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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、特には炎症性皮膚機能不全処置において使用するための組換え型プロバイオティクス細菌、さらには、炎症性皮膚機能不全を処置するための方法を対象とする。

概要

背景

本出願は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる国際出願PCT/EP2015/052345の優先権を請求する。

マクロファージは、本質的にすべての組織において見出され得る白血球の1種である。マクロファージは、非特異的防御において重要な役割を果たし、リンパ球などの他の免疫細胞動員することによって、特異的防御機構を開始する助けともなる。

マクロファージは、弾性組織特異的マクロファージとして存在するか、またはマクロファージに分化する循環血液単球由来する。

マクロファージは、様々な活性化状態提示する。2つの対照的な活性化状態は、M1分極化マクロファージとも呼ばれる典型的な活性化マクロファージ、およびM2分極化マクロファージとも呼ばれる別の活性化マクロファージとして公知である。

M1分極化マクロファージは、活性炎症性表現型を有する免疫エフェクター細胞を含む。M1分極化マクロファージは、高レベル炎症誘発性サイトカイン発現反応性窒素および酸素中間体の高い産生、Th1応答の促進、ならびに強力な殺菌性および殺腫瘍活性によって特徴づけられる。

M2分極化マクロファージは、抗炎症性表現型である。M2分極化マクロファージは、寄生虫保持ならびに組織リモデリングの促進および腫瘍進行に関係しており、かつ免疫調節機能を有すると考えられている。M2マクロファージはまた、効率的な食細胞活性、捕捉分子の高い発現によって特徴づけられる。

可塑性および柔軟性は、単核食細胞の活性化状態の特徴である。例えば、M1分極化またはM2分極化マクロファージの表現型は、in vitroおよびin vivoで逆転され得る。

マクロファージは、微小環境における刺激サイトカインおよびケモカイン分泌パターンに応じて、複数回変化し得る。例えば、in vitroおよびin vivoにおいて、ヒト一次M1分極化マクロファージは、それら自身のカウンターパートからの分泌因子によって、M2分極化マクロファージへと再分極化され得、逆も同様である。

病原体に対する第一線の防御を提示することに加えて、単核食細胞は、ホメオスタティック状態および損傷を受けた状態にある組織のリモデリングおよび修復に寄与する。

さらに、マクロファージは、炎症の制御に対する必須の寄与物質であり、その際、M1分極化マクロファージは、炎症の開始および持続関与し、M2分極化マクロファージは、慢性炎症の制御と関連する。

例えば、マクロファージは、創傷治癒の様々なフェーズの間に、ダイナミックな変化を受ける。M1分極化マクロファージは、組織損傷を媒介し、炎症応答を開始する。さらに、創傷の修復応答の初期段階の間に、皮膚浸潤性マクロファージは、M2分極化表現型を示し、高度に血管新生された細胞性肉芽組織の形成をサポートする。

炎症は、敗血症外傷、および創傷治癒などの状況では、急性炎症として、または例えば、関節リウマチ潰瘍性大腸炎クローン病などの疾患では、慢性炎症として特徴づけられ得る。癌、糖尿病動脈硬化症アルツハイマー、および肥満などの多くの他の疾患も、調節解除された炎症と関連している。

急性炎症応答は、侵入病原体または損傷組織の位置を決定し、他の細胞および分子に警告し、それらを動員し、損傷物質を消去し、最後に、身体を平衡まで回復させる細胞および分子の大きなアレイによって媒介される事象カスケードを伴う。

敗血症および外傷では、この応答は、熱および心拍数の上昇などの肉眼的症状発現随伴する。他の組織では、炎症は、発赤腫脹、および疼痛として症状発現する。

炎症に至る損傷/機能不全をもたらす炎症のフィードフォワードループは、臓器機能不全および死亡を促進する持続性の調節解除された炎症をもたらし得る。適正な組織治癒には、良好に調節された炎症応答が必要である。

傷害後の皮膚の完全性およびホメオスターシスの回復は、修復応答:炎症、組織形成、および成熟の連続的なフェーズを達成するために、組織常在造血細胞および動員された造血細胞と一緒に、上皮および間葉細胞の複雑でダイナミックな相互作用を必要とする。修復応答の初期段階では、炎症フェーズが優勢であり、これは、先天免疫系が局所活性化して、好中球の即時の流入、その後に続く、マクロファージに分化する血液単球侵襲が生じることによって特徴づけられる。

修復応答の中間段階は、組織形成のフェーズを包含し、これは、皮膚創傷空間を再充填する肉芽組織の発生によって特徴づけられる。肉芽組織形成は、血管新生をもたらす内皮細胞の侵襲、線維芽細胞の流入、および追加のマクロファージの蓄積を包含する。

暫定的な細胞外創傷マトリックス堆積は、細胞の接着遊走、および増殖を促進する。さらに、創傷周辺部では、複雑な表皮間葉相互作用が、角化細胞の増殖および遊走を刺激して、表皮バリアを回復させる。

創傷空間が再充填され、被覆する表皮が回復するまで、肉芽組織形成は続く。表皮バリアが完成すると、修復応答は、後期段階入り、これは、組織成熟によって特徴づけられる。組織成熟のフェーズの間に、肉芽組織は、瘢痕組織に変化する。

皮膚の修復の間、常在細胞、さらには、動員された炎症性細胞の先天免疫応答は、侵襲性微生物戦い壊死組織切除に寄与するが、多種多様増殖因子の放出による修復プロセスもサポートし得る。

しかしながら、炎症誘発性および細胞傷害性メディエーターの放出によって、マクロファージの制御から逸脱した活性は、組織修復にとって有害でもあり得る。

マクロファージの数の上昇によって特徴づけられるアンバランスな炎症は、ヒト疾患において、修復応答の減弱の顕著な特徴であり、非治癒性慢性創傷の形成をもたらす。非治癒性慢性創傷に寄与する追加の因子は、例えば、糖尿病、静脈または動脈疾患、感染、および高齢者における代謝不全である。

慢性創傷を処置するために、感染を処置するための抗生物質の使用、壊死組織切除、陰圧補助閉鎖、および酸素付加を包含する様々な方法が存在する。

さらなる方法には、例えば、増殖因子の適用が包含される。

例えば、ベカプレルミンは、組換え型ヒト血小板由来増殖因子BBである。ベカプレルミンは、商品名Regranexで販売されており、皮下組織内に、またはそれを越えて伸長し、十分な血液供給を有する下肢糖尿病性神経障害潰瘍の処置に適応とされる。

ベカプレルミンはさらに、初期の高度創面清掃術、圧力放出、および感染制御を包含する足部潰瘍の治療実施に対する補助剤として(代替としてではない)適応とされる。

しかしながら、市販後の後向きコホート研究において、悪性腫瘍に次ぐ死亡率の上昇が、3本以上のチューブのRegranexジェルで処置された患者において観察された。

使用される別の増殖因子は、商品名REGEN−Dジェルで販売されており、慢性糖尿病性足部潰瘍を処置するために使用される組換え型ヒト表皮増殖因子である。

さらに、トラフェルミンは、商品名「Fiblast Spray」で販売されているヒト線維芽細胞増殖因子2の組換え型である。トラフェルミンは、圧迫潰瘍、ならびに熱傷潰瘍および黒色潰瘍を包含する他の皮膚潰瘍を処置するために使用される。

足部潰瘍の慢性糖尿病性神経障害性潰瘍に罹患している患者に対して、6週間にわたってトラフェルミンまたはプラセボ毎日適用した後に、週1回の臨床検査およびコンピュータ写真によって、サイズが評価された。潰瘍の外周および面積の週ごとの低減は、両方の群で同一であり、処置のエントリーから6週目まで、直線的な進行速度も同様であった。さらに、研究の終了時での治癒面積パーセンテージが、有意に異なることはなかった。Richardset al.(1995)によれば、足の慢性神経障害性糖尿病性潰瘍治癒について、トラフェルミンの局所適用は、プラセボを上回る利点を有さなかった。

罹患創傷面に適用した後に、様々な増殖因子を分泌するヒト胚細胞を含有する2種の皮膚代替物も市販されている。

皮膚代替物Dermagraftは、線維芽細胞、細胞外マトリックス、および生体吸収性スキャフォールドから構成される。Dermagrafは、寄付された新生児包皮組織に由来するヒト線維芽細胞から製造される。

製造プロセス中に、ヒト線維芽細胞は、生体吸収性ポリグラクチンスキャフォールド上に播種される。

市販の皮膚代替物Apligrafは、新生児包皮に由来する2種の細胞種を含有する。生きたヒト角化細胞および線維芽細胞が、創傷1型コラーゲンマトリックス包埋される。

上述の皮膚代替物の欠点は、製造プロセスから生じる相当する高価格である。例えば、母体血液は、免疫不全ウイルス1および2型B型肝炎ウイルスC型肝炎ウイルス梅毒、ヒトTリンパ好性ウイルス1および2型、さらには、エプスタインバールウイルスなどのヒトウイルスでの感染の証拠について検査される。

さらなる市販品が、商品名Procurenで販売されている。Procurenは、非治癒性創傷を処置するための血小板由来創傷治癒配合物である。Procurenは、患者の血液サンプルから調製される自己血小板由来産物である。

しかしながら、慢性非治癒性創傷を処置するための、または急性外科的創傷などの他の状態を処置するための、自己血小板由来増殖因子を包含する自己血小板由来産物の有効性に関する証拠は十分に存在しない。

さらに、上述の皮膚代替物、さらには、自己血小板由来産物によって供給される増殖因子の量は、出発物質品質に応じて、著しく変動する。

概要

本発明は、特には炎症性皮膚機能不全の処置において使用するための組換え型プロバイオティクス細菌、さらには、炎症性皮膚機能不全を処置するための方法を対象とする。なし

目的

本発明の目的は、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全に対して有益な因子を容易に適用することができる、炎症性皮膚機能不全、特に、慢性炎症性皮膚機能不全の代替処置を可能にすることである

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

組換え型プロバイオティクス細菌であって、第1の異種因子をコードする核酸配列複数可)、第2の異種因子をコードする核酸配列(複数可)、および好ましくは第3の異種因子をコードする核酸配列(複数可)を含むが、ただし、第1の因子、第2の因子、および第3の因子は、相互に機能的に異なり、その際、第1の因子は、増殖因子であり、第2の因子は、M2分極化因子からなる群から選択され、好ましくは、第3の因子は、M2分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする、組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項2

核酸配列(複数可)が、組換え型プロバイオティクス細菌の染色体およびプラスミドの少なくとも1つに配置されている、請求項1に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項3

核酸配列(複数可)の発現が、構成プロモーターまたは誘導性プロモーターによって制御される、請求項1または2のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項4

核酸配列(複数可)の発現が、誘導性プロモーターによって制御されていて、核酸配列(複数可)が、少なくとも1種の誘導因子の存在下で発現可能である、請求項3に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項5

誘導因子によって誘導可能である誘導性プロモーターが、ランチビオティクスペプチド、その機能的類似体をコードする微生物遺伝子のためのプロモーターであり、好ましくは誘導性プロモーターが、LactococcuslactisのPnisA、PnisZ、PnisQ、PnisF、PnisU、またはそれらの組合せである、請求項3または4のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項6

誘導因子が、好ましくは、ナイシンA、ナイシンZ、ナイシンQ、ナイシンF、ナイシンU、それらの機能的類似体、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1種のランチビオティクスペプチドまたはその機能的類似体である、請求項4または5のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項7

プロバイオティクス細菌がさらに、プロバイオティクス細菌の生存に必要な必須タンパク質をコードする少なくとも1つの不活性化遺伝子を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項8

プロバイオティクス細菌の生存に必要な少なくとも1つの不活性化遺伝子が、アラニンラセマーゼ(alaR)、チミジル酸シンターゼ(thyA)、アスパラギンシンターゼ(asnH)、CTPシンターゼ(pyrG)、トリプトファンシンターゼ(trpBA)、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項7に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項9

遺伝子が、遺伝子の欠失、遺伝子の変異、遺伝子のエピジェネティック修飾、遺伝子のRNA干渉(RNAi)媒介性遺伝子サイレンシング、遺伝子の翻訳阻害、またはそれらの組合せによって不活性化されている、請求項7または8のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項10

第1の因子、第2の因子、および第3の因子の少なくとも1つが、組換え型プロバイオティクス細菌から放出され得る、請求項1から9のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項11

M2分極化因子が、サイトカインケモカイン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項12

M2分極化因子が、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン10(IL−10)、インターロイキン13(IL−13)、コロニー刺激因子−1(CSF1)、インターロイキン34(IL34)、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項13

増殖因子が、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血管内皮細胞増殖因子VEGF)、表皮成長因子(EGF)、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF−α)、インスリン様成長因子(IGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF−β)、およびそれらの混合物、好ましくは線維芽細胞増殖因子2(FGF−2)からなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項14

組換え型プロバイオティクス細菌が、乳酸細菌、好ましくはラクトバシラスまたはラクトコッカス種である、請求項1から13のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項15

ラクトコッカス種が、Lactococcuslactis、好ましくはLactococcuslactis亜種cremorisである、請求項14に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項16

組換え型プロバイオティクス細菌が、溶液であるか、凍結または乾燥、好ましくは凍結乾燥または噴霧乾燥されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項17

組換え型プロバイオティクス細菌が、局所で、および/または皮下注射によって投与される、請求項1から16のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項18

請求項1から17のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌である、炎症性皮膚機能不全処置において使用するための組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項19

炎症性皮膚機能不全が、炎症性皮膚疾患または炎症性結合組織疾患である、請求項18に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項20

炎症性皮膚疾患が、凍傷湿疹乾癬皮膚炎潰瘍創傷エリテマトーデス神経皮膚炎、またはそれらの組合せである、請求項19に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項21

創傷が、熱傷化学的創傷、放射線誘導性創傷、虚血性創傷、または機械的創傷である、請求項20に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項22

潰瘍が褥瘡性潰瘍または下腿潰瘍である、請求項20に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。

請求項23

請求項1から22のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌を、炎症性皮膚機能不全に罹患している個体に投与するステップを含む、炎症性皮膚機能不全を処置するための方法。

