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図面 (16)

課題・解決手段

本発明は、アミロイドを画像化するためにニトロキシドスピン標識されたアミロイドβ結合性化合物を用いる方法を提供する。また、本発明は、アミロイドに結合することが可能なニトロキシドスピン標識されたアミロイドβ結合性化合物も提供する。

概要

背景

現在、アメリカでは500万人を越える人々がアルツハイマー病(AD)に罹患しており、この数字が劇的に上昇することが予想された(Hebert et al. (2013) Neurology 80:1778)。ADは、加齢に伴う進行性の、潜行性神経変性疾病であって、認知機能の段階的な低下につながる。ADは、複合的な、多因子性病因が原因で進行するが、しかしながら、診断的な試みと治療的な試みの両方に標的を示す2つの病理学的疾患単位がADには存在する。これらの標的は、不溶性細胞外アミロイドβ(AB)プラークと、過リン酸化タウ微小管関連タンパク質凝集体から生じる細胞神経原線維変化である。ABプラークの不溶性沈着物がADのマーカーとしての役割を果たす一方で、複数の遺伝的および生化学的ないくつかの証拠は、アルツハイマー原因物質がABペプチドの可溶性の、オリゴマー形態であるという仮説を支持する(Viola and Klein (2015) Acta Neuropathol. 129:183)。ABプラークは、γおよびβセクレターゼ(プロテアーゼ)が、ニューロン原形質膜上で発現されるタンパク質であるアミロイド前駆タンパク質(APP)を切断したとき形成される可溶性ABペプチドの凝集から作り出される(Zhang et al. (2011) Mol. Brain 4:3)。アミロイドプラーク沈着による重大な脳損傷は、認知症確定診断がなされ得る10〜20年も前に一般的に起こるので(Sperling et al. (2011) Alzheimers Dement. 7:280およびBateman et al. (2012) N. Eng. J. Med. 367:795)、可能な限り最も初期病期にアルツハイマー病の経過を検出できる方法を発症することが必須である。現在、ADの唯一の確定診断は、検視に適用され、そして、臨床診断ツールは、もっぱら記憶試験とPETによる画像化に限られている。脳内のABレベル早期検出を可能にする利用しやすく、かつ、非侵襲性代替法が、疾病リスクを特定するのに、臨床試験を容易にするのに、疾病の進行を追跡するのに、および治療法を管理するのに有用である場合がある。

アミロイドプラークのABペプチドに結合する放射性標識された陽電子放射断層撮影(PET)または単光子放射コンピューター断層撮影(SPECT)を利用した画像化技術は、アミロイド負荷量を直接評価する可能性を有するが(Klunk et al. (2004) Ann. Neurol. 55:306)、短寿命放射性同位体の限定された利用可能性高コスト、および信頼性に難点がある。この点で、ADリスク核磁気共鳴画像法(MRI)に基づく検出法が非常に望ましい。MRIは、非放射性プローブの使用、増強された分解能、およびアミロイドプラークを定量するのに使用できる解剖学的詳細を明確に定める能力を含めたPETやSPECTを超える利点を提供する(Huddleston and Small (2005) Nat. Clin. Pract. Neurol. 1:96)。

MRIは、十分な量の内因性鉄がプラークに結合しているとき、アミロイドプラークの沈着物を検出できる(Vanhoutte et al. (2005) Magn. Reson. Med. 53:607)。プラーク内の金属、特に鉄の存在は、加速的なT2*緩和速度および鉄が豊富なABを多く含む領域のネガティブコントラストを作り出す(Vanhoette et al. (2005) and Jack et al. (2007) Neuroscientist 13:38)。しかしながら、T2*コントラストは、赤血球に存在するヘム鉄または脳組織に存在する非ヘム鉄などのさまざまな起源由来するので、内因性鉄に依存する方法は妨害を受ける(Jack et al. (2007) and Gelman et al. (2001) J. Neurochem. 45:71)。加えて、脳の一部の領域では、鉄が乏しいAB沈着物を含有しており(Vanhoutte et al. (2005) and Ghribi et al. (2006) J. Neurochem. 99:438)、鉄によって誘発されたコントラストによる総AB負荷の正確な評価を難しくする。

鉄が豊富なアミロイドプラークがMRIにおいてネガティブコントラストを示す一方で(Jack et al. (2007) and Wadghiri et al. (2012) MethodsMol. Biol. 849:435)、鉄が乏しいアミロイドからのシグナル不足が、脳ABレベルの全体的な評価のためのアプローチの価値を制限する(Adlard et al. (2014) Front Neurosci. 8:327)。MRIを使用してADを診断するという目標に向かって、MRIにおいて増強されたコントラストを生じるようにABを標的とする様々な作用物質が作り出された。例えば、超常磁性鉄を添加した磁性ナノ構造物が、ADマウスの脳でコントラストを生じるようにオリゴマー形態のABに対する抗体に連結された(Viola et al. (2015) Nat. Nanotechnol. 10:91)。加えて、いくつかのGd(III)に基づくアプローチが、AB自体(Wadghiri et al. (2012)およびPoduslo et al. (2002) Neurobiol. Dis. 11:315)、またはABに対する抗原結合性フラグメント(Ramakrishnan et al. (2008) Pharm. Res. 25:1861)のいずれかに金属キレート剤が結合することが調査された。AB集合体に親和性を有する小分子もまた、ABにおいてコントラストを生じるようにGd(III)キレート剤と組み合わせられたが、しかしながら、標的化分子へのキレート化Gd(III)の付加は、アミロイド結合および血液脳関門透過性を低下させる(Bort et al. (2014) Eur. J. Med. Chem. 87:843)。金属含有プローブおよび/または抗体介在性プローブが有望である一方で、問題および制限が、代替の小分子作用物質の必要性に至らせる。例えば、抗体介在性作用物質が、炎症カスケードを増強する可能性があり(Fuller et al. (2015) 130:699)、そして、免疫グロビン結合Gd(III)作用物質の使用が、脳実質においてわずかしか輸送されない(Wadghiri et al. (2012))。加えて、キレート化Gd(III)の使用は、腎臓または肝臓疾患に罹患している多くの患者において禁忌である(Khawaja et al. (2015) Insights Imaging 6: 553)。より重要なことには、ガドリニウム造影MRIの何年後も脳内に隔離されるという最近の証拠(Karabulut (2015) Diagn. Interv. Radiol. 21:269)が、免疫グロブリンおよびと小分子ベースのアミロイド特異的リガンドの両方のためのガドリニウムを用いない画像化の選択肢を調査するきっかけを提供する。

斯かるリガンドを作り出すための選択肢の1つが、例えばニトロキシドなどのスピン標識の取り付けによってである。スピン標識化合物は、ABペプチドオリゴマー相互作用して、潜在的な治癒的価値を実証することを示した(Altman et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta 2854:1860; Petrlova et al. (2012)PLoS One 7:e35443;およびHong et al. (2010) Neurobiol. Aging 31:1690)。他の業績は、蛍光および電子スピン共鳴を用いて原繊維酸化還元状態の変化を試験するための標識チオフラビン化合物の使用を実証した(Mito et al.(2011) Chem. Commun. 47:5070)。しかしながら、MRI適用におけるニトロキシドスピン標識の使用は、緩和能の低さが実証されたことにより制限された(Maliakal et al. (2003) J. Phys. Chem. A 107:8467; Winalski et al. (2008) Osteoarthritis Cartilage 16:815;およびRajca et al. (2012) J. Am. Chem. Soc. 134:15724)。この制限に対処する際に、本発明は、驚いたことに、アミロイド画像化の利用しやすく、かつ、非侵襲性の方法に関する要求、ならびに他の要求を満たした。

概要

本発明は、アミロイドを画像化するためにニトロキシドスピン標識されたアミロイドβ結合性化合物を用いる方法を提供する。また、本発明は、アミロイドに結合することが可能なニトロキシドスピン標識されたアミロイドβ結合性化合物も提供する。

目的

MRIは、非放射性プローブの使用、増強された分解能、およびアミロイドプラークを定量するのに使用できる解剖学的詳細を明確に定める能力を含めたPETやSPECTを超える利点を提供する

効果

実績

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請求項1

アミロイドを画像化する方法であって、式I:X-(Y)n(I)(式中、Xは、アミロイドβ結合性化合物であり;Yはニトロキシドであり;かつ、nは1〜3の整数である)の構造を有する化合物の有効量を、該化合物がアミロイドに結合するように対象に投与すること;および、アミロイドに結合した化合物を検出し、それによってアミロイドを画像化することを含む、方法。

請求項2

前記検出は、前記投与に続き少なくとも60分行う、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記検出は、核磁気共鳴画像法(MRI)、電子常磁性共鳴(EPR)、陽電子放射断層撮影(PET)、又は電子スピン共鳴顕微鏡法(ESRM)の少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。

請求項4

前記アミロイドは、アミロイドβ凝集体を含む、請求項1に記載の方法。

請求項5

前記アミロイドβ結合性化合物は、(式中、RaおよびRbはそれぞれ独立してH又はC1-4アルキルであり;ZはI、123I、125I、131I、Br、76Br、77Br、F、18F、および-O-トシルからなる群より選択され;かつ、qは2〜5の整数である)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項6

前記ニトロキシドは、からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項7

前記化合物は、(式中、R1は、からなる群より選択され;かつ、R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、および(OCH2CH2)3Fからなる群より選択される)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項8

前記化合物は、構造:(式中、R1は、メチル又はからなる群より選択されるニトロキシドであり;かつ、R2は、プロピルアミン又はここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)を有する、請求項1に記載の方法。

請求項9

前記化合物は、(式中、R1、R2、およびR3は、それぞれ独立してからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項10

前記化合物は、(式中、R1およびR2はそれぞれ独立してH又はからなる群より選択されるニトロキシドであり、ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項11

前記化合物は、(式中、R1およびR2はそれぞれ独立してH、からなる群より選択されるニトロキシドであり、ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項12

前記化合物は、(式中、Rは、からなる群より選択される)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項13

前記化合物は、構造:を有する、請求項1に記載の方法。

請求項14

前記化合物は、からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項15

前記化合物は、からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項16

前記化合物は、からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。

請求項17

前記対象は、治療目的で前記化合物を受けていない、請求項1に記載の方法。

請求項18

式II:(式中、R1およびR2はそれぞれ独立してH又はからなる群より選択されるニトロキシドであり、ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)を有する化合物。

請求項19

前記化合物は、からなる群より選択される、請求項18に記載の化合物。

請求項20

式:(式中、R1およびR2はそれぞれ独立してH、からなる群より選択されるニトロキシドであり、ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである)を有する化合物。

請求項21

前記化合物は、からなる群より選択される、請求項20に記載の化合物。

請求項22

式:(式中、R1は、からなる群より選択され;かつ、R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、および(OCH2CH2)3Fからなる群より選択される)を有する化合物。

請求項23

式:(式中、R1は、からなる群より選択され;かつ、R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、および(OCH2CH2)3Fからなる群より選択される)を有する化合物。

請求項24

からなる群より選択される化合物。

請求項25

式I:X-(Y)n(I)(式中、Xは、アミロイドβ結合性化合物であり;Yはニトロキシドであり;かつ、nは1〜3の整数である)の化合物を含む、アミロイドを画像化するための診断用組成物

請求項26

疾患を治療するための方法であって、請求項18〜23のいずれか1項に記載の化合物の治療的有効量を、前記疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む方法。

請求項27

前記疾患は、アルツハイマー病である、請求項26に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本願は、その全体が参考として本明細書に援用される、2015年8月18日に出願された米国仮出願第62/206,706号に基づく優先権の利益を主張する。

0002

連邦政府支援を受けた研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する声明
この業績は、国立衛生研究所からの助成金番号P30 AG010129によって支援された。連邦政府は、本願発明に一定の権利を有する。

