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課題・解決手段

エンドスタチン突然変異体が提供される。前記突然変異体は、改善されたATPアーゼ活性ならびに改善された血管新生阻害および腫瘍阻害活性を有する。さらに、腫瘍などの血管新生関連疾患治療における突然変異体の使用が提供される。

概要

背景

1997年に、ハーバード大学のJudah Folkman博士内因性血管新生阻害剤エンドスタチン(本明細書ではESと略す)を発見した。ESは、コラーゲンXVIIIのカルボキシル末端由来酵素消化産物であり、分子量は約20kDaであり、183個のアミノ酸残基を含んでなる。組換えエンドスタチンは、薬剤耐性を示すことなく種々のマウス腫瘍阻害することができ、あるいは治癒することさえできる(Folkman J. et al. Cell 1997; 88:277-285; Folkman J. et al. Nature 1997; 390:404-407)。腫瘍阻害におけるESの機序は、その血管新生を阻害すること、ならびに腫瘍への栄養素および酸素の供給を遮断することである。

アデノシン三リン酸ATP)は、生命にとって最も基本的なエネルギー源であり、生命活動の維持に極めて重要である。正常な生理状態では、細胞および血液のATPのモル濃度はそれぞれ1〜10mMおよび100μMである。アデノシントリホスファターゼとも呼ばれるATPアーゼは、ATPの加水分解によるエネルギー放出、および同時にアデノシン二リン酸ADP)およびリン酸イオン(Pi)の産生を触媒する酵素種である。加えて、グアノシン三リン酸GTP)に含まれる高エネルギー結合もまたタンパク質生合成エネルギーを供給し得る。

Hsp90、ミオシンなどの多くの重要なタンパク質は、エネルギー供給をATPに依存する。これらのタンパク質はそれら自体、通常、ATPアーゼ活性を有する。様々なATPアーゼは配列および三次構造が異なるが、それらは通常ATP結合モチーフ、すなわち、Pループ構造を持つ(Andrea T. Deyrup, et al., 1998,JBC, 273(16):9450-9456)。Pループ構造に典型的な配列はGXXGXXKであり(Driscoll, W. J., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:12328-12332)、配列中、Xは任意のアミノ酸残基を表し、他のアミノ酸残基(2つのGおよび1つのK)は、比較的よく保存されている。通常、これらのATPアーゼ中のATP結合モチーフはGTPとも結合でき、従って、多くのATPアーゼがGTPアーゼ活性も同時に持つ。

腫瘍を有する場合、癌細胞および新血管内皮細胞は極めて活発代謝活性を有し、その代謝は正常な成熟細胞のものとは大きく異なる。一方、癌細胞および活発に増殖している細胞は多量のATPを消費する必要があり、他方、癌細胞および活発に増殖している細胞がグルコースからATPを産生する効率はむしろ低く、このような好気解糖によるATP産生の低効率の方法は、「ワールブルグ効果」と呼ばれる。この方法におけるATP産生の効率は極めて低いが、細胞構造の組み立てに使用可能な多数の構成ブロックがこのプロセスで産生され、しかしながらこのプロセスは細胞増殖にとってより有用である(Matthew G., et al., 2009, Science, 324:1029-1033)。

従来技術では、天然エンドスタチンは極めて高いATPアーゼ活性を有し、その配列(配列番号1)の89〜95番のアミノ酸Gly−Ser−Glu−Gly−Pro−Leu−Lysは、GXXGXXKの形態の古典的ATP結合モチーフを有することが示されている。従来技術では、ESのATPアーゼ活性は、ESの内皮細胞移動阻害活性と負の関係があることが示され、この現象はワールブルグ効果によって説明することができる。このパターンは、ATPアーゼ活性を低下させた一連のES突然変異体で証明および解明されている(PCT/CN2012/081210)。

概要

エンドスタチンの突然変異体が提供される。前記突然変異体は、改善されたATPアーゼ活性ならびに改善された血管新生阻害および腫瘍阻害活性を有する。さらに、腫瘍などの血管新生関連疾患治療における突然変異体の使用が提供される。