技術分野

0001

本発明は、特には炎症性皮膚機能不全処置において使用するための組換え型プロバイオティクス細菌、さらには、炎症性皮膚機能不全を処置するための方法を対象とする。

背景技術

0002

本出願は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる国際出願PCT/EP2015/052345の優先権を請求する。

0003

マクロファージは、本質的にすべての組織において見出され得る白血球の1種である。マクロファージは、非特異的防御において重要な役割を果たし、リンパ球などの他の免疫細胞動員することによって、特異的防御機構を開始する助けともなる。

0004

マクロファージは、弾性組織特異的マクロファージとして存在するか、またはマクロファージに分化する循環血液単球由来する。

0005

マクロファージは、様々な活性化状態提示する。2つの対照的な活性化状態は、M1分極化マクロファージとも呼ばれる典型的な活性化マクロファージ、およびM2分極化マクロファージとも呼ばれる別の活性化マクロファージとして公知である。

0006

M1分極化マクロファージは、活性な炎症性表現型を有する免疫エフェクター細胞を含む。M1分極化マクロファージは、高レベル炎症誘発性サイトカイン発現反応性窒素および酸素中間体の高い産生、Th1応答の促進、ならびに強力な殺菌性および殺腫瘍活性によって特徴づけられる。

0007

M2分極化マクロファージは、抗炎症性表現型である。M2分極化マクロファージは、寄生虫保持ならびに組織リモデリングの促進および腫瘍進行に関係しており、かつ免疫調節機能を有すると考えられている。M2マクロファージはまた、効率的な食細胞活性、捕捉分子の高い発現によって特徴づけられる。

0008

可塑性および柔軟性は、単核食細胞の活性化状態の特徴である。例えば、M1分極化またはM2分極化マクロファージの表現型は、in vitroおよびin vivoで逆転され得る。

0009

マクロファージは、微小環境における刺激サイトカインおよびケモカイン分泌パターンに応じて、複数回変化し得る。例えば、in vitroおよびin vivoにおいて、ヒト一次M1分極化マクロファージは、それら自身のカウンターパートからの分泌因子によって、M2分極化マクロファージへと再分極化され得、逆も同様である。

0010

病原体に対する第一線の防御を提示することに加えて、単核食細胞は、ホメオスタティック状態および損傷を受けた状態にある組織のリモデリングおよび修復に寄与する。

0011

さらに、マクロファージは、炎症の制御に対する必須の寄与物質であり、その際、M1分極化マクロファージは、炎症の開始および持続関与し、M2分極化マクロファージは、慢性炎症の制御と関連する。

0012

例えば、マクロファージは、創傷治癒の様々なフェーズの間に、ダイナミックな変化を受ける。M1分極化マクロファージは、組織損傷を媒介し、炎症応答を開始する。さらに、創傷の修復応答の初期段階の間に、皮膚浸潤性マクロファージは、M2分極化表現型を示し、高度に血管新生された細胞性肉芽組織の形成をサポートする。

0013

炎症は、敗血症外傷、および創傷治癒などの状況では、急性炎症として、または例えば、関節リウマチ潰瘍性大腸炎クローン病などの疾患では、慢性炎症として特徴づけられ得る。癌、糖尿病動脈硬化症アルツハイマー、および肥満などの多くの他の疾患も、調節解除された炎症と関連している。

0014

急性炎症応答は、侵入病原体または損傷組織の位置を決定し、他の細胞および分子に警告し、それらを動員し、損傷物質を消去し、最後に、身体を平衡まで回復させる細胞および分子の大きなアレイによって媒介される事象カスケードを伴う。

0015

敗血症および外傷では、この応答は、熱および心拍数の上昇などの肉眼的症状発現随伴する。他の組織では、炎症は、発赤腫脹、および疼痛として症状発現する。

0016

炎症に至る損傷/機能不全をもたらす炎症のフィードフォワードループは、臓器機能不全および死亡を促進する持続性の調節解除された炎症をもたらし得る。適正な組織治癒には、良好に調節された炎症応答が必要である。

0017

傷害後の皮膚の完全性およびホメオスターシスの回復は、修復応答:炎症、組織形成、および成熟の連続的なフェーズを達成するために、組織常在造血細胞および動員された造血細胞と一緒に、上皮および間葉細胞の複雑でダイナミックな相互作用を必要とする。修復応答の初期段階では、炎症フェーズが優勢であり、これは、先天免疫系が局所活性化して、好中球の即時の流入、その後に続く、マクロファージに分化する血液単球侵襲が生じることによって特徴づけられる。

0018

修復応答の中間段階は、組織形成のフェーズを包含し、これは、皮膚創傷空間を再充填する肉芽組織の発生によって特徴づけられる。肉芽組織形成は、血管新生をもたらす内皮細胞の侵襲、線維芽細胞の流入、および追加のマクロファージの蓄積を包含する。

0019

暫定的な細胞外創傷マトリックス堆積は、細胞の接着遊走、および増殖を促進する。さらに、創傷周辺部では、複雑な表皮間葉相互作用が、角化細胞の増殖および遊走を刺激して、表皮バリアを回復させる。

0020

創傷空間が再充填され、被覆する表皮が回復するまで、肉芽組織形成は続く。表皮バリアが完成すると、修復応答は、後期段階入り、これは、組織成熟によって特徴づけられる。組織成熟のフェーズの間に、肉芽組織は、瘢痕組織に変化する。

0021

皮膚の修復の間、常在細胞、さらには、動員された炎症性細胞の先天免疫応答は、侵襲性微生物戦い壊死組織切除に寄与するが、多種多様増殖因子の放出による修復プロセスもサポートし得る。

0022

しかしながら、炎症誘発性および細胞傷害性メディエーターの放出によって、マクロファージの制御から逸脱した活性は、組織修復にとって有害でもあり得る。

0023

マクロファージの数の上昇によって特徴づけられるアンバランスな炎症は、ヒト疾患において、修復応答の減弱の顕著な特徴であり、非治癒性慢性創傷の形成をもたらす。非治癒性慢性創傷に寄与する追加の因子は、例えば、糖尿病、静脈または動脈疾患、感染、および高齢者における代謝不全である。

0024

慢性創傷を処置するために、感染を処置するための抗生物質の使用、壊死組織切除、陰圧補助閉鎖、および酸素付加を包含する様々な方法が存在する。

0025

さらなる方法には、例えば、増殖因子の適用が包含される。

0026

例えば、ベカプレルミンは、組換え型ヒト血小板由来増殖因子BBである。ベカプレルミンは、商品名Regranexで販売されており、皮下組織内に、またはそれを越えて伸長し、十分な血液供給を有する下肢糖尿病性神経障害潰瘍の処置に適応とされる。

0027

ベカプレルミンはさらに、初期の高度創面清掃術、圧力放出、および感染制御を包含する足部潰瘍の治療実施に対する補助剤として(代替としてではない)適応とされる。

0028

しかしながら、市販後の後向きコホート研究において、悪性腫瘍に次ぐ死亡率の上昇が、3本以上のチューブのRegranexジェルで処置された患者において観察された。

0029

使用される別の増殖因子は、商品名REGEN−Dジェルで販売されており、慢性糖尿病性足部潰瘍を処置するために使用される組換え型ヒト表皮増殖因子である。

0030

さらに、トラフェルミンは、商品名「Fiblast Spray」で販売されているヒト線維芽細胞増殖因子2の組換え型である。トラフェルミンは、圧迫潰瘍、ならびに熱傷潰瘍および黒色潰瘍を包含する他の皮膚潰瘍を処置するために使用される。

0031

足部潰瘍の慢性糖尿病性神経障害性潰瘍に罹患している患者に対して、6週間にわたってトラフェルミンまたはプラセボ毎日適用した後に、週1回の臨床検査およびコンピュータ写真によって、サイズが評価された。潰瘍の外周および面積の週ごとの低減は、両方の群で同一であり、処置のエントリーから6週目まで、直線的な進行速度も同様であった。さらに、研究の終了時での治癒面積パーセンテージが、有意に異なることはなかった。Richardset al.(1995)によれば、足の慢性神経障害性糖尿病性潰瘍治癒について、トラフェルミンの局所適用は、プラセボを上回る利点を有さなかった。

0032

罹患創傷面に適用した後に、様々な増殖因子を分泌するヒト胚細胞を含有する2種の皮膚代替物も市販されている。

0033

皮膚代替物Dermagraftは、線維芽細胞、細胞外マトリックス、および生体吸収性スキャフォールドから構成される。Dermagrafは、寄付された新生児包皮組織に由来するヒト線維芽細胞から製造される。

0034

製造プロセス中に、ヒト線維芽細胞は、生体吸収性ポリグラクチンスキャフォールド上に播種される。

0035

市販の皮膚代替物Apligrafは、新生児包皮に由来する2種の細胞種を含有する。生きたヒト角化細胞および線維芽細胞が、創傷1型コラーゲンマトリックス包埋される。

0036

上述の皮膚代替物の欠点は、製造プロセスから生じる相当する高価格である。例えば、母体血液は、免疫不全ウイルス1および2型B型肝炎ウイルスC型肝炎ウイルス梅毒、ヒトTリンパ好性ウイルス1および2型、さらには、エプスタインバールウイルスなどのヒトウイルスでの感染の証拠について検査される。

0037

さらなる市販品が、商品名Procurenで販売されている。Procurenは、非治癒性創傷を処置するための血小板由来創傷治癒配合物である。Procurenは、患者の血液サンプルから調製される自己血小板由来産物である。

0038

しかしながら、慢性非治癒性創傷を処置するための、または急性外科的創傷などの他の状態を処置するための、自己血小板由来増殖因子を包含する自己血小板由来産物の有効性に関する証拠は十分に存在しない。

0039

さらに、上述の皮膚代替物、さらには、自己血小板由来産物によって供給される増殖因子の量は、出発物質品質に応じて、著しく変動する。

発明が解決しようとする課題

0040

本発明の目的は、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全に対して有益な因子を容易に適用することができる、炎症性皮膚機能不全、特に、慢性炎症性皮膚機能不全の代替処置を可能にすることである。

0041

さらに、治癒をサポートする有益な因子を制御量で、炎症性皮膚機能不全を処置するために提供すべきである。

課題を解決するための手段

0042

本発明の目的は、第1の異種因子をコードする核酸配列複数可)、第2の異種因子をコードする核酸配列(複数可)、および好ましくは第3の異種因子をコードする核酸配列(複数可)を含むが、ただし、第1の因子、第2の因子、および第3の因子は、相互に機能的に異なり、その際、第1の因子は、増殖因子であり、第2の因子は、M2分極化因子からなる群から選択され、好ましくは、第3の因子は、M2分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする、請求項1に記載の組換え型プロバイオティクス細菌を提供することによって解決される。

0043

好ましくは、請求項1に記載の組換え型プロバイオティクス細菌は、第1の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、第2の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、および第3の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列を含むが、ただし、第1の因子、第2の因子、および第3の因子は、相互に機能的に異なり、その際、第1の因子は、増殖因子であり、第2の因子は、M2分極化因子からなる群から選択され、第3の因子は、M2分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする。

0044

組換え型プロバイオティクス細菌の好ましい実施形態は、従属請求項2〜22において開示されている。

0045

本発明の目的はさらに、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の処置において使用するための、請求項17に記載の組換え型プロバイオティクス細菌を提供することによって解決され、その組換え型プロバイオティクス細菌は、第1の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、および第2の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列を含み、その際、第1の因子は、増殖因子であり、第2の因子は、M2分極化因子からなる群から選択される。

0046

好ましくは、請求項17に記載の組換え型プロバイオティクス細菌は、第1の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、第2の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、および第3の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列を含むが、ただし、第1の因子、第2の因子、および第3の因子は、相互に機能的に異なり、その際、第1の因子は、増殖因子であり、第2の因子は、M2分極化因子からなる群から選択され、第3の因子は、M2分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする。

0047

本発明の目的はさらに、請求項23に記載の、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全を処置するための方法を提供することによって解決され、その方法は、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌を、皮膚機能不全に罹患している個体に投与するステップを含む。

0048

本発明者らは意外にも、上述の核酸配列を含む組換え型プロバイオティクス細菌を、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の処置において使用することができるであろうことを見い出した。

0049

本発明の好ましい実施形態は、従属請求項において開示されている。

0050

本発明によれば、「機能的に異なる因子」または「相互に機能的に異なる」という用語は、個々の因子が好ましくは、異なる受容体に結合し、および/または標的細胞において、異なる第2のメッセンジャーを活性化させることを意味する。第2のメッセンジャーは、細胞によって放出されて、生理学的変化を開始させる細胞内シグナル伝達分子である。

0051

本発明によれば、因子の「機能的類似体」という用語は、個々の因子と同一の受容体(複数可)に結合し、かつ好ましくは、標的細胞において、同一の第2のメッセンジャーを活性化させる作用物質を意味する。

0052

例えば、ナイシンの機能的類似体は、成熟ナイシン分子またはその機能的類似体のための受容体として作用し、かつ好ましくは、NisRのその後のリン酸化をもたらすNisKに結合する。リン酸化NisRは、個々のナイシンプロモーターからの転写誘導する。

0053

好ましくは、第1、第2、および第3の異種因子の「機能的類似体」は、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも93%、さらに好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも97%のアミノ酸配列配列同一性を有する。

0054

本発明によれば、「異種因子」という用語は、使用されるプロバイオティクス細菌内に自然発生していないか、またはそれよって発現されない因子、好ましくはタンパク質を意味する。

0055

「機能的類似体」は、バイオシミラーとも呼ばれ得る。

0056

「異種因子(複数可)」に一般に言及する場合、または例えば、FGF−2、IL−4、CSF−1などの具体的な「異種因子(複数可)」に言及する場合、この用語が、その機能的類似体(複数可)も包含することが意図されている。

0057

上述の核酸配列を含む組換え型プロバイオティクス細菌は、常に、および/または誘導されると、個々の核酸配列を転写および翻訳することによって、個々の第1、第2、および、好ましくは第3の異種因子の独特組合せを産生することができる。

