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技術 抗−CD43抗体およびその癌治療用途

出願人 アプロゲン・ケーアイシー・インコーポレイテッド
発明者 ホン,クォンピョユン,サンスンカウカウラス,アイリンバトリ,ビンセントクリスティアーノ,ブリオニーウィルソン・ジュニア,デイビッド・エスカップシダス,ジョージ
出願日 2016年10月12日 (3年4ヶ月経過) 出願番号 2018-538512
公開日 2018年11月22日 (1年3ヶ月経過) 公開番号 2018-534360
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 繰り返し頻度 標識子 青色線 差別性 転写物質 白ネズミ 脱水過程 灰色領域
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この項目の情報は公開日時点(2018年11月22日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

癌治療用抗体に関し、CD43の細胞外領域に結合する抗−CD43抗体、これを有効成分として含む抗癌組成物癌幹細胞阻害組成物、および癌幹細胞阻害剤スクリーニング方法が提供される。

概要

背景

CD43は、赤血球を除いた多くの造血細胞発現する細胞表面蛋白質である。ヒトCD43、sialophorinまたはleukosialinとして知られている、は、235個のアミノ酸から構成されたmucine−like細胞外ドメイン、23個のアミノ酸からなる膜透過ドメイン、そして123個のアミノ酸から構成された細胞質内ドメインからなり、関連する遺伝情報は1つのエクソンに暗号化されている。ヒトCD43の細胞外ドメインには多くのセリン(46残基)とトレオニン(47残基)アミノ酸があり、そのアミノ酸の大部分がO−linked糖鎖(O−糖鎖)を保有している。付加的に、CD43にN−糖鎖も連結されている。O−糖鎖の構造は、細胞類型によって差が大きいことが知られている。CD43は、378個の塩基対からなるイントロンでエクソンを2つに区分することができ、2番目のエクソンに全体転写物質情報が暗号化されている。

CD43は、1つのN−糖鎖を含めて約40kDaに達する前駆物質に合成され、連続的な成熟糖化過程を経て115kDa〜200kDaに達する物質転換される。厳格に調節される転写後の糖化過程は、類型によって特徴的な分子同型蛋白質を形成し、これは、細胞の類型によって異なって発現できる。

CD43の糖化抗原決定部位は、最近、白血球に制限された特異的標識子として知られており、血液癌腫標識子としての特異的な有用性究明された。その理由から、多くの研究において、CD43糖化抗原決定部位に結合する抗体の診断または治療目的の使用可能性が探られた。CD43を認知するげっ歯類単クローン抗体は、CD34過発現系統標識子の陰性骨髄造血幹細胞(Bazil et al.(1996)Blood,87(4):1272−81)とヒトT−リンパ芽球性細胞(Brown et al.
(1996)J.Biol.Chem.271:27686−95)で細胞自滅死を誘導することが知られた。しかし、このような抗体は、ほとんど成熟した(非癌腫)造血細胞で発現するCD43の細胞外ドメインに位置した糖鎖抗原決定部位と反応するため、癌細胞の検出または治療に効果的でない。したがって、血液癌腫の診断、追跡、治療のために、より改善されたCD43糖化抗原決定部位結合物質の開発が必要である。

一方、癌の発生と再発に異常な幹細胞が位階的に(hierarchical model)関与するという癌幹細胞(cancer stem cell)の仮説が知られている。

人体のすべての組織は、器官特有の幹細胞(organ−specific stem cells)に起源する。器官特有の幹細胞は自己再生(self−renewal)可能であり、各器官を構成するすべての細胞に分化(differentiation)する能力を有している。このような器官特有の幹細胞は、分化の形態が主に定められた器官内の細胞形態にのみ分化できる点で、胚芽幹細胞と区別される。

癌幹細胞の仮説は大きく2つの構成要素からなるが、第一、腫瘍は組織の幹細胞から発生することと、第二、その細胞から発生して構成された腫瘍は幹細胞の基本特性を有していなければならないことと、である。

癌幹細胞は、無制限の再生能力を有する癌細胞であって、免疫抑制ネズミ注入した時、高効率的に腫瘍を生成することができ、該形成された腫瘍では、原発腫瘍が有していた固有異質性(heterogeneity)がよく表現される細胞と定義される。

癌幹細胞の仮説は最近、幹細胞生物学の発達に伴ってより具体化され始めた。1997年、急性骨髄性白血病で癌幹細胞となり得る一端の細胞を免疫抑制ネズミに移植してヒトの白血病がネズミで再現されることが発表されるにつれ、癌幹細胞の仮説は一歩進むようになった(Bonnet D,Dick JE;Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.Nat Med1997;3:730−7)。

悪性腫瘍の示す多様な異質性が幹細胞の多様な分化性と一致し、多くの標的治療にもかかわらず、絶えず発現する癌細胞の薬物抵抗性も幹細胞の基本特性と一致する。癌幹細胞は、自己複製能力(self−renewal)によって新しい癌腫塊を形成し得ることから、癌幹細胞でない腫瘍細胞手術で完全に除去し抗癌化学治療を施しても、癌幹細胞が残っていれば癌は再び再発する。

したがって、癌を完全に治療するためには、癌幹細胞を阻害または除去する技術の開発が求められる。

概要

癌治療用抗体に関し、CD43の細胞外領域に結合する抗−CD43抗体、これを有効成分として含む抗癌組成物、癌幹細胞阻害用組成物、および癌幹細胞阻害剤スクリーニング方法が提供される。

目的

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位(epitope)に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む固形癌治療用薬学組成物を提供する

効果

実績

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請求項1

EQIDNO:131のアミノ酸配列を含み、SEQIDNO:134のアミノ酸配列内の連続する6〜9個のアミノ酸からなる抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を含む、固形癌治療用薬学組成物

請求項2

前記抗原決定部位は、SEQIDNO:131〜134の中から選択されたアミノ酸配列からなるものである、請求項1に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項3

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:110のCDR1H、SEQIDNO:113のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:120のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項1に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項4

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:121、122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項1に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項5

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、可変領域の糖化モチーフが修飾したものである、請求項1に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項6

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項5に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項7

前記固形癌は、胃癌乳癌肺癌大腸癌肝癌および胆嚢癌腎臓癌膵臓癌甲状腺癌前立腺癌卵巣癌子宮頸部癌、または膀胱癌である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項8

細胞毒性物質および標識物質からなる群より選択された1種以上を追加的に含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項9

前記細胞毒性物質は、リシン(ricin)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、モモジン(momordin)、デボウガニン(debouganin)、ジフテリア毒素シュードモナス毒素(pseudomonastoxin)、放射線同位元素デュオカルマイシン(duocarmycin)、モノメチルアウリスタチンE(monomethylauristatinE;MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(monomethylauristatinF;MMAF)、N2’−ジアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピルマイタンシン(N2’−deacetyl−N2’−(3−mercapto−1−oxopropyl)maytansine;DM1)、およびPBD(Pyrrolobenzodiazepine)dimerからなる群より選択された1種以上である、請求項8に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項10

固形癌の癌幹細胞阻害効果を有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の固形癌治療用薬学組成物。

請求項11

SEQIDNO:131のアミノ酸配列を含み、SEQIDNO:134のアミノ酸配列内の連続する6〜9個のアミノ酸からなる抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を含む、癌幹細胞阻害薬学組成物

請求項12

前記抗原決定部位は、SEQIDNO:131〜134の中から選択されたアミノ酸配列からなるものである、請求項11に記載の癌幹細胞阻害用薬学組成物。

請求項13

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:110のCDR1H、SEQIDNO:113のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:120のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項11に記載の癌幹細胞阻害用薬学組成物。

請求項14

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:121、122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項11に記載の癌幹細胞阻害用薬学組成物。

請求項15

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の糖化可能なアミノ酸残基が糖化されないアミノ酸残基に置換されたものである、請求項11に記載の癌幹細胞阻害用薬学組成物。

請求項16

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項15に記載の癌幹細胞阻害用薬学組成物。

請求項17

細胞毒性物質および標識物質からなる群より選択された1種以上を追加的に含む、請求項11〜16のいずれか1項に記載の癌幹細胞阻害用薬学組成物。

請求項18

前記細胞毒性物質は、リシン(ricin)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、モモルジン(momordin)、デボウガニン(debouganin)、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素(pseudomonastoxin)、放射線同位元素、デュオカルマイシン(duocarmycin)、モノメチルアウリスタチンE(monomethylauristatinE;MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(monomethylauristatinF;MMAF)、N2’−ジアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)マイタンシン(N2’−deacetyl−N2’−(3−mercapto−1−oxopropyl)maytansine;DM1)、およびPBD(Pyrrolobenzodiazepine)dimerからなる群より選択された1種以上である、請求項17に記載の癌幹細胞阻害用薬学組成物。

請求項19

前記癌幹細胞は、血液癌または固形癌の癌幹細胞である、請求項11〜16のいずれか1項に記載の癌幹細胞阻害用薬学組成物。

請求項20

SEQIDNO:131を含むSEQIDNO:134内の連続する6〜9個のアミノ酸からなる抗原決定部位に候補化合物を接触させる段階と、前記抗原決定部位に結合する候補化合物を選択して固形癌治療剤候補物質として決定する段階とを含む、固形癌治療剤のスクリーニング方法

請求項21

前記抗原決定部位は、SEQIDNO:131〜134の中から選択されたアミノ酸配列からなるものである、請求項20に記載の固形癌治療剤のスクリーニング方法。

請求項22

SEQIDNO:131を含むSEQIDNO:134内の連続する6〜9個のアミノ酸からなる抗原決定部位に候補化合物を接触させる段階と、前記抗原決定部位に結合する候補化合物を選択して固形癌の癌幹細胞阻害剤の候補物質として決定する段階とを含む、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。

請求項23

前記抗原決定部位は、SEQIDNO:131〜134の中から選択されたアミノ酸配列からなるものである、請求項22に記載の癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。

請求項24

前記癌幹細胞は、固形癌の癌幹細胞である、請求項22または23に記載の固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。

請求項25

SEQIDNO:131のアミノ酸配列を含み、SEQIDNO:134のアミノ酸配列内の連続する6〜9個のアミノ酸からなる抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者投与する段階を含む、固形癌の治療方法

請求項26

前記抗原決定部位は、SEQIDNO:131〜134の中から選択されたアミノ酸配列からなるものである、請求項25に記載の固形癌の治療方法。

請求項27

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:110のCDR1H、SEQIDNO:113のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:120のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項25に記載の固形癌の治療方法。

請求項28

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:121、122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項25に記載の固形癌の治療方法。

請求項29

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の糖化可能なアミノ酸残基が糖化されないアミノ酸残基に置換されたものである、請求項25に記載の固形癌の治療方法。

請求項30

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項29に記載の固形癌の治療方法。

請求項31

前記固形癌は、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌および胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、または膀胱癌である、請求項25に記載の固形癌の治療方法。

請求項32

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、細胞毒性物質および標識物質からなる群より選択された1種以上を追加的に含むものである、請求項25に記載の固形癌の治療方法。

請求項33

前記細胞毒性物質は、リシン(ricin)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、モモルジン(momordin)、デボウガニン(debouganin)、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素(pseudomonastoxin)、放射線同位元素、デュオカルマイシン(duocarmycin)、モノメチルアウリスタチンE(monomethylauristatinE;MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(monomethylauristatinF;MMAF)、N2’−ジアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)マイタンシン(N2’−deacetyl−N2’−(3−mercapto−1−oxopropyl)maytansine;DM1)、およびPBD(Pyrrolobenzodiazepine)dimerからなる群より選択された1種以上である、請求項32に記載の固形癌の治療方法。

請求項34

固形癌の癌幹細胞阻害効果を有することを特徴とする、請求項25に記載の固形癌の治療方法。

請求項35

SEQIDNO:131のアミノ酸配列を含み、SEQIDNO:134のアミノ酸配列内の連続する6〜9個のアミノ酸からなる抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌幹細胞阻害を必要とする患者に投与する段階を含む、癌幹細胞阻害方法

請求項36

前記抗原決定部位は、SEQIDNO:131〜134の中から選択されたアミノ酸配列からなるものである、請求項35に記載の癌幹細胞阻害方法。

請求項37

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:110のCDR1H、SEQIDNO:113のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:120のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項35に記載の癌幹細胞阻害方法。

請求項38

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:121、122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項35に記載の癌幹細胞阻害方法。

請求項39

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の糖化可能なアミノ酸残基が糖化されないアミノ酸残基に置換されたものである、請求項35に記載の癌幹細胞阻害方法。

請求項40

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項39に記載の癌幹細胞阻害方法。

請求項41

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、細胞毒性物質および標識物質からなる群より選択された1種以上を追加的に含むものである、請求項35に記載の癌幹細胞阻害方法。

請求項42

前記細胞毒性物質は、リシン(ricin)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、モモルジン(momordin)、デボウガニン(debouganin)、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素(pseudomonastoxin)、放射線同位元素、デュオカルマイシン(duocarmycin)、モノメチルアウリスタチンE(monomethylauristatinE;MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(monomethylauristatinF;MMAF)、N2’−ジアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)マイタンシン(N2’−deacetyl−N2’−(3−mercapto−1−oxopropyl)maytansine;DM1)、およびPBD(Pyrrolobenzodiazepine)dimerからなる群より選択された1種以上である、請求項41に記載の癌幹細胞阻害方法。

請求項43

SEQIDNO:110のCDR1H、SEQIDNO:113のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:120のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含む、抗−CD43抗体またはその抗原結合断片。

請求項44

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:121、122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項43に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片。

請求項45

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の糖化可能なアミノ酸残基が糖化されないアミノ酸残基に置換されたものである、請求項43に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片。

請求項46

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:111または112のCDR1H、SEQIDNO:114、115、116、または117のCDR2H、SEQIDNO:118のCDR3H、SEQIDNO:119のCDR1L、SEQIDNO:122、123、または124のCDR2L、およびSEQIDNO:125のCDR3Lを含むものである、請求項45に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片。

請求項47

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、または94の重鎖可変領域;およびSEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、または109の軽鎖可変領域を含むものである、請求項43に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片。

請求項48

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、動物由来抗体、キメリック抗体、またはヒト化抗体である、請求項43〜47のいずれか1項に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片。

請求項49

前記抗原結合断片は、抗原のFab、F(ab)2、Fv、scFv、およびscFv−Fc断片の中から選択されたものである、請求項43〜47のいずれか1項に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片。

請求項50

請求項43〜47のいずれか1項に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片;および細胞毒性物質および標識物質からなる群より選択された1種以上を含む接合体

