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課題・解決手段

本発明は、抗体の1以上の遊離チオール共有結合することが可能なリンカーを有する新規で有利な組成物を提供する。具体的には、分子構造合成経路結合機構、及び抗体薬物複合体ADC)における使用としてのそれらの適用が本明細書において提供される。

概要

背景

急速に成長している一種の標的療法である抗体薬物複合体(antibody drug conjugates)(ADC)は、癌薬物の選択性及び細胞毒性活性の両方の改善に向けた有望な新たなアプローチである。米国で治療的使用に対して承認されているADC薬の例は、未分化大細胞型リンパ腫及びホジキンリンパ腫の治療に使用される、モノメチルアウリスタチンEに複合体化されたキメラ抗CD30抗体である、ブレツキシマブベドチン(ADCETRIS(登録商標))である。

抗体薬物複合体(ADC)の設計で採用される従来の一方法は、結合部分を介して抗体鎖のチオール基に対して薬物分子カップリングすることを含む。遊離チオール基は、還元反応によって抗体のシステイン鎖間ジスルフィド結合破壊する結果として得られる。典型的な抗体は4個の鎖間ジスルフィド結合(重鎖間の2個、及び重鎖と軽鎖との間の2個)を含む。これらの鎖間ジスルフィドジチオトレイトールトリス(2−カルボキシエチルホスフィン、又は他の穏やかな還元剤によって選択的に還元して、複合体化のための8個の反応性スルフヒドリル基をもたらすことができる。この方法は、8個までの薬物分子を所与の抗体に連結することができる。

少なくとも2個のジスルフィド結合が破壊されるという事実により、この原理を使用して設計したADCは、一旦循環に入ると不安定であることから、ADCの半減期が短縮される。その結果、最近のADC設計及び合成における開発は、異なるアプローチ、すなわちカップリング剤によって2個のチオール基を共有結合することに依存して、所与の抗体の2本の重鎖間及び重鎖と軽鎖との間のチオール架橋確立するアプローチを採用している。かかるアプローチを探索する現在の研究努力は、主に、2個のチオール基に共有結合的に架橋するための官能性を有するのみならず、特定の生物学的活性を促進するために必要な成分も包含するカップリング剤の構造設計に着目するものである。

当該分野における初期の研究は、破壊されたジスルフィド結合に起因する2個のチオール基と反応するビスマレイミドを利用していた。マレイミドとチオールとの間の共有結合カップリングは典型的なアルケン転換反応である。より最近に研究されたチオール架橋反応もまた、マレイミド、ビス−マレイミド及びハロゲン置換基を有するマレイミドを含む例示的な反応によるこの原理に基づくものである。しかしながら、現在まで、チオール架橋リンカー組成物は、マレイミド系化合物のみに限定され、腫瘍標的ADCにおける適用については指定されないことが多い。例えば、同様のマレイミド系化合物の使用を含む共有結合チオールカップリングの先に開示した方法は、腫瘍標的薬物分子タンパク質、又はポリペプチド等の活性剤によるカップリングの際にそれらの適用を指定していなかった(例えば、特許文献1を参照されたい)。マレイミド系化合物を利用する腫瘍標的ADCにおける適用を具体的に開示した他の方法は、本発明によって提供されるような1個のリンカーが同時に2個のチオール基と反応する、共有結合チオール架橋を含む機構を採用するものではなかった(例えば、特許文献2を参照されたい)。

概要

本発明は、抗体の1以上の遊離チオールを共有結合することが可能なリンカーを有する新規で有利な組成物を提供する。具体的には、分子構造合成経路結合機構、及び抗体薬物複合体(ADC)における使用としてのそれらの適用が本明細書において提供される。なし

目的

本発明は、別の化合物に抗体をカップリングするための新規で有利なリンカーを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

(式中、R1及びR2はチオールと反応することが可能な官能基であり、L1、L2、Lはリンカーを表すか又はヌルとすることができ、Mは結合基を表し、Qは活性剤を表すか又はヌルとすることができ、mは0〜6の整数を表し、nは0〜8の整数を表す)を含むリンカー活性剤又はその薬学的に許容可能な塩。

請求項2

R1及びR2が各々マレイミドハロゲンハロゲン置換官能基、アルカナールアルカノンスルホニルアルケンシランイソシアネート及びノルボルネンから選択される少なくとも1つの基を含み、R1及びR2の両方がマレイミドになることはなく、R1及びR2の両方がハロゲンになることはない、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項3

R1及びR2が独立して、並びにそれらの誘導体から選択され、式中、R5、R6及びR7が独立してH、ハロゲン、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル芳香族基ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリルポリエチレングリコール、NO2、CN、SCN、OR8、SR9、NR10R11、C(=O)R12、C(=O)OR8、C(=O)NR10R11、C(=S)OR8、C(=S)NR10R11、C(=S)SR9、NRl0(C=O)R12、NR10(C=S)NR10R11、O(C=O)NR10R11、SO2R9、S(=O)2OR8、及びそれらの組み合わせから選択され、式中、R8、R9、R10、R11、R12が独立して、H、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項4

XがF、Cl、Br、及びIから選択される、請求項2に記載のリンカー活性剤。

請求項5

R1及びR2が異なる、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項6

MがC−R5、N、B、P、Si−R5、芳香族基、ヘテロアリール、シクロアルキル、及び(ヘテロシクリル)アルキルから選択される、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項7

R5がH、Cl〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される、請求項6に記載のリンカー活性剤。

請求項8

L1及びL2が独立してC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、O、S、NR6、C(=O)、C(=O)O、C(=O)NR6、C=NR6、C(=S)O、C(=S)NR6、C(=S)S、NR6(C=O)、NR6(C=S)NR7、O(C=O)NR6、S(=O)2及びそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項9

R6及びR7が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される、請求項8に記載のリンカー活性剤。

請求項10

Lが切断不可単位を含む、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項11

Lが切断可能単位を含む、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項12

少なくとも1つのLがC1〜C9アルキル、C2〜C9アルケニル、C2〜C9アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、O、S、NR8、C(=O)、C(=O)O、C(=O)NR8、C=NR8、C(=S)O、C(=S)NR8、C(=S)S、NR8(C=O)、NR8(C=S)NR9、O(C=O)NR8、S(=O)2、Val−Cit−PAB、Val−Ala−PAB、Val−Lys(Ac)−PAB、Phe−Lys−PAB、Phe−Lys(Ac)−PAB、D−Val−Leu−Lys、Gly−Gly−Arg、Ala−Ala−Asn−PAB、Ala−PAB、PAB又はそれらの組み合わせを含む、請求項10〜11に記載のリンカー活性剤。

請求項13

R8及びR9が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される、請求項12に記載のリンカー活性剤。

請求項14

前記Qがチューブリン結合剤、DNAアルキル化剤、DNAインターカレータ酵素阻害剤免疫調節剤可視化剤ペプチド及びヌクレオチドから選択される、上記請求項のいずれか一項に記載のリンカー活性剤。

請求項15

Qがマイタンシノイドアウリスタチンカリケアマイシンドキソルビシンデュオカルマイシン、及びピロロベンゾジアゼピンから選択される、請求項14に記載のリンカー活性剤。

請求項16

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項17

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項18

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項19

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項20

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項21

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項22

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項23

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項24

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項25

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項26

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項27

前記式Iの構造が、である、請求項1に記載のリンカー活性剤。

請求項28

下記式:(式中、L1、L2、Lはリンカーを表すか又はヌルとすることができ、Mは結合基を表し、Qは活性剤を表すか又はヌルとすることができ、mは0〜6の整数を表し、nは0〜8の整数を表し、Aはターゲッティング部分であり、Sはターゲッティング部分のチオール基硫黄原子であり、及びR3及びR4は各々、Sと、チオールと反応することができる官能基との間の反応の結果として形成される)を有する抗体薬物複合体又はその薬学的に許容可能な塩。

請求項29

R3及びR4が異なる、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項30

R3及びR4が各々独立して、チオール基と、並びにそれらの誘導体から選択される基との反応の結果として形成され、式中、R5、R6及びR7が独立してH、ハロゲン、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、NO2、CN、SCN、OR8、SR9、NR10R11、C(=O)R12、C(=O)OR8、C(=O)NR10R11、C(=S)OR8、C(=S)NR10R11、C(=S)SR9、NR10(C=O)R12、NR10(C=S)NR10R11、O(C=O)NR10R11、SO2R9、S(=O)2OR8、及びそれらの組み合わせから選択され、式中、R8、R9、R10、R11、R12が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項31

R3及びR4が各々独立して、及びそれらの誘導体から選択される、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項32

MがC−R5、N、B、P、Si−R5、芳香族基、ヘテロアリール、シクロアルキル及び(ヘテロシクリル)アルキルから選択される、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項33

R5がH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される、請求項32に記載の抗体薬物複合体。

請求項34

L1及びL2が独立してC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、O、S、NR6、C(=O)、C(=O)O、C(=O)NR6、C=NR6、C(=S)O、C(=S)NR6、C(=S)S、NR6(C=O)、NR6(C=S)NR7、O(C=O)NR6、S(=O)2及びそれらの組み合わせから選択される、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項35

R6及びR7が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される、請求項34に記載の抗体薬物複合体。

請求項36

Lが切断不可単位を含む、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項37

Lが切断可能単位を含む、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項38

少なくとも1つのLがC1〜C9アルキル、C2〜C9アルケニル、C2〜C9アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、O、S、NR8、C(=O)、C(=O)O、C(=O)NR8、C=NR8、C(=S)O、C(=S)NR8、C(=S)S、NR8(C=O)、NR8(C=S)NR9、O(C=O)NR8、S(=O)2、Val−Cit−PAB、Val−Ala−PAB、Val−Lys(Ac)−PAB、Phe−Lys−PAB、Phe−Lys(Ac)−PAB、D−Val−Leu−Lys、Gly−Gly−Arg、Ala−Ala−Asn−PAB、Ala−PAB、PAB、又はそれらの組み合わせを含む、請求項36〜37に記載の抗体薬物複合体。

請求項39

R8及びR9が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される、請求項38に記載の抗体薬物複合体。

請求項40

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項41

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項42

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項43

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項44

前記式IIの構造が構造:を有する、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項45

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項46

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項47

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項48

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項49

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項50

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項51

前記式IIの構造が、である、請求項28に記載の抗体薬物複合体。

請求項52

Aがモノクローナル抗体を含む、請求項28〜50に記載の抗体薬物複合体。

請求項53

Aが抗体のフラグメントサロゲート、又は変異体を含む、請求項28〜51に記載の抗体薬物複合体。

請求項54

Aがタンパク質リガンド又はタンパク質スキャフォールドを含む、請求項28〜51に記載の抗体薬物複合体。

請求項55

Aがペプチドを含む、請求項28〜51に記載の抗体薬物複合体。

請求項56

Aが低分子リガンドを含む、請求項28〜51に記載の抗体薬物複合体。

請求項57

被験体において病的状態治療する方法であって、かかる治療を必要とする被験体に請求項28〜51に記載の抗体薬物複合体を投与することを含む、方法。

請求項58

前記病的状態が癌、炎症性障害自己免疫障害、神経系の障害、及び心血管系障害から選択される、請求項57に記載の方法。

請求項59

前記病的状態が癌である、請求項58に記載の方法。

請求項60

前記癌が癌腫リンパ腫芽細胞腫肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍から選択される、請求項59に記載の方法。

請求項61

前記癌がHER2陽性癌である、請求項60に記載の方法。

請求項62

前記癌が乳癌である、請求項61に記載の方法。

請求項63

ターゲット部分がHER2に結合する、抗体又はそのフラグメントである、請求項61に記載の方法。

請求項64

前記活性剤が細胞毒素である、請求項59に記載の方法。

請求項65

前記被験体がヒトである、請求項57に記載の方法。

請求項66

目的の分析物を有することが疑われる試料と、請求項28に記載の抗体薬物複合体とを接触させることを含む診断方法であって、ターゲット部分が前記目的の分析物に選択的に結合し、Qが検出可能な実体、及び/又は1以上の追加の実体が結合する実体であり、該1以上の追加の実体自体が検出可能な実体であり、前記方法が前記試料を分析して、検出可能な実体の存在を判定することを更に含み、その存在が前記目的の分析物の存在の指標となる、診断方法。