0058

因子のこの独特の組合せは、少なくとも1種の増殖因子、および少なくとも1種のM2分極化因子を含む。

0059

好ましくは、因子のこの独特の組合せは、増殖因子、第1のM2分極化因子、および第1のM2分極化因子とは異なる第2のM2分極化因子を含む。別法では、因子のこの独特の組合せは、第1の増殖因子、M2分極化因子、および第1の増殖因子とは異なる第2の増殖因子を含む。

0060

組換え型プロバイオティクス細菌は、好ましくは、請求項1において列挙したとおりの様々な少なくとも2種、好ましくは少なくとも3種の異種因子を、罹患組織送達して、局所免疫系をモジュレートし、治癒を可能にする。

0061

好ましくは、組換え型プロバイオティクス細菌は、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全への適用後に、個々の第1の異種因子および第2の異種因子、および好ましくは第3の異種因子を放出する。

0062

さらに、本発明において使用される組換え型プロバイオティクス細菌は、好ましくは、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の部位への適用後に、個々の第1の異種因子および第2の異種因子、および好ましくは第3の異種因子のコンスタントな放出を提供する。

0063

それによって、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全に罹患している対象のために、かなり改善され、より安全で、かつより費用対効果の高い処置オプション利用可能である。

0064

好ましくは、細菌から放出された後の個々の第1、第2、および第3の異種因子は、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の治癒をサポートする生物学的活性機能を発揮する。

0065

第1の異種因子は、増殖因子である。

0066

好ましくは、増殖因子は、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血管内皮細胞増殖因子VEGF)、表皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF−ベータ)、神経成長因子(NGF)、アクチビン、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物からなる群から選択される。

0067

もちろん、上述もしくは下述する因子の機能的類似体またはそれらのバイオシミラーも、特許請求の範囲において記載するとおり、本発明の範囲内で使用することができる。

0068

線維芽細胞増殖因子は、血管新生、創傷治癒、および様々な内分泌シグナル伝達経路に関係する増殖因子のファミリーである。

0069

ヒトでは、FGFファミリーの22のメンバー、FGF−1〜FGF−14およびFGF−16〜FGF−23が同定されており、これらを、本発明において使用することができる。

0070

FGF−1からFGF−10は、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)に結合する。

0071

線維芽細胞増殖因子1は、酸性線維芽細胞増殖因子としても公知である。線維芽細胞増殖因子2は、塩基性線維芽細胞増殖因子としても公知である。さらに、線維芽細胞増殖因子7は、角化細胞成長因子(KGF)としても公知であり、線維芽細胞増殖因子10は、角化細胞成長因子2(KGF−2)としても公知である。

0072

好ましい一実施形態では、線維芽細胞増殖因子は、FGF−1、FGF−2、FGF−3、FGF−4、FGF−5、FGF−6、FGF−7、FGF−8、FGF−9、FGF−10、およびそれらの混合物、さらに好ましくはFGF−1、FGF−2、FGF−7、FGF−10、およびそれらの混合物、さらに好ましくは、FGF−2、FGF−7、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物からなる群から選択され、さらに好ましくは、FGF−2である。

0073

例えば、FGF−1およびFGF−2は、血管新生を刺激することができ、かつ線維芽細胞および角化細胞を包含する、炎症性皮膚機能不全の部位に存在する複数の細胞種について、分裂促進性である。さらに、FGF−7は、パラ分泌的に、創傷の再上皮形成を刺激し得る。

0074

線維芽細胞増殖因子2(FGF−2)、好ましくはヒト線維芽細胞増殖因子2(hFGF−2)は、創傷治癒および腫瘍増殖を包含する多様な生物学的プロセスに関与している。

0075

この遺伝子のためのmRNAは、複数のポリアデニル化部位を含有し、他には、非AUGおよびAUG開始コドンから翻訳されて、別個の特性を有する5種の異なるアイソフォームをもたらす。非AUGアイソフォームは、核に局在化されており、かつイントラクライン作用を担っている一方で、AUG開始形態は、大部分、細胞質ゾルであり、かつFGF−2のパラ分泌および自己分泌作用を担っている。

0076

ヒト線維芽細胞増殖因子2(hFGF−2)のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_002006.4で入手可能である。AUG−異性体の個々のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001997.5、さらには、UniProt受入番号P09038−version182で入手可能であり、図22aにおいても示されている。

0077

プレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜142に及ぶプロペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸143〜288に及ぶ成熟ヒト線維芽細胞増殖因子2ペプチドを包含する。

0078

好ましい一実施形態では、線維芽細胞増殖因子2は、配列番号26〜30のアミノ酸配列の1つまたは少なくとも1つ、さらに好ましくは配列番号28のアミノ酸配列を含む。配列番号28のアミノ酸配列は、図22bにおいて示されている。

0079

インスリン様成長因子(IGF)は、インスリンと高い配列類似性を有するタンパク質である。インスリン様成長因子は、2種のタンパク質IGF−1およびIGF−2を含み、これらを、本発明において使用することができる。

0080

表皮成長因子(EGF)のファミリーは、高度に類似する構造的および機能的特徴を有するタンパク質であり、タンパク質の表皮成長因子(EGF)、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF−α)、アンフィレグリン(AR)、エピレグリンEPR)、エピジェン(EPGN)、ベータセルリンBTC)、ニューレグリン−1(NRG1)、ニューレグリン−2(NRG2)、ニューレグリン−3(NRG3)、およびニューレグリン−4(NRG4)、好ましくは表皮成長因子(EGF)、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF−α)、アンフィレグリン(AR)、エピレグリン(EPR)、エピジェン(EPGN)、およびベータセルリン(BTC)、さらに好ましくは表皮成長因子(EGF)、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)、およびトランスフォーミング増殖因子−α(TGF−α)を含み、これらを、本発明において使用することができる。

0081

表皮成長因子(EGF)、好ましくはヒト表皮成長因子(hEGF)は、in vivoおよびin vitroにおいて様々な表皮および上皮性組織の、かつ細胞培養において一部の線維芽細胞の増殖を刺激する。さらに、hEGFは、in vivoにおいて、特異的な細胞の分化に対して非常に大きな効果を有し、外胚葉および中胚葉由来の両方の様々な培養細胞のための強力な分裂促進因子である。

0082

ヒト表皮成長因子は、選択的スプライシングによって産生される少なくとも3種のアイソフォームで存在する。

0083

ヒト表皮成長因子アイソフォーム1プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001954.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001963.2で入手可能である。

0084

アイソフォーム1のプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜22に及ぶシグナルペプチド、プレプロタンパク質のアミノ酸23〜1207に及ぶプロペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸971〜1023に及ぶ成熟ヒト表皮成長因子ペプチドを包含する。

0085

ヒト表皮成長因子アイソフォーム2プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001171601.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001178130.1で入手可能である。ヒト表皮成長因子アイソフォーム3プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001171602.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001178131.1で入手可能である。ヒト表皮成長因子アイソフォーム1〜3のアミノ酸配列は、UniProt受入番号P01133−version180でも入手可能であり、図25a〜25cにおいても示されている。成熟ヒト表皮成長因子のアミノ酸配列は、図25dにおいて示されている。

0086

ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)、好ましくはヒトヘパリン結合性EGF様増殖因子(hHB−EGF)は、皮膚創傷治癒に必要とされる上皮形成において重要な増殖因子である。hHB−EGFは、角質細胞および線維芽細胞に対して、分裂促進性および遊走性作用を有する。hHB−EGFはさらに、創傷治癒に必要な皮膚修復および血管新生を促進する。hHB−EGFは、創傷液の主たる成分である。hHB−EGFは、マクロファージ、単球、および角化細胞によって放出される。さらに、へパラ硫酸プロテオグリカンへのhHB−EGF細胞表面の結合は、皮膚創傷治癒の速度を上げ、ヒト皮膚移植治癒時間を短縮する能力を促進する分裂促進因子を増強し、かつ潰瘍、熱傷、および表皮中層創傷の迅速な治癒を促進する。

0087

ヒトヘパリン結合性EGF様増殖因子プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001936.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001945.2で入手可能である。

0088

ヒトヘパリン結合性EGF様増殖因子の前駆体は、前駆体のアミノ酸1〜19に及ぶシグナルペプチド、前駆体のアミノ酸20〜208に及ぶプロヘパリン結合性EGF様増殖因子、および前駆体のアミノ酸63〜148に及ぶ成熟ヒト表皮成長因子ペプチドを包含する。

0089

ヒトヘパリン結合性EGF様増殖因子のアミノ酸配列は、UniProt受入番号Q99075−version 151でも入手可能であり、かつ図26aにおいても示されている。成熟ヒトヘパリン結合性EGF様増殖因子のアミノ酸配列は、図26bにおいて示されている。

0090

トランスフォーミング増殖因子−α(TGF−α)、好ましくはヒトトランスフォーミング増殖因子−α(hTGF−α)は、マクロファージ、脳細胞、および角化細胞において産生され得る。hTGF−αは、上皮発生を誘導する。hTGF−αおよびhEGFは、同じ受容体、上皮成長因子受容体(EGFR;ErbB−1;ヒトではHER1)に結合する。TGF−αがEGFRに結合すると、これは、創傷治癒を包含する複数の細胞増殖事象を開始させ得る。

0091

ヒトトランスフォーミング増殖因子−αは、選択的スプライシングによって産生される少なくとも5種のアイソフォームで存在する。

0092

ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム1プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_003227.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_003236.2で入手可能である。

0093

ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム1の前駆体は、前駆体のアミノ酸1〜23に及ぶシグナルペプチド、前駆体のアミノ酸24〜160に及ぶプロトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム1、および前駆体のアミノ酸40〜89に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子アルファペプチドを包含する。

0094

ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム2プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001093161.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001099691.1で入手可能である。

0095

ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム3プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001295087.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001308158.1で入手可能である。

0096

ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム4プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001295088.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001308159.1で入手可能である。

0097

ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム5プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号AAF05090.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号AF149097.1で入手可能である。

0098

ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム1〜5の前駆体のアミノ酸配列は、UniProt受入番号P01135−version 168でも入手可能であり、図27a〜27eにおいて示されている。成熟ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファのアミノ酸配列は、図27fにおいて示されている。

0099

アンフィレグリン(AREG)、好ましくはヒトアンフィレグリン(hAREG)は、EGF受容体の別のリガンドである。ヒトアンフィレグリンは、星状細胞シュバン細胞、および線維芽細胞を包含する幅広い範囲の標的細胞のための自己分泌増殖因子、さらには、分裂促進因子である。ヒトアンフィレグリンは、上皮細胞の増殖を促進する。

0100

ヒトアンフィレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001648.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001657.3で入手可能である。

0101

ヒトアンフィレグリンプレプロタンパク質の前駆体は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜19に及ぶシグナルペプチド、プレプロタンパク質のアミノ酸20〜100に及ぶプロペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸101〜187に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子アルファペプチドを包含する。

0102

ヒトアンフィレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列は、UniProt受入番号P15514−version 147でも入手可能であり、かつ図28aにおいても示されている。成熟ヒトアンフィレグリンのアミノ酸配列は、図28bにおいて示されている。

0103

エピレグリン(EPR)、好ましくはヒトエピレグリン(hEPR)は、細胞増殖および/または血管新生を刺激し得るEGF受容体のリガンドである。

0104

ヒトエピレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001423.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001432.1で入手可能である。

0105

ヒトエピレグリンのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜29に及ぶシグナルペプチド、プレプロタンパク質のアミノ酸30〜169に及ぶプロエピレグリン、およびプレプロタンパク質のアミノ酸60〜108に及ぶ成熟エピレグリンを包含する。

0106

ヒトエピレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列は、UniProt受入番号O14944−version 146でも入手可能であり、図29aにおいても示されている。成熟ヒトエピレグリンのアミノ酸配列は、図29bにおいて示されている。

0107

エピジェン(EPGN)、好ましくはヒトエピジェン(hEPGN)は、上皮細胞の増殖を促進する。ヒトエピジェンは、選択的スプライシングによって産生される少なくとも7種のアイソフォームで存在する。

0108

ヒトエピジェンアイソフォーム1前駆体のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001257918.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001270989.1で入手可能である。

0109

ヒトエピジェンアイソフォーム1前駆体は、前駆体のアミノ酸1〜22に及ぶシグナルペプチド、および前駆体のアミノ酸23〜154に及ぶ成熟エピレグリンを包含する。

0110

ヒトエピジェンアイソフォーム1〜7前駆体のアミノ酸配列は、UniProt受入番号Q6UW88−version 101でも入手可能であり、かつ図30a〜30gにおいても示されている。成熟ヒトエピジェンのアミノ酸配列は、図30hにおいて示されている。

0111

ベータセルリン(BTC)、好ましくはヒトベータセルリン(hBTC)は、上皮成長因子受容体にも結合し、かつ、広範な成体組織によって、かつ平滑筋細胞および上皮細胞を包含する多くの培養細胞において合成される増殖因子である。ヒトプロベータセルリン前駆体のアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001720.1で入手可能である。対応するmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001729.1で入手可能である。

0112

ヒトプロベータセルリンの前駆体は、前駆体のアミノ酸1〜31に及ぶシグナルペプチド、前駆体のアミノ酸32〜178に及ぶプロベータセルリン、および前駆体のアミノ酸32〜111に及ぶ成熟ベータセルリンを包含する。

0113

ヒトプロベータセルリン前駆体のアミノ酸配列は、UniProt受入番号P35070−version 139でも入手可能であり、かつ図31aにおいても示されている。成熟ヒトベータセルリンのアミノ酸配列は、図31bにおいて示されている。

0114

インスリン様成長因子1(IGF−1)は、ソマトメジンCとも呼ばれる。ヒトIGF−1のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_000618.2で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_000609.1、さらに、UniProt受入番号P05019−version 178で入手可能である。

0115

そのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜21に及ぶシグナルペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸49〜118に及ぶヒトインスリン様成長因子1ペプチドを包含する。

0116

ヒトインスリン様成長因子2(hIGF−2)のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_000612.4で入手可能である。ヒトインスリン様成長因子2プレプロタンパク質の対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_000603.1、さらには、UniProt受入番号P01344−version 192で入手可能である。

0117

そのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜24に及ぶシグナルペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸25〜91に及ぶインスリン様成長因子2の成熟鎖を包含する。