背景技術

0003

現在、アメリカでは500万人を越える人々がアルツハイマー病(AD)に罹患しており、この数字が劇的に上昇することが予想された(Hebert et al. (2013) Neurology 80:1778)。ADは、加齢に伴う進行性の、潜行性神経変性疾病であって、認知機能の段階的な低下につながる。ADは、複合的な、多因子性病因が原因で進行するが、しかしながら、診断的な試みと治療的な試みの両方に標的を示す2つの病理学的疾患単位がADには存在する。これらの標的は、不溶性細胞外アミロイドβ(AB)プラークと、過リン酸化タウ微小管関連タンパク質凝集体から生じる細胞神経原線維変化である。ABプラークの不溶性沈着物がADのマーカーとしての役割を果たす一方で、複数の遺伝的および生化学的ないくつかの証拠は、アルツハイマー原因物質がABペプチドの可溶性の、オリゴマー形態であるという仮説を支持する(Viola and Klein (2015) Acta Neuropathol. 129:183)。ABプラークは、γおよびβセクレターゼ(プロテアーゼ)が、ニューロン原形質膜上で発現されるタンパク質であるアミロイド前駆タンパク質(APP)を切断したとき形成される可溶性ABペプチドの凝集から作り出される(Zhang et al. (2011) Mol. Brain 4:3)。アミロイドプラーク沈着による重大な脳損傷は、認知症確定診断がなされ得る10〜20年も前に一般的に起こるので(Sperling et al. (2011) Alzheimers Dement. 7:280およびBateman et al. (2012) N. Eng. J. Med. 367:795)、可能な限り最も初期病期にアルツハイマー病の経過を検出できる方法を発症することが必須である。現在、ADの唯一の確定診断は、検視に適用され、そして、臨床診断ツールは、もっぱら記憶試験とPETによる画像化に限られている。脳内のABレベル早期検出を可能にする利用しやすく、かつ、非侵襲性代替法が、疾病リスクを特定するのに、臨床試験を容易にするのに、疾病の進行を追跡するのに、および治療法を管理するのに有用である場合がある。

0004

アミロイドプラークのABペプチドに結合する放射性標識された陽電子放射断層撮影(PET)または単光子放射コンピューター断層撮影(SPECT)を利用した画像化技術は、アミロイド負荷量を直接評価する可能性を有するが(Klunk et al. (2004) Ann. Neurol. 55:306)、短寿命放射性同位体の限定された利用可能性高コスト、および信頼性に難点がある。この点で、ADリスク核磁気共鳴画像法(MRI)に基づく検出法が非常に望ましい。MRIは、非放射性プローブの使用、増強された分解能、およびアミロイドプラークを定量するのに使用できる解剖学的詳細を明確に定める能力を含めたPETやSPECTを超える利点を提供する(Huddleston and Small (2005) Nat. Clin. Pract. Neurol. 1:96)。

0005

MRIは、十分な量の内因性鉄がプラークに結合しているとき、アミロイドプラークの沈着物を検出できる(Vanhoutte et al. (2005) Magn. Reson. Med. 53:607)。プラーク内の金属、特に鉄の存在は、加速的なT2*緩和速度および鉄が豊富なABを多く含む領域のネガティブコントラストを作り出す(Vanhoette et al. (2005) and Jack et al. (2007) Neuroscientist 13:38)。しかしながら、T2*コントラストは、赤血球に存在するヘム鉄または脳組織に存在する非ヘム鉄などのさまざまな起源由来するので、内因性鉄に依存する方法は妨害を受ける(Jack et al. (2007) and Gelman et al. (2001) J. Neurochem. 45:71)。加えて、脳の一部の領域では、鉄が乏しいAB沈着物を含有しており(Vanhoutte et al. (2005) and Ghribi et al. (2006) J. Neurochem. 99:438)、鉄によって誘発されたコントラストによる総AB負荷の正確な評価を難しくする。

0006

鉄が豊富なアミロイドプラークがMRIにおいてネガティブコントラストを示す一方で(Jack et al. (2007) and Wadghiri et al. (2012) MethodsMol. Biol. 849:435)、鉄が乏しいアミロイドからのシグナル不足が、脳ABレベルの全体的な評価のためのアプローチの価値を制限する(Adlard et al. (2014) Front Neurosci. 8:327)。MRIを使用してADを診断するという目標に向かって、MRIにおいて増強されたコントラストを生じるようにABを標的とする様々な作用物質が作り出された。例えば、超常磁性鉄を添加した磁性ナノ構造物が、ADマウスの脳でコントラストを生じるようにオリゴマー形態のABに対する抗体に連結された(Viola et al. (2015) Nat. Nanotechnol. 10:91)。加えて、いくつかのGd(III)に基づくアプローチが、AB自体(Wadghiri et al. (2012)およびPoduslo et al. (2002) Neurobiol. Dis. 11:315)、またはABに対する抗原結合性フラグメント(Ramakrishnan et al. (2008) Pharm. Res. 25:1861)のいずれかに金属キレート剤が結合することが調査された。AB集合体に親和性を有する小分子もまた、ABにおいてコントラストを生じるようにGd(III)キレート剤と組み合わせられたが、しかしながら、標的化分子へのキレート化Gd(III)の付加は、アミロイド結合および血液脳関門透過性を低下させる(Bort et al. (2014) Eur. J. Med. Chem. 87:843)。金属含有プローブおよび/または抗体介在性プローブが有望である一方で、問題および制限が、代替の小分子作用物質の必要性に至らせる。例えば、抗体介在性作用物質が、炎症カスケードを増強する可能性があり(Fuller et al. (2015) 130:699)、そして、免疫グロビン結合Gd(III)作用物質の使用が、脳実質においてわずかしか輸送されない(Wadghiri et al. (2012))。加えて、キレート化Gd(III)の使用は、腎臓または肝臓疾患に罹患している多くの患者において禁忌である(Khawaja et al. (2015) Insights Imaging 6: 553)。より重要なことには、ガドリニウム造影MRIの何年後も脳内に隔離されるという最近の証拠(Karabulut (2015) Diagn. Interv. Radiol. 21:269)が、免疫グロブリンおよびと小分子ベースのアミロイド特異的リガンドの両方のためのガドリニウムを用いない画像化の選択肢を調査するきっかけを提供する。

0007

斯かるリガンドを作り出すための選択肢の1つが、例えばニトロキシドなどのスピン標識の取り付けによってである。スピン標識化合物は、ABペプチドオリゴマー相互作用して、潜在的な治癒的価値を実証することを示した(Altman et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta 2854:1860; Petrlova et al. (2012)PLoS One 7:e35443;およびHong et al. (2010) Neurobiol. Aging 31:1690)。他の業績は、蛍光および電子スピン共鳴を用いて原繊維酸化還元状態の変化を試験するための標識チオフラビン化合物の使用を実証した(Mito et al.(2011) Chem. Commun. 47:5070)。しかしながら、MRI適用におけるニトロキシドスピン標識の使用は、緩和能の低さが実証されたことにより制限された(Maliakal et al. (2003) J. Phys. Chem. A 107:8467; Winalski et al. (2008) Osteoarthritis Cartilage 16:815;およびRajca et al. (2012) J. Am. Chem. Soc. 134:15724)。この制限に対処する際に、本発明は、驚いたことに、アミロイド画像化の利用しやすく、かつ、非侵襲性の方法に関する要求、ならびに他の要求を満たした。

0008

第1の実施形態では、本発明は、式I:
X-(Y)n (I)
の構造を有する化合物の有効量を、該化合物がアミロイドに結合するように対象に投与することを含む、アミロイドを画像化する方法を提供する。式IのXはアミロイドβ結合性化合物である。式IのYはニトロキシドである。下付き文字nは1〜3の整数でありうる。この方法は、アミロイドに結合した化合物を検出し、それによってアミロイドを画像化することをさらに含む。

0009

第2の実施形態では、本発明は、式II:



(式中、式IのR1およびR2はそれぞれ独立してH又はニトロキシドでありうる。ニトロキシドは:



でありうる。R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)の構造を有する化合物を提供する。

0010

第3の実施形態では、本発明は、式III:



(式中、式IIIおよびIVのR1およびR2はそれぞれ独立してH、



又はニトロキシドでありうる。ニトロキシドは:



でありうる。R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)の構造を有する化合物を提供する。

0011

第4の実施形態では、本発明は、式V:



(式中、R1は、



でありうる。R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。)の構造を有する化合物を提供する。

0012

第5の実施形態では、本発明は、式VI:



(式中、R1は、



でありうる。R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。)の構造を有する化合物を提供する。

0013

第6の実施形態では、本発明は、式I:
X-(Y)n (I)
(式中、式IのXは、アミロイドβ結合性化合物であり、式IのYはニトロキシドであり、下付き文字nは1〜3の整数でありうる)の化合物を含む、アミロイドを画像化するための診断用組成物を提供する。

0014

第7の実施形態では、本発明は、疾患を治療するための方法であって、式(II)〜(VI)のいずれかの化合物の治療的有効量を、かかる疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

図面の簡単な説明

0015

図1は、ニトロキシドスピン標識化合物SL-Res1の合成のためのスキームを示す。

0016

図2は、ニトロキシドスピン標識化合物SL-Res2の合成のためのスキームを示す。

0017

図3は、ニトロキシドスピン標識化合物SL-Res3の合成のためのスキームを示す。

0018

図4は、ニトロキシドスピン標識化合物SL-LRL1およびSL-LRL2の合成のためのスキームを示す。

0019

図5は、(脳内に高いアミロイドβレベルを生じさせる)5xFADアルツハイマーマウスモデルからのマウス脳標本の各磁気共鳴画像法においてHO-4160ニトロキシドスピン標識フッ素(SLF)によって作り出されるネガティブコントラストを示す(Oakley et al. (2006) J. Neuorsci. 26:10129)。3つの独立した実験を、5xFADおよび野性型(WT)マウスからの標本に対して実施した(A、B、C)。各列に関するサンプル起源および処理条件を、図面の見出しに示す。各列は、T2(上のパネル)またはT2*(下のパネル)強調下で最も強い切片画像を生じた位置から選択されたのと同じ座標からの画像を示す独立した実験を表す。各ボックスの下の数字は、気泡または解剖学的アーティファクトが存在しない脳領域強度値(×105)を表す。各実験では、2つの5xFAD画像は、同じ動物からの異なった切片である。

0020

図6は、SLF投与後のAPP-PS1マウス脳標本に関する核磁気共鳴画像を示す。APP-PS1マウス状断半球脳切片のT2*強調画像は、左側のパネルに示した無SLF標本に対して、右側のパネルに示したSLF標識標本における強度の著しい喪失を示す。

0021

図7は、ビヒクルで治療された5xFADまたはSLFで治療されたWTのいずれかの対照と比較して、5xFADマウス切片におけるSLFによるシグナル抑制の規模を示す。エラーバーは、3つの異なった実験からの値の間の標準誤差を表す。

0022

図8は、SLF投与後の5xFADマウス脳標本に関する電子常磁性共鳴(EPR)検査法の結果を示す。ABへのSLFの特異的結合は、5xFAD SLF+マウス冠状断脳切片からの固定されたニトロキシドスペクトルの存在によって示される。5xFAD SLFサンプルおよびWT SLF+サンプルにおいてシグナルが欠如する。

0023

図9は、5xFADSLF+(左のパネル)およびWT(右のパネル)マウス脳冠状断面におけるABペプチドに対する抗体の近赤外蛍光画像を示す。冠状断面は、海馬皮質を含む。ABのびまん性分布は、5xFADマウスモデルの表面の全体にわたって白いドットとして見られ、SLFで治療された5xFAD標本のT2*強調MRI画像中に作り出されるネガティブコントラストの比較的均一な分配相関している。斯かる特徴は、対照マウスにはなかった。下段のボックス内の拡大像は、選択領域のより詳細を明らかにする。

0024

図10は、約3mg/kgの濃度でのSLFの静脈内注射後の、5カ月齢の5xFADトランスジェニックマウス(左上)および野性型マウス(右下)からの、400μmの、T2*強調MR画像エクスビボにおける半冠状断脳切片を示す。5xFADサンプルは、野性型標本と比べて海馬領域における強度の著しい喪失を示す。各切片の写真を右側に示す。

0025

図11は、化合物を静脈内に注射した5xFADマウスの脳内のSLFの結合を、エクスビボにおける脳標本のEPR検査法によってどのように明らかにできるかを示す。5xFADマウスおよび野性型マウスから、注射の24時間後に採取した脳切片の100GのXバンドEPRスペクトルが示される。両方のマウスに、約3mg/kgのSLFが注射された。

0026

図12は、SL-LRL1で治療されたマウス脳標本のMRI画像およびEPRスペクトルを示す。

0027

図13は、SL-LRL2、SL-Res1、SL-Res2、およびSL-Res3で治療された5xFADおよびWTマウス脳標本のMRI画像を示す。

0028

図14は、ThT単独、オリゴマーABと組み合わせたもの、またはRES/LRL化合物と組み合わたもの蛍光発光を示す。AB単独と比較して、(478nmでの発光によって示される)ThT結合は、RES1-3およびLRL1-2によって減少する。

