前記取扱説明書は免疫刺激剤を投与するための情報も含む。好ましくは、前記免疫刺激剤は少なくとも2回与えられる。好ましくは、少なくとも3日、より好ましくは少なくとも5日、さらにより好ましくは少なくとも7日の間隔が、免疫刺激剤の第1の投与と第2の投与またはそれ以降の投与の間に置かれる。好ましくは、免疫刺激剤は、PCV3 ORFタンパク質の免疫原性組成物の初期投与より少なくとも10日間、好ましくは15日間、さらにより好ましくは20日間、さらにより好ましくは少なくとも22日間与えられる。当業者に知られている任意の免疫刺激剤も使用できることが理解される。本明細書で使用される「免疫刺激剤」は、好ましくは特異的な免疫応答、例えば特定の病原体に対する免疫応答を開始または増加させることなく、一般的な免疫応答を引き起こすことができる任意の作用物質または組成物を意味する。適切な用量で免疫刺激剤を投与することがさらに指示される。キットはまた、免疫刺激剤の少なくとも1つの用量を含む第2の容器を含むことができる。

0053

本開示のさらなる態様は、本明細書に提供されるPCV3 ORFの免疫原性組成物および使用説明書を含み、使用説明書は、PCV3 ORF免疫原性組成物を一緒に投与するための情報をさらに含む。別のブタ病原体に関連する臨床兆候の重症度または発生率を低下させるのに有効なさらなる抗原を含む免疫原性組成物と同じ時間で投与される。好ましくは、このマニュアルは、PCV3 ORF含有組成物およびさらなる抗原を含む免疫原性組成物が投与される時期に関する情報を含むことが好ましい。

0054

さらなる態様は、医薬として、好ましくは獣医薬として、より好ましくはワクチンとして、本明細書で提供される組成物のいずれかの使用に関する。さらに、本開示はまた、PCV3感染に関連する臨床症状の重症度を軽減するための医薬品の調製のための、本明細書に記載の組成物のいずれかの使用に関する。好ましくは、該薬剤は、ブタ、さらに好ましくは子ブタにおけるPCV3感染の予防用である。

0055

さらなる態様は、以下の、(1)被験体におけるPCV3による感染または再感染の予防または(2)被験体におけるPCV3によって引き起こされる臨床症状の発生または重症度の軽減または排除のための方法であって、免疫原性組成物のそれを必要とする対象に投与することを含む。好ましくは、対象はブタである。この減少は、本開示の組成物の投与を受けていない被験体と比較したものであることが理解される。好ましくは、1用量または2用量の免疫原性組成物を投与し、1用量は好ましくは少なくとも約2μgのPCV3ORFタンパク質を含む。さらなる態様は、免疫原性組成物の第2の適用が投与される、上記の治療方法に関する。好ましくは、第2の投与は、同じ免疫原性組成物、好ましくは同量のPCV3 ORFタンパク質を用いて行われる。好ましくは、第2の投与は、最初の投与より少なくとも14日後、さらにより好ましくは最初の投与から少なくとも4週間後に行われる。好ましい形態では、この方法は免疫原性組成物の単回投与後に有効であり、被験体に保護的利益を与えるために第2回またはその後の投与を必要としない。

0056

さらなる態様によれば、本開示は、PCV3感染の発生率または重症度を低下させるのに有効な免疫学的薬剤、およびブタにおける他の病原体に対する少なくとも1種の免疫学的活性成分を含む多価混合ワクチンを提供する。

0057

特に、PCV3感染の発生率を低下させるかまたはその重症度を低下させるのに有効な免疫学的薬剤は、PCV3抗原である。好ましくは、前記PCV3抗原は、本明細書で提供されるPCV3ORFタンパク質、またはPCV3 ORFタンパク質を含む、上記の任意の免疫原性組成物である。PCV3 ORFタンパク質は、ORF1、ORF2、ORF3、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ORF2と組み合わせたORF1、ORF3と組み合わせたORF2、ORF3と組み合わせたORF1、およびORF1,2、および3の組み合わせは、単一の免疫原性組成物において組み合わせることができるPCV3 ORFのそれぞれの可能な組合せである組成。好ましい形態では、ORFはORF2またはORF2を含む組み合わせである。

0058

本明細書で使用する「免疫原性タンパク質」、「免疫原性ポリペプチド」または「免疫原性アミノ酸配列」という用語は、前記免疫原性タンパク質、免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性アミノ酸配列を含む病原体に対する宿主において免疫応答を誘発する任意のアミノ酸配列をいう。本明細書で使用する「免疫原性タンパク質」、「免疫原性ポリペプチド」または「免疫原性アミノ酸配列」は、任意のタンパク質、その類似体、またはその免疫原性断片全長配列を含む。「免疫原性断片」とは、1つまたは複数のエピトープを含み、したがって、関連する病原体に対する免疫学的応答を誘発するタンパク質の断片を意味する。そのような断片は、当技術分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば、Methodsin Molecular Biology、Vol.66(Glenn E.Morris、Ed.、1996)Humana Press、Totowa、New Jersey。例えば、線状エピトープは、例えばタンパク質分子の部分に対応する固体支持体上の多数のペプチドを同時に合成し、ペプチドが抗体と反応している間にペプチドが支持体に付着したままで測定することができる。そのような技術は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第4,708,871号;Geysen et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998−4002;Geysen et al.(1986)Molec.Immunol.23:709−715.同様に、立体配座エピトープは、例えば、X線結晶学および2次元核磁気共鳴などのアミノ酸の空間的立体配座決定方法によって容易に同定される。例えば、上記のエピトープマッピングプロトコールを参照されたい。合成抗原、例えばポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原も定義に含まれる。例えば、Bergmann et al.(1993)Eur.J.Immunol.23:2777−2781;Bergmann et al.(1996)、J.Immunol.157:3242−3249;Suhrbier、A.(1997)、Immunol、およびCell Biol.75:402−408;Gardnerら(1998)、第12回世界エイズ会議ジュネーブ、スイス、1998年6月28日〜7月3日。

0059

好ましくは、ブタにおける他の病原体は、アクチノバチルスプルニューモニアアデノウイルスアルファウイルス(例えば東部ウマ脳炎ウイルス)、気管支敗血症菌ブラキスピラ属(好ましくは、ブラキスピラヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピオシコリ)、ブタ流産菌(好ましくは、生物型1、2、および3)、ブタコレラウイルス、クロストリジウム属(好ましくは、クロストリジウムディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンスA、BおよびC型、クロストリジウム・ノーヴィ、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・テタニ)、コロナウイルス(好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス)、エペリスロゾーノシス・スイス、エリシペロスリクスルシオパシエ、大腸菌、ヘモフィルスパラスイス(好ましくは、亜型1、7、および14)、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルスローソニアイントラセルラリスレプトスピラ属(好ましくは、レプトスピラ・アウストラリス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリッポチフォサ、レプトスピラ・イクテロヘモラジカエ、プトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・ポモナ、およびレプトスピラ・タラソビ)、マイコバクテリウム属(好ましくは、マイコバクテリウムアビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・ボビス)、マイコプラズマハイオニューモニエパスツレラマルトシダブタサイトメガロウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ウイルス、仮性狂犬病ウイルスロタウイルスサルモネラ属(好ましくは、サルモネラティフィムリウム、サルモネラ・コレラスイス)、スタフィロコッカス・ヒイクス、スタフィロコッカス属(好ましくはストレプトコッカス属、好ましくはストレプトコッカス・スイス)、ブタヘルペスウイルス、ブタインフルエンザウイルスブタポックスウイルス水疱性口内炎ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、レプトスピラ・ハルジョー、およびマイコプラズマ・ハイオシノビエまたはこれらの少なくともいずれか一つを含む群から選択された病原体である。

0060

本明細書で使用される「免疫学的活性成分」は、前記成分が投与される動物において免疫応答を誘導または刺激する成分を意味する。好ましい実施形態によれば、前記免疫応答は前記成分または前記成分を含む微生物に対するものである。さらなる好ましい実施形態によれば、免疫学的活性成分は、弱毒化微生物であり、モディファイ生ウイルス(MLV)、死滅微生物または少なくとも微生物の免疫学的活性部分を含む。

0061

本明細書で使用される「微生物の免疫学的活性部分」は、前記成分が投与される動物において免疫応答を誘導または刺激する少なくとも1つの抗原を含む微生物のタンパク質、糖および糖タンパク質またはこれらの少なくともこれらのいずれかを含むことを意味する。好ましい実施形態によれば、前記免疫応答は、微生物の前記免疫学的活性部分または前記免疫学的活性部分を含む微生物に向けられる。