請求項67

前記分析物が癌と関連する、請求項65に記載の方法。

請求項68

前記分析物がHER2である、請求項66に記載の方法。

請求項69

前記ターゲッティング部分が抗体又は抗体フラグメントである、請求項67に記載の方法。

請求項70

invivoで行われる、請求項66に記載の方法。

請求項71

ヒトにおいて行われる、請求項70に記載の方法。

請求項72

invitroで行われる、請求項66に記載の方法。

技術分野

0001

[関連出願の相互参照
本願は、2016年8月14日付で出願された米国仮特許出願第62/205,121号の利益を主張するものであり、あらゆる数値、表及び図面を含む全ては、引用することにより本明細書の一部をなす。

背景技術

0002

急速に成長している一種の標的療法である抗体薬物複合体(antibody drug conjugates)(ADC)は、癌薬物の選択性及び細胞毒性活性の両方の改善に向けた有望な新たなアプローチである。米国で治療的使用に対して承認されているADC薬の例は、未分化大細胞型リンパ腫及びホジキンリンパ腫の治療に使用される、モノメチルアウリスタチンEに複合体化されたキメラ抗CD30抗体である、ブレツキシマブベドチン(ADCETRIS(登録商標))である。

0003

抗体薬物複合体(ADC)の設計で採用される従来の一方法は、結合部分を介して抗体鎖のチオール基に対して薬物分子カップリングすることを含む。遊離チオール基は、還元反応によって抗体のシステイン鎖間ジスルフィド結合破壊する結果として得られる。典型的な抗体は4個の鎖間ジスルフィド結合(重鎖間の2個、及び重鎖と軽鎖との間の2個)を含む。これらの鎖間ジスルフィドジチオトレイトールトリス(2−カルボキシエチルホスフィン、又は他の穏やかな還元剤によって選択的に還元して、複合体化のための8個の反応性スルフヒドリル基をもたらすことができる。この方法は、8個までの薬物分子を所与の抗体に連結することができる。

0004

少なくとも2個のジスルフィド結合が破壊されるという事実により、この原理を使用して設計したADCは、一旦循環に入ると不安定であることから、ADCの半減期が短縮される。その結果、最近のADC設計及び合成における開発は、異なるアプローチ、すなわちカップリング剤によって2個のチオール基を共有結合することに依存して、所与の抗体の2本の重鎖間及び重鎖と軽鎖との間のチオール架橋確立するアプローチを採用している。かかるアプローチを探索する現在の研究努力は、主に、2個のチオール基に共有結合的に架橋するための官能性を有するのみならず、特定の生物学的活性を促進するために必要な成分も包含するカップリング剤の構造設計に着目するものである。

0005

当該分野における初期の研究は、破壊されたジスルフィド結合に起因する2個のチオール基と反応するビスマレイミドを利用していた。マレイミドとチオールとの間の共有結合カップリングは典型的なアルケン転換反応である。より最近に研究されたチオール架橋反応もまた、マレイミド、ビス−マレイミド及びハロゲン置換基を有するマレイミドを含む例示的な反応によるこの原理に基づくものである。しかしながら、現在まで、チオール架橋リンカー組成物は、マレイミド系化合物のみに限定され、腫瘍標的ADCにおける適用については指定されないことが多い。例えば、同様のマレイミド系化合物の使用を含む共有結合チオールカップリングの先に開示した方法は、腫瘍標的薬物分子タンパク質、又はポリペプチド等の活性剤によるカップリングの際にそれらの適用を指定していなかった(例えば、特許文献1を参照されたい)。マレイミド系化合物を利用する腫瘍標的ADCにおける適用を具体的に開示した他の方法は、本発明によって提供されるような1個のリンカーが同時に2個のチオール基と反応する、共有結合チオール架橋を含む機構を採用するものではなかった(例えば、特許文献2を参照されたい)。

先行技術

0006

国際公開第2013132268号
中国特許出願公開第103933575号

発明が解決しようとする課題

0007

本発明は、別の化合物に抗体をカップリングするための新規で有利なリンカーを提供する。構造的合成及びその使用が本明細書に記載されているリンカーに加えて、本発明は、例えば抗体薬物複合体用途に使用されるような、抗体/活性剤複合体及びその適用も提供する。

課題を解決するための手段

0008

幾つかの実施の形態は、式I:



(式中、
R1及びR2はチオールと反応することが可能な官能基であり、
L1、L2、Lはリンカーを表すか又はヌル(null)とすることができ、
Mは結合基を表し、
Qは活性剤を表すか又はヌルとすることができ、
mは0〜6の整数を表し、
nは0〜8の整数を表す)
の構造を有するリンカー活性剤又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。

0009

幾つかの実施の形態では、R1及びR2は独立して、



及びそれらの誘導体から選択される。

0010

幾つかの実施の形態は、式II:



(Aはターゲッティング部分であり、
L1、L2、Lはリンカー又はヌルを表し、
Mは結合基であり、
Qは活性剤又はヌルであり、
mは0〜6から選択される整数であり、
nは0〜8から選択される整数であり、
R3及びR4は各々独立して、



、それらの誘導体から選択されるか、又はヌルである)
の構造を有する、ターゲッティング部分とリンカー活性剤との複合体又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。

0011

本明細書で使用される「ヌル」に対する言及は、実体(entity)が存在しないことを意味する。

図面の簡単な説明

0012

抗体の破壊された又は還元されたジスルフィド結合の2つの隣接するチオール基と反応するリンカーによって確立された共有結合チオール架橋の概要図を示す。
Mc−VC−PAB−MMAEを使用して作製された細胞毒素と複合体化した抗Her−2モノクローナル抗体を含む、例示的な抗Her−2ADCのSDS−PAGE画像である。
MSL−C31のHIC−HPLCクロマトグラムを示す図である。
MSL−C75の還元SDS−PAGEの結果を示す図である。
MSL−C75のHIC−HPLCクロマトグラムを示す図である。
a)ネイキッド抗体、b)CD59−C78に対する還元SDS−PAGEの結果を示す図である。
CD59−C78のHIC−HPLCクロマトグラムを示す図である。

0013

以下の詳細な説明では、本発明の例示的で非限定的かつ非網羅的な実施形態を描く添付の図面に言及される。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施することができるように十分詳細に記載され、他の実施形態が使用され得ること、また本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の変更を行ってもよいことが理解される。したがって、以下の詳細な説明は限定の意味で取られるものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ規定される。本明細書において参照又は引用される特許、特許出願、仮出願、及び出版物はいずれも、本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度に、全ての図面及び表を含むその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

0014

本発明は、リンカーの1つの末端を介して抗体の2個の遊離チオールに共有結合するとともに、リンカーの別の末端で活性剤に結びつくことが可能な、新規で有利なリンカー分子を提供する。本明細書では、例えば抗体薬物複合体(ADC)を含む抗体/活性剤複合体も提供される。幾つかの実施形態では、本明細書で提供されるADCは、活性剤として抗癌剤を組み込む。

0016

本発明により使用される「活性剤」の用語は、動物投与された場合に生理学的効果を有する任意の天然又は合成の物質を含む。活性剤は、例えば、温血動物、特にヒトを含む哺乳動物獣医動物及び家畜を治療するために、本発明に従って利用することができる。活性剤は、腫瘍組織を含む、動物の身体内の又は身体上の所望の標的に対して作用するか、又は該標的において可視化され得る。

0017

「活性剤」の非限定的な例は、シナプスの部位及び神経効果器接合部位に作用する薬物;全身及び局所鎮痛剤催眠剤及び鎮静剤鬱病及び統合失調症等の精神障害治療薬抗てんかん薬及び抗痙攣薬パーキンソン病及びハンチントン病老化及びアルツハイマー病の治療薬;興奮性アミノ酸拮抗剤神経栄養因子及び神経再生剤;栄養因子中枢神経系(CNS)の外傷又は卒中の治療を目的とする薬物;依存症及び薬物乱用の治療薬;インフルエンザHIVヘルペス水痘等の細菌、ウイルス及び/又は微生物感染症の治療薬;制酸薬及び抗炎症薬寄生虫感染症及び微生物によって引き起こされた疾患に対する化学療法剤免疫抑制剤;抗癌剤;ホルモン及びホルモン拮抗剤;重金属及び重金属拮抗剤;非金属毒物に対する拮抗剤;細胞分裂阻害剤視覚化剤及び他の診断用物質免疫活性剤及び免疫反応剤;伝達物質並びにそれらの各受容体アゴニスト及び受容体アンタゴニスト、それらの各前駆物質及び代謝産物トランスポーター阻害剤抗生物質鎮痙剤抗ヒスタミン薬制吐剤弛緩剤;興奮剤センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド大脳拡張剤(cerebral dilators);向精神薬抗躁薬;血管の拡張剤及び収縮剤抗高血圧薬片頭痛治療薬;血糖上昇剤(hyperglycemic agent)及び血糖降下剤ミネラル剤及び栄養剤抗肥満薬アナボリック(anabolics:同化剤);抗喘息薬;並びにそれらの混合物である。

0018

免疫グロブリンとしても知られる「抗体」は、細菌及びウイルス等の外来物質識別し、中和するために免疫系によって使用される大きなY形のタンパク質である。抗体はシステインジスルフィド結合によって接続される4本のポリペプチド鎖、すなわち2本の同じ重鎖と2本の同じ軽鎖とを有する。

0019

「モノクローナル抗体」は、いずれも特有親細胞クローンである同一の免疫細胞によって作られるため、全ての抗体分子が同一である単特異性抗体である。モノクローナル抗体は、骨髄腫細胞を、所望の抗原で免疫したマウス由来脾臓細胞(又はウサギ由来B細胞)と融合させた後、得られたハイブリドーマアフィニティー精製等の技術によって精製することにより作製され得る。組み換えモノクローナル抗体を、所望の特異性を有する抗体が得られる可能性のある、わずかに異なるアミノ酸配列を有する抗体のライブラリを生成する免疫グロブリン遺伝子セグメントクローニングであるレパートリークローニング又はファージディスプレイ酵母ディスプレイを含む技術によって、マウスではなくウイルス又は酵母細胞で作製してもよい。得られた抗体を発酵によって大規模に作製してもよい。

0020

「キメラ(の)」、「ヒト化(された)」抗体は、モノクローナル抗体の結合部分をコードするマウスDNAを、ヒト抗体生産するDNAと融合させて、部分的にマウス、部分的にヒトのモノクローナル抗体を生じるような、組み換えのプロセスで使用される本来の(通常はマウス)及びヒトのDNA配列の組み合わせを含む抗体である。完全ヒト化抗体は、(ヒト抗体を産生するように操作された)トランスジェニックマウス又はファージディスプレイライブラリを使用して産生される。

0021

「リンカー」は、1つは抗体(又はそのフラグメント)等の生物学的部分又はそのフラグメントの結合用、又はそうでなければそれと会合するためのものと、他方は細胞毒素等の活性剤に対する複合体化用のものとの2つの反応性末端を有する部分である。

0022

「細胞毒素」は、癌細胞等の細胞が存在する場合に毒性であるか、又はその細胞に対して重要な機能変化誘導する実体である。

0023

本明細書で使用される「アルキル」は、完全に飽和された(すなわち、二重結合又は三重結合を含まない)直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルキル基は、1個〜9個の炭素原子を有してもよい(本発明での定義は数値範囲が指定されない「アルキル」の用語の存在も包含するが、本明細書に示される場合は常に、「1〜9」等の数値範囲が所与の範囲内の各整数を指し、例えば、「1個〜9個の炭素原子」は、アルキル基が1個の炭素原子、2個の炭素原子、3個の炭素原子等の9個までの炭素原子を含むことを意味する)。また、アルキル基は、1個〜9個の炭素原子を有する中級(medium size)アルキルであってもよい。典型的なアルキル基として、何ら限定されないが、メチル、エチル、プロピルイソプロピルブチルイソブチルターシャリーブチルペンチル、ヘキシル等が挙げられる。

0024

本明細書で使用される「アルケニル」は、1以上の二重結合を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指す。本発明での定義は数値範囲が指定されない「アルケニル」の用語の存在も包含するが、アルケニル基は2個〜9個の炭素原子を有してもよい。また、アルケニル基は2個〜9個の炭素原子を有する中級アルケニルであってもよい。また、アルケニル基は2個〜4個の炭素原子を有する低級アルケニルであってもよい。アルケニル基は、「C2〜4アルケニル」又は同様の表示として指定され得る。例に過ぎないが、「C2〜4アルケニル」は、2個〜4個の炭素原子がアルケニル鎖中にあることを示し、すなわち、アルケニル鎖はエテニルプロペン−1−イル、プロペン−2−イル、プロペン−3−イル、ブテン−1−イル、ブテン−2−イル、ブテン−3−イル、ブテン−4−イル、1−メチル−プロペン−1−イル、2−メチル−プロペン−1−イル、1−エチル−エテン−1−イル、2−メチル−プロペン−3−イル、ブタ−1,3−ジエニル、ブタ−1,2−ジエニル、及びブタ−1,2−ジエン−4−イルから選択される。典型的なアルケニル基として、何ら限定されないが、エテニル、プロペニルブテニルペンテニル及びヘキセニル等が挙げられる。

