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技術 防汚損組成物およびそれを産生する方法

出願人 バイオミメテクス、エス.エー.
発明者 コスタ、ゴンサロフレイレ、パトリックサントス、ロマナシルバ、アナ・クリスティナギノテ、イネス
出願日 2016年6月9日 (4年0ヶ月経過) 出願番号 2018-516647
公開日 2018年8月30日 (1年10ヶ月経過) 公開番号 2018-524021
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 予備対 最適温度での 付着接着剤 人工構造体 国際輸送 環境コスト 付着性材料 デトリタス
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重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、シュードモナス(Pseudomonas)環境株PF−11の細胞を培養することと、上澄み液回収することとを含む、細菌上澄み液を調製する方法に関する。本発明はまた、表面のバイオフィルムの量を減少させる、少なくとも1種の有機体が表面へ付着するのを減少させる、または表面のマイクロ汚損またはマクロ汚損を減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、表面を接触させることを含む方法に関する。本発明はまた、真菌もしくは細菌細胞を殺傷するもしくはこれらの増殖を減少させる方法または昆虫もしくは海洋カイアシを殺傷するもしくはこれらの発生を阻害する方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、真菌、細菌、昆虫、または海洋カイアシを接触させることを含む方法に関する。本発明はまた、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の実質的に純粋な培養物に関する。本発明はまた、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11が富化された培養物に関する。本発明はまた、細菌が、高分子量基質消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能であるかどうかを識別する方法を提供する。

概要

背景

概要

本発明は、シュードモナス(Pseudomonas)環境株PF−11の細胞を培養することと、上澄み液回収することとを含む、細菌上澄み液を調製する方法に関する。本発明はまた、表面のバイオフィルムの量を減少させる、少なくとも1種の有機体が表面へ付着するのを減少させる、または表面のマイクロ汚損またはマクロ汚損を減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、表面を接触させることを含む方法に関する。本発明はまた、真菌もしくは細菌細胞を殺傷するもしくはこれらの増殖を減少させる方法または昆虫もしくは海洋カイアシを殺傷するもしくはこれらの発生を阻害する方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、真菌、細菌、昆虫、または海洋カイアシを接触させることを含む方法に関する。本発明はまた、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の実質的に純粋な培養物に関する。本発明はまた、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11が富化された培養物に関する。本発明はまた、細菌が、高分子量基質消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能であるかどうかを識別する方法を提供する。

目的

発明の背景

抗微生物剤耐性
抗微生物剤に対する細菌耐性が増加しているために、細菌感染症治療および予防は、今後数十年間、健康上の世界的な主要課題である

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
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請求項1

i)シュードモナス(Pseudomonas)環境株PF−11の細胞を培養することと、ii)上澄み液回収することとを含む細菌上澄み液を調製する方法。

請求項2

前記シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の細胞を、前記細胞を少なくとも1種の細胞外プロテアーゼを産生する条件下で培養し、前記上澄み液が前記少なくとも1種の細胞外プロテアーゼを含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

(a)前記上澄み液を、培養細胞の数が対数的速度で増加しているときに回収する、(b)前記上澄み液を、培養細胞の数が対数的速度で増加しなくなった後に回収する、(c)前記細胞を、グルコースが添加された塩培地で培養する、(d)前記細胞を、グルコースが添加されたM9培地で培養する、(e)前記細胞を、アンモニウムおよびチアミン欠如した培地で培養する、または(f)前記細胞を、約28、29、30、31、または32℃の温度で培養する請求項1または2に記載の方法。

請求項4

前記上澄み液または修飾上澄み液を、(a)サイズが10キロダルトン(kDa)超の構成成分の分画と、(b)サイズが10kDa未満の構成成分の分画とに分割することをさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

(a)前記上澄み液またはその分画のうちの1種以上の構成成分から少なくとも1種の細胞外プロテアーゼを分離し、(b)前記上澄み液もしくはその分画の塩濃度を減少させて、(c)前記上澄み液もしくはその分画の水分含量を低下させて、または(d)前記上澄み液もしくはその分画を滅菌して、修飾上澄み液またはその分画を産生することをさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

1種以上の許容される担体を、前記上澄み液、修飾上澄み液、またはその分画へ添加することをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

表面のバイオフィルムの量を減少させる方法であって、i)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはii)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、前記表面を接触させることを含む方法。

請求項8

前記バイオフィルムが、(a)淡水バイオフィルムであり、(b)、もしくは河川環境で増殖可能な淡水バイオフィルムであり、(c)海洋バイオフィルムであり、または(D)淡水もしくは塩水の水槽中で増殖可能である、請求項7に記載の方法。

請求項9

少なくとも1種の有機体が表面へ付着するのを減少させる方法であって、i)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはii)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、前記表面を接触させることを含む方法。

請求項10

前記少なくとも1種以上の有機体が、藻類ウニフジツボ、またはコケムシ個虫である、請求項9に記載の方法。

請求項11

表面のマイクロ汚損またはマクロ汚損を減少させる方法であって、i)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはii)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、前記表面を接触させることを含む方法。

請求項12

前記表面が、(a)ガラス繊維ガラス、木、ゴムプラスチック、または金属、(b)水槽、プール浮標桟橋、または船舶もしくは平底荷船船体の表面、(c)水中に入れられた漁網または他の網、(d)縄、または(e)壁または内張り構造体、である、請求項7から11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む前記組成物が、塗料または透明被覆剤である、請求項7から12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

真菌を殺傷するまたはその増殖を減少させる方法であって、i)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはii)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、前記真菌を接触させることを含む方法。

請求項15

昆虫を殺傷するまたはその発生を阻害する方法であって、i)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはii)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、前記昆虫を接触させることを含む方法。

請求項16

海洋カイアシを殺傷するまたはその発生を阻害する方法であって、i)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはii)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、前記海洋カイアシを接触させることを含む方法。

請求項17

細菌細胞を殺傷するまたはその増殖を減少させる方法であって、i)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはii)シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、前記細菌細胞を接触させることを含む方法。

請求項18

前記上澄み液分画または修飾上澄み液分画が、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11セクレトームの、サイズが10kDa超の構成成分を含む、請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。

請求項19

前記上澄み液分画または修飾上澄み液分画が、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11セクレトームの、サイズが10kDa未満の構成成分を含む、請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。

請求項20

前記細菌細胞が、シュードモナス属種(Pseudomonasspp.)、緑膿菌(Pseudomonasaeruginosa)、またはシュードモナス属(Pseudomonas)の細胞以外のものである、請求項17から19のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

前記細菌細胞が、ブドウ球菌属種(Staphylococcusspp.)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcusaureus)、またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicilin−resistantStaphylococcusaureus)の細胞である、請求項17から19のいずれか一項に記載の方法。

請求項22

前記細菌細胞が、エシェリキア属種(Escherichiaspp.)、大腸菌(Escherichiacoli)、または大腸菌(Echerichiacoli)O157の細胞である、請求項17から19のいずれか一項に記載の方法。

請求項23

シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の実質的に純粋な培養物。

請求項24

シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞の実質的に純粋な培養物であって、前記細胞が、プロモーターに操作可能に連結されたレポーターポリペプチドをコードする外因性耐性遺伝子または外因性ポリヌクレオチドを含むように修飾されている、実質的に純粋な培養物。

請求項25

シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞の実質的に純粋な培養物であって、前記細胞が、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の対応する細胞と比較して、抗生物質化合物に対する感受性が高まるように遺伝子操作されている、実質的に純粋な培養物。

請求項26

前記培養物中の生存微生物細胞の総数のうちの約40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%未満、またはさらにこれら未満が、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞以外の生存細胞である、請求項23から25のいずれか一項に記載の実質的に純粋な培養物。

請求項27

シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞が富化された、細胞培養物

請求項28

前記シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞が、請求項24から26のいずれか一項に記載の細胞である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

請求項29

前記上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、または修飾上澄み液分画が、請求項1から6のいずれか一項に従って産生される、請求項7から23のいずれか一項に記載の方法。

請求項30

前記シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物が、請求項24から26のいずれか一項に記載の1種以上の細胞の培養物である、請求項7から23のいずれか一項に記載の方法。

請求項31

i)請求項23から27のいずれか一項に記載の細胞、または上澄み液、修飾上澄み液、もしくはその分画と、ii)1種以上の許容される担体とを含む組成物。

請求項32

防汚損または抗微生物組成物であって、i)請求項23から27のいずれか一項に記載の細胞、または上澄み液、修飾上澄み液、もしくはその分画、またはii)請求項23から27のいずれか一項に記載の細胞、または上澄み液、修飾上澄み液、もしくはその分画と、1種以上の許容される担体とを含む組成物を含む防汚損または抗微生物組成物。

請求項33

細菌が、高分子量基質消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能であるかどうかを識別する方法であって、i)前記細菌の細胞を、前記高分子量基質が添加された増殖制限培地へ入れることと、ii)前記高分子量基質が添加された前記増殖制限培地中で前記細胞が増殖するかどうかを判定することと、iii)工程ii)で前記細胞が増殖すると判定された場合に、前記細菌が、前記高分子量基質を消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能であると識別すること、および工程ii)で前記細胞が増殖しないと判定された場合に、前記細菌が、前記高分子量基質を消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが不可能であると識別することとを含む方法。

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0001

本出願のあらゆる箇所で種々の刊行物が参照され、丸括弧内における参照を含む。丸括弧において参照された刊行物の完全な引用は、本明細書の最後、特許請求の範囲の直前に記載されていることを見出すことができる。参照された全ての刊行物の開示はその全体が、本発明が関連する技術水準をより完全に記載するために、ここでは参照により本出願に組み込まれるものとする。

発明の背景

0002

抗微生物剤耐性
抗微生物剤に対する細菌耐性が増加しているために、細菌感染症治療および予防は、今後数十年間、健康上の世界的な主要課題である(Kaplan 2004)。EUのみで、1年あたり25000名を超える患者が、多剤耐性菌を起因とする感染症が原因で死亡し、社会に対する全体的な直接コストは15億ユーロである(ECDC/EMA joint technical report 2009)。しかし、ヒト病原体を治療するために使用される抗生物質はまた、疾患を治療し、成長を促進し、かつ飼料効果を改善するために、動物に使用されている(FAO/OIE/WHO 2003)。結果として、都市起源農業起源の両方に由来する抗生物質は、土壌および水生環境で生き残り、強い重圧かけられ、耐性菌の選択がもたらされる。それにより、抗微生物剤耐性(AMR)を有する細菌の存在が、動物飼育施設および食肉処理場で、土壌および廃水で、都市および農業汚水で検出されてきた。これらの耐性菌のほとんどが、ヒト病原体への耐性遺伝子の導入を示してきた(Martinez 2013)。したがって、抗生物質の連続使用および乱用は、AMRメカニズム病原株に導入することが可能な環境耐性株を選択する大きな一因となり、かつ任意の新規の抗生物質を短期間で治療用途に導入したとしても、その使用に対して細菌が耐性を示すようになるメカニズムの選択を引き起こし、限界をもたらす。

0003

新たに利用可能な抗生物質の流通衰退し、1990年代と今世紀初めの10年とで認可された件数は少ない(Boucher et al.2009)。したがって、AMR細菌による感染症負担と問題に取り組むための新たな抗生物質の開発との間にはギャップがある。これは実質的には、新規の有効な抗生物質の開発が困難であること、細菌によって容易に克服されること、新規の抗生物質の使用を実行するための規制が困難であること、ならびに抗生物質が製薬業界で利益が小さいという事実に起因する(Livermore 2011;Payne et al.2007)。したがって、AMRメカニズムに効果的でもあり、それを促進することもない、新たな作用様式を有する新規の抗菌戦略発展に研究努力焦点を合わせるべきである。

0004

生物汚損(Biofouling)
生きた有機体(living organisms)は、大部分の多様な環境、天然、および合成表面上に付着し、増殖することが可能である。生物汚損は、水に曝露されたときに、表面が多層状コロニー化する天然プロセスにあり、吸収された有機材料蓄積によって発生し、これが細菌または微細藻類が付着するためのコンディショニングフィルムを形成し、バイオフィルムの形成をもたらす(Abarzua et al.,Olsen et al.)。

0005

抗微生物剤耐性および生物汚損を低下させるための新規の方法および組成物が必要とされる。

0006

殺真菌剤
微生物有機体によって産生される抗真菌剤化合物、たとえば抗生物質の利用は、医薬化合物に強く焦点を合わせて、新規の化合物の開発に大いに活用されてきた。

0007

いくつかの細菌は、酵素シデロフォア、および多様な分子、たとえばシアン化水素またはエチレンを含む天然の抗真菌剤および抗生物質である、さまざまな分類の化合物を産生することが確認されてきた。

0008

寄生生物として、真菌は一般的なかつ重要な病原体であり、深刻な作物損失や動物およびヒト集団における疾患をもたらすだけでなく、天然生物コミュニティーの組成物および構造体を作り出す。殺真菌剤は、健康および獣医用途から、製紙時の工業用パルプ製造までかつ家庭用まで幅広一連の用途のために使用することができる。

0009

ヒト健康において、真菌感染症は、1種以上の真菌種によって組織浸潤されることを表す。大部分の真菌感染症は、ヒトが、近接環境、たとえば、空気、土壌、または中の真菌源に曝露されるために発症する。一般的な疾患は、手指の爪および足指の爪の真菌、足白癬、たむし、頭皮頭髪感染症、輪癬、真菌性副鼻腔感染症、毛そうなどを含む真菌感染症によって引き起こされる。このような疾患は、一般的に、疼痛不快感、および社会的困惑を患者にもたらす。時には永久的な損傷を引き起こす恐れさえあり、場合によっては、最終的に特定の患者、たとえば、臓器移植レシピエントおよびHIVAIDS保菌者に対して致命的となる。

0010

植物もまた、多種多様病原性真菌にさらされている。植物においてまたは植物の一部において真菌が増殖すると、葉、果実、または種子の生成、および栽培作物品質全般が抑制されるために、真菌をコントロールすることは重要である。農業および園芸における全真菌性疾患のうちの約25%は、うどん粉病植物病原体によって引き起こされる。農業および園芸栽培における真菌繁殖経済的影響が大きいために、一般的なおよび特異的な用途に対して広域スペクトル殺真菌性および静真菌性製品が開発されてきた。このような例は、無機炭酸塩炭酸塩化合物レシチン、およびライムの使用である。しかし、これらの殺真菌性および静真菌性製品は環境に対して有害である恐れがあり、地域、たとえば、地下水汚染する恐れがある。したがって、環境に悪影響を及ぼすことなく真菌をコントロールし、同時に植物に有害な副次的影響を最小限にして植物を保護する手段を提供する生物学的溶液が必要とされる。