0062

本開示の別の態様において、ブタサーコウイルス(PCV3)の感染性キメラDNAクローンおよびワクチンとして有用なDNAクローンに由来する生キメラウイルスが提供される。新しい生きたキメラ、遺伝的に無毒なウイルスは、病原性PCV3の免疫原性遺伝子が、典型的には対応する同じ位置にあるPCV1の遺伝子を置換する非病原性PCV1ゲノム構造から作製される。本開示は、本明細書に記載の新規組換え核酸分子を含む生物学的機能プラスミド、ウイルスベクターの類で、DNAおよび免疫原性ポリペプチド発現産物を含むベクターによってトランスフェクトされた適切な宿主細胞を包含する。本開示の範囲に含まれるものには、上記のブタの防御またはウイルス感染または上記の臨床兆候に対する防御効果を提供する新規な方法および離乳後多全身系消耗症候群ウイルス(PMWS)に関してであり、肺炎、生殖不全、およびブタ皮膚炎およびPCV3によって引き起こされる腎症症候群(PDNS)であり、そのような防御を必要とするブタに、免疫学的に有効な量の、例えば、プラスミド中のクローン化キメラDNA、キメラDNAクローンに由来するキメラウイルス、本明細書に記載のDNAから発現されたポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本開示の別の態様は、PCV3免疫原性カプシド遺伝子およびタンパク質の新規突然変異体、ならびにキメラクローンにおける突然変異の導入によって細胞培養物の増殖を促進し、ワクチンの安全性を確保することを目的とする。さらに別の態様では、本開示は、新規の非病原性ウイルスワクチンを取得または同定する実験モデルとして有用な、新規な感染性PCV3分子DNAおよびPCVの相互キメラDNAクローンを提供する。

0063

本開示の一態様によれば、ブタサーコウイルス(PCV)の感染性分子およびキメラ核酸分子、ウイルス感染、肺炎、生殖不全、PMWSからブタを防御するためのキメラ核酸分子および獣医学的ワクチンから製造された生キメラウイルス、およびPCV3に起因するPDNSまたはこれらのいずれか一方が提供される。本開示はさらに、ワクチンとして使用され得る免疫原性ポリペプチド発現産物を提供する。新規の非病原性の感染性キメラDNA分子のPCV(PCV1−3)は、感染性の非病原性PCV1をコードする核酸分子を含み、それはPCV1遺伝子におけるORF遺伝子の代わりに病原性PCV3の免疫原性オープンリーディングフレーム(ORF)遺伝子を含む。感染性キメラPCV1−3 DNAクローンは、好ましくは、感染性非病原性PCV1 DNAクローンのゲノム骨格にクローン化されたPCV3 DNAの免疫原性カプシド遺伝子(ORF2)を含む。一般に、PCV3 DNAのカプシド遺伝子は、非病原性PCV1ゲノム構造中のPCV1 DNAのORF2遺伝子を置換するが、他の非病原性または弱毒化キメラDNAクローンを得るために遺伝子工学によって多様な位置置換を構築することができると考えられている。本開示のキメラPCV1−3クローンを分析制御するものとして、PCV1とPCV3との間の相互性があるキメラ感染性PCV3−1 DNAクローンが開示されており、かつそれは、PCV3のカプシド遺伝子を病原性PCV3の骨格中のPCV1のものに置き換えることによって構築される。実験モデルであることに加えて、相互性のあるキメラPCV3−1 DNAクローンは、特別に誂えられたワクチンを作製する際に使用され得る。

0064

他の形態では、PCV3のORF3は、PCV1−3またはPCV3−1感染クローンのORF2またはORF3の代わりに用いることができる。さらに他の好ましい形態では、PCV3のORF1およびORF3は、PCV1−3またはPCV3−1感染クローンのPCV3のORF2の代わりに用いることができる。

0065

本明細書に記載のPCV3のクローン化されたゲノムDNAは、PK−15細胞にトランスフェクトされ、ブタに与えられた場合、試験管内および生体内で感染性であることが示される。感染性PCV3 DNAクローンは、ブタのPMWSおよびPDNSまたはこれらのいずれか一方に特徴的な病理学的病変を生じ、臨床病態の改善された同定および組織細胞におけるウイルス分布の理解を可能にする。この新しい容易に再現性のある病原体は、ブタのPMWSおよびPDNSまたはこれらのいずれか一方を予防するための適切なワクチン接種プログラムの開発に役立つ

0066

新規キメラPCV1−3 DNAクローンは、PK−15細胞の試験管内トランスフェクションおよびブタへの生体投与の両方によって感染性でもある。トランスフェクトされたPK−15細胞では、1つの好ましいキメラPCV1−3 DNAクローンがPCV3 ORF2カプシド抗原(PCV3の免疫原性カプシドタンパク質)を発現するであろうが、一方、キメラPCV3−1 DNAクローンはPCV1カプシド抗原を発現するであろうが、それは、PCV1またはPCV3カプシド抗原に特異的な抗体を用いた免疫蛍光アッセイ(IFA)によって証明可能である。PCV3特異的抗体へのセロコンバージョンは、感染性PCV3クローンと同様にキメラPCV1−3クローンを接種したブタにおいて検出可能であろう。PCV3特異的抗体へのセロコンバージョンの検出は、キメラPCV1−3 DNAクローンが感染ブタにPCV3特異的抗体を誘導し、その結果、接種ブタをPCV3感染から保護するように作用することを確立するであろう。

0067

驚くべきことには、そして有利には、非病原性PCV1ゲノム骨格にクローン化された病原性PCV3の免疫原性カプシド遺伝子(ORF2)を有するキメラPCV1−3感染性DNAクローンは、病原性PCV3カプシド抗原に対する特異的抗体応答を誘導する一方で、ブタにおいては、PCVIの非病原的性質を保存する。キメラPCV1−3感染性DNAクローンを接種した動物は、PCVI接種動物に似た軽度の感染を発症する一方で、病原性PCV3のORF2カプシドタンパク質に対する抗体にセロコンバージョンする。PCV1およびキメラPCV1−3接種動物で観察されるウイルス血症平均長さは、病原性PCV3接種動物におけるものよりも短くなるであろう。いくつかの接種動物において検出可能なキメラPCV1−3ウイルス血症の欠如は、PCV1−3接種ブタにおけるPCV3 ORF2カプシドタンパク質に対する抗体へのセロコンバージョンに影響しない。この結果は、いくつかの接種動物においてキメラPCV1−3ウイルス血症が短かったり検出不能だったりしても、キメラPCV1−3ウイルスがPCV3 ORF2カプシドタンパク質に対する抗体応答を誘導可能であろうということを示すものであろう。この病原性PCV3免疫原性ORF2カプシドタンパク質に特異的な免疫応答を誘発するが、ブタには非病原性のままであるとするキメラPCV1−3感染性DNAクローンの特別な能力は、キメラPCV1−3クローンを、遺伝子操作された生弱毒化ワクチンおよび他のタイプのワクチンに特に有用とさせる。キメラ核酸分子を含む適切な細胞は、生存している感染性キメラブタサーコウイルスを独自に産生する。いくつかの好ましい形態では、試験管内および生体内トランスフェクションを介してPK−15細胞をトランスフェクトすることによって、生存している感染性キメラウイルスがキメラDNAクローンから生成されるであろう。本開示はさらに、キメラウイルスが相補鎖または少なくとも90%、より好ましくは91,92,93,94,95,96,97,98または99%のキメラヌクレオチド配列に対して高い相同性を有するヌクレオチド配列に由来することを想定している。

0068

本開示の範囲には、生物学的機能性プラスミド、ウイルスベクターの類で、本明細書に記載の新規組換え核酸分子、キメラおよび分子DNAクローンを含むベクターおよび免疫原性ポリペプチド発現産物を含むベクターによってトランスフェクトされた適切な宿主細胞を含むものが含まれる。いくつかの特に好ましい免疫原性タンパク質は、配列番号4,6または8に掲げるアミノ酸配列を有するであろう。その生物学的に活性なバリアントは、本開示にさらに包含される。当業者は、ポリペプチド配列からアミノ酸をどのようにモディファイし、置換し、デリート等させるかを、かつ親配列と同一または実質的に同一の活性を保持する生物学的に活性なバリアントを容易に生成する方法を知っている。

0069

この開示の免疫原性ポリペプチド産物を生成するために、このプロセスは、以下の工程を含む。すなわち、適切な栄養条件下で、本明細書に記載の新規組換え核酸分子でトランスフェクトされた原核または真核宿主細胞を、当技術分野で公知の標準的な方法によって前記核酸分子の発現可能とし、かつ所望のポリペプチド産物を単離することを含む工程である。免疫原性タンパク質は、例えば、生化学的合成の類の他の技術によって用意されてもよいものと考えられる。