請求項51

前記細胞毒性物質は、リシン(ricin)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、モモルジン(momordin)、デボウガニン(debouganin)、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素(pseudomonastoxin)、放射線同位元素、デュオカルマイシン(duocarmycin)、モノメチルアウリスタチンE(monomethylauristatinE;MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(monomethylauristatinF;MMAF)、N2’−ジアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)マイタンシン(N2’−deacetyl−N2’−(3−mercapto−1−oxopropyl)maytansine;DM1)、およびPBD(Pyrrolobenzodiazepine)dimerからなる群より選択された1種以上である、請求項50に記載の接合体。

請求項52

請求項43〜47のいずれか1項に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物。

請求項53

前記薬学組成物は、抗癌剤である、請求項52に記載の薬学組成物。

請求項54

前記抗癌剤は、血液癌(hematopoieticmalignancy)に対する抗癌活性を有するものである、請求項53に記載の薬学組成物。

請求項55

前記血液癌は、急性骨髄球性白血病(acutemyeloidleukemia)、急性リンパ球性白血病(acutelymphoblasticleukemia)、急性単球性白血病(acutemonocyticleukemia)、またはホジキンリンパ腫(Hodgkin’slymphoma)、非ホジキンリンパ腫(non−Hodgkin’slymphoma)である、請求項55に記載の薬学組成物。

請求項56

請求項51に記載の接合体および薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物。

請求項57

前記薬学組成物は、抗癌剤である、請求項56に記載の薬学組成物。

請求項58

前記抗癌剤は、血液癌(hematopoieticmalignancy)に対する抗癌活性を有するものである、請求項57に記載の薬学組成物。

請求項59

前記血液癌は、急性骨髄球性白血病(acutemyeloidleukemia)、急性リンパ球性白血病(acutelymphoblasticleukemia)、急性単球性白血病(acutemonocyticleukemia)、またはホジキンリンパ腫(Hodgkin’slymphoma)、非ホジキンリンパ腫(non−Hodgkin’slymphoma)である、請求項58に記載の薬学組成物。

請求項60

請求項43に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を癌患者に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法。

請求項61

前記癌患者は、血液癌(hematopoieticmalignancy)患者である、請求項60に記載の癌の予防または治療方法。

請求項62

前記血液癌は、急性骨髄球性白血病(acutemyeloidleukemia)、急性リンパ球性白血病(acutelymphoblasticleukemia)、急性単球性白血病(acutemonocyticleukemia)、またはホジキンリンパ腫(Hodgkin’slymphoma)、非ホジキンリンパ腫(non−Hodgkin’slymphoma)である、請求項61に記載の癌の予防または治療方法。

請求項63

請求項51に記載の接合体を癌患者に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法。

請求項64

前記癌患者は、血液癌(hematopoieticmalignancy)患者である、請求項63に記載の癌の予防または治療方法。

請求項65

前記血液癌は、急性骨髄球性白血病(acutemyeloidleukemia)、急性リンパ球性白血病(acutelymphoblasticleukemia)、急性単球性白血病(acutemonocyticleukemia)、またはホジキンリンパ腫(Hodgkin’slymphoma)、非ホジキンリンパ腫(non−Hodgkin’slymphoma)である、請求項64に記載の癌の予防または治療方法。

請求項66

請求項43〜47のいずれか1項に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子

請求項67

請求項66に記載の核酸分子を含む組換えベクター

請求項68

請求項67に記載の組換えベクターを含む組換え細胞

請求項69

請求項68に記載の組換えベクターを培養する段階を含む、請求項43〜47のいずれか1項に記載の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の製造方法。

技術分野

0001

CD43の細胞外領域に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片、抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌治療用組成物、CD43の細胞外領域に結合する抗−CD43抗体を有効成分として含む癌幹細胞阻害組成物、および癌幹細胞阻害剤スクリーニング方法が提供される。

背景技術

0002

CD43は、赤血球を除いた多くの造血細胞発現する細胞表面蛋白質である。ヒトCD43、sialophorinまたはleukosialinとして知られている、は、235個のアミノ酸から構成されたmucine−like細胞外ドメイン、23個のアミノ酸からなる膜透過ドメイン、そして123個のアミノ酸から構成された細胞質内ドメインからなり、関連する遺伝情報は1つのエクソンに暗号化されている。ヒトCD43の細胞外ドメインには多くのセリン(46残基)とトレオニン(47残基)アミノ酸があり、そのアミノ酸の大部分がO−linked糖鎖(O−糖鎖)を保有している。付加的に、CD43にN−糖鎖も連結されている。O−糖鎖の構造は、細胞類型によって差が大きいことが知られている。CD43は、378個の塩基対からなるイントロンでエクソンを2つに区分することができ、2番目のエクソンに全体転写物質情報が暗号化されている。

0003

CD43は、1つのN−糖鎖を含めて約40kDaに達する前駆物質に合成され、連続的な成熟糖化過程を経て115kDa〜200kDaに達する物質転換される。厳格に調節される転写後の糖化過程は、類型によって特徴的な分子同型蛋白質を形成し、これは、細胞の類型によって異なって発現できる。

0004

CD43の糖化抗原決定部位は、最近、白血球に制限された特異的標識子として知られており、血液癌腫標識子としての特異的な有用性究明された。その理由から、多くの研究において、CD43糖化抗原決定部位に結合する抗体の診断または治療目的の使用可能性が探られた。CD43を認知するげっ歯類単クローン抗体は、CD34過発現系統標識子の陰性骨髄造血幹細胞(Bazil et al.(1996)Blood,87(4):1272−81)とヒトT−リンパ芽球性細胞(Brown et al.
(1996)J.Biol.Chem.271:27686−95)で細胞自滅死を誘導することが知られた。しかし、このような抗体は、ほとんど成熟した(非癌腫)造血細胞で発現するCD43の細胞外ドメインに位置した糖鎖抗原決定部位と反応するため、癌細胞の検出または治療に効果的でない。したがって、血液癌腫の診断、追跡、治療のために、より改善されたCD43糖化抗原決定部位結合物質の開発が必要である。

0005

一方、癌の発生と再発に異常な幹細胞が位階的に(hierarchical model)関与するという癌幹細胞(cancer stem cell)の仮説が知られている。

0006

人体のすべての組織は、器官特有の幹細胞(organ−specific stem cells)に起源する。器官特有の幹細胞は自己再生(self−renewal)可能であり、各器官を構成するすべての細胞に分化(differentiation)する能力を有している。このような器官特有の幹細胞は、分化の形態が主に定められた器官内の細胞形態にのみ分化できる点で、胚芽幹細胞と区別される。

0007

癌幹細胞の仮説は大きく2つの構成要素からなるが、第一、腫瘍は組織の幹細胞から発生することと、第二、その細胞から発生して構成された腫瘍は幹細胞の基本特性を有していなければならないことと、である。

0008

癌幹細胞は、無制限の再生能力を有する癌細胞であって、免疫抑制ネズミ注入した時、高効率的に腫瘍を生成することができ、該形成された腫瘍では、原発腫瘍が有していた固有異質性(heterogeneity)がよく表現される細胞と定義される。

0009

癌幹細胞の仮説は最近、幹細胞生物学の発達に伴ってより具体化され始めた。1997年、急性骨髄性白血病で癌幹細胞となり得る一端の細胞を免疫抑制ネズミに移植してヒトの白血病がネズミで再現されることが発表されるにつれ、癌幹細胞の仮説は一歩進むようになった(Bonnet D,Dick JE;Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.Nat Med1997;3:730−7)。

0010

悪性腫瘍の示す多様な異質性が幹細胞の多様な分化性と一致し、多くの標的治療にもかかわらず、絶えず発現する癌細胞の薬物抵抗性も幹細胞の基本特性と一致する。癌幹細胞は、自己複製能力(self−renewal)によって新しい癌腫塊を形成し得ることから、癌幹細胞でない腫瘍細胞手術で完全に除去し抗癌化学治療を施しても、癌幹細胞が残っていれば癌は再び再発する。

0011

したがって、癌を完全に治療するためには、癌幹細胞を阻害または除去する技術の開発が求められる。

発明が解決しようとする課題

0012

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位(epitope)に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む固形癌治療用薬学組成物を提供する。

0013

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする対象(患者)に投与する段階を含む固形癌の治療方法を提供する。

0014

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の固形癌の治療のための用途を提供する。

0015

前記抗原決定部位は、SEQID NO:131のアミノ酸配列を含むCD43の細胞外領域内の連続する6〜9個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、先に説明した抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。

0016

前記固形癌の治療のための薬学組成物、方法、および用途は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の阻害効果を有することを特徴とするものであってもよい。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよく、前記血液癌は、白血病であってもよい。

0017

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。

0018

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害方法を提供する。

0019

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害のための用途を提供する。

0020

前記抗原決定部位は、SEQID NO:131のアミノ酸配列を含むCD43の細胞外領域内の連続する6〜9個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、先に説明した抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。

0021

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片と癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞が結合された接合体を提供する。他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を癌試料、例えば、固形癌試料または癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む抗−CD43抗体またはその抗原結合断片と癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞が結合された接合体を生成する方法を提供する。前記接合体またはこれを生成する方法は、癌の治療だけでなく、多様な臨床的、診断的、および/または実験的目的で使用可能である。

0022

他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位を含む固形癌治療剤スクリーニングのための製剤を提供する。他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位を用いる固形癌治療剤のスクリーニング方法を提供する。他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位の固形癌治療剤のスクリーニングのための用途を提供する。前記抗原決定部位は、SEQID NO:131のアミノ酸配列を含むCD43の細胞外領域内の連続する6〜9個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の阻害効果を有することを特徴とするものであってもよい。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。

0023

他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニングのための製剤を提供する。他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位を用いる癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法を提供する。他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニングのための用途を提供する。前記抗原決定部位は、SEQID NO:131のアミノ酸配列を含むCD43の細胞外領域内の連続する6〜9個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。

0024

他の例は、新規な抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位(epitope)に結合するものであってもよい。前記抗原決定部位は、SEQID NO:131のアミノ酸配列を含むCD43の細胞外領域内の連続する6〜9個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。

0025

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域(Heavy chain variable region;VH)および軽鎖可変領域(Light chain variable region;VL)を含む。

0026

前記重鎖可変領域は、N−末端からC−末端方向に順次に、第1相補性決定部位(complementarity determining region;CDR)(CDR1H)、第2CDR(CDR2H)、および第3CDR(CDR3H)を含むことができる。

0027

一例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域の必須成分として、GYX1MN(SEQID NO:110;X1は、すべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、FまたはYであってもよい)のアミノ酸配列(例えば、GYFMN(SEQ ID NO:111)またはGYYMN(SEQ ID NO:112))を含むCDR1H、RINPNX2GDSFYNQKFX3G(SEQ ID NO:113;X2およびX3は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、X2は、NまたはSであり、X3は、QまたはKである)のアミノ酸配列(例えば、RINPNNGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:114)、RINPNSGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:115)、RINPNNGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:116)、またはRINPNSGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:117))を含むCDR2H、およびEGYYGGRGYALDY(SEQ ID NO:118)のアミノ酸配列を含むCDR3Hを含むことができる。

0028

前記軽鎖可変領域は、N−末端からC−末端方向に順次に、第1CDR(CDR1L)、第2CDR(CDR2L)、および第3CDR(CDR3L)を含むことができる。

0029

一例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の必須成分として、RTSQDISNYLN(SEQID NO:119)のアミノ酸配列を含むCDR1L;X4TX5RLHS(SEQ ID NO:120;X4およびX5は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されてもよいし、例えば、X4は、N、Q、またはAであり、X5は、SまたはAである)のアミノ酸配列(例えば、NTSRLHS(SEQ ID NO:121、NTARLHS(SEQ ID NO:122)、QTSRLHS(SEQ ID NO:123)、またはATSRLHS(SEQ ID NO:124))のアミノ酸配列を含むCDR2L;およびQQSNMFPY(SEQ ID NO:125)のアミノ酸配列を含むCDR3Lを含むことができる。

0030

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容可能な担体を含む癌の予防および/または治療用薬学組成物を提供する。

0031

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を癌の予防および/または治療を必要とする患者に投与する段階を含む癌の予防および/または治療方法を提供する。

0032

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の癌の予防および/または治療、または抗癌剤の製造に用いるための用途を提供する。

0033

一具体例において、前記癌の予防および/または治療用薬学組成物、方法、および用途において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、単独有効成分として提供されたり、抗癌剤などの細胞毒性物質併用投与されたり、抗癌剤などの細胞毒性物質と接合された接合体(antibody−drug conjugate;ADC)形態で提供される。

0034

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を用いて試料における癌細胞の検出方法を提供する。前記検出方法は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を試料に接触させる段階と、前記試料における抗原−抗体反応を検出する段階とを含むことができる。

0035

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子を提供する。

0036

他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、前記核酸分子を宿主細胞で発現させるための発現ベクターとして使用できる。

0037

他の例は、前記核酸分子または前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、前記核酸分子または前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換させて得られたものであってもよい。

0038

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含むことができる。前記発現させる段階は、前記組換え細胞を培養する段階を含むことができ、任意に、前記得られた細胞培養物から抗体を分離および/または精製する段階を追加的に含むことができる。

0039

一具体例において、前記製造方法は次を含む:
(a)前記核酸分子または前記組換えベクターで形質転換された組換え細胞を準備する段階と、
(b)前記核酸分子の十分な発現のための条件および/または期間で前記組換え細胞を培養する段階と、
(c)前記(c)段階で得られた培養物から抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を分離および/または精製する段階。

課題を解決するための手段

0040

前記のように、癌を完全に治療するためには、癌幹細胞を阻害または除去する技術の開発が必要であり、そのためには、癌幹細胞を他の細胞から分離できる癌幹細胞標識子を選定する過程が必要である。

0041

本発明において、CD43が癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞表面に発現することが最初に提案される。CD43は、赤血球を除いた大部分の白血球と造血幹細胞血小板に制限的な特定の白血球マーカーとして知られていたが、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞に発現するという事実はまだ知られていない。

0042

また、CD43の細胞外領域のうち特定部位を特異的に認識および/または結合する抗−CD43抗体が癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害効能を有することが提案される。