0118

血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のファミリーは、VEGF−A、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、および胎盤増殖因子PGF)を包含する増殖因子の群であり、これらを、本発明において使用することができる。

0119

好ましい一実施形態では、血管内皮細胞増殖因子は、血管内皮細胞増殖因子A(VEGF−A)である。

0120

VEGF−Aは、血管新生、脈管形成、および内皮細胞増殖を誘導し得る。

0121

ヒト血管内皮細胞増殖因子A(hVEGF−A)のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001025366.1で入手可能である。ヒト血管内皮細胞増殖因子Aの対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001020537.2、さらには、UniProt受入番号P15692−version 197で入手可能である。

0122

ヒト血管内皮細胞増殖因子Aの前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質のアミノ酸1〜26に及ぶシグナルペプチド、さらには、前駆体タンパク質のアミノ酸27〜232に及ぶ成熟ヒト血管内皮細胞増殖因子Aを包含する。

0123

血小板由来増殖因子(PDGF)は、細胞増殖および分化を調節する。ヒト血小板由来増殖因子(hPDGF)は、個々のサブユニットホモまたはヘテロ二量体のいずれかを形成する4種のサブユニット、PDGF−A、PDGF−B、PDGF−C、およびPDGF−Dを有し、これらを、本発明において使用することができる。

0124

好ましくは、血小板由来増殖因子は、PDGF−AA、PDGF−BB、PDGF−AB、PDGF−CC、PDGF−DD、またはそれらの混合物である。

0125

さらに好ましくは、血小板由来増殖因子は、2個のPDGF−Aサブユニットから構成される二量体タンパク質、2個のPDGF−Bサブユニットから構成される二量体糖タンパク質、1個のPDGF−Aサブユニットおよび1個のPDGF−Bサブユニットから構成される二量体糖タンパク質、またはそれらの混合物である。

0126

ヒト血小板由来増殖因子サブユニットA(hPDGF−A)のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_002607.4で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_002598.4、さらには、UniProt受入番号P04085−version 159で入手可能である。

0127

ヒトPDGF−Aサブユニットの対応するプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜20に及ぶシグナルペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸87〜211に及ぶ成熟ヒト血小板由来増殖因子サブユニットAをコードする。

0128

ヒト血小板由来増殖因子サブユニットB(hPDGF)のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_002608.1で入手可能である。ヒト血小板由来増殖因子サブユニットプレプロタンパク質の対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_002599.1、さらには、UniProt受入番号P01127−version 181で入手可能である。

0129

ヒトPDGF−Bサブユニットのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜20に及ぶシグナルペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸82〜190に及ぶヒト血小板由来増殖因子サブユニットBの成熟型をコードする。

0130

肝細胞増殖因子HGF)は、間葉細胞によって分泌され、かつ主に上皮細胞および内皮細胞に対して作用するが、造血前駆細胞に対しても作用する増殖因子であり、本発明において使用することができる。

0131

HGFは、1つのプレプロタンパク質として分泌され、セリンプロテイナーゼによって、69kGaアルファ鎖および34kDaベータ鎖に切断される。プレプロタンパク質、さらには、対応するアルファおよびベータ鎖のアミノ酸配列は、図23a〜23cにおいて示されている。

0132

ヒト肝細胞増殖因子(hHGF)のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_000601.3で入手可能である。ヒト肝細胞増殖因子プレプロタンパク質の対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_000592.3、さらには、UniProt受入番号P14210−version 186で入手可能である。

0133

そのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸1〜31に及ぶシグナルペプチド、プレプロタンパク質のアミノ酸32〜494に及ぶヒト肝細胞増殖因子アルファ鎖、およびプレプロタンパク質のアミノ酸495〜728に及ぶヒト肝細胞増殖因子ベータ鎖を包含する。

0134

トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)、好ましくはヒトトランスフォーミング増殖因子β(hTGF−β)は、マクロファージを包含する多くの細胞種によって分泌されるサイトカインである。

0135

TGF−βは、少なくとも3種のアイソフォーム、TGF−β1、TFG−β2、およびTGF−β3で存在し、これらを、本発明において使用することができる。対応する前駆体タンパク質および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、図21a〜21gにおいて示されている。

0136

ヒトトランスフォーミング増殖因子β1は、潜在関連ペプチドLAP)および成熟TGF−β1ペプチドへと切断される分泌タンパク質である。成熟ペプチドは、他のTGF−βファミリーメンバーと共にTGF−β1ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかを形成し得る。

0137

ヒトトランスフォーミング増殖因子β1前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_000660.4によって得ることができる。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_000651.3またはUniProt受入番号P01137−version 199で入手可能である。

0138

ヒトTGF−β1前駆体のアミノ酸配列は、前駆体タンパク質のアミノ酸1〜29に及ぶシグナルペプチド、前駆体タンパク質のアミノ酸30〜278に及ぶ潜在関連ペプチド、および前駆体タンパク質のアミノ酸279〜390に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子β1を包含する。

0139

トランスフォーミング増殖因子β2(TGF−β2)、好ましくはヒトトランスフォーミング増殖因子β2(hTGF−β2)は、多くの細胞種の増殖、分化、接着、および遊走を調節する多機能型サイトカインである。

0140

別に、ヒトトランスフォーミング増殖因子β2遺伝子のスプライシングされた転写変異体が同定されており、それらは、2種の異なるアイソフォームをコードする。

0141

ヒトヒトトランスフォーミング増殖因子ベータ2アイソフォーム1前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001135599.3で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001129071.1で入手可能である。

0142

ヒトトランスフォーミング増殖因子ベータ2アイソフォーム1前駆体は、前駆体タンパク質のアミノ酸1〜20に及ぶシグナルペプチド、前駆体タンパク質のアミノ酸21〜302に及ぶ潜在関連ペプチド、および前駆体タンパク質のアミノ酸303〜414に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子ベータ2を包含する。

0143

ヒトトランスフォーミング増殖因子β2アイソフォーム2前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_003238.3で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_003229.1で入手可能である。その前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質のアミノ酸1〜20に及ぶシグナルペプチド、前駆体タンパク質のアミノ酸21〜302に及ぶ潜伏関連ペプチド、および前駆体タンパク質のアミノ酸303〜414に及ぶ成熟TGF−β2ペプチドを包含する。

0144

トランスフォーミング増殖因子β2のアミノ酸配列はさらに、UniProt受入番号P61812−version 128で入手可能である。

0145

トランスフォーミング増殖因子β3(TGF−β3)、好ましくはヒトトランスフォーミング増殖因子β3(hTGF−β3)は、胚形成および細胞分化に関係する分泌サイトカインである。

0146

ヒトトランスフォーミング増殖因子β3前駆体タンパク質のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_003239.3で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_003230.1、さらには、UniProt受入番号P10600−version 170で入手可能である。

0147

その前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質のアミノ酸1〜23を包含するシグナルペプチド、前駆体タンパク質のアミノ酸24〜30を包含する潜伏関連ペプチド、および前駆体タンパク質のアミノ酸301〜412に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子β3ペプチドを包含する。

0148

好ましくは、トランスフォーミング増殖因子βは、配列番号19〜25のアミノ酸配列の1つまたは少なくとも1つを含む。

0149

アクチビンは、下垂体卵胞刺激ホルモンFSH)放出を刺激するタンパク質として、生殖腺液から元々は精製されたジスルフィド結合二量体タンパク質である。アクチビンタンパク質は、中胚葉誘導神経細胞分化、骨リモデリング、造血、および生殖生理における役割を包含する広範な生物学的活性を有する。

0150

アクチビンは、様々なベータサブユニットアイソフォームのホモ二量体またはヘテロ二量体である一方で、インヒビンは、1個の独特のアルファサブユニットおよび様々なベータサブユニットの1個のヘテロ二量体である。

0151

4種のベータサブユニット、ベータA、ベータB、ベータC、およびベータEが公知である。

0152

第2の異種因子は、M2分極化因子からなる群から選択される。

0153

好ましくは、M2分極化因子は、非分極化マクロファージ、M1分極化マクロファージ、さらには、未分化単球、および他のマクロファージ前駆細胞に対して作用する。

0154

さらに好ましくは、M2分極化因子は、非分極化マクロファージ、M1分極化マクロファージ、さらには、未分化単球、および他のマクロファージ前駆細胞のM2分極化を誘導する。

0155

マクロファージが、局所組織環境に応じて、特異的な分化を受け得ることは、当業者には公知である。T−ヘルパー1型(TH1)およびT−ヘルパー2型(TH2)分極化と同様に、マクロファージの分極化の2つの別個の状態:典型的な活性化(M1分極化)マクロファージ表現型および別の活性化(M2分極化)マクロファージ表現型が明らかにされている。

0156

M2分極化マクロファージ表現型は、遺伝子発現プロファイルに基づき、サブセット:M2a分極化、M2b分極化、およびM2c分極化表現型にさらに区分され得る。

0157

M1分極化およびM2分極化マクロファージは、別個のケモカインおよびケモカイン受容体プロファイルを有する。

0158

M1分極化マクロファージは好ましくは、TH1細胞誘引性ケモカインであるケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド9(CXCL9)およびC−X−Cモチーフケモカイン10(CXCL10)を分泌する。M2分極化マクロファージは好ましくは、ケモカインであるケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド17(CCL17)、C−Cモチーフケモカイン22(CCL22)、およびケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド24(CCL24)を分泌する。

0159

異種因子のM2分極化作用は、例えば、非分極化マクロファージ、M1分極化マクロファージ、またはマクロファージ前駆細胞、好ましくは単球が、少なくとも1種のM2分極化因子と接触すること、およびその後で、M2分極化マーカーの発現および/または分泌を決定することによって決定され得る。

0160

例えば、マウス非分極化マクロファージ細胞系、マウスM1分極化マクロファージ細胞系、またはマウスマクロファージ前駆細胞系、好ましくはマウス単球細胞系を、少なくとも1種のM2分極化因子と接触させて、マウスM2分極化マクロファージ細胞系を生成することができる。マウスマクロファージ細胞系のM2分極化は、例えば、次の因子の発現を決定することによって検出され得る:アルギナーゼ1(Arg1)、インターロイキン10(IL−10)、マンノース受容体C1型(Mrc1)、およびYm1(Tリンパ球由来好酸球走化性因子(ECF−L)またはキチナーゼ様タンパク質3(Chil3)とも呼ばれる)。マウスマクロファージ細胞系のM1分極化は、例えば、次の因子の発現および/または放出を決定することによって検出され得る:腫瘍壊死因子アルファ(TNFアルファ、TNFα)、インターロイキン6(IL−6)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド2(CCL2)、およびケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド4(CCL4)。

0161

好ましくはヒトM2分極化マクロファージは、少なくとも1種のM2分極化因子と共にインキュベートされたヒト単球に由来する。ヒト単球に由来するマクロファージのM2分極化は、例えば、次の因子の発現および/または放出を決定することによって検出され得る:インターロイキン1受容体アンタゴニスト(IL1RA)、プロスタグランジンE2(PGE2)、インターロイキン10(IL−10)、およびトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF−β)。

0162

近年、in vitroで、サイトカイン環境の変化に応じて、マクロファージは、M2からM1へと逆分極化することができ、その逆も同様であることが実証されている(Davis et al.(2013))。さらに、分極化の変化は、迅速であり、遺伝子発現、タンパク質、代謝産物、および殺菌活性のレベルで生じる。

0163

さらに、マクロファージは、固形腫瘍と関連する浸潤性白血球の主たる集団の1つである。腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、腫瘍免疫において重要な役割を果たし、M2d TAM分極化とも呼ばれる、M2分極化と同様の機能を示す。

0164

個々の分極化(M1、M2a、M2b、M2c、およびM2d TAM)の刺激および/または活性化に必要なそれぞれの因子は、当業者に公知であり、例えば、Hao et al.(2012)またはDuluc et al.(2007)において開示されている。

0165

好ましくは、個々の第2の異種因子および、任意選択で、第3の異種因子は、組換え型プロバイオティクス細菌における発現、および細菌から、炎症性、好ましくは、慢性炎症性皮膚機能不全の部位への放出の後に、M2分極化を誘導する。

0166

次いで、抗炎症性M2分極化マクロファージは好ましくは、血管新生、結合組織付着、および創傷修復を促進し、これが、処置を受ける炎症性、好ましくは、慢性炎症性皮膚機能不全の改善、好ましくは治癒をもたらす。

0167

好ましい一実施形態では、M2分極化因子は、M2分極化サイトカイン、M2分極化ケモカイン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、M2分極化因子は、M2c分極化を誘導する。

0168

さらに好ましくは、M2分極化因子は、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン10(IL−10)、インターロイキン13(IL−13)、コロニー刺激因子−1(CSF1)、インターロイキン34(IL34)、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物、好ましくは、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン10(IL−10)、インターロイキン13(IL−13)、コロニー刺激因子−1(CSF1)、インターロイキン34(IL34)、およびそれらの混合物、さらに好ましくは、コロニー刺激因子−1(CSF1)、インターロイキン34(IL34)、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン13(IL−13)、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物、さらに好ましくは、コロニー刺激因子−1(CSF1)、インターロイキン34(IL34)、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン13(IL−13)、およびそれらの混合物からなる群から選択される。

0169

インターロイキン4(IL−4)、好ましくはヒトインターロイキン4(hIL−4)は、多面発現性サイトカインである。インターロイキン4は、インターロイキン4受容体のリガンドである。インターロイキン4受容体は、インターロイキン13(IL−13)にも結合し、このことが、インターロイキン4およびインターロイキン13の多くの重複する機能に寄与し得る。

0170

インターロイキン4(IL−4)は、増殖誘導特性を有することも示されている。さらに、インターロイキン4(IL−4)は、コラーゲンの産生を誘導する。

0171

ヒトインターロイキン4アイソフォーム1前駆体のmRNAの核酸配列は、NCPI−受入番号NM_000589.3で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_000580.1で入手可能であり、図18aにおいて示されている。

0172

ヒトインターロイキン4アイソフォーム2前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_172348.2で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_758858.1で入手可能であり、図18bにおいて示されている。