0070

本開示の別の実施形態は、PCV3免疫原性カプシド遺伝子およびタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の新規な変異に関する。PCV3はPMWS、PDNS、肺炎および生殖不全の原因物質であるが、PK−15細胞培養由来のブタサーコウイルスI型(PCV1)はブタに非病原性である。突然変異を含むPCV1−3ワクチンは、PCV3毒性のさらなる減弱化のためのブタのワクチン接種時に、続けてされたとするとき、細胞培養下でのルーチンの手順によって細胞培養増殖を促進するか、または、安全性の測定をもっと改善されたものと確実にする組み合わせを選択し、するために、細胞培養においてさらに試験することができる。PCV1−3キメラの利点はその天然の非毒性特性にある一方、PCV1−3キメラを作製するための突然変異PCV3 ORF2の代わりの使用は、本開示の別の実施形態を提供し、それによって、より安全な天然生キメラワクチンが将来利用可能となることが保証されている。

0071

キメラウイルスおよび分子DNAクローンのワクチンおよびそれらを使用する方法も、本開示の範囲内に含まれる。接種されたブタは、PCV3に起因する重大なウイルス感染、肺炎、生殖不全、PDNSおよびPMWSから保護される。ウイルス感染、肺炎、生殖不全、PDNS、またはPMWSに対する防御を必要とするブタを防御する新規な方法は、免疫学的に有効な量の本開示によるワクチンをブタに投与することによるが、それは、例えば、キメラPCV1−3 DNA、クローン化キメラウイルス、PCV1−3のキメラDNAを含むプラスミドまたはウイルスベクター、ポリペプチド発現産物、組換えPCV3 DNAなどの免疫原性量を含むワクチン等である。上記のような他の抗原と免疫刺激剤とをブタに同時に投与して、感染に対する幅広い範囲の保護を提供することができる。そのような同時投与は、別個の投与で提供することができ、または単一投与の複数効果の混合ワクチンにすることもできる。

0072

ワクチンは、例えば、感染性キメラPCV1−3DNA、適切なプラスミドまたはベクター、例えばpSKベクター、非病原性の生キメラウイルス、不活性化キメラウイルスなどにおけるクローン化PCVキメラDNAゲノムと、本明細書に記載のように、生理学的に許容される担体および必要に応じて1つまたは複数のアジュバントとの組み合わせを含む。ワクチンはまた、本明細書に記載の感染性PCV3分子DNAクローンを含み得る。本開示の非病原性生ウイルスワクチンは、毒性状態に復帰するリスクを有する弱毒化生ウイルスまたは十分な抗体免疫応答を誘導しない死滅細胞培養増殖全ウイルスのいずれかを使用する伝統的ウイルス性ワクチンに優る利点を提供する。

0073

生ウイルスワクチンにはいくつかの利点があるが、他のタイプのワクチンを使用して、本明細書に記載の新しいキメラウイルスおよび他の抗原をブタに接種することができる。不活性ウイルスワクチンを提供するために、例えば、感染性DNAクローンからのウイルス増殖は、当該分野で公知の方法または本明細書に記載の方法によって行われる。続いて、当業者に一般的に知られているプロトコルによって、連続的なウイルス不活性化が最適化される。

0074

不活性化ウイルスワクチンは、単離されたウイルスまたはクローニングされたPCVDNA由来のキメラウイルスを、ホルマリンまたは疎水性溶媒、酸などの不活性化剤で、紫外線またはX線照射、加熱による処理によって提供可能である。不活性化は、当技術分野で理解されている方法で行われる。ウイルスは、感染しやすい細胞に感染することができない場合、不活性化されたと考えられる。

0075

病原性クローンから弱毒化ワクチンを提供するために、組織培養が適用され、当技術分野で知られている方法、典型的には、細胞培養物を通した連続継代培養により作製され、生病原性PCV3は最初に弱毒化される(非病原性化または無害化される)。病原性クローンの減弱は、遺伝子欠失またはウイルス産生遺伝子突然変異によっても行うことができる。次いで、弱毒化PCV3ウイルスを使用して、PCV1の非病原性表現型を保持するさらなるキメラPCV1−3ウイルスを構築することができるが、PCV3ゲノムから選択された免疫原性形質の強度が組換え技術によって変化し得る。

0076

本開示はまた、PCV3、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、またはそのホモログまたはその断片のゲノムのヌクレオチド配列を含むワクチン、および許容され得る製薬用または獣医学用の担体に関する。本開示の1つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、そのホモログまたはその断片から選択される。本開示の別の実施形態において、相同体は、配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8と少なくとも90%の配列同一性を有する。さらに別の実施形態では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。

0077

本開示のさらなる態様は、ベクターおよび許容され得る薬学的または獣医学的担体を含むワクチンに関し、ベクターは、配列番号2,4,6,8のようなPCV3のゲノムのヌクレオチド配列またはそれらの任意の組み合わせ、またはホモログもしくはその断片を含む。

0078

本開示はまた、許容され得る薬学的または獣医学的担体を含み、細胞がPCV3のゲノムのヌクレオチド配列、ホモログもしくはその断片で転換されていることを特徴とする、ワクチン免疫原性組成物に関する

0079

またさらに、本開示は、薬学的に許容され得る担体および単一ポリペプチドを含むワクチンまたは免疫原性組成物に関し、単一ポリペプチドは、配列番号2,4,6または8から成ることを特徴とするワクチンまたは免疫原性組成物に関する。

0080

さらに、本開示は、哺乳動物に上記のワクチンまたは免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物をPCV3に対して免疫化する方法に関する。

0081

本開示は、PCV3のゲノムの配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のまたはそれらの断片の1つから選択されたヌクレオチド配列に関する。

0082

本開示は、同様に以下のa)〜e)から選択されるヌクレオチド配列に関する。
a)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7の配列の特定の断片のヌクレオチド配列またはその断片の1つ。
b)a)で定義したようなヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列。
c)a)またはb)で定義されるようなヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、および対応するRNAのヌクレオチド配列。
d)ストリンジェントな条件で、a)、b)またはc)で定義されるような配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列。
e)a)、b)、c)またはd)に定義されるような配列を含むヌクレオチド配列。
f)a)、b)、c)、d)またはe)に定義されるようなヌクレオチド配列によってモディファイされたヌクレオチド配列。

0083

ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、本開示にしたがって、単量体および二量体(いわゆるタンデム)形態の二本鎖または一本鎖DNAおよび前記DNAの転写産物の双方を意味すると理解される。

0084

本開示は、それらの自然環境で、すなわち自然状態で採取されたゲノムヌクレオチド配列に関連しないと理解されねばならない。これは、単離、精製または部分精製が可能であった配列に関し、分離方法は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを始めとして、分子サイズに基づく除外、または親和性による、または異なる溶媒での溶解度に基づく分別技術によるものから、あるいは遺伝子工学の方法から出発して増幅、クローニングおよびサブクローニングなど、本開示の配列をベクターによって保持することが可能なものまである。

0085

本開示の配列の相補的ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチドが本開示の配列のヌクレオチドに相補的であり、向きが逆転される(逆平行配列)任意のDNAを意味すると理解される。

0086

本開示によるヌクレオチド配列とのストリンジェント条件でのハイブリダイゼーションは、相補的DNAの2つの断片間のハイブリダイゼーションの維持を可能にするように選択された温度およびイオン強度の条件でのハイブリダイゼーションを意味すると理解される。

0087

本開示によるヌクレオチド配列の中でも、本開示にしたがって相同配列が得られる方法でプライマーまたはプローブとして使用することができるこれらのものは同様に好ましく、これらの方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸クローニングおよびシーケンシングなどは、当業者に周知である。

0088

本開示による前記ヌクレオチド配列の中でも、PCV3または以下で診断されることを可能に定義されるようなバリアントの1つを存在可能とする方法においてプライマーまたはプローブとして使用され得るものが、やはり好ましい。

0089

PCV3遺伝子の発現を調節、阻害または誘導することが可能であり、かつ宿主細胞および生物またはこれらのいずれか一方におけるPCV3の複製サイクルを調節することが可能であるか、またはこれらのいずれか一方が可能である本開示のヌクレオチド配列も同様に好ましい。複製サイクルは、宿主生物内で宿主細胞から宿主細胞への伝播およびPCV3の増殖および侵入を指定するものとして理解される。

0090

本開示に従い、ヌクレオチド配列の中で、例えば、配列番号4(ORF1)、配列番号6(ORF2)および配列番号8(ORF3)それぞれのようなポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに対応するものは、ORF配列と呼ばれる。本開示によるヌクレオチド配列断片は、例えば、PCRのような特異的増幅によって、または本開示によるヌクレオチド配列の適切な制限酵素による消化後に得ることができ、これらの方法は特にSambrookらの1989年の研究に記載されている。前記代表的な断片は、それらのサイズがそれほど大きくなく、かつ当業者に周知の方法に従うと、化学合成によって同様に得ることができる。

0091

モディファイされたヌクレオチド配列は、当業者に周知の技術による突然変異誘発により得られるすべてのヌクレオチド配列の意味に理解されるであろうし、かつ、本開示による正常な配列のモディファイを含み、例えば制御配列およびプロモーター配列またはこれらのいずれか一方のポリペプチドの配列発現を意味すると理解され、特に前記ポリペプチドの発現速度モディフィケーション配列を意味したり、または複製サイクルの調節配列を意味したりする。