目的

本発明は、天然エンドスタチンに比べて、より高いATPアーゼ活性ならびにより高い血管新生阻害および腫瘍成長阻害活性を有するエンドスタチンの変異体を提供する

効果

実績

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請求項1

エンドスタチンまたはその変異体ATPアーゼ活性を増加させることを含む、エンドスタチンまたはその変異体の抗血管新生活性を増加させる方法。

請求項2

ATPアーゼ活性を増加させたエンドスタチン突然変異体を得るためのエンドスタチンまたはその変異体のAモチーフおよび/またはBモチーフおよび/またはCモチーフに対する遺伝子工学を含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記遺伝子工学が以下のアプローチ:(1)配列番号1のAモチーフGXXGXXKにおいて保存されているアミノ酸残基G89、G92、およびK95に対応するアミノ酸残基を変更せずに維持すること;(2)AモチーフGXXGXXK内の可変残基Xを調整することによりAモチーフに対応するペプチドの空間的立体配座の柔軟性を高めること;(3)AモチーフGXXGXXKの古典的配列の残基K95の後にSerまたはThrを付加すること;(4)Aモチーフの変化に応じてBモチーフを調整すること;(5)Cモチーフのアミノ酸残基を部分的にまたは完全に変異させること;(6)Bモチーフの変化に応じてCモチーフを調整すること;(7)Aモチーフの変化に応じてCモチーフを調整すること;(8)A、B、およびCモチーフを同時に変化させること、のうちの1以上を含む、請求項2に記載の方法。

請求項4

Bモチーフを変更せずに維持する、請求項2または3に記載の方法。

請求項5

前記エンドスタチン突然変異体がヒトエンドスタチン突然変異体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

前記エンドスタチン突然変異体が配列番号3〜34および配列番号37〜39からなる群から選択される配列を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

前記エンドスタチン突然変異体が以下の群:配列番号3、配列番号20、配列番号21および配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号28、配列番号29および配列番号30から選択される配列を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

抗血管新生活性を増加させた、エンドスタチンまたはその変異体の突然変異体であって、前記突然変異体は、そのATP結合モチーフ内に突然変異を含んでなり、かつ、対応する野生型エンドスタチンまたはその変異体に比べて増加したATPアーゼ活性を有する、前記突然変異体。

請求項9

前記突然変異体のATPアーゼ活性を、対応する野生型エンドスタチンまたはその変異体に比べて少なくとも約100%増加させた、請求項8に記載の突然変異体。

請求項10

前記突然変異体のATPアーゼ活性を、対応する野生型エンドスタチンまたはその変異体に比べて少なくとも約200%増加させた、請求項8に記載の突然変異体。

請求項11

前記突然変異体のATPアーゼ活性を、対応する野生型エンドスタチンまたはその変異体に比べて少なくとも約300%増加させた、請求項8に記載の突然変異体。

請求項12

前記突然変異体が、配列番号1の89〜95番のアミノ酸残基からなるGly−Ser−Glu−Gly−Pro−Leu−Lysモチーフに相当する配列に突然変異を含み、かつ、前記突然変異が1または数個のアミノ酸残基の置換欠失、および/もしくは付加、またはそれらの組合せから選択され、かつ、前記突然変異が前記突然変異体のATPアーゼ活性を増加させる、請求項8に記載の突然変異体。

請求項13

配列番号1の89〜95番のアミノ酸残基からなるGly−Ser−Glu−Gly−Pro−Leu−Lysモチーフに相当する前記突然変異体の配列が部分的にまたは完全に欠失している、請求項12に記載の突然変異体。

請求項14

配列番号1の89、92および95番のアミノ酸残基に相当する前記突然変異体の1以上のアミノ酸残基が部分的にまたは完全に置換されているか、または欠失している、請求項12に記載の突然変異体。

請求項15

(a)配列番号1の89番のGlyに相当するアミノ酸残基が欠失している、または非電荷もしくは芳香族アミノ酸で置換されている;あるいは(b)配列番号1の92番のGlyに相当するアミノ酸残基が欠失している、または非電荷アミノ酸で置換されている;あるいは(c)配列番号1の95番のLysに相当するアミノ酸残基が欠失している、または正電荷もしくは非電荷アミノ酸で置換されている;あるいは(a)〜(c)の任意の組合せである、請求項12に記載の突然変異体。

請求項16

(a)配列番号1の89のGlyに相当するアミノ酸残基が欠失している、またはAlaもしくはProで置換されている;あるいは(b)配列番号1の92番のGlyに相当するアミノ酸残基が欠失している、またはAlaで置換されている;あるいは(c)配列番号1の95番のLysに相当するアミノ酸残基が欠失している、またはArgもしくはGlnで置換されている;あるいは(a)〜(c)の任意の組合せである、請求項15に記載の突然変異体。