0011

殺虫剤
媒介性疾患は、世界的に毎年7億人近くの人々に影響を及ぼし、かつ100万件を超える死因関与する。蚊媒介性疾患をコントロールすることが、世界保健機関(WHO)のMillennium Development Goalで設定された目的である。さらに、このような疾患は、ヨーロッパではEuropean Centre for Disease Prevention and Controlにより新たに出現した脅威として特定されてきた。今のところ、蚊のコントロールは、環境への大きな打撃および殺昆虫剤耐性の増加を伴う殺昆虫剤用途で主に伝えられてきた。

0012

さらに、多くの昆虫は、住宅所有者、行楽者、園芸家、ならびに農場経営者および昆虫による農作物の著しい損害の結果として農業製品への投資がしばしば損失しているまたは減少している人々にとっては害虫として広くみなされている。特に生育期が短い地域では、昆虫による著しい損害は、栽培者の全利益の損失および穀物生産高の著しい減少を意味し得る。特定の農業生産物の供給が不十分であると、食品加工業者にとって、ひいては食用植物およびこれらの植物由来の製品の最終消費者にとって常にコスト高となる。

0013

殺虫剤または革新的戦略における新規の活性成分は最も重要なものであり、すなわち、植物または細菌のいずれかから単離された天然製品をベースとして、かつ2つの主な領域である農業および健康で作用するように模索されているところである。

0014

農業において
殺虫剤は、農業生産性および食品供給を増加させる主な一因であった。一方で、ヒト、動物、および環境への副次的影響のため、同程度に悩みの種でもあった。この懸念は、殺虫剤散布および使用の政府規制が高まり、オーガニック食品の需要が増加し、かつ人々の間の健康意識が高まる形で現れた。過去10年間における合成有機化学物質広範囲な使用により、長期にわたるいくつかの環境問題が生じた。主な問題は、殺虫剤の、環境、特に水への蓄積と関連する。これらの問題は殺虫剤使用者の安全に関する心配と同様に継続している。これらの事実は全て、生物殺虫剤市場の世界的な成長に限りない限界があることを示す。

0015

昆虫によって生じる損害は、任意の作物種の生産性の低下における最も重大な因子のうちのひとつである。年間での全経済的損失は約177億USドルに達する。殺虫剤は作物保護に対する効果が連続的に低下する。それは、これらの化学物質が有する環境影響、たとえば、小川、河川、または運河の汚染が原因で生じる、耐性ならびに消失がもたらされる可能性が高いという事実のためである。これらの変化は全て、世界的に、1年で推定1兆USドルの食品ロスまたは廃棄の一因となる。

0016

健康に関して
蚊は、疾患、たとえば、マラリアリンパ系フィラリア症、ならびにデング熱、ジカ熱、黄熱病、チクングンヤ熱、およびウエストナイル熱などのアルボウイルスを引き起こす、いくつかのヒトおよび/または動物病原体ベクターである。これらの疾患は、それが最も流行している特に亜熱帯および熱帯地方の国で、結果として生じる社会的かつ経済的影響とともに、高レベル死亡率および罹患率をもたらす。蚊媒介性疾患のコントロールは、世界保健機構のMillennium Development Goals(MDG)で検討されている。さらに、グローバル化、人々の移動、および気候変化などの要因、それに伴い結果として生じる蚊ベクター種の地理的拡大および/または病原因子分布が原因で、いくつかのこれらの疾患、たとえば、2007年のイタリアでのチクングンヤ熱、2012年のポルトガルのマデイラ島および2010年のフランスでのデング熱が拡散しかつ新たに発生し、または温帯地方において、たとえば2010年のギリシャ再発生している。さらに、1999年米国のウエストナイル熱および2013/14年のブラジルカリブ海のチクングンヤ熱の移入に伴って、これらは現在ではデング熱とともに、東および西半球にわたって最も広範囲なアボウイルス蚊媒介性疾病である。重篤な罹患率そして/あるいは死亡率がもたらされる恐れがある発熱症候群重度関節痛髄膜脳炎、あるいは出血症候群のいずれかを引き起こすため、これらの感染症への公衆衛生の関連性は非常に高い。

0017

ベクターコントロールは、依然としてベクター媒介疾患をコントロールする基本ツールである。組込み型ベクターコントロール戦略が推奨されるが、ベクターコントロールは、殺昆虫用途で主に伝えられてきている。環境コストおよび殺昆虫剤耐性の発現のため(非常に高価で、安価ではないコストが原因で、これらの集中的なかつ/または断続的な散布を頻繁に行った結果)、新規の殺昆虫剤/配合剤/戦略、すなわち、植物または細菌産物をベースにした生物殺昆虫剤/配合剤/戦略が模索されている。

0018

生物殺虫剤
細菌起源由来の代謝産物害虫管理における使用は、耐性発現を誘発する傾向がないために、農業において、かつヒト/動物疾患ベクターのコントロールにおいて拡大しており、従来の殺虫剤よりも一般的により生分解性でありかつ環境に優しい。

0019

現在のところ生物殺昆虫剤として使用されている大部分の生物殺虫剤は、バチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)(Bt)細菌由来であり、全殺昆虫剤市場の約2%を占めている。蚊ベクターコントロールにおいて、使用されている大部分の生物殺虫剤は、B.t.イスラエレンシス(B.t.Israelensis)(Bti)およびリジニバチルス・スファエリカス(Lysinbacillus sphaericus)(=バチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus))(Ls)であった。BtおよびLsは蚊の幼虫期に対して高特異性を示し、かつ中腸組織の破壊することによって、続いて、おそらくそれらのみの作用によってだけではなく、他の細菌腫によっても敗血症を起こすことによって昆虫を殺傷する。胞子形成時に、BtiおよびLsは、CryまたはCyt毒素と呼ばれる種々の殺昆虫タンパク質によって形成された結晶封入体を産生する。これらの毒素は、高選択スペクトル活性を示し、狭い範囲の昆虫種を殺傷する。それらを使用することにより、化学殺虫剤の使用が有意に減少することになる。

0020

しかし、BtiおよびLs系殺昆虫剤に対する耐性発現の可能性があるという報告が出現している。一方で、害虫コントロールの歴史により、殺昆虫剤の使用においてローテンションすることが、耐性発現を回避するために望ましいことが示される。

0021

それにより、農業害虫管理において取り入れられた類似の戦略との組み合わせた、新規の殺生物剤またはそれを使用する方法が必要とされ、かつ研究され、蚊などの有害またはベクター昆虫をコントロールするためのより広範囲の溶液が提供されなければならない。

0022

海洋寄生虫
集中的な養魚により、フナムシなどの寄生生物によるの損傷を介して実質的な経済損失が継続される。これらの海洋カイアシ蔓延は、網囲いをベースとする生産において避けることは困難であり、世界中の水産養殖産業で深刻な問題である。問題の深刻さは各地域によって変わる。サケ養殖産業の分野において、フナムシのコントロールは、その今後の持続可能性にとって不可欠である。その飼育により損傷が生じ、浸透圧の問題および2次感染につながる病変の原因となるため、フナムシの蔓延は、その宿主の、成長、繁殖力、および生存に影響を及ぼし、処置しない場合は、魚にとって高度に有害なまたは致死的なレベルに達し得る。野生と養殖の両方のサケが、フナムシの宿主としての働きをすることができる。フナムシは水を介して動き養殖魚から野生魚へ、そしてその逆に移動することができる。養殖魚と野生魚との間の寄生虫に起こり得る相互作用および交差蔓延は重大な問題をもたらす。水産養殖業のための目的は、魚養殖施設由来のフナムシが野生魚集団に任意の悪影響を与えないことを確実にすることである。

0023

現在、養殖魚のフナムシの処置としては、生物学的処置(ベラ清掃魚)、医薬処置(経口処置および浴槽処置)、および飼料添加化合物がある。種々の処置を組み合わせていてもよい。抗寄生虫剤は、蔓延に対処するために1980年代初期から使用され、有機リン剤は1980初期から1990年代の中期に耐性が発現するまで使用されてきた。それ以降、合成のピレスロイドである、シペルメトリンデルタメトリン、およびアベルメクチンエマメクチンが、フナムシ処置のために、有機リン剤とほぼ完全に取って代わった。しかし、最近では、これらのピレスロイドおよびエマメクチンを用いたいくつかの処置の失敗が報告され、かつ感受性の低下が検出された。今日の害虫管理のための戦略は、抗寄生虫剤にほとんど依存していない。

0024

過酸化水素がまた、魚からフナムシを除去するために使用される。しかし、大量の過酸化水素が必要とされ、魚に対する処置活性および毒性は限られ、この理想的な方法を行うことができない。過酸化水素は、フナムシを殺傷しないため、寄生虫が魚を再攻撃することがある。

0025

多くの処置が利用可能であるが、信頼性の高い方法はまた確立されていない。さらに、フナムシの感受性が処置に対して低下したことが、頻繁に使用された領域で記録された。交叉耐性がまた、関連する化合物間で生じることもある。特定の処置に対する耐性の根拠がある場合には、関連化合物の使用を避けるための手当をするべきである。耐性に対する可能性は、正しい処置手順に従い、完全推奨用量を投与することによって、かつ可能である場合は、別の治療方法と交互に使用することによって減らすことができる。したがって、耐性発現を回避するために、いくつかの異なるグループの有効化合物がフナムシの蔓延の処置に利用可能であることが必要とされる。したがって、フナムシの阻止に効果的であり、かつ、魚、消費者、および環境に対して安全な、魚におけるフナムシをコントロールする改善された手段が必要であると長い間思われてきた。外見的には、フナムシの蔓延の管理に有用な化合物を識別するための明らかな取り組みは、既知の殺虫剤、たとえば、海洋寄生虫に対して効果的であることが以前に示された殺昆虫剤または化合物に焦点を合わせたことであろう。しかし、経験により、他の水生寄生虫に対する特定の化合物の有効性も、フナムシ蔓延に対して効果的である化合物の指標ではないことが示されてきた。魚用の多数の抗寄生虫剤が、フナムシ蔓延の阻止に対してそれらの効果を試験されてきた。周知の例は、プラジカンテルおよび別のベンズイミダゾールフェンベンダゾールメベンダゾールアルベンダゾールフルベンダゾールなど)であり、抗蠕虫剤であるがフナムシに対して効果が全くない。ピランテルは、別の抗蠕虫剤(抗線虫チオフェン)であり、フナムシに対して効果がない。抗原虫剤、たとえば、トルトラズリルおよびジクズリル(抗コクシジウム剤)はまた、フナムシに対して効果がない。腸内原虫に対して効果があるがフナムシに対して効果がないバシトラシンの場合も同様である。非常に限られた数の利用可能な殺虫剤のみがフナムシなどの魚寄生虫に対して優れた有効性を示してきた。これらには、ピレスロイド、たとえばシペルメトリンおよびデルタメトリンが含まれる。既知の抗寄生虫化合物が新規の種に対して試験されたときに、経験した難しさを説明するいくつかの因子、たとえば、さまざまな種の寄生虫間での遺伝子型および表現型の広い多様性、代謝の大きな違い、および寄生虫が全く異なる生息地を占め、かつ宿主への伝播および感染のための異なる戦略を有するという事実がある。

0026

寄生虫蔓延を処置するための治療化学物質の背景にある原理は、宿主に劇的な影響を与えることなく、寄生虫を効率的に不活性化する治療窓を見出すことである。

0027

発明の概要
本発明は、シュードモナス(Pseudomonas)環境株PF−11の細胞を培養することと、上澄み液回収することとを含む、細菌上澄み液を調製する方法を提供する。

0028

本発明はまた、表面のバイオフィルムの量を減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、表面を接触させることを含む方法を提供する。

0029

本発明はまた、少なくとも1種の有機体が表面へ付着するのを減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、表面を接触させることを含む方法を提供する。

0030

本発明はまた、表面のマイクロ汚損(microfouling)またはマクロ汚損(macrofouling)を減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、表面を接触させることを含む方法を提供する。

0031

本発明はまた、真菌もしくは細菌細胞を殺傷するもしくはこれらの増殖を減少させる方法または昆虫もしくは海洋カイアシを殺傷するもしくはこれらの発生を阻害する方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、真菌、細菌、昆虫、または海洋カイアシを接触させることを含む方法が提供される。

0032

本発明はまた、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の実質的に純粋な培養物を提供する。

0033

本発明はまた、細菌が、高分子量基質消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能であるかどうかを識別する方法であって、i)細菌の細胞を、高分子量基質が添加された増殖制限培地へ入れることと、ii)高分子量基質が添加された増殖制限培地中で細胞が増殖するかどうかを判定することと、iii)工程ii)で細胞が増殖すると判定された場合に、細菌が、高分子量基質を消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能であると識別すること、および工程ii)で細胞が増殖しないと判定された場合に、細菌が、高分子量基質を消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが不可能であると識別することとを含む方法を提供する。