0092

モディファイされたヌクレオチド配列は、同様に、以下に定義されるようなモディファイされたポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を意味すると理解される。

0093

本開示は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、またはそれらの断片の1つを含む配列から選択されることを特徴とする、本開示によるPCV3のヌクレオチド配列に関する。

0094

本開示は、同様に、以下のa)〜e)によって選択されるヌクレオチド配列条件のいずれかに適合することを特徴とするヌクレオチド配列に関する:
a)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、またはそれらの断片の1つの配列。
b)a)で定義したような配列の特定の断片のヌクレオチド配列。
c)a)またはb)で定義したような配列と少なくとも80%の同一性を有する相同ヌクレオチド配列。
d)a)、b)またはc)で定義したような配列に対応するRNAの相補的ヌクレオチド配列または配列。
e)a)、b)、c)またはd)に定義されるような配列によってモディファイされたヌクレオチド配列。

0095

配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列、またはそれらの断片の1つとの相同性に関する限り、相同な、特に特定の配列は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、またはそれらの断片のうちの1つと少なくとも80%、好ましくは90%または95%の同一性を有するアミノ酸配列が好ましい。前記特定の相同配列は、例えば、PCV3のORF1、ORF2、ORF3の配列に対応する配列を含むことができる。同様に、これらの特定の相同配列は、PCV3の株内の変異に関連する変異体に対応することができ、特に、少なくとも1つのヌクレオチドの切断、置換、欠失および付加またはこれらのいずれか一方に対応する。

0096

本開示は、本開示によるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、好ましくはその配列が断片、特に特定の断片によって表されるポリペプチドを含み、これら6つのアミノ酸配列は、3つのうちの1つにしたがってコードされ得るポリペプチドに対応する配列番号1の配列または配列番号2の配列の可能なリーディングフレーム

0097

この開示は、同様に、それらが配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、またはそれらの断片の1つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチドに関する。

0098

本開示はまた、以下から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチドに関する。
a)本開示によるアミノ酸配列のポリペプチドの少なくとも5アミノ酸の特定の断片。
b)a)で定義したようなポリペプチドと相同なポリペプチド。
c)a)またはb)で定義したようなポリペプチドの特定の生物学的に活性な断片
d)a)、b)またはc)に定義されるようなポリペプチドによってモディファイされたポリペプチド。

0099

本開示によるポリペプチドの中で、配列番号2、配列番号4、配列番号6および配列番号8のアミノ酸配列のポリペプチドもまた好ましく、これらのポリペプチドは、特に、PCV3による感染の間に産生される抗体。したがって、これらのポリペプチドは、PCV3に特異的なエピトープを有し、したがって、PCV3による感染に対するブタの防御を付与するための診断分野または免疫原性剤として特に使用することができる。

0100

本明細書において、用語ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は互換的である。

0101

本開示は、天然形態のポリペプチドに関連するものではないことは理解されなければならない、すなわち、換言すれば、それらは、天然の環境では採取されないが、天然源からの精製によって単離または取得され得るか、または代わりに、遺伝子組換えによって得られたり、化学合成によって製造することができたりし、したがって以下に記載するように、それらは非天然アミノ酸を含むことができる。

0102

本開示によるポリペプチド断片は、少なくとも5個の連続したアミノ酸、好ましくは10個の連続するアミノ酸または15個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを指定するものとして理解される。

0103

本開示では、特定のポリペプチド断片は、本開示による特定の断片ヌクレオチド配列によってコードされる連続ポリペプチド断片を指定するものとして理解される。

0104

相同ポリペプチドは、天然ポリペプチドに関して、特に、少なくとも1つのアミノ酸の、欠失、付加または置換、切断、延長、キメラ融合、および突然変異またはこれらのうちの少なくとも任意の1つを含むいずれかのアミノ酸への所定のモディファイを有するポリペプチドを指定するものとして理解される。相同ポリペプチドの中で、そのアミノ酸配列が、本開示によるポリペプチドのアミノ酸の配列と少なくとも80%、好ましくは90%の相同性を有するものが好ましい。

0105

特定の相同ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドの特定の断片を有する、上記で定義された相同ポリペプチドを指定するものとして理解される。

0106

置換の場合、1つ以上の連続または非連続のアミノ酸は「等価な」アミノ酸に置き換えられる。ここで表現する「等価」アミノ酸は、本明細書では、対応するペプチドの生物学的活性を本質的にモディファイすることなく、基本構造のアミノ酸の1つによって置換され得る任意のアミノ酸を指し示し、以下で説明される。これらの等価アミノ酸は、それらが置換するアミノ酸とのそれらの構造的相同性に依存して、または実施され得る異なるポリペプチド間の生物学的活性の比較試験の結果によって決定され得る。例として、対応するモディファイされたポリペプチドの生物学的活性の広範なモディファイをもたらさずに実施することができる置換の可能性を挙げると、例えばロイシンバリンまたはイソロイシンに、アスパラギン酸グルタミン酸グルタミンアスパラギン、アルギニンのリジンなどによる置換であり、逆の置換は当然のことながら同じ条件下で考えられる。

0107

特定の相同ポリペプチドは、同様に、上記で定義したような特定の相同ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対応し、したがって、本発明の定義において、PCV3中に存在し得て、そして特に切断、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失および付加またはこれらのいずれか一方を含む。

0108

本開示によるポリペプチドの特定の生物学的に活性な断片は、特に、本開示によるポリペプチドの特徴の少なくとも1つを有する、上で定義したような特定のポリペプチド断片を指定するものとして理解され、特に、PCV3に対する免疫原性反応を誘導する能力と、本開示によるポリペプチドの特定の抗体によって認識され得るポリペプチドおよびポリペプチドまたはPCV3のヌクレオチド配列に連結することができるポリペプチドと、生理学的活性を発揮することができ、部分的であっても、例えば、散在性または構造的(カプシド)活性などを発揮することができる能力を有することと、PCV3遺伝子またはその変異体の1つの発現をモディファイ、または誘導または阻害することができる能力を有することと、細胞および宿主生物またはこれらのいずれか一方におけるPCV3の複製サイクルを調節する能力を有すること、これらのうち少なくとも任意の1つの特徴を有するポリペプチド断片を指定する。

0109

本開示によるポリペプチド断片は、PCV3に天然に存在する単離または精製された断片に対応し得るか、またはトリプシンまたはキモトリプシンまたはコラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素による、または化学試薬例えば臭化シアン(CNBr)による、あるいは代わりに前記ポリペプチドを非常に酸性の環境、例えばpH2.5に置くことによる、前記ポリペプチドの分割によって得られる得る断片に一致し得る。そのようなポリペプチド断片は、同様に、化学合成によって容易に、適切な制御および発現エレメントまたはこれらのいずれか一方の制御下に置かれ、前記断片の発現を可能にする核酸を含む本開示による発現ベクターによって転換された宿主から、生成することができる。

0110

本開示によるポリペプチドの「モディファイされたポリペプチド」は、正常な配列に関して少なくとも1つのモディファイを有する、以下に記載されるような遺伝子組換えまたは化学合成によって得られたポリペプチドを指すものとして理解される。これらのモディファイは、特に、特定性、病原性および毒性またはこれらの少なくともいずれかの1つを含む起源、または構造の立体配座の起源および本開示によるポリペプチドの膜挿入能力に関わるアミノ酸に関わりうる。したがって、同等、増加または減少した活性、および同等、より狭い、またはより広い特定性のポリペプチドを作製することが可能であろう。モディファイされたポリペプチドの中で、最大5個のアミノ酸がモディファイされ、N−末端またはC−末端で切断され、または欠失または付加さえさえできるポリペプチドに言及する必要がある。

0111

示されるように、ポリペプチドのモディファイは、特に、それがPCV3遺伝子の発現を調節、阻害または誘導可能であること、かつ細胞および宿主生物またはこれらのいずれか一方においてPCV3の複製サイクルを調節可能であることまたはこれらのいずれか一方が可能であり、混合ワクチンへのその組み込みを可能にすること、かつ治療的使用のための化合物としてそのバイオアベイラビリティーをモディファイすることまたはこれらのいずれか一方を含む。

0112

真核または原核細胞に対する前記調節を可能にするものとして開示すべき方法は、当業者に周知である。同様に、例えば、開示され、以下に記載されるベクターを介して、例えば、感染に関連する病状を予防または治療するために、前記モディファイのために前記モディファイされたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用することが可能であることも理解される。

0113

先行するモディファイポリペプチドは、例えば、モデル、細胞培養物または微生物でそれらを試験する前にポリペプチドの部分を体系的に変化させて、最も活性の高いまたは所望の特性を有する化合物を選択することが可能なコンビナトリアルケミストリーの使用によって獲得し得る。