請求項17

前記突然変異体が配列番号3〜34および配列番号37〜39からなる群から選択される配列を有する、請求項8に記載の突然変異体。

請求項18

前記突然変異体が、以下の群:配列番号3、配列番号20、配列番号21、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号28、配列番号29および配列番号30から選択される配列を有する、請求項8に記載の突然変異体。

請求項19

ヒトエンドスタチンまたはその変異体の突然変異体である、請求項8〜18のいずれか一項に記載の突然変異体。

請求項20

請求項8〜18のいずれか一項に記載の突然変異体と薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物

請求項21

前記突然変異体がPEG分子共有結合している、請求項20に記載の医薬組成物。

請求項22

前記PEG分子が5〜40kDの分子量である、請求項21に記載の医薬組成物。

請求項23

前記PEG分子が前記突然変異体のN末端においてαアミノ基と共有結合している、請求項21に記載の医薬組成物。

請求項24

前記PEG分子がモノメトキシポリエチレングリコールである、請求項21に記載の医薬組成物。

請求項25

前記モノメトキシポリエチレングリコールがモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド(mPEG−ALD)である、請求項21に記載の医薬組成物。

請求項26

患者に有効量の請求項8〜18のいずれか一項に記載の突然変異体または請求項20〜25のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、血管新生関連疾患治療する方法。

請求項27

前記血管新生関連疾患が腫瘍肥満脂肪肝、またはインスリン抵抗性である、請求項27に記載の方法。

請求項28

血管新生関連疾患を治療するための医薬の製造における、請求項8〜18のいずれか一項に記載の突然変異体の使用。

請求項29

前記血管新生関連疾患が腫瘍、肥満、脂肪肝、またはインスリン抵抗性である、請求項28に記載の使用。

技術分野

0001

本発明は、新規組換えタンパク質薬に関する。具体的には、本発明は、天然エンドスタチンに比べて、より高いATPアーゼ活性ならびにより高い血管新生阻害および腫瘍成長阻害活性を有するエンドスタチンの変異体を提供する。本発明はまた、腫瘍および他の血管新生関連疾患治療における前記変異体の使用を提供する。

背景技術

0002

1997年に、ハーバード大学のJudah Folkman博士内因性血管新生阻害剤:エンドスタチン(本明細書ではESと略す)を発見した。ESは、コラーゲンXVIIIのカルボキシル末端由来酵素消化産物であり、分子量は約20kDaであり、183個のアミノ酸残基を含んでなる。組換えエンドスタチンは、薬剤耐性を示すことなく種々のマウス腫瘍を阻害することができ、あるいは治癒することさえできる(Folkman J. et al. Cell 1997; 88:277-285; Folkman J. et al. Nature 1997; 390:404-407)。腫瘍阻害におけるESの機序は、その血管新生を阻害すること、ならびに腫瘍への栄養素および酸素の供給を遮断することである。

0003

アデノシン三リン酸ATP)は、生命にとって最も基本的なエネルギー源であり、生命活動の維持に極めて重要である。正常な生理状態では、細胞および血液のATPのモル濃度はそれぞれ1〜10mMおよび100μMである。アデノシントリホスファターゼとも呼ばれるATPアーゼは、ATPの加水分解によるエネルギー放出、および同時にアデノシン二リン酸ADP)およびリン酸イオン(Pi)の産生を触媒する酵素種である。加えて、グアノシン三リン酸GTP)に含まれる高エネルギー結合もまたタンパク質生合成エネルギーを供給し得る。

0004

Hsp90、ミオシンなどの多くの重要なタンパク質は、エネルギー供給をATPに依存する。これらのタンパク質はそれら自体、通常、ATPアーゼ活性を有する。様々なATPアーゼは配列および三次構造が異なるが、それらは通常ATP結合モチーフ、すなわち、Pループ構造を持つ(Andrea T. Deyrup, et al., 1998,JBC, 273(16):9450-9456)。Pループ構造に典型的な配列はGXXGXXKであり(Driscoll, W. J., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:12328-12332)、配列中、Xは任意のアミノ酸残基を表し、他のアミノ酸残基(2つのGおよび1つのK)は、比較的よく保存されている。通常、これらのATPアーゼ中のATP結合モチーフはGTPとも結合でき、従って、多くのATPアーゼがGTPアーゼ活性も同時に持つ。