図面の簡単な説明

0034

細菌セクレトーム抗微生物効果。非病原株緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853に対して試験された回収上澄み液の増殖阻害の潜在力。
細菌セクレトームの抗微生物効果。非病原株大腸菌(Escherichia coli)ATCC25922に対して試験された回収上澄み液の増殖阻害の潜在力。
細菌セクレトームの抗微生物効果。非病原株黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)NCTC8325に対して試験された回収上澄み液の増殖阻害の潜在力。
PF−11セクレトームの抗微生物効果。PF−11セクレトームの抗微生物活性を、図1のように参考株に対して試験し、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)参考株KT2440および他のP.プチダ(P.putida)環境単離株まで範囲を広げた。
PF−11セクレトーム分画の抗微生物活性。分泌ペプチドおよび低分子の効果。この分画の効果を、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、大腸菌(Echerichia coli)ATCC25922、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)NCTC8325、およびシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)参考株KT2440の株の増殖に対して試験した。
PF−11セクレトーム分画の抗微生物活性。タンパク質を含む高分子の効果。この分画の効果を、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、大腸菌(Echerichia coli)ATCC25922、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)NCTC8325、およびシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)参考株KT2440の株の増殖に対して試験した。
PF−11セクレトーム分画の抗微生物活性。沸騰された未加工セクレトームの効果。この分画の効果を、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、大腸菌(Echerichia coli)ATCC25922、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)NCTC8325、およびシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)参考株KT2440の株の増殖に対して試験した。
シュードモナス(seudomonas)株分ペプチドHPLCパターン。M9培地対照)と、対数期のP.プチダ(P.putida)参考株およびPF−11分泌ペプチドとの間の比較。参考株は高濃度で最も高いタンパク質分子量を有し、同時に株11は第1の内容物とサイズがわずかに一致するが、大部分はいくつかのkDaに沿って分散されたペプチドを示す。
シュードモナス(Pseudomonas)PF−11単離株分泌ペプチドのHPLCパターン。予想した通り、SDS−PAGE後に対数期と比較すると、静止期のセクレトームは有意に高い変動性およびレベルのペプチドを有する。
PF−11セクレトームの表面張力の判定。
黄色ブドウ球菌(S.aureus)および緑膿菌(P.aeruginosa)参考株の粗精製抽出物に対するPF−11セクレトームの分解酵素活性の分析
大腸菌(Echerichia coli)O157およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicilin−resistant S.aureus)(MRSA)ATCC33591有毒臨床病原単離株、および既に使用された非病原性大腸菌(E.coli)および黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対する異なる濃度のPF−11セクレトームの増殖阻害アッセイ
大腸菌(Echerichia coli)O157およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicilin−resistant S.aureus)(MRSA)ATCC33591有毒臨床病原単離株、および既に使用された非病原性大腸菌(E.coli)および黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対する異なる濃度のPF−11セクレトームの増殖阻害アッセイ。PF−11セクレトームの分離ペプチド分画の効果。
大腸菌(Echerichia coli)O157およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicilin−resistant S.aureus)(MRSA)ATCC33591有毒臨床病原単離株、および既に使用された非病原性大腸菌(E.coli)および黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対する異なる濃度のPF−11セクレトームの増殖阻害アッセイ。PF−11セクレトームの高分子分画の効果。
大腸菌(Echerichia coli)O157およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicilin−resistant S.aureus)(MRSA)ATCC33591有毒臨床病原単離株、および既に使用された非病原性大腸菌(E.coli)および黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対する異なる濃度のPF−11セクレトームの増殖阻害アッセイ。PF−11の沸騰された完全なセクレトームの効果。
参考株P.プチダ(P.putida)KT2440、および7種類の選択環境単離株(PF−08、PF−09、PF−11、PF−13、PF−29、PF−50、およびPF−57)から抽出されたタンパク質のプロファイルを有するSDS−PAGEゲル。M9培地で増殖された静止期細菌の細胞内の全体的なタンパク質のプロファイル。ロードされた試料は等量の総タンパク質に相当する。
参考株P.プチダ(P.putida)KT2440、および7種類の選択環境単離株(PF−08、PF−09、PF−11、PF−13、PF−29、PF−50、およびPF−57)から抽出されたタンパク質のプロファイルを有するSDS−PAGEゲル。同一の増殖条件で増殖された同一の株の上澄み液から回収された分泌タンパク質。ロードされた試料は、過剰ローディング裂けるために1:8に希釈されたPF−11を除いて、等体積収集上澄み液に相当する。対照レーンは、非接種増殖培地M9に相当する。
参考株P.プチダ(P.putida)KT2440、および7種類の選択環境単離株(PF−08、PF−09、PF−11、PF−13、PF−29、PF−50、およびPF−57)から抽出されたタンパク質のプロファイルを有するSDS−PAGEゲル。増殖曲線に沿ってPF−11により培地へ分泌されたタンパク質のOD600nmが0.1から1.2までのプロファイル(1.2は静止期後期に相当する)。ゲルへアプライされた試料は、培養物のそれぞれ40、30、20、4、および2mlの体積の上澄み液に相当する。M:分子量マーカー
上澄み液中のmg総タンパク質によってμgプロテアーゼ換算値で測定された、対数期(11EXP)および静止期(11STAT)のPF−11セクレトームのタンパク質活性
インキュベーションの温度(15、20、25、30、35、40、および45℃)による、増殖静止期に収集されたPF−11セクレトームの、カゼインに対するタンパク質分解活性。データは、相対百分率で示され、100%活性は、タンパク質1mg当たり115μgに相当する(表1を参照のこと)。
酵素ターンオーバー評価:37℃で一晩インキュベートした後の、PF−11静止期セクレトームのタンパク質分解活性(左)。
タンパク質ターンオーバー評価:37℃で一晩インキュベートする前(レーン1)およびインキュベートした後(レーン2)のPF−11セクレトームプロファイル。全ての実験において、暗色の縦棒は、少なくとも3回の単独測定からの標準偏差を表す。
PF−11分泌タンパク質によって分解された最終的なタンパク質分解基質をスクリーニングするために使用された2D対角線SDS−PAGEゲル。大腸菌(E.coli)ATCC25922からの全タンパク質抽出物を、1D SDS−PAGEゲルへアプライし、陰性対照としてのM9培地、およびPF−11上澄み液と、35℃で5時間インキュベートした。インキュベート後、2次元ランすると、左のゲルに認められるように、タンパク質分解がない連続的な対角バンドが示された。矢印は1次元の移動方向を表す。
PF−11分泌タンパク質によって分解された最終的なタンパク質分解基質をスクリーニングするために使用された2D対角線SDS−PAGEゲル。上述のように調製された、ウニ付着性足跡(footprint)のタンパク質抽出物を使用していることを除いて、図10Aと同一である。
M9培地(対照)、PF−11およびKT2440培養物、ならびに上澄み液(SN)とインキュベートされた海洋バイオフィルム。水槽中に置かれ、回収されたペトリ皿を使用し、インキュベーションしてから18および40時間後に、接着した細菌および微細藻類の除去を試験した。
M9培地(対照)、PF−11およびKT2440培養物、ならびに上澄み液(SN)とインキュベートされ、クリスタルバイオレットで着色されたウニ付着性足跡。少なくとも2つのスライド(沸騰されたPF−11 SN)は、生体接着剤の破壊に対して、煮沸されたPF−11上澄み液は効果がないことを示す。
水(O)、P.プチダ(P.putida)および緑膿菌(P.aeruginosa)のそれぞれの参考株KT2440およびNTC、ならびに環境単離株PF−11(陽性対照)およびPF−29(陰性対照)の接種物によって正規化されたままの増殖百分率。ウシ血清アルブミンが添加された普通ブロス(NB+BSA)中で増殖させた。
水(O)、P.プチダ(P.putida)および緑膿菌(P.aeruginosa)のそれぞれの参考株KT2440およびNTC、ならびに環境単離株PF−11(陽性対照)およびPF−29(陰性対照)の接種物によって正規化されたままの増殖百分率。ゼラチンが添加された普通ブロス(NB+ゼラチン)中で増殖させた。値は2回の測定値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
水(O)、P.プチダ(P.putida)および緑膿菌(P.aeruginosa)のそれぞれの参考株KT2440およびNTC、ならびに環境単離株PF−11(陽性対照)およびPF−29(陰性対照)の接種物によって正規化されたままの増殖百分率。窒素源を含まない、ウシ血清アルブミンが添加されたM9(M9−N+BSA)中で増殖させた。値は2回の測定値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
水(O)、P.プチダ(P.putida)および緑膿菌(P.aeruginosa)のそれぞれの参考株KT2440およびNTC、ならびに環境単離株PF−11(陽性対照)およびPF−29(陰性対照)の接種物によって正規化されたままの増殖百分率。窒素源を含まない、ゼラチンが添加されたM9(M9−N+ゼラチン)中で増殖させた。値は2回の測定値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
水(O)、P.プチダ(P.putida)および緑膿菌(P.aeruginosa)のそれぞれの参考株KT2440およびNTC、ならびに環境単離株PF−11(陽性対照)およびPF−29(陰性対照)の接種物によって正規化されたままの増殖百分率。炭素源を含まない、ウシ血清アルブミンが添加されたM9(M9−G+BSA)中で増殖させた。値は2回の測定値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
水(O)、P.プチダ(P.putida)および緑膿菌(P.aeruginosa)のそれぞれの参考株KT2440およびNTC、ならびに環境単離株PF−11(陽性対照)およびPF−29(陰性対照)の接種物によって正規化されたままの増殖百分率。炭素源を含まない、ゼラチンが添加されたM9(M9−G+ゼラチン)中で増殖させた。値は2回の測定値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
水(O)、P.プチダ(P.putida)および緑膿菌(P.aeruginosa)のそれぞれの参考株KT2440およびNTC、ならびに環境単離株PF−11(陽性対照)およびPF−29(陰性対照)の接種物によって正規化されたままの増殖百分率。ウシ血清アルブミンが添加されたシュードモナス属(Pseudomonas)最小培地(PMM+BSA)中で増殖させた。値は2回の測定値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
水(O)、P.プチダ(P.putida)および緑膿菌(P.aeruginosa)のそれぞれの参考株KT2440およびNTC、ならびに環境単離株PF−11(陽性対照)およびPF−29(陰性対照)の接種物によって正規化されたままの増殖百分率。ゼラチンが添加されたシュードモナス属(Pseudomonas)最小培地(PMM+ゼラチン)中で増殖させた。値は2回の測定値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
分泌単離株の細胞外タンパク質加水分解活性視覚検査。M9完全培地増殖培養物に、15分間、8時間、72時間、および2カ月間曝露した後の、写真フィルムの表面ゼラチン層の分解の評価。
参考株P.プチダ(P.putida)KT2440(1)、および選択環境単離株PF−09、PF−11、PF−29、および参考株NTC由来の分泌タンパク質のSDS−PAGEタンパク質プロファイル。分泌タンパク質は、TCA/アセトンを用いた沈殿によって、上澄み液から回収された。ロードされた試料は、等体積の収集上澄み液に相当する。ゲルの左側は分子量マーカーを示す。
ゼラチンザイモグラフ中の分泌タンパク質の細胞外プロテアーゼプロファイル。
試料を10mMPMSFおよび/または10mMEDTA阻害剤とインキュベートした後の、ゼラチンザイモグラム中の緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)NTC27853参照環境単離株の分泌タンパク質の細胞外プロテアーゼプロファイル。
試料を10mM PMSFおよび/または10mM EDTA阻害剤とインキュベートした後の、ゼラチンザイモグラム中のシュードモナス(Pseudomonas)PF−11環境単離株の分泌タンパク質の細胞外プロテアーゼプロファイル。
分類学相同性によってグループ化されたPF−11セクレトーム。
分子機能によってグループ化されたPF−11セクレトーム。
酵素活性によってグループ化されたPF−11セクレトーム。
増殖対数期中期のPF−11を添加した後の、海洋ブロスにおけるコベティア・マリナ(Cobetia marina)の細菌増殖曲線の発展。
OD600nmによって判定された増殖%およびmg/Lに相当するPF−11濃度ppm(w/v)で測定された、ブロス微量希釈試験による、2種類の海洋細菌ビブリオコレラエ(Vibrio cholerae)およびビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)の増殖に対する抗微生物効果。
クリスタルバイオレット染色によって判定された付着細胞密度%で測定された細菌バイオフィルム形成のPF−11阻止。PF−11濃度は、mg/Lに相当するppm(w/v)である。
海水テトラセルミススエシカ(Tetraselmis suecica))および2淡水コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)およびムレミカズキモ(Pseudokirchneriella subcapitata))微細藻類の増殖に対するPF−11の殺藻効果。PF−11濃度はg/Lである。
異なる濃度のPF−11セクレトームに対するアノフェレスアトパルブス(Anopheles atroparvus)幼虫の生存率アッセイ。
フナムシコペポジドに対する異なる濃度のPF−11セクレトームの生存率アッセイ。
フナムシ幼虫に対する異なる濃度のPF−11セクレトームの生存率アッセイ。

発明の詳細な説明

0035

定義
他に定義されない限り、ここで使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される場合と同じ意味を有する。

0036

ここで使用される、かつ特に指示がない限りまたは文脈によって特に必要性がない限り、以下の用語はそれぞれ下記の定義を有するものとする。

0037

一般定義
数値または数値範囲の文脈において、ここで使用される「約」は、文脈上、より限定された範囲に解すべき場合を除き、列挙されたまたは特許請求された数値または数値範囲の±10%を意味する。

0038

ここで使用される「セクレトーム」は、細胞によって産生および分泌された有機分子および無機元素の全てを意味する。増殖条件が示される場合、セクレトームは、その増殖条件下の細胞によって産生および分泌された有機分子および無機元素の全てである。セクレトームは、細胞上澄み液に回収されていてもよいことが理解されるであろう。

0039

ここで使用される「操作可能に連結された」は、構成要素が配置されて、その通常機能を実行する並置を指す。たとえば、コード配列に操作可能に連結されたコントロール配列またはプロモーターは、コード配列の発現をもたらすことが可能である。

0040

ここで使用される「シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の細胞」は、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の細胞またはその任意の後代を指す。シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11は、寄託番号DSM32058として、2015年6月2日に、Leibniz−Institut DSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)、住所:Inhoffenstr.7B 38124 Braunschweigに寄託した。

0041

ここで使用される微生物の「実質的に純粋な培養物」は、培養物中の生存微生物(たとえば、細菌、真菌(酵母を含む)、マイコプラズマ、または原生動物)細胞の総数のうちの約40%未満(すなわち、約35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%未満、またはさらにこれら未満)が微生物以外の生存微生物細胞である、その微生物の培養物である。

0042

ここで使用される「富化された」シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞は、天然で見出されるシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞の任意の濃縮物よりも高濃度のシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞の濃縮物を指す。

0043

ここで使用される「ベクター」という用語は、それに連結されている他のポリヌクレオチドフラグメントまたは配列をある位置(たとえば、宿主、系)から他の位置へ運搬および移送することが可能なポリヌクレオチド分子を指す。その用語は、in vivoまたはin vitro発現系用のベクターを含む。非限定例として、ベクターは、「プラスミド」の形態とすることができ、これは、典型的にはエピソームによって維持されているが、宿主ゲノム中に組み込まれていてもよい、環状二本鎖DNAループを指す。

0044

本発明の側面は、1種以上の細胞外プロテアーゼの産生に効果的な条件下で1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能な細胞を培養し、1種以上の細胞外プロテアーゼを含むセクレトームを回収することによる、1種以上の細胞外プロテアーゼを含むセクレトームの産生に関する。培養のための好ましい細胞は、本発明の細胞である。効果的な培養条件としては、これらに限定されるものではないが、細胞外プロテアーゼの産生を可能にする、有効培地、バイオリアクター、温度、pH、および酸素条件がある。有効培地は、1種以上の本発明の細胞外プロテアーゼを産生するために細胞が培養される、任意の培地を指す。このような培地には、同化可能な炭素窒素、およびリン酸源、ならびに適切な塩、無機物、金属、ならびに他の栄養素、たとえば、ビタミンが含まれていてもよい。いくつかの態様において、培地は、同化可能な炭素、窒素、またはリン酸源が欠如したまたはそれらを減少させた増殖制限培地である。