0114

同様に、化学合成は、非天然アミノ酸または非ペプチド結合を使用することができるという利点を有する。したがって、本開示によるポリペプチドの存続期間を改善するために、非天然アミノ酸、例えばD体、またはアミノ酸類似体、特に硫黄含有形態を用いることが重要であり得る。

0115

最後に、本開示によるポリペプチドの構造、その特定またはモディファイされた同種の形態を、ポリペプチドタイプまたは他の化学構造の中に組み込むことが可能である。したがって、プロテアーゼによって認識されない化合物をN−末端およびC−末端に提供することは重要であり得る。

0116

本開示によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も同様に本開示の一部である。

0117

本開示は、同様に、プライマーまたはプローブとして利用可能なヌクレオチド配列に関し、前記配列は、本開示によるヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする。

0118

PCV3のクローニングおよびシーケンシングにより、他のブタサーコウイルスのヌクレオチド配列との比較分析後に、これらの核酸の断片の配列のうち、PCV3に厳密に特定されるものであることが確認されたが、これはPCV3以外のブタサーコウイルスのコンセンサス配列に対応する。同様に、他の既知および非病原性ブタサーコウイルス全体に対して特定されるプライマーまたはプローブとして利用可能なヌクレオチド配列の強いニーズがある。

0119

本発明は、同様にPCV3以外の既知のブタサーコウイルスの特定のポリペプチドに関し、それはコンセンサスヌクレオチド配列によってコードされ、天然ポリペプチドからの精製、遺伝子組換え、または周知の方法による化学合成によっても取得可能である。当業者に知られる手順によって、以下に特に記載されている。同様に、前記コンセンサスヌクレオチド配列によってコードされる前記特定のポリペプチドに向けられ前記標識化され、または非標識のモノまたは多クローン性抗体も本開示の一部である。

0120

前記コンセンサスヌクレオチド配列、前記対応するポリペプチドならびに前記ポリペプチドに対する前記抗体を手順で、または、下記のように検出および同定またはこれらのいずれか一方のためのセットで、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは前記記載にしたがって抗体の代わりに、またはそれに加えて使用可能であろう、特定は、PCV3タイプAおよびBまたはこれらのいずれか一方についてされる。

0121

これらのプロトコルは、複製におけるビリオンまたはDNAの特定の複製形態の環状単量体形態の差異検出のため、およびいわゆるタンデム分子構築物に見られる二量体形態の差異検出のために改良された。

0122

本開示は、核酸配列の検出および増幅またはこれらのいずれか一方のためのプライマーまたはプローブとしての開示に加えて、ヌクレオチド配列の使用に関する開示である。

0123

本開示によるヌクレオチド配列は、したがって、特にPCR技術(ポリメラーゼ連鎖反応)(Erlich、1989、Innis他、1990年、Rolfs他、1991年およびWhite他、1997年)によってヌクレオチド配列を増幅するのに使用され得る。これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドプライマーは、有利には、少なくとも8ヌクレオチド、好ましくは少なくとも12ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも20ヌクレオチドの長さを有する。他の標的核酸の増幅技術がPCRの代替として有利に使用することができる。

0124

本開示のヌクレオチド配列、特に本開示によるプライマーは、標的核酸の増幅の他の手順においても同様に使用可能であり、TAS技術(転写に基づく増幅システム)のようにKwoh他(1989年)、3SR技術(自己持続的配列複製)Guatelli他(1990年)、NASBA技術(Nucleic Acid Sequence Based Amplification、核酸配列ベース増幅)Kievitis他(1991年)、SDA技術(Strand Displacement Amplification、鎖置換増幅)Walker他(1992年)、TMA技術(Transcription−Mediated Amplification、転写増幅法)等がある。

0125

本開示のポリヌクレオチドはまた、プローブとして働く核酸の増幅またはモディファイの技術において使用することができ、例えば、LCR技術(Ligase Chain Reaction、リガーゼ連鎖反応)Landegren他(1988年)、その改善技術(熱安定リガーゼを使用)、Barany他(1991年)、RCR技術(Repair Chain Reaction、修復連鎖反応),Segev(1992年)、CPR技術(Cycling Probe Reaction、サイクリングプローブ反応)Duck他(1990年)、Q−ベータ・レプリカーゼによる増幅技術,Miele他(1983年)、その特別改善技術、Chu他(1986年)、Lizardi他(1988年),Burg他.Stone他(1996年)がある。

0126

検出される標的ポリヌクレオチドが可能性としてRNA、例えばMRNAである場合には、本開示による少なくとも1つのプライマーの助けを借り増幅反応を採用する前に、あるいは、本開示による少なくとも1つのプローブの助けを借りて検出手順を採用する前に、生物学的サンプル中に含まれるRNAからcDNAを得るために、逆転写酵素型の酵素を使用することが可能であろう。したがって、得られたcDNAは、本開示による増幅または検出手順において使用されるプライマーまたはプローブの標的として働くであろう。

0127

検出プローブは、それが標的配列または標的配列から生成されたアンプリコンとハイブリダイズするように選択されている。配列方法として、このようなプローブは、有利には少なくとも12ヌクレオチド、特に少なくとも20ヌクレオチド、好ましくは少なくとも100ヌクレオチドの配列を有する。

0128

本開示は、放射性化合物または非放射性化合物で標識されていることを特徴とする、本開示によるプローブまたはプライマーとして利用可能なヌクレオチド配列も含む。配列は、一般に放射性エレメント(32P、35S、3H、125I)で標識されており、あるいは、非放射性分子(ビオチンアセチルアミノフルオレンジゴキシゲニン5-ブロモデオキシウリジンフルオレセイン)で標識されるが、非標識ヌクレオチド配列はプローブまたはプライマーとして直接使用することができ、多数の用途に利用可能なプローブを得る。ヌクレオチド配列の非放射性標識の例は、例えば、フランス特許第78.10975号またはUrdea他またはSanchez−Pescador他(1988年)がある。後者の場合、特許FR−2,422,956およびFR−2,518.755に掲載されている標識方法の1つを使用することも可能であろう。

0129

ハイブリダイゼーション技術は様々な方法で実施することができる(Matthews et al., 1988)。最も一般的な方法は、細胞の核酸抽出物を支持体(例えば、ニトロセルロースナイロン登録商標)、ポリスチレン)上に固定化すること、および明確に定められた条件下で固定化された標的核酸をプローブとともにインキュベートすることにある。ハイブリダイゼーション後、過剰プローブを除去し、形成されたハイブリッド分子を適切な方法(蛍光またはプローブに結合した酵素活性放射能の測定)によって検出する。

0130

本開示は同様に、それらが共有結合的または非共有結合的に支持体上に固定化されていることを特徴とする、本開示によるヌクレオチド配列を含む。

0131

本開示によるヌクレオチド配列を利用する別の有利な実施形態によれば、ヌクレオチド配列は支持体上に固定化して使用することができ、したがって特異的ハイブリダイゼーションにより、試験される生物学的サンプルから得られた標的核酸を捕捉することができる。必要に応じて、固体支持体をサンプルから分離し、次いで、前記捕捉プローブと標的核酸との間に形成されたハイブリダイゼーション複合体を、容易に検出可能なエレメントで標識された、いわゆる検出プローブである第2のプローブを用いて検出する。

0132

本開示の別の主題は、本開示によるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、配列のクローニングおよび/または発現のためのベクターである。

0133

決定された宿主細胞において前記ヌクレオチド配列の発現および/または分泌を可能にするエレメントを含むことを特徴とする本開示によるベクターは、同様に本開示の一部である。次いで、ベクターは、プロモーター翻訳の開始および終結シグナル、並びに転写の調節の適切な領域を含まなければならない。これは、宿主細胞中で安定に維持できなければならず、選択に応じて、翻訳されたタンパク質の分泌を特定する、特定のシグナルを有することができる。これらの異なるエレメントは、使用される宿主細胞の機能として選択される。この目的のために、本開示によるヌクレオチド配列は、選択された宿主内の自己複製ベクター、または選択された宿主の組み込みベクターに挿入することができる。そのようなベクターは、当業者が現在利用している方法で調製され、また、標準的な方法、例えばリポフェクションエレクトロポレーションおよび熱ショックなどによって、当該ベクターから得られるクローンを適切な宿主に導入することが可能である。本開示によるベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。本開示のポリペプチドの発現に好ましいベクターは、バキュロウイルスである。

0134

これらのベクターは、本開示のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現させるために宿主細胞を形質転換するために有用である。本開示は、同様に、本開示によるベクターによって形質転換された宿主細胞を含む。これらの細胞は、上記のようなベクターに挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入し、次いでトランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および/または発現を可能にする条件下での該細胞を培養することによって得ることができる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞系から選択することができ、例えばバクテリア細胞(Olins and Lee, 1993)、同様に酵母細胞(Buckholz, 1993)、ならびに動物細胞、特に哺乳動物の培養物(Edwardsand Aruffo, 1993)の、とりわけチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられるが、例えば同様にバキュロウイルスを用いた手順を用いることが可能な昆虫細胞でもよい(Luckow, 1993)。本開示のタンパク質の発現のための好ましい宿主細胞は、sf9昆虫細胞によって構成される。