0005

腫瘍を有する場合、癌細胞および新血管内皮細胞は極めて活発代謝活性を有し、その代謝は正常な成熟細胞のものとは大きく異なる。一方、癌細胞および活発に増殖している細胞は多量のATPを消費する必要があり、他方、癌細胞および活発に増殖している細胞がグルコースからATPを産生する効率はむしろ低く、このような好気解糖によるATP産生の低効率の方法は、「ワールブルグ効果」と呼ばれる。この方法におけるATP産生の効率は極めて低いが、細胞構造の組み立てに使用可能な多数の構成ブロックがこのプロセスで産生され、しかしながらこのプロセスは細胞増殖にとってより有用である(Matthew G., et al., 2009, Science, 324:1029-1033)。

0006

従来技術では、天然エンドスタチンは極めて高いATPアーゼ活性を有し、その配列(配列番号1)の89〜95番のアミノ酸Gly−Ser−Glu−Gly−Pro−Leu−Lysは、GXXGXXKの形態の古典的ATP結合モチーフを有することが示されている。従来技術では、ESのATPアーゼ活性は、ESの内皮細胞移動阻害活性と負の関係があることが示され、この現象はワールブルグ効果によって説明することができる。このパターンは、ATPアーゼ活性を低下させた一連のES突然変異体で証明および解明されている(PCT/CN2012/081210)。

0007

本発明は、ESのATPアーゼ活性、およびこのような活性に基づくES薬設計およびより高い抗腫瘍活性を有するES突然変異体に関する。

0008

GXXGXXKの形態の古典的ATP結合モチーフに加え、天然ES分子はATPアーゼ活性に関連する別の部位、すなわち、天然ES配列(配列番号1)の171〜175番に補助結合モチーフVal−Leu−Cys−Ile−Gluも有することが本発明により見出され、前記モチーフは別の古典型のATP結合モチーフ:hhhhE(配列中、hは疎水性アミノ酸残基を表す)に従う。

0009

また、2つのATP結合モチーフが調整された場合にのみ、ESのATPアーゼ活性は保証され得ることも本発明により見出される。これら2つのモチーフ内で、GXXGXXK結合モチーフを有する部位が主要な結合および触媒機能遂行し、hhhhE形態の結合モチーフは、ESと基質ATPの結合状態に影響を与えることによりATPアーゼ活性に重要な影響を持つ。従って、ESのATPアーゼ活性は、これら2つのATP結合モチーフのアミノ酸残基の欠失、挿入または置換によって変化させることができる。

0010

本発明において、ES分子内の、GXXGXXKの形態を有するATP結合モチーフは、Walker Aモチーフ(すなわち、Aモチーフ)と呼ばれる。このAモチーフは、主要な触媒的働きを果たす。ESのATPアーゼ活性は、Aモチーフのアミノ酸残基の欠失、挿入または置換によって増加(増強)または低下(低減)させ得る。

0011

本発明において、ES分子内の、hhhhEの形態を有するATP結合モチーフは、Walker Bモチーフ(Bモチーフ)と呼ばれる。Bモチーフは主としてESとATPの結合を助け、ATPの加水分解を直接触媒することはしない。従って、Bモチーフのアミノ酸残基の欠失、挿入または置換は、通常、ESのATPアーゼ活性を低下させるだけである。しかしながら、理論的には、特定のAモチーフに関して、Bモチーフにおける適当な変化はATPアーゼ活性の増加もまた引き起こし得る。よって、ATPアーゼ活性が改善されたES突然変異体が望まれるなら、AモチーフおよびBモチーフは薬物設計において適合して調節されなければならない。

0012

驚くべきことに、本発明により、ATPアーゼ活性が有意に改善されたES突然変異体に関して、それらの内皮細胞の移動を阻害し、腫瘍を阻害する活性は、天然ESおよびATPアーゼ活性を低下させたES突然変異体の活性よりも有意に高いことが見出された。

0013

ESは、抗血管新生タンパク質であり、その最も基本的な機能は、内皮細胞の活性を抑制することにより血管新生を阻害することであり、よって、それは腫瘍、網膜黄斑変性肥満糖尿病などの血管新生関連疾患を治療することができる。本発明者らは、より高いATPアーゼ活性を有するES突然変異体が、血管新生関連疾患(例えば、腫瘍、肥満、脂肪肝インスリン抵抗性など)の阻害に、天然ESまたはATPアーゼ活性を低下させたES突然変異体よりも改善した活性を示すことを見出した。