0029

図15Aおよび図15Bは、スピン捕獲によるLRL1-2およびRES1-3の酸化防止剤活性を示す。図15Aは、ヒドロキシルラジカルを伴ったBMPO付加物のEPR検出を示す(Eur J Med Chem, 2014, 77, 343-50)。黒色トレースは、添加されたROSスカベンジャー不存在下でのBMPO-OHのスペクトルを示す。赤色のトレースは、LRL1サンプルに関するBMPO-OH+ニトロキシドの複合EPRスペクトルを示す。BMPO-OHシグナルの低減は、ROS捕捉と相関する。捕捉活性は、無添加BMPO-OHシグナル(黒色の矢印)と比較した、第二BMPO-OH系列(赤色の矢印)の振幅の減少として計測された。相対活性を、図15Bにプロットする。

0030

I.全体的な説明
本発明は、ニトロキシドスピン標識されたアミロイドβ結合性化合物を対象に投与し、アミロイドに結合した化合物を検出することによりアミロイドを画像化する方法を提供する。また、本発明は、アミロイドに結合することが可能なニトロキシドスピン標識された化合物も提供する。

0031

II.定義
明細書中に使用される省略形は、化学および生物学の分野におけるそれらの従来の意味を有する。

0032

「画像化」とは、例えば本発明の化合物などの造影剤の位置を決定するために対象の外側でデバイスを使用することを指す。画像手段の例としては、これだけに限定されるものではないが、陽電子放射断層撮影(PET)、核磁気共鳴画像法(MRI)、電子常磁性共鳴(EPR)、電子スピン共鳴顕微鏡法(ESRM)、超音波、単光子放射コンピューター断層撮影(SPECT)、およびX線コンピューター断層撮影(CT)が挙げられる。

0033

「アミロイド」とは、タンパク質の凝集体を指す。アミロイドのタンパク質は、それらの異常に折り畳まれた形状が凝集を促進するように異常に折り畳まれ得る。該アミロイドは、例えばアミロイドβ(AB)、アミリン、α-シヌクレインハンチンチンカルシトニン心房性利尿ペプチドアポリポタンパク質A1、血清アミロイドA、メディン(medin)、プロラクチントランスチレチンリゾチーム、β-2-ミクログロブリンゲルゾリンケラエピセリンシスタチン、または免疫グロブリン軽鎖ALなどのタンパク質を含み得る。対象内のアミロイドは、オリゴマー、プラーク、または原繊維の形態で存在し得る。対象におけるアミロイドの存在は、対象内の組織および臓器の健常な生理機能を妨げる可能性がある。対象におけるアミロイドの存在は、疾患のリスク増大または発症に関連する可能性がある。アミロイドの存在が関連する疾患は、例えば、アルツハイマー病、糖尿病パーキンソン病海綿状脳症ハンチントン病甲状腺癌心房アミロイドーシスアテローム性動脈硬化関節炎、プロラクチン産生下垂体腺腫多発性神経障害角膜ジストロフィー、または脳アミロイド血管症であり得る。対象におけるアミロイドの存在は、アルツハイマー病のリスク増大または発症に関連する可能性がある。

0034

「投与」とは、対象への、経口投与や、坐剤局所接触、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内鼻腔内または皮下投与としての投与や、くも膜下腔内投与や、あるいは遅効性デバイス、例えばミニ浸透ポンプ移植を指す。

0035

「対象」とは、これだけに限定されるものではないが、例えば、長動物(例えば、ヒト)、ウシヒツジヤギウマイヌネコウサギラット、マウスなどを含めた哺乳動物などの動物を指す。特定の実施形態において、対象はヒトである。

0036

「ニトロキシド」とは、窒素原子酸素原子単結合している構造R2N-O・を有する安定したアミノキシルラジカル化合物または基を指す。ニトロキシドのR基は、同じであっても、または異なっていてもよい。R基は、縮合環を形成してもよい。

0037

アルキル」とは、示される数の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状の飽和脂肪族ラジカルのことを指す。アルキルは、任意の数の炭素(例えば、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6およびC5-6)を含み得る。例えば、C1-6アルキルとしては、メチルエチルプロピルイソプロピルブチルイソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチルヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルとは、最大20個の炭素原子を有するアルキル基(例えば、ヘプチルオクチル、ノニルデシルなどであるがこれらに限定されない)のことも指し得る。該アルキル基は、置換されていても、または非置換であってもよい。

0038

アルコキシ」とは、アルキル基を結合点に連結する酸素原子を有するアルキル基:アルキル-O-のことを指す。アルキル基と同様に、アルコキシ基は、C1-6などの任意の好適な数の炭素原子を有し得る。アルコキシ基は、例えば、メトキシエトキシプロポキシ、iso-プロポキシ、ブトキシ、2-ブトキシ、iso-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシヘキソキシなどを含む。該アルコキシ基は、置換されていても、または非置換であってもよい。

0039

ハロアルコキシ」とは、水素原子のいくつかまたはすべてがハロゲン原子で置換されているアルコキシ基のことを指す。アルキル基と同様に、ハロアルコキシ基は、C1-6などの任意の好適な数の炭素原子を有し得る。アルコキシ基は、1、2、3個またはそれ以上のハロゲンで置換され得る。すべての水素が、ハロゲン、例えば、フッ素で置き換えられるとき、その化合物は、全置換、例えば、全フッ素置換される。ハロアルコキシとしては、トリフルオロメトキシ、2,2,2-トリフルオロエトキシペルフルオロエトキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。

0040

「塩」とは、本発明の方法において使用される化合物の酸塩または塩基塩のことを指す。薬学的に許容され得る塩の例証的な例は、鉱酸(塩酸臭化水素酸リン酸など)の塩、有機酸(酢酸プロピオン酸グルタミン酸クエン酸など)の塩、四級アンモニウム(ヨウ化メチルヨウ化エチルなど)の塩である。薬学的に許容され得る塩は無毒性であると理解される。好適な薬学的に許容され得る塩に関するさらなる情報は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985(参照により本明細書中に援用される)に見られる。

0041

本発明の酸性化合物医薬的に許容され得る塩は、塩基を用いて形成される塩、すなわち、例えばアルカリおよびアルカリ土類金属塩などカチオン塩、例えばナトリウムリチウムカリウムカルシウムマグネシウムなど、ならびに、例えばアンモニウムトリメチル-アンモニウム、ジエチルアンモニウム、およびtris-(ヒドロキシメチル)-メチル-アンモニウム塩などのアンモニウム塩である。

0042

同様に、例えば、鉱酸、有機カルボン酸および有機硫酸、例えば塩酸、メタンスルホン酸マレイン酸などの酸付加塩もまた、提供された塩基性基、例えばピリジルなどが、構造の一部を構成することを可能にする。

0043

化合物の中性形態は、従来の様式でその塩塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を単離することによって再生され得る。化合物の親の形態は、特定の物理的特性(例えば、極性溶媒への溶解性)が様々な塩形態で異なるが、それ以外は、かかる塩は本発明の目的の化合物の親の形態と等価である。

0044

本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子(光学中心)または二重結合を保有する;ラセミ体ジアステレオマー幾何異性体、および個々の異性体が、本発明の範囲内に包含されることを専ら意図する。

0045

水和物」とは、少なくとも1つの水分子錯体化された化合物のことを指す。本発明の化合物は、1〜10個の水分子と錯体化され得る。

0046

ナノ粒子」とは、典型的に5〜500個の原子から成る形が定まった粒子を指す。本発明のナノ粒子の典型的な寸法は、数ナノメートルの規模であり、数十ナノメートルであってもよい。本発明のナノ粒子は、典型的に100ナノメートル未満の寸法を有する。

0047

本明細書中で使用される「組成物」とは、指定された量で指定された構成要素を含む生成物、ならびに指定された量での指定された構成要素の組み合わせから、直接的または間接的に、生じる任意の生成物を包含することを意図する。「医薬的に許容され得る」により、それが、担体希釈剤または賦形剤が、製剤の他の構成要素およびその受容個体に対する有害性適合できなければならないことを意味する。

0048

「医薬的に許容される賦形剤」とは、対象への活性物質の投与および対象による吸収を助ける物質を指す。本発明に有用な医薬賦形剤としては、これだけに限定されるものではないが、結合剤増量剤崩壊剤潤滑剤、コーティング剤甘味料香料、および着色料が挙げられる。当業者は、他の医薬賦形剤が本発明で有用であることを認識するであろう。

0049

「治療的有効量または用量」、「治療的十分量または用量」または「有効もしくは十分量または用量」とは、それが投与された対象に治療効果を生じさせる用量を指す。適確な用量は、治療目的に依存し、かつ、既知の技術を使用して当業者によって確認されるであろう(例えばLieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1 3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999);およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照のこと)。感作細胞では、治療的有効量は、非感作細胞の従来の治療的有効量より少なくてもよいことが多い。

0050

「治療する(Treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」とは、例えば、任意の客観的または主観パラメーター(例えば、軽減;緩解;症状を減少させること、または症状、損傷、病態もしくは体調を患者にとって容認できるものにすること;症状または条件の頻度または持続性を低減すること;あるいは、状況によっては、症状の発症を予防すること)を含めた、損傷、病態、体調、または症状(例えば、疼痛)の治療または回復の任意の成功徴候のことを指す。症状の治療または回復は、例えば、理学的検査の結果を含めた、任意の客観的または主観的パラメーターに基づき得る。

0051

III.アミロイドを画像化する方法
本発明は、アミロイドを画像化するいくつかの方法を提供する。この方法は、構造:
X-(Y)n (I)
(式中、式IのXは、アミロイドβ結合性化合物であり、式IのYはニトロキシドであり、下付き文字nは1〜3の整数である)を有する化合物の有効量を、該化合物がアミロイドに結合するように対象に投与することを含む。投与は、該化合物がアミロイドに結合するように行う。この方法は、アミロイドに結合した化合物を検出し、それによってアミロイドを画像化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、式Iのnは1である。いくつかの実施形態では、nは2である。いくつかの実施形態では、nは3である。

0052

アミロイドに結合した化合物の検出は、前記化合物の対象への投与に続き、少なくとも10分、少なくとも20分、少なくとも30分、少なくとも40分、少なくとも50分、少なくとも60分、少なくとも70分、少なくとも80分、少なくとも90分、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、又は少なくとも10時間行うことができる。いくつかの実施形態では、検出は、前記投与に続き少なくとも60分行う。

0053

検出は、1つまたは複数の医療画像技術の使用を含む。いくつかの実施形態では、検出は、核磁気共鳴画像法(MRI)、電子常磁性共鳴の画像化又は分光法(EPR、電子スピン共鳴(ESR)としても知られる)、陽電子放射断層撮影(PET)、又は電子スピン共鳴顕微鏡法(ESRM)を含む。いくつかの実施形態では、検出は、MRIを含む。いくつかの実施形態では、検出は、MRIとPETの両方を含む。

0054

EPRは、外部磁場中に置かれたときに不対電子によってもたらされるスピンに基づく磁気共鳴技術である。このスピンは、外部磁場に反対するか、またはそれと整列するかのいずれかに指向し得る。不対電子は、不対電子エネルギー準位相違に相当するエネルギー量を有する光子に対応するエネルギー準位間で推移し得る。不対電子を有する材料によってこの方法で吸収されるエネルギーを定量することによって、その材料のEPRスペクトルを得ることができる。いくつかの天然材料しか不対電子を有していないので、EPRは、例えばニトロキシドなどの安定したラジカルの、これらの天然材料との相互作用を試験するために最も一般的に使用され、そして、天然材料自体を画像化しない。

0055

MRIは、外部磁場中に置かれたときに核内陽子によってもたらされるスピンに基づく代替の磁気共鳴法である。MRIに使用される磁場は、一般的に磁場勾配の形態である。この磁場勾配は、共振周波数が磁場と正比例している共振周波数勾配をもたらす。様々な共振周波数にてエネルギー吸収強度をマッピングすることによって、次に、材料中の陽子の数および位置が共に決定され得る。多くの天然材料が、このように画像化され得る。例えば、軟組織中に存在する水の量および位置は、水の陽子に関連した磁気共鳴を探測することによって検出され得る。このように、MRIは、対象に投与されたニトロキシドスピン標識化合物などの化合物だけではなく、そのプローブに近接している対象の解剖学的特徴も画像化するのに使用できる。

0056

PETは、対象の代謝過程を観察するために使用される放射線検出技術である。この技術では、投与された放射性トレーサー化合物から放射された陽電子が、電子と相互作用し、そして、ほぼ反対方向に進むγ線対を生じる。これらのγ線は、対象の周囲に位置する走査デバイスシンチレーターによって検出される。次に、これらの検出事象に関連するデータが、トレーサー化合物濃縮されている組織の位置のマップまたは画像を構成するのに使用される。

0057

いくつかの実施形態において、検出および画像化は、T1強調MRIを用いて行われる。いくつかの実施形態において、検出および画像化は、T2*強調MRIを用いて行われる。該T2*強調MRIは、いくつかの状況においてニトロキシドスピン標識化合物に関してより高い画像化コントラストを提供し得る。