0025

本明細書で使用される「アルキニル」は、1以上の三重結合を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指す。本発明での定義は数値範囲を指定しない「アルキニル」の用語の存在も包含するが、アルキニル基は、2個〜9個の炭素原子を有してもよい。また、アルキニル基は、2個〜9個の炭素原子を有する中級アルキニルであってもよい。また、アルキニル基は2個〜4個の炭素原子を有する低級アルキニルであってもよい。アルキニル基は「C2〜4アルキニル」又は同様の表示として指定され得る。例に過ぎないが、「C2〜4アルキニル」は、2個〜4個の炭素原子がアルキニル鎖中にあることを示し、すなわち、アルキニル鎖は、エチニルプロピン−1−イル、プロピン−2−イル、ブチン−1−イル、ブチン−3−イル、ブチン−4−イル、及び2−ブチニルから選択される。典型的なアルキニル基として、何ら限定されないが、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル及びヘキシニル等が挙げられる。

0026

芳香族」の用語は、共役π電子系を有する環又は環系を指し、炭素環式芳香族基(例えばフェニル)と複素環式芳香族基(例えばピリジン)の両方を含む。全環系が芳香族である場合、上記用語は単環式基又は縮合環多環式基(すなわち、隣接する原子対を共有する環)を含む。

0027

本明細書で使用される「シクロアルキル」は、完全に飽和したカルボシクリル環又は環系を意味する。例として、限定されないが、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。

0028

本明細書で使用される「ヘテロアリール」は、1以上のヘテロ原子、すなわち、限定されないが、窒素酸素及び硫黄を含む炭素以外の元素環骨格中に含む、芳香環又は芳香環系(すなわち、2個の隣接する原子を共有する2以上の縮合環)を指す。ヘテロアリールが環系である場合、該系の環はいずれも芳香族である。本発明での定義は数値範囲が指定されない「ヘテロアリール」の用語の存在も包含するが、ヘテロアリール基は、5個〜18個の環員(すなわち、炭素原子及びヘテロ原子を含む環骨格を構成する原子の数)を含んでもよい。ヘテロアリール環の例として、限定されないが、フリルチエニルフタラジニルピロリル、オキサゾリルチアゾリルイミダゾリルピラゾリルイソキサゾリルイソチアゾリルトリアゾリルチアジアゾリル、ピリジニルピリダジニルピリミジニルピラジニルトリアジニルキノリニルイソキノリニルベンズイミダゾリルベンゾキサゾリル、ベンゾチアゾリルインドリルイソインドリル、及びベンゾチエニルが挙げられる。

0029

本明細書で使用される「ヘテロシクリル」は、環骨格中に少なくとも1つのヘテロ原子を含む非芳香環又は環系を意味する。ヘテロシクリルは、縮合、架橋、又はスピロ接続において共に連結され得る。環系中の少なくとも1つの環が芳香族でなければ、ヘテロシクリルはどのような飽和度を有していてもよい。ヘテロ原子(複数の場合がある)は、環系中の非芳香環又は芳香環のいずれの中にあってもよい。本発明での定義は数値範囲が指定されない「ヘテロシクリル」の用語の存在も包含するが、ヘテロシクリル基は、3個〜20個の環員(すなわち、炭素原子及びヘテロ原子を含む環骨格を構成する原子の数)を有してもよい。また、ヘテロシクリル基は、3個〜10個の環員を有する中級ヘテロシクリルであってもよい。また、ヘテロシクリル基は、3個〜6個の環員を有するヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル環の例として、限定されないが、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリルシンノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルフォリニルオキシラニルオキセパニル、チエパニル、ピペリジニルピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピロリジオニル、4−ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、1,3−ジオキシニル、1,3−ジオキサニル、1,4−ジオキシニル、1,4−ジオキサニル、1,3−オキサチアニル、1,4−オキサチイニル、1,4−オキサチアニル、2H−1,2−オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジニル、1,3−ジオキソリル、1,3−ジオキソラニル、1,3−ジチオリル、1,3−ジチオラニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリジニル、オキサゾリニルオキサゾリジニル、オキサゾリジノニルチアゾリニル、チアゾリジニル、1,3−オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニルテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ−1,4−チアジニル、チアモルフォリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンズイミダゾリジニル、及びテトラヒドロキノリンが挙げられる。

0030

「(ヘテロシクリル)アルキル」は、置換基としてアルキレン基を介して接続されたヘテロシクリル基である。例として、限定されないが、イミダゾリニルメチル及びインドリニルエチルが挙げられる。

0031

リンカー/活性剤
一態様において、本発明は、式I:



(式中、
L1、L2、Lはリンカー又はヌルを表し、
Mは結合基であり、
Qは活性剤又はヌルであり、
mは0〜6の整数であり、
nは0〜8の整数であり、
R1及びR2は各々、チオールと反応することが可能な官能基である)
として表され得るリンカー活性剤又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。

0032

幾つかの実施形態では、2個のチオール反応性官能基は、各々独立してマレイミド、ハロゲンハロゲン置換官能基、アルカナールアルカノンスルホニル−アルケン、シランイソシアネート、又はノルボルネンを含んでもよいが、両方がマレイミドになることはなく、また両方がハロゲンになることはない。

0033

特定の実施形態では、R1及びR2が各々独立して、



並びにそれらの誘導体から選択され、
式中、本実施形態では、R5、R6及びR7が独立してH、ハロゲン、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、芳香族基(aromatics)、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、NO2、CN、SCN、OR8、SR9、NR10R11、C(=O)R12、C(=O)OR8、C(=O)NR10R11、C(=S)OR8、C(=S)NR10R11、C(=S)SR9、NRl0(C=O)R12、NR10(C=S)NR10R11、O(C=O)NR10R11、SO2R9、S(=O)2OR8、及びそれらの組み合わせから選択され、
R8、R9、R10、R11、R12が独立して、H、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、及びそれらの組み合わせから選択され、
Xはハロゲンであり、幾つかの実施形態では、XがF、Cl、Br、又はIとすることができ、
R1及びR2は同じであっても異なっていてもよい。

0034

幾つかの実施形態では、Mが例えば、C−R5、N、B、P、Si−R5、芳香族基、ヘテロアリール、シクロアルキル、及び(ヘテロシクリル)アルキルから選択され、R5がH、Cl〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される。

0035

他の実施形態では、Mは、



からなる群から選択される。

0036

特定の実施形態では、Mは、



から選択される。

0037

幾つかの実施形態では、Qは活性剤であり、チューブリン結合剤、DNAアルキル化剤、DNAインターカレータ酵素阻害剤免疫調節剤ペプチド、及びヌクレオチドからなる群から選択される。

0038

幾つかの実施形態では、Qはマイタンシノイド、アウリスタチン、カリケアマイシンドキソルビシンデュオカルマイシン、及びピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される。

0039

或る特定の実施形態では、Qは、MMAE、MMAF、PBD二量体DM1及びDM4から選択される。活性剤は、例えば、国際公開第2013085925号(その全体が引用することにより本明細書の一部をなす)に開示されるもののいずれかであってもよい。「薬物」及び「活性剤」は本明細書において同じ意味で使用される。

0040

幾つかの実施形態では、内部結合部分L1及びL2が各々独立してC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、O、S、NR6、C(=O)、C(=O)O、C(=O)NR6、C=NR6、C(=S)O、C(=S)NR6、C(=S)S、NR6(C=O)、NR6(C=S)NR7、O(C=O)NR6、S(=O)2及びそれらの任意の組み合わせから選択され、
式中、本実施形態では、R6及びR7が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される。

0041

他の実施形態では、L1及びL2は各々独立して、



から選択されるか、又はヌルである。

0042

或る特定の実施形態では、L1及びL2は各々独立して、



から選択されるか、又はヌルである。

0043

Lは結合基Mに対して活性剤Qを接続するリンカーを表す。幾つかの実施形態では、Lは切断不可単位を含み、他の実施形態ではLは切断可能単位を含む。リンカー/活性剤複合体は、1個のリンカー、2個のリンカー、3個のリンカー、4個のリンカー、5個のリンカー、又は6個のリンカーを有してもよい。

0044

幾つかの実施形態では、Lが独立してC1〜C9アルキル、C2〜C9アルケニル、C2〜C9アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、O、S、NR8、C(=O)、C(=O)O、C(=O)NR8、C=NR8、C(=S)O、C(=S)NR8、C(=S)S、NR8(C=O)、NR8(C=S)NR9、O(C=O)NR8、S(=O)2、Val−Cit−PAB、Val−Ala−PAB、Val−Lys(Ac)−PAB、Phe−Lys−PAB、Phe−Lys(Ac)−PAB、D−Val−Leu−Lys、Gly−Gly−Arg、Ala−Ala−Asn−PAB、Ala−PAB、PAB及びそれらの任意の組み合わせから選択される。

0045

本実施形態では、R8及びR9が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される。

0046

幾つかの実施形態では、Lはヌルである。Lがヌルの場合、活性剤QはMに直接接続される。

0047

幾つかの実施形態では、Lは独立して、




からなる群から選択されるか、又はヌルである。

0048

幾つかの実施形態では、Lは独立して下記:



のような群から選択されるか、又はヌルである。

0049

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0050

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0051

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0052

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0053

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0054

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0055

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0056

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0057

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0058

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0059

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0060

幾つかの実施形態では、リンカー−活性剤複合体は下記式Iの構造を有する。

0061

別の態様では、本発明は、下記式II:



を有する抗体薬物複合体又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、
Aはターゲッティング部分であり、
Sはターゲッティング部分のチオール基の硫黄原子であり、
L1、L2、Lはリンカー又はヌルを表し、
Mは結合基であり、
Qは活性剤又はヌルであり、
mは0〜6から選択される整数であり、
nは0〜8から選択される整数であり、
R3及びR4は各々、Sと、チオールと反応することができる官能基との間の反応の結果として形成される。

0062

幾つかの実施形態では、チオールと反応する官能基は、独立してマレイミド、ハロゲン、ハロゲン置換官能基、アルカナール、アルカノン、スルホニル−アルケン、シラン、イソシアネート、又はノルボルネンを含んでもよいが、両方がマレイミドになることはなく、また両方がハロゲンになることはない。

0063

或る特定の実施形態では、R3及びR4が各々独立して、チオール基と、



並びにそれらの誘導体から選択される基との反応の結果として形成され、
式中、本実施形態では、R5、R6及びR7が独立してH、ハロゲン、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、NO2、CN、SCN、OR8、SR9、NR10R11、C(=O)R12、C(=O)OR8、C(=O)NR10R11、C(=S)OR8、C(=S)NR10R11、C(=S)SR9、NR10(C=O)R12、NR10(C=S)NR10R11、O(C=O)NR10R11、SO2R9、S(=O)2OR8、及びそれらの組み合わせから選択され、
式中、R8、R9、R10、R11、R12が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、及びそれらの組み合わせから選択される。

0064

或る特定の実施形態では、R3及びR4は10個以下、好ましくは5以下の炭素原子を有し、環状である及び/又はケトン基を含む。

0065

特定の実施形態では、R3及びR4が各々独立して、



及びそれらの誘導体から選択される。一実施形態では、R3及びR4は2個のスルフヒドリル基を連結し、抗体の軽鎖−重鎖をより安定にすることができる。

0066

R3又はR4がヌルである場合、L1又はL2はターゲッティング部分に直接複合体化される。

0067

R3及びR4は同じであっても異なっていてもよい。

0068

R3のみが、



であり、R3及びR4は同じであってもよい。

0069

幾つかの実施形態では、Mが例えば、C−R5、C、N、B、P、Si−R5、芳香族基、ヘテロアリール、シクロアルキル、及び(ヘテロシクリル)アルキルから選択され、R5がH、Cl〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される。他の実施形態では、Mは、



からなる群から選択される。

0070

或る特定の実施形態では、Mは、



から選択される。

0071

幾つかの実施形態では、Qは活性剤であり、チューブリン結合剤、DNAアルキル化剤、DNAインターカレータ、酵素阻害剤、免疫調節剤、ペプチド、及びヌクレオチドからなる群から選択される。「薬物」及び「活性剤」は本明細書において同じ意味で使用される。