0173

ヒトインターロイキン4のアミノ酸配列は、UniProt受入番号P05112−version 178でも入手可能である。

0174

そのアミノ酸配列は、インターロイキン4アイソフォーム1およびアイソフォーム2前駆体のアミノ酸1〜24に及ぶシグナルペプチドを含む。

0175

好ましくは、ヒトインターロイキン4は、配列番号10〜14のアミノ酸配列の1つまたは少なくとも1つを含む。

0176

インターロイキン13(IL−13)、好ましくはヒトインターロイキン13(hIL−13)は、活性化TH2細胞によって主に産生される免疫調節サイトカインである。

0177

ヒトインターロイキン13前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_002188.2で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_002179.2、さらには、UniProt受入番号P35225−version 157で入手可能であり、図20aにおいて示されている。

0178

インターロイキン13前駆体は、UniProt受入番号P35225−version 157で寄託されているインターロイキン13前駆体タンパク質のアミノ酸1〜24に及ぶシグナルペプチドを含む。

0179

好ましくは、インターロイキン13は、配列番号17および18のアミノ酸配列の1つまたは少なくとも1つを含む。

0180

インターロイキン10(IL−10)、好ましくはヒトインターロイキン10(hIL−10)は、主に単球によって、かつより少ない規模でリンパ球によって産生されるサイトカインである。インターロイキン10は、免疫調節および炎症において多面発現性作用を有する。例えば、インターロイキン10は、TH1サイトカインの発現をダウンレギュレートする。

0181

ヒトインターロイキン10前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_000572.2で見い出され得る。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_000563.1、さらには、UniProt受入番号P22301−version 156で見い出され得、かつ図19aにおいて示されている。

0182

ヒトインターロイキン10前駆体のアミノ酸配列は、ヒトインターロイキン10前駆体タンパク質のアミノ酸1〜18に及ぶシグナルペプチドを包含する。

0183

好ましくは、インターロイキン10は、配列番号15〜16のアミノ酸配列の1つまたは少なくとも1つを含む。

0184

マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)としても公知のコロニー刺激因子−1(CSF−1)は、マクロファージの産生、分化、および機能を制御するサイトカインである。

0185

選択的スプライシングによって、ヒトCSF−1は、種々のアイソフォームで存在し、これらを、本発明において使用することができる。

0186

マクロファージコロニー刺激因子1アイソフォームA前駆体とも呼ばれるヒトCSF−1アイソフォーム1のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_000757.5で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_000748.3で入手可能であり、図16aにおいて示されている。

0187

ヒトマクロファージコロニー刺激因子1アイソフォームB前駆体とも呼ばれるヒトCSF−1アイソフォーム2前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_172210.2で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_757349.1で入手可能であり、図16bにおいて示されている。

0188

マクロファージコロニー刺激因子1アイソフォームC前駆体とも呼ばれるヒトCSF−1アイソフォーム3前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_172211.3で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_757350.1で入手可能であり、図16cにおいて示されている。

0189

個々のアミノ酸配列は、UniProt受入番号P09603−version 158でも入手可能である。アイソフォーム1は、標準UniProt配列として選択されている。

0190

ヒトCSF−1前駆体アイソフォーム1〜3の個々のタンパク質配列は、個々のアミノ酸配列のアミノ酸番号1からアミノ酸番号32に及ぶN末端シグナルペプチドを包含する。

0191

ヒトCSF−1の活性型は、ジスルフィド結合ホモ二量体として細胞外で見い出され得る。活性型は、N末端シグナルペプチドの喪失をもたらす膜結合前駆体のタンパク質分解切断によって産生される。

0192

好ましくは、コロニー刺激因子1は、配列番号1〜6のアミノ酸配列の1つまたは少なくとも1つを含む。

0193

インターロイキン34(IL−34)は、単球およびマクロファージの分化および生存も促進するサイトカインである。

0194

選択的スプライシングによって、ヒトインターロイキン34は、2種のアイソフォームで存在し、これらを、本発明において使用することができる。

0195

ヒトインターロイキン34アイソフォーム1前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001172772.1で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001166243.1で入手可能であり、図17aにおいて示されている。

0196

ヒトインターロイキン34アイソフォーム2前駆体のmRNAの核酸配列は、NCBI受入番号NM_001172771.1で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、NCBI受入番号NP_001166242.1で入手可能であり、図17bにおいて示されている。

0197

個々のアミノ酸配列は、UniProt受入番号Q6ZMJ4−version 80でも入手可能である。

0198

ヒトインターロイキン34前駆体は、前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列のアミノ酸1〜20に及ぶシグナルペプチドを包含する。

0199

好ましくは、インターロイキン34は、配列番号7〜9のアミノ酸配列の1つまたは少なくとも1つを含む。

0200

好ましい一実施形態では、M2分極化因子は、コロニー刺激因子−1受容体への結合によって、単球およびマクロファージの分化および生存を促進する。

0201

マクロファージコロニー刺激因子受容体としても公知であるコロニー刺激因子−1受容体(CSF1R)は、細胞表面受容体として作用するチロシンタンパク質キナーゼであり、マクロファージおよび単球の生存、増殖、および分化の調節で必須の役割を果たす。

0202

CSF1Rは、例えば、CSF1Rリガンドの結合に応じて、炎症誘発性ケモカインの放出を促進し、それによって、先天免疫で、かつ炎症プロセスにおいて重要な役割を果たす。

0203

好ましくはM2分極化因子は、少なくとも1種のコロニー刺激因子−1受容体(CSF1R)リガンドである。

0204

CSF1Rリガンドは、当業者に公知であり、それには、インターロイキン34(IL−34)およびコロニー刺激因子1(CSF−1)が包含される。好ましくは、コロニー刺激因子−1受容体リガンドは、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、インターロイキン34(IL−34)、それらの機能的類似体、およびそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。

0205

さらに好ましくは、コロニー刺激因子−1受容体リガンドは、ヒトコニー刺激因子−1受容体リガンドであり、さらに好ましくは、ヒトコロニー刺激因子−1(hCSF−1)、ヒトインターロイキン34(hIL−34)、それらの機能的類似体、およびそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。

0206

さらに好ましい一実施形態では、コロニー刺激因子−1受容体リガンドは、配列番号1〜9のアミノ酸配列の1つまたは少なくとも1つを有するタンパク質である。

0207

好ましい一実施形態では、第1、第2、および/または第3の異種因子は、分泌シグナル配列、好ましくはN末端シグナルペプチドまたはプロペプチドと共に発現される。個々の因子の発現の後に、分泌シグナル配列、好ましくはN末端シグナルペプチドまたはプロペプチドは、翻訳後修飾によって除去され得る。別法では、第1、第2、および/または第3の異種因子は、成熟型で、好ましくは分泌シグナル配列、好ましくはN末端シグナルペプチドまたはプロペプチドを伴わずに発現され得るであろう。

0208

好ましい一実施形態では、請求項1に記載の組換え型プロバイオティクス細菌は、第1の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、第2の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、および第3の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列を含むが、ただし、第1の因子、第2の因子、および第3の因子が、相互に機能的に異なり、その際、第1の因子は、増殖因子であり、第2の因子は、M2分極化因子からなる群から選択され、第3の因子は、M2分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする。

0209

好ましい一実施形態では、第2の異種因子および第3の異種因子は、M2分極化因子からなる群から選択され、第2の因子および第3の因子は、機能的に異なるM2分極化因子である。

0210

これは、第2の異種因子が、第1のM2分極化因子でり、かつ第3の異種因子が、第1のM2分極化因子とは機能的に異なる第2のM2分極化因子であることを言っている。

0211

好ましくは、第1のM2分極化因子は、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、インターロイキン34(IL−34)、インターロイキン4(IL−4)、およびインターロイキン13(IL−13)からなる群から選択されるM2分極化因子であり、第2のM2分極化因子は、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、インターロイキン34(IL−34)、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン10(IL−10)、およびインターロイキン13(IL−13)からなる群から選択されるM2分極化因子であるが、ただし、第2のM2分極化因子は、第1のM2分極化因子とは機能的に異なることを条件とする。

0212

さらに好ましくは、第1のM2分極化因子は、コロニー刺激因子−1受容体(CSF1R)リガンドであり、かつ第2のM2分極化因子は、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン10(IL−10)、インターロイキン13(IL−13)、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物からなる群から選択されるM2分極化因子である。

0213

M2分極化因子のさらに好ましい組合せは、下記である:
・コロニー刺激因子−1およびインターロイキン4、
・コロニー刺激因子−1およびインターロイキン13、
・コロニー刺激因子−1およびインターロイキン10、
・インターロイキン34およびインターロイキン4、
・インターロイキン34およびインターロイキン13、
・インターロイキン34およびインターロイキン10、
・インターロイキン4およびインターロイキン10、または
・インターロイキン13およびインターロイキン10。

0214

M2分極化因子の上述のさらに好ましい組合せを、上述の増殖因子の少なくとも1種と、好ましくは、線維芽細胞増殖因子1、線維芽細胞増殖因子2、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子10、肝細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF−ベータ)、表皮増殖因子(EGF)、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF−α)、および血小板由来増殖因子BBからなる群から選択される増殖因子と、組み合わせる。

0215

好ましくは、第1、第2、および第3の異種因子は、下記の組合せである:
・線維芽細胞増殖因子2、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン4、
・線維芽細胞増殖因子2、インターロイキン34、およびインターロイキン4、
・線維芽細胞増殖因子2、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン13、
・線維芽細胞増殖因子2、インターロイキン34、およびインターロイキン13、
・線維芽細胞増殖因子2、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン10、
・線維芽細胞増殖因子2、インターロイキン34、およびインターロイキン10、
・線維芽細胞増殖因子7、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン4、
・線維芽細胞増殖因子7、インターロイキン34、およびインターロイキン4、
・線維芽細胞増殖因子7、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン13、
・線維芽細胞増殖因子7、インターロイキン34、およびインターロイキン13、
・線維芽細胞増殖因子7、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン10、
・線維芽細胞増殖因子7、インターロイキン34、およびインターロイキン10、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン4、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターロイキン34、およびインターロイキン4、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン13、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターロイキン34、およびインターロイキン13
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン10、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターロイキン34、およびインターロイキン10、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン4、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、インターロイキン34、およびインターロイキン4、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン13、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、インターロイキン34、およびインターロイキン13
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン10、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、インターロイキン34、およびインターロイキン10
・血小板由来増殖因子BB、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン4、
・血小板由来増殖因子BB、インターロイキン34、およびインターロイキン4、
・血小板由来増殖因子BB、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン13、
・血小板由来増殖因子BB、インターロイキン34、およびインターロイキン13
・血小板由来増殖因子BB、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン10、または
・血小板由来増殖因子BB、インターロイキン34、およびインターロイキン10。

0216

さらに好ましくは、第1、第2、および第3の異種因子は、線維芽細胞増殖因子2、コロニー刺激因子−1、およびインターロイキン4、それらの機能的類似体、およびそれらのバイオシミラーの組合せである。

0217

好ましくは、本発明のプロバイオティクス細菌から2種以上のM2分極化因子が放出されることによって、非分極化マクロファージ、M1分極化マクロファージ、さらには未分化単球、および他のマクロファージ前駆細胞のM2分極化がさらに促進される。

0218

代替の一実施形態では、第1の因子は、上述の増殖因子からなる群から選択される第1の増殖因子であり、第3の因子は、上述の増殖因子からなる群から選択され、かつ第1の増殖因子とは機能的に異なる第2の増殖因子である。好ましくは、第2の増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF−ベータ)である。

0219

増殖因子のさらに好ましい組み合わせは、下記である:
・線維芽細胞増殖因子1およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・線維芽細胞増殖因子2およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・線維芽細胞増殖因子7およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・線維芽細胞増殖因子10およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・血小板由来増殖因子BBおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・トランスフォーミング増殖因子アルファおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・表皮成長因子およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・ヘパリン結合性EGF様増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・肝細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、または
・血管内皮細胞増殖因子Aおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ。

0220

増殖因子の上述のさらに好ましい組合せを、好ましくは、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、インターロイキン34(IL−34)、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン10(IL−10)、インターロイキン13(IL−13)、およびそれらの混合物、好ましくは、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、インターロイキン34(IL−34)、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン13(IL−13)、およびそれらの混合物からなる群から選択されるM2分極化因子と組み合わせる。

0221

本発明の組換え型プロバイオティクス細菌は、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の処置において使用され得る。

0222

好ましい一実施形態では、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全は、炎症性皮膚疾患、好ましくは慢性炎症性皮膚疾患、または炎症性結合組織疾患、好ましくは、慢性炎症性結合組織疾患である。炎症性皮膚疾患は、凍傷湿疹乾癬皮膚炎、潰瘍、創傷、エリテマトーデス神経皮膚炎、およびそれらの組合せ、好ましくは凍傷、皮膚炎、潰瘍、創傷、およびそれらの組合せ、さらに好ましくは創傷、潰瘍、およびそれらの組合せ、さらに好ましくは潰瘍であり得る。

0223

炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚疾患にはまた、慢性炎症状態に進行することがある炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚外傷が包含され得る。

0224

凍傷は、凍結によって、限局性損傷が皮膚および他の組織に生じていて、組織破壊を伴い得る医学的状態である。凍傷は、寒冷および湿気に対する曝露から生じる皮膚の表在性潰瘍である凍瘡しもやけ)であってもよい。皮膚内の毛細血管床の損傷は、発赤、掻痒、炎症、および時には水疱をもたらす。さらに好ましくは、凍傷は、凍瘡である。

0225

創傷は、熱傷、化学的創傷、放射線誘導性創傷、虚血性創傷、または機械的創傷であってよい。

0226

潰瘍は、褥瘡性潰瘍または下腿潰瘍であってよい。潰瘍は、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、または圧迫潰瘍であってもよい。

0227

潰瘍は、開放皮膚創傷の何らかの可視徴候を伴わない上述の潰瘍の前潰瘍段階であってもよい。医学介入がなければ、前潰瘍段階は、潰瘍に進行することがある。

0228

創傷は、急性創傷または慢性創傷、好ましくは慢性創傷であってもよい。

0229

慢性創傷は当業者に公知であり、それには、例えば、慢性静脈性潰瘍、慢性動脈性潰瘍、慢性糖尿病性潰瘍、および慢性圧迫潰瘍が包含される。慢性創傷は、放射線被毒または虚血に起因してもよい。好ましくは慢性創傷は、慢性静脈性潰瘍、慢性動脈性潰瘍、慢性圧迫潰瘍、およびそれらの慢性前潰瘍段階、好ましくは、慢性静脈性潰瘍、慢性動脈性潰瘍、および慢性圧迫潰瘍の少なくとも1つである。