0058

いくつかの実施形態では、アミロイドは、アミロイド凝集体を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドは、アミロイドβを含む。アミロイドは、可溶性アミロイドもしくはアミロイドβオリゴマー、又は不溶性プラークもしくは原繊維の形態でありうる。アミロイドは、対象の脳内に存在することがある。いくつかの実施形態では、対象は、アルツハイマー病のリスクがある、または現在アルツハイマー病を有していると診断されている。いくつかの実施形態では、対象は、治療目的で化合物を受けていない。いくつかの実施形態では、化合物は、無傷(intact)の血液脳関門を貫通して脳のアミロイドβ凝集体に結合する。

0059

アミロイドβ結合性化合物は、十分な特異性と親和性をもってアミロイドβを標的とする任意の化合物であってよい。いくつかの実施形態では、式Iのアミロイドβ結合性化合物は、



(式中、
RaおよびRbはそれぞれ独立してH又はC1-4アルキルでありえて; ZはI、123I、125I、131I、Br、76Br、77Br、F、18F、又は-O-トシルでありえて;かつ、qは2〜5の整数でありうる)でありうる。

0060

いくつかの実施形態では、アミロイドβ結合性化合物は、



でありうる。

0061

いくつかの実施形態では、式Iのニトロキシドは、



でありうる。

0062

いくつかの実施形態では、ニトロキシドは、



でありうる。

0063

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



(式中、RaおよびRbはそれぞれ独立してH又は-4アルキルでありうる。R1は、



でありうる。
R2は、OH、アルキル、アルコキシ、又はハロアルコキシでありうる。いくつかの実施形態では、R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3F)でありうる)でありうる。

0064

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



(式中、R1は、



でありうる。
R2は、OH、アルキル、アルコキシ、又はハロアルコキシでありうる。いくつかの実施形態では、R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。)でありうる。

0065

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、構造:



(式中、R1は、メチル又はニトロキシドである。R1のニトロキシドは、

0066

R2は、プロピルアミンorニトロキシドでありうる。R2のニトロキシドは、



でありうる。
ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)を有する。

0067

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



(式中、R1、R2、およびR3は、それぞれ独立して



でありうる)でありうる。

0068

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



(式中、R1およびR2は、それぞれ独立してH又はニトロキシドでありうる。ニトロキシドは、



でありうる。
ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)でありうる。

0069

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



(式中、R1およびR2は、それぞれ独立してH又はニトロキシドでありうる。ニトロキシドは、



でありうる。
ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)である。

0070

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



(式中、R1はHであり、R2はニトロキシドである。R2のニトロキシドは、



でありうる。)でありうる。

0071

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



(式中、R1およびR2は、それぞれ独立してH、



ニトロキシドでありうる。ニトロキシドは、



でありうる。
ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)でありうる。

0072

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



(式中、Rは、



でありうる)でありうる。

0073

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、構造:



を有する。

0074

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



でありうる。

0075

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、



でありうる。

0076

いくつかの実施形態では、式Iの化合物は細胞外のアミロイドに結合する。いくつかの実施形態では、この化合物は、ニューロン内のアミロイドに結合する。式Iの化合物は、化学的還元耐性があるように設計され得る。例えば、化合物のニトロキシド基は、テトラメチル置換の代わりにテトラエチル環置換を含むことがある。テトラエチル置換は、ニトロキシド基のN-O部分が化合物を投与した後に細胞内還元剤と反応する速度を低下させる可能性がある。

0077

IV.化合物
いくつかの実施形態では、本発明は、いくつかのニトロキシドスピン標識アミロイド結合性化合物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、構造:



(式中、
式IIのR1およびR2はそれぞれ独立してH又はニトロキシドでありうる。ニトロキシドは:



でありうる。R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)を有する化合物を提供する。

0078

いくつかの実施形態では、式IIのR1およびR2は、それぞれ独立してニトロキシドである。いくつかの実施形態では、R1はHであり、R2はニトロキシドである。いくつかの実施形態では、R1はニトロキシドであり、R2はHである。

0079

いくつかの実施形態では、式IIのR1およびR2は、それぞれ独立してH又はニトロキシドでありうる。ニトロキシドは、



でありうる。

0080

いくつかの実施形態では、式IIの化合物は、



でありうる。

0081

いくつかの実施形態では、式IIの化合物は、



でありうる。

0082

いくつかの実施形態では、式IIの化合物は、



でありうる。

0083

いくつかの実施形態では、式IIの化合物は、



でありうる。

0084

いくつかの実施形態では、本発明は、構造:



(式中、式IIIおよびIVのR1およびR2は、それぞれ独立してH、



ニトロキシドでありうる。ニトロキシドは、



でありうる。
ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。)を有する化合物を提供する。

0085

いくつかの実施形態では、式IIIおよびIVのR1およびR2は、それぞれ独立してニトロキシドである。いくつかの実施形態では、R1はH、



であり、R2はニトロキシドである。いくつかの実施形態では、R1はニトロキシドであり、R2はH、



である。

0086

いくつかの実施形態では、式IIIおよびIVのR1およびR2は、それぞれ独立してH、



ニトロキシドでありうる。ニトロキシドは、



でありうる。
ここで、R1およびR2のうち少なくとも一方は、ニトロキシドである。

0087

いくつかの実施形態では、式IVの化合物は、



でありうる。

0088

いくつかの実施形態では、式IVの化合物は、



でありうる。

0089

いくつかの実施形態では、式IVの化合物は、



でありうる。

0090

いくつかの実施形態では、本発明は、構造:



(式中、R1は、



でありうる。
R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。)を有する化合物を提供する。

0091

いくつかの実施形態では、本発明は、構造:



(式中、R1は、



でありうる。
R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。 別の実施形態では、R2は、OH、Me、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。)を有する化合物を提供する。

0092

いくつかの実施形態では、本発明は、構造:



(式中、R1は、



でありうる。
R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。別の実施形態では、R2は、OH、Me、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。)を有する化合物を提供する。

0093

いくつかの実施形態では、本発明は、構造:



(式中、R1は、



でありうる。
RaおよびRbはそれぞれ独立してHおよびC1-4アルキルでありうる。)を有する化合物を提供する。

0094

いくつかの実施形態では、本発明は、構造:



(式中、R1は、



でありうる。
R2は、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。別の実施形態では、R2は、OH、Me、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、又は(OCH2CH2)3Fでありうる。)を有する化合物を提供する。

0095

いくつかの実施形態では、当該化合物は、



でありうる。

0096

いくつかの実施形態では、当該化合物は、



でありうる。

0097

本発明の化合物は、上記化合物の塩および異性体でもあり得る。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、それらの塩の形態を含む。適用可能な塩の形態の例としては、塩酸塩臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩硝酸塩マレイン酸塩酢酸塩クエン酸塩フマル酸塩酒石酸塩(例えば、(+)-酒石酸塩、(-)-酒石酸塩、またはラセミ混合物を含むそれらの混合物)、コハク酸塩安息香酸塩、およびグルタミン酸などのアミノ酸との塩が挙げられる。これらの塩は、当業者に公知の方法によって調製され得る。本発明の化合物が、比較的塩基性官能基を含むとき、そのような化合物の中性の形態を十分量の所望の酸と、そのままでまたは好適な不活性な溶媒中で接触させることによって、酸付加塩を得ることができる。適用可能な酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸炭酸モノヒドロゲン炭酸、リン酸、モノヒドロゲンリン酸、ジヒドロゲンリン酸、硫酸、モノヒドロゲン硫酸、ヨウ化水素酸または亜リン酸などのような無機酸から得られる塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸安息香酸コハク酸スベリン酸フマル酸乳酸マンデル酸フタル酸ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような有機酸から得られる塩が挙げられる。アルギン酸塩などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる(例えば、Berge et al., “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照のこと)。本発明のある特定の化合物は、その化合物を塩基付加塩に変換させる基本的な酸性官能基を含む。好適な医薬的に許容され得る塩に関するさらなる情報は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985(参照により本明細書中に援用される)に見られる。

0098

本化合物の中性の形態は、好ましくは、従来の様式でその塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を単離することによって再生される。本化合物の親の形態は、特定の物理的特性(例えば、極性溶媒への溶解性)が様々な塩形態で異なる。

0099

本発明のある特定の化合物は、非溶媒和の形態、ならびに水和の形態を含む溶媒和の形態で存在し得る。通常、溶媒和の形態は、非溶媒和の形態と等価であり、本発明の範囲内に包含される。本発明のある特定の化合物は、いくつもの結晶性または非晶質の形態で存在し得る。通常、すべての物理的形態が、本発明によって企図される用途に対して等価であり、本発明の範囲内であると意図される。

0100

本発明のある特定の化合物は、不斉炭素原子(光学中心)または二重結合を有する;エナンチオマー、ラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、立体異性体((R)-もしくは(S)-またはアミノ酸の場合(D)-もしくは(L)-として絶対立体化学に関して定義され得る)および個々の異性体が、本発明の範囲内に包含される。本発明の化合物は、不安定すぎて合成できないおよび/または単離できないと当該分野で公知の化合物を含まない。本発明は、ラセミ形態および光学的に純粋な形態の化合物を含むと意図される。光学活性な(R)-および(S)-異性体または(D)-および(L)-異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を使用して調製され得るか、または従来の手法を用いて分割され得る。

0101

異性体は、同じ数および種類の原子を有するがゆえに同じ分子量を有するが、原子の構造上の配列または配置が異なる化合物を含む。

0102

本発明のある特定の化合物が、互変異性体で存在し得ることは、当業者にとって明らかだろう(それらの化合物のそのような互変異性体のすべてが、本発明の範囲内である)。互変異性体とは、平衡状態で存在し、一方の異性体からもう一方の異性体に容易に変換される、2つ以上の構造異性体のうちの1つのことを指す。

0103

別段述べられない限り、本明細書中に表される構造は、その構造のすべての立体化学的形態;すなわち、各不斉中心に対するRおよびS配置を含むとも意味される。ゆえに、単一の立体化学異性体、ならびに本化合物の鏡像異性およびジアステレオ異性の混合物は、本発明の範囲内である。

0104

別段述べられない限り、本発明の化合物は、そのような化合物を構成する原子の1つ以上において非天然比率同位体原子も含み得る。例えば、本発明の化合物は、放射性同位体、例えば、ジュウテリウム(2H)、トリチウム(3H)、ヨウ素-125(125I)、炭素-13(13C)または炭素-14(14C)で放射標識され得る。放射性であるか否かに関係なく、本発明の化合物の同位体的バリエーションのすべてが、本発明の範囲内に包含される。

0105

塩の形態に加えて、本発明は、プロドラッグの形態の化合物を提供する。本明細書中に記載される化合物のプロドラッグは、生理学的条件下において容易に化学変化を起こして、本発明の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、エキソビボ環境において化学的または生化学的な方法によって本発明の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、好適な酵素または化学的試薬とともに経皮パッチレザバーに配置されたとき、本発明の化合物にゆっくり変換され得る。

0106

本発明の化合物は、当業者に公知の種々の方法(Comprehensive Organic Transformations Richard C. Larock, 1989を参照のこと)または一般に周知の合成方法の適切な組み合わせによって合成され得る。本発明の化合物を合成する際の有用な手法は、直ちに明らかになり、かつ関連する分野の当業者が利用しやすいものである。下記の記述は、本発明の化合物を構築する際に使用するために利用可能な、多種多様な方法のある特定の方法を例証するために提供される。しかしながら、その記述は、本発明の化合物を調製する際に有用な反応または反応順序の範囲を定義することを目的としていない。当業者は、それらの化合物を生成する他の方法も本発明において有用であることを認識するだろう。記載したいくつかの化合物が、相対立体化学を示しているが、それらの化合物は、ラセミ混合物またはいずれかのエナンチオマーとして存在してもよい。

0107

通例、本願発明のいくつかの化合物は、スピン標識ニトロキシド化合物を用いたアミロイドβ結合性化合物のアルキル化によって合成され得る。該アルキル化は、例えば、市販の3-ブロモメチル-2,5-ジヒドロ-2,2,5,5-テトラメチル-1H-ピロール-1-イルオキシ(RBr)を用いてもよい。該アルキル化は、塩基の存在下でのN-アルキル化であってもよい。いくつかの実施形態において、該塩基は、トリエチルアミン(TEA)である。該アルキル化は、還元剤の存在下での還元的アルキル化であってもよい。いくつかの実施形態において、該還元剤は、ナトリウムトリアトボヒドリドである。