0135

本開示は、同様に、本開示による前記形質転換細胞の1つを含む動物に関する。本開示による、PCV3の遺伝子の1つ以上またはその一部を過剰発現するトランスジェニック動物の取得は、好ましくは、例えばウイルスまたは非ウイルスのトランスフェクションなどの当業者に周知の方法で、ラットマウスまたはウサギにおいて実施される。遍在性の高い、または1つのタイプの組織に対して選択的であるプロモーターの制御下で前記遺伝子の複数コピーをトランスフェクションすることにより、前記遺伝子の1つ以上を過剰発現するトランスジェニック動物を得ることが可能である。同様に、胚細胞株における相同組換え、これらの細胞株への移入生殖系列のレベルでの罹患キメラの選択、および前記キメラの成長によって、トランスジェニック動物を得ることが可能である。本開示による形質転換細胞およびトランスジェニック動物は、組換えポリペプチドの調製の手順において利用可能である。

0136

本開示による発現ベクターによって形質転換された細胞を用いる遺伝子組換えによって、または本開示によるトランスジェニック動物を用いて、比較的大量の組換えポリペプチドを製造することが今日可能である。本開示によるベクターによって形質転換されたベクターおよび/または細胞および/または本開示による前記形質転換細胞の1つを含むトランスジェニック動物を使用することを特徴とする、組換え形態の本開示のポリペプチドの調製手順も本発明に含まれる。本開示の組換え型のポリペプチドを調製する前記手順の中で、ベクターを用い調製手順および/または前記ベクターおよび/または前記形質転換細胞の1つを含むトランスジェニック動物によって形質転換された細胞は、PCV3のポリペプチドをコードする本発明によるヌクレオチド配列を含有するものが好ましい。上記で示したようにして得られた組換えポリペプチドは、非グリコシル化形態と同様、グリコシル化形態でも存在することができ、天然の三次構造を有することも、有さないこともできる。

0137

好ましい変異体は、「キャリア」タンパク質(キメラタンパク質)に使用される組換えポリペプチドを産生するものである。この系の利点は、組換え産物タンパク質分解の安定化および減少、インビトロでの再生の間の溶解性の増加および/または融合パートナーが特定のリガンドに親和性を有する場合の精製の単純化を可能にすることである。

0138

より詳細には、本開示は、(a)本開示によるヌクレオチド配列の組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下での形質転換細胞の培養のステップ、および(b)必要に応じて行う、前記組換えポリペプチドの回収のステップを含む、本開示のポリペプチドの調製手順に関する。

0139

本開示のポリペプチドの調製方法が、本開示によるトランスジェニック動物を使用する場合、次いで組換えポリペプチドが前記動物から抽出される。

0140

本開示はまた、先に記載したような開示の手順によって得ることができるポリペプチドに関する。

0141

本開示はまた、本開示によるポリペプチドのアミノ酸の配列を使用することを特徴とする、合成ポリペプチドの調製のための方法を含む。本開示は同様に、本開示による手順によって得られる合成ポリペプチドに関する。

0142

本開示によるポリペプチドは、同様に、ペプチドの合成の分野における従来の技術によって調製することができる。この合成は、均質溶液または固相で行うことができる。例えば、Houben-Weyl 1974に記載された均質溶液中での合成技術を参照することができる。この合成方法は、連続したアミノ酸を必要な順序で連続的に2つずつ縮合させること、または以前に形成されたアミノ酸およびいくつかのアミノ酸を既に適切な順序で含む断片を縮合、あるいはこのように予め調製された断片のいくつかを縮合させることにあり、理解されるように、これらのアミノ酸または断片が有する全ての反応性官能基は、一方のアミン官能基で他方のカルボキシルの場合またはその逆の場合を除き、予め保護することが必要であり、これは、ペプチドの合成の公知の方法で、特にカルボキシル官能基の活性化後に、ペプチド結合の形成に通常含めなければならない。本開示の別の好ましい技術によれば、Merrifieldに記載された技術が用いられる。Merrifieldの方法でペプチド鎖を作製するために、鎖の最初のC末端アミノ酸が固定化された多孔性の非常に高い高分子樹脂が用いられる。このアミノ酸はカルボキシル基を介して樹脂に固定化され、そのアミン官能基が保護されている。このようにして、ペプチド鎖を形成しているアミノ酸は、樹脂に結合されている既に形成されたペプチド鎖の部分の、毎回の前もって脱保護されるアミノ基上に次々に固定化される。所望のペプチド鎖の全体が形成されると、ペプチド鎖を形成する異なるアミノ酸の保護基が除去され、そしてペプチドは酸を用いて樹脂から分離される。

0143

本開示は、さらに、本開示による少なくとも1つのポリペプチドを含み、ヒトまたは動物において免疫応答を誘導することができるポリペプチドの配列を有するハイブリッドポリペプチドに関する。

0144

好都合な点として、抗原決定基は、体液性および/または細胞性の応答を誘導することが可能であるようなものである。そのような抗原決定基は、複数のエピトープに対する抗体の合成を誘導することができる免疫原性組成物を得るために使用される、グリコシル化された形態の本開示によるポリペプチドを含むことが可能である。前記ポリペプチドまたはそのグリコシル化断片も同様に本開示の一部である。これらのハイブリッド分子は、部分的には、本開示によるポリペプチドキャリア分子またはその断片から、場合によっては免疫原性部分とともに形成することができ、免疫原性部分としては、特にジフテリア毒素破傷風毒素のエピトープ、B型肝炎ウイルス表面抗原(仏国特許FR79 21811)、ポリオウイルスのVP1抗原または他の任意のウイルスまたは細菌の毒素または抗原などが挙げられる。ハイブリッド分子の合成のための手順は、求められるポリペプチド配列をコードするハイブリッドヌクレオチド配列を構築するための遺伝子改変に用いられる方法を包含する。例えば、Minton 1984に記載された融合タンパク質をコードする遺伝子を取得するための技術を好都合に参照することが可能であろう。ハイブリッドポリペプチドをコードする前記ハイブリッドヌクレオチド配列、並びに前記ハイブリッドヌクレオチド配列の発現によって得られる組換えポリペプチドであることを特徴とする本開示によるハイブリッドポリペプチドも、同様に本開示の一部である。

0145

本開示は、同様に、前記ハイブリッドヌクレオチド配列の1つを含むことを特徴とするベクターを含む。前記ベクターによって形質転換された宿主細胞、前記形質転換細胞の1つを含むトランスジェニック動物、並びに前記ベクター、前記形質転換細胞および/または前記トランスジェニック動物を用いる組換えポリペプチドの調製方法は、当然ながら同様に本開示の一部である。

0146

本開示によるポリペプチド、以下に記載の本開示による抗体および本開示によるヌクレオチド配列は、PCV3またはPCV3以外のブタサーコウイルスの、それらを含み得る生物学的サンプル(生物学的組織または液体)中での検出および/または同定のための手順において好都合に用いることができる。使用されることになるポリペプチド、抗体およびヌクレオチド配列の特異性にしたがったこれらの手順は、特にPCV3またはPCV3以外またはPCV3以外のブタサーコウイルスを検出および/または同定することができる。

0147

本開示によるポリペプチドは、それらを含有することができる生物学的サンプル(生物学的組織または液体)中のPCV3の検出および/または同定のための手順であって、(a)この生物学的サンプルと本開示によるポリペプチドまたはその断片の1つとを(該ポリペプチドと生物学的サンプル中におそらく存在する抗体との間の免疫学的反応を可能にする条件下で)接触させるステップと、(b)形成される可能性のある抗原−抗体複合体を実証するステップを含むことを特徴とする、該手順において好都合に使用することができる。好ましくは、生物学的サンプルは流体、例えばブタ血清全血、または生検によって形成される。このような形成される可能性のある抗原−抗体複合体の検出を行うために、任意の従来の手順を用いることができる。例として、好ましい方法は、ELISA技術、免疫蛍光法、またはラジオイムノアッセイRIA)または同等の方法によって免疫酵素プロセスを生じさせる。

0148

したがって、本開示は同様に、酵素、蛍光または放射性のタイプなどの適切な標識の助けを借りて標識された、本開示によるポリペプチドにも関する。そのような方法は、例えば以下のステップ、すなわち(1)マイクロタイタープレートウェル中への所定量の本開示によるポリペプチド組成物沈着、(2)血清または以前に定めたもの以外の生物学的サンプルの漸増希釈液を前記ウェルに導入して行う分析、(3)マイクロプレートインキュベーション、および(4)ブタ免疫グロブリンに対する標識された抗体のマイクロタイタープレートのウェルへの導入を含み、これらの抗体の標識化は、基質加水分解できる酵素群のなかから選択される酵素を利用して加水分解された基質の量を、少なくとも所定の波長、例えば550nmでの基質の放射線吸収の変化を、対照試験との比較で検出することによって行われる。