0043

CD43(cluster of differentiation43)は、Leukosialinまたはsialophorinとも呼ばれ、赤血球を除いた大部分の造血細胞表面に発現する主要膜通過蛋白質(transmembrane protein)である。前記CD43は、ヒト(Homo sapiens)などの霊長類マウス(Mus musculus)などのげっ歯類などを含む哺乳類由来するものであってもよい。例えば、前記CD43は、ヒトCD43(例えば、NCBI Accession No.AAA51949.1(遺伝子(mRNA):M61827.1)、NP_001025459.1(遺伝子(mRNA):NM_001030288.1)、NP_003114.1(遺伝子:NM_003123.3)など)、マウスCD43(例えば、NCBI Accession No.NP_001032899.1(遺伝子:NM_001037810.1)、NP_033285.1(遺伝子:NM_009259.4)など)などであってもよい。この例において、前記CD43は、ヒトCD43(蛋白質:NCBI Accession No.AAA51949.1(SEQID NO:130);遺伝子(mRNA):M61827.1)であってもよい。

0044

本発明の一例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位(epitope)に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。

0045

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者に投与する段階を含む固形癌の治療方法を提供する。

0046

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の固形癌の治療のための用途を提供する。

0047

前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害活性を示すことを特徴とする。

0048

したがって、本発明の他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。

0049

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害方法を提供する。

0050

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害のための用途を提供する。

0051

本明細書において、別途の定義がない限り、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位(epitope)は、SEQID NO:131のアミノ酸配列を含むCD43の細胞外領域内の連続する6〜9個のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味するものであってもよい。

0052

SEQID NO:131:Pro Leu Trp Thr Ser Ile

0053

前記抗原決定部位は、CD43蛋白質の細胞外領域に位置しかつ、正常状態では外部環境露出していないが、細胞が癌細胞化されたり癌幹細胞化されると外部に露出するものであってもよい。したがって、前記抗原決定部位を特異的に認識したり、および/またはこれに特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合断片は、癌細胞および/または癌幹細胞を特異的に標的化および/または阻害するものであってもよい。

0054

前記抗原決定部位が位置するCD43の細胞外領域は、CD43(AAA51949.1;SEQID NO:130)の73番目から81番目までのアミノ酸部位(SEQ ID NO:134)であってもよい。したがって、前記抗原決定部位は、CD43(AAA51949.1)中のSEQ ID NO:134内のSEQ ID NO:131を含む連続する6個〜9個のアミノ酸配列部位であってもよい。

0055

前記抗原決定部位は、SEQID NO:131〜134からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよいし、例えば、SEQ ID NO:134のアミノ酸配列を有するものであってもよい:

0056

SEQID NO:132:Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile
SEQ ID NO:133:Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile
SEQ ID NO:134:Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile

0057

本発明の抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、先に説明した抗原結合部位を認識したり、これに特異的に結合するすべての抗体または抗原結合断片からなる群より選択された1種以上であってもよい。

0058

本明細書において、用語「JL−1」は、CD43または前記のようなCD43の抗原決定部位を意味するために使用される。

0059

本発明において、抗体またはその抗原結合断片は、動物由来抗体、キメリック抗体、ヒト化抗体ヒト抗体、およびこれらの抗原結合断片からなる群より選択されたものであってもよい。前記抗体は、組換え的または合成的に生産されたものであってもよい。

0060

所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般に治療目的でヒトに投与時に免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制すべくキメリック抗体(chimeric antibody)が開発された。キメリック抗体は、遺伝工学的方法を利用して抗−アイソタイプ(anti−isotype)反応の原因となる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメリック抗体は、動物由来抗体に比べて抗−アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来アミノ酸が可変領域に存在していて、潜在的な抗−イディオタイプ(anti−idiotypic)反応に対する副作用を内包している。このような副作用を改善すべく開発されたものがヒト化抗体(humanized antibody)である。これは、キメリック抗体の可変領域のうち抗原の結合に重要な役割を果たすCDR(complementaritiy determining regions)部位をヒト抗体骨格(framework)に移植して作製される。

0061

ヒト化抗体を作製するためのCDR移植(grafting)技術において最も重要なのは、動物由来抗体のCDR部位を最もよく受け入れられる最適化したヒト抗体を選定するものであり、そのために、抗体データベース活用結晶構造(crystal structure)の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化したヒト抗体骨格に動物由来抗体のCDR部位を移植しても、動物由来抗体の骨格に位置しかつ、抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸が存在する場合があるため、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在するので、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須といえる。

0062

前記抗体または抗原結合断片は、生体から分離された(生体に存在しない)もの、または非自然的に生産(non−naturally occurring)されたものであってもよいし、例えば、合成的または組換え的に生産されたものであってもよい。

0063

本発明において、「抗体」とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、その種類は特に制限されず、自然的または非自然的(例えば、合成的または組換え的)に得られる。抗体は、生体外のみならず、生体内でも非常に安定し半減期が長いため、大量発現および生産に有利である。また、抗体は本質的にダイマー(dimer)構造を有するため、接着能(avidity)が非常に高い。

0064

完全な抗体は、2個の全長(full length)軽鎖および2個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)、およびエプシロン(ε)タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ1(γ1)、ガンマ2(γ2)、ガンマ3(γ3)、ガンマ4(γ4)、アルファ1(α1)およびアルファ2(α2)を有する。軽鎖の不変領域は、カッパκ)およびラムダ(λ)タイプを有する。

0065

用語、「重鎖(heavy chain)」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVHおよび3個の不変領域ドメインCH1、CH2およびCH3とヒンジ(hinge)を含む全長重鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖(light chain)」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVLおよび不変領域ドメインCLを含む全長軽鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。

0066

用語、「CDR(complementarity determining region)」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域(hypervariable region)のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ3個のCDRを含むことができる(CDRH1、CDRH2、CDRH3およびCDRL1、CDRL2、CDRL3)。前記CDRは、抗体が抗原または抗原決定部位に結合するにあたって主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語、「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常公知となっている意味と同一のものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。

0067

用語、「抗原結合断片」は、免疫グロブリンの全体構造に対するその断片で、抗原が結合可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、scFv、(scFv)2、scFv−Fc、Fab、Fab’またはF(ab’)2であってもよいが、これに限定されない。

0068

前記抗原結合断片のうち、Fabは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域、および重鎖の最初の不変領域(CH1)を有する構造で1個の抗原結合部位を有する。Fab’は、重鎖のCH1ドメインのC−末端に1つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域(hinge region)を有する点でFabと差がある。F(ab’)2抗体は、Fab’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Fvは、重鎖可変領域および軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体片で、Fv断片を生成する組換え技術は当業界で幅広く公知である。二重鎖Fv(two−chain Fv)は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Fv(single−chain Fv)は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されたり、またはC−末端で直接連結されていて、二重鎖Fvと同じくダイマーのような構造をなすことができる。前記リンカーは、1〜100個または2〜50個の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよいし、当業界に適切な配列が知られている。前記抗原結合断片は、蛋白質加水分解酵素を用いて得ることができ(例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればFabを得ることができ、ペプシンで切断するとF(ab’)2断片を得ることができる)、遺伝子組換え技術により作製することができる。

0069

用語「ヒンジ領域(hinge region)」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、CH1およびCH2領域の間に存在し、抗体内の抗原結合部位の柔軟性(flexibility)を提供する機能をする領域を意味する。例えば、前記ヒンジは、ヒト抗体に由来するものであってもよいし、具体的には、IgAIgE、またはIgG、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4に由来するものであってもよい。

0070

抗−CD43抗体は、多クローン抗体または単クローン抗体でもよいし、例えば、単クローン抗体であってよい。単クローン抗体は、当業界で広く知られた方法通りに製造される。例えば、phage display手法を用いて製造される。

0071

一方、典型的なELISA(Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)フォーマットを用いて、CD43との結合能に基づいて個別単クローン抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競争的ELISA(Competitive ELISA)、細胞−基盤分析(cell−based assay)、Scatchard analysis、またはsurface plasmon resonanceなどのような機能性分析により阻害活性に対して検定することができる。その後、強い阻害活性に基づいて選択された単クローン抗体メンバーに対して、CD43に対するそれぞれの親和度(Kd values)を検定することができる。

0072

例えば、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、CD43(例えば、ヒトCD43、マウスCD43など)またはCD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に対する結合親和度(Kd;例えば、Scatchard analysisで測定)が1mM以下、100nM以下、10nM以下、5nM以下、または3nM以下であってもよいし、例えば、1pM〜1mM、1pM〜100nM、1pM〜10nM、1pM〜5nM、1pM〜3nM、10pM〜1mM、10pM〜100nM、10pM〜10nM、10pM〜5nM、10pM〜3nM、100pM〜1mM、100pM〜100nM、100pM〜10nM、100pM〜5nM、100pM〜3nM、1nM〜1mM、1nM〜100nM、1nM〜10nM、1nM〜5nM、または1nM〜3nMであってもよい。

0073

他の例は、前記抗−CD43抗体の単クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を提供する。前記ハイブリドーマ細胞株は、受託番号KCLRF−BP−00010のH−JL1細胞株であってもよい。

0074

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上と共に適用可能である。

0075

したがって、前記薬学組成物は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片に加えて、細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上を追加的に含むものであってもよい。また、前記治療、または阻害方法は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を投与する段階に加えて、細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上を投与する段階を追加的に含むことができる。

0076

具体的には、本発明の他の例は、(1)CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位(epitope)に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片、および(2)細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。

0077

他の例は、(1)CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者に投与する段階と、(2)細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者に投与する段階とを含む固形癌の治療方法を提供する。

0078

他の例は、(i)CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片、および(ii)細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上を有効成分として含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。

0079

他の例は、(i)CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階と、(ii)細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階とを含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。

0080

前記薬学組成物において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片と細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上は、互いに接合(conjugate)または混合されて1つの製剤に剤形化されたり、それぞれ別個の製剤に剤形化されて混合されたものであってもよい。前記方法において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を投与する段階と、細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上を投与する段階は、同時または順序に関係なく順次に行われる。

0081

前記細胞毒性物質は、癌細胞、特に固形癌細胞に対して毒性を有するすべての物質であってもよいし、放射線同位元素細胞毒素化合物(small molecule)、細胞毒性蛋白質、抗癌剤などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記細胞毒素蛋白質は、リシン(ricin)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、モモジン(momordin)、デボウガニン(debouganin)、ジフテリア毒素シュードモナス毒素(pseudomonas toxin)などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記放射線同位元素としては、131I、188Rh、90Yなどからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記細胞毒素化合物は、デュオカルマイシン(duocarmycin)、モノメチルアウリスタチンE(monomethyl auristatin E;MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(monomethyl auristatin F;MMAF)、N2’−ジアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピルマイタンシン(N2’−deacetyl−N2’−(3−mercapto−1−oxopropyl)maytansine;DM1)、PBD(Pyrrolobenzodiazepine)dimerなどからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。

0082

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片と前記細胞毒性物質などからなる群より選択された1種以上は、互いに結合(例えば、共有結合、ペプチド結合などによる)されて接合体(conjugate)または融合蛋白質(細胞毒性物質および/または標識物質が蛋白質の場合)の形態で使用できる。前記抗体(または抗原結合断片)と細胞毒性物質の結合は、本発明の属する技術分野でよく知られた技術によるものであってもよい。

0083

前記有効成分(抗−CD43抗体またはその抗原結合断片、および/または細胞毒性物質および/または標識物質)は、薬学的に許容可能な担体と共に適用(投与)可能であり、前記薬学的に許容可能な担体は、薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトースデキストローススクロースソルビトールマンニトールデンプンアカシアガムリン酸カルシウムアルギネートゼラチンケイ酸カルシウム微細結晶セルロースポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップメチルセルロースメチルヒドロキシベンゾエートプロピルヒドロキシベンゾエート滑石ステアリン酸マグネシウムミネラルオイルなどからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。前記抗−CD43抗体は、前記成分のほか、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤賦形剤潤滑剤、湿潤剤甘味剤香味剤乳化剤懸濁剤保存剤などからなる群より選択された1種以上を追加的に含むことができる。

0084

前記有効成分または薬学組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入皮下注入筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与鼻内投与肺内投与、または直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、蛋白質またはペプチド消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤コーティングしたり、での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、活性物質標的細胞に移動可能な任意の装置によって投与される。

0085

本明細書において、「薬学的有効量」は、薬物が薬学的に意味のある効果を奏し得る量を意味する。1回投与のための有効成分の薬学的有効量は、製剤化方法投与方式、患者の年令、体重、性、病的状態食べ物、投与時間、投与間隔投与経路排泄速度および反応感応性のような要因に応じて多様に処方される。例えば、1回投与のための有効成分(例えば、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片)の薬学的有効量は、0.001〜100mg/kg、または0.02〜10mg/kgの範囲であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記1回投与のための薬学的有効量は、単位用量形態で1つの製剤に製剤化されたり、適切に分量して製剤化されたり、多用量容器内に入れて製造される。

0086

前記固形癌は、血液癌以外のすべての非血液癌を意味するものであってもよい。例えば、前記固形癌は、肺癌(例えば、扁平上皮細胞癌小細胞肺癌非小細胞肺癌腺癌、肺の扁平上皮癌)、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫尿道癌、胃腸癌、胃癌、膵臓癌膠芽腫頸部癌卵巣癌肝癌胆嚢癌膀胱癌乳癌結腸癌大腸癌子宮癌子宮内膜癌子宮頸部癌唾液腺癌、腎臓癌前立腺癌陰門癌、甲状腺癌頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。例えば、前記固形癌は、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、前立腺癌、または膀胱癌であってもよい。前記癌は、原発性癌だけでなく、転移性癌も含む。また、前記固形癌は、既存の抗癌剤(e.g.,小分子抗癌剤(anticancer chemical)、抗代謝剤アルキル化剤抗生剤ビンカアルカロイド酵素ホルモン剤標的治療剤、および/または抗体治療剤など)に対して抵抗性を有する癌であってもよく、既存の抗癌剤(e.g.,小分子抗癌剤(anticancer chemical)、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生剤、ビンカアルカロイド、酵素、ホルモン剤、標的治療剤、および/または抗体治療剤など)の治療後に再発した癌であってもよい。

0087

前記固形癌の治療効果は、癌細胞(特に、癌幹細胞)またはこれを含む癌組織成長抑制(量的減少)、死滅(apoptosis)効果だけでなく、移動(migration)、侵襲(invasion)、転移(metastasis)などを抑制して、これによる癌の悪化を抑制する効果を含む。

0088

本明細書において、「癌幹細胞阻害」は、癌幹細胞の成長抑制(量的減少)、死滅(apoptosis)などのすべての癌幹細胞の量的および/または機能的阻害、および/またはこれにより前記癌幹細胞が関与する癌の治療および/または改善を意味する。