0108

V.投与
本発明は、アミロイドを画像化するための診断用組成物を提供する。該組成物は、
X-(Y)n (I)
(式中、
Xは、アミロイドβ結合性化合物であり、Yはニトロキシドであり、かつ、nは1〜3の整数である)
の構造を有する化合物を含有する。本発明の化合物および組成物は、経口、非経口および局所的方法を含む任意の好適な手段によって送達され得る。局所的経路による経皮的投与方法は、アプリケータースティック溶液、懸濁液、エマルジョンゲルクリーム軟膏ペーストゼリーペイントパウダーおよびエアロゾルとして製剤化され得る。

0109

医薬品は、好ましくは、単位剤形で存在する。そのような形態において、調製物は、適切な量の本発明の化合物および組成物を含む単位用量に細分される。単位剤形は、包装された調製物であり得、その包装は、別々の量の調製物を含む(例えば、パック詰めされた錠剤カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル内の散剤)。また、単位剤形は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤もしくは舐剤自体であり得るか、または包装された形態の適切な数のこれらのいずれかであり得る。

0110

本発明の化合物および組成物は、他の作用物質と同時投与され得る。同時投与には、他の作用物質の0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20または24時間以内の本発明の化合物または組成物の投与が含まれる。同時投与には、同時、ほぼ同時(例えば、互いに約1、5、10、15、20または30分以内)または任意の順序での順次の投与も含まれる。さらに、本発明の化合物および組成物は各々、1日あたり好ましい投与量レベルを提供するために、1日に1回、または1日あたり2回、3回もしくはそれ以上の回数で投与され得る。

0111

いくつかの実施形態において、同時投与は、共製剤化、すなわち、本発明の化合物および組成物ならびに他の任意の作用物質を含む単一の医薬的組成物を調製することによって、達成され得る。あるいは、様々な成分が、別々に製剤化され得る。

0112

本発明の化合物および組成物ならびに他の任意の作用物質は、任意の好適な量で存在し得、被験体の体重および年齢、対象の疾患状態などを含むがこれらに限定されない様々な因子に依存し得る。好適な投与量の範囲は、約0.1mg〜約10,000mgまたは約1mg〜約1000mgまたは約10mg〜約750mgまたは約25mg〜約500mgまたは約50mg〜約250mgを含む。好適な投与量は、約1mg、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000mgも含む。

0113

本発明の化合物は、任意の好適な頻度、間隔、および継続期間にて投与され得る。例えば、本発明の化合物は、好ましい投与量レベルを提供するために、1、2、3時間に1回または1時間に複数回、1日、2日、3日に1回または1日に複数回、あるいは、2日、3日、4日、5日、6日、または7日毎に1回投与され得る。本発明の化合物は、1日に複数回投与されるとき、代表的な間隔としては、5、10、15、20、30、45および60分間、ならびに1、2、4、6、8、10、12、16、20、および24時間が挙げられる。本発明の化合物は、1時間、1〜6時間、1〜12時間、1〜24時間、6〜12時間、12〜24時間、1日、1〜7日間、1週間、1〜4週間、1カ月、1〜12カ月、1年間以上、または無期限に、1回、2回、または3回以上投与され得る。

0114

VI.製剤
本発明の組成物は、多種多様の経口、非経口および局所的剤形で調製され得る。経口調製物としては、患者による経口摂取に適した、錠剤、丸剤、散剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、舐剤、カシェ剤、ゲル、シロップ剤スラリー、懸濁液などが挙げられる。本発明の組成物はまた、注射によって、すなわち、静脈内に、筋肉内に、皮内に、皮下に、十二指腸内に、腹腔内に、脳内に、くも膜下腔内に、脊髄内に、または動脈内に、投与され得る。また、本明細書中に記載される組成物は、吸入によって、例えば、鼻腔内に投与され得る。さらに、本発明の組成物は、経皮的に投与され得る。本発明の組成物は、眼内経路、内経路および直腸内経路(坐剤を含む)、ガス注入、散剤およびエアロゾル製剤によっても投与され得る(例えば、ステロイド吸入剤について、Rohatagi 1995 J. Clin. Pharmacol. 35:1187 and Tjwa 1995 Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107を参照のこと)。したがって、本発明は、医薬的に許容され得るキャリアまたは賦形剤および本発明の化合物を含む医薬的組成物も提供する。

0115

本発明の化合物から医薬的組成物を調製するために、医薬的に許容され得るキャリアは、固体または液体であり得る。固体の形態の調製物としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤および分散性顆粒剤が挙げられる。固体のキャリアは、希釈剤、香味料、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤または封入材料として作用し得る1つ以上の物質であり得る。製剤化および投与のための手法に関する詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA ("Remington's")の最新版を参照のこと。

0116

散剤において、キャリアは、微粉化された固体であり、それは、微粉化された活性な成分とともに混合物中に存在する。錠剤において、活性な成分は、必要な結合特性を有するキャリアと好適な比率で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。その散剤および錠剤は、好ましくは、5%または10%〜70%の本発明の化合物を含む。

0117

好適な固体の賦形剤としては、炭酸マグネシウムステアリン酸マグネシウムタルクペクチンデキストリンデンプントラガント低融点ろうカカオバター炭水化物;糖(ラクトーススクロースマンニトールまたはソルビトールトウモロコシコムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプンを含むがこれらに限定されない);セルロース(例えば、メチルセルロースヒドロキシプロピルメチル-セルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム);およびゴム(アラビアおよびトラガントを含む);ならびにタンパク質(ゼラチンおよびコラーゲンを含むがこれらに限定されない)が挙げられるが、これらに限定されない。所望であれば、崩壊剤または可溶化剤(例えば、架橋ポリビニルピロリドン寒天アルギン酸またはその塩(例えば、アルギン酸ナトリウム))を加えてもよい。

0118

糖衣錠コアには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドンカーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび/もしくは二酸化チタンラッカー溶液ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物も含み得る好適なコーティング剤(例えば、濃縮された糖の溶液)が提供される。生成物の識別のため、または活性な化合物の量(すなわち、投与量)を特徴付けるために、染料または色素が、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられてもよい。本発明の医薬品はまた、例えば、ゼラチンからできた押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよびコーティング剤(例えば、グリセロールまたはソルビトール)からできた密封された軟カプセルを使用して、経口的に使用され得る。押し込み型カプセルは、充填剤または結合剤(例えば、ラクトースまたはデンプン)、潤滑剤(例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム)および必要に応じて安定剤と混合される本発明の化合物を含み得る。軟カプセルでは、本発明の化合物は、安定剤を含むまたは含まない好適な液体(例えば、脂肪油流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール)に溶解または懸濁され得る。

0119

坐剤を調製するために、脂肪酸グリセリドの混合物またはカカオバターなどの低融点ろうをまず融解し、本発明の化合物を、撹拌することによってその中に均一に分散させる。次いで、融解した均一な混合物を都合のよいサイズのモールドに注ぎ込み、冷却し、それにより、凝固させる。

0120

液体の形態の調製物としては、溶液、懸濁液およびエマルジョン、例えば、水または水/プロピレングリコール溶液が挙げられる。非経口の注射のために、液体の調製物は、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液として製剤化され得る。

0121

経口使用に適した水溶液は、本発明の化合物を水に溶解し、所望のとおり、好適な着色剤、香料、安定剤および増粘剤を加えることによって、調製され得る。経口使用に適した水性懸濁液は、微粉化された活性な成分を、粘稠性の材料(例えば、天然ゴムまたは合成ゴム樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム)および分散剤または湿潤剤(例えば、天然に存在するホスファチド(例えば、レシチン)、アルキレンオキシド脂肪酸との縮合物(例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン)、エチレンオキシド長鎖脂肪族アルコールとの縮合物(例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール)、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合物(例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノ-オレエート)またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合物(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノ-オレエート)とともに水に分散することによって、生成され得る。その水性懸濁液は、1つ以上の保存剤(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エチルまたはp-ヒドロキシ安息香酸n-プロピル)、1つ以上の着色剤、1つ以上の香味料および1つ以上の甘味剤(例えば、スクロース、アスパルテームまたはサッカリン)も含み得る。製剤は、オスモル濃度について調整され得る。

0122

使用する直前に、経口投与用の液体の形態の調製物に変換されることが意図された固体の形態の調製物も含められる。そのような液体の形態としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。これらの調製物は、活性な成分に加えて、着色剤、香料、安定剤、緩衝剤人工および天然の甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含み得る。

0123

本発明の化合物を植物油(例えば、落花生油オリーブ油ゴマ油またはやし油)または鉱油(例えば、流動パラフィン);またはこれらの混合物に懸濁することによって、油性懸濁液が製剤化され得る。その油性懸濁液は、増粘剤(例えば、蜜ろう固形パラフィンまたはセチルアルコール)を含み得る。甘味剤(例えば、グリセロール、ソルビトールまたはスクロース)は、美味な経口調製物を提供するために加えられ得る。これらの製剤は、アスコルビン酸などの酸化防止剤を加えることによって、保存することができる。注射可能な油性ビヒクルの例として、Minto 1997 J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93を参照のこと。本発明の医薬的製剤は、水中油型エマルジョンの形態でもあり得る。油相は、上に記載された、植物油もしくは鉱油またはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤としては、天然に存在するゴム(例えば、アラビアゴムおよびトラガカントゴム)、天然に存在するホスファチド(例えば、ダイズレシチン)、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル(例えば、ソルビタンモノ-オレエート)およびこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノ-オレエート)が挙げられる。エマルジョンは、シロップ剤およびエリキシル剤の製剤におけるように、甘味剤および香味料も含み得る。そのような製剤は、粘滑剤、保存剤または着色剤も含み得る。

0124

本発明の組成物は、身体内での緩徐な放出のためにミクロスフェアとしても送達され得る。例えば、ミクロスフェアは、皮下にゆっくり放出する薬物含有ミクロスフェアの皮内注射を介した投与のために製剤化され得る(Rao 1995 J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623を参照のこと;生分解性で注射可能なゲル製剤として(例えば、Gao 1995 Pharm. Res. 12:857を参照のこと);または経口投与用のミクロスフェアとして(例えば、Eyles 1997 J. Pharm. Pharmacol. 49:669を参照のこと)。経皮的経路と皮内経路の両方が、数週間または数ヶ月間にわたって一定の送達をもたらす。

0125

別の実施形態において、本発明の組成物は、非経口投与(例えば、静脈内(IV)投与または体腔もしくは器官管腔への投与)のために製剤化され得る。投与用の製剤は、通常、医薬的に許容され得るキャリアに溶解された本発明の組成物の溶液を含む。使用することができる許容され得るビヒクルおよび溶媒は、水およびリンガー溶液等張性塩化ナトリウムである。さらに、滅菌された固定油が、慣習的に溶媒または懸濁媒として使用され得る。この目的のために、合成モノ-またはジグリセリドを含む任意の無刺激の固定油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射可能物の調製において同様に使用され得る。これらの溶液は、滅菌されており、通常、望ましくない物質を含まない。これらの製剤は、従来の周知の滅菌手法によって滅菌され得る。それらの製剤は、生理学的条件に近づけるために必要とされるような医薬的に許容され得る補助物質(例えば、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム塩化カルシウム乳酸ナトリウムなど)を含み得る。これらの製剤における本発明の組成物の濃度は、大きく変動し得、選択される特定の投与様式および患者のニーズに従って、主に、液量、粘度、体重などに基づいて選択され得る。IV投与の場合、その製剤は、滅菌された注射可能な調製物(例えば、滅菌された注射可能な水性または油性の懸濁液)であり得る。この懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌された注射可能な製剤は、無毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌された注射可能な溶液または懸濁液(例えば、1,3-ブタンジオールの溶液)でもあり得る。

0126

別の実施形態において、本発明の組成物の製剤は、リポソームを使用することによって送達され得、そのリポソームは、細胞膜と融合するか、またはエンドサイトーシスされ、すなわち、そのリポソームに付着されたリガンド、または細胞の表面膜タンパク質レセプターに結合するオリゴヌクレオチドに直接付着されたリガンドを使用することによって送達されて、エンドサイトーシスがもたらされる。特に、リポソーム表面が、標的細胞に特異的なリガンドを有するか、または別途、特定の器官に優先的に方向づけられている場合に、リポソームを使用することによって、インビボにおいて本発明の組成物を標的細胞に送達することに焦点を合わせることができる(例えば、Al-Muhammed 1996 J. Microencapsul. 13:293; Chonn 1995 Curr. Opin. Biotechnol. 6:698;およびOstro 1989 Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576を参照のこと)。