0045

本発明はまた、本発明の細胞の、上澄み液、修飾上澄み液、上澄み液分画、セクレトーム、部分的に精製されたセクレトーム、およびセクレトーム分画を提供する。

0046

培地
本発明の態様において有用な細菌培地の非限定例としては、M9培地、M9−NH4Cl−Vit B1培地、M9−グルコース培地、シュードモナス属(Pseudomonas)用の最小培地、およびNBがあり、以下で述べられる。

0047

M9培地:1L当たり、Na2HPO4 12.8g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、NH4Cl 1g、100mM CaCl2 1ml、1M MgSO4 1 ml、1%Vit B1 500μl、20%グルコース20mlが添加されている(0)。

0048

M9−NH4Cl−Vit B1またはM9−N培地:1L当たり、Na2HPO4 12.8g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、100mM CaCl2 1ml、1M MgSO4 1ml(0)、
M9−グルコースまたはM9−G:1L当たり、Na2HPO4 12.8g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、100mM CaCl2 1ml、1M MgSO4 1ml(0)
シュードモナス属(Pseudomonas)用最小培地:1L当たり、K2HPO4 1g、KH2PO4 3g、NaCl 5g、MgSO4・7H2O 0.2g、FeCl3 3mg(Prijambada et al.1995)
NB:1%ペプトン、0.6%牛肉エキス、1% NaCl(Gaby and Hadley 1957)。

0049

略語
以下の略語がここで使用される:
BSA −ウシ血清アルブミン、OD−光学密度、MMP −シュードモナス属(Pseudomonas)用最小培地、M9−N − M9−NH4Cl−Vit B1、M9−G − M9−グルコース。

0050

態様
本発明は、シュードモナス(Pseudomonas)環境株PF−11の細胞を培養することと、上澄み液を回収することとを含む、細菌上澄み液を調製する方法を提供する。

0051

1つの態様において、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の細胞を細胞または細胞後代が少なくとも1種の細胞外プロテアーゼを産生する条件下で培養し、上澄み液は少なくとも1種の細胞外プロテアーゼを含む。

0052

いくつかの態様において、上澄み液を、培養細胞の数が対数的速度で増加しているときに回収する。他の態様において、上澄み液を、培養細胞の数が対数的速度で増加しなくなった後に回収する。他の態様において、細胞を、グルコースが添加された塩培地で培養する。他の態様において、細胞を、グルコースが添加されたM9培地で培養する。他の態様において、細胞を、アンモニウムおよびチアミンが欠如した培地で培養する。いくつかの態様において、細胞を、約28、29、30、31、または32℃の温度で培養する。

0053

いくつかの態様において、本方法は、上澄み液または修飾上澄み液を、サイズが10キロダルトン(kDa)超の構成成分の分画とサイズが10kDa未満の構成成分の分画とに分割することをさらに伴う。

0054

いくつかの態様において、本方法は、上澄み液またはその分画のうちの1種以上の構成成分から少なくとも1種の細胞外プロテアーゼを分離し、上澄み液もしくはその分画の塩濃度を減少させて、上澄み液もしくはその分画の水分含量を低下させて、または上澄み液もしくはその分画を滅菌して、修飾上澄み液またはその分画を産生することを伴う。

0055

いくつかの態様において、本方法は、1種以上の許容される担体を、上澄み液、修飾上澄み液、またはこれらの分画へ添加することを含む。

0056

本発明はまた、表面のバイオフィルムの量を減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、表面を接触させることを含む方法を提供する。

0057

いくつかの態様において、バイオフィルムは水生バイオフィルムである。いくつかの態様において、水生バイオフィルムは、淡水バイオフィルム;、もしくは河川環境で増殖可能な淡水バイオフィルム;海洋バイオフィルム;または淡水もしくは塩水の水槽中で増殖可能なバイオフィルムである。

0058

本発明はまた、少なくとも1種の有機体が表面へ付着するのを減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、表面を接触させることを含む方法を提供する。

0059

いくつかの態様において、有機体は、藻類、ウニ、フジツボ、またはコケムシ個虫である。

0060

本発明はまた、表面のマイクロ汚損またはマクロ汚損を減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、表面を接触させることを含む方法を提供する。

0061

いくつかの態様において、表面は、ガラス繊維ガラス、木、ゴムプラスチック、または金属である。他の態様において、表面は、水槽、プール浮標桟橋、または船舶もしくは平底荷船船体のものである。他の態様において、表面は、水中に入れられた漁網または他の網のものである。他の態様において、表面は縄である。他の態様において、表面は、壁または内張り構造体のものである。

0062

いくつかの態様において、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物は、塗料または透明被覆剤である。

0063

本発明はまた、真菌を殺傷するまたはその増殖を減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、真菌を接触させることを含む方法を提供する。

0064

本発明はまた、昆虫を殺傷するまたはその発生を阻害する方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、昆虫を接触させることを含む方法を提供する。

0065

本発明はまた、海洋カイアシを殺傷するまたはその発生を阻害する方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、海洋カイアシを接触させることを含む方法を提供する。

0066

本発明はまた、細菌細胞を殺傷するまたはその増殖を減少させる方法であって、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画、またはシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11培養物の、上澄み液、上澄み液分画、修飾上澄み液、もしくは修飾上澄み液分画と1種以上の許容される担体とを含む組成物と、細菌細胞を接触させることを含む方法を提供する。

0067

他の態様において、上澄み液分画または修飾上澄み液分画は、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11セクレトームの、サイズが10kDa超の構成成分を含む。他の態様において、上澄み液分画または修飾上澄み液分画は、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11セクレトームの、サイズが10kDa未満の構成成分を含む。他の態様において、細菌細胞は、シュードモナス属種(Pseudomonas spp.)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、またはシュードモナス属(Pseudomonas)の細胞以外のものである。他の態様において、細菌細胞は、ブドウ球菌属種(Staphylococcus spp.)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicilin−resistant Staphylococcus aureus)の細胞である。他の態様において、細菌細胞は、エシェリキア属種(Escherichia spp.)、大腸菌(Escherichia coli)、または大腸菌(Echerichia coli)O157の細胞である。

0068

本発明はまた、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の実質的に純粋な培養物を提供する。いくつかの態様において、実質的に純粋な培養物の細胞は、プロモーターに操作可能に連結されたレポーターポリペプチドをコードする外因性耐性遺伝子または外因性ポリヌクレオチドを含むように修飾されている。いくつかの態様において、実質的に純粋な培養物の細胞は、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11の対応する細胞と比較して、抗生物質化合物に対する感受性が高まるように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、実質的に純粋な培養物は、培養物中の生存微生物細胞の総数のうちの約40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%未満、またはさらにこれら未満が、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11細胞以外の生存細胞である培養物である。

0069

本発明はまた、シュードモナス(Pseudomonas)株PF−11が富化された培養物を提供する。

0070

本発明はまた、ここで記載される態様のうちのいずれか1つの細胞、または上澄み液、修飾上澄み液、もしくはこれらの分画と、1種以上の許容される担体とを含む組成物を提供する。

0071

いくつかの態様において、組成物は、ここで記載される態様のうちのいずれか1つの細胞、または上澄み液、修飾上澄み液、もしくはこれらの分画を含む、防汚損(antifouling)または抗微生物組成物である。いくつかの態様において、組成物は、1種以上の許容される担体を含む。

0072

本発明はまた、細菌が、高分子量基質を消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能であるかどうかを識別する方法であって、i)細菌細胞を、高分子量基質が添加された増殖制限培地へ入れることと、ii)高分子量基質が添加された増殖制限培地中で細胞が増殖するかどうかを判定することと、iii)工程ii)で細胞が増殖すると判定された場合に、細菌が、高分子量基質を消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが可能であると識別すること、および工程ii)で細胞が増殖しないと判定された場合に、細菌が、高分子量基質を消化することが可能な1種以上の細胞外プロテアーゼを産生することが不可能であると識別することとを含む方法を提供する。

0073

1つの態様において、高分子量基質が添加された増殖制限培地中の細胞数が、少なくとも0.5、1、3、4、5、または1〜24時間にわたって、少なくとも1、5、10、100、1000、または10,000倍に増加する場合に、細胞は増殖すると判定される。

0074

1つの態様において、増殖制限培地は塩培地である。他の態様において、増殖制限培地は、グルコースが添加された塩培地である。他の態様において、増殖制限培地は、グルコースが添加されたM9培地である。他の態様において、増殖培地は、アンモニウムおよびチアミンが欠如している。他の態様において、増殖制限培地は、約28、29、30、31、または32℃の温度で維持される。他の態様において、増殖制限培地は液体である。他の態様において、増殖培地は寒天を含む。

0075

1つの態様において、高分子量基質は、細菌細胞の細胞壁または細胞膜を通過することができない。他の態様において、高分子量基質は、細胞増殖のために取り込まれかつ使用されるために、分解されなければならない。他の態様において、高分子量基質は、ゼラチン、カゼイン、ヘモグロビン、またはウシ血清アルブミン(BSA)である。

0076

1つの態様において、工程i)の細菌細胞は、完全培地から得られ、その培地を希釈して高分子量基質を含む増殖制限培地とする。

0077

ここで開示される任意の態様は、ここで開示される目標、目的、および必要性のうちの少なくとも1つと一致する任意の方法で任意の他の態様と組み合わせもよく、「態様」、「いくつかの態様」、「別の態様」、「種々の態様」、「1つの態様」などに対する言及は必ずしも互いに排他的なものではなく、態様に関連して記載される特定の、特定の特徴、構造、または特性は少なくとも1つの態様に含まれていてもよいことを示すことを意図する。

0078

培養
細菌細胞を培養する方法は、当業者には既知であり、ここで開示される方法に限定されるものではない。たとえば、本発明の細胞は、従来の、発酵バイオリアクター、振とうフラスコ試験管マイクロタイター皿、およびペトリプレート中で培養することができる。培養は、組換え細胞に適した、温度、pH、および酸素含量で行うことができる。このような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。

0079

セクレトームまたはセクレトームを含む上澄み液の1種以上の構成成分から細胞外プロテアーゼを分離する非限定方法としては、透析限外ろ過超遠心分離、およびクロマトグラフィー方法(これらに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー拡張床吸着(Expanded Bed Adsorption)(EBA)クロマトグラフィー分離逆相クロマトグラフィー高速タンパク質液体クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーを含む)がある。

0080

培養培地から細胞を除去し、セクレトームを含む上澄み液を回収する方法の非限定例としては、遠心分離、ろ過、または沈殿がある。上澄み液、修飾上澄み液、またはこれらの分画の水分含量を低下させる方法の非限定例としては、蒸発、低分子量膜を用いた透析またはろ過、凍結乾燥噴霧乾燥、およびドラム乾燥がある。

0081

本発明の組成物
本発明の組成物には、ここでは「許容される担体」とも呼ばれる賦形剤剤が含まれる。賦形剤は、処置される表面が許容することができる任意の材料とすることができる。このような賦形剤の例としては、水、生理食塩水リンガー溶液デキストロース溶液ハンク溶液、および他の生理学平衡塩水溶液がある。非水性ビヒクル、たとえば、固定油、ゴマ油オレイン酸エチル、またはトリグリセリドをまた、使用していてもよい。他の有用な調製剤としては、粘度強化剤、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウムソルビトール、またはデキストランを含む懸濁液がある。賦形剤はまた、少量の添加物、たとえば、等張性および化学的定性を促進する物質を含むことができる。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液重炭酸緩衝液、およびトリス緩衝液があり、同時に防腐剤の例としては、チメロサールまたはo−クレゾールホルマリン、およびベンジルアルコールがある。賦形剤、たとえば、これらに限定されるものではないが、ポリマー制御放出ビヒクル生分解性インプラントリポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステル、およびグリコールはまた、組成物の半減期を増加するために使用することができる。

0082

本発明のいくつかの態様において、本発明の組成物は、被覆剤であるかまたは被覆剤と混合される。本発明のいくつかの態様において、本発明の組成物は、塗料であるかまたは塗料と混合される。1つの態様において、塗料は水性塗料である。他の態様において、塗料は油性塗料である。他の態様において、塗料は船舶用塗料である。他の態様において、塗料は、溶媒または希釈剤を含まない。被覆剤または塗料は、ここで開示される1種以上の表面、たとえば、水槽のガラス、プールの内側、水産業用網、または船舶の船体へ塗布してもよい。

0083

本発明の1つの態様は、本発明の組成物を環境または表面へ徐々に放出することが可能な制御放出調製剤である。ここで使用される制御放出調製剤は、制御放出ビヒクル中に本発明の組成物を含む。好適な制御放出ビヒクルとしては、これらに限定されるものではないが、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックスカプセルマイクロカプセルマイクロ粒子ボーラス製剤、浸透圧ポンプ拡散デバイス、リポソーム、リポスフィア、および経皮送達系がある。いくつかの態様において、制御放出調製剤は生分解性(すなわち、生体内分解性)である。徐放性組成物は、移動水中での使用に特に有用である。調製剤は、好ましくは約1〜約12カ月にわたって放出される。本発明の好ましい制御放出調製剤は、好ましくは少なくとも約1カ月間、より好ましくは少なくとも約3カ月間、さらにより好ましくは少なくとも約6カ月間、さらにより好ましくは少なくとも約9カ月間、さらにより好ましくは少なくとも約12カ月間、処置を行うことが可能である。

0084

別の態様において、組成物は乾燥組成物である。より好ましくは、本発明の細胞、たとえば、本発明の上澄み液またはセクレトームの乾燥抽出物である。液体組成物は当業者に既知の任意の技術、たとえばこれらに限定されないが、凍結乾燥、噴霧乾燥、およびドラム乾燥を使用して乾燥することができる。乾燥組成物は、被覆剤または塗料の添加物として使用することができる。

0085

細胞の修飾
ある態様において、本発明の細胞は、天然に存在するその同等物から修飾された。1つの態様において、細胞は天然に存在するその同等物と比較して、抗生物質に対し耐性を示すか、または高い耐性を有する。他の態様において、細胞は天然に存在するその同等物と比較して、抗生物質に対し耐性を示さないか、または耐性が低い。

0086

本発明の側面は、特異的な遺伝子型変化を有する本発明の細胞を選択する能力に関する。いくつかの態様において、本発明の細胞は、細胞の選択を可能にする外因性選択可能マーカーを含む。