0014

加えて、ESの抗血管新生活性とそのATPアーゼ活性の間の関連の発見に基づき、ATPアーゼ活性をさらに変更する(例えば、増加させる)ために、従って、腫瘍などの血管新生関連疾患をより良好に阻害するES薬を得るために、ES突然変異体を分子クローニングアプローチによって設計することができる。

0015

本発明はまた、ESまたはその変異体のATPアーゼ活性を増加させることを含む、ESまたはその変異体の抗腫瘍活性を改善する方法を提供する。具体的には、ATPアーゼ活性を増加させたESまたはその変異体の突然変異体を得るために、遺伝子工学的アプローチによりESまたはその変異体の2つのATP結合モチーフに突然変異を導入することができ、前記突然変異体は、内皮細胞移動阻害活性の増加および腫瘍阻害活性の増加など、改良された生物学的活性を有する。

0016

本発明はまた、抗血管新生活性を増加させたES突然変異体であって、そのATP結合モチーフに突然変異を含み、かつ、野生型ESまたはそのいくつかの変異体に比べて高いATPアーゼ活性を有するES突然変異体を提供する。

0017

好ましくは、野生型ESと比較した場合、前記ES突然変異体のATPアーゼ活性は少なくとも100%増加し、これは前記ES突然変異体のATPアーゼ活性が野生型ESの活性の200%、野生型ESの活性の300%またはそれを超える活性であることを意味する。ATPアーゼ活性を低下させる操作スキームに比べて、ATPアーゼ活性を増加させる操作スキームは、最適化に大きな余地がある。

0018

いくつかの実施形態では、対応する野生型ESまたはその変異体と比較した場合、ATPアーゼ活性を増加させた突然変異体は、そのATP結合モチーフのAモチーフに突然変異を含む。例えば、前記突然変異体は、配列番号1の89〜95番のアミノ酸残基からなるGly−Ser−Glu−Gly−Pro−Leu−Lysモチーフに対応する配列に突然変異を含み、前記突然変異は、1もしくは数個のアミノ酸の欠失、挿入もしくは置換、またはそれらの組合せから選択され、前記突然変異は、前記突然変異体のATPアーゼ活性の増加をもたらす。

0019

いくつかの実施形態では、Aモチーフ、すなわち、配列番号1の89〜95番のアミノ酸残基からなるGly−Ser−Glu−Gly−Pro−Leu−Lysモチーフに対応する前記突然変異体の配列が変異され、前記突然変異は、前記突然変異体のATPアーゼ活性の増加をもたらす。

0020

いくつかの実施形態では、前記突然変異体は、野生型ESまたはその変異体と比較した場合にBモチーフに突然変異を含む。

0021

いくつかの実施形態では、配列番号1の171〜175番のアミノ酸残基からなるBモチーフ、すなわち、Val−Leu−Cys−Ile−Glu補助結合モチーフに対応する前記突然変異体の配列は、部分的にまたは完全に変異を受けている。

0022

また、本発明により、ESにCモチーフ(Walker Cモチーフ)、すなわち、配列番号1の141〜144番のアミノ酸残基からなるGlu−Ala−Pro−Serモチーフが存在し、それはESの抗血管新生活性に重要な効果を持つことも見出された。

0023

いくつかの実施形態では、Cモチーフ、すなわち、配列番号1の141〜144番のアミノ酸残基からなるGlu−Ala−Pro−Serモチーフに相当する前記突然変異体の配列は、部分的にまたは完全に変異され、ESのATPアーゼ活性および抗血管新生活性を増加させることができる。

0024

好ましくは、Cモチーフに対応する配列番号1の141〜144番のアミノ酸残基からなるGlu−Ala−Pro−Serモチーフは、ESの抗血管新生機能を増加させ得るAsp−Ser−Arg−Alaに完全に変異されている。

0025

好ましくは、突然変異体のCモチーフに対応するモチーフの突然変異操作は、ESの抗血管新生機能をさらに増加させるためにAおよびBモチーフの突然変異操作と組み合わせて行うことができる。

0026

好ましくは、以下の操作スキームをESまたはその変異体に適用すると、そのATPアーゼ活性を増加させる:(1)配列番号1のAモチーフGXXGXXKにおいて保存されているアミノ酸残基G89、G92、およびK95に対応するアミノ酸残基を変更せずに維持すること;(2)AモチーフGXXGXXK内の可変残基Xを調製することによりAモチーフに対応するペプチドの空間的立体配座の柔軟性を高めること;(3)AモチーフGXXGXXKの古典的配列の残基K95の後にSerまたはThrを付加すること;(4)Aモチーフの変化に応じてBモチーフを調整すること;(5)Cモチーフのアミノ酸残基を部分的にまたは完全に変異させること;(6)Bモチーフの変化に応じてCモチーフを調整すること;(7)Aモチーフの変化に応じてCモチーフを調整すること;(8)A、B、およびCモチーフを同時に変化させること。