0127

脂質ベース薬物送達系には、脂質溶液脂質エマルジョン脂質分散液自己乳化薬物送達系(SEDDS)および自己微小乳化薬物送達系(SMEDDS)が含まれる。特に、SEDDSおよびSMEDDSは、自発的に水性媒質に分散し得、微細なエマルジョン(SEDDS)またはマイクロエマルジョン(SMEDDS)を形成し得る、脂質の等方性混合物、界面活性剤および共界面活性剤である。本発明の製剤化において有用な脂質としては、任意の天然または合成の脂質(ゴマ種子油、オリーブ油、ひまし油、落花生油、脂肪酸エステルグリセロールエステル、Labrafil(登録商標)、Labrasol(登録商標)、Cremophor(登録商標)、Solutol(登録商標)、Tween(登録商標)、Capryol(登録商標)、Capmul(登録商標)、Captex(登録商標)およびPeceol(登録商標)を含むがこれらに限定されない)が挙げられる。

0128

別の実施形態において、本発明の組成物の製剤は、ナノ粒子の使用によって送達され得る。例えば、スピン標識フルオロフォアの使用は、Li et al. (2012) ACS Nano. 6:9485に記載されている。ナノ粒子は、従来の抗癌剤を送達するための主要なクラスのビヒクルとして現れた。ナノ粒子薬物送達システムは、例えば制御放出および長い循環時間、ならびに受動的および能動的な腫瘍標的化などの異なったいくつかの利点を示した(Cabral et al. (2011) Nat. Nanotechnol. 6:815; Gref et al. (1994) Science 263:1600; Liu and Allen (2006) Curr. Pharm. 12:4685;およびLi et al. (2009) anotechnology 20:065104)。いくつかの実施形態において、ニトロキシドスピン標識化合物は、疎水性なので、容易にナノミセル内部に添加できた。該ナノミセルは、非架橋ミセルナノ粒子(NCMN)を含み得る。該ナノミセルは、ジスルフィド架橋ミセルナノ粒子(DCMN)を含み得る。いくつかの実施形態において、ナノ粒子の表面は、脳標的化分子の1若しくは複数のコピーが取り付けられている。該脳標的化分子は、例えば、アポリポタンパク質E(apoE)であってもよい。

0129

いくつかの実施形態において、本発明の組成物の製剤は、溶解性助剤を含む。該溶解性助剤は、例えば、シクロデキストリンであってもよい。高度な水不溶性ステロイドのための溶解性助剤としてのシクロデキストリンの使用は、米国特許出願公開公報第2015/0018327号および同第2015/0313915号で考察されている。該シクロデキストリンは、例えば、β-シクロデキストリンであってもよい。いくつかの実施形態において、該シクロデキストリンは、スルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンである。

0130

VII.障害を治療する方法
いくつかの実施形態において、本発明は、障害を処置する方法を提供し、その方法は、そのような処置を必要とする被験体に、治療有効量の本発明の化合物を投与し、それによって、その障害を処置する工程を含む。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、アルツハイマー病を治療するか、または回復するのに有用なニトロキシドスピン標識アミロイドβ結合性化合物である。該作用物質は、寿命延長することを目指して、または症状を低減することを目的として与えられてもよい。いくつかの実施形態において、有効量のニトロキシドスピン標識アミロイドβ結合性化合物を用いた治療は、アミロイドを形成するタンパク質の凝集を妨害する。いくつかの実施形態において、該妨害は、新しいオリゴマー、プラーク、または原繊維の形成を予防する。いくつかの実施形態において、該妨害は、既存のオリゴマー、プラーク、または原繊維の構造を変更する。

0131

本発明を使用のに好適な疾患または状態の例は、これだけに限定されるものではないが、アルツハイマー病、糖尿病、パーキンソン病、海綿状脳症、ハンチントン病、甲状腺癌、心房アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化、関節炎、プロラクチン産生下垂体腺腫、多発性神経障害、角膜ジストロフィー、または脳アミロイド血管症が挙げられる。

0132

VIII.実施例
以下の実施例の構造を、CambridgeSoft ChemDrawネーミングパッケージを使用した標準的なIUPAC命名法に従って命名する。

0133

実施例1.SL-Res1.(E)-3-(4-ヒドロキシスチリル)-5-((2,2,5,5-テトラメチル-1-オキシル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-3-イル-)メトキシ)フェノールラジカル

0134

0135

合成は図1に示したとおりであった。1.5mLのエッペンドルフチューブに、レスベラトール3,4’-ジアセタート(Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada、8.3mg、0.0266mmol)、3-ヒドロキシメチル-(1-オキシ-2,2,5,5-テトラメチルピロリン)(5mg、0.0294mmol)、トリフェニルホスフィン(PPh3、8.0mg、0.0305mmol)、および無水テトラヒドロフラン(THF、0.2mL)を加えた。次に、反応チューブを、42kHzの超音波処理バス(Cole-Parmer)に浸けて、2分間、超音波処理した。超音波処理している間、ジイソプロピルアゾジカルボン酸(DIAD、6.6μL、0.0335mmol)を、反応混合物に加えた。反応混合物を、25分間、超音波処理した。その反応混合物を、KOH溶液(20μL、10%の水溶液)に加え、次に、室温にて30分間撹拌した。その溶液を、アセトニトリル中の0.05%のトリフルオロ酢酸(TFA)で中和し、次に、精製のために調製用逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に供した。その溶出液回収し、凍結乾燥して、粉末SL-Res1を得た。

0136

HPLCを、C18カラム(Vydac、10μm、2.2cmの内径×25cm)を備えたSystem Gold 126NMP溶媒モジュール(Beckman)により実施した。46分間にわたる25-100%Bの勾配溶出を、5mL/分の流量で使用した(溶媒A、H2O/0.1%のTFA;B、アセトニトリル/0.1%のTFA)。化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C23H26NO4の計算質量380.19と、381.20および382.20の観測質量で確認した。

0137

実施例2.SL-Res2(E)-2-(3-ヒドロキシ-5-(4-ヒドロキシスチリル)フェノキシ)-N-(2,2,5,5-テトラメチル-1-オキシルピロリジン-3-イル)アセトアミドラジカル

0138

0139

合成は図2に示したとおりであった。Cs2CO3(20mg、0.0624mmol)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF、1mL)中のレスベラトール3,4’-ジアセタート(13mg、0.0416mmol)の溶液に加え、そして、反応混合物を、室温にて45分間撹拌した。次に、3-(2’-ヨードアセトアミド)-2,2,5,5-テトラメチル-1-ピロリジニル-1-オキシル(13.5mg、0.0415mmol)を、その溶液に加え、そして、得られた混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を、KOH溶液(20μL、10%の水溶液)に加え、次に、室温にて30分間撹拌した。溶液をアセトニトリル中の0.05%のTFAで中和し、次に、前述の条件を使用したHPLC精製に供した。溶出液を凍結乾燥して、粉末SL-Res2を得た。

0140

化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C24H29N2O5の計算質量425.21と、426.22および427.22の観測質量で確認した。

0141

実施例3.SL-Res3(E)-4-(3,5-ジヒドロキシスチリル)フェニル2,2,5,5-テトラメチル-1-オキシル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-3-カルボキシラートラジカル

0142

0143

合成は図3に示したとおりであった。2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-オキシル-3-カルボン酸無水物遊離基を、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、56mg、0.271mmol)を、無水ジクロロメタン(3mL)中の2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-オキシル-3-カルボン酸遊離基(100mg、0.542mmol)の溶液に加えることによってまず調製した。混合物を室温にて1時間撹拌した。沈殿物濾別し、透明溶液を、濃縮し、真空によってSL-無水物まで乾燥させた。

0144

丸底フラスコ内の1mLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)中のレスベラトール(25.3mg、0.11mmol)の溶液に、水素化ナトリウム(11mg、鉱油中の60%分散液)を加えた。得られた混合物を、室温にて20分間撹拌し、続いて、スピン標識無水物(38.5mg、0.11mmol)を加えた。その反応液を室温にて2時間撹拌した。反応を、水(100μL)でクエンチし、次に、5mLの冷水(0.1%の酢酸を含む)をその溶液に加えた。固形物を、遠心分離機によって分離し、水(0.05%のTFAを含む)中の80%のアセトニトリルで再溶解し、先に記載したように、HPLCで精製した。

0145

化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C23H24NO5の計算質量394.16と、395.18および396.18の観測質量で確認した。

0146

実施例4.SL-LRL1.3-(3-ヨードベンジル)-8-メチル-6-オキソ-2-((2-(2,2,5,5-テトラメチル-1-オキシルピロリジン-3-カルボキシアミド)エチル)アミノ)-3,6-ジヒドロクロメノ
イミダゾール-7-カルボキサミドラジカル

0147

0148

合成は図4に示したとおりであった。SL-LRL1およびSL-LRL2の合成を、スピン標識イソチオシアナートを用いたクマリンジアミン環化によって達成した。クマリンジアミンTFA塩を、RinkアミドMBHA樹脂(0.503mmol/g添加)上に合成し、TFAを用いて切り落とした。簡単に言えば、Fmocを、DMF中の20%の4-メチルピペリジンを用いて0.2gのRink樹脂から取り除いた(5分、次に15分)。DMF(×3)、メタノール(MeOH、×3)およびDMF(×3)で洗浄した後に、7-フルオロ-4-メチル-6-ニトロ-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボン酸(骨格、0.3mmol、80.2mg)を、DMF中の6-Cl HOBt(50.9mg、0.3mmol)およびN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、46μL、0.3mmol)の存在下でRink樹脂に連結した。カイゼル試験が陰性になるまで、反応物を室温にて回転させた。濾過後に、ビーズを、DMF(×3)、MeOH(×3)およびDMF(×3)で洗浄した。DMF中の3-ヨードベンジルアミン(53.6μL、0.4024mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA、140μL、0.8048mmol)を、ビーズに加え、一晩回転させた。洗浄後に、NO2還元を、1〜2日間を2回、DMF中の2MのSnCl2・2H2O溶液5mLを用いて達成した。DMF、MeOH、およびジクロロメタンで徹底的に洗浄した後に、ビーズを、真空によって乾燥させ、その後、クマリンジアミンを、2hのためにTFA(95%)/トリイソプロピルシラン(TIS、2.5%)/H2O(2.5%)によって切断した。クマリンジアミンTFA塩を、冷ジエチルエーテル沈殿させ、エーテルで2回洗浄し、その後、真空によってであると乾燥させた。

0149

無水DMF(1.0mL)中のクマリンジアミンTFA塩(20.0mg、0.0295mmol)およびDIEA(25.8μL、0.148mmol)の溶液に、無水DMF(0.3mL)中の3-(2-イソチオシアナート-エチルカルバモイル-プロキシル、遊離基(15mg、0.0555mmol)を加えた。得られた混合物を、室温にて5分間撹拌し、その後、DIC(17μL、0.11mmol)を加え、2時間撹拌した。追加のDIC(34μL、0.22mmol)を加え、そして、反応液を、室温にて一晩撹拌した。冷水をその溶液に加えた。沈殿物を、遠心分離機によって回収し、そして、液体を捨てた。固形物を、水(0.05%のTFAを含む)中の80%のアセトニトリルで再溶解し、先に記載したようにHPLCで精製した。

0150

化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C30H34IN6O5の計算質量685.16と、686.17の観察質量で確認した。

0151

実施例5.SL-LRL2.3-(3-ヨードベンジル)-8-メチル-6-オキソ-2-((2-(2,2,5,5-テトラメチル-1-オキシル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-3-イル)メチル)アミノ)-3,6-ジヒドロクロメノ
イミダゾール-7-カルボキサミドラジカル

0152

0153

合成は図4に示したとおりであった。無水DMF(1.2mL)中のクマリンジアミンTFA塩(21.5mg、0.0317mmol)およびDIEA(22μL、0.1268mmol)の溶液に、3-(イソチオシアナートメチル)-2,2,5,5-テトラメチル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イルオキシルラジカル(7.5.mg、0.0355mmol)を加えた。得られた溶液を、室温にて5分間撹拌し、その後、DIC(11μL、0.071mmol)を加えた。反応液を室温にて2時間撹拌した。追加のDIC(22μL)を加え、そして、得られた溶液を、室温にて一晩撹拌した。冷水をその溶液に加えた。沈殿物を、遠心分離機によって回収し、そして、液体を捨てた。固形物を、水(0.05%のTFAを含む)中の80%のアセトニトリルで再溶解し、先に記載したようにHPLCで精製した。

0154

化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C28H29IN5O4の計算質量626.12と、627.13の観察質量で確認した。