0087

組換えDNA技術における1つの一般的な選択戦略は、表現型特性を有する遺伝要素(プラスミド、ウイルス、トランスポゾンなど)中に、クローン遺伝子またはDNA配列を含めることであり、それにより要素(形質転換細胞)を含む宿主細胞を、それを含まない細胞から分離することが可能になる。生存選択を提供する遺伝子が特に有用である。したがって、遺伝要素を含む細胞の選択は、毒物を含む培地上で細胞を増殖させることによって簡便に行うことができ、その培地上で「耐性遺伝子」を発現する形質転換体のみが生き残ることが可能である。いくつかの態様において、本発明の細胞は、外因性細胞を含み、それが発現したときに細胞の選択を可能にする。本発明の細胞の選択を可能にする外因性遺伝子の非限定例としては、抗生物質耐性遺伝子がある。ウイルス耐性、重金属耐性、またはポリペプチド耐性を提供する遺伝子がまた、利用可能である。当業者であれば、形質転換細胞を選択するためのプロトコールが、形質転換宿主細胞中に耐性、たとえば抗生物質耐性をコードする遺伝子を発現する遺伝要素(たとえば、クローニングベクター)に基づくことは既知であろう(たとえば、US4,237,224;Ausubel,2000を参照のこと)。例示的な抗生物質としては、ペニシリンテトラサイクリンストレプトマイシン、およびサルファ薬がある。いくつかの態様において、本発明の細胞は、そのゲノムへ組み込まれた外因性耐性遺伝子を含む。

0088

いくつかの態様において、本発明の細胞は、レポーターポリペプチドを発現する。ここで使用される「レポーターポリペプチド」は、識別可能シグナルを細胞内に提供するか、または当技術分野において既知の任意の技術によって細胞内で特異的に検出可能であるポリペプチドである。レポーターポリペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ストレプトアビジンβ−ガラクトシダーゼエピトープ標識、蛍光タンパク質発光タンパク質、および発色酵素がある。

0089

蛍光タンパク質は、当技術分野で周知であり、これらに限定されるものではないが、GFP、AcGFP、EGFP、TagGFP、EBFP、EBFP2、Asurite、mCFP、mKeima−Red、Azami Green、YagYFP、YFP、Topaz、mCitrine、Kusabira Orange、mOrange、mKO、TagRFP、RFP、DsRed、DsRed2、mStrawberry、mRFP1、mCherry、およびmRaspberryがある。発光タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、発光反応触媒し得る酵素、たとえば、ルシフェラーゼがある。発色酵素の例としては、これらに限定されるものではないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびアルカリフォスファターゼがある。

0090

エピトープ標識の例としては、これらに限定されるものではないが、V5−tag、Myc−tag、HA−tag、FLAG−tag、GST−tag、およびHis−tagがある。エピトープ標識の更なる例は次の参考文献:Huang and Honda,CED:a conformational epitope database.BMCImmunology 7:7 www.biomedcentral.com/1471−2172/7/7#B1.Retrieved February 16,2011(2006);およびWalker and Rapley,Molecular biomethodshandbook.Pg.467(Humana Press,2008)に記載される。これらの参考文献のその全体が、参照により本出願に組み込まれるものとする。

0091

他の刊行物または参考文献、および実験の詳細の参照
ここで挙げられる全ての刊行物および他の参考文献は、個々の刊行物または参考文献それぞれが具体的にかつ個々に示され参照によって組み込まれたように、参照によってその全体が組み込まれるものとする。ここで引用される刊行物および参考文献は、従来技術であるとは認められない。

0092

本発明は、後に続く実験の詳細を参照することによってより理解されるが、その後に続く特許請求の範囲で定義されるため、記述された特定の実験は本発明の単に例示にすぎないことは当業者であれば容易に理解するであろう。

0093

実験の詳細
本発明をより完全に理解することを容易にするために、例を以下に提供する。以下の例は、本発明を作製しかつ実施する例示的様式を示す。しかし、本発明の範囲は、これらの例で開示される特定の態様に限定されるものではなく、単に説明のみを目的とする。

0094

例1
株PF−11の、単離、特性評価、および保存
環境サンプリングおよび細菌単離
土壌および/または試料を、PortugalのLisbon付近のTagus川地区で収集した。収集された材料(10g)を、滅菌水(50mL)とホモジネートした。混合物重力沈降した後、液体分画を回収した。次いで、(微生物を含む)材料懸濁液を、遠心分離(12000g、5分)によって収集した。得られた沈殿物滅菌水中再懸濁した。1次増殖は、LB(Luria Bertani)培地中で実施した。これらの培養物を希釈(10−2〜10−9)し、LA(LB+寒天)またはアンピシリン(8μg/mL)、アモキシリン(8μg/mL)、もしくはセフォタキシム(2μg/mL)を含むLAのいずれかで培養し、耐性または低い感受性を示す株を選択した。サイズまたは形態に違いが認識できるコロニーを選択した。選択されたコロニーはそれぞれ、連続的な培養継代(3回まで)を行い、純粋な培養物を得た。

0095

単離された株の識別
グラム陰性株の検出を、シクロヘキシミドを含む選択的McConkey nr3培地で実施した。生物学的特性評価を実施し、広範の株特性を確立した。TSI(Triple Sugar Iron)、オキシダーゼ、およびカタラーゼ試験によって、デキストロースラクトーススクロース、および硫黄化合物醗酵する能力ならびにオキシダーゼおよび/またはカタラーゼを産生する能力を推測した(Hajna 1945)。従来の判定にしたがって、市販の表現型識別システムを使用し、単離されたグラム陰性細菌の正確な識別を実施した。API(登録商標)(API 20EおよびAPI ID32 GN)試験紙を使用し、自動システムおよびソフトウェア(BioMerieux)と組み合わせると、99.5%以上の精度を有する識別が得られた。単離株PF−11は、99,9%の精度でシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)と識別された。

0096

MIC判定
MIC(最小阻止濃度)を、CLSI標準(CLSI、M02−A10;CLSI、M100−S21)に従い、寒天希釈およびディスク拡散によって判定した。手短に言うと、LAプレートを調製し、試験される抗生物質の一連の希釈物を添加し、MICを判定した。株の増殖を阻止する最も低い抗生物質濃度が、MIC値とみなされる。推奨されるように、株大腸菌(Escherichia coli)ATCC25922を対照株として使用した。EUCASTによる耐性ブレークポイントのCLSI標準および参照値を使用して、株PF−11がアンピシリン、アモキシリン、セフォタキシム、セフタジジムセフォキシチンアズトレオナムに対して耐性があることが判定された。

0097

株PF−11の保存
株を、−80℃で、保存培地として20%グリセロールが添加されたLB培地を使用して、いくつかの一定量で保管した。

0098

例2
PF−11培養物の増殖、化合物の製造、分泌された化合物の回収および特性評価
PF−11増殖条件
凍結細菌の一定量を、LB寒天培地で、30℃で一晩(16〜18時間)培養する。次いで、1つのコロニーを使用して、グルコースが添加されたM9培地を含む滅菌フラスコへ接種し、オービタルシェーカー内で、30℃、120rpmで16時間増殖させる。
培地からの化合物の回収
細胞を、4℃、14.000rpmで15分間遠心分離によって除去し、上澄み液を収集する。上澄み液を、0.22μmDURAPOREフィルター(Millex GP、Millipore、Ireland)を備えたろ過装置を使用したろ過によって滅菌する。滅菌状態は、上澄み液50μlを、30℃で少なくとも16時間、LAプレートでインキュベートすることによって確認する。

0099

化合物の未加工混合物の精製
上澄み液を−80℃で凍結し、凍結乾燥によって脱水する。次いで、それを水中に再懸濁し、2kDaのカットオフを使用した透析を実施して、過剰な塩を除去する。透析した混合物を再凍結乾燥し、粉末のまま−80℃で保持する。

0100

混合物に存在するタンパク質の識別
セクレトームタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(12%SDS−PAGE)によって、ミニゲルフォーマット(7×7cm Tetra system Bio−Rad製)中で分離した。タンパク質20マイクログラムを、1レーン当たりに使用した。試料を、MilliQ水で10倍に希釈し、還元緩衝液(62.5mM Tris−HCl、pH6.8、20%(v/v)グリセロール、2%(w/v)SDS、5%(v/v)b−メルカプトエタノール)と混合した。電気泳動の前に、試料を100℃で5分間加熱した。タンパク質バンドをCoomassie Brilliant Blue R−250で染色した。

0101

タンパク質バンドをゲルから手動切り出し、MilliQ水で洗浄し、50%(v/v)アセトニトリル、続いて100%アセトニトリルで変色させた。システイン残基を10mM DTTで還元し、50mMヨードアセトアミドアルキル化した。ゲル切片真空下で遠心分離することによって乾燥し、50mM NH4HCO3および6.7ng・μL−1トリプシン(修飾ブタトリプシン、プロテオミクスグレード、Promega)を含む消化緩衝液に4℃で再水和した。30分後、上澄み液を除去し、廃棄して、50mM NH4HCO3 20μLを添加した。消化を、37℃で一晩進行させた。消化後、残留上澄み液を除去し、−20℃で保存した。

0102

得られたペプチド混合物を、ZipTip C18(Millipore)を用いて脱塩し、真空乾燥し、0.1%FAで再構成してから分析した。ナノ−LC−MS/MSの設定は以下のとおりである。試料を、Finnigan Micro ASオートサンプラーを介して注入し、Micro AS−Surveyor MSクロマトグラフシステムを使用して、NanoEase捕獲カラムSymmetry 300(商標)、C18、5μm(Waters)へ15μl/分の流量でロードした。ペプチドを、C18 PepMap 100、3μmキャピラリーカラム(75μm、15cm)(Dionex、LC Packings)を使用して、0%Bで10分のアイクラティック溶出、0%〜15%Bで10分の、15%〜60%Bで70分の、60%〜100%Bで20分の直線勾配を含む3つの連続工程、続いて、100%Bで10分のアイソクラティック溶出(A=H2O中の0.1%FA、B=CH3CN中の0.1%FA)を含む160分ランで分離した。ペプチド分離のために使用した110nl/分の流量は、自社のスプリッターステムによって達成された。カラム出口を、TriVersa NanoMateのLC連結器へ連結し、その連結器を7 TLTQ−FT Ultraへ連結した。質量分析計を、データ依存モードで作動させた。1回のスキャン当たり、最強イオンのうちの最大10個を分解し、線形イオントラップで検出した。FTICRセルへのイオン透過率および線形トラップを、電荷容量サーベイフルスキャンでは100万カウントに、かつMS/MS実験では50,000カウントに設定することにより、分析機最適性能で自動的にコントロールした。MS/MS用に既に選択された標的イオンを、60分間、動的に除外した。データベース検索を、Proteome Discovererソフトウェアv1.2(Thermo)を用い、Sequest and Mascotエンジンを使用して実施した。使用されたデータベースは、SwissprotおよびNCBInrであった。

0103

Blast2GOプログラムを、識別されたタンパク質の機能分析に使用した。このプログラムは、相同な配列を見出すためのブラスト工程と、ブラストヒットと関連するGOタームを収集するためのマッピング工程と、機能タームを、マッピングで収集されたGOタームのプールからクエリー配列アサインするためのアノテーション工程の3つの主要工程からなる。機能アサインメントはGOデータベースに基づく。識別されたタンパク質の配列データを、Blast2GOソフトウェアによってバッチ分析するためのマルチプルFASTAファイルとしてアップロードした。ブラスト工程を、共通データベースSwissprotに対してblastpを使用して実行した。他のパラメータデフォルト値で、すなわち、e値閾値を1e−3でかつ回収率を1配列当たり20ヒットで保持した。さらに、最小整列長(hspフィルター)を33に設定し、100個のヌクレオチドよりも少ないマッチング領域へのヒットを避けた。QBlast−NCBIをBlastモードのままで設定した。1.0E−6のe値ヒットフィルターを有するアノテーションコンフィグレーション、55のアノテーションカットオフ、および5のGO重み(GO weight)が選択された。識別されたタンパク質を、情報の簡潔表現を得るために、分析ツールである複合グラフ(combined graph)を使用して、20の配列フィルターを用い、GOカテゴリー(たとえば、分子機能)の選択されたサブグループにグループ化した。

0104

質量分析および相同性検索分析により、PF−11セクレトームは少なくとも171個のタンパク質を含むことが示された。識別されたタンパク質の機能分析により、セクレトームタンパク質は、1)シュードモナス(Pseudomonas)属、より具体的には緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のタンパク質と高い相同性を示し(図18A)、2)36%のセクレトームタンパク質が触媒活性を有し(図18B)、かつ3)その中で、加水分解酵素がセクレトーム中の最も多い酵素である(図18C)ことが示された。

0105

例3
環境起源由来の抗微生物剤
抗生物質に対する耐性を介し従来の研究を通じて収集され(Meireles 2013)、強力な適応能力を有する環境シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)株の異種コレクションを使用して、微生物学的増殖コントロールに関する分泌天然化合物の潜在力をスクリーニングした。Meireles 2013の内容は、参照により本出願に組み込まれるものとする。コレクション由来の1組のP.プチダ(P. putida)単離株を、その適応レベル、抗生物質耐性、および一般適合性(データは示されていない)をベースに、かつ多様な範囲の株特性を収集することを目的として選択した。これらの株のセクレトーム(すなわち、これらの分泌分子)を収集し、大腸菌(Echerichia coli)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のジャンルの3つの基準株の増殖に対する効果について最初に試験した。1つの株PF−11が、最も優れた抗微生物潜在力を示した。次いで、この最初の1組を、セクレトームを収集した全てのP.プチダ(P. putida)株にまで拡大した。抗微生物特性を有する化合物の最初の特性評価を実施すると、その効果の一因となり得る、ペプチド、酵素、および界面活性剤の存在が明らかになった。最後に、PF−11セクレトームの病原株に対する効果を試験し、感染症治療における将来の用途に対する潜在力を評価するために、臨床株MRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicilin−resistant S.aureus))および有毒な大腸菌(E.coli)O157の増殖をアッセイした。その結果、環境から単離されたP.プチダ(P.putida)PF−11が、抗生物質として将来の用途に対し高い潜在力を有する抗微生物化合物の強力な分泌体(secretor)として確認された。

0106

材料および方法
菌環境単離株および試験株
あらかじめ、65種類の環境シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のコレクションを土壌から単離し、肉眼的に選択し、識別し、獲得した抗生物質耐性メカニズムを特徴付けた(Meireles 2013)。土壌および泥試料を、PortugalのLisbon地区にあるTejo川付近のいくつかの場所から収集した。予備的な表現型分析の後に、高い適応能力(速い増殖、最低限の栄養必要量)および抗微生物多耐性プロファイルを示した7種類のP.プチダ(P.putida)株(PF−8、PF−9、PF−11、PF−13、PF−29、PF−50、PF−57)を、これらが抗微生物化合物を分泌することをスクリーニングするために選択した。