0089

本明細書において、「患者」は、癌(例えば、固形癌または血液癌)の治療、および/または癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の阻害を必要とする患者を意味するもので、すべての哺乳類、例えば、ヒトであってもよく、癌に苦しめられていたり、癌の症状を持ったり、癌発病の危険がある患者、またはこれから分離された細胞、組織、体液またはその培養物であってもよい。

0090

他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片と癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞が結合された接合体を提供する。他の例は、CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を生体から分離された癌試料、例えば、固形癌試料に接触させたり、または癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む抗−CD43抗体またはその抗原結合断片と癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞が結合された接合体を生成する方法を提供する。前記方法は、生体内または生体外で行われるものであってもよい。前記接合体またはこれを生成する方法は、固形癌の治療だけでなく、多様な臨床的、診断的、および/または実験的目的で使用可能である。例えば、癌試料に抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を接触時、接合体生成の有無を検出して癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の存在の有無を確認および/または癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞可視化のための用途に使用可能である。この時、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、標識物質を追加的に含むものであってもよい。前記標識物質は、放射線同位元素、蛍光物質クロモゲン(chromogen)、染色物質などからなる群より選択された1種以上であってもよい。前記蛍光物質は、通常使用可能なすべての蛍光物質であってもよいし、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate:FITC)、フィコエリスリン(phycoerythrin:PE)、アロフィコシアニン(allophycocyanin、APC)、またはビオチン(biotin)などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記標識物質は、前記抗体または抗原結合断片に通常の方法(例えば、共有結合、配位結合イオン結合などの化学結合)で結合(連結)されたものであってもよい。前記抗体(または抗原結合断片)と標識物質の結合は、本発明の属する技術分野でよく知られた技術によるものであってもよい。

0091

前記癌試料は、癌細胞株、または癌患者から分離されたり人工的に培養された細胞、組織、体液などであってもよい。前記固形癌試料は、固形癌細胞株、または固形癌患者から分離されたり人工的に培養された細胞、組織、体液などであってもよい。

0092

他の例は、CD43、具体的にはCD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞検出のためのマーカーとしての用途を提供する。具体的には、一例は、CD43、具体的にはCD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用する物質を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞検出用組成物を提供する。他の例は、細胞試料にCD43、具体的にはCD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用する物質を接触させる段階と、前記CD43、具体的にはCD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用する物質間の相互作用の有無または程度を測定する段階とを含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の検出方法を提供する。この場合、CD43、具体的にはCD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用する物質間の相互作用が存在したりその水準が高い場合、前記細胞試料は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞を含むと決定(確認)することができる。前記相互作用する物質は、CD43、具体的にはCD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位と相互作用可能なすべての物質、例えば、化学物質(small molecular chemical)、抗体、抗体の抗原結合断片、アプタマーなどからなる群より選択された1種以上であってもよい。前記相互作用の有無は、前記相互作用する物質を用いる通常の蛋白質分析方法、例えば、免疫クロマトグラフィー(Immunochromatography)、免疫組織化学染色酵素結合免疫吸着分析(enzyme linked immunosorbent assay:ELISA)、放射線免疫測定法(radioimmunoassay:RIA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay:EIA)、蛍光免疫分析(Fluorescence immunoassay:FIA)、発光免疫分析(luminescence immunoassay:LIA)、ウェスタンブロッティング(Western blotting)、FISH(fluorescent in situ hybridization)、Flow cytometer、マイクロアレイ法などを利用して測定することができるが、これに制限されるわけではない。前記細胞試料は、哺乳類、例えば、ヒトから分離された細胞、組織、またはその培養物であってもよいし、例えば、癌患者、例えば、固形癌患者から分離された癌細胞、癌組織、またはその培養物であってもよい。

0093

他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位の固形癌治療剤のスクリーニングのための用途を提供する。

0094

他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位を含む固形癌治療剤のスクリーニングのための製剤を提供する。

0095

他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に候補化合物を接触させる段階と、前記抗原決定部位に結合する候補化合物を選択して固形癌治療剤の候補物質として決定する段階とを含む、固形癌治療剤のスクリーニング方法を提供する。

0096

前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤は、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞の阻害効果を有することを特徴とするものであってもよい。

0097

したがって、他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位の癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニングのための用途を提供する。

0098

他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニングのための製剤を提供する。

0099

他の例は、前記CD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位に候補化合物を接触させる段階と、前記抗原決定部位に結合する候補化合物を選択して癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤の候補物質として決定する段階とを含む、癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法を提供する。

0100

前記抗原決定部位に結合する候補化合物は、前記抗原決定部位に対する結合親和度(Kd;例えば、Scatchard analysisで測定)が1mM以下、100nM以下、10nM以下、5nM以下、または3nM以下であってもよいし、例えば、1pM〜1mM、1pM〜100nM、1pM〜10nM、1pM〜5nM、1pM〜3nM、10pM〜1mM、10pM〜100nM、10pM〜10nM、10pM〜5nM、10pM〜3nM、100pM〜1mM、100pM〜100nM、100pM〜10nM、100pM〜5nM、100pM〜3nM、1nM〜1mM、1nM〜100nM、1nM〜10nM、1nM〜5nM、または1nM〜3nMであってもよい。

0101

前記抗原決定部位は先に説明した通りであり、SEQID NO:131〜134の中から選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。前記抗原決定部位は、CD43蛋白質の全体または前記抗原決定部位を含む一部として提供されたり、化学的に合成または組換え的に生産されたものであってもよい。

0102

前記候補化合物は、人工的に合成されたり、天然の各種化合物、ポリペプチド、オリゴペプチドペプチド構造体または蛋白質構造体(例えば、抗体、抗体の抗原結合断片、ペプチボディナノボディなど)、ポリヌクレオチドオリゴヌクレオチドアンチセンス−RNA、shRNA(short hairpin RNA)、siRNA(small interference RNA)、アプタマー、天然物抽出物などからなる群より選択された1種以上であってもよい。

0103

前記候補化合物と抗原決定部位の結合は、候補化合物と抗原決定部位の複合体の形成を確認することにより行われ、これは、当業界で公知の多様な方法により行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光および/または放射線検出により測定され、具体的には、免疫クロマトグラフィー(Immunochromatography)、免疫組織化学染色(Immunohistochemistry)、酵素結合免疫吸着分析(enzyme linked immunosorbent assay:ELISA)、放射線免疫測定法(radioimmunoassay:RIA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay:EIA)、蛍光免疫分析(Floresence immunoassay:FIA)、発光免疫分析(luminescence immunoassay:LIA)、ウェスタンブロッティング(Western blotting)などからなる群より選択された方法によって測定されるが、これに制限されるわけではない。

0104

一例において、前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤または癌幹細胞阻害剤は、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体類似蛋白質構造体(例えば、ペプチボディ、ナノボディ)などからなる群より選択された1種以上であってもよい。

0105

他の例において、前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。他の例は、前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤の薬学的有効量を固形癌の治療を必要とする患者に投与する段階を含む固形癌の治療方法を提供する。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。

0106

他の例は、前記のようにスクリーニングされた癌幹細胞阻害剤を有効成分として含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。他の例は、前記のようにスクリーニングされた癌幹細胞阻害剤の薬学的有効量を癌患者、例えば、固形癌患者に投与する段階を含む癌幹細胞、例えば、血液癌または固形癌の癌幹細胞阻害方法を提供する。一例において、前記固形癌は、胃癌であってもよい。

0107

他の例は、新規な抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、先に説明したようなCD43の細胞外領域に位置する抗原決定部位(epitope)に結合するものであってもよい。前記抗原決定部位は、SEQID NO:131のアミノ酸配列を含むCD43の細胞外領域内の連続する6〜9個のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。

0108

前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域(Heavy chain variable region;VH)および軽鎖可変領域(Light chain variable region;VL)を含む。前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、動物由来抗体(例えば、マウス抗体)、キメリック抗体、またはヒト化抗体であってもよく、単クローン抗体または多クローン抗体であってもよいし、非自然的(例えば、化学的または生物学的合成、組換え的方法など)に生産されたものであってもよい。

0109

前記重鎖可変領域は、N−末端からC−末端方向に順次に、第1相補性決定部位(complementarity determining region;CDR)(CDR1H)、第2CDR(CDR2H)、および第3CDR(CDR3H)を含むことができる。

0110

一例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域の必須成分として、GYX1MN(SEQID NO:110;X1は、すべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、FまたはYであってもよい)のアミノ酸配列(例えば、GYFMN(SEQ ID NO:111)またはGYYMN(SEQ ID NO:112))を含むCDR1H、RINPNX2GDSFYNQKFX3G(SEQ ID NO:113;X2およびX3は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、X2は、NまたはSであり、X3は、QまたはKである)のアミノ酸配列(例えば、RINPNNGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:114)、RINPNSGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:115)、RINPNNGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:116)、またはRINPNSGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:117))を含むCDR2H、およびEGYYGGRGYALDY(SEQ ID NO:118)のアミノ酸配列を含むCDR3Hを含むことができる。

0111

前記重鎖可変領域は、前記相補性決定部位(CDR)のN−末端側および/またはC−末端側に免疫グロブリンの骨格部位(framework)を追加的に含むことができる。より具体的には、前記重鎖可変領域は、N−末端からC−末端方向に順次に、第1framework(FR1H)、第1相補性決定部位(complementarity determining region;CDR)(CDR1H)、第2framework(FR2H)、第2CDR(CDR2H)、第3framework(FR3H)、第3CDR(CDR3H)、および第4framework(FR4H)を含むことができる。

0112

一具体例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化されたものであり、

0113

(i)FRIHは、SEQID NO:83〜SEQ ID NO:94のうちいずれか1つの1番目から30番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい;

0114

(ii)CDR1Hは、GYX1MN(SEQID NO:110;X1は、すべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、FまたはYであってもよい)のアミノ酸配列を含むものであってもよいし、例えば、GYFMN(SEQ ID NO:111)またはGYYMN(SEQ ID NO:112)のアミノ酸配列を含むことができる;

0115

(iii)FR2Hは、SEQID NO:83〜SEQ ID NO:94のうちいずれか1つの36番目から49番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる;

0116

(iv)CDR2Hは、RINPNX2GDSFYNQKFX3G(SEQID NO:113;X2およびX3は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されたものであってもよいし、例えば、X2は、NまたはSであり、X3は、QまたはKである)のアミノ酸配列を含むものであってもよいし、例えば、RINPNNGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:114)、RINPNSGDSFYNQKFQG(SEQ ID NO:115)、RINPNNGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:116)、またはRINPNSGDSFYNQKFKG(SEQ ID NO:117)のアミノ酸配列を含むことができる;

0117

(v)FR3Hは、SEQID NO:83〜SEQ ID NO:94のうちいずれか1つの67番目から98番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる;

0118

(vi)CDR3Hは、EGYYGGRGYALDY(SEQID NO:118)のアミノ酸配列を含むことができる;

0119

(vii)FR4Hは、SEQID NO:83〜SEQ ID NO:94のうちいずれか1つの112番目から122番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

0120

前記軽鎖可変領域は、N−末端からC−末端方向に順次に、第1CDR(CDR1L)、第2CDR(CDR2L)、および第3CDR(CDR3L)を含むことができる。

0121

一例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の必須成分として、RTSQDISNYLN(SEQID NO:119)のアミノ酸配列を含むCDR1L;X4TX5RLHS(SEQ ID NO:120;X4およびX5は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されてもよいし、例えば、X4は、N、Q、またはAであり、X5は、SまたはAである)のアミノ酸配列(例えば、NTSRLHS(SEQ ID NO:121、NTARLHS(SEQ ID NO:122)、QTSRLHS(SEQ ID NO:123)、またはATSRLHS(SEQ ID NO:124))のアミノ酸配列を含むCDR2L;およびQQSNMFPY(SEQ ID NO:125)のアミノ酸配列を含むCDR3Lを含むことができる。

0122

前記軽鎖可変領域は、前記相補性決定部位(CDR)のN−末端側および/またはC−末端側に免疫グロブリンの骨格部位(framework)を追加的に含むことができる。より具体的には、前記重鎖可変領域は、N−末端からC−末端方向に順次に、第1framework(FR1L)、第1CDR(CDR1L)、第2framework(FR2L)、第2CDR(CDR2L)、第3framework(FR3L)、第3CDR(CDR3L)、および第4framework(FR4L)を含むことができる。

0123

一具体例において、

0124

(viii)FR1Lは、SEQID NO:95〜SEQ ID NO:109のうちいずれか1つの1番目から23番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい;

0125

(ix)CDR1Lは、RTSQDISNYLN(SEQID NO:119)のアミノ酸配列を含むことができる;

0126

(x)FR2Lは、SEQID NO:95〜SEQ ID NO:109のうちいずれか1つの35番目から49番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい;

0127

(xi)CDR2Lは、X4TX5RLHS(SEQID NO:120;X4およびX5は、それぞれ独立にすべてのアミノ酸の中から選択されてもよいし、例えば、X4は、N、Q、またはAであり、X5は、SまたはAである)のアミノ酸配列を含むことができ、例えば、NTSRLHS(SEQ ID NO:121、NTARLHS(SEQ ID NO:122)、QTSRLHS(SEQ ID NO:123)、またはATSRLHS((SEQ ID NO:124)を含むものであってもよい。

0128

(xii)FR3Lは、SEQID NO:95〜SEQ ID NO:109のうちいずれか1つの57番目から88番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。

0129

(xiii)CDR3Lは、QQSNMFPY(SEQID NO:125)のアミノ酸配列を含むことができる;

0130

(xiv)FR4Lは、SEQID NO:95〜SEQ ID NO:109のうちいずれか1つの97番目から108番目までのアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。

0131

一具体例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。前記重鎖可変領域は、SEQID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、または94のアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、または109のアミノ酸配列を含むものであってもよい。

0132

例えば、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化されたものであってもよいし、次に定義される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むものが例示される:
(a)SEQID NO:83のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(b)SEQ ID NO:84のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:96のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(c)SEQ ID NO:85のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:97のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(d)SEQ ID NO:86のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:98のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(e)SEQ ID NO:87のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:99のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(f)SEQ ID NO:88のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:100のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(g)SEQ ID NO:89のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:101のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(h)SEQ ID NO:90のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:102のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(i)SEQ ID NO:91のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:103のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(j)SEQ ID NO:93のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:103のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(k)SEQ ID NO:94のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:106のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(l)SEQ ID NO:91のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:97のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(m)SEQ ID NO:85のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:103のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(n)SEQ ID NO:93のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:107のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(o)SEQ ID NO:93のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:108のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;または
(p)SEQ ID NO:93のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:109のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。