0230

慢性静脈性潰瘍は、通常、肢で起こり得て、慢性創傷の約70%〜90%を占め、多くは高齢患者が罹患する。

0231

慢性創傷の別の主な原因は、糖尿病である。糖尿病に罹患している患者は、慢性潰瘍によって、一般の個体群よりも、15%高い切断のリスクを有する。糖尿病は、侵害受容および疼痛の知覚阻害する神経障害をもたらす。したがって、患者は、肢および足への小さな創傷に気づくことができず、ゆえに、感染または繰り返しの損傷を防ぐことができない。

0232

さらなる問題は、糖尿病が、免疫低下および小血管の損傷の原因となり、その結果、組織の酸素付加が低減することである。組織の適正な酸素付加が妨げられると、慢性損傷の有病率が著しく上昇する。

0233

褥瘡性潰瘍または床ずれとしても公知である圧迫潰瘍は、糖尿病状態があってもなくても起こり得る。圧迫潰瘍は、圧迫、またはずれもしくは摩擦と組み合わさった圧迫の結果として、骨の隆起部の上で起こり得る皮膚および/またはその下にある組織に対する限局性外傷である。

0234

糖尿病は、割合が拡大していて、世界的な汎流行性状態に近づいている主要な内分泌代謝障害である。下肢潰瘍、例えば、糖尿病性足部潰瘍は、組織再生根本的な失敗によって持続および増幅され得る、糖尿病と関連する重篤長期合併症の1つである。

0235

米国、EU、および日本には、約1300万人の慢性創傷患者がおり、そのうち約280万人が、糖尿病性足部潰瘍などの下肢潰瘍に罹患している。

0236

下肢潰瘍、例えば、糖尿病性足部潰瘍は、処置が困難であり、確定した常用非侵襲性治療は存在しない。下肢潰瘍は、多くの医学的手当てを必要とし、生活の質のかなりの喪失と関連して、患者を極端衰弱させる。

0237

下肢潰瘍に罹患している患者のおよそ24%は、長期身体障害をもたらす切断を必要とすることとなる。

0238

下肢潰瘍に罹患している患者に対する年間医療費は、1000億アメリカドルの範囲である。さらに、下肢潰瘍に罹患している患者の5年死亡率は約45%であり、これは、多くの癌の5年死亡率よりも高い。

0239

現在、下肢潰瘍などの糖尿病性創傷を包含する慢性創傷の標準治療管理は、主に、感染の制御および血管再生の促進に焦点が当てられている。これらのストラテジーにも関わらず、切断率は、下肢潰瘍に罹患している患者では、許容しがたいほどに高いままである。

0240

さらに、糖尿病または慢性静脈不全などの、潰瘍の根底にある疾患状態または原因が、それぞれ、例えば、血糖値の制御または血圧薬の投与によって改善および/または処置されている場合、既存の潰瘍は、治癒に非常に長期間かかることがある。

0241

したがって、下肢潰瘍などの糖尿病性創傷を包含する慢性創傷の確定的な非侵襲性処置が存在しないことを克服するために、慢性創傷に罹患している患者において創傷治癒を再活性化および促進するための新たなストラテジーが至急必要とされている。

0242

好ましくは、慢性創傷の場合には、好ましくはプロバイオティクス細菌から放出される因子の独特の組合せは、慢性創傷を、後で創口閉鎖を施される急性創傷へと再プログラミングすることを可能にする。

0243

好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、局所で、および/または皮下注射によって、さらに好ましくは局所で投与されることができる。

0244

組換え型プロバイオティクス細菌は、好ましくは、処置を受ける炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全部に、局所投与することができる。

0245

組換え型プロバイオティクス細菌は、炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全に局所で、および/または皮膚機能不全の付近に、好ましくは、炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の周縁もしくは空隙部に皮下注射によって投与することができる。

0246

本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の適用後に、細菌は、第1および第2の異種因子、好ましくは第1、第2、および第3の異種因子を発現する。

0247

さらに、前潰瘍の部位への、および/またはその中への本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の局所適用または皮下注射によって、前潰瘍から開放創傷への進行を回避することができる。

0248

組換え型プロバイオティクス細菌を、好ましくは、プロバイオティクス細菌を、第1の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列および第2の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列および、好ましくは第3の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列で形質転換することによって得る。

0249

本発明の組換え型プロバイオティクス細菌を得るために適したプロバイオティクス細菌は、非病原細菌である。好ましくは、非病原細菌は、非侵襲性細菌である。さらに好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、グラム陽性菌、好ましくはグラム陽性胞子形成性細菌である。さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ヒト胃腸管内で増殖する能力を欠いた非コロニー形成性細菌である。

0250

さらに好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、グラム陽性食品グレード菌株を含む。

0251

本発明の好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、同じ菌株または異なる菌株の混合物に由来してよい。

0252

別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、アメリカ食品医薬品局FDA)によって、「一般に安全と認められる」(GRAS)と分類される。

0253

別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、欧州食品安全機関(EFSA)によって定義されるとおりの「安全性適格推定」(QPSステータス)を有する。選択された微生物の評価のために安全性適格推定(QPS)アプローチを導入することは、EFSA Journal、Vol.587、2007、1〜16頁において記載されている。

0254

さらに好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ファーミキューテス門または放線菌門に属する非病原細菌である。好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ビフィドバクテリウムコリネバクテリウムエンテロコッカスラクトバシラスラクトコッカスリューコノストック、ペジオコッカスプロピオニバクテリウム、およびストレプトコッカスからなる群から選択される少なくとも1つの属からの非病原細菌である。

0255

別の好ましい実施形態では、プロバイオティクス細菌は、乳酸細菌(LAB)である。乳酸細菌は、共通の代謝および生理学的特徴共有するグラム陽性、耐酸性、一般に非胞子形成性、非呼吸細菌の分岐群である。これらの細菌は、炭水化物形成の主な代謝最終産物として、乳酸を産生する。

0256

乳酸細菌は、以前から公知であり、例えば、食品発酵において使用されている。さらに、タンパク質性バクテリオシンは、複数種乳酸細菌株によって産生される。

0257

さらに、乳酸細菌は一般に、食品におけるそれらの広範な出現、およびヒト粘膜表面の健全ミクロフローラに対するそれらの寄与によって、安全(GRAS)ステータスと認識されている。

0258

さらに好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、病原性および/または日和見細菌を排除する。

0259

別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ビフィドバクテリウム属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Bifidobacterium actinocoloniiforme、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium aesculapii、Bifidobacterium angulatum、Bifidobacterium Bifidobacterium animalis、例えば、Bifidobacterium animalis subsp.animalisもしくはBifidobacterium animalis subsp.lactis、Bifidobacterium asteroides、Bifidobacterium biavatii、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium bohemicum、Bifidobacterium bombi、Bifidobacterium boum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium callitrichos、Bifidobacterium catenulatum、Bifidobacterium choerinum、Bifidobacterium coryneforme、Bifidobacterium crudilactis、Bifidobacterium cuniculi、Bifidobacterium denticolens、Bifidobacterium dentium、Bifidobacterium faecale、Bifidobacterium gallicum、Bifidobacterium gallinarum、Bifidobacterium globosum、Bifidobacterium indicum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium inopinatum、Bifidobacterium kashiwanohense、Bifidobacterium lactis、Bifidobacterium longum、例えば、Bifidobacterium longum subsp.infantis、Bifidobacterium longum subsp.longum、もしくはBifidobacterium longum subsp.suis、Bifidobacterium magnum、Bifidobacterium merycicum、Bifidobacterium minimum、Bifidobacterium mongoliense、Bifidobacterium moukalabense、Bifidobacterium pseudocatenulatum、Bifidobacterium pseudolongum、例えば、Bifidobacterium pseudolongum subsp.globosumもしくはBifidobacterium pseudolongum subsp.pseudolongum、Bifidobacterium psychraerophilum、Bifidobacterium pullorum、Bifidobacterium reuteri、Bifidobacterium ruminantium、Bifidobacterium saeculare、Bifidobacterium saguini、Bifidobacterium scardovii、Bifidobacterium stellenboschense、Bifidobacterium subtile、Bifidobacterium stercoris、Bifidobacterium suis、Bifidobacterium thermacidophilum、例えば、Bifidobacterium thermacidophilum subsp.porcinumもしくはBifidobacterium thermacidophilum subsp.thermacidophilum、Bifidobacterium thermophilum、またはBifidobacterium tsurumienseが包含される。

0260

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、Bifidobacterium dentiumではない。

0261

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ビフィドバクテリウム属種において「安全性適格推定」(QPS)ステータスを有する細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium animalis、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、またはBifidobacterium bifidumが包含される。

0262

一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、コリネバクテリウム属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Corynebacterium accolens、Corynebacterium afermentans、例えば、Corynebacterium afermentans subsp.afermentansもしくはCorynebacterium afermentans subsp.lipophilum、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium amycolatum、Corynebacterium appendices、Corynebacterium aquatimens、Corynebacterium aquilae、Corynebacterium argentoratense、Corynebacterium atypicum、Corynebacterium aurimucosum、Corynebacterium auris、Corynebacterium auriscanis、Corynebacterium betae、Corynebacterium beticola、Corynebacterium bovis、Corynebacterium callunae、Corynebacterium camporealensis、Corynebacterium canis、Corynebacterium capitovis、Corynebacterium casei、Corynebacterium caspium、Corynebacterium ciconiae、Corynebacterium confusum、Corynebacterium coyleae、Corynebacterium cystitidis、Corynebacterium deserti、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium doosanense、Corynebacterium durum、Corynebacterium efficiens、Corynebacterium epidermidicanis、Corynebacterium equi、Corynebacterium falsenii、Corynebacterium fascians、Corynebacterium felinum、Corynebacterium flaccumfaciens、例えば、Corynebacterium flaccumfaciens subsp.betae、Corynebacterium flaccumfaciens subsp.flaccumfaciens、Corynebacterium flaccumfaciens subsp.oortii、もしくはCorynebacterium flaccumfaciens subsp.poinsettiae、Corynebacterium flavescens、Corynebacterium frankenforstense、Corynebacterium freiburgense、Corynebacterium freneyi、Corynebacterium glaucum、Corynebacterium glucuronolyticum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium halotolerans、Corynebacterium hansenii、Corynebacterium hoagie、Corynebacterium humireducens、Corynebacterium ilicis、Corynebacterium imitans、Corynebacterium insidiosum、Corynebacterium iranicum、Corynebacterium jeikeium、Corynebacterium kroppenstedtii、Corynebacterium kutscheri、Corynebacterium lactis、Corynebacterium lilium、Corynebacterium lipophiloflavum、Corynebacterium liquefaciens、Corynebacterium lubricantis、Corynebacterium macginleyi、Corynebacterium marinum、Corynebacterium maris、Corynebacterium massiliense、Corynebacterium mastitidis、Corynebacterium matruchotii、Corynebacterium michiganense、例えば、Corynebacterium michiganense subsp.insidiosum、Corynebacterium michiganense subsp.michiganense、Corynebacterium michiganense subsp.nebraskense、Corynebacterium michiganense subsp.sepedonicum、もしくはCorynebacterium michiganense subsp.tessellarius、Corynebacterium minutissimum、Corynebacterium mooreparkense、Corynebacterium mucifaciens、Corynebacterium mustelae、Corynebacterium mycetoides、Corynebacterium nebraskense、Corynebacterium nigricans、Corynebacterium nuruki、Corynebacterium oortii、Corynebacterium paurometabolum、Corynebacterium phocae、Corynebacterium pilbarense、Corynebacterium pilosum、Corynebacterium poinsettiae、Corynebacterium propinquum、Corynebacterium pseudodiphtheriticum、Corynebacterium pseudotuberculosis、Corynebacterium pyogenes、Corynebacterium pyruviciproducens、Corynebacterium rathayi、Corynebacterium renale、Corynebacterium resistens、Corynebacterium riegelii、Corynebacterium seminale、Corynebacterium sepedonicum、Corynebacterium simulans、Corynebacterium singulare、Corynebacterium sphenisci、Corynebacterium spheniscorum、Corynebacterium sputi、Corynebacterium stationis、Corynebacterium striatum、Corynebacterium suicordis、Corynebacterium sundsvallense、Corynebacterium terpenotabidum、Corynebacterium testudinoris、Corynebacterium thomssenii、Corynebacterium timonense、Corynebacterium tritici、Corynebacterium tuberculostearicum、Corynebacterium tuscaniense、Corynebacterium ulcerans、Corynebacterium ulceribovis、Corynebacterium urealyticum、Corynebacterium ureicelerivorans、Corynebacterium uterequi、Corynebacterium variabile、Corynebacterium vitaeruminis、またはCorynebacterium xerosisが包含される。

0263

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium amicolatum、Corynebacterium striatum、Corynebacterium jeikeium、Corynebacterium urealyticum、Corynebacterium xerosis、Corynebacterium pseudotuberculosis、Corynebacterium tenuis、Corynebacterium striatum、またはCorynebacterium minutissimumではない。

0264

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、コリネバクテリウム属において「一般に安全と認められる」(GRAS)と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium casei、Corynebacterium flavescens、またはCorynebacterium variabileが包含される。