0072

幾つかの実施形態では、Qはマイタンシノイド、アウリスタチン、カリケアマイシン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、及びPBDからなる群から選択される。

0073

或る特定の実施形態では、Qは、MMAE、MMAF、PBD、DM1及びDM4から選択される。活性剤は、例えば、国際公開第2013085925号(その全体が引用することにより本明細書の一部をなす)に開示されるもののいずれかであってもよい。

0074

幾つかの実施形態では、内部結合部分L1及びL2が各々独立してC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、O、S、NR6、C(=O)、C(=O)O、C(=O)NR6、C=NR6、C(=S)O、C(=S)NR6、C(=S)S、NR6(C=O)、NR6(C=S)NR7、O(C=O)NR6、S(=O)2及びそれらの任意の組み合わせから選択される。

0075

ここで、本実施形態では、R6及びR7が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される。

0076

他の実施形態では、L1及びL2は各々独立して、



から選択されるか、又はヌルである。

0077

或る特定の実施形態では、L1及びL2は各々独立して、



から選択されるか、又はヌルである。

0078

Lは結合基Mに対して薬物Qを接続するリンカーを表す。幾つかの実施形態では、Lは切断不可単位を含み、他の実施形態ではLは切断可能単位を含む。抗体薬物複合体は、1個のリンカー、2個のリンカー、3個のリンカー、4個のリンカー、5個のリンカー、又は6個のリンカーを有してもよい。

0079

幾つかの実施形態では、Lが独立してC1〜C9アルキル、C2〜C9アルケニル、C2〜C9アルキニル、芳香族基、ヘテロアリール、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C9ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、O、S、NR8、C(=O)、C(=O)O、C(=O)NR8、C=NR8、C(=S)O、C(=S)NR8、C(=S)S、NR8(C=O)、NR8(C=S)NR9、O(C=O)NR8、S(=O)2、Val−Cit−PAB、Val−Ala−PAB、Val−Lys(Ac)−PAB、Phe−Lys−PAB、Phe−Lys(Ac)−PAB、D−Val−Leu−Lys、Gly−Gly−Arg、Ala−Ala−Asn−PAB、Ala−PAB、PAB及びそれらの任意の組み合わせから選択される。

0080

ここで、本実施形態では、R8及びR9が独立してH、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、及びC2〜C6アルキニルから選択される。

0081

幾つかの実施形態では、Lはヌルである。Lがヌルの場合、活性剤QはMに直接接続される。

0082

幾つかの実施形態では、Lは独立して、





からなる群から選択されるか、又はヌルである。

0083

幾つかの実施形態では、Lは独立して下記:




のような群から選択されるか、又はヌルである。

0084

Aはターゲッティング部分である。幾つかの実施形態では、Aは抗体、抗体のフラグメント、サロゲート(surrogate)若しくは変異体タンパク質リガンドタンパク質スキャフォールド、ペプチド、又は低分子リガンドである。抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab’、(Fab’)2、又はscFv、Fvであってもよい。

0085

本発明に従って標的化され得る腫瘍関連抗原の例として、限定されないが、以下に列挙される腫瘍関連抗原(1)〜(36)が挙げられる。各抗原例の名称代替名、及びGenBankアクセッション番号を提示する。これらの例示的な腫瘍関連抗原に対応する核酸及びタンパク質の配列は、GenBank等の公的データベースに見ることができる。

0086

(1)BMPR1B(1B型骨形成タンパク質受容体、GenBankアクセッション番号NM_001203);
(2)E16(LAT1、SLC7A5、GenBankアクセッション番号bandit_00:3486);
(3)STEAP1(前立腺の6回膜貫通型上皮抗原、GenBankアクセッション番号NM_012449);
(4)0772P(CA125、MUC16、GenBankアクセッション番号AF361486);
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核球強化因子メソテリン、GenBankアクセッション番号NM_005823);
(6)Napi3b(NAP1−3B、NPTIlb、SLC34A2、溶質輸送体ファミリー34メンバーリン酸ナトリウム)メンバー2、II型ナトリウム依存性リン酸輸送体3b、GenBankアクセッション番号NM_006424);
(7)Sema5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、セマフォリン5b Hlog、セマドメイン、7回トロンボスポンジンリピートI型及びI型)、膜貫通領域(TM)及び短い細胞質領域、(セマフォリン)5b、GenBankアクセッション番号AB040878);
(8)PSCAhlg(2700050C12Rik、C530008016Rik、RIKEcDNA2700050C12、RIKENcDNA2700050C12遺伝子、GenBankアクセッション番号AY358628);
(9)ETBR(エンドセリン受容体、GenBankアクセッション番号AY275463);
(10)MSG783(RNF124、タンパク質FLJ20315、GenBankアクセッション番号NM_017763);
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA−1、PCANAP I、STAMPI及びSTEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子I、前立腺癌関連タンパク質I、前立腺の6回膜貫通型上皮抗原2、6回膜貫通型前立腺タンパク質、GenBankアクセッション番号AF455138);
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーM、メンバー4、GenBankアクセッション番号NM_017636);
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGFI、奇形腫由来増殖因子、GenBankアクセッション番号NP_003203又はNM_003212);
(14)CD21(CR2(2型補体受容体)又はC3DR(C3d/EBウイルス受容体)、又はHs.73792、GenBankアクセッション番号M26004);
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫グロブリン関連β)、B29、GenBankアクセッション番号NM_000626);
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(SH2ドメインのホスファターゼアンカータンパク質Iaを含む)、SPAP1B、SPAP1C、GenBankアクセッション番号NM_030764);
(17)HER2(ErbB2、GenBankアクセッション番号M11730);
(18)NCA(CEACAM6、GenBankアクセッション番号M18728);
(19)MDP(DPEP1、GenBankアクセッション番号BC017023);
(20)IL20Ra(IL20Ra、ZCYT0R7、GenBankアクセッション番号AF184971);
(21)Brevican(BCAN、BEHAB、GenBankアクセッション番号AF229053);
(22)EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5、GenBankアクセッション番号NM_004442);
(23)ASLG659(B7h、GenBankアクセッション番号AX092328);
(24)PSCA(前立腺幹細胞抗原フォーマー体(former body)、GenBankアクセッション番号AJ297436);
(25)GEDA(GenBankアクセッション番号AY260763);
(26)BAFF−R(B細胞活性化因子受容体、BLyS受容体3、BR3、GenBankアクセッション番号AF116456);
(27)CD22(B細胞受容体CD22−Bアイソフォーム、GenBankアクセッション番号AK026467);
(28)CD79a(CD79A、CD79a、Ig(CD79B)との共有結合的相互作用が可能であり、表面上でIgM分子と複合物(complex)を形成する免疫グロブリン関連α、B細胞シグナル特異的タンパク質関与する導入B細胞、GenBankアクセッション番号NP_001774.1);
(29)CXCR5(ケモカインCXCL13によって活性化されるGタンパク質共役型受容体であるバーキットリンパ腫受容体1は、リンパ球遊走及び液性防御役割を果たし、恐らくHIV−2感染、AIDS、リンパ腫、骨髄腫及び白血病に影響する、GenBankアクセッション番号NP_001701.1);
(30)HLAD0B(ペプチドを結合し、小さなリンパ(small lymphoid)においてCD4+T細胞にそれらを提示するベータサブユニットIa抗原)のMHCII分子、GenBankアクセッション番号NP_002111.1);
(31)P2X5(細胞外ATP開口型イオンチャネルであるP2Xプリン作動性受容体リガンド開口型イオンチャネル5は、シナプス伝達及び神経新生に関与し、その欠損特発性排尿筋不安定の病態生理を引き起こす可能性がある、GenBankアクセッション番号NP_002552.2);
(32)CD72(B細胞分化抗原CD72、Lyb−2、GenBankアクセッション番号NP_001773.1);
(33)LY64(ロイシンリッチリピートI型膜タンパク質(LRR)ファミリーであるリンパ球抗原64(RP105)は、B細胞活性化、アポトーシス及び機能喪失を調節し、全身性紅斑性狼瘡患者において活性の増加に関与する可能性がある、GenBankアクセッション番号NP_005573.1);
(34)FcRH1(Fe1受容体様タンパク質である免疫グロブリンドメイン受容体の推定上のFcはC2型Ig様ドメイン及びITAMドメインを含み、B細胞分化に役割を果たす可能性がある、GenBankアクセッション番号NP_443170.1);
(35)IRTA2(免疫グロブリンスーパーファミリー転座関連受容体2、推定上の免疫受容体は、B細胞発生及びリンパ腫発生に役割を果たす可能性がある;転座によって引き起こされる遺伝的障害は、幾つかのB細胞悪性腫瘍において起こる、GenBankアクセッション番号NP_112571.1);
(36)TENB2(推定上の膜貫通プロテオグリカン、増殖因子EGF/ヘレグリンファミリー及びホリスタチンに関連する、GenBankアクセッション番号AF179274)。

0087

或る特定の実施形態では、Aは腫瘍関連抗原を標的とするヒト化モノクローナル抗体である。ヒト化抗体は、限定されないが、トラスツズマブ(抗HER2)、ペルツズマブ(抗HER2)、リツキシマブ(抗CD20)、アレムツズマブ(抗CD52)、ベバシズマブ(抗VEGF)、アダリムマブ(抗TNF−アルファ)、セツキシマブ(抗EGFR)、アマツキシマブ(抗メソテリン)、ブリツモマブ(抗CD19)、ブレンツキシマブ(抗CD30)、セルトリズマブペゴール(抗TNF−アルファ)、パニツムマブ(抗EGFR)、ニモツズマブ(抗EGFR)、ゲムツズマブ(抗CD33)、ゴリムマブ(抗TNF−アルファ)、イブリツモマブ(抗CD20)、インフリキシマブ(抗TNF−アルファ)、イピリムマブ(抗CTLA−4)、オファツムマブ(抗CD20)、及びトシツモマブ(抗CD20)であってもよい。

0088

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0089

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0090

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0091

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0092

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0093

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0094

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0095

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0096

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0097

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0098

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0099

幾つかの実施形態では、抗体薬物複合体は下記式IIの構造を有する。

0100

或る特定の実施形態では、上記化合物において、限定されないが、Aはトラスツズマブを含む。

0101

治療的使用
或る特定の実施形態では、本発明の複合体は、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫肉腫及び白血病を含む癌、又はリンパ性悪性腫瘍の治療を提供する。かかる癌の更なる特定の例として、扁平細胞癌(squamous cell cancer)(例えば扁平上皮癌(epithelial squamous cell cancer));小細胞肺癌非小細胞肺癌腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌腹膜の癌;肝細胞癌消化器癌を含む胃癌(gastric or stomach cancer);膵癌膠芽腫子宮頸癌卵巣癌口腔癌肝臓癌(liver cancer);膀胱癌尿路の癌;肝癌(hepatoma);例えばHER2陽性乳癌を含む乳癌;大腸癌直腸癌結腸直腸癌子宮内膜癌又は子宮癌唾液腺癌;腎癌(kidney or renal cancer);前立腺癌;外陰部癌;甲状腺癌肝臓の癌(hepatic carcinoma);肛門癌;陰茎癌;黒色腫多発性骨髄腫及びB細胞リンパ腫;脳腫瘍頭頸部癌;並びに関連する転移が挙げられる。

0102

また、本発明の複合体を、限定されないが、炎症性障害自己免疫障害、神経系の障害及び心血管障害を含む様々な他の状態の治療に対して、活性剤を送達するために使用することもできる。

0103

診断的使用
他の実施形態では、本発明の複合体は活性剤として検出可能な実体を含む。検出可能な実体は、例えば、可視化剤であってもよい。該薬剤は合成製品又は天然産物であってもよく、顕微鏡等の好適な画像化及び/又は診断用機器によって検出可能な波長で光を反射するか発することができる。好適な可視化剤の非限定的な例として、有機染料食用色素、及び蛍光染料が挙げられる。

0104

したがって、一実施形態では、本発明は、目的の分析物を有することが疑われる試料と、本発明の抗体薬物複合体とを接触させることを含む診断方法であって、上記ターゲット部分が目的の分析物に選択的に結合し、Qが検出可能な実体、及び/又は1以上の追加の実体が結合する実体であり、該1以上の追加の実体自体が検出可能な実体であり、上記方法が上記試料を分析して、検出可能な実体の存在を判定することを更に含み、その存在が目的の分析物の存在の指標となる、診断方法を提供する。一実施形態では、上記分析物はHER2又は癌と関連する他の抗原である。in vivoで又はin vitroで上記方法を行ってもよい。