0107

細菌培養物成長条件
使用した全ての株は、5%グリセロール中、−80℃で保存し、LA(LuriaブロスAgar)中、35℃で一晩(16時間)培養してから、M9培地に接種した。単一のコロニーを、0.4%グルコースが添加された液体M9最小培地(50mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、8.5mM NaCl、18.7mM NH4Cl、0.1mM CaCl2、1mM MgSO4、0.0005%チアミン)に、35℃、120rpmで、1、2、4、6、または24時間接種した(後半を静止期と定義した)。

0108

細菌培養物由来の上澄み液の調製
M9培地中の細菌培養物由来の上澄み液を回収し、以前に記載のように(Roy et al.)、ろ過装置の0.22μmナイロンフィルター(Millex GP、Millipore、Ireland)を介して滅菌ろ過した。滅菌状態を確認するために、各上澄み液の100μlを35℃で少なくとも16時間インキュベートした。

0109

抗微生物実験に関しては、ろ過された上澄み液を直接使用し、in vitroタンパク質分解アッセイに関しては、上澄み液を−50℃で凍結乾燥し、水に懸濁し、収集された上澄み液の最初の体積と比較して20分の1に濃縮した。

0110

培養物粗精製タンパク質の抽出および分離
株を、LB中、表示された条件で一晩増殖させた。次いで、培養物を1000gで10分間遠心分離し、細菌を沈殿させた。タンパク質抽出緩衝液を添加し、5分間沸騰させ、細胞を溶解した。タンパク質をNanodrop装置(Bio−Rad)、280nmで測定して定量化し、ホモジネートして、最終的に10μg/10μlとした。Coomassie blue brilliant(登録商標)(Sigma)および1%メルカプトエタノールを含む、1:1volのタンパク質ローディング緩衝液を添加してからすぐに、試料をSDS−PAGE用の12.5%PAAゲルにローディングした。

0111

細菌培養物由来の上澄み液の調製
選択された細菌単離株を35℃で16時間培養し、48時間超まで保存した。コロニーを、グルコースが添加されたLuria Bertaniブロス(LB)またはM9最小培地中で、35℃、120rpmで、1、2、4、6、または24時間増殖させた(静止期)。培養物が目的の増殖期に達した後に、それを次の使用のために保存するかまたは10000gで15分間遠心分離した。上澄み液を、ろ過装置の0.2μm孔ナイロンフィルター(Millex GP、Millipore、Ireland)でろ過した。滅菌状態を確認するために、各上澄み液の1mLを37℃で72時間インキュベートした。画分が必要とされるときは、ろ過された上澄み液を、10kDaカットオフを有するアミコンチューブで遠心分離し、上部分画をM9培地に再溶解して、分画濃度または緩衝液濃度は変化させずに同様の最終体積となるようにした。ろ過された上澄み液の加熱不活性化を、100℃の沸騰水で10分間インキュベートすることにより行い、タンパク質変性を促進した。4℃で1または2週間静止させた直前に記載の分画のうちいずれかを用いていくつかの実験を実施し、タンパク質分解活性を「失わせる」と同時に完全な多糖および界面活性剤特性を維持し、画分手順において分子の非特異的な減少をさけるために、これらを別々に評価した。各実験に対して、少なくとも独立した3回の繰り返しを実施した。HPLC分析に関しては、ろ過された上澄み液(200ml)を−20℃で保存し、−54℃で凍結乾燥し、最終的に再蒸留水5mlに再懸濁し、ペプチド分画を10kDaカットオフフィルターによって分離して、ペプチドを分析することができた。

0112

細菌タンパク質変性研究
大腸菌(E.coli)基準株から抽出された全タンパク質200μgを上澄み液と(個々に)混合して、4〜7μg/μlの最終濃度とし、37℃でインキュベートした。プロテアーゼ活性を阻害するために、4−アミジノフェニルメタンスルホニルフルオリド塩酸塩を添加して、最終濃度を25μMとした。反応内容物をローディングダイと混合し(6回)、SDS−PAGEによって分離した。同一の手順を行い、静止期11単離株セクレトームの活性を、異なる温度、特に15〜45℃で5℃毎に判定した。この手順を再度使用し、セクレトームのタンパク質分解活性の低下を、4℃での貯蔵時間に沿って評価した。各実験に対して、最低でも独立した3回の繰り返しを実施した。

0113

培養上澄み液中のタンパク質の検出
単離株をLuriaブロス中で表示された条件で一晩増殖させた後、培養物を1000gで15分間遠心分離し、細菌を沈殿させ、上澄み液を回収し、以前に記載のように(Roy et al.)、0.2μmフィルター(Millipore)を介して滅菌ろ過した。次いで、同量のタンパク質を隣接するウエルにロードし、12.5%のSDS−PAGEによって分離した。

0114

PF−11が分泌したペプチドのHPLCによる分離
HPLCシステムは、LDC、Milton Roy、Consta Metric 1ポンプ、およびLichrosorb RP−18(Merck Hibar)カラム(粒径5μm、長さ125mm、内径4mm)からなっていた。ポンプ圧は60MPaであった。インジェクター全自動式(Rheotype Gilson Abimed Model 231)であった。検出器は、蛍光分光高度計(Shimadzu RF 535、γ励起365mm、およびγ放射444nm)を備えていた。流量は1分当たり1mLであり、注入体積は50μLであった。移動相は水/アセトニトリル(75:25)であった。

0115

標準溶液
AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、およびAFG2はSigma−Aldrich(St.Louis、MO、USA)から得た。市販のAFM1のストック溶液は1,000ng/mLであった。スパイク溶液を、HPLCグレードのアセトニトリル/水を使用して1:40に希釈し、約25ng/mLを得た。希釈したストック溶液のうちの140μLを、脱脂Hippベビーミルク70mLへ添加した。校正曲線を、AFM1 2μg/Lで1:500に希釈することによって用意した。ストック溶液を使用しないときは、4℃で保管した。

0116

結果
抗生物質選択を介して前もって収集した(Meireles 2013)環境シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)単離株のコレクションを使用し、微生物学的増殖コントロールに対する天然細菌ツールの潜在力をスクリーニングした。これらの株のうち少数の単離株が、適応潜在力および平均を上回る細胞外分泌を示し(データは示されていない)、ここから7種類のシュードモナス(Pseudomona)環境単離株(PF−8、PF−9、PF−11、PF−13、PF−29、PF−50、PF−57)を選択し、さらに研究した。最初に、これらの選択単離株および対照株P.プチダ(P.putida)KT2440の細菌培養物の上澄み液を最小培地に増殖静止期に収集し、これらのセクレトームの抗微生物効果を評価した。収集した上澄み液の増殖を阻害する潜在力を、ヒト感染症を含む、広く研究された3種類のジャンルの細菌、すなわち、大腸菌(Escherichia coli)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)で試験した。3種類の非病原株(大腸菌(E.coli)ATCC25922、黄色ブドウ球菌(S.aureus)NCTC8325、および緑膿菌(P.aeruginosa)ATCC27853)をこの段階で使用し、セクレトームの抗微生物効果を評価した。3種類の試験株を冨栄養培地で増殖させ、8種類のセクレトームおよび最小増殖培地M9からなる対照と1:1体積で16時間インキュベートし、上澄み液を回収した(図1A〜1C)。緑膿菌(P.aeruginosa)は、7種類の単離株または参考株P.プチダ(P.putida)KT24240よって分泌された化合物のいずれによっても明らかに影響を受けなかった(図1A)。対照的に、大腸菌(E.coli)と黄色ブドウ球菌(S.aureus)の両方の試験株は、いくつかのP.プチダ(P.putida)セクレトームによる影響を強く受けた。異なる反復実験で一致した阻害効果のみを考慮すると、大腸菌(E.coli)の増殖は、PF−9およびPF−11のセクレトームによって少なくとも40%に阻害された(図1B)。黄色ブドウ球菌(S.aureus)の増殖阻害の試験により、株PF−13、PF−29、およびPF−50のセクレトームで、セクレトームに対して非常に高い感受性が示され、増殖が50%超に減少し、特にPF−11のセクレトームは黄色ブドウ球菌(S.aureus)の増殖を90%低下させた(図1C)。株PF−11のセクレトームが大腸菌(E.coli)と黄色ブドウ球菌(S.aureus)の両方に広範な増殖阻害を示すことを考慮し、更なる分析を選択した。

0117

シュードモナス(Pseudomonas)PF−11のセクレトームの細菌増殖に対する効果を、標的として上記で使用した全てのシュードモナス(Pseudomonas)単離株および参照株を添加したことを除いて、上記のように試験した。図2のデータにより、PF−11株の培養培地から回収された分泌化合物は、全てのP.プチダ(P.putida)株に対して、強力な阻害効果である約50%の増殖阻害を有することが明らかに示され、同じジャンル由来の細菌に対する分泌化合物の優れた効果が明らかなった。対照的に、増殖静止期のPF−11培養物から回収した培養上澄み液を株PF−11自体で試験したとき、増殖が20%誘発され(図2)、その株に特異的な増殖強化物質、さらに上記で検出された他の細菌の増殖阻害物質の存在が明らかになった。PF−11に特異的なこれらの増殖強化物質の存在は、実質的に純粋な培養物またはPF−11が富化された培養物が、その天然状態の細胞とは異なった振舞いをすることを意味する。実質的に純粋な培養物またはPF−11が富化された培養物は、天然のPF−11細胞と比較して増殖を促進することが実証される。したがって、実質的に純粋な培養物またはPF−11が富化された培養物は、天然に存在するようなPF−11細胞よりも有用である。たとえば、実質的に純粋なまたは富化された培養物は、防汚損、抗微生物、または他の用途用の分泌化合物を産生するためにより有用であろう。

0118

増殖静止期に最小培地M9に分泌されたPF−11のセクレトームを回収し、10kDaの排除膜フィルターを使用して分離した。2つの分画が得られた。1つ目は分泌ペプチドおよび低分子を含み、2つ目はタンパク質を含む高分子を含んでいた。これらの分画の効果を、上記で使用した株の増殖に対して試験した。緑膿菌(P.aeruginosa)ATCC27853の増殖は予想通り、依然としてPF−11セクレトームのどの分画によっても影響を受けないままである(図3Aおよび図3B)。2種類の他のグラム陰性株である、P.プチダ(P.putida)KT2420および大腸菌(E.coli)ATCC25922の増殖は、完全なセクレトームによって大きく(50%)低下した。しかし、大腸菌(E.coli)の増殖は、分泌ペプチド分画によってわずかに(25%)低下したのみであると同時に、P.プチダ(P.putida)に対する有意な効果は有さなかった(図3A)。対照的に、タンパク質および高分子を含む分画は、多少は低下しているが、一般的にこれらの2種類の株に対して観察された全体的な抗微生物活性を保持する(図3B)。明らかに、黄色ブドウ球菌(S.aureus)NCTC8325は、PF−11の完全なセクレトームによってほぼ完全に(90%)阻害された。図3Aのデータより、セクレトームのペプチド分画が同一の阻害を再現し、抗ブドウ球菌化合物の主な供給源としてこの分画を表していることが示される。しかし、タンパク質分画(10kDa超)はまた、50%超のこの株の増殖阻害効果を示し(図3B)、いくつかの種類の抗ブドウ球菌分子であるセクレトームの存在を示唆する。PF−11の上澄み液の活性をさらに特徴付けるために、とりわけ、沸騰させて分子を変性させ、存在する任意の酵素活性を破壊した後に、その抗微生物効果を試験した。図3Cのデータより、煮沸されたセクレトームは、上記の図2で観察された抗微生物効果を保持することが示される。

0119

分泌されたペプチド含量を特徴付けるために(上記図3Bのように調製し)、増殖の対数期のP.プチダ(P.putida)PF−11セクレトームに含まれる材料の評価を、P.プチダ(P.putida)KT2440を参考株として使用し、HPLCによって実施した。参照株の分泌ペプチドのプロファイルは、溶出の最初の段階でのみ認識することができる非常に小さいペプチドを表すいくつかのピークとともに不十分な溶出プロファイルを示す。対照的に、PF−11セクレトームは、ペプチドが明らかに豊富であること、クロマトグラフィーに沿って均一に溶出されること、および特にKT2440株よりもはるかに大量であることを示す(図4A)。ここで増殖の対数期および静止期で得た抽出物を比較すると、PF−11セクレトームのこのペプチド分画のより詳細なHPLC分析により、この株によって分泌されたペプチドの入り組んだ複雑性が示された(図4B)。さらに、これらの低分子の非常に強い蓄積は静止増殖期において明らかに検出可能であり、ペプチドの安定性が良好であることを示し、かつ優れたペプチド分泌株としての株P.プチダ(P.putida)PF−11が確認される。

0120

細菌ペプチドは大抵の場合、界面活性を有するリポペプチドである。したがって、増殖静止期におけるPF−11の細菌培養物の表面張力を分析し、増殖培地および株KT2440と比較した(図5A)。同一体積の溶液をプラスチック表面滴下し、液滴の直径とその高さの両方を視覚化した(材料および方法を参照のこと)。増殖培地のみと株KT2440の両方が、沈殿物の直径と高さの両方で同様の特徴を示した。対照的に、PF−11培養物の液滴は、表面接触の非常に有意な広がりを示し、同時に生じる直径の増加(対照と比較すると、2倍)と高さの急激な減少とから明らかに認識される。培養されたPF−11を含む培地は接触表面張力(contact surface tension)が大きく低下し、培地中に界面活性剤分子が存在することを示す。細菌細胞の存在から任意の人為的効果を除くため、実験を、株KT2440およびPF−11の精製セクレトームを使用して繰り返した(図5B)。細菌培養物を用い上記で得られたデータをそのセクレトームで確認することにより、株PF−11が界面活性剤分子を培地中に活発に分泌することが示される。