0133

一具体例において、前記ヒト化された抗−CD43抗体またはその抗原結合断片に含まれているフレームワークのアミノ酸配列は次のように例示されるが、これに制限されるわけではない:
(i)FR1Hは、SEQID NOs:83〜94のうちいずれか1つの1番目から30番目までのアミノ酸残基を含むことができる;
(ii)FR2Hは、SEQ ID NOs:83〜94のうちいずれか1つの36番目から49までのアミノ酸残基を含むことができる;
(iii)FR3Hは、SEQ ID NOs:83〜94のうちいずれか1つの67番目から98番目までのアミノ酸残基を含むことができる;
(iv)FR4Hは、SEQ ID NOs:83〜94のうちいずれか1つの112番目から122番目までのアミノ酸残基を含むことができる;
(v)FR1Lは、SEQ ID NOs:95〜109のうちいずれか1つの1番目から23番目までのアミノ酸残基を含むことができる;
(vi)FR2Lは、SEQ ID NOs:95〜109のうちいずれか1つの35番目から49番目までのアミノ酸残基を含むことができる;
(vii)FR3Lは、SEQ ID NOs:95〜109のうちいずれか1つの57番目から88番目までのアミノ酸残基を含むことができる;
(viii)FR4Lは、SEQ ID NOs:95〜109のうちいずれか1つの97番目から108番目までのアミノ酸残基を含むことができる。

0134

他の実施例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、ヒト免疫グロブリンから誘導されたヒト重鎖不変領域および/またはヒト軽鎖不変領域を追加的に含むことができる。前記ヒト免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgMなどからなる群より選択されたものであってもよい。例えば、前記ヒト重鎖不変領域は、SEQID NO:40の123−452番目のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよいし;前記ヒト軽鎖不変領域は、SEQ ID NO:48の108−214番目のアミノ酸、または前記アミノ酸配列と95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。

0135

他の例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸残基が糖化されないことを特徴とするものであってもよい。そのために、抗体、特に重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域に糖化モチーフ、例えば、N−glycosylationモチーフ(e.g.,「N−X−S/T」(Xは、すべてのアミノ酸残基であってもよい))が含まれている場合、前記モチーフを変形させることができる。例えば、前記N−glycosylationモチーフが「N−X−S/T」(Xは、すべてのアミノ酸残基であってもよい)の場合、前記モチーフ内の「N」、「S/T」またはこれらすべてをそれぞれ元と異なるアミノ酸に置換させることができる。一例において、前記糖化されない抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、CDR2Lとして、NTARLHS(SEQID NO:122)、QTSRLHS(SEQ ID NO:123)、またはATSRLHS(SEQ ID NO:124)を含むものであってもよい。他の例として、前記糖化されない抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域として、SEQ ID NO:107、108、または109のアミノ酸配列を含むものであってもよい。

0136

前記抗−CD43抗体または抗原結合断片は、先に説明したCD43の特定抗原決定部位に特異的に結合するもので、動物抗体(例えば、マウス抗体)、キメリック抗体、ヒト化抗体、およびこれらの抗原結合断片からなる群より選択されたものであってもよい。前記動物抗体は、ヒト以外の動物種に由来するものであってもよいし、例えば、ネズミ、ハツカネズミヤギ、ギニーピッグロバウサギウマラマラクダ鳥類(例えば、ニワトリカモなど)などに由来するものであってもよいが、これに限定されるものではない。このような動物抗体からキメリック抗体および/またはヒト化抗体を作製する技術は、関連技術分野でよく知られている。ヒト化抗体は、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD、IgE、または任意のsubclassのような任意の好適なアイソタイプであってもよい。

0137

本明細書において、抗体のCD43に対する結合特異性は、抗体が非−CD43ペプチドに比べてCD43に対してより高い親和力を有したり、CD43の他の部位または他の細胞外領域と比較して先に説明したCD43の抗原決定部位に対してより高い親和力を有することを意味することができる。

0138

抗体と抗原(より具体的には、抗原結合部位)との結合(抗原−抗体結合)は、関連技術分野で知られたすべての方法によって測定される。例えば、抗原−抗体結合は、ELISA、流細胞分析器免疫化学染色、BIAcore光学バイオセンサなどからなる群より選択された1つ以上の方法によって測定されるが、これに制限されるわけではない。

0139

本明細書で使用された抗原結合断片という用語は、抗原(CD43)または先に説明したCD43の抗原決定部位を特異的に認識および/またはこれに特異的に結合する能力を有する抗体の一部分(断片)を意味する。例えば、抗原結合断片は、Fab、F(ab)2、Fv、scFv、scFv−Fc断片などからなる群より選択される。

0140

一例において、抗−CD43抗体の抗原結合断片は、抗−CD43scFvであってもよい。前記抗−CD43scFvは、先に説明したCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含んだり、先に説明した重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むものであってもよい。

0141

前記抗−CD43scFvにおいて、先に説明した重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、適切なリンカーを介して連結されたものであってもよい。前記リンカーは、1〜100個または2〜50個の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよいし、当業界における適切な配列が知られている。一例において、前記ペプチドリンカーは、(GGGX6S;X6は、GまたはA;SEQID NO:126)または(GGGX6S)n(nは、1〜5の整数で、各繰り返し単位に含まれているX6は、それぞれ独立にGまたはAである)で表現され、例えば、GGGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:127)またはGGGGSGGGGSGGGAS(SEQ ID NO:128)のアミノ酸配列を含むことができるが、これに制限されるわけではない。

0142

一例において、前記抗−CD43scFvは、SEQID NOs:50、52、54、56、または58のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されるわけではない。

0143

一例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、細胞死滅(例えば、細胞自殺(apoptosis)のようなプログラム化された細胞死滅を含む)を誘導可能な細胞毒性物質と接合されて標的細胞に細胞毒性を示すことができる。前記細胞毒性物質は、関連技術分野において細胞、特に癌細胞に対して毒性を示すことが知られたすべての化合物(small molecular compound;抗癌剤など)、蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどからなる群より選択された1種以上であってもよいし、例えば、放射線同位元素、細胞毒素化合物(small molecule)、細胞毒性蛋白質、抗癌剤などからなる群より選択された1種以上であってもよい。前記細胞毒素蛋白質は、リシン(ricin)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、モモルジン(momordin)、デボウガニン(debouganin)、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素(pseudomonas toxin)などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記放射線同位元素としては、131I、188Rh、90Yなどからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記細胞毒素化合物は、デュオカルマイシン(duocarmycin)、モノメチルアウリスタチンE(monomethyl auristatin E;MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(monomethyl auristatin F;MMAF)、N2’−ジアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)マイタンシン(N2’−deacetyl−N2’−(3−mercapto−1−oxopropyl)maytansine;DM1)、PBD(Pyrrolobenzodiazepine)dimerなどからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。

0144

他の例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識が接合された接合体形態で提供される。前記接合体は、in vitroまたはin vivoでCD43または先に説明したCD43の抗原決定部位の存在を検出するのに有用に使用できる。前記検出可能な標識は、関連技術分野で同相的に知られたすべての標識物質の中から選択され、例えば、放射線標識(例えば、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、1251、1311、177Lu、166Ho、153Smなど)、酵素、蛍光標識発光標識生物発光標識、磁性標識、ビオチンのような化学的物質などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。抗体または抗原結合断片の用途に応じて適切な標識を選択することは、関連技術分野における通常の知識を有する者にとって明確な事項である。

0145

他の例は、前記抗CD43抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防および/または治療用薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗CD43抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌幹細胞阻害用薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の予防および/または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の予防および/または治療方法を提供する。他の例は、前記抗CD43抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の予防および/または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、癌幹細胞阻害方法を提供する。前記薬学的有効量は、前記投与対象において所望の抗癌効果、例えば、治療的効果(例えば、癌細胞死滅率の増加、癌組織の減少、癌転移抑制など)を得るのに効果的な量を意味する。前記薬学組成物および方法において、前記抗CD43抗体またはその抗原結合断片は、単独または細胞毒性物質と接合された接合体形態で使用できる。細胞毒性物質は先に説明された通りである。

0146

前記癌は、CD43、具体的には、先に説明したCD43の抗原決定部位を発現するすべての癌であってもよい。一例において、前記癌は、血液癌(hematopoietic malignancy)であってもよいし、例えば、急性骨髄球性白血病(acute myeloid leukemia)、急性リンパ球性白血病(acute lymphoblastic leukemia)、急性単球性白血病(acute monocytic leukemia)、ホジキンリンパ腫(Hodgkin’s lymphoma)、非ホジキンリンパ腫(non−Hodgkin’s lymphoma)などからなる群より選択された1種以上であってもよい。他の例において、前記癌は、後述する固形癌の中から選択された1種以上であってもよい。

0147

前記抗体または抗原結合断片は、細胞表面にCD43、特に先に説明したCD43の抗原決定部位を発現する腫瘍細胞上のCD43またはCD43抗原決定部位に結合するのに十分な量で投与され、その量は、関連技術分野における通常の知識を有する者によって困難なく決定可能である。

0148

前記言及された薬学的有効量または十分な量は、投与対象から期待される効果を提供するための量を意味する。期待される効果は、細胞表面に発現するCD43(またはCD43の抗原決定部位)に対する抗体の結合を伴うはずであり、前記結合は、抗体、抗原結合断片、または前記抗体または断片に接合された細胞毒性物質を介した細胞毒性(例えば、antibody−dependent cellular cytotoxicity(ADCC)またはcomplement−dependent cytotoxicity(CDC))の発揮であってもよい。他の例において、前記期待される効果は、細胞毒性が少なかったり無い細胞の表面で発現するCD43に対する抗体の結合を引き出し、これによって、前記結合は、CD43+細胞、そして患者から前記CD43+細胞(例えば、抗体または断片は、検出可能なマーカーとして標識されている所)を検出し、選択的に除去(例えば、白血球分離搬出法)するために熟練した受取人が行うことができる。要求される抗体分子の量は、患者において患者、人種年齢、そして患者の一般的な状態、特定化合物の投与、投与の方法などへの依存から異なり得る。したがって、それは、「正確な充分量」を指定することが可能でないことがある。しかし、任意の個別的な場合において、適当な量は、規則的な実験を利用して1つの日常記述によって決定可能である。用量はまた、状況の危急性に合わせて調整され、最適な投与量を導出可能に調整することができる。例えば、いくつかの用量は、毎日毎週、毎月または他の適正な時間間隔で提供される。

0149

前記言及された薬学的有効量または充分量は、抗体またはその抗原結合断片が投与されていたり、投与予定の患者から得られた生物学的サンプル(例えば、体液サンプル(例えば、血液サンプルなど)、細胞/組織サンプル(例えば、腫瘍細胞/組織サンプルなど)など)において細胞に抗体が結合することをモニタリングすることにより決定可能である。前記生物学的サンプルは、抗体または断片の投与後の特定時間(例えば、投与後、約5、10、5または20分)に患者から取ることができる。関連技術分野でよく知られた方法を用いて、サンプル内の細胞表面上の抗体または断片の存在(つまり、細胞表面のCD43またはその抗原決定部位と抗原−抗体反応によって結合した抗体またはその抗原結合断片)に対して分析することができる。あるいは、前記得られた生物学的サンプルは、サンプル内の生きている細胞の生存率または数を測定するための通常的分析に使用できる。抗体または断片の投与後にCD43−陽性細胞の数が減少するという事実(例えば、抗体または断片を投与する前に得たサンプルなどのような対照群サンプルと比較した時、抗体または断片を投与したサンプル内の生きている細胞数の減少)に基づいて、抗体媒介細胞毒性を測定することができる。前記細胞毒性は、抗体単独(例えば、細胞毒性物質と接合しない非−接合抗体またはその抗原結合断片)によって媒介されたり、および/または抗体または断片に接合された細胞毒性物質に媒介される。

0150

本明細書で提供されたCD43抗原決定部位に特異的に結合する抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、投与された患者のサンプルにおける標的CD43−陽性細胞の水準を対照群サンプル(例えば、抗体または断片の投与前に患者から得たサンプル)のCD43−陽性細胞の水準と比較して10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上または90%以上減少させることができる。一例において、CD43陽性細胞は、癌細胞、例えば、悪性造血細胞(例えば、白血病細胞)、および/または癌幹細胞であってもよい。

0151

他の例において、前記抗体またはその抗原結合断片の投与量(薬学的有効量)は、体外細胞基盤毒性実験(in vitro cell−based assay)により推定して決定可能である。例えば、前記抗体または断片の標的であるCD43陽性細胞の数を減少させるための抗体または断片の濃度を決定するために、CD43陽性細胞(例、CEM7細胞株)を用いた体外細胞基盤実験を行うことができる。試験管内(in vitro)での細胞の数を減少(例えば、前記抗体または断片の不在時における細胞数と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%減少)させるために決定される抗体または断片の濃度は、生体内実験(in vivo)で必要とするCD43陽性細胞数を減少させるのに十分な投与量を決定する根拠として採用される。その他にも、前記投与量は、患者の体重、血液量クリアランス率(clearance rate)などのような要素を考慮して決定可能である。

0152

本明細書に使用された用語「対象または患者(subject)」は、ヒト、ゴリラチンパンジーなどの哺乳類を含む動物の中から選択されたり、前記動物から分離された細胞、組織、体液またはその培養物であってもよい。前記哺乳類は、ヒトを含むことができる。本明細書に提供された発明は、ヒトまたは獣医学分野におけるCD43陽性細胞の特異的標的化のために応用可能であり、これは、関連技術分野における当業者が明確に理解できる内容である。通常、「動物」は、ヒト、サルなどの霊長類だけでなく、ウシ、ウマ、ヒツジブタ、ラクダ、ヤギ、ロバ、イヌネコなどの家畜伴侶動物、およびマウス、ラットなどの実験用動物通称するために使用できる。ウマの場合、娯楽または家畜産業に使用されるウマだけでなく、競走用産業に利用されるウマも含まれる。

0153

必要に応じて、本明細書で提供される方法は、第2の治療手段(例えば、治療剤)を行うことを追加的に含むことができる。例えば、本発明の方法は、他の化学療法化合物(第2有効成分)を必要とする対象に投与することを含むことができる。前記第2有効成分の投与は、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片の投与と同時に行われたり、順序に関係なく(抗体などの投与前または後)順次に行われる。