0105

複合体の生物学的活性
本明細書における本発明の複合体を、既知の方法を使用して効力及び毒性について評価することができる。例えば、特定の化合物の毒性評価(toxicology)、又は或る特定の化学部分を共有する化合物のサブセットの毒性評価は、哺乳動物の細胞株、好ましくはヒトの細胞株等に対するin−vitro毒性を判定することによって確立され得る。かかる研究の結果は、哺乳動物、又はより具体的にはヒト等の動物における毒性の予測であることが多い。代替的には、マウス、ラットウサギイヌ、又はサル等の動物モデルにおける特定の化合物の毒性を既知の方法を使用して判定することができる。

0106

特定の化合物の効力は、in−vitro法、動物モデル、又はヒト臨床試験等の当該技術分野で認識される方法を使用して確立され得る。癌、心血管疾患、及び様々な免疫系機能不全、並びに感染性疾患を含む、本明細書に開示される化合物によって緩和される状態を含む、ほぼ全ての種類の状態について、当該技術分野で認識されるin−vitroモデルが存在する。同様に、許容可能な動物モデルを使用して、かかる状態を治療するための化学物質の効力を確立することができる。効力を判定するためにモデル選択する場合、当業者は、適切なモデル、用量、並びに投与経路及び投与計画を選択するため最先端技術水準によって導くことができる。

0107

本明細書で提供される複合物を、抗体のアッセイに従来使用される方法のいずれかによって所望の標的に対する結合親和性及び特異性についてアッセイしてもよい。上記複合物を、細胞培養物に対する効能に関するアッセイ、異種移植片アッセイ等といった、細胞分裂阻害剤/細胞毒性剤のアッセイに従来使用される方法のいずれかによって、抗癌剤としての効力についてアッセイしてもよい。

0108

本開示の利益を有する当業者は、利用可能な技術及び文献を考慮すれば、好適なアッセイ技術の決定において;それらのアッセイの結果から、抗癌剤としてヒトにおいて試験するための好適な用量の決定において;またそれらの試験の結果から、ヒトにおいて癌を治療するために使用される好適な用量の決定において困ることはないであろう。

0109

製剤化及び投与
本発明の組成物は、本明細書に記載される複合物に加えて、投与後に動物において標的への複合物の輸送を可能とする生理学的に許容可能な担体及び/又は希釈剤を含む。担体及び/又は希釈剤は、一般的には、それによって所望の目的が達成され、所望の標的に向けられる複合体の能力に影響を及ぼさない、また所望の効果のためこの標的に活性剤を輸送する任意の好適な媒質とすることができる。特に、担体及び/又は希釈剤は、動物の身体内で又は身体に対して所望の標的に向けられる活性剤の薬理学的効能及び複合物の能力を低下させるものであってはならない。上記担体及び/又は希釈剤は、水、塩及び/又はバッファーを含む生理学的に許容可能な水溶液、並びに動物への投与に関して許容可能な任意の他の溶液から選択されることが好ましい。かかる担体及び希釈剤は当業者によく知られており、例えば、蒸留水脱イオン水、純水又は超純水生理食塩水リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、薬物標的システムの他の成分と適合する通常のバッファーを含む溶液等であってもよい。

0110

上記組成物は、限定されないが、(a)カプセル剤錠剤顆粒剤スプレー剤シロップ剤、又は他のかかる形態での投与を含む経口経路による投与;(b)水性懸濁液油性製剤等、又は点滴坐剤膏薬軟膏等としての投与を含む非経口経路による投与;皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等の注射による投与;また同様に、本発明の実施形態の化合物を生きた組織と接触させるため当業者によって適切であるとされる(c)局所投与、(d)直腸投与、又は(e)経膣投与;並びに(f)制御放出製剤デポ製剤及び輸液ポンプ送達による投与、を含む方法によって被験体に投与され得る。

0111

かかる投与様式の更なる例として、また投与様式の更なる開示として、眼内、鼻腔内、及び耳介内の経路による投与様式を含む、開示される化合物及び医薬組成物の投与に関する様々な方法が本明細書に開示される。

0112

特定の実施形態では、本発明の複合物は、静脈内投与用の溶液として、又は静脈内溶液を調製するための再構成凍結乾燥濃縮物(例えば、通常の生理食塩水、5%デキストロース、又は同様の等張溶液により再構成される)として製剤化され得る。本発明の複合物は、典型的には静脈内の注射又は点滴によって投与される。医薬の製剤化、特に抗癌抗体の製剤化の技術分野の当業者は、利用可能な技術及び文献を考慮すれば、好適な製剤の開発に困ることはないであろう。

0113

以下は、本発明を実施するための手順を示す実施例である。これらの実施例は限定するよう解釈されるべきものではない。

0114

実施例Iリンカー−活性剤複合体の合成
実施例I−1化合物9の合成



i)Et3N、MeOH、室温、2時間;ii)NaH、THF、室温、5時間;iii)塩酸、1,4−ジオキサン、室温、16時間;iv)NaHCO3、H2O/THF、室温、3時間;v)HOBt、DIC、DIPEA、DMF、室温、12時間;vi)Et3N、CH2Cl2、室温、2時間。

0115

化合物2の合成
1,3−ジアミノ2−プロパノール(3.15g、0.035mol)及びEt3N(4.85mL、0.035mol)のメタノール(120mL)溶液を45℃に加熱した。メタノール(80mL)中(Boc)2O(17.05g、0.078mol)を該溶液に徐々に滴加した。該反応溶液を45℃で30分間撹拌した。更に室温で1.5時間撹拌した後、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物ジエチルエーテル(200mLで3回)で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させて白色粉末として化合物2(9.94g、97.8%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、291.19(M+H)+。

0116

化合物3の合成
ブロモ酢酸tert−ブチル(5.41mL、33.5mmol)を室温で化合物2(3.89g、13.4mmol)の乾燥THF(40mL)溶液に添加した。その後、該溶液に水素化ナトリウム鉱物油中60%の分散物、2.42g、60.5mmol)を添加した。混合物を5時間後に濾過した。濾液蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィー石油エーテル酢酸エチル=10:1〜5:1)によって精製して白色固体として生成物3(3.96g、73.1%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、405.26(M+H)+。

0117

化合物4の合成
5mLの塩酸を化合物3(1.0g、2.5mmol)の1,4−ジオキサン(10mL)撹拌溶液に室温で添加した。反応を16時間後に完了した。その後、溶媒を除去して白色の粗生成物(384.2mg、69.8%)を得た。生成物4は精製せずに次の工程で使用可能であった。LC−MS m/z(ES+)、221.05(M+H)+。

0118

化合物5の合成
0℃の化合物4(242.1mg、1.1mmol)の飽和重炭酸ナトリウム溶液/THF(体積/体積=1:1、20mL)溶液に塩化アクリロイル(267μL、3.3mmol)を添加した。得られた混合物を0℃で勢いよく撹拌した。10分後、溶液を室温にし、3時間反応させた。混合物を塩酸で酸性化してpH4未満に調整した。該混合物を酢酸エチル(50mLで2回)で抽出した。有機層を合わせ、飽和塩ナトリウム溶液(40mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して溶媒を除去した。固体残渣を分取HPLCによって精製し、灰色の粉末として生成物5(196.0mg、69.6%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、257.12(M+H)+。

0119

化合物7の合成
0℃の化合物5(25.6mg、0.10mmol)及びDIPEA(16.5μl、0.10mmol)の乾燥DMF(6ml)撹拌溶液にHOBt(14.9mg、0.11mmol)及びDIC(13.9mg、0.11mmol)を添加した。15分後、化合物6(20.5mg、0.09mmol)を該溶液に添加した。反応混合物を室温まで温め、一晩撹拌した。該混合物を水(10mL)で希釈し、酢酸エチル(20mLで3回)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を真空で除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=3:1)によって精製し、白色固体として化合物7(24.3mg、62.6%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、467.22(M+H)+。

0120

化合物9の合成
化合物7(140.1mg、0.3mmol)を5mLのCH2Cl2に溶解し、氷浴中0℃に冷却した。Et3N(1mg、0.01mmol)及び化合物8(73.7mg、0.1mmol)を得られた混合物に添加し、撹拌しながら30分間放置した。溶液を室温まで温め、更に1.5時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、固体残渣を分取HPLCによって精製して白色粉末として化合物9(90mg、74.8%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1204.49(M+H)+。

0121

実施例I−2化合物17の合成



i)Et3N、CH2Cl2、室温、5時間;ii)Et3N、THF、室温、4時間;iii)CH2Cl2、室温、12時間;iv)TFA、CH2Cl2、室温、3時間;v)K2CO3、H2O/EtOAc、室温、5h;vi)HOBt、DIC、DIPEA、DMF、室温、24時間。

0122

化合物11の合成
化合物10(263.3mg、1.15mmol)をCH2Cl2(15mL)に溶解し、Et3N(5.9μL、0.04mmol)及び化合物6(300.1mg、0.39mmol)を0℃の得られた混合物に添加した。溶液を室温に温め、5時間維持した。真空で溶媒を除去し、粗生成物を分取HPLCによって精製して白色固体として化合物11(193.2mg、49.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、994.43(M+H)+。

0123

化合物13の合成
THF(15mL)中の化合物12(0.45g、4.2mol)とEt3N(8mL、0.06mol)との混合物に、2−(tert−ブトキシカルボニルオキシイミノ)−2−フェニルアセトニトリル(2.1g、8.3mol)のTHF(30mL)溶液を0℃で滴加した。添加の完了に続いて、溶液を室温に温め、撹拌しながら4時間放置した。反応混合物を減圧下で油になるまで濃縮し、CH2Cl2(50mL)を添加した。該混合物を水酸化ナトリウム(5%、30mL)及び塩水(30mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、MeOH:CH2Cl2=1:10、体積/体積)によって精製し、黄色の油として化合物13(803.1mg、60.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、304.22(M+H)+。

0124

化合物14の合成
無水コハク酸(265.2mg、2.65mmol)を化合物13(800.1mg、2.65mmol)のCH2Cl2(10mL)溶液に添加した。混合物を一晩室温で撹拌した後、減圧下で油になるまで濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、MeOH:CH2Cl2=1:8、体積/体積)で精製し、灰色の油として化合物14(506.5mg、47.6%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、404.24(M+H)+。

0125

化合物15の合成
化合物14(503.5mg、1.25mmol)をトリフルオロ酢酸(2mL)と共にCH2Cl2(10mL)に溶解した。溶液を室温で3時間反応させた。減圧下で溶媒を除去し、更に精製することなく灰色の油として化合物15(190.2mg、75.1%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、204.13(M+H)+。

0126

化合物16の合成
水(5mL)中の炭酸カリウム(68.3mg、0.5mmol)と酢酸エチル(10mL)中の化合物15(67.2mg、0.33mmol)との混合物に、塩化アクリロイル(53.6μL、0.67mmol)の酢酸エチル(10mL)溶液を0℃で滴加した。得られた混合物を氷浴中0℃で10分間撹拌した後、室温で5時間反応させた。混合物を塩酸で酸性化してpH5未満に調整した。該混合物を酢酸エチル(20mLで2回)で抽出した。有機層を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液(20mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。固体残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=10:1)によって精製し、黄色油として生成物16(63.1mg、61.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、312.15(M+H)+。

0127

化合物17の合成
化合物16(22.2mg、0.07mmol)、HOBt(9.7mg、0.07mmol)及びDIC(11μL、0.07mmol)を8mLのDMFに溶解し、氷浴中0℃に冷却した。その後、化合物11(59.1mg、0.06mmol)及びDIPEA(12.4μL、0.07mmol)を混合物に添加した。溶液を室温まで温め、放置して24時間反応させた。得られた混合物を濃縮し、分取HPLCによって精製して白色固体として化合物17(11.3mg、39.5%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1287.56(M+H)+。

0128

実施例I−3化合物25の合成



i)HOBt、DIPEA、ピリジン、DMF、室温、32時間;ii)DEA、DMF、室温、2時間;iii)Et3N、CH2Cl2、室温、4時間;iv)Et3N、CH2Cl2、室温、12時間;v)EDCI、HOBt、DIPEA、CH2Cl2、室温、24時間。