0121

サイズが10kDa超の化合物の分画は、いくつかの試験標的株に対して有意な抗微生物効果を示した。沸騰された抽出セクレトームは、その特性が有意に変化しないにもかかわらず、酵素、すなわち触媒活性を有するタンパク質の存在が、それが示す阻害効果の大きな一因となり得る。したがって、大腸菌(E.coli)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、および緑膿菌(P.aeruginosa)株からの粗精製タンパク質抽出物を使用し、KT2440の増殖の対数期および静止期において抽出したPF−11セクレトーム、ならびに対照としての水と一晩インキュベートして、分解酵素の存在をアッセイした(図6)。水とインキュベーションすると、37℃で一晩後に、外部効果の影響を受けることなく標的タンパク質のパターンが示される。KT2440セクレトームと一晩インキュベートした後のタンパク質プロファイルは、巨大タンパク質に相当する薄いバンドを最上部にもたらし、低レベルであるが、いくつかの分解を示す。対照的に、上記の通り、PF−11セクレトームは全てのタンパク質抽出物を、静止期と比較して低濃度の化合物を有する対数期に収集されたものでさえ強力に分解する。この分析によって、PF−11セクレトーム中に、複合体基質、たとえば別の細菌由来の全粗精製タンパク質抽出物を分解することが可能である、顕著な濃度かつ極めて効率的な活性の分泌分解酵素の存在が示される。

0122

したがって、シュードモナス(Pseudomonas)PF−11セクレトームは、非常に豊富でありかつ組成と活性に関して複雑であり、グラム陰性株とグラム陽性株の両方に強い抗微生物効果を有する。このような化合物の潜在的な用途についての更なる研究に関しては、分泌分子を抽出し、濃縮することと、その特性評価を進めることとが不可欠である。したがって、セクレトームを、凍結乾燥によって濃縮し、緩衝液交換によって脱塩し、水中に再懸濁した。この再構成溶液を、試験済みの大腸菌(E.coli)および黄色ブドウ球菌(S.aureus)株に対して、異なる濃度(10倍、4倍、および2倍、1倍の濃度がPF−11培養物の上澄み液の濃度に相当する)で調べ、この精製プロセスの後に化合物がその抗菌特徴を保持したかどうかを評価した。さらに、これらの研究の1つの目的は、新規の抗感染症剤アプローチを実施することであり得、病原株は「基準」株とは異なる特性を有するため、2種類の病原株を使用してPF−11によって分泌された精製化合物を試験した。大腸菌(Echerichia coli)O157およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicilin−resistant S.aureus)(MRSA)ATCC33591は有毒な臨床病原単離株であり、一般的にはEU薬局方のコントロールおよびモニタリングにおける最小株として使用される。最初に、精製され、脱塩され、濃縮された全セクレトームを、これらの4種類の株とともに増殖阻害アッセイで使用した(図7A)。従来通り、PF−11セクレトームの強力な抗微生物活性は、試験された全ての株については明白である。黄色ブドウ球菌(S.aureus)株は、2倍の濃度の抽出物で全体的に阻害される。しかし、高濃度(4倍および10倍)で阻害効果は低下するが、80%越の増殖阻害は依然として達成される。両方の大腸菌(E.coli)株がPF−11セクレトーム存在下で同様の振舞いをするが、大腸菌(E.coli)O157は、その抗微生物効果に対して大腸菌(E.coli)ATCC25922よりも低濃度でより耐性を示す。この相違にも関わらず、10倍の濃度で両方の株の増殖は90%阻害される。先のように、再懸濁されたセクレトームのペプチド分画を分離し、その抗微生物効果を分析した。ペプチドは、2倍の濃度で大腸菌(E.coli)に対する効果が低いことが示された(図7B)。しかし、4倍の濃度では、両方の株の増殖は50%に低下し、全体的な増殖阻害が10倍の濃度で達成される。ペプチドの抗ブドウ球菌効果については、約90%阻害が2倍の濃度で達成され、100%阻害に近い範囲が高濃度で達成される。サイズが10kDa越の分子を含む分画の抗微生物効果を分析するときに、PF−11培養物の上澄み液で観察された大腸菌(E.coli)25922に対する増殖阻害が実証された(図7C)が、この分画は病原性大腸菌(E.coli)O157の増殖に有意な効果は有さない。驚くことに、黄色ブドウ球菌(S.aureus)増殖は両方の株で大きく低下し、80%よりも優れた阻害を伴うが、上澄み液では約50%の阻害しか達成されなかった。沸騰させて分子構造を変性させること以外は同一の分画を使用した更なる試験を実施し、沸騰されていない懸濁液と非常に類似した結果であった(図7D)。

0123

例4
PF−11セクレトームの防汚損効果
P.プチダ(P.putida)の環境株の異種コレクションを、抗生物質に対する耐性を介した活性選択による従来の研究を通じて収集した(Meireles 2013)。この1組の株を使用し、細胞外分泌潜在力を調べ、P.プチダ(P.putida)によって産生されたプロテアーゼを識別しかつ特徴付けた。P.プチダ(P.putida)KT2440と比較すると、バイオレメディエーション用途の関連で単離され、研究された株であるシュードモナス(Pseudomonas)PF−11は有益な株として発生し、コレクション由来の他の全ての細菌の中でバイオテクノロジー関連の潜在力を伴っていた。この環境株をスクリーニングするために使用した選択手順および防汚損剤分泌細菌としてのその潜在力の評価をここに記載する。粗精製細菌タンパク質抽出物の分解と海洋生物学付着剤の分解との両方において、強力なタンパク質分解効果がin vitroで示された。さらに、上澄み液または全PF−11細菌培養物のいずれかを使用したin vivoアッセイにより、海洋性マイクロ汚損の破壊に対するかつウニによって産生された生体接着剤の分解に対するこの株の防汚損特性が明らかに実証される。

0124

したがって、環境から単離されたシュードモナス(Pseudomonas)株PF−11は、プロテアーゼ、とりわけ他の生体分子濃縮混合物を分泌することが可能であり、マイクロ汚損またはマクロ汚損事象のいずれかに対する強力な防汚損効果を高めることが可能である。したがって、天然起源のこのような化合物は、海洋性防汚損技術における用途、たとえば、新規の被覆剤または保護塗料への添加物に潜在的に有用である。

0125

材料および方法
細菌単離株
あらかじめ、65種類の環境シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のコレクションを、土壌から単離し、肉眼的に選択し、識別し、獲得した抗生物質耐性メカニズムを特徴付けた(Meireles 2013)。土壌および泥試料を、PortugalのLisbon地区にあるTejo川付近のいくつかの場所から収集した。予備的な表現型分析の後に、高い適応力(速い増殖、最低限の栄養必要量)および抗微生物多耐性プロファイルを示した7種類のP.プチダ(P.putida)を、これらの分泌挙動をスクリーニングするために選択した。この環境設定セットを分析し、十分に研究された参考株(Palleroni)であるP.プチダ(P.putida)KT2440と比較した。

0126

細菌培養物の成長条件
使用した全ての株は、5%グリセロール中、−80℃で保存し、LA(LuriaブロスAgar)中、35℃で一晩(16時間)培養してから、M9に接種した。単一のコロニーを、0.4%グルコースが添加された液体M9最小培地(50mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、8.5mM NaCl、18.7mM NH4Cl、0.1mM CaCl2、1mM MgSO4、0.0005%チアミン)(Miller et al.)に、35℃、120rpmで、1、2、4、6、または24時間増殖させた(後半を静止期と定義した)。培養物が所望の増殖期に達した後に、それを直接使用するために収集するかまたは10,000gで最低でも15分間遠心分離して、培養培地中のバルク細胞を、上澄み液から収集された分泌分子から分離した。

0127

細菌細胞内タンパク質の抽出および分離
増殖の対数期または静止期のいずれかからの細菌細胞沈殿物を10,000gで15分間遠心分離することによって収集した。細菌を、タンパク質抽出緩衝液(2%SDS、20mM Tris、2mMPMSF)(Sambrook et al.)に再懸濁し、懸濁液を5分間煮沸し、細胞溶解を誘発した。タンパク質をNanodrop装置(Thermo Fisher Scientific)で、280nmで測定することによって定量化し、ホモジネートし、最終的に10μg/10μlとした。Coomassie Brilliant Blue(登録商標)(Sigma)(0.03%)、グリセロール(30%)、およびβ−メルカプトエタノール(10%)を含む、1:1volのタンパク質ローディング緩衝液を添加し、沸騰してからすぐに、試料をSDS−PAGE用の12.5%PAAゲルにローディングした。

0128

細菌培養物からの上澄み液の調製
M9培地中の細菌培養物由来の上澄み液を回収し、以前に記載のように(0)、ろ過装置の0.22μmナイロンフィルターを介して滅菌ろ過した。滅菌状態を確認するために、各上澄み液の100μlを35℃で少なくとも16時間インキュベートした。防汚損実験に関しては、ろ過された上澄み液を直接使用し、in vitroタンパク質分解アッセイに関しては、上澄み液を−50℃で凍結乾燥し、水中に懸濁し、収集された上澄み液の最初の体積と比較して20分の1に濃縮した。

0129

分泌されたタンパク質のTCA沈降
滅菌ろ過されたタンパク質上澄み液を、トリクロロ酢酸(TCA)およびアセトンを使用して沈降させた。4℃のアセトン中の25%TCA溶液を、1:3(通常は、TCA8ml対上澄み液の沈降物25ml)の体積比で各試料へ添加した。ホモジネート後、混合物を上で15分間インキュベートし、次いで、10,000g、4℃で10分間遠心分離した。得られた沈殿物をアセトンで10mlおよび4mlでそれぞれ懸濁することによって2回洗浄し、続いて、同一の条件で遠心分離した。乾燥した最終沈降物をSDSタンパク質変性ローディング緩衝液(62.5mM Tris HCl pH6.8、2%SDS、5%β−メルカプトエタノール、20%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー)40μlに懸濁し、その10μlを12.5%SDS−PAGEゲル中でランした。ゲルをCommasie Brilliant Blue(Sigma)で染色した。沈降フラクションを、初期細胞培養物懸濁液6.5mlに相当するゲルへアプライした。

0130

タンパク質分解アッセイ
P.プチダ(P.putida)セクレトームのタンパク質分解物質含量を評価するために、Fluorescent Protease Assay Kit(Pierce)を製造業者取扱説明書に従って使用した。手短に言うと、アッセイには、フルオレセイン共鳴エネルギー移動(FRET)によって、試料中のプロテアーゼ活性を評価するためのフルオレセイン標識基質(カゼイン)の使用が含まれる。この強く標識された無傷タンパク基質蛍光特性は、プロテアーゼによって消化されたときに劇的に変化し、測定可能なタンパク質分解の指標をもたらす。基質がより小さいフルオレセイン標識フラグメントに消化されるにつれて、総蛍光シグナルは(蛍光消光が減少する結果として)増加する(ホモトランスファー蛍光方法)。蛍光測定を、フルオレセイン励起/発光フィルター(485/538nm)を備えたFluorolog−3(Horiba Jobin Yvon)を用い、0.5cmの石英キュベット光路中で行った。校正用に、トリプシンを一般的なプロテアーゼに選択した。セクレトーム試料をTBS(25mM Tris、0.15M NaCl、pH7.2)で100倍に希釈した。トリプシン標準およびカゼイン溶液を同一の緩衝液で調製した。全ての試料および標準を基質と、室温で20分間インキュベートした。タンパク質濃度を、Bradfordタンパク質アッセイによって判定し、ウシ血清アルブミン(BSA)(Bio−Rad)を標準として使用した。単離された全てのP.プチダ(P.putida)株のセクレトームを本方法に従って評価したが、ブランクよりも優れた総蛍光値を示したもののみをさらに処理した。試料中のプロテアーゼ濃度の評価を、トリプシン標準を用いた直線回帰によって計算し、次いで、アッセイで使用した総タンパク質量で割った(μgプロテアーゼ/μgタンパク質)。プロテアーゼ活性に対する温度効果を評価するために、セクレトーム試料をフルオレセイン標識カゼインと、異なる温度(5℃毎に15〜45℃)で20分間インキュベートした。得られたタンパク質1mg当たりのプロテアーゼ活性μgの最大値最大活性(100%)とみなし、全温度結果とこの値との比を実施した。温度がそれ自体の蛍光シグナルに影響を与えないことを確認するために、標準ブランクに加えて、フルオレセイン標識カゼインを用いて予備対照を作製し、各研究温度の緩衝液中のみでインキュベートした。

0131

プロテアーゼ基質をスクリーニングするための2D−PAGE
細菌参考株(大腸菌(E.coli)ATCC25922)の細胞外タンパク質抽出物およびウニ、ヨーロッパムラサキウニ(Paracentrotus lividus)の削られた付着性足跡を、記載のように(Nestler et al.)タンパク質分解アッセイのための基質として使用した。大腸菌(E.coli)の全タンパク質を上記(細菌細胞内タンパク質の抽出および分離)のように抽出した。ウニ付着性足跡(乾燥重量で1mg)を、10%トリクロロ酢酸1mL、0.07%(w/v)β−メルカプトエタノール中に、4℃で1時間懸濁し、タンパク質を沈降させ、次いで、冷却(−20℃)されたアセトン中の0.07%(v/v)β−メルカプトエタノール1mLで3回洗浄し、最後に真空乾燥した。得られたタンパク質沈殿物非還元条件下(62.5mM Tris−HCl pH6.8中、2%SDS、20%グリセロール)で再懸濁し、得られた溶液を95℃で5分間加熱した。次いで、ウニ付着性タンパク質を、12.5%ポリアクリルアミドゲル中でSDS−PAGEを使用し、一次元で分離した。分離後、レーンを切り出し、陰性対照としてM9培地と、かつPF−11株上澄み液と、35℃で5時間インキュベートした。1Dレーンは、12.5%ポリアクリルアミドゲル上のアガロースシールし、2次元を、1次元に対して直角にランした。電気泳動は同一の条件下で実施されるため、未消化のタンパク質がゲルを通して対角線上に出現する。特異的なタンパク質分解的切断生成物はこのレーンの下に生じるはずである。

0132

海洋バイオフィルムの破壊
PF−11P.プチダ(P.putida)の最終単離上澄み液の抗微生物学的防汚損潜在力をex vivoで評価するために、海洋バイオフィルムを、「Vasco da Gama Aquarium」(Alges、Oeiras)の15℃で33%の海水を含む開放型循環槽(open-circuit tank)の内側に入れたペトリ皿上で成長させた。これらのペトリ皿を再蒸留水で優しく3回洗浄し、過剰の塩および遊離有機材料を除去した。残りの強力に接着した材料(細菌および微細藻類)を、異なる細胞基質および滅菌上澄み液とインキュベートし、海洋性マクロ汚損を、室温、18〜40時間でガラスマトリックスから破壊する能力を評価した。インキュベーション期間後、液体分画を除去し、皿を再蒸留水で優しく洗浄し、バイオフィルム破壊を可視化した。全ての試験を少なくとも3回実施した。代表的な写真を示す。