0155

実施例6.SL-G8の合成

0156

0157

100mLの丸底ボトルに、2,6-ジメチルキノリン(628.8mg、4.0mmol)、4-ニトロベンズアルデヒド(635mg、4.2mmol)、および無水酢酸(50mL)を加えた。混合物を24時間還流した。その反応混合物を室温に冷ました。黄色結晶を濾過し、水で、続いて水性エタノールで洗浄し、次に、真空によって乾燥させて、(E)-6-メチル-2-(4-ニトロスチリル)キノロン、750mgを得た、収率64.4%。化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C18H14N2O2の計算値:290.11、実測値:291.11で確認した。

0158

ニトロ還元を、塩化スズを用いて達成した。塩化スズ(2.0g、10.54mmol)を、エタノール(18mL)中の(E)-6-メチル-2-(4-ニトロスチリル)キノリン(612mg、2.108mol)の溶液に加え、続いて、濃塩酸(1.0mL)を加えた。その溶液を、5時間還流し、そして、一晩撹拌しながら室温に冷ました。その反応混合物を室温に冷ました。暗赤色の固形物を、濾過によって回収し、ジクロロメタンで、続いて、ジクロロメタンとエタノール(2:1)の混合物で洗浄した。赤色の固形物を、エタノール(60mL)中に再懸濁し、次に、赤色の色素が見えなくなりpHが9〜10に達するまで、K2CO3水溶液を加えた。水(60mL)を懸濁液に加え、混合した。遠心分離後に、固形物を、濾過によって回収し、水で、そして、水中の70%エタノールで洗浄し、真空によって乾燥させて、(E)-4-(2-(6-メチルキノリン-2-イル)ビニル)アニリン色がかった固形物として得た、495mg、収率90%。化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C18H16N2の計算値:260.13、実測値:261.14で確認した。

0159

エタノール(1.5mL)と無水THF(0.8mL)の混合物中の(E)-4-(2-(6-メチルキノリン-2-イル)ビニル)アニリン(9.3mg、0.0357mmol)、(1-オキシル-2,2,5,5-テトラメチル-Δ3-ピロリン)ホルムアルデヒド(6mg、0.0357mmol)およびp-トルエンスルホン酸(1mg、0.0058mmol)の懸濁液を、5分間超音波処理し、次に、室温にてさらに15分間撹拌した。得られた溶液を、氷水バスで冷ました後に、NaBH4(27mg、0.714mmol)を加えた。その混合物を、室温にて一晩撹拌した後に、水(20mL)を加えた。沈殿物を、遠心分離後に回収し、そして、SL-Res1の合成に記載の勾配を使用したHPLC精製のために、水(0.05%のTFAを含む)中の80%アセトニトリルで再溶解した。溶出液を、回収し、凍結乾燥して、暗赤色の粉末としてSL-G8を得た。化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C27H30N3Oの計算値:412.24、実測値:413.25で確認した。

0160

実施例7.SL-Sb1の合成

0161

0162

塩化スズ(4.74g、25mmol)を、エタノール(40mL)中の(E)-4-(4-ニトロスチリル)フェノール(1.2g、5mmol)の溶液に加え、続いて、濃塩酸(2.0mL)を加えた。その溶液を3時間還流し、一晩撹拌しながら室温まで冷ました。こげ茶色の沈殿物を、濾過によって回収し、少量のエタノールで洗浄して、HCl塩として(E)-4-(4-アミノスチリル)フェノールを得た、薄茶色の粉末、850mg、収率68.4%。C14H13NOに関するOrbitrapESI-MS211.10、実測値212.10。

0163

(E)-4-(4-アミノスチリル)フェノールHCl塩(495.4mg、2.0mmol)、パラホルムアルデヒド(600mg、20mmol)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(378mg、6.0mmol)の混合物に、酢酸(20mL)を加えた。得られた混合物を、溶液が透明になるまで加熱し、室温にて一晩撹拌した。200mLの水をその反応液に加えた。炭酸ナトリウムを、加えて8〜9にpHを調整した。ジクロロメタン(3×40mL)での抽出後に、合わせたジクロロメタン層を、水および塩水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。液体を、濾過によって回収し、rotovapによって濃縮して、明灰色の固形物として(E)-4-(4-(ジメチルアミノ)スチリル)フェノールを得た、144mg、収率30%。C16H17NOに関するOrbitrapESI-MS239.13、実測値240.14。

0164

1.5mLのエッペンドルフチューブに、(E)-4-(4-(ジメチルアミノ)スチリル)フェノール(7.7mg、0.032mmol)、3-ヒドロキシメチル-(1-オキシ-2,2,5,5-テトラメチルピロリン)(6.0mg、0.0352mmol)、トリフェニルホスフィン(PPh3、9.7mg、0.0368mmol)、および無水テトラヒドロフラン(THF、0.3mL)を加えた。次に、反応チューブを、42kHzの超音波処理バス(Cole-Parmer)に浸けて、2分間、超音波処理した。超音波処理している間、ジイソプロピルアゾジカルボン酸(DIAD、7.9μL、0.04mmol)を、反応混合物に加えた。反応混合物を、15分間を3回繰り返し、合計で45分間、超音波処理した。その反応混合物を50%のアセトニトリル/水(0.05%のTFA)2mLで希釈し、次に、SL-Res1の合成に記載の勾配を使用したHPLC精製に供した。溶出液を、回収し、凍結乾燥して、こげ茶色の粉末としてSL-Sb1を得た。C25H31N2O2に関するOrbitrapESI-MS391.24、実測値392.25。

0165

実施例8.SL-Sb2の合成

0166

0167

SL-Sb2を、(E)-4-(4-アミノスチリル)フェノールから合成した。そのHCl塩(200mg)を、エタノール(25mL)中に懸濁し、次に、K2CO3水溶液をpH9まで加えた。水(25mL)を、その懸濁液に加え、混合した。遠心分離後に、
固形物を、濾過によって回収し、水で、そして、水中の70%エタノールで洗浄し、および真空によって乾燥させて、茶色がかった固形物として(E)-4-(4-アミノスチリル)フェノールを得た。エタノール(1.5mL)および無水THF(0.8mL)の混合物中の(E)-4-(4-アミノスチリル)フェノール(7.6mg、0.0357mmol)、(1-オキシル-2,2,5,5-テトラメチル-Δ3-ピロリン)ホルムアルデヒド(6mg、0.0357mmol)およびp-トルエンスルホン酸(1mg、0.0058mmol)の懸濁液を、溶液が透明になるまで5分間超音波処理し、室温にてさらに15分間撹拌した。得られた溶液を氷水バスで冷ました後に、NaBH4(27mg、0.714mmol)を加えた。その混合物を室温にて一晩撹拌した後に、水(20mL)を加えた。沈殿物を、遠心分離後に回収し、SL-Res1の合成に記載の勾配を使用したHPLC精製のために、水(0.05%のTFAを含む)中の80%アセトニトリルで再溶解した。溶出液を、回収し、凍結乾燥して、こげ茶色の粉末としてSL-G8を得た。化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C23H27N2O2の計算値:363.21、実測値:364.22、365.22で確認した。

0168

実施例9.SL-AV45の合成

0169

0170

p-トルエンスルホニルクロライド(7.50g、40.0mmol)を、窒素下で、ピリジン(6.5mL)およびジクロロメタン(DCM、400mL)中のトリエチレングリコール(60.0g、40.0mmol)の溶液に加えた。室温にて18時間撹拌した後に、rotovapによって溶媒を取り除いた。残渣を、酢酸エチル(200mL)中に溶解し、塩水(3×100mL)で洗浄した。酢酸エチル溶液を、無水Na2SO4上で乾燥させた。濾過後に、濾液蒸発乾固して、シリカカラムにより精製して透明なオイルとして8-トシルオキシ-3,6-ジオキソオクタン-1-オールを生じる未精製の生成物を得た(8.68g、71.3%)。C13H20O6Sに関するOrbitrapESI-MS計算値304.10、実測値305.11。

0171

無水THF(28mL)中の8-トシルオキシ-3,6-ジオキソオクタン-1-オール(8.5g、27.93mmol)の溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF、32mL、32.0mmol)の1.0M THF溶液をN2下で滴下して加えた。その反応液を、N2下、室温にて一晩撹拌した。THFを、rotovapによって除去した。残渣を、蒸留して、薄茶色の液体を得た。再蒸留後に、無色液体として1-フルオロ-3,6-ジオキソオクタン-1-オールを得た、2.55g、収率60%。C6H13FO3に関するOrbitrapESI-MS計算値152.08、実測値153.20。

0172

ナトリウムメトキシド(メタノール中に1M、10.0ml)を、メタノール(10.0mL)中のジエチル4-ニトロベンジルホスホナート(1.092g、4.0mmol)および6-クロロピリジン-3-カルボキサルデヒド(566mg、4.0mmol)の溶液にゆっくり加えた。その反応混合物を2時間還流し、その後、0℃まで冷やした。黄色の沈殿物を、濾過によって回収し、冷メタノールで洗浄し、真空によって乾燥させて、(E)-2-クロロ-5-(4-ニトロスチリル)ピリジンを得た、782mg、収率75%。C13H9ClN2O2に関するOrbitrapESI-MS計算値260.04、実測値261.08。

0173

1-フルオロ-3,6-ジオキソオクタン-1-オール(600mg、3.92mmol)を、0℃にて無水DMF(30mL)中の水素化ナトリウム(528mg、鉱油中の60%の分散液、13.2mmol)の混合物に加えた。得られた混合物を、室温にて0.5時間撹拌し、次に、(E)-2-クロロ-5-(4-ニトロスチリル)ピリジン(866mg、3.32mmol)を加えた。反応混合物を100℃にて2時間撹拌し、冷ました。酢酸エチルおよび水を加え、有機層を分離し、塩水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。濾過後に、濾液をrotovap下で留去した。残渣を、シリカカラムで精製して、生成物(E)-2-(2-(2-(2-フルオロエトキシ)エトキシ)エトキシ)-5-(4-ニトロスチリル)ピリジンを得た、480mg、収率38%。C19H21FN2O5に関するOrbitrapESI-MS計算値376.14、実測値377.16。

0174

塩化スズ(1.13g、5.965mmol)を、エタノール(12mL)中の(E)-2-(2-(2-(2-フルオロエトキシ)エトキシ)エトキシ-5-(4-ニトロスチリル)ピリジンの溶液(450mg、1.193mmol)を加え、続いて、濃塩酸(1.13mL)を加えた。その溶液を3時間還流し、その後、室温にて一晩撹拌した。沈殿物を、濾過によって回収し、エタノール中に再懸濁し、次に、K2CO3水溶液で〜pH9まで中和した。冷水を加えて、沈殿させた。遠心分離後に、固形物を、濾過によって回収し、水で洗浄し、真空によって乾燥させて、(E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-フルオロエトキシ)エトキシ)エトキシ)ピリジン-3-イル)ビニル)アニリンを得た、352mg、収率85%。C19H23FN2O3に関するOrbitrapESI-MS計算値346.17、実測値347.17。

0175

エタノール(1.5mL)および無水THF(0.8mL)中の(E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-フルオロエトキシ)エトキシ)エトキシ)ピリジン-3-イル)ビニル)アニリン(11.3mg、0.0325mmol)および(1-オキシル-2,2,5,5-テトラメチル-Δ3-ピロリン)ホルムアルデヒド(6mg、0.0357mmol)の混合物に、p-トルエンスルホン酸(1mg、0.0058mmol)(0.8mL)を加えた。得られた混合物を、5分間超音波処理し、室温にてさらに30分間撹拌した。NaBH4(27mg、0.714mmol)を0℃にて加えた。その混合物を室温にて一晩撹拌した後に、水(20mL)を加えた。沈殿物を、遠心分離後に回収し、SL-Res1の合成に記載の勾配を使用したHPLC精製のために、水(0.05%のTFAを含む)中の80%アセトニトリルで再溶解した。その溶出液を回収し、凍結乾燥して、SL-AV45を得た。化学的同一性を、OrbitrapESI-MSを用いて、C28H37FN3O4の計算値:498.28、実測値:499.30で確認した。

0176

実施例10.HO-4160標識は、ADトランスジェニックマウスモデルからの脳標本におけるアミロイドプラークのインビトロ検出を容易にする

0177

冠状断脳切片(厚さ400μm)のMR画像を、HO-4160ニトロキシドスピン標識フッ素(SLF)への曝露の有無を伴ったトランスジェニックADマウスモデル(5xFAD)から得、そしてそのときには、SLF陰性サンプルを、SLF曝露サンプルと同等にDMSOビヒクルで処理した。SLFまたはDMSOビヒクル対照のいずれかの標識期間に続いて、脳切片を、アガロースの中に包埋し、MRIによって画像化した。各実験における特有のADおよび野性型(WT)マウスからの切片を使用した、3つの別々の実験で測定をした。SLFは、T1強調画像強度では観察可能なコントラストを生じない。しかしながら、T2およびT2*強調画像化の両方が、SLF処置標本におけるネガティブコントラストを示す(図5)。