0149

本開示は、同様に、次の要素、すなわち(1)本開示によるポリペプチド、(2)必要であれば、免疫学的または特異的反応に好都合な培地の形成のための試薬、(3)必要であれば、本開示のポリペプチドと生物学的サンプル中に存在する可能性のある抗体との間の免疫学的反応によって生成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬であって、同様に標識を有するができ、または標識された試薬によって認識されることが可能(但し、より詳細には、本開示によるポリペプチドが標識されていない場合に)な、該抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬、(4)必要であれば、本開示によるポリペプチドによって認識される抗体を欠く生物学的参照サンプル(陰性対照/ネガティブコントロール)、および(5)必要であれば、本開示によるポリペプチドによって認識される所定量の抗体を含有する生物学的参照サンプル(陽性対照ポジティブコントロール)を含むことを特徴とするPCV3の検出および/または同定のためのキットまたはセットに関する。

0150

本開示によるポリペプチドにより、本開示によるポリペプチドを特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を調製することを可能になる。好都合なことに、Kohler and Milstein 1975に記載された技術にしたがって、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を調製することが可能である。ポリクローナル抗体の調製は、例えば、免疫応答のアジュバントとともに、本開示によるポリペプチドまたはDNAを用いて、動物、特にマウスを免疫化した後、免疫化した動物の血清中に含まれる抗原特異的抗体を、予め抗原となったポリペプチドが固定化されたアフィニティーカラム上で精製することによって行うことができる。本開示によるポリクローナル抗体はまた、PCV3に感染したブタの血清に含まれる抗体を、本開示によるポリペプチドが予め固定化されているアフィニティーカラム上での精製するによって調製することもできる。

0151

本開示は、同様に、本開示によるポリペプチドを特異的に認識することができることを特徴とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片、またはキメラ抗体に関する。同様に、本開示の抗体を、酵素、蛍光または放射性のタイプの標識など、本開示の核酸プローブについて先に記載されたのと同じ方法で標識することが可能である。

0152

本開示は、さらに、生物学的サンプル中のPCV3の検出および/または同定のための手順であって、以下のステップすなわち(a)生物学的サンプル(生物学的組織または液体)を本開示によるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と、生物学的サンプル中に存在する可能性のあるORF1、ORF2、および/またはORF3を含むPCV3のポリペプチドと前記抗体との間の免疫反応を可能にする条件下で接触させるステップと、(b)形成される可能性のある抗原−抗体複合体を実証するステップとを含むことを特徴とする、該手順に関する。

0153

本発明の範囲内には、PCV3の検出および/または同定のためのキットまたはセットであって、(a)必要であれば標識される、本開示によるポリクローナルまたはモノクローナル抗体、(b)必要であれば、免疫学的反応の実施に有利な培地の形成のための試薬、(c)必要であれば、免疫反応によって生成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬であって、同様に標識を有することができ、または特に前記モノクローナルまたはポリクローナル抗体が標識されていない場合には、標識された試薬によって順番に認識することができる、該抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬、および(d)必要であれば、試験したサンプルの細胞の溶解を行うための試薬を含むことを特徴とするPCV3の検出および/または同定のためのキットまたはセットが含まれる。

0154

本開示は、同様に、本開示によるヌクレオチド配列を使用することを特徴とする、生物学的サンプル中のPCV3の検出および/または同定のための手順に関する。本開示は、特に、生物学的サンプル中のPCV3の検出および/または同定の手順であって、次のステップすなわち(a)必要であれば、分析される生物学的サンプルからのDNAの単離、(b)本開示による、少なくとも1つのプライマーまたは一対のプライマーの補助によるサンプルのDNAの特異的増幅、および(c)増幅産物の実証を含むことを特徴とする手順を含む。これらは、例えば、本開示による核酸プローブを利用する分子ハイブリダイゼーション技術によって検出することができる。このプローブは、非放射性(低温プローブ)または放射性エレメントで標識されることが好都合である。

0155

本明細書において、「生物学的サンプルのDNA」または「生物学的サンプルに含まれるDNA」という表現は、考慮される生物学的サンプル中に存在するDNA、または場合によっては生物学的サンプル中に存在するRNA上の逆転写酵素の作用後に得られたcDNAのいずれかを意味すると理解されたい。

0156

本開示のもう別の目的は、以下のステップすなわち、(a)本開示によるヌクレオチドプローブを生物学的サンプルと接触させるステップであって、必要であれば、生物学的サンプル中に含まれるDNAが、前もってプローブとサンプルのDNAとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でハイブリダイゼーションのためにアクセス可能にされている、該ステップ、および(b)ヌクレオチドプローブと生物学的サンプルのDNAとの間に形成されたハイブリッドの実証のステップを含むことを特徴とする本開示による方法の提供である。

0157

本開示はまた、次のステップすなわち(a)本開示による支持体上に固定化されたヌクレオチドプローブを生物学的サンプルと接触させるステップであって、必要であれば、生物学的サンプル中に含まれるDNAが、前もってプローブとサンプルのDNAとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でハイブリダイゼーションのためにアクセス可能にされている、該ステップ、(b)支持体に固定化されたヌクレオチドプローブと生物学的サンプルに含まれるDNAとの間に形成されたハイブリッドを、本開示による標識されたヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、必要であれば、プローブにハイブリダイズしていない生物学的サンプルのDNAを除去した後に行う、該ステップ、および(c)ステップ(b)で形成された新規なハイブリッドの実証のステップを含むことを特徴とする本開示による手順に関する。前に定められた検出および/または同定のための手順の効果的な実施形態によれば、ステップ(a)の前に、生物学的サンプルのDNAが、本開示による少なくとも1つのプライマーの補助により最初に増幅されることを特徴とする。

0158

本開示はさらに、PCV3の検出および/または同定のためのキットまたはセットであって、次の要素すなわち(a)本開示によるヌクレオチドプローブ、(b)必要であれば、ハイブリダイゼーション反応の実施に必要な試薬、および(c)必要であれば、本開示による少なくとも1つのプライマー、ならびにDNAの増幅反応に必要な試薬を含むことを特徴とする、該PCV3の検出および/または同定のためのキットまたはセットに関する。

0159

本開示は、同様に、PCV3またはPCV3以外のブタサーコウイルスの検出および/または同定のためのキットまたはセットであって、以下の成分すなわち(a)本開示による、捕捉プローブと呼ばれるヌクレオチドプローブ、(b)本開示による、露出プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドプローブ、および(c)必要であれば、本開示による少なくとも1つのプライマー、ならびにDNAの増幅反応に必要な試薬を含むことを特徴とする、該PCV3の検出および/または同定のためのキットまたはセットに関する。

0160

本開示は、PCV3の検出および/または同定のためのキットまたはセットであって、以下の要素すなわち(a)本開示による少なくとも1つのプライマー、(b)必要であれば、DNA増幅反応を実施するために必要な試薬、および(c)必要であれば、増幅された断片の配列を確認する成分、より具体的には本開示によるオリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とする、該PCV3の検出および/または同定のためのキットまたはセットにも関する。

0161

本開示は、さらに、遺伝子の発現を調節、誘導または阻害することができる有機または無機化合物の選択のため、および/またはPCV3の細胞複製を調節することが可能であるか、またはPCV3による感染に関連する臨床兆候の発生率および重症度の低下を含む病理を誘導または抑制することができる、本開示によるヌクレオチド配列、本開示によるポリペプチド、本開示による抗体、本開示による細胞、および/または本開示による形質転換された動物の使用に関する。