0265

別の実施形態では、細菌は、エンテロコッカス属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Enterococcus alcedinis、Enterococcus aquimarinus、Enterococcus asini、Enterococcus avium、Enterococcus caccae、Enterococcus camelliae、Enterococcus canintestini、Enterococcus canis、Enterococcus casseliflavus、Enterococcus cecorum、Enterococcus columbae、Enterococcus devriesei、Enterococcus diestrammenae、Enterococcus dispar、Enterococcus durans、Enterococcus eurekensis、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Enterococcus flavescens、Enterococcus gallinarum、Enterococcus gilvus、Enterococcus haemoperoxidus、Enterococcus hermanniensis、Enterococcus hirae、Enterococcus italicus、Enterococcus lactis、Enterococcus lemanii、Enterococcus malodoratus、Enterococcus moraviensis、Enterococcus mundtii、Enterococcus olivae、Enterococcus pallens、Enterococcus phoeniculicola、Enterococcus plantarum、Enterococcus porcinus、Enterococcus pseudoavium、Enterococcus quebecensis、Enterococcus raffinosus、Enterococcus ratti、Enterococcus rivorum、Enterococcus rotai、Enterococcus saccharolyticus、例えば、Enterococcus saccharolyticus subsp.saccharolyticusもしくはEnterococcus saccharolyticus subsp.taiwanensis、Enterococcus saccharominimus、Enterococcus seriolicida、Enterococcus silesiacus、Enterococcus solitarius、Enterococcus sulfureus、Enterococcus termitis、Enterococcus thailandicus、Enterococcus ureilyticus、Enterococcus viikkiensis、Enterococcus villorum、またはEnterococcus xiangfangensisが包含される。

0266

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、エンテロコッカス属において「一般に安全と認められる」(GRAS)と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Enterococcus durans、Enterococcus faecalis、またはEnterococcus faeciumが包含される。

0267

別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ラクトバシラス属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus agilis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus animalis、Lactobacillus antri、Lactobacillus apinorum、Lactobacillus apis、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aquaticus、Lactobacillus arizonensis、Lactobacillus aviaries、例えば、Lactobacillus aviarius subsp.araffinosusもしくはLactobacillus aviarius subsp.aviarius、Lactobacillus backii、Lactobacillus bavaricus、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus bobalius、Lactobacillus bombi、Lactobacillus brantae、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus cacaonum、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus capillatus、Lactobacillus carnis、Lactobacillus casei、例えば、Lactobacillus casei subsp.alactosus、Lactobacillus casei subsp.casei、Lactobacillus casei subsp.pseudoplantarum、Lactobacillus casei subsp.rhamnosus、もしくはLactobacillus casei subsp.tolerans、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus cellobiosus、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus confusus、Lactobacillus coryniformis、例えば、Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformisもしくはLactobacillus coryniformis subsp.torquens、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curieae、Lactobacillus curvatus、例えば、Lactobacillus curvatus subsp.curvatusもしくはLactobacillus curvatus subsp.melibiosus、Lactobacillus cypricasei、Lactobacillus delbrueckii、例えば、Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp.indicus、Lactobacillus delbrueckii subsp.jakobsenii、Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis、もしくはLactobacillus delbrueckii subsp.sunkii、Lactobacillusdextrinicus、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus divergens、Lactobacillus durianis、Lactobacillus equi、Lactobacillus equicursoris、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus fabifermentans、Lactobacillus faecis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus ferintoshensis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus floricola、Lactobacillus florum、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus fructosus、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus furfuricola、Lactobacillus futsaii、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus gigeriorum、Lactobacillus graminis、Lactobacillus halotolerans、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus heilongjiangensis、Lactobacillus helsingborgensis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus heterohiochii、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus hokkaidonensis、Lactobacillus hominis、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus hordei、Lactobacillus iners、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus iwatensis、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kandleri、Lactobacillus kefiranofaciens、例えば、Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciensもしくはLactobacillus kefiranofaciens subsp.kefirgranum、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kefirgranum、Lactobacillus kimbladii、Lactobacillus kimchicus、Lactobacillus kimchiensis、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kisonensis、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus koreensis、Lactobacillus kullabergensis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus lactis、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus maltaromicus、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mellifer、Lactobacillus mellis、Lactobacillus melliventris、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus minor、Lactobacillus minutus、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus nasuensis、Lactobacillus nenjiangensis、Lactobacillus nodensis、Lactobacillus odoratitofui、Lactobacillus oeni、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus oris、Lactobacillus oryzae、Lactobacillus otakiensis、Lactobacillus ozensis、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracasei、例えば、Lactobacillus paracasei subsp.paracaseiもしくはLactobacillus paracasei subsp.tolerans、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pasteurii、Lactobacillus paucivorans、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus perolens、Lactobacillus piscicola、Lactobacillus plantarum、例えば、Lactobacillus plantarum subsp.argentoratensisもしくはLactobacillus plantarum subsp.plantarum、Lactobacillus pobuzihii、Lactobacillus pontis、Lactobacillus porcinae、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rapi、Lactobacillus rennini、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rodentium、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、
Lactobacillus sakei、例えば、Lactobacillus sakei subsp.carnosusもしくはLactobacillus sakei subsp.sakei、Lactobacillus salivarius、例えば、Lactobacillus salivarius subsp.saliciniusもしくはLactobacillus salivarius subsp.salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus saniviri、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus selangorensis、Lactobacillus senioris、Lactobacillus senmaizukei、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus shenzhenensis、Lactobacillus sicerae、Lactobacillus silagei、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus similes、Lactobacillus sobrius、Lactobacillus songhuajiangensis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus sucicola、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus sunkii、Lactobacillus suntoryeus、Lactobacillus taiwanensis、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus thermotolerans、Lactobacillus trichodes、Lactobacillus tucceti、Lactobacillus uli、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus uvarum、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus viridescens、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus xiangfangensis、Lactobacillus xylosus、Lactobacillus yamanashiensis、例えば、Lactobacillus yamanashiensis subsp.maliもしくはLactobacillus yamanashiensis subsp.yamanashiensis、Lactobacillus yonginensis、Lactobacillus zeae、またはLactobacillus zymaeが包含される。

0268

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ラクトバシラス属種において「一般に安全と認められる」(GRAS)と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Lactobacillus acidophilus株NP28、Lactobacillus acidophilus株NP51、Lactobacillus subsp.lactis株NP7、Lactobacillus reuteri株NCIMB30242、Lactobacillus casei株Shirota、Lactobacillus reuteri株DSM17938、Lactobacillus reuteri株NCIMB30242、Lactobacillus acidophilus株NCFM、Lactobacillus rhamnosus株HN001、Lactobacillus rhamnosus株HN001、Lactobacillus reuteri株DSM17938、Lactobacillus casei subsp.rhamnosus株GG、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus lactis、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus cacaonum、Lactobacillus casei subsp.casei、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus composti、Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curvatus subps.curvatus、Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis、Lactobacillusdextrinicus、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus fabifermentans、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus hordei、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kefiranofadens subsp.kefiranofaciens、Lactobacillus kefiranofadens subsp.kefirgranum、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kisonensis、Lactobacillus mail、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus nodensis、Lactobacillus oeni、Lactobacillus otakiensis、Lactobacillus panis、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus perolens、Lactobacillus plantarum subsp.plantarum、Lactobacillus pobuzihii、Lactobacillus pontis、Lactobacillus rapi、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus sakei subsp carnosus、Lactobacillus sakei subsp.sakei、Lactobacillus sali varius subsp.salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus senmaizukei、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus sunkii、Lactobacillus tucceti、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus versmoldensis、またはLactobacillus yamanashiensisが包含される。

0269

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ラクトバシラス属種において「安全性適格推定」(QPS)ステータスを有する細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus aviaries、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus panis、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pontis、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、またはLactobacillus zeaeが包含される。

0270

別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ラクトコッカス属種に由来し、それは、これらだけに限定されないが、Lactococcus chungangensis、Lactococcus formosensis、Lactococcus fujiensis、Lactococcus garvieae、Lactococcus lactis、例えば、Lactococcus lactis subsp.cremoris、Lactococcus lactis subsp.hordniae、Lactococcus lactis subsp.lactis、もしくはLactococcus lactis subsp.tructae、Lactococcus piscium、Lactococcus plantarum、Lactococcus raffinolactis、またはLactococcus taiwanensisが包含される。

0271

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ラクトコッカス属において「一般に安全と認められる」(GRAS)と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Lactococcus lactis subsp.cremoris、Lactococcus lactis subsp.lactis、およびLactococcus raffinolactisが包含される。

0272

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、Lactococcus lactis、好ましくはLactococcus lactis subsp.lactis、Lactococcus lactis subsp.lactis biovariant diacetylactis、またはLactococcus lactis subsp.cremoris、さらに好ましくはLactococcus lactis subsp.cremorisである。

0273

別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、リューコノストック属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Leuconostoc amelibiosum、Leuconostoc argentinum、Leuconostoc carnosum、Leuconostoc citreum、Leuconostoc cremoris、Leuconostocdextranicum、Leuconostoc durionis、Leuconostoc fallax、Leuconostoc ficulneum、Leuconostoc fructosum、Leuconostoc gasicomitatum、Leuconostoc gelidum、例えば、Leuconostoc gelidum subsp.aenigmaticum、Leuconostoc gelidum subsp.gasicomitatum、もしくはLeuconostoc gelidum subsp.gelidum、Leuconostoc holzapfelii、Leuconostoc inhae、Leuconostoc kimchii、Leuconostoc lactis、Leuconostoc mesenteroides、例えば、Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris、Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicums、Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides、もしくはLeuconostoc mesenteroides subsp.suionicum、Leuconostoc miyukkimchii、Leuconostoc oeni、Leuconostoc paramesenteroides、Leuconostoc pseudoficulneum、またはLeuconostoc pseudomesenteroidesが包含される。

0274

好ましくは、細菌は、リューコノストック属種において「一般に安全と認められる」(GRAS)と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Leuconostoc carnosum、Leuconostoc citreum、Leuconostoc fallax、Leuconostoc holzapfelii、Leuconostoc inhae、Leuconostoc kimchii、Leuconostoc lactis、Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris、Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicums、Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides、Leuconostoc palmae、またはLeuconostoc pseudomesenteroidesが包含される。

0275

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、リューコノストック属種において「安全性適格推定」(QPS)ステータスを有する細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Leuconostoc citreum、Leuconostoc lactis、Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris、Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum、またはLeuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroidesが包含される。

0276

別の実施形態では、細菌は、ペジオコッカス属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Pediococcus acidilactici、Pediococcus argentinicus、Pediococcus cellicola、Pediococcus claussenii、Pediococcus damnosus、Pediococcusdextrinicus.Pediococcus ethanolidurans、Pediococcus halophilus、Pediococcus inopinatus、Pediococcus lolii、Pediococcus parvulus、Pediococcus pentosaceus、Pediococcus siamensis、Pediococcus stilesii、またはPediococcus urinaeequiが包含される。

0277

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ペジオコッカス属種において「安全性適格推定」(QPS)ステータスを有する細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Pediococcus acidilactici、Pediococcusdextrinicus、またはPediococcus pentosaceusが包含される。

0278

別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、プロピオニバクテリウム属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Propionibacterium acidifaciens、Propionibacterium acidipropionici、Propionibacterium acnes、Propionibacterium australiense、Propionibacterium avidum、Propionibacterium cyclohexanicum、Propionibacterium damnosum、Propionibacterium freudenreichii、例えば、Propionibacterium freudenreichii subsp.freudenreichiiもしくはPropionibacterium freudenreichii subsp.shermanii、Propionibacterium granulosum、Propionibacterium innocuum、Propionibacterium jensenii、Propionibacterium lymphophilum、Propionibacterium microaerophilum、Propionibacterium olivae、Propionibacterium propionicum、またはPropionibacterium thoeniiが包含される。

0279

一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、Propionibacterium acnesではない。

0280

さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、プロピオニバクテリウム属種において「一般に安全と認められる」(GRAS)と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Propionibacterium acidipropionici、Propionibacterium freudenreichii subsp.Freudenreichii、Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii、Propionibacterium jensenii、またはPropionibacterium thoeniiが包含される。

0281

さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、Propionibacterium freudenreichii、さらに好ましくは、Propionibacterium freudenreichii subsp.freudenreichiiまたはPropionibacterium freudenreichii subsp.shermaniiである。

0282

別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ストレプトコッカス属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Streptococcus acidominimus、Streptococcus adjacens、Streptococcus agalactiae、Streptococcus alactolyticus、Streptococcus anginosus、Streptococcus australis、Streptococcus bovis、Streptococcus caballi、Streptococcus canis、Streptococcus caprinus、Streptococcus castoreus、Streptococcus cecorum、Streptococcus constellatus、例えば、Streptococcus constellatus subsp.constellatus、Streptococcus constellatus subsp.pharynges、もしくはStreptococcus constellatus subsp.viborgensis、Streptococcus cremoris、Streptococcus criceti、Streptococcus cristatus、Streptococcus cuniculi、Streptococcus danieliae、Streptococcus defectivus、Streptococcus dentapri、Streptococcus dentirousetti、Streptococcus dentasini、Streptococcus dentisani、Streptococcus devriesei、Streptococcus didelphis、Streptococcus difficilis、Streptococcus downei、Streptococcus durans、Streptococcus dysgalactiae、例えば、Streptococcus dysgalactiae subsp.dysgalactiaeもしくはStreptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis、Streptococcus entericus、Streptococcus equi、例えば、Streptococcus equi subsp.equi、Streptococcus equi subsp.ruminatorum、もしくはStreptococcus equi subsp.zooepidemicus、Streptococcus equinus、Streptococcus faecalis、Streptococcus faecium、Streptococcus ferus、Streptococcus gallinaceus、Streptococcus gallinarum、Streptococcus gallolyticus、例えば、Streptococcus gallolyticus subsp.gallolyticus、Streptococcus gallolyticus subsp.macedonicus、もしくはStreptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus、Streptococcus garvieae、Streptococcus gordonii、Streptococcus halichoeri、Streptococcus hansenii、Streptococcus henryi、Streptococcus hongkongensis、Streptococcus hyointestinalis、Streptococcus hyovaginalis、Streptococcus ictaluri、Streptococcus infantarius、例えば、Streptococcus infantarius subsp.coliもしくはStreptococcus infantarius subsp.infantarius、Streptococcus infantis、Streptococcus iniae、Streptococcus intermedius、Streptococcus intestinalis、Streptococcus lactarius、Streptococcus lactis、例えば、Streptococcus lactis subsp.cremoris、Streptococcus lactis subsp.diacetilactis、もしくはStreptococcus lactis subsp.lactis、Streptococcus loxodontisalivarius、Streptococcus lutetiensis、Streptococcus macacae、Streptococcus macedonicus、Streptococcus marimammalium、Streptococcus massiliensis、Streptococcus merionis、Streptococcus minor、Streptococcus mitis、Streptococcus morbillorum、Streptococcus moroccensis、Streptococcus mutans、Streptococcus oligofermentans、Streptococcus oralis、Streptococcus orisasini、Streptococcus orisuis、Streptococcus ovis、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus parauberis、Streptococcus parvulus、Streptococcus pasteurianus、Streptococcus peroris、Streptococcus phocae、例えば、Streptococcus phocae subsp.phocaeもしくはStreptococcus phocae subsp.salmonis、Streptococcus plantarum、Streptococcus pleomorphus、Streptococcus pluranimalium、Streptococcus plurextorum、Streptococcus pneumonia、Streptococcus porci、Streptococcus porcinus、Streptococcus porcorum、Streptococcus pseudopneumoniae、Streptococcus pseudoporcinus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus raffinolactis、Streptococcus ratti、Streptococcus rifensis、Streptococcus rubneri、Streptococcus rupicaprae、Streptococcus saccharolyticus、Streptococcus salivarius、例えば、Streptococcus salivarius subsp.salivariusもしくはStreptococcus salivarius subsp.thermophilus、Streptococcus saliviloxodontae、Streptococcus sanguinis、Streptococcus shiloi、Streptococcus sinensis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus suis、Streptococcus thermophilus、Streptococcus thoraltensis、Streptococcus tigurinus、Streptococcus troglodytae、Streptococcus uberis、Streptococcus urinalis、Streptococcus ursoris、Streptococcus vestibularis、またはStreptococcus waiusが包含される。