0133

ウニ付着性足跡のex vivoでの分解
ヨーロッパムラサキウニ(Paracentrotus lividus)種由来のウニ(Lamark 1816)を、Portugalの西海岸(Estoril、Cascais)で干潮時に収集した。収集後、動物を「Vasco da Gama Aquarium」(Alges、Oeiras)に移送し、15℃および33%の開放型循環槽で飼育した。人工海水(Crystal Sea、Marine Enterprises International、Baltimore、MD、USA)中にウニを含む小さいプラスチック水槽(3L)を使用し、付着性材料を収集した。この水槽の内部を、動物が接着することができる取り外し可能なガラス板で覆った。

0134

数時間後、何百もの足跡で覆われたこれらのガラス板を除去し、蒸留水すすぎ、タンパク質抽出のために使い捨てメスで削るかまたは除去アッセイのために直接使用した(0)。シュードモナス(Pseudomonas)PF−11の最終単離上澄み液の海洋性防汚損潜在力をex vivoで評価するために、収集したウニの足跡を既に記載の細胞培養物および滅菌上澄み液とインキュベートした。インキュベートの前に、ガラススライドを再蒸留水で洗浄し、0.05%Crystal violetで染色し、再び洗浄し、付着性足跡材料を可視化した(0)。次いで、これらを評価の段階で、溶液と35℃、80rpmで18時間インキュベートした。ガラススライドを最後に洗浄し、同一のプロトコールに従って染色し、ガラス基質から生物学的付着剤を除去するその能力を評価した。

0135

海洋環境無脊椎動物に対する防汚損剤としてのPF−11セクレトームの能力を評価するために、ウニ管足によって分泌された付着性足跡をタンパク質分解基質として使用した。その粘着力単位面積当たりの力)は0.09〜0.54MPaと推定され(0 et al.2005、Santos et al.2006)、これは他の無脊椎動物(非永久接着剤および永久接着剤に関してそれぞれ0.1〜0.5および0.5〜1MPa(Smith 2006))と比較して、強力な非永久接着剤としてのウニの分泌付着物を示す。

0136

ウニによって分泌された付着接着剤は、水生環境において重合することが可能であり、部分的にタンパク質で形成された化合物の複合混合物を含んでいる、織り交ぜられた構造を形成する。したがって、以前(Santos et al.2005、Santos et al.2009)に示されように、それは非常に安定でありかつ分解に対して耐性を示す。

0137

ウニを海水水槽中、15℃で維持し、次いでガラス板に置き、付着させた。その本来の挙動によって、ウニは接着と脱着とを繰り返し、ガラス上に付着性足跡を残し、それを可溶化するには強力な変性および還元剤が必要であった(Santos et al.2009)。対角線SDS−PAGEをまた実施し、1次元は付着性足跡から抽出されたタンパク質の分離からなり、続いてゲルレーンをPF−11上澄み液とインキュベートし、最後に、大腸菌(E.coli)タンパク質抽出物に関して2次元をランした。

0138

先のように、PF−11細胞培養物から回収された上澄み液とインキュベートすると、タンパク質の完全な分解が確実になる。このタンパク質抽出物は、大腸菌(E.coli)由来の全細胞タンパク質抽出物ほど複雑ではないが、分解がより困難であることが予想される付着性タンパク質を含むが、一方で結果より、株PF−11によって分泌されるタンパク質の潜在的なタンパク質分解活性が確認され、さらに防汚損化合物分泌体としてその潜在力を高める一因となる(図10B)。

0139

セクレトーム分析
環境細菌単離株のコレクションを都会河川岸および農地土壌から回収し、スクリーニング方法としていくつかの抗生物質を使用し、強力な適応および生存潜在力を有する株を選択した。収集され、識別された細菌のうち、その複製速度が速いこと、異なる状態に対して適応が広いこと、およびストレスに対する耐性が確立されていることとおそらく関連する回復力の優れた保有体としてシュードモナス科(Pseudomonaceas)が出現した(Palleroni)。これらの科のうち、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)は最も一般的な種であり、70種類の1組の株を、多数の、概してβ−ラクタムに対する耐性株とともに単離した(データは未発表である)。

0140

バイオテクノロジー用途の潜在的な活性生体分子をスクリーニングするために、概してβ−ラクタムに、特に第3世代のセファロスポリンおよびカルバペネムに対して高い耐性プロファイルを示す7種類の環境単離P.プチダ(P.putida)株を選択し、最小培地で培養し、その分泌プロファイルを評価した(Meireles 2013)。最初に、全細胞タンパク質を環境単離株から抽出し、バイオレメディエーション研究の背景において広く研究されたP.プチダ(P.putida)KT2440株と比較した(Nelson et al.)。

0141

株KT2440は、バイオレメディエーションツールとしてのその潜在力および優れた挙動に基づいて単離され、不利な環境または毒性化合物に対する耐性のいずれかに適応する株である、P.プチダ(P.putida)mt−2から得られた(0 et al.)。したがって、その特徴が、その生存力の点で同一種由来の大部分の株よりも多用途性を示すという意味では、それは既に非典型的なP.プチダ(P.putida)株である。SDS−PAGEゲルによる分析により、KT2440株に類似する分布プロファイルを有する株PF−11(それぞれ、図8Aのレーン4および1)を除いて、単離株間でほぼ類似する細胞内タンパク質分布パターンが示された(図8A)。同時に、これらの株の分泌潜在力を評価するために、培地に分泌されたタンパク質を、TCA/アセトンを用いた沈殿によって濃縮し、(ろ過によって細胞を除去した後に)最初の培地体積に対して比例的に懸濁した。

0142

セクレトームプロファイルを、SDS−PAGEによって同様に分析した(図8B)。細胞内タンパク質分画とは異なり、分泌されたタンパク質プロファイルは単離株間で、組成だけではなく、定量的にも異なっていた。最も著しい違いは、株PF−11分泌挙動において観察された。実際には、同一のゲル中で全ての株のデータを示すために、PF−11株の回収されたセクレトームを8倍に希釈して、過剰ローディングを避けなければならない。その場合でさえも、図8Bに示されるように、研究された他の株のセクレトームよりも有意により高濃度でありかつ複雑である。

0143

PF−11の8倍に希釈された試料を除いて、このゲルにロードされたタンパク質は、増殖静止期における同体積の培養上澄み液と一致する。シュードモナス(Pseudomonas)PF−11がこのような高レベルの分泌タンパク質を産生するという事実が得られることにより、強力な分泌潜在力が明らかになり、そのセクレトームをさらなる特性評価のために選択した。株PF−11によって分泌されたタンパク質を収集し、増殖曲線に沿って視覚化し、増殖条件による変化を判定した。グルコースが添加されたM9最小培地の増殖曲線に従って培養物中の細胞が増加するために、予想通りに、培地に放出されたタンパク質が時間とともに有意に蓄積されたことを実証することが可能であった(図8C)。バルク上澄み液のタンパク質分解活性を、スクリーニングされた全ての株について分析した。

0144

ろ過した上澄み液を、酵素活性を保持するために凍結乾燥し、水中に懸濁すると、未加工上澄み液の20倍の濃度に相当した。試験された全ての試料のうち、増殖の対数期または静止期のいずれかで収集されたPF−11セクレトームのみが、タンパク質分解活性を判定するためにカゼイン基質を分解することが可能であった(表1)。

0145

0146

表1.プチダ(P.putida)参考株および単離株によって静止期(STAT)にM9最小培地に分泌された全タンパク質のプロテアーゼ活性。データはまた、対数期(EXP)のPF−11細胞外プロテアーゼについても示す。ND:未検出。

0147

このスクリーニングにおいて、PF−11は、優れた分泌潜在力を有する株として明らかな振舞いをする。上澄み液への全体的な分泌タンパク質の蓄積が増殖曲線に沿って観察されたため、タンパク質分解活性の増加が、静止期に収集されたセクレトームに予想することができる。しかし、静止期に測定された全分泌タンパク質によって正規化されたタンパク質分解活性は、分泌タンパク質1mg当たりプロテアーゼ115μgであり、対数期と比較するとほぼ2倍の増加に相当し、したがってまた、増殖曲線とともに、分泌タンパク質のうちプロテアーゼが豊富であることが明らかになった(表1、図9A)。

0148

静止期に収集された分泌プロテアーゼのタンパク質分解活性に最適な温度を15〜45℃で測定し、35℃であることが実証された(図9B)。活性を比較し、カゼインのタンパク質分解が試験された温度に応じて百分率でプロットした。P.プチダ(P.putida)は平均で15〜30℃の温度範囲で通常は生存する環境株であるため、その分泌タンパク質は広い温度範囲で活性を保持することができるであろうと期待することができる。図9Bに示されるように、分泌プロテアーゼは、35℃の最適温度でのその活性を比較すると、15℃の低温度でそのタンパク質分解活性の30%を依然として保持する。

0149

その細胞機能熱ショック状態で悪化するため、ほとんどの細胞プロテアーゼは約50〜60℃の最適温度を有する(Angilletta et al.)。細胞外細菌プロテアーゼはまた、工業用途でプロテアーゼの製造および精製のために広く使用される、すなわちバチルス属種(Bacillus spp.)において同様の特徴を有することが示される(Watanabe et al.,Angilletta et al.)。一方、海洋微生物は、中国で単離される海洋細菌株によって産生されるメタロプロテイナーゼなどの、低温に適応した酵素を通常産生し、その酵素は30℃で最大活性を示す(0 et al.)。

0150

プロテアーゼの産業用途も、これらの酵素のターンオーバーが少ないことを必要とするであろう。これを評価するために、PF−11分泌タンパク質を37℃で一晩インキュベートし、タンパク質分解活性を測定すると、活性の低下は約25%であったことが実証された(図9C)。さらに、いくつかの高分子量構成成分は、おそらく自己タンパク質融解のために低下したが、一晩インキュベートした後のセクレトームタンパク質のプロファイルはほとんど変化しなかった(図9D)。

0151

対数期または静止期のいずれかでPF−11から回収された上澄み液は、カゼインに対して強力なタンパク質分解効果を示した。これは、このセクレトームの極めて特異的なタンパク質分解活性を明らかに示すにもかかわらず、単一基質のタンパク質分解のままである。広範囲の標的プロテアーゼ混合物としてのPF−11株セクレトームの効果を評価するために、全タンパク質を大腸菌(Echerichia coli)株から抽出し、基質として使用した。対角線SDS−PAGEゲルを実施し、PF−11セクレトームによる、大腸菌(E.coli)タンパク質抽出物の最終的なタンパク質分解を可視化した(Nestler et al.)。

0152

大腸菌(E.coli)ATCC25922から収集した全タンパク質を、1次元SDSポリアクリルアミドゲルで分離し、次いで、ゲルレーンをPF−11活性上澄み液と37℃で5時間インキュベートした。2次元の移動により、同様にサイズによって分子が分離され、大腸菌(E.coli)タンパク質抽出物のほぼ完全な分解が明らかに示された(図10A)。不十分な分解フラグメントが依然として検出されるが、対照ゲルと対照的に、対角線移動パターンが明白に認められないことにより、PF−11セクレトームの強力で広範囲なタンパク質分解活性が確認された。このような結果より、これらはタンパク質の複合体溶液をほぼ完全に分解することができるため、これらの分泌プロテアーゼは防汚損剤として作用することができることが示唆される。

0153

PF−11セクレトームのin vitro効果
PF−11セクレトームの防汚損効果をin vitroで評価するために、2種類のアッセイを実施した。防汚損作用を、ガラスペトリ皿またはスライドに堆積した海洋細菌、微細藻類、海洋バイオフィルム、およびウニの付着性足跡によって代表される、マイクロ汚損とマクロ汚損の両方に対して試験した。

0154

海中に浸した材料が、微生物、主に細菌が接着するための場所となる。これらの細菌の多くが、有機デトリタス破片が付着する粘着性材料を産生する。続いて、微細藻類が表面にコロニーを形成することもある。細菌およびその副産物はデトリタスと結合し、かつ微細藻類集団は「スライムフィルム」と通常呼ばれるものを構成する。このフィルムは、通常、汚損の最初の形態であり、水面下の表面に出現する。

0155

マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)およびコベティア・マリナ(Cobetia marina)は偏性海洋細菌であり、海洋付着物の主要な最初のコロニーとして常に記載される。これらの細菌は、海洋防汚損試験における指標として定期的に使用され、マクロ汚損またはより一般的にはスライムと呼ばれる生物汚損の初期層に対する化合物の防汚損能力を評価してきた。PF−11セクレトームは、コベティア・マリナ(Cobetia marina)の増殖のコントロールに非常に効率的である。図19に示されるデータは、いくつかの濃度のPF−11セクレトーム存在下での、海洋環境における最適な条件下でのコベティア・マリナ(Cobetia marina)の増殖発展を表す。曲線により、8g/Lおよび4g/Lの低濃度のPF−11セクレトームで、コベティア・マリナ(C.marina)の強力な増殖阻害が明らかに示される。PF−11セクレトームはまた、増殖阻害試験において、470または234ppm(w/v)の低濃度で、いくつかの他の海洋細菌、たとえば、海洋生物汚損と通常関連するビブリオ属種(Vibrio spp.)の増殖を阻止する(図20)。これらの株に加えて、PF−11セクレトームはとりわけ、グラム陰性菌グラム陽性菌の両方の細菌、すなわち、大腸菌(Echerichia coli)、ビブリオ・アルギノリティカス(Vibrio alginolyticus)、腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、コベティア・マリナ(Cobetia marina)、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、エンテロコッカスフェカーリス(Enterococcus faecalis)に対して効果的な抗微生物活性を与える。

0156

したがって、PF−11セクレトームは、一般的に細菌有機体の増殖コントロールに非常に効果的である。より具体的には、PF−11セクレトームは、生物汚損の初期層を形成する細菌に対して防汚損能力を有する。細菌自体の増殖コントロールに加えて、PF−11セクレトームはまた、海洋細菌バイオフィルムの形成、事実上、スライムのベース形成の阻止に効率的である。図21に示されるデータにより、腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)およびマリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)のバイオフィルムの阻止に対するPF−11の効果が、500〜2000ppmの範囲のPF−11セクレトーム濃度で達成したことが示される。

0157

図22で観察することができるように、海洋細菌とともに、PF−11セクレトームもまた、効果的な抗微細藻類活性を与えることができ、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)、ムレミカズキモ(Pseudokirchneriella subcapitata)、およびテトラセルミス・スエシカ(Tetraselmis suecica)などのいくつかの微細藻類種の増殖に影響を及ぼす。試験された最も感受性を示す種はコナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtiiであり、最も耐性を示す種はムレミカズキモ(Pseudokirchneriella subcapitata)であった。

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