0162

本開示は、同様に、本開示によるポリペプチドまたはその断片の1つに結合することができる、本開示によるヌクレオチド配列に結合することができるか、または本開示による抗体を認識することができる、および/または遺伝子の発現を調節、誘導または阻害すること、および/またはPCV3の細胞複製を改変することができるか、または病状を誘発または阻害すること(PCV3による感染に関連する臨床兆候の発生率および重症度の低下を含む)ができる化合物の選択方法であって、次のステップすなわち、(a)前記化合物と前記ポリペプチド、前記ヌクレオチド配列との接触、または前記本開示による形質転換された細胞および/または前記化合物の本開示による形質転換された動物への投与を行うステップ、および(b)前記ポリペプチドまたは前記ヌクレオチド配列に結合する前記化合物の能力の決定する、または遺伝子の調節、誘導または阻害をする、またはPCV3の増殖または複製の調節をする、若しくは前記形質転換された動物においてPCV3による感染に関連する病状を誘導または阻害(該化合物の示す活性)をするステップを含むことを特徴とする、該化合物の選択方法を含む。選択され得る化合物は、ポリペプチドまたは炭水化物などの有機化合物、既知の任意の他の有機化合物、無機化合物、または分子モデリング技術によって精緻化され、化学的または生化学的合成によって得られる(これらの技術は当業者に公知である)新規な有機化合物であり得る。選択された化合物を使用して、PCV3の細胞複製を調節し、したがってこのウイルスによる感染を制御することが可能であり、この方法により、当業者に周知の前記調節が決定されることが可能となる。この調節は、例えば、タンパク質に結合することができ、したがってその生物学的活性を阻害または増強することができる、または前記ウイルスの外部表面のエンベロープタンパク質に結合することができ、かつ前記ウイルスの宿主細胞への浸透ブロックすることができるか、または前記ウイルスに向けられた感染生物の免疫系の作用を助力することができる作用物質によって実施することができる。この調節は、同様に、前記ウイルスのDNAのヌクレオチド配列に結合することができ、例えば、前記ウイルスの宿主細胞からの宿主動物への宿主細胞への複製または増殖のために必要な生物学的または構造的活性を有するポリペプチドの発現をブロックすることができる作用物質によって実施することができる。

0163

本開示は、本開示による選択方法によって選択され得る化合物に関する。

0164

本開示は、同様に、次の化合物すなわち(a)本開示によるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド、(b)本開示によるポリペプチド、(c)本開示によるベクター、ウイルス粒子または形質転換された細胞、(d)本開示による抗体、および(e)本開示による選択方法によって選択することができる化合物、から選択される化合物と、場合によっては、薬学的に許容される担体とを組み合わせて含み、必要な場合には適切な免疫性の1種以上のアジュバントも含まれる医薬組成物に関する。

0165

本開示は、次の化合物、(a)本開示によるヌクレオチド配列、(b)本開示によるポリペプチド、(c)本開示によるベクターまたはウイルス粒子、および(d)本開示による細胞から選択される化合物を含むことを特徴とする免疫原性および/またはワクチン組成物にも関する。

0166

一実施形態では、本開示によるワクチン組成物は、前記化合物(a)、(b)、(c)および(d)の少なくとも2つの混合物を含み、前記2つの化合物の1つがPCV3に関連する。

0167

本開示の別の実施形態では、ワクチン組成物が、PCV3に関連する上記化合物(a)、(b)、(c)、または(d)の少なくとも1つを含むことを特徴とする。さらに別の実施形態では、ワクチン組成物が、PCV3のORF2に関連する上記化合物(a)、(b)、(c)、または(d)の少なくとも1つを含むことを特徴とする。

0168

PCV3に関連する化合物は、本明細書では、PCV3および/または、PCV3のORF1、ORF2およびORF2のゲノム配列から得られた化合物をそれぞれ示すものとして理解される。

0169

本開示はさらに、免疫原性および/またはワクチン組成物であって、次の化合物すなわち(1)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列のヌクレオチド、またはそれらの断片若しくはホモログの1つ、(2)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8の配列またはそれらの断片の1つのポリペプチド、またはその改変体、(3)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列のヌクレオチド、またはそれらの断片若しくはホモログの1つを含むベクターまたはウイルス粒子、(4)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、またはそれらの断片の1つのポリペプチド、またはその改変体を発現することができる形質転換細胞、または(5)前記化合物の少なくとも2種の混合物の少なくとも1つを含むことを特徴とする、該免疫原性および/またはワクチン組成物を対象とする。

0170

本開示はまた、本開示による免疫原性および/またはワクチン組成物であって、PCV3による感染の予防または治療のための、同時使用、別々の使用または長期使用のための組み合わせ製品として、前記化合物の少なくとも2つの前記混合物を含む、該免疫原性および/またはワクチン組成物も含む。

0171

好ましい実施形態では、本開示によるワクチン組成物は、次の化合物すなわち、(1)配列番号1の配列を有する核酸を含むpcDNA3プラスミド、(2)配列番号3、配列番号5、または配列番号7の配列を有する核酸を含むpcDNA3プラスミド、(3)GMCSFタンパク質をコードする核酸を含有するpcDNA3プラスミド、(4)配列番号1の配列を有する核酸を含む組換えバキュロウイルス、(5)配列番号3、配列番号5または配列番号7の配列を有する核酸を含む組換えバキュロウイルス、および(6)必要に応じて、適切な免疫のアジュバント、特にアジュバントAIFTMを含む。

0172

本開示は、同様に、PCV3による感染症の予防または治療のための、本開示による医薬組成物に関する。

0173

本開示で使用される「予防」には、PCV3による感染の完全な予防が含まれるが、PCV3感染に関連するか、またはPCV3感染によって引き起こされる臨床兆候の重症度または発症率を低下させることも包含されると理解されたい。そのような予防は、本明細書においては保護効果とも称する。

0174

本開示は、同様に、PCV3による感染の予防または治療を目的とする医薬品の調製のための、本開示による組成物の使用に関する。

0175

別の態様では、本開示は、遺伝子治療による疾患の治療および/または予防のための、本開示によるベクター、ウイルス粒子または細胞に関する。

0176

最後に、本開示は、遺伝子治療による疾患の治療および/または予防を目的とした医薬の調製のための、本開示によるベクター、ウイルス粒子または細胞の使用を含む。

0177

本開示による免疫原性またはワクチン組成物に入る、本開示のポリペプチドは、例えば、T細胞を刺激する前記ポリペプチドの能力(例えば、その増殖またはインターロイキンの分泌によって翻訳され、前記ポリペプチドに対する抗体の産生をもたらす能力)に応じて当業者に公知の技術によって選択することができる。

0178

ブタでは、マウスのように、ヒトで使用される用量に匹敵するワクチン組成物の重量用量が投与され、抗体反応は、通常の技術にしたがって、血清を採取し、続いて血清中に存在する抗体とワクチン組成物の抗原との間の複合体の形成を調べることによって試験される。

0179

本開示による医薬組成物は、有効量の本開示による組成物が、すなわち、例えばPCV3の細胞複製の調節のような、所望の効果が得られるのに十分な量の本開示による組成物が前記化合物中に存在し得る。当業者であれば、この量を、例えば処置される個体の年齢および体重、病理の進行状態、可能性のある副次効果および集団範囲で得られた効果の評価試験(これらの試験は当分野で公知である)の関数として決定する方法を知っている。

0180

本開示によれば、前記ワクチンの組み合わせは、好ましくは、薬学的または獣医学的に許容される担体と組み合わせられ、必要であれば、適切な免疫の1種以上のアジュバントも組み合わせられる。

0181

今日、様々なタイプのワクチンが動物またはヒトを感染症から保護するために利用可能であり、そのようなワクチンとしては、弱毒化された生きた微生物(結核のためのM.ボビス−BCG)、不活化微生物(インフルエンザウイルス)、細胞抽出物百日咳のための百日咳菌)、組換えタンパク質(B型肝炎ウイルスの表面抗原)、多糖類肺炎球菌)などがある。合成ペプチドから調製されたワクチンまたは異種抗原を発現する遺伝子組換え微生物は、実験の過程にある。さらに最近では、予防的抗原をコードする遺伝子を保有する組換えプラスミドDNAが、代替的ワクチンストラテジーとして提案されている。このタイプのワクチン接種は、インビボで複製せず、ワクチン接種タンパク質に対して一意的にコードする大腸菌(E.coli)のプラスミドに由来する特定のプラスミドを用いて行われる。動物はのプラスミドDNAを筋肉に注射するだけで免疫されている。この技術は、その場でのワクチンタンパク質の発現および細胞型(CTL)および体液性型(抗体)の免疫応答につながる。この免疫応答の二重誘導は、裸のDNAによるワクチン接種技術の主な利点の1つである。

0182

本開示にしたがってワクチン組成物の構成的ヌクレオチド配列は、このポリヌクレオチドの細胞内部への浸透または細胞核へのその輸送を促す化合物に結合された後に宿主に注入され得る。得られた複合体は、国際公開出願第94/027238号(Medisorb Technologies International)に記載されているように、ポリマー微粒子封入することができる。

0183

本開示によるワクチン組成物の別の実施形態によれば、本発明の配列のヌクレオチド、好ましくはDNAは、DEAEデキストランと(Pagano et al., 1967)、核タンパク質と(Kaneda et al., 1989)、または脂質と(Felgner et al., 1987)複合体化されるか、またはリポソームに封入される(Fraley et al., 1980)か、または細胞へのそのトランスフェクションを容易にするゲルの形態で導入される(Midoux et al., 1993, Pastore et al., 1994)。本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターはまた、緩衝溶液中に懸濁していても、またはリポソームと組み合わせてもよい。

0184

好都合な点として、そのようなワクチンは、Tacson et al.、またはHuygen et al. 1996年に、あるいは代わりにDavis et al.、国際公開第WO95/011307号に記載された技術によって調製される。

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