0283

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ストレプトコッカス属種において「一般に安全と認められる」(GRAS)と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Streptococcus thermophilus株Th4、Streptococcus gallolyticus subsp.macedonicus、Streptococcus salivarius subsp.salivarius、またはStreptococrus salivarius subsp.thermophilusが包含される。

0284

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ストレプトコッカス属種において「安全性適格推定」(QPS)ステータスを有する細菌であり、それには、これだけに限定されないが、Streptococcus thermophilusが包含される。

0285

好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、内毒素または他の潜在的な毒性物質を産生しない。それによって、プロバイオティクス細菌は、使用するために安全であり、かつ適用後に対象に有害であることはない。

0286

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、胞子を産生しない。細菌胞子は、性周期の一部ではないが、好ましくない条件下で生存するために使用される耐性構造である。プロバイオティクス細菌は、好ましくは胞子を産生しないので、組換え型プロバイオティクス細菌は、例えば、栄養素がないか、または栄養要求因子が喪失していると生存することができない。

0287

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、封入体を産生しない。封入体は、多くの場合に、過剰発現されたタンパク質を含有し、封入体内での過剰発現されたタンパク質の凝集は、不可逆的であり得る。

0288

プロバイオティクス細菌は、好ましくは、封入体を産生しないので、個々の核酸配列を転写および翻訳した後の第1、第2、および第3の異種因子の量は、封入体内での細胞内蓄積によって減少しない。

0289

さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、細胞外プロテイナーゼも産生しない。細胞外プロテイナーゼは、タンパク質などの細胞外構造を破壊して、炭素、窒素、または硫黄などの栄養素を生成するために細菌から分泌され得る。細胞外プロテイナーゼは、外毒素としても作用し、細菌性病原における病原性因子の一例であり得る。

0290

細胞外プロテイナーゼが存在しないことによって、対象に適用した後のプロバイオティクス細菌の安全性は好ましくは上昇する。さらに、プロバイオティクス細菌は、好ましくは、組換え型プロバイオティクス細菌から放出された後の個々の第1、第2、および第3の異種因子を分解しない。

0291

好ましくは、プロバイオティクス細菌は、天然起源プラスミドをすべて欠いている。天然起源のプラスミドがすべて存在しないことによって、プロバイオティクス細菌は、好ましくは抗生物質耐性を有さない。

0292

さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、接合転移に必要な宿主因子を欠いている。

0293

天然起源のプラスミドは、接合性プラスミドおよび非接合性プラスミドに広く分類することができる。接合性プラスミドは、異なる細胞間での性接合を促進するトランスファーまたはtra遺伝子のセットを含有する。接合の複雑なプロセスにおいて、プラスミドは、tra遺伝子のいくつかによってコードされる性線毛を介して、一方の細菌から他方へと移入され得る。非接合性プラスミドは、接合を開始することは不可能であり、したがって、それは、接合性プラスミドなどの接合転移に必要とされる宿主因子の補助があって初めて移入され得る。

0294

接合転移に必要な宿主因子が存在しないことによって、プロバイオティクス細菌から他の微生物への、個々の第1、第2、および第3の異種因子をコードする核酸(複数可)の遺伝子転移は、ほとんど起こり得ず、好ましくは遺伝子転移は抑制される。

0295

さらに好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、乳酸細菌、好ましくはラクトバシラスまたはラクトコッカス種である。さらに好ましい一実施形態では、ラクトコッカス種は、lactococcus lactis subsp.cremorisである。

0296

乳酸細菌はさらに、炭水化物発酵の主たる代謝最終生成物として乳酸を放出する。乳酸は、内皮成長および増殖も刺激することが公知である。さらに、乳酸は、皮膚機能不全の部位での細菌感染の確率を低下させる抗菌効果を有する。

0297

上述のプロバイオティクス細菌を形質転換するための技術は、当業者に公知であり、例えば、Green and Sambrook(2012):「Molecular cloning:a laboratory manual」、第4版、Cold Spring Harbour Laboratory Press(Cold Spring Harbor、NY、USA)において記載されている。

0298

形質転換の後に、組換え型プロバイオティクス細菌は、第1の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列および第2の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、および好ましくは第3の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む。

0299

一実施形態では、第1の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列および第2の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列、好ましくは、および第3の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列は、組換え型プロバイオティクス細菌の異なる亜集団内に位置する。

0300

例えば、個々の核酸配列は、プロバイオティクス細菌の別々の亜集団内にそれぞれ位置し、それらを組み合わせて、本発明の組換え型プロバイオティクス細菌を得る。

0301

個々の核酸配列を含む個々の個別の亜集団は、例えば、上述のプロバイオティクス細菌の同じ種に、または異なる種に由来してよい。

0302

例えば、異なる異種因子を発現する組換え型プロバイオティクス細菌の異なる種を使用して、プロバイオティクス細菌からの個々の異種因子の発現および、好ましくは放出を適合させることができる。

0303

本発明の好ましい一実施形態では、個々の核酸配列は、様々なコピー数で組換え型プロバイオティクス細菌中に存在する。例えば、組換え型プロバイオティクス細菌は、第1、第2、および/または好ましくは第3の因子をコードする個々の核酸配列の少なくとも1つのコピーを含む。

0304

個々の異種因子の発現を増強するために、個々の核酸配列のコピーの数を増加させることができる。

0305

好ましくは、第1、第2、および/または第3の因子をコードする個々の核酸配列のコピーの比は、1:1:1である。

0306

組換え型プロバイオティクス細菌によって転写される核酸配列の追加のコピーを用意することによって、翻訳効率を増強することができる。

0307

本発明のさらなる一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌の亜集団は、3種の異種因子のうちの2種をコードする少なくとも1つの核酸配列を含み、その際、好ましくは、第3の異種因子は、組換え型プロバイオティクス細菌の第2の亜集団内に位置する核酸配列によってコードされる。

0308

好ましい一実施形態では、3種すべての異種因子をコードする核酸配列が、組換え型プロバイオティクス細菌の1つの集団内に位置する。

0309

さらに好ましい一実施形態では、個々の核酸配列は、組換え型プロバイオティクス細菌の染色体およびプラスミドの少なくとも1つの上に位置する。

0310

組換え型プロバイオティクス細菌の染色体上に、または組換え型プロバイオティクス細菌のプラスミド上に核酸配列を位置させることで、なかんずく、細菌によって翻訳されるタンパク質の量を決定するが、それというのも、プラスミド上での発現レベルは、染色体上での発現レベルと比較して高いためである。

0311

本発明のさらに好ましい一実施形態では、個々の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列を、細菌の染色体上に用意し、かつ別の異種因子をコードする少なくとも1つの核酸配列を、組換え型プロバイオティクス細菌のプラスミド上に用意する。

0312

次いで、第3の因子をコードする個々の核酸配列を、組換え型プロバイオティクス細菌の染色体上に、またはプラスミド上に用意してよい。

0313

本発明の代替の一実施形態では、個々の核酸配列を、組換え型プロバイオティクス細菌の染色体の個別の部分上に、または組換え型プロバイオティクス細菌の異なるプラスミド上に用意する。

0314

本発明の特に好ましい一実施形態では、異種因子をコードするすべての核酸配列を、例えば、それぞれ制御されていて、別個のプロモーターに機能的に連結されている単一プラスミド上に用意する。

0315

本発明の別の特に好ましい一実施形態では、個々の異種因子をコードする個々の核酸配列は、単一のプロモーターに動作的に結合していて、かつそれによって制御される単一のオペロン内に位置する。

0316

オペロンは、単一のプロモーターの制御下の一群の遺伝子を含有するDNAの機能性ユニットである。遺伝子は、mRNAストランドにおいて一緒に転写され、細胞質において一緒に翻訳されるか、またはトランススプライシングを受けて、別々に翻訳される単シストロン性mRNAを作製する。

0317

好ましくは、単一のオペロン内に位置する個々の異種因子をコードする個々の核酸配列に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位をコードする核酸配列を用意する。

0318

好ましくは、リボソーム結合部位をコードする核酸配列は、転写されるべき同じストランドの5’領域の方向で開始コドンの上流に位置する。その配列は好ましくは、16SリボソームRNAの3’末端相補的である。

0319

好ましくは、単一のオペロン中に位置する個々の異種因子をコードする個々の核酸配列に、分泌シグナル配列をコードする核酸配列を、異種因子のオープンリーディングフレーム(ORF)の5’末端で用意して、分泌シグナル配列および異種因子を含む融合タンパク質を生じさせる。

0320

さらに好ましい一実施形態では、核酸配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターによって制御され、かつそれに機能的に連結されている。

0321

例えば、個々の異種因子をコードする核酸配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれか、さらに好ましくは誘導性プロモーターであり得る個別のプロモーターによって制御され、かつそれに機能的に連結されてよい。

0322

構成的プロモーターは、あらゆる状況において細胞内で活性である一方で、誘導性プロモーターは、特異的誘導因子に応じて活性になる。

0323

プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸配列である。プロモーターは、遺伝子の転写開始側近くに、同じストランド上で、かつ転写されるべき同じストランドの5’領域の方向でDNAの上流に位置する。

0324

好ましくは、使用される個々のプロモーターは、個々の核酸配列を発現するプロバイオティクス細菌からの自己プロモーターである。

0325

別法では、個々のプロモーターは、異種プロモーター、好ましくは原核プロモーター、さらに好ましくは細菌からのプロモーターである。

0326

さらに好ましい一実施形態では、少なくとも1つの核酸配列の発現は、誘導性プロモーターによって制御され、その際、少なくとも1つの核酸配列は、少なくとも1種の誘導因子の存在下で、発現可能である。

0327

好ましくは、誘導因子によって誘導可能である誘導性プロモーターは、ランチビオティクスペプチドをコードする少なくとも1つの微生物遺伝子のためのプロモーターである。

0328

ランチビオティクスペプチドは、当業者に公知である。ランチビオティクスは、特徴的な多環式チオエーテルアミノ酸であるランチオニン、さらには、不飽和アミノ酸であるデヒドロアラニンおよび2−アミノイソ酪酸を含有するペプチドの群である。

0329

ランチオニンは、例えば、システインの一硫化物類似体であり、チオエーテル結合によって、そのベータ−炭素原子架橋されている2個のアラニン残基から構成される。

0330

ランチビオティクスは、グラム陽性菌の多数によって産生される。

0331

好ましい一実施形態では、誘導性プロモーターは、lactococcus lactisからのナイシンプロモーター、bifidobacterium longumからのビシンプロモーター、bacillus subtilisからのオプチリンプロモーター、streptococcus salivariusからのサルバリジンプロモーター、staphylococcus epidermidisからのエピデルミンプロモーター、staphylococcus gallinarumからのガリデルミンプロモーター、streptococcus mutansからのミュータシンプロモーター、streptococcus pyogenesからのストレプチンプロモーター、streptococcus pyogenesからのストレプトコカイナムプロモーター、lactococcus lactisからのラクチシンプロモーター、staphylococcis epidermidisからのエピデルミンプロモーター、staphylococcus epidermidisからのエピランジンプロモーター、staphylococcus epidermidisからのpep5プロモーター、lactobacillus sakeiからのラクトシン−sプロモーター、streptococcus salivariusもしくはstreptococcus pyogenesからのサルバリシンプロモーター、lactobacillus plantarumからのプランタリジンプロモーター、ストレプトコッカスからのテルモフィリンプモーター、ストレプトコッカスからのボビシンプロモーター、またはそれらの組合せである。

0332

さらに好ましくは、誘導性プロモーターは、lactococcus lactisのPnisA、PnisZ、PnisQ、PnisF、PnisU、またはそれらの組合せである。

0333

好ましい一実施形態では、誘導因子は、好ましくは、ナイシンA、ナイシンZ、ナイシンQ、ナイシンF、ナイシンU、それらの機能的類似体、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1種のランチビオティクスペプチドまたはその機能的類似体である。

0334

ナイシン制御される遺伝子発現系は、例えば、MoBiTec GmbH(Goettingen、Germany)から、商品名NICE(登録商標)で市販されており、これは、NIZO Food Research(Ede、Netherlands)で開発された。

0335

当業者に周知であるナイシンは、広範な宿主スペクトルを有する34アミノ酸ランチビオティクスペプチドである。例えば、Lactococcus lactisからのナイシンは、Sigma−Aldrich Chemie GmbH(Munich、Germany)から市販されている。

0336

ナイシンは、食品において防腐剤として広く使用されている。最初は、ナイシンは、前駆体としてリボソームで合成される。その後の酵素による修飾の後に、修飾された分子は、細胞膜を通過して透過し、その成熟型にプロセシングされる。

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