0154

他の側面において、本明細書で提供される抗CD43抗体またはその抗原結合断片の癌治療;抗癌剤の製造;癌幹細胞阻害;および/または癌幹細胞阻害剤の製造のための用途が提供される。

0155

本明細書に記載の薬学組成物、方法、および用途において、前記癌は、固形癌または血液癌であってもよいし、原発性癌または転移性癌であってもよい。一例において、前記癌は、造血性悪性腫瘍(hematopoietic malignancy)であってもよい。前記造血性悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、急性単核球性白血病、またはホジキンリンパ種であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記血液癌は、癌幹細胞を含む癌であってもよい。

0156

他の例において、前記癌は、固形癌であってもよい。前記固形癌は、肺癌(例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌)、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、胃腸癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、胆嚢癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。例えば、前記固形癌は、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、前立腺癌、または膀胱癌であってもよい。前記癌は、原発性癌だけでなく、転移性癌も含む。また、前記固形癌は、既存の抗癌剤(e.g.,小分子抗癌剤(anticancer chemical)、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生剤、ビンカアルカロイド、酵素、ホルモン剤、標的治療剤、および/または抗体治療剤など)に対して抵抗性を有する癌であってもよく、既存の抗癌剤(e.g.,小分子抗癌剤(anticancer chemical)、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生剤、ビンカアルカロイド、酵素、ホルモン剤、標的治療剤、および/または抗体治療剤など)治療後に再発した癌であってもよい。前記固形癌は、癌幹細胞を含む癌であってもよい。

0157

前記固形癌の治療効果は、癌細胞(特に、癌幹細胞)またはこれを含む癌組織の成長抑制(量的減少)、死滅(apoptosis)効果だけでなく、移動(migration)、侵襲(invasion)、転移(metastasis)などを抑制して、それによる癌の悪化を抑制する効果を含む。

0158

本明細書で提供される抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、多様な経路で投与され、経口または非経口的経路で投与される。例えば、適切な投与経路の例として、静脈動脈筋肉内注射または注入などがあり、一例において、静脈注射に投与されるが、これに制限されるわけではない。

0159

一例において、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片は、単独または第2治療化合物(例、化学治療化合物)と共に投与されるための形態に剤形化される。

0160

さらに他の側面において、本明細書で提供された抗−CD43抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および賦形剤からなる群より選択された1種以上の添加剤を含む薬学組成物が提供される。一例において、前記薬学組成物に含まれている抗体は、細胞毒性物質が連結または接合された形態のものが含まれる。適切な薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および賦形剤は、関連技術分野における当業者によく知られている事項であり、その例として、食塩水溶剤(例えば、注射用剤)、分散媒(dispersion media)、抗真菌性および/または抗菌性製剤界面活性剤等張性製剤、吸収性製剤などが挙げられるが、これに制限されるわけではない。

0161

一例において、前記薬学組成物は、多様な用量単位形態の注射可能な製剤などのような多様な形態の製剤に製剤化される。

0162

前記薬学組成物の剤形と後続投与は、関連技術分野における通常の技術による。投薬は、治療に対する対象の状態、薬物反応性などに依存するが、好ましい効果が続けば持続することが好ましい。前記薬学組成物の投与量、投与方法、そして繰り返し頻度を投与対象の年齢、性別、病的状態、薬物反応性などを考慮して決定可能であり、これは、関連技術分野における通常の知識を有する者にとって明確な事項である。

0163

さらに他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片の生産方法を提供する。前記製造方法は、前記核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含むことができる。前記発現させる段階は、前記組換え細胞を培養する段階を含むことができ、任意に、前記得られた細胞培養物から抗体を分離および/または精製する段階を追加的に含むことができる。

0164

一具体例において、前記製造方法は、
前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子またはこれを含む組換えベクターで形質転換された組換え細胞を前記核酸分子の十分な発現のための条件および/または期間で培養する段階と、
前記培養された細胞または得られた培養物から抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を分離および/または精製する段階とを含むことができる。

0165

前記組換え細胞は、宿主細胞を前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子またはこれを含む組換えベクターで形質転換させて得られたものであってもよい。

0166

他の例は、前記分離および/または精製する段階から得られた精製された抗−CD43抗体または抗原結合断片を提供する。前記得られた抗体または抗原結合断片は、細胞で発現または細胞外分泌時に連結されていた他の成分から分離された組換え分子であってもよい。一例において、前記分離および/または精製された抗体または抗原結合断片は、50%以上、60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の純度を有するものであってもよい。関連技術分野における当業者は、分離および/または精製程度は、抗体または抗原結合断片の使用目的および/または使用形態に依存することを明確に理解するであろう。例えば、動物、特に人間の体内投与を目的とする場合に、前記抗体または抗原結合断片の精製純度は比較的高い水準が要求され、体外実験に使用される場合、許容可能な不純物(例えば、宿主細胞および/または培養物由来の成分(蛋白質など)など)が含まれる。

0167

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子を提供する。一具体例において、前記核酸分子は、前記抗体または抗原結合断片の重鎖可変部位(VH binding domain)を暗号化する核酸分子、軽鎖可変部位(VL binding domain)を暗号化する核酸分子、またはこれらの組み合わせを含むことができる。前記重鎖可変部位を暗号化する核酸分子は、SEQID NOs:1、5、9、13、17、21、25、および29からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含むことができる。前記軽鎖可変部位を暗号化する核酸分子は、SEQ ID NOs:3、7、11、15、19、23、27、および31からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含むことができる。

0168

前記核酸分子は、適切な発現ベクターに含まれる。前記発現ベクターは、宿主細胞で外来遺伝子を発現させるために通常使用されるすべてのベクターであってもよいし、例えば、pTT5、pAPEX3p、pcDNA3.2(−)などが例示されるが、これに限定されるものではない。

0169

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子またはこれを含む組換えベクター(または発現ベクター)を含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、前記核酸分子または組換えベクターを宿主細胞に導入させて得られたもので、前記核酸分子を発現させることができる細胞である。前記宿主細胞の例として、原核細胞(例、E.Coliなど)または原生細胞、動物細胞(例、CHO、COS、HEK−293E、HEK−293T細胞、これらの特定遺伝子変形(例えば、欠失)細胞など)、植物細胞真菌細胞(例、Saccharomyces cerevisiaeなど)、昆虫細胞(例、Sf9細胞など)のような真核細胞が挙げられるが、これに制限されず、外来遺伝子を発現させることができるすべての細胞の中から選択される。

0170

他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を細胞試料に接触させる段階と、前記試料内の抗原−抗体結合の有無を確認する段階とを含む、CD43の検出方法またはCD43陽性細胞の検出方法を提供する。前記方法によれば、前記細胞試料内に含まれている細胞表面におけるCD43の発現の有無を確認することができ、したがって、前記方法は、CD43の発現に関連する疾病の診断に適用可能である。したがって、他の例は、前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を細胞試料に接触させる段階と、前記試料内の抗原−抗体結合の有無を確認する段階とを含む、CD43関連疾病の診断方法またはCD43関連疾病の診断に情報を提供する方法を提供する。前記CD43関連疾病は、CD43の検出またはCD43の増加に関連する疾病で、癌であってもよいし、前記癌は、固形癌または血液癌であってもよく、特にCD43の増加に関連する造血性悪性腫瘍(例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病)であってもよい。他の具体例において、CD43関連疾病は、癌幹細胞を含む癌であってもよい。

0171

前記方法において、抗原−抗体結合は、前記抗体(またはその抗原結合断片)とCD43蛋白質との間の複合体の形成の有無を検出することにより確認することができる(つまり、前記抗体−CD43蛋白質の複合体の形成が検出されると、抗原−抗体結合が存在すると確認する)。この時、相対的な比較のために、対照細胞試料に対して同一の試験を行って、試験細胞試料から得られた結果と比較することができる。前記対照細胞試料は、よく知られたCD43陰性細胞、または正常細胞(non−cancer or non−tumor cells)の中から選択されたものであってもよい。

0172

一例において、前記検出方法または診断方法は、
(1)試験細胞試料および対照細胞試料に前記抗体またはその抗原結合断片をそれぞれ接触させる段階と、
(2)前記抗体または抗原結合断片と前記細胞との間の複合体の形成の有無または水準を測定する段階とを含むことができる。この時、試験細胞試料における複合体の存在または対照細胞試料と比較して相対的に高い複合体の水準が測定される場合、前記試験細胞試料内のCD43が存在し、または前記細胞がCD43を発現する細胞(つまり、CD43陽性細胞)であることを確認することができる。前記細胞試料は、生体から分離されたものであってもよく、前記方法は、in vitroで行われるものであってもよい。

0173

他の例は、前記抗CD43抗体またはその抗原結合断片を含むCD43の検出または可視化(イメージング)のための組成物を提供する。さらに他の例は、前記抗CD43抗体またはその抗原結合断片を用いるCD43の検出または可視化(イメージング)方法を提供する。前記組成物および方法は、生体外(in vitro)のみならず、生体内(in vivo)でのCD43の検出および/または可視化に適用可能である。前記組成物および方法において、前記抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識と接合された形態であってもよいし、例えば、前記検出可能な標識は、放射線標識(例えば、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、1251、1311、177Lu、166Ho、153Smなど)、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁性標識、ビオチンのような化学的物質などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されず、関連技術分野で明確に知られた通常の検出手段によって検出可能なすべての標識であってもよい。先に説明したように、このような生体外および/または生体内でのCD43の検出および/または可視化は、CD43陽性細胞数の増加に関連する疾病、例えば、癌、より具体的には、癌幹細胞を含む癌または造血性悪性腫瘍の診断に使用できる。

0174

前記CD43の検出および/または可視化方法(in vivo)は次を含むことができる:
(i)前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を試験対象に投与する段階と、
(ii)前記抗体またはその抗原結合断片の複合体の形成の有無または複合体の形成程度(水準)を測定する段階とを含むことができる。

0175

前記複合体は、前記抗体またはその抗原結合断片と試験対象の体内の細胞表面に発現したCD43との複合体またはCD43を発現する細胞(CD43陽性細胞)との間の抗原−抗体結合によって形成された複合体であってもよい。前記抗体またはその抗原結合断片は、先に説明したような検出可能な標識(特に、生体適合性標識)と接合された形態で使用できる。前記可視化方法は、CD43の発現を特徴とする細胞、例えば、癌幹細胞の可視化に適用可能である。

0176

前記投与対象における抗体または抗原結合断片の複合体の形成の有無または形成程度は、対照対象(例えば、CD43関連疾病を有しない対象またはCD43(過)発現細胞を含まない対象)における複合体の形成の有無または形成程度と比較して相対的に評価される。このような比較のために、前記方法は、
(i−1)前記抗−CD43抗体またはその抗原結合断片を試験対象および対照対象にそれぞれ投与する段階と、
(ii−1)前記試験対象および対照対象における抗体またはその抗原結合断片の複合体の形成の有無または複合体の形成程度(水準)をそれぞれ測定する段階と、
(iii)試験対象で測定された結果を対照対象における結果と比較する段階とを含むことができる。

0177

前記方法は、試験対象のCD43関連疾病の診断またはCD43の発現を特徴とする癌幹細胞の確認(検出)に適用可能である。この場合、前記段階(ii)または(ii−1)で複合体の形成または対照対象と比較して複合体の形成水準の増加が測定される場合、前記試験対象をCD43関連疾病患者として判断したり、前記試験対象が癌幹細胞を有するものと判断することができる。

0178

生体内または生体外抗原(または抗原を表面に発現する細胞)−抗体複合体の形成は、関連技術分野における通常の手段によって測定され、このような通常の手段は、関連技術分野における当業者にとって明確な内容である。例えば、前記複合体は、抗体または抗原結合断片を適切な検出可能な標識で標識し、前記標識の信号を測定したり適切な検出方法によって確認することができる。前記適切な検出方法は、関連技術分野における通常のすべての方法であってもよいし、例えば、ELISA、流細胞測定(Flow activated cytometry system;FACS)、免疫組織化学染色などであってもよいが、これに制限されるわけではない。

0179

関連技術分野における通常の専門家であれば、本明細書に記載の発明が説明された事項以外の変形および/または修正の余地があることを明確に理解することができる。本明細書に提供された発明は、記載された思想および/または範囲内におけるすべての変形および/または修正を含むことが理解されなければならない。また、本明細書に提供された発明は、本明細書に明示または参照されたすべての段階、特徴、組成物および/または化合物をそれぞれまたは総合的に含むことができる。

0180

特定の具体例を次の実施例を参照して説明するが、これらの実施例は例示のみの目的のために設計され、先に言及された発明の範囲を限定するものではない。

0181

理解されるように、本発明における開発および記述された塩基配列は、例えば、親和度成熟やMHCclass2の結合力のモチーフを予測し除去して、免疫原性を減少して結合力を増加させる、この技術分野におけるよく知られた方法で修正された。この文書で開発および記述した塩基配列の治療剤の有用性は、抗体依存的細胞媒介毒性(ADCC)、補体依存性細胞傷害作用(CDC)、血清半減期生物分類Fc受容体結合力またはこの作用の組み合わせによる機能的特性を調節することにより向上できる。このような変形は、蛋白質工学糖鎖工学または化学的方法によって行うことができる。要求された治療剤の適用により、このような活動の増加または減少は有利になる。

0182

抗体の親和度成熟に対する数多くの方法は業界で周知である。これらの大部分は、親和力を増加させるために、突然変異パネルまたは変形蛋白質のライブラリーを生成し、スクリーニングおよび選択する一般的な戦略に基づいている。突然変異の誘発は、例えば、PCRエラーの誘発と遺伝子シャッフリング突然変異誘発物質放射線または化学物質の使用、エラーが発生しやすい複製機械を用いた突然変異遺伝子種類の使用、自然親和度成熟機械を活用した体細胞超突然変異の接近によってDNA水準で時々起こる。また、突然変異の誘発は、レプリカーゼを用いてRNA水準でも起こる。改善された変形蛋白質によるライブラリーに基づくスクリーニング方法は、ファージ酵母リボソームバクテリアまたは哺乳動物細胞のような多様なディスプレイ技術に基づいており、業界で周知である。親和度成熟は、3D蛋白質で発見された部位特異的変異または遺伝子合成のよって明確および予測可能になった。ADCCまたはCDCを増加させる方法は、業界における熟練した技術者に知られている。