0129

化合物20の合成
窒素下で0℃の化合物18(191.6mg、0.25mmol)の乾燥DMF(15mL)撹拌溶液に、HOBt(33.8mg、0.25mmol)及び化合物19(197.3mg、0.26mmol)を添加した。15分後、ピリジン(3mL)及びDIPEA(52.4μL、0.30mmol)を添加し、0℃で30分間反応させた。その後、反応混合物を室温まで温め、3時間撹拌した。該混合物にDIPEA(52.4μL、0.30mmol)を補充し、32時間反応させた。反応の完了に際して、減圧下で溶媒を除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=20:1)で精製し、白色固体として化合物20(126.4mg、37.5%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1344.77(M+H)+。

0130

化合物21の合成
ジエチルアミン(4mL、38.8mmol)を室温で化合物20(126.4mg、0.1mmol)のDMF(8mL)溶液に添加した。2時間撹拌した後、減圧下で溶媒を除去し、粗生成物21(104.1mg、99%)を得た。該生成物は精製せずに次の工程で使用可能であった。LC−MS m/z(ES+)、1123.72(M+H)+。

0131

化合物23の合成
塩化アクリロイル(7.31mL、90.00mmol)の乾燥CH2Cl2(50mL)溶液を、アルゴン下の0℃の乾燥CH2Cl2(60mL)中の化合物22(2.64g、20.00mmol)とEt3N(16.60mL、120.00mmol)との混合物に滴加した。混合物を室温にし、4時間反応させた。その後、該混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液(150mL)及び塩水(150mL)で処理し、CH2Cl2(150mLで3回)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を真空で除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=10:1)によって精製し、白色固体として化合物23(4.88g、83.0%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、295.10[M+H]+。

0132

化合物24の合成
化合物23(444.1mg、1.5mmol)及びEt3N(0.23mL、1.66mmol)のCH2Cl2(30mL)溶液に、CH2Cl2(5mL)中のメルカプト酢酸(0.23mL、3.32mmol)を氷浴下で滴加した。添加の完了に続いて、溶液を室温に温め、撹拌しながら一晩放置した。真空で溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=60:1〜30:1)で精製し、黄色の油として化合物24(1.72g、36.87%)を得た。LC−MS m/z(ES−)、385.10(M−H)−。

0133

化合物25の合成
化合物24(22.2mg、0.057mmol)、HOBt(9.3mg、0.069mmol)及びEDCI(16.5mg、0.086mmol)を5.0mLのCH2Cl2に溶解した。その後、化合物21(64.5mg、0.063mmol)及びDIPEA(20.3μL、0.104mmol)を混合物に添加した。溶液を室温まで温め、24時間反応させた。得られた溶液を分取HPLCによって分離し、白色固体として化合物25(25.3mg、29.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1479.80(M+H)+。

0134

実施例I−4化合物31の合成



i)HOBt、DIPEA、ピリジン、DMF、室温、24時間;ii)DEA、DMF、室温、2.5時間;iii)Et3N、CH2Cl2、室温、12時間;iv)DIC、HOBt、DIPEA、DMF、室温、24時間。

0135

化合物27の合成
窒素下、0℃の化合物18(194.2mg、0.25mmol)の乾燥DMF(15mL)溶液にHOBt(34.2mg、0.25mmol)及び化合物26(200.3mg、0.28mmol)を添加した。15分間撹拌した後、ピリジン(3mL)及びDIPEA(53.1μL、0.32mmol)を添加し、0℃で放置して30分間反応させた。その後、反応混合物を室温で3時間撹拌した。該混合物にDIPEA(53.1μL、0.32mmol)を補充し、更に24時間反応させた。反応の完了に際して、該混合物を真空で濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固体として化合物27(126.2mg、37.0%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1398.75(M+H)+。

0136

化合物28の合成
ジエチルアミン(4mL)を室温で化合物27(126.2mg、0.09mmol)のDMF(8mL)溶液に添加した。2.5時間撹拌した後、減圧下で溶媒を除去し、粗生成物28(73.3mg、68.9%)を得て、それを精製せずに使用することができた。LC−MS m/z(ES+)、1176.68(M+H)+。

0137

化合物30の合成
化合物29(1.87mg、7.5mmol)及びEt3N(104μL、0.75mmol)のCH2Cl2(40mL)溶液に、CH2Cl2(10mL)中のメルカプト酢酸(103.9μL、1.5mmol)を0℃で滴加した。添加の完了に際して、溶液を室温に温め、撹拌しながら一晩放置した。真空で溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固体として化合物30(1.72g、36.87%)を得た。LC−MS m/z(ES−)、342.11(M−H)−。

0138

化合物31の合成
化合物30(22.2mg、0.065mmol)、HOBt(8.8mg、0.065momol)及びDIC(11μL、0.065mmol)をDMF(8mL)に添加し、氷浴中0℃に冷却した。化合物28(63.7mg、0.054mmol)及びDIPEA(12.4μL、0.054mmol)を溶液に添加した。混合物を室温に温め、放置して24時間反応させた。残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=60:1〜30:1)で精製して、白色固体として化合物31(11.3mg、39.5%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1499.78(M+H)+。

0139

実施例I−5化合物36の合成



i)K2CO3、EtOAc/H2O、室温、2時間;ii)EDCI、DMF、室温、12時間;iii)DIPEA、DMF、室温、12時間;iv)EDCI、HOBt、DIPEA、DMF、室温、24時間。

0140

化合物33の合成
2,4−ジアミノ安息香酸32(501.8mg、3.3mmol)を酢酸エチル(20mL)に分散させ、炭酸カリウム(9.0g、66mmol)の水溶液(20mL)を添加した。混合物に、塩化アクリロイル(1mL、13mmol)を注意深く添加し、淡褐色沈澱を形成させた。その後、該反応混合物を室温にし、沈殿を溶解させた。2時間後、反応が完了した。有機層を廃棄し、水層を5%塩酸で酸性化して、pH4未満で沈殿を生じさせた。沈殿を濾過し、石油エーテルで洗浄し、酢酸エチルで希釈した。その後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空で除去した。固体残渣を水に懸濁し、濾過し、ジエチルエーテルで十分に洗浄して、灰色の粉末として生成物33(670.2mg、78%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、261.09(M+H)+。

0141

化合物34の合成
化合物33(260.1mg、1.0mmol)及びEDCI(210.9mg、1.1mmol)、N−ヒドロキシスクシンイミド(126.6mg、1.1mmol)をDMF(14mL)に溶解した。溶液を室温で一晩撹拌した。反応の完了に際して、減圧下で溶媒を除去した。CH2Cl2/MeOH(10:1)を溶離液とするカラムクロマトグラフィーで固体残渣を精製し、淡褐色の固体として生成物34(273mg、76.4%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、358.11(M+H)+。

0142

化合物35の合成
4−アミノ酪酸(82.4mg、0.8mmol)及びDIPEA(489μL、2.8mmol)のDMF(10mL)溶液に、氷浴中0℃で化合物34(260.7mg、0.73mmol)のDMF(10mL)溶液を添加した。混合物を0℃で10分間撹拌した後、室温で一晩撹拌した。反応が完了すると溶媒を真空で除去した。固体残渣をカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH=10:1、体積/体積)によって精製して化合物35(192.3mg、76.2%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、346.14(M+H)+。

0143

化合物36の合成
HOBt(14.9mg、0.11mmol)、EDCI(21.1mg、0.11mmol)及びDIPEA(19.2μL、0.11mmol)を0℃で化合物35(34.5mg、0.1mmol)の乾燥DMF(10ml)撹拌溶液に添加した。15分後、化合物21(112.3mg、0.1mmol)を添加した。反応混合物を室温に温め、24時間撹拌した。該混合物に水(15mL)を添加し、酢酸エチル(20mLで3回)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して、真空で除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH=10:1、体積/体積)によって精製し、白色固体として化合物36(56.5mg、39%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1450.84(M+H)+。

0144

実施例I−6化合物43の合成



i)DMAP、CH2Cl2、室温、1時間;ii)NaOH、EtOH/H2O、80℃、2時間;iii)EDCI、HOBt、DIPEA、DMF、室温、18時間;(iv)EEDQ、CH2Cl2、MeOH、室温、18時間。

0145

化合物38の合成
100mL容の丸底フラスコに化合物37(1.05g、6.9mmol)及びDMAP(1.94g、15.9mmol)のCH2Cl2(20mL)溶液を入れ、0℃で撹拌しながら塩化アクリロイル(1.38g、15.2mmol)を滴加した。反応物を室温で1時間撹拌した。反応を水(50mL)の添加によってクエンチし、CH2Cl2(20mLで3回)で抽出した。有機相を合わせ、飽和重炭酸ナトリウム溶液(30mL)及び塩水(30mL)で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、淡黄色の半固体として化合物38(1.51g、85.8%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、253.04(M+H)+。

0146

化合物39の合成
化合物38(1.56g、5.94mmol)及び4−アミノブタン酸(673.0mg、6.53mmol)を水(15mL)中の水酸化ナトリウム(713.3mg、17.82mmol)と共にEtOH(15ml)に溶解した。反応混合物を80℃で2時間撹拌した。室温に冷却した後、減圧下で溶媒を濃縮した。該混合物を塩酸(0.5N)でph7未満に酸性化した。固体を濾過によって回収し、水(10mLで2回)で洗浄し、乾燥してオフホワイト色の固体として化合物39(490.2mg、25.8%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、320.03(M+H)+。

0147

化合物41の合成
化合物39(230.1mg、0.72mmol)、HOBt(116.7mg、0.86mmol)、EDCI(151.8mg、0.79mmol)及びDIPEA(279.2mg、2.2mmol)をDMF(20mL)に添加し、氷浴中0℃で撹拌した。1時間後、化合物40(149.1mg、0.79mmol)を溶液に添加した。混合物を室温に温め、放置して18時間反応させた。該反応混合物を塩水(50mL)で希釈し、酢酸エチル(20mLで3回)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=200/1〜10/1、体積/体積)によって精製して、黄色固体として化合物41(97.3mg、27.6%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、490.23(M+H)+。

0148

化合物43の合成
化合物41(90.1mg、0.18mmol)、EEDQ(54.6mg、0.22mmol)の無水CH2Cl2(7ml)及び無水MeOH(0.07mL)溶液を室温で1時間撹拌した。その後、化合物42(133.5mg、0.184mmol)を添加した。反応混合物を更に18時間撹拌した。該反応混合物を真空で濃縮し、分取HPLCによって精製して白色固体として化合物43(12.3mg、5.6%)得た。LC−MS m/z(ES+)、1197.51(M+H)+。

0149

実施例I−7化合物49の合成



i)HCl(g)、MeOH、0℃、2時間;ii)ピリジン、100℃、2時間;iii)NaOH、THF/H2O、室温、4時間;iv)EDCI、HOBt、DIPEA、DMF、室温、18時間;v)EEDQ、CH2Cl2/MeOH、室温、18時間。

0150

化合物45の合成
化合物44(1.13g、6.53mmol)のメタノール(30mL)溶液に、塩酸(気体)を0℃で撹拌しながら投入した。反応物を0℃で2時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣を水(50mL)に溶解した。該混合物を飽和重炭酸ナトリウムで8に調整し、酢酸エチル(20mLで3回)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮して、黄色固体として化合物45(710.1mg、65.1%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、168.07(M+H)+。

0151

化合物46の合成
塩化アクリロイル(947.1mg、10.47mmol)を氷浴中0℃で撹拌しながら化合物45(700.5mg、4.19mmol)のピリジン(20mL)溶液に滴加した。反応混合物を100℃で2時間撹拌した。室温に冷却した後、該反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=200/1〜10/1、体積/体積)によって精製し、黄色固体として化合物46(520.4mg、45.2%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、276.09(M+H)+。

0152

化合物47の合成
化合物46(510.2mg、1.85mmol)、水酸化ナトリウム(370.6mg、9.26mmol)、THF(10mL)及び水(10mL)の混合物を室温で4時間撹拌した。反応の完了に際して、該混合物を濃縮し、塩酸(1N)でpH7に調整した。化合物47(360.2mg、74.1%)をオフホワイト色の固体として濾過によって回収した。LC−MS m/z(ES+)、262.07(M+H)+。

0153

化合物48の合成
化合物47(120.5mg、0.5mmol)、HOBt(4.7mg、0.6mmol)、EDCI(96.8mg、0.5mmol)及びDIPEA(178.1mg、1.4mmol)をDMF(10mL)に添加し、氷浴中0℃で撹拌した。1時間後、化合物40(95.1mg、0.5mmol)を溶液に添加した。混合物を室温に温め、放置して18時間反応させた。該反応混合物を塩水(20mL)で希釈し、酢酸エチル(10mLで3回)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=100/1〜20/1、体積/体積)によって精製して、白色固体として化合物41(71mg、35.8%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、432.07(M+H)+。