0178

SLFで処理した5xFAD脳切片は、2.6±0.1×105の平均値を有する未処理サンプルのT2強調画像と比較して、1.6±0.1×105の平均値まで強度が低下する。対応のないt-検定による二組の評価は、これらの群間有意差確証を与える(p<0.01)。T2*に関して、SLF処理サンプルに関して1.4±0.2×105の平均強度、および未処理サンプルに関して2.3±0.1×105の平均強度を有する、5xFAD標本の2つの群間にもまた、有意な強度差がある(p<0.02)。加えて、WTマウスからの対応する切片のT2およびT2*強調画像化は、SLF処理標本とSLF陰性(未掲載)標本との間に違いがないことを示す。よって、SLF誘発ネガティブコントラストは、高いAB負荷量を含有するADモデルマウス標本に特異的である。

0179

加えて、WTマウスからの対応する切片のT2およびT2*強調画像化は、SLF処理標本とSLF陰性標本との間に違いがないことを示す(図6)。よって、SLF誘発ネガティブコントラストは、高いAB負荷量を含有する標本に特有である。同様の定性結果が、PS/APPマウスモデルからの脳標本を使用したときも得られ、そしてそのときには、サンプルのSLF処理は、T2*強調MRI画像において実質的なネガティブコントラストをもたらす(図6)。

0180

実施例11.MRIによって検出したSLF標識アミロイドプラークからのネガティブコントラストの定量

0181

T2およびT2*の両方のシグナル抑制を、3つの実験のそれぞれについて計算した。平均抑制値を、方程式

0182

0183

に従って計算し、そこでは、SIは、5xFADSLF+切片の平均シグナル強度であり、かつ、SIrefは、5xFAD SLF-またはWT SLF+切片の平均シグナル強度である。計算結果を図7にプロットし、そこでは、灰色および白色の棒グラフの両方が、SLF処理後の5xFAD標本に見られるMRI強度の抑制を表す。灰色の棒グラフは、未処理5xFAD脳に対するシグナル抑制を示し、それに対して、白色の棒グラフは、WTマウスからのSLF処理標本に対する抑制を比較する。両方の対照に対して、SLFは、高アミロイドβ負荷量を担持するサンプルに関して〜40%のシグナル抑制を生じる。SLFの不在下、5xFAD脳切片の平均強度は、WTマウスからの標本に比べて、わずかに低いT2/T2*MRI強度を有する。これは、ABの沈着物に結合した鉄に起因すると考えられ、そしてそれは、ADモデルマウスのMRI分析で以前に観察されていた(Vanhoutte et al. (2005); Jack et al. (2007);およびWadghiri et al. (2012))。よって、+SLF ADサンプル対+SLF WTサンプルを比較するとき、相対抑制は、わずかに高い。この知見は、アミロイドプラークを特異的に標識し、MR画像におけるネガティブコントラストを生じるSLFの能力を明確に実証する。

0184

実施例12.アミロイドの存在に対して特異性を有する高SLF結合が、EPR分析によって裏付けられる

0185

サンプルを石英セルに入れ、電子常磁性共鳴(EPR)分光法によって調べた。図8に示したとおり、強いEPRシグナルが、SLF処理5xFAD脳組織から得られたが、しかしながら、同様に処理したWT脳組織からのシグナルは得られなかった。よって、MRI測定値からの結果と一致して、WT+SLF脳切片からのEPRシグナルの欠如が、これらの組織サンプルにおけるSLFの非特異的結合を排除する。予想されるように、SLF処理を欠いた5xFADサンプルは、EPRシグナルを示さなかった。+SLF 5xFADからの幅広いEPRスペクトルは、強固に固定されたスピンプローブを反映し、固化マトリックスへの高親和性結合と一致した。SLFのこの高度に固定された状況は、可溶性ABでは観察されず、そこでは、分子が、この化学種の範囲内での短時間の回転拡散のため、高度な運動による平均化を示す(Altman et al. (2015))。

0186

実施例13.抗AB免疫組織化学は、MRIによって検出されるアミロイドプラーク分布と相関がある

0187

SLFを投与した5xFADトランスジェニックマウスからの脳切片を、抗βアミロイド、17-24(4G8)モノクローナル抗体を用いて免疫染色した。図9に示した結果は、白色のドットパターンを伴った暗領域として現れる抗体蛍光によってアミロイドプラークの存在を示す。この抗体蛍光は、T2*強調MRI画像において5xFAD+SLFマウス脳切片を通じて見られた、分散した暗パターン(強度の喪失)と相関がある。

0188

実施例14.SLFの血液-脳分布の評価

0189

以下の表1に、10mg/kgの用量での、3匹のマウスの腹腔内注射後のSLF化合物の血漿および脳中レベルを報告する。総SLF血漿中濃度を、投与後20、40、および60分に各マウスから計測した。マウスを、注射の60分後に安楽死させ、それらの脳を摘出し、-80℃にて保存した。サンプル中のSLFのUPLC-MS/MS分析法によって、脳内濃度が血漿中濃度の約50%であり、0.5の脳/血漿比に相当することがわかった。まとめると、これらのデータは、SLFが、画像化プローブとして有用であるくらい十分に脳に浸透することを実証する。

0190

表1.マウス脳および血漿におけるSLFの注射後レベル
平均不確実性を標準誤差として示す。

0191

0192

実施例15.SLFのインビボにおける常磁性および蓄積の実証

0193

脳組織におけるSLFのエクスビボ分析のために、1匹の5xFADマウスおよび1匹のWTマウスに尾静脈を通してSLFを注射した(i.v.、〜3mg/kg)。24時間後に、マウスを安楽死させ、それらの脳を摘出し、4〜8℃にて一晩、4%のパラホルム中で固定した。これらの脳サンプルから、400μmの冠状断切片を調製し、アガロース中に包埋した。図10は、5xFADおよびWTマウスの両方の(ブレグマ-2.12における)半冠状断切片のMR画像を示す。5xFAD脳組織のT2*強調画像は、腹側海馬および視床に相当する領域において5xFADマウス冠状断切片に関してわずかなネガティブコントラストを示す。このネガティブコントラストは、WTマウスからの標本には存在しない。

0194

実施例16.常磁性SLFの選択的保持の検証

0195

SLF注射マウスから収集した脳標本および上記の実施例に記載した脳標本を、アガローススラブから取り出し、それらのニトロキシドEPRシグナルについて分析した(図11)。脳切片のインビトロにおけるSLF標識からの我々の結果と一致して、WTマウス脳標本はEPRシグナルを示さず、実験した組織サンプルにおけるSLFの非特異的結合を排除し、それと同時に、SLF注射5xFADマウスから単離した脳切片は、明確なEPRシグナルを生じた。インビトロにおけるSLF標識によって得られたシグナル(図8)と比較して、図11における5xFAD+SLFサンプルは、より弱いEPRシグナルを生じた。しかしながら、図8のサンプルは、SLF中に完全に浸したが、それに対して、図11における組織のSLF標識は、脳脊髄液(CSF)への可触性に依存している。

0196

実施例17.脳組織に結合しているSL-LRL1の確認

0197

ニトロキシドスピン標識化合物、LRL1を合成し、5xFADマウス脳標本と一緒インキュベートした。図12の左側のパネルでは、LRL1が5xFAD標本のT2*強調MRI画像において強いネガティブコントラストを生じることが明らかである。図12の右側のパネルは、MRI分析後のサンプルのEPRスペクトルを示し、脳組織へのLRL1化合物の結合を確認した。

0198

実施例18.脳組織に結合しているSL-LRL2、SL-Res1、SL-Res2、およびSL-Res3の確認

0199

ニトロキシドスピン標識化合物、LRL2、SL-Res1、SL-Res2、およびSL-Res3を合成し、そして、5xFADマウス脳標本と一緒にインキュベートした。図13は、これらの4種類の化合物それぞれが、5xFADマウスから分離した脳標本のT2*強調MRI画像においてネガティブコントラストを生じる能力があるが(左のパネル)、WT(正常)マウスではそれを生じない(右のパネル)ことを示す。

0200

実施例19.SL-LRL1、SL-LRL2、SL-Res1、SL-Res2、およびSL-Res3の治療効果の証明

0201

AB毒性に対する作用物質の保護能力が、MC65神経芽腫細胞の生存率に対するそれらの効果によって計測できる(Maezawa et al. (2008) J. Neurochem. 104:457)。MC65モデル系では、アミロイド前駆タンパク質(APP)のC末端領域(C99)の発現が、導入遺伝子抑制因子テトラサイクリン(TC)の不存在下で始まる。APP-C99誘導により(TC-)、細胞内γ-セクレターゼを含めた条件付き発現によるタンパク質分解後に、ABが作り出される。保護がないとき、MC65神経芽腫細胞の死滅は、オリゴマーAB(ABO)の細胞内蓄積のため生じる。例として、我々は、非スピン標識親フルオレンK01-162に比べて、SLFが、約1桁優れた効果でAB毒性に対する保護能力をもたらすことをPetrlova et al. (2012)に示した。以下の表2では、MC65アッセイにおけるAB毒性に対するSL-LRL1、SL-LRL2、SL-Res1、SL-Res2、およびSL-Res3化合物の保護能力を報告する。

0202

表2.MC65アッセイによって測定されるAB毒性に対する保護における新しいスピン標識アミロイド作用物質の効果。EC50は、最大効果の50%を達成する化合物の濃度を表し、そのとき、すべての化合物に関して、最大効果は細胞生存率100%である。

0203

0204

これらの試験に使用した細胞培養モデルは、ヒトアミロイドβ前駆タンパク質(APP-C99)のカルボキシル末端99残基の条件付き発現を備えた神経芽腫細胞株(MC65)であった。ABは、細胞内γ-セクレターゼによるタンパク質分解後にAPP-C99から作り出される。細胞内AB産生を誘導するために、先に記載したように(Maezawa et al. (2008))、導入遺伝子抑制因子、テトラサイクリン(TC)を培地から除去した。細胞内ABOは、早ければTC除去後4時間で蓄積を開始する。化合物を、TC除去直後に加え、そして、細胞生存率を計測する前に、細胞を培地交換なしで3日間維持した。細胞毒性を、3日目に比色MTT[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物]細胞生存率アッセイを使用して測定した。

0205

実施例20.ABの病原性

0206

ABの病原性は、ペプチドの可溶性、オリゴマー状態に特有の毒性立体構造に関連している可能性がある。ABの毒性立体構造を覆す我々の作用物質の能力を試験するために、我々は、オリゴマーABへのアミロイド色素チオフラビン-T(ThT)の結合に対するLRL1-2およびRES1-3の効果を計測し、そしてそれは、AB凝集および原線維形成汎用標識としての役割を果たし、ABを無毒性立体構造に作り変える作用物質を同定するための簡便法を提供する。478nmにおけるThTの蛍光はABが毒性凝集体を形成するに従って増強されるので、我々は、オリゴマーABの存在下でThT蛍光に対するRES1-3およびLRL1-2の効果を試験した。図14にみられるように、RES1-3およびLRL1-2の添加は、添加のないサンプルに比べて、ABとThTの混合物に関する478nmのシグナルを抑制した。これは、各化合物がABに直接関与し、そのアミロイド形成プロフィールおよび毒性プロフィールを変更することを示唆している。

0207

ABが複数の細胞機能を妨げることは知られているが、タンパク質および脂質に対する酸化損傷が、その発症機構一般的特徴である。ニトロキシドは特有の酸化防止剤活性を有するので、我々の化合物は、酸化ストレスを相殺する高い能力を有する。我々の化合物は、ABに直接関与するので、そのため、これらの作用物質は、ABにおける局在化抗酸化剤の機能性による活性酵素(ROS)や窒素分子種(NOS)の捕捉において特に効果的になるように設計されている。図15AおよびBは、スピン捕獲によって計測されるとおり、LRL1-2およびRES1-3がROSの効果的なスカベンジャーであることを示す。

実施例

0208

前述の本発明は、理解を明確にする目的で例証および実施例によっていくらか詳細に説明されてきたが、当業者は、ある特定の変更および改変が添付の請求項の範囲内で実施され得ることを認識するであろう。さらに、本明細書中に提供される各参考文献は、その各参考文献が個別に参照により援用されたかのように同程度にその全体が参照により援用される。本願と本明細書中に提供される参考文献との間で矛盾がある場合、本願に優先性があるものとする。

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