0183

抗体の血清半減期および生体分布度を変調する多数の方法は、抗体および新生児Fc受容体、異化作用からIgGの保護に重要な役割の受容体の相互作用を変え、高い血清抗体の濃度を維持させる。例えば、U.S.Pat.Nos6,277,375;6,821,505;7,083,784、U.S.Pat.No7,217,797と、WO2000/42072の特許を参照すればよい。Fc受容体とこれらの受容体に媒介機能の結合力を調節する不変領域のアミノ酸置換の他の例は、FcRnに結合力と血清半減期を含み、特許にU.S.Pat.Application Nos20090142340;20090068175;と20090092599;に説明されている。

0184

抗体分子に連結されている糖鎖は、Fc受容体と糖鎖受容体の相互作用に影響を及ぼして血清半減期を含む抗体の活性に影響を与える。したがって、抗体の活性を調節する糖鎖形態は治療剤の有利な点を付与することができる。操作された糖鎖形態を生成する方法は、業界でよく知られているが、U.S.Pat.Nos6,602,684;7,326,681;7,388,081;およびWO2008/006554に記載されているものに限定されない。

0185

ポリエチレングリコール(PEG)を添加して半減期を延長する方法は、蛋白質の血清半減期を延長するのに用いている。

0186

本明細書に使用されたものとして、「配列相同性」または「%同一性」は、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の同一順序に配列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の個数の、全体ヌクレオチドまたはアミノ酸の個数に対する比率を示す。

0187

いずれか1つのポリペプチドに対する、他のポリペプチドの%同一性は、空白の生成に対する不利益=5と、空白の増加に対する不利益=0.3のGAP分析法によって決定可能である。クエリー塩基配列は長さが少なくとも50個のアミノ酸であり、GAP分析は少なくとも50個のアミノ酸の領域に2つの塩基配列の領域を合わせる。さらに好ましくは、クエリー塩基配列の長さは少なくとも100個のアミノ酸であり、GAP分析法は少なくとも100個のアミノ酸の領域上に2つの塩基配列の領域を合わせる。さらに好ましくは、クエリー塩基配列の長さは少なくとも100個のアミノ酸であり、GAP分析法は少なくとも100個のアミノ酸の領域上に2つの塩基配列の領域を合わせる。よりさらに好ましくは、クエリー塩基配列の長さは少なくとも250個のアミノ酸で、GAP分析法は少なくとも250個のアミノ酸の領域上に2つの塩基配列を整列する。よりさらに好ましくは、クエリー塩基配列の長さは少なくとも250個のアミノ酸で、GAP分析法は少なくとも250個のアミノ酸の領域上に2つの塩基配列を整列する。最も好ましくは、議論とされている2つのポリペプチドの全体長さのアミノ酸塩基配列を整列するのである。

0188

同定されたポリペプチドに対して、%同一性が高いほど好ましいことは容易に理解されるであろう。したがって、適用可能であれば、最小限の%同一性の数値に照らして、ポリペプチドは、好ましくは少なくとも95%以上、さらに好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%以上、さらに好ましくは少なくとも99%以上、さらに好ましくは99.1%以上、さらに好ましくは99.2%以上、さらに好ましくは99.3%以上、さらに好ましくは99.4%以上、さらに好ましくは99.5%以上、さらに好ましくは99.6%以上、さらに好ましくは99.7%、さらに好ましくは99.8%、よりさらに好ましくは99.9%のアミノ酸配列の同一性は、SEQID NOに関連づけられたアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。

0189

本明細書におけるポリペプチドのアミノ酸またはヌクレオチド配列変異は、化学的または放射線処理によって生体内で核酸の突然変異によってヌクレオチドの変化により導入されて生成されたものであってもよい。このような突然変異の例は、欠失、挿入またはアミノ酸配列の残基の置換を含む。1988、Harayamaによって説明される本発明のポリヌクレオチドは、DNAシャッフリング技術に属しており、また、試験管内による方法は、エンコーディングポリペプチドの変形からポリヌクレオチドを生成する。このようなDNAシャッフリング技術は、ムギ以外の植物種からRht−B1のような、本発明に関連する遺伝子配列を使用することができる。突然変異/変形DNAから得られた生産品は、例えば、過増殖表現型を有するかを確認するために、本文書で記述された手法を用いてスクリーニングすることができる。

0190

例えば、アミノ酸配列の欠失は、一般に、約1〜15個のアミノ酸残基の範囲、例えば、1〜10個のアミノ酸残基または連続する1〜5個のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。

0191

例えば、アミノ酸配列の置換は、ポリペプチド内のアミノ酸残基のうち1つ以上のアミノ酸残基が欠失し、その場に元のアミノ酸残基と異なる1つ以上のアミノ酸残基が挿入されたものを含むことができる。

0192

本明細書に使用されたものとして、「含む(comprise、comprises、またはcomprising)」は、記載された成分、段階、数値などを含む開放型意味で使用され、これを除いた成分、段階、数値などを排除するための意図で解釈されず、場合によって、「consisting essentially of」を意味することが排除されない。

0193

本明細書で言及されたすべての文献は参照として本明細書に含まれる。

発明の効果

0194

本発明は、血液癌または固形癌細胞だけでなく、癌幹細胞まで治療可能な抗体および前記抗体が認知する抗原決定部位およびこれを認知する抗体またはその抗原結合断片を提供することによって、癌のより強力で根本的な治療が可能であり、効果的な癌治療剤の開発に寄与することができる。

図面の簡単な説明

0195

図1は、ヒト胃癌細胞株NCI−N87(左)とAGS(右)におけるCD43の発現をimmunostaining法で確認した結果である(X軸:CD43の発現率、Y軸:Reading cell numbers)。
図2A〜2Cは、多様な固形癌細胞株におけるCD43の発現をimmunostaining法で確認した結果である(2A:胃癌細胞株;2B:大腸癌細胞株;2C:肝癌細胞株)。
図2A〜2Cは、多様な固形癌細胞株におけるCD43の発現をimmunostaining法で確認した結果である(2A:胃癌細胞株;2B:大腸癌細胞株;2C:肝癌細胞株)。
図2A〜2Cは、多様な固形癌細胞株におけるCD43の発現をimmunostaining法で確認した結果である(2A:胃癌細胞株;2B:大腸癌細胞株;2C:肝癌細胞株)。
図3は、ヒト胃癌細胞株NCI−N87、SNU−719、AGSに対する(抗−CD43抗体)−MMAE接合体の細胞毒性を確認した結果である。
図4は、ヒト胃癌細胞株NCI−N87、SNU−719、AGSに対する(抗−CD43抗体)−DM1接合体の細胞毒性を確認した結果である。
図5は、ヒト胃癌細胞株NCI−N87、AGSに対する(抗−CD43抗体)−Duocarmycin接合体の細胞毒性を確認した結果である。
図6は、ヒト胃癌細胞株移植された胃癌動物モデルにおける抗−CD43抗体単独および抗−CD43抗体−Duocarmycin接合体の抗癌効果を確認した結果である。
図7は、ヒト起源の多様な固形癌組織におけるCD43抗原決定部位の発現をimmunohistochemistry法で確認した結果である(M;medulla(髄質)、C;cortex(皮質))。
図8は、ヒト起源の多様な固形癌の疾患別CD43抗原決定部位の発現をimmunohistochemistry法で確認した結果である(A;signet ring cell胃癌(Stomach signet ring cell carcinoma)、B;乳管浸潤腺癌(Breast infiltrating duct adenocarcinoma)、C;膵臓癌(Pancreas adenocarcinoma)、D;腎臓癌(Kidney renal cell carcinoma)、E;肺癌(lung Adenocarcinoma)、F;扁平細胞癌(LarynX squamous cell carcinoma)、G;膀胱癌(Gall bladder carcinoma)、H;子宮扁平細胞癌(Cervix squamous cell carcinoma)、I;子宮頸部扁平細胞癌(Uterus squamous cell carcinoma)、J;膀胱癌(Urinary bladder cancer)、K;肺扁平細胞癌(Lung squamous cell carcinoma)、L;顆粒性肉腫(Ear granulocytic sarcoma))。
図9は、ヒトの胃癌細胞株NCI−N87の癌幹細胞におけるCD43、CD44、およびCD133の発現をimmunostaining法で確認した結果である。
図10は、胸腺組織を抗−CD43単クローン抗体(YG5)で免疫組織化学染色した結果である。
図11は、胸腺細胞に対する抗−CD43単クローン抗体(YG5)の反応性を測定した流細胞測定グラフである。
図12は、11種のCD43欠損型突然変異(deletion mutant)を図式的に示す図である。
図13は、11種のCD43欠損型突然変異に対する抗−CD43(EB−1)単クローン抗体の反応性を確認したウェスタンブロットの結果である。
図14は、抗−CD43抗体の重鎖および軽鎖発現プラスミド作製過程を例として示す模式図である。
図15は、正常血液細胞ノイラミニダーゼ処理後、抗−CD43抗体のCD43epitopeに対する結合力を示すグラフである。
図16は、抗−CD43抗体の組換えCEACAM5とCEACAM6に対する交差反応性を測定した結果を示すグラフである。
図17は、腫瘍幹細胞(tumor sphere)におけるCD43epitopeの発現程度を示すグラフである。
図17は、腫瘍幹細胞(tumor sphere)におけるCD43epitopeの発現程度を示すグラフである。
図18は、CEM7またはCCRF−CEM細胞(低いCD43抗原決定部位の発現)に対する抗−CD43抗体の細胞毒性を示すグラフであって、抗−CD43抗体は直接的な細胞毒性がないことを示す。
図19は、毒素(saporin)が接着された抗−JL−1抗体(saporin接合抗−JL−1抗体)を処理した目的細胞の生存率を示すグラフであって、saporin接合抗−JL−1抗体によって細胞自滅死が起こることを示す。
図20は、図19で説明した細胞死滅試験において抗−JL−1抗体(抗−CD43抗体)(げっ歯類、ヒト抗体とも)のinternalization現象を示すグラフであって、マウスJL−1抗体を30分間冷蔵状態で細胞に処理した後、37℃の条件に移した後、グラフのx軸に表示されたそれぞれの時間の時に106細胞を取って、冷蔵温度でanti−mouseIgG−PE二次抗体を10分間処理し、細胞を洗浄して固定した後、流細胞分析器で分析して得られた結果である。
図21は、抗原を発現する細胞において抗−JL−1抗体によって誘導される同種細胞凝集現象を示すイメージで、それぞれ300、000個の細胞に抗−JL−1抗体40ug/mLの開始濃度で処理して、37℃、5%CO2の条件で培養した後、定められた時間に応じて顕微鏡写真を撮ってイメージを得ており、本図は、抗体処理時間経過時点で得られたイメージである。
図22は、正常骨髄細胞における低くて異質的なJL−1抗原の発現を示す結果であって、正常骨髄単核球をmouse anti−JL1で染色した後、続いて、Goat−anti−mouse IgG F(ab)2−PEで染色して観察し、Histogram overlayはリンパ球に限って表現したものである。
図23は、末梢血液細胞におけるJL−1抗原の発現率を示すもので、低い発現率を確認することができ、前記結果は2つの正常ヒトPBMCサンプルをマウス抗−ヒトJL−1(青色線:(d))で染色して測定した。
図24は、正常骨髄細胞にsaporinを結合させた抗−JL−1抗体を予め処理した場合の(JL1+)と、予め処理しない場合(JL1−)の骨髄下位集合(subset)のコロニー形成程度を測定した結果を示すグラフであって、saporinを結合させた抗−JL−1抗体を予め処理した場合(JL1+)に、骨髄下位集合(subset)のコロニーを形成しないことを確認することができ、前記結果は骨髄を分離して白血球を収穫し、CD34+細胞はJL−1の陽性と陰性に分けて分離収穫し、収穫した細胞をcytokineと共にMethocultに入れた後、測定した。
図25は、細胞株を用いた白血病ALL異種移植モデルにおいて抗−JL1抗体自体と結合された毒素と抗−JL1抗体の治療効果を示すグラフであって、(A)はCEM7leukemia modelでの結果を、(B)はNALM−6model(Cell line:NALM6(B−ALL))での結果をそれぞれ示し、試験は次の条件下で行った:Mice:NOD−SCID(8/group);接種:0日目107cells;投与:15ug/injection+100ug bulk IgG i.v.1x/week starting day8;終了時点:マヒ状態。
図26は、主要AML blastと下位集合物(subset)におけるJL−1の発現程度を示す。
図27は、キメリックヒト化JL1による細胞死滅効果(ADCCand CDC)を示すグラフであって、AはCEM7細胞株を効果器細胞(PBMC)とJL1キメリック抗体または対照群との間に培養した後、細胞毒性をCell Titer Gloを用いて測定した結果であり、BはCEM7細胞株を培養培地とJL1キメリック抗体をウサギ補体と共に培養した後、細胞毒性をCell Titer Gloを用いて測定した結果である。この時、対照群は実験と無関係なIgG1イソタイプ抗体を使用した。
図28は、脱フコシル化された時、JL−1キメラ抗体ADCC活性が増加することを示す結果である。
図29は、in vivoでいずれとも結合しないキメリック抗体自体のCEM7細胞株での効果を示すグラフである。
図30は、白血病幹細胞(Leukemia stem cell;LSC)下位集合(subset)におけるJL1の発現を示す結果である。
図31は、in vitroで毒素(サポリン:SAP)と接合した抗−JL1抗体(CCC)を用いたコロニーの分析結果(コロニーの平均個数)を示すグラフであって、抗原−陽性AMLの細胞死滅効果を示し、細胞はJL1−サポリンまたはマウスIgG1−サポリンと共に幹細胞コロニーmatrixに入れて観察した。
図32は、in vitroで毒素(サポリン:SAP)を接合させた抗−JL1抗体(CCC)が抗原陽性の主要AMLの増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
図33は、NSGマウスにおいて毒素が結合された抗体による主要AML癌細胞成長抑制効果(in vivo)を示すグラフであって、JL−1+AML患者から5×107個の骨髄細胞を収穫し、放射線照射を受けたNSGマウス30匹に静脈注射し、8週後に前記マウスにJL1−debouganin(DB)、hIgG1−DB、またはPBSを4週間45ugの用量で毎週投与した後、骨髄と脾臓を収穫し、生着と腫瘍生成を観察した。
図34および35は、多様なヒト化/最適化した変形抗体が原型(マウス)JL−1抗体と比較した時、同等のバインディングプロファイルを示すことを確認した結果であって、図34は、CEM7細胞を親原型JL−1抗体と3種類のヒト化に変形させた抗体で染色して観察した結果であり、変形した「Combo A」が最も良いプロファイルを示すが、その他の試験抗体もすべてCEM7細胞で細胞毒性を有意な程度に示すことが確認され;
図35は、最終3個の変形抗体を内在化細胞毒性分析方法で試験した結果を示すもので、抗体をantihuman IgG−saporinと予め混合した後、細胞に処理して、3日後に細胞毒性を測定した結果である。
図36は、最高ラウンドと3ラウンドのクローンのアミノ酸配列の整列結果を示すもので、それぞれ親クローンとよりヒト化されたクローンのアミノ酸配列を比較したものである。このうち、153−28が36−10Q6Rに由来し、257−10は45−37に由来した。CDRsは太くて下線フォントで表示した。
図37Aは、流動細胞計測法によってJL−1陽性CEM7細胞においてART140リード候補のIgGとの結合程度を示すグラフであり、図37Bは、陰性対照群のU937細胞での結果を示すグラフである。
図37Aは、流動細胞計測法によってJL−1陽性CEM7細胞においてART140リード候補のIgGとの結合程度を示すグラフであり、図37Bは、陰性対照群のU937細胞での結果を示すグラフである。
図38Aは、細胞基盤ELISA(懸濁液に生きている細胞)によってJL−1陽性CEM7細胞においてART140リード候補とIgGとの結合程度を示すグラフであり、図38Bは、陰性対照群のU937細胞での結果を示すグラフである。
図38Aは、細胞基盤ELISA(懸濁液に生きている細胞)によってJL−1陽性CEM7細胞においてART140リード候補とIgGとの結合程度を示すグラフであり、図38Bは、陰性対照群のU937細胞での結果を示すグラフである。
図39Aは、流動細胞計測法によってリード候補群とクイックチェンジ(Quickchange)突然変異のIgGがJL−1陽性CEMに結合する程度を示すグラフであり、図39Bは、陰性対照群のU937細胞での結果を示すグラフである。
図39Aは、流動細胞計測法によってリード候補群とクイックチェンジ(Quickchange)突然変異のIgGがJL−1陽性CEMに結合する程度を示すグラフであり、図39Bは、陰性対照群のU937細胞での結果を示すグラフである。
図40A−40Cは、流動細胞計測法によってクイックチェンジ(Quickchange)突然変異のIgGがJL−1陽性CEMに結合する程度を示すグラフである。
図40A−40Cは、流動細胞計測法によってクイックチェンジ(Quickchange)突然変異のIgGがJL−1陽性CEMに結合する程度を示すグラフである。
図40A−40Cは、流動細胞計測法によってクイックチェンジ(Quickchange)突然変異のIgGがJL−1陽性CEMに結合する程度を示すグラフである。
図41A−41Cは、細胞基盤ELISA(懸濁液に生きている細胞)によってJL−1陽性CEM7と結合するクイックチェンジ(Quickchange)突然変異のIgGの確認した結果を示すグラフである。
図41A−41Cは、細胞基盤ELISA(懸濁液に生きている細胞)によってJL−1陽性CEM7と結合するクイックチェンジ(Quickchange)突然変異のIgGの確認した結果を示すグラフである。
図41A−41Cは、細胞基盤ELISA(懸濁液に生きている細胞)によってJL−1陽性CEM7と結合するクイックチェンジ(Quickchange)突然変異のIgGの確認した結果を示すグラフである。
図42は、キメリック抗体DNP001のエピトープ結合活性を示すグラフである。
図43は、ヒト化抗体の糖化部位アミノ酸残基除去変異抗体を製造するために置換される軽鎖可変領域の糖化部位アミノ酸を例として示す。
図44は、ヒト化抗体の糖化部位アミノ酸残基除去変異抗体に対する糖化部位に結合するコンカナバリンA(Concanavalin A)−HRPを用いたウェスタンブロッティングの結果である。
図45は、ヒト化抗体の糖化部位アミノ酸残基除去変異抗体の抗原(CD43)陽性細胞のCEM7細胞との結合力を示すグラフである。
図46は、キメリック抗−CD43抗体と糖化部位アミノ酸残基除去されたヒト化抗−CD43抗体の抗原(CD43)陽性細胞のCEM7細胞との結合力を示すグラフである。