0154

化合物49の合成
化合物48(60.2mg、0.14mmol)、EEDQ(41.3mg、0.17mmol)を無水CH2Cl2(6ml)及び無水MeOH(0.06mL)に溶解し、撹拌しながら室温で1時間放置した。化合物42(100.9mg、0.14mmol)を溶液に添加した。反応混合物を更に18時間撹拌した。該反応混合物を減圧下で濃縮し、分取HPLCによって精製して白色固体として化合物49(12.4mg、7.61%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1139.45(M+H)+。

0155

実施例I−8化合物55の合成



i)Et3N、MeOH、室温、3時間;ii)Na2CO3、THF/H2O、室温、3時間;iii)HOBt、DIC、DIPEA、DMF、室温、12時間;iv)TFA、CH2Cl2、室温、3時間;v)Et3N、CH2Cl2、室温、2時間;vi)

0156

化合物50の合成
Et3N(332.7μL、2.4mmol)を45℃の化合物4(440.0mg、2mmol)のMeOH(10mL)溶液に添加した。その後、(Boc)2O(436.2mg、2mmol)のMeOH(10mL)溶液を添加した。得られた混合物を45℃で30分間勢いよく撹拌した後、室温で2時間撹拌した。溶媒を除去した後、残渣を塩酸(5%、10mL)、飽和塩化ナトリウム溶液(15mL)で洗浄し、酢酸エチル(10mLで3回)で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空で除去した。固体残渣を石油エーテル/酢酸エチル(10mL、体積:体積=2:1)によって再結晶化して白色粉末として化合物50(375.4mg、75.6%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、249.15(M+H)+。

0157

化合物51の合成
塩化アクリロイル(121μL、1.5mmol)を0℃の化合物50(248.0mg、1.0mmol)の飽和重炭酸ナトリウム溶液/THF(体積/体積=1:1、20mL)溶液に添加した。得られた混合物を0℃で10分間勢いよく撹拌した。該混合物を室温にし、3時間反応させた。該混合物を塩酸で酸性化してpHを4未満に調整した。該混合物を酢酸エチル(20mLで3回)によって抽出した。有機層を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液(30mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して、溶媒を除去した。固体残渣を分取HPLCによって精製し、灰色の油として生成物51(176.1mg、58.3%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、303.16(M+H)+。

0158

化合物52の合成
化合物51(30.2mg、0.1mmol)、HOBt(14.7mg、0.11mmol)及びDIC(13.9mg、0.11mmol)を乾燥DMF(6mL)に溶解し、氷浴中0℃に冷却した。15分後、化合物6(20.5mg、0.09mmol)及びDIPEA(19.2μL、0.11mmol)を混合物に添加した。溶液を室温に温め、一晩撹拌した。該混合物を水(10mL)で希釈し、酢酸エチル(20mLで3回)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空で溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH=20:1、体積/体積)によって精製し、白色固体として化合物52(28.2mg、60.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、513.26(M+H)+。

0159

化合物53の合成
化合物52(28.2mg、0.06mmol)、トリフルオロ酢酸(1.0mL)のCH2Cl2(5mL)溶液を、室温で3時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、灰色固体として化合物53(20.4mg、88.2%)を得て、それを更に精製することなく次の工程で使用することができた。LC−MS m/z(ES+)、413.21(M+H)+。

0160

化合物54の合成
化合物53(41.2mg、0.1mmol)を10mLのDMFに溶解し、氷浴中0℃に冷却した。Et3N(6.9μL、0.05mmol)及び化合物8(73.7mg、0.1mmol)を溶液に滴加し、撹拌しながら30分間放置した。該溶液を室温に温め、更に5時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製して白色粉末として化合物54(73mg、63.6%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1148.47(M+H)+。

0161

化合物55の合成
臭化ブロモアセチル(150.0mg、0.75mmol)を0℃の化合物54(573.7mg、0.5mmol)のDMF(10mL)溶液に添加した。得られた混合物を0℃で10分間撹拌した後、室温で更に3時間撹拌した。該混合物に水(20mL)を添加し、酢酸エチル(20mLで3回)で抽出した。合わせた有機層を濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製して黄色粉末として化合物55(421mg、66.4%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1270.38(M+H)+。

0162

実施例I−9化合物59の合成



化合物11
i)K2CO3、H2O/EtOAc、室温、5時間;ii)CHCl3、還流、12時間;iii)Ac2O、NaAc、100℃、2時間;iv)HOBt、DIC、DIPEA、DMF、室温、24時間。

0163

化合物56の合成
水(5mL)中の炭酸カリウム(51.2mg、0.37mmol)と酢酸エチル(10mL)中の化合物15(50.0mg、0.25mmol)との混合物に塩化アクリロイル(16μL、0.2mmol)の酢酸エチル(8mL)溶液を0℃で徐々に滴加した。添加の完了に際して、得られた混合物を氷浴中0℃で更に10分間撹拌した。その後、該混合物を室温にし、5時間反応させた。該混合物を塩酸で酸性化してpHを5未満に調整した。該混合物を酢酸エチル(15mLで3回)で抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム溶液(15mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。固体残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=8:1)で精製し、灰色の油として生成物56(26.2mg、40.1%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、258.14(M+H)+。

0164

化合物57の合成
化合物56(26.0mg、0.10mmol)をCHCl3(10mL)中で撹拌し、無水マレイン酸(28.1mg、0.11mmol)を混合物に添加した。反応物を加熱し、12時間還流させた。室温に冷却した後、沈澱した固体生成物を濾過し、CHCl3(30mLで3回)で洗浄して、白色固体として化合物57(20.1mg、59.1%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、356.14(M+H)+。

0165

化合物58の合成
化合物57(20.1mg、0.054mmol)及び酢酸ナトリウム(6.3mg、0.047mmol)の無水酢酸(10mL)溶液を100℃で2時間加熱した。一旦反応が完了すると、反応溶液を撹拌しながら砕いたにゆっくりと注ぎ、氷冷水を添加した。1時間撹拌した後、固体を沈澱させた。固体残渣を濾過し、氷冷水(15mLで3回)で洗浄して白色固体として化合物58(9.1mg、46.1%)を得た。LC−MS m/z(ES+),338.13(M+H)+。

0166

化合物59の合成
化合物58(8.1mg、0.02mmol)、HOBt(3.25mg、0.02mmol)及びDIC(3.7μL、0.02mmol)を5mLのDMFに溶解し、氷浴中0℃に冷却した。その後、化合物11(20.1mg、0.02mmol)及びDIPEA(4.1μL、0.02mmol)を混合物に添加した。溶液を室温に温め、放置して24時間反応させた。得られた混合物を濃縮し、分取HPLCによって精製して、白色固体として化合物59(9.3mg、34.9%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1313.53(M+H)+。

0167

実施例I−10化合物64の合成



i)DMF、80℃、6時間;ii)K2CO3、EtOAc/H2O、室温、5時間;iii)Ac2O、NaAc、90℃、3時間;iv)HOBt、DIC、DIPEA、DMF、室温、24時間。

0168

化合物60の合成
化合物32(140.0mg、0.9mmol)のDMF(6mL)溶液に、無水マレイン酸(89.8mg、0.9mmol)を滴加した。混合物を60℃で6時間撹拌した後、減圧下で油になるまで濃縮した。酢酸エチル(5ml)からの再結晶化により、化合物60(白色固体、209.1mg、90.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、(M+H)+251.06。

0169

化合物61の合成
水(15mL)中の炭酸カリウム(201.3mg、1.4mmol)と酢酸エチル(20mL)中の化合物60(209.1mg、0.9mmol)との混合物に塩化アクリロイル(90μL、1.1mmol)の酢酸エチル(10mL)溶液を0℃で滴加した。添加の完了の際、混合物を室温に温め、5時間反応させた。該混合物を塩酸で酸性化してpH5未満に調整した。該混合物を酢酸エチル(20mLで2回)で抽出した。有機層を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液(20mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて濾過した。真空で溶媒を除去し、灰色の固体として化合物61(201.0mg、82.7%)を得て、それを更に精製することなく次の工程で使用することができた。LC−MS m/z(ES+)、(M+H)+304.07。

0170

化合物62の合成
粗化合物61(201.0mg、0.7mmol)の無水酢酸(30mL)溶液に酢酸ナトリウム(60.5mg、0.7mmol)を添加した。混合物を90℃で3時間撹拌した。該反応混合物を氷水に注ぎ、30分間撹拌し、酢酸エチル(20mLで3回)で抽出した。合わせた有機層を濃縮し、分取HPLCによって精製して、白色固体として化合物62(92.2mg、48.6%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、(M+H)+287.06。

0171

化合物64の合成
化合物62(57.0mg、0.2mmol)、HOBt(27.2mg、0.2mmol)、DIC(29.3μL、0.2mmol)及びDIPEA(0.2mmol、33.1μL)をDMF(6mL)に添加した。30分後、化合物63(109.8mg、0.15mmol)を0℃で添加した。混合物を室温で24時間撹拌した。溶液を濃縮し、分取HPLCによって精製して白色固体として化合物64(94.8mg、47.6%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1000.53(M+H)+。

0172

実施例I−11化合物69の合成



i)DMF、還流、12時間;iii)Ac2O、NaAc、還流、6時間;iii)DMF、80℃、12時間;iv)HOBt、DIC、DIPEA、NMP、室温、36時間。

0173

化合物66の合成
DMF(6mL)中の化合物65(145.0mg、1.0mmol)の混合物に、無水マレイン酸(89.8mg、0.9mmol)を徐々に滴加した。混合物を加熱して12時間還流させた。室温に冷却した後、沈澱した固体生成物を濾過し、CH2Cl2(20mLで3回)で洗浄して白色固体として化合物66(110.2mg、45.1%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、244.02(M+H)+。

0174

化合物67の合成
無水酢酸(10mL)中の化合物66(110.2mg、0.5mmol)と酢酸ナトリウム(14.2mg、0.2mmol)との混合物を加熱して6時間還流させた。一旦反応が完了すると、反応混合物を撹拌しながら砕いた氷にゆっくりと注ぎ、氷冷水を添加した。固体残渣を1時間の撹拌の後に沈澱させた。該固体残渣を濾過し、氷冷水(10mLで3回)で洗浄して白色固体として化合物67(87.3mg、85.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+),226.01(M+H)+。

0175

化合物68の合成
無水コハク酸(38.8mg、0.4mmol)をDMF(6mL)中の化合物67(87.3mg、0.4mmol)の混合物に添加した。該混合物を80℃で一晩撹拌した後、減圧下で油になるまで濃縮した。粗生成物を分取HPLCで精製し、白色固体として化合物68(45.0mg、35.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、326.02(M+H)+。

0176

化合物69の合成
化合物68(45.0mg、0.14mmol)、HOBt(19.0mg、0.14mmol)、DIC(20.5μL、0.14mmol)及びDIPEA(23.2μL、0.14mmol)をDMF(10mL)に添加し、氷浴中0℃で1時間撹拌した。化合物63(76.9mg、0.11mmol)を溶液に添加した。混合物を室温まで温め、放置して36時間反応させた。該反応混合物を分取HPLCによって精製し、白色固体として化合物69(64.3mg、44.3%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1039.49(M+H)+。

0177

実施例I−12化合物74の合成



i)Et3N、n−ブタノール、90℃、18時間、ii)Et3N、CH2Cl2、室温、18時間、iii)EDCI、HOBt、DIPEA、DMF、室温、18時間、iv)EEDQ、CH2Cl2、MeOH、室温、18時間。

0178

化合物71の合成
化合物69(1.0g、6.10mmol)及び4−アミノブタン酸(691.9mg、6.71mmol)及びトリエチルアミン(3.09g、30.5mmol)をn−ブタノール(30mL)に溶解した。反応混合物を90 で18時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を減圧下で濃縮した。残渣を水(100mL)で希釈し、酢酸エチル(30mLで3回)で抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=200/1〜10/1、体積/体積)により精製し、黄色固体として化合物71(482.3mg、34.3%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、231.06(M+H)+。

0179

化合物72の合成
氷浴中、0℃で撹拌しながら化合物71(450.5mg、1.95mmol)及びTEA(590.8mg、5.85mmol)のCH2Cl2(20ml)溶液に塩化アクリロイル(947.2mg、10.47mmol)を滴加した。反応混合物を室温で18時間撹拌した。水(50mL)の添加によって反応をクエンチし、CH2Cl2(20mLで3回)で抽出した。有機層を合わせて塩水(30mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して黄色固体として化合物72(255.4mg、46%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、285.07(M+H)+。

0180

化合物73の合成
化合物3(155.7mg、0.547mmol)、HOBt(88.7mg、0.656mmol)、EDCI(115.4mg、0.602mmol)及びDIPEA(212.1mg、1.64mmol)をDMF(10mL)に添加し、氷浴中0℃で1時間撹拌した。化合物40(113.3mg、0.602mmol)を溶液に添加した。混合物を室温まで温め、放置して18時間反応させた。該反応混合物を塩水(30mL)で希釈し、CH2Cl2(10mLで3回)で抽出した。有機層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2=200/1〜10/1、体積/体積)によって精製し、黄色固体として化合物73(90.2mg、36.2%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、455.17(M+H)+。

0181

化合物74の合成
化合物73(85.4mg、0.19mmol)、EEDQ(55.4mg、0.23mmol)の無水CH2Cl2(7ml)及び無水MeOH(0.07mL)溶液を室温で1時間撹拌した。その後、化合物42(135.7mg、0.19mmol)を添加した。反応混合物を更に18時間撹拌した。該反応混合物を真空で濃縮し、分取HPLCによって精製して白色固体として化合物74(19.1mg、6.7%)を得た。LC−MS m/z(ES+)、1162.45(M+H)+。

0182

0183

実施例II抗体薬物複合体の作製
概括的な複合体化手順
TPA(1mM)及び3.0当量〜5.0当量のTCEP(10mM)をPCRチューブ中の抗体(10mg/mL)に添加し、1時間に亘ってミキサーにかけ、抗体上のジスルフィド結合を還元した。様々な量のリンカー−活性剤複合体を反応混合物に添加して、一晩ボルテックスミキサーを使用して振盪した。全ての反応を室温で行った。得られた生成物をゲル電気泳動(SDS−PAGE)及びHIC(疎水性相互作用クロマトグラフィー)−HPLCによって分析した。

0184

抗体薬物複合体を還元SDS−PAGEによって分析した:バッファーと混合した試料を8%〜15%アクリルアミドゲル充填し、UVP BioDoc−it画像化システムゲル写真撮影した。

0185

バンド(50kDa以上)がレーン2及びレーン3に現われ、チオール架橋複合体化が有効であったことを示唆する(H、L)。75kDaのバンドは、一対の架橋されたチオールによって連結された重鎖と軽鎖とで構成される部分を表す(LH)。2本の重鎖が1個又は2個の架橋チオール対によって連結され、100kDaでバンドを形成した(HH)。125kDaのバンドは、重鎖と軽鎖との間の1個の架橋が形成されなかった部分(LHH)を表す。最後に、150kDaのバンドは、完全に架橋された抗体(LHHL)の形成を明らかにした。

0186

抗体薬物複合体を次の条件の下、HIC−HPLCによって分析した:HPLCカラム:TSK−GELブチル−NPRカラム4.6×35mm;バッファーA:75%リン酸ナトリウム(20mM、pH7.0)、25%イソプロパノール(体積/体積);バッファーB:リン酸ナトリウム(20mM、pH7.0)、硫酸アンモニウム(1.5mM);流速:l.0mL/分。

0187

in vitroでの抗体薬物複合体の評価
初日に、OVCAR3等のヒト卵巣癌細胞株の腫瘍細胞株を、96ウェル培養プレート(Cellstar)に100μlの培養培地中5000個の細胞で蒔いた。細胞を37℃で一晩、飽和水と共にCO2インキュベータにおいてインキュベートした。2日目、MSL−31及びMSL−75の2個の共有結合チオール的複合体化ADCを段階希釈し、OVCAR3細胞を含む96ウェルプレートに1ウェル当たり100μlで複合体を添加した。最初の複合体は100000ng/mlであり、0.001ng/mlまで希釈した。添加したADCと共にOVCAR3細胞を37℃で72時間インキュベートした。その後、共有結合的チオール複合体化ADCで処理した腫瘍細胞生存率を、プレートリーダー(Molecular device製BIO−RADiMark SpectraMax L)上で製造業者プロトコルに従い、細胞生存率測定キットであるCell Counting Kit−8(DOJINDO、CK04)を使用して測定した。50%細胞増殖阻害であるIC50値は、曲線適合ソフトウェア(Graphpad)を使用して計算された。

0188

実施例II−1 MSL−C31の作製
DTPA(1mM)及び5.0当量のTCEP(10mM)をPCRチューブ中の抗MSL(10mg/mL)に添加した。混合物をボルテックスミキサーで1時間撹拌して抗体上のジスルフィド結合を還元した。その後、25%のDMSOを反応混合物に添加した。化合物31(5.0当量、10mM)を反応混合物に添加し、ボルテックスミキサーを使用して一晩振盪した。全ての反応を室温で行った。反応終了後、混合物をMilliporeの4mL容の遠心限外濾過チューブに充填し、PBSで3回洗浄した後、反応混合物を回収した。図2は、少なくとも1対のスルフヒドリル基の共有結合的複合体化の生成物(右レーン)が、重鎖(H)又は軽鎖(L)単独のもの(左レーンに示される)よりも遅く移動することを示す。重鎖と軽鎖との間の共有結合的複合体化は75kDa(HL)のバンドを生じ、2本の重鎖の共有結合的複合体化は100kDa(HH)のバンドを生じた。HIC−HPLCクロマトグラムに3つのピークが存在し、DARのうち3、4及び5をそれぞれ表す。得られたMSL−C31のDARは、HIC−HPLCの結果に基づき3.60であった(図3)。

0189

図2は、a)ネイキッド抗体、b)共有結合的チオール複合体化の生成物であるMSL−C31に対する、還元SDS−PAGEの結果を示す。

0190

図3は、MSL−C31のHIC−HPLCクロマトグラムを示す。

0191

実施例II−2 MSL−C75の作製
DTPA(1mM)及び5.0当量のTCEP(10mM)をPCRチューブ中の抗MSL(10mg/mL)に添加した。混合物をボルテックスミキサーで1時間撹拌して抗体上のジスルフィド結合を還元した。その後、25%のDMSOを反応混合物に添加した。5.0当量の化合物75(5.0当量、10mM)を反応混合物に添加し、ボルテックスミキサーを使用して一晩振盪した。全ての反応を室温で行った。反応終了後、混合物をMilliporeの4mL容の遠心限外濾過チューブに充填し、PBSで3回洗浄した後、反応混合物を回収した。試料を電気泳動による分析に供した。還元SDS−PAGEの結果を図4に提示する。左レーンはネイキッド抗体であり、右レーンはMSL−C75の共有結合的複合体であった。得られたMSL−C75のDARは、HIC−HPLCに基づいて3.87であった。

0192

図4は、MSL−C75の還元SDS−PAGEの結果を示す。

0193

図5は、MSL−C75のHIC−HPLCクロマトグラムを示す。

0194

表2は、2つの試料、すなわちヒト卵巣癌細胞で試験したADC−C31及びADC−C75のIC50値を示す。

0195

実施例II−3 CD59−C78の作製
DTPA(1mM)及び5.0当量のTCEP(10mM)をPCRチューブ中の抗CD59(10mg/mL)に添加した。混合物をボルテックスミキサーで1時間撹拌して抗体上のジスルフィド結合を還元した。その後、25%のDMSOを反応混合物に添加した。化合物78(5.0当量、10mM)を反応混合物に添加し、ボルテックスミキサーを使用して一晩振盪した。全ての反応を室温で行った。反応終了後、混合物をMilliporeの4mL容の遠心限外濾過チューブに充填し、PBSで3回洗浄した。得られたCD59−C78のDARは、HIC−HPLCに基づき3.66であった。

0196

図6は、a)ネイキッド抗体、b)CD59−C78に対する還元SDS−PAGEの結果を示す。

0197

図7は、CD59−C78のHIC−HPLCクロマトグラムを示す。

0198

実施例II−4HER2−C78複合体の作製
DTPA(1mM)及び5.0当量のTCEP(10mM)をPCRチューブ中の抗HeR2(10mg/mL)に添加した。混合物をボルテックスミキサーで1時間撹拌して抗体上のジスルフィド結合を還元した。その後、25%のDMSOを反応混合物に添加した。化合物75(5.0当量、10mM)を反応混合物に添加し、ボルテックスミキサーを使用して一晩振盪した。全ての反応を室温で行った。反応終了後、混合物をMilliporeの4mL容の遠心限外濾過チューブに充填し、PBSで3回洗浄した。

0199

HER2−C78複合体に関する安定性研究
通常のチオール複合体化に対する共有結合的チオール複合体化のADCの分解速度を特定するため、ELISA用に上の手順によって作製された3つのADC試料を安定性研究に使用した。ELISA実施計画は以下の通り:最初に、Her2−ECD(100ng)を96ウェルプレートの各ウェルにコートした;次に(通常のチオール複合体化の)抗Her2−Mc−VC−PAB−MMAE、抗Her2−Di−Mc−VC−PAB−MMAE(bi−マレイミド−チオール複合体化)、及び抗Her2−PY−QJ2−ADC(本発明の共有結合的チオール複合体化であるHer2−C78)で処理したヒト末梢血をコートしたウェルにおいてインキュベートし、Her2−ECDに結合させた。最後に、後に発色基質であるo−フェニレンジアミン(OPD)の有色生成物への変換を触媒するストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼと複合体化された抗ヒトIgGを結合することによって、Her2−ECD抗原に結合した抗her2 ADCの量を測定する。結果から、末梢血との3日間のインキュベーションの間に一般的なチオール複合体化によるADCの分解速度は26.7%であり、bi−マレイミド−チオール複合体化による本発明の2番目のADCの分解速度は18.9%であり、本発明の3番目のADCの分解速度は5.1%であったことが示される。本発明の共有結合リンカーによるADCの分解速度は、下記表3に示される3つのADCのなかで最も遅い。

0200

0201

実施例III−抗体薬物複合体の活性
本発明の抗体薬物複合体は、一実施形態において、腫瘍細胞を特異的に標的とするのに、また腫瘍細胞の表面上の腫瘍関連抗原に結合するのに使用することができる。ADC抗原の複合物はエンドサイトーシスによって腫瘍細胞に入り、ADC抗原複合物のエンドソームリソソームとの融合の後、そのペイロード(payload)を放出する。放出されたペイロードは、腫瘍細胞の重要な機能を阻害する、及び/又は更には腫瘍細胞を殺傷する。ペイロードが細胞表面で又は腫瘍細胞の近くで放出する場合、腫瘍細胞はバイスタンダー方式(by-stander manner)によっても殺傷され得る。

0202

したがって、本発明は、腫瘍細胞の成長及び/又はそれらの分化を阻害する様々なタンパク質−薬物複合物を提供する。様々な種類の活性ペイロードによって武装されたこれらの化合物を使用して、新生物、自己免疫障害及び炎症、更には腫瘍細胞又は幹細胞の分化を治療することができる。

0203

実施例III−1−腫瘍に対する活性
一実施形態又は本発明において、抗体薬物複合体(ADC)は、mAbの特有のターゲッティング細胞毒性薬物の癌を殺傷する性能とを組み合わせて、ADCを強力な腫瘍殺傷剤とする。さらに、本発明による共有結合的チオール複合体の使用はADCの安定性を増加させて、血液循環におけるADCの分解を制限し、それによりその毒性を減少させる。この実施例は、ヒト乳癌細胞(MDA−MB−231)が移植されたヌードマウスにおいて上に記載されるように作製されたADCを使用する、ヒト癌の治療を示すデータを提供する。

0204

共有結合的な又は一般的な複合体による様々なADCの生物学的機能を特定するため、抗Her−2 mAbを一般的な複合体化によりチオール複合体化するか又は同じリンカー及び細胞毒素と共有結合的にチオール複合体化した。ヌードマウスにヒト癌細胞株(MDA−MB−231)を移植し、腫瘍体積が約100立方ミリメートルに達した時にADC(0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg及び10mg/kg)を腹腔内注射によって投与した。腫瘍体積を3日毎にモニターし、21日間の終わりに動物を屠殺して、腫瘍を解剖し、計量した。

0205

下記表4は、ヒト乳癌細胞が移植されたヌードマウスに投与された一般的なADCと共有結合的チオール複合体化ADCとの間の効力の比較を提供する。

0206

実施例

0207

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