実施例

0196

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示に過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。下記記載の実施例は、発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できることは当業者にとって自明である。

0197

実施例1.抗−CD43抗体の製造
1−1.マウス抗体の製造
1−1−1.単一クローン抗体生産細胞の製造
ヒト胸腺細胞を抗原として注入したBalb/c白ネズミ脾臓細胞8−アザグアニン(8−azaguanine)耐性(resistant)マウスの骨髄腫細胞株SP2/0−Ag14(ATCC、CRL−1581)の融合により作った。

0198

Balb/c白ネズミに6週間2週間隔で107個のヒト胸腺細胞(ソウル大学病院)を腹腔内注射して免疫反応を誘導し、最後の追加接種後3日目に脾臓を摘出して細胞浮遊液を作った。ケラーとミルステイン(Koeler&Milstein1975)の方法により、DMEM(Dulbeco’s modified Eagle’s medium)で108個の脾臓細胞と107個の骨髄腫細胞を50%ポリエチレングリコール400を用いて細胞融合した。融合された細胞は洗浄した後、20%ウシ胎児血清、100uMヒポキサンチン(hypoxanthine)、0.44uMアミノプテリン(aminopterin)および16uMチミジン(thymidine)が補充されたDMEM培養液HAT培養液)に再浮遊させ、細胞は96−ウェルプレート(96−well plate)に分注し、37℃、5%CO2が供給される培養器で培養した。

0199

2週後、集落の形成が観察されると、上清液を取って抗体力価を免疫組織化学染色(immunohistochemistry)および流細胞測定(flowcytometry)を用いて測定した。

0200

陽性集団は、ウェル(well)あたり105個以上の細胞が単一に形成された場合とした。上清液の抗体力価が高い群落が形成されたウェルから細胞を取って、制限希釈試験(limiting dilution assay)方法によりサブクローニングして抗体力価が高い単一クローン細胞を得た。単一クローン細胞の培養液は上清液を取って後の実験のために保管した。

0201

1−1−2.胸腺細胞の細胞表面蛋白質に対する抗体を生産する単一クローン細胞の選別
胸腺の凍結組織(ソウル大学病院)およびパラフィン包埋組織(ソウル大学病院)を4マイクロメートルの厚さに薄切して使用した。パラフィン包埋組織はパラフィン除去過程を経た後、正常ヤギ血清(BioGenex社製品)を加えた後、室温で1時間放置した。前記組織にそれぞれ一次抗体(ダイノナ(株)、Dinona)を塗布した後、4℃の低温室に一晩置いて反応させた後、翌日、リン酸塩緩衝食塩水で3回洗浄した。二次抗体としてビオチン結合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン(biotinylated goat anti−mouse immunoglobulin;2滴、DAKO)を用いて1時間室温に放置した後、リン酸塩緩衝食塩水で3回洗浄し、ストレプトアビジン(streptavidin)−HRP接合体を処理した。これにH2O2−アミノエチルカルバゾール(H2O2−aminoethyl carbazole)溶液を塗布した後、20分間処置し、リン酸塩緩衝食塩水で3回水洗した後、光学顕微鏡で発色を観察した。

0202

その結果、ヒト胸腺細胞にだけ特異に反応する抗体を生産する単一クローン細胞株H−JL1を選別することができた。前記得られた細胞株は、1997年1月13日付で大韓民国ソウル市鍾路区蓮建洞所在の韓国細胞株研究財団(Korean Cell Line Research Foundation;KCLRF)に寄託して、accession number KCLRF−BP−00010を与えられた。

0203

前記選別した単一クローン細胞株の上清液で胸腺組織を免疫組織化学染色し、胸腺細胞が陽性に染色されたことを確認した(図10)。また、陽性に染色された胸腺細胞は細胞の周辺部に強く染色される様相を示し、前記単一クローン細胞株は細胞表面蛋白質に対する抗体を生産することが分かった。

0204

胸腺細胞の発達段階で前記抗体の反応を確認するために流細胞測定を行った。心臓手術のために摘出したヒトの胸腺を小さい片に切断し、ガラススライドで引いて胸腺細胞を採取した。分離した胸腺細胞に前記抗体(1×10^5細胞/抗体10ug/ml)を30分間4℃で反応させた後、冷リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、FITC(Fluorescein Isothiocyanate)が結合されたヤギ抗−マウス免疫グロブリン抗体(Jackson ImmunoResearch)を30分間4℃で反応させた。冷リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、PE(phycoerythrin)が結合された抗−CD8抗体(BD Bioscience)とAPCが結合された抗−CD4抗体(BD Bioscience)を5ulずつ入れて、30分間4℃で反応させた。冷リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、FACScalibur(Becton Dickinson、Mountain View、CA)を用いて流細胞測定を行った。CD4とCD8の発現様相によって、胸腺細胞をCD4−CD8−胸腺細胞→CD4+CD8+胸腺細胞→CD4+CD8−あるいはCD4−CD8+胸腺細胞に区分し、前記抗体は4種類の胸腺細胞にすべて反応したが、特にCD4+CD8+胸腺細胞に高く反応した(図11参照)。図11において、灰色領域は陰性対照群であり、実線は選別された抗体で染色したグラフである。

0205

1−1−3.選別した単クローン細胞株から単クローン抗体の生産
10%ウシ胎児血清が含まれているDMEM培地で培養した単クローン細胞107個をプリスタン(pristane)0.5mlを3週前に予め腹腔内注射したBalb/cマウスの腹腔に注射し、2−3週後にマウスの腹水を採取した。前記腹水から5−10mg/mlの高濃度抗体を得ることができた。

0206

腹水から抗体を精製するために、Q−セファロース(Pharmacia製品)クロマトグラフィーおよびヒドロキシルアパタイト(hydroxylapatite、Bio−gelHTP Gel、Pharmacia製品)クロマトグラフィーを施した。腹水10mlあたり3.14gのアムモニウムスルフェート((NH4)2SO4)を加えて上で徐々に溶かした(50%(NH4)2SO4沈殿)。この混合物を15,000rpmで30分間遠心分離し、沈殿物脱イオン水(deionized water)に溶かした後、1Lの緩衝液(20mM phosphate、pH7.4)に透析した。

0207

前記溶液を緩衝溶液(20mM phosphate、pH7.4)で予め平衡させたQ−セファロースカラムに通過させて吸着させた後、緩衝溶液I(20mM phosphate、pH7.4)および緩衝溶液II(20mM phosphate、0.5M NaCl、pH7.4)を用いて、NaClの濃度勾配を0Mから0.8Mの線形勾配で流して、溶出物を得た。各分画は15%SDS−PAGEして、多量の抗体が含有された分画を集めた。前記分画は緩衝液(20mM phosphate、pH6.8)に透析し、緩衝溶液(20mM phosphate、pH6.8)で予め平衡させたヒドロキシルアパタイトカラムに通過させながら吸着させた後、緩衝溶液III(20mM phosphate、pH6.8)および緩衝溶液IV(300mM phosphate、pH6.8)を用いて、リン酸の濃度勾配が0Mから0.3Mまでとなるように線形勾配で流して、溶出物を得た。分画は15%SDS−PAGEして、抗体の純度が95%以上となる分画だけを集めた。前記実験により、腹水1mlあたり5−10mgの単クローン抗体を回収することができた。
前記得られた抗体をYG5と名付けた。

0208

1−1−4.CD43の抗原決定部位の分析
<CD43の一部切片を含む構造体の構築
図12に示すように、それぞれのCD43欠損型突然変異を作製し、前記欠損型突然変異に対するYG5抗体の反応性を確認して、CD43の抗原決定部位を分析した。CD43蛋白質(NCBI Accession No.M61827.1)は計400個のアミノ酸からなり、1から19番目のアミノ酸配列は信号配列であり、20から254番目のアミノ酸配列は細胞外ドメインであり、255から277番目のアミノ酸配列はトランスメンブレンドメインであり、278から400番目のアミノ酸配列は細胞内ドメインである。

0209

欠損型突然変異それぞれはグルタチオン−S−転移酵素(Glutathione−S−transferase、GST)のC末端に融合発現するようにDNA構造体を作製した後、これをpGEX−2T(Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,NJ)ベクターに挿入した。以下、CD43蛋白質の1から253番目のアミノ酸配列を含むベクターをpGEX1−253とし、1から98番目のアミノ酸配列を含むベクターをpGEX1−98、1から87番目のアミノ酸配列を含むベクターをpGEX1−87、1から87番目のアミノ酸配列を含むベクターをpGEX1−81、1から75番目のアミノ酸配列を含むベクターをpGEX1−75、1から70番目のアミノ酸配列を含むベクターをpGEX1−70、70から98番目のアミノ酸配列を含むベクターをpGEX70−98とし、前記と同一の原理でpGEX71−81、pGEX76−81、pGEX73−81、そしてpGEX73−80と名付けた。

0210

欠損型突然変異をコーディングする配列はヒトCD43cDNAから増幅させて使用し、PCRプライマーはGenebank上の配列から作製し、ただし、BamHI/EcoRIまたはBamHI/BglII制限酵素部位が含まれるようにした。PCR産物はBamHI/EcoRIまたはBamHI/BglIIで切断した後、同一制限酵素部位のpGEX−2Tに連結させた後、E.coliコンピテントTOP10F’細胞[F’[lacIq、Tn10(TetR)]、mcrA、D(mrr−hsdRMS−mcrBC)、80lacZDM15、lacX74、deoR、recA1、araD139D(ara−leu)7697、galK、rpsL(StrR)、endA1、nupG]に形質導入した。形質転換体の塩基配列は分析して、欠損型突然変異配列を再確認した。

0211

<GST−CD43欠損型突然変異体融合蛋白質の発現>
形質転換されたE.coli TOP10細胞は50ug/mlのアンピシリンが添加されたLB培地で37℃で一晩培養し、培養された細胞をLB培地で20倍希釈した後、OD0.6となるように3〜4時間培養した。培養物にIPTG(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を最終濃度1mMで添加して4時間さらに培養した後、6,000gで15分間遠心分離した。細胞だけを得て、細胞1gあたり3mlの溶解(lysis)緩衝液(50mM Tris、pH8.0、1mMEDTA、100mM NaCl)で懸濁した後、最終濃度0.2mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(phenylmethylsulfonyl fluoride、Sigma Chemical Co.)を加えた後、30分間氷上に置いた。

0212

<CD43抗原決定部位の分析>
計11種の欠損型突然変異を発現するそれぞれの形質転換体の溶解質(lysate)を10%SDS−PAGEした後、YG5抗体および抗−GST抗体でそれぞれウェスタンブロットを実施した。

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