0027

上記の8つのスキームはそれぞれ単独で使用することができ、より好ましくは、ATPアーゼ活性を増加させたより良いES突然変異体を得るために組み合わせて使用することができる。

0028

詳細な実施形態では、本発明のES突然変異体は、以下の群:配列番号3〜34および配列番号37〜39から選択される配列を有する。好ましくは、本発明のエンドスタチン突然変異体は、以下の群:配列番号3、配列番号20、配列番号21、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号28、配列番号29および配列番号30から選択される配列を有する。

0029

好ましくは、上記のような本発明のES突然変異体は、ヒトES突然変異体である。

0030

より好ましくは、上記のような本発明のES突然変異体は、ATPアーゼ結合部位に突然変異を含んでなる。

0031

本発明はまた、上記のような本発明のES突然変異体と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物では、前記ES突然変異体は、ポリエチレングリコール(PEG)分子と共有結合している。好ましくは、前記PEG分子は、モノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)であり、前記PEG分子の分子量は5〜40kD、例えば、5〜20kD、または20〜40kDであり得、好ましくは、前記PEG分子の分子量は20kDであり、例えば、20kDのモノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)、例えば、モノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド(mPEG−ALD)またはモノメトキシポリエチレングリコールブチルド(mPEG−Buty)である。

0032

好ましくは、PEG分子は、前記ES突然変異体のN末端においてαアミノ基と共有結合している。

0033

本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の薬学上許容可能な担体を用いる常法により、例えば、それを散剤または注射剤に処方することにより得ることができる。

0034

用語「治療上有効な量」は、本明細書で使用する場合、ヒト身体において、臨床家により求められる生物学的または医学的応答を生じるのに十分な有効化合物の量を意味する。この用量は使用する化合物、投与様式、疾患の状態およびその他の因子によって異なると認識される。患者許容可能な典型的な一日用量は、体重1kg当たり0.01mg〜100mgの範囲であり得る。

0035

本発明はまた、腫瘍患者に上記のような本発明のES突然変異体または本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、腫瘍を治療するための方法を提供する。対象への投与は、好都合には静注などの当業者に公知の方法によって実施され得る。

0036

本発明はまた、肥満、脂肪肝またはインスリン抵抗性に苦しむ患者に、上記のような本発明のES突然変異体または本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、肥満、脂肪肝またはインスリン抵抗性を治療する方法も提供する。

0037

本発明はまた、血管新生関連疾患の治療のための医薬の製造における上記のようなES突然変異体の使用に関する。例えば、前記血管新生関連疾患は、腫瘍、肥満、脂肪肝、インスリン抵抗性などであり得る。

図面の簡単な説明

0038

図1は、操作された細菌におけるES突然変異体S03の発現を示す。
図2は、ES突然変異体S03およびそのmPEG修飾産物の精製を示す。(A)封入体からのタンパク質の精製。(B)再折り畳みタンパク質の精製。(C)修飾タンパク質の精製。
図3は、天然ヒトES配列を示す。但し、大腸菌(Escherichia coli)で組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図4は、S03配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図5は、S04配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図6は、S05配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図7は、S06配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図8は、S07配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図9は、S08配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図10は、S11配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図11は、S13配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図12は、S14配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図13は、S15配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図14は、S16配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図15は、S17配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図16は、S18配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図17は、S19配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図18は、S20配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図19は、NSN1配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図20は、NSN2配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図21は、NSN3配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図22は、NSN4配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図23は、E176A配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図24は、C174E配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図25は、E−M配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、N末端の最初のアミノ酸残基Mは無作為に欠失していることがある。
図26は、内皮細胞移動阻害活性に関する非修飾ES突然変異体S03、NSN4およびE−Mの比較を示す。
図27は、内皮細胞移動阻害活性に関するES突然変異体E176AとC174Eの比較を示す。
図28は、内皮細胞移動阻害活性に関する修飾ES突然変異体MS03、MS04、MS05、MS06、MS07、MS08、MS11、およびMS13の比較を示す。
図29は、内皮細胞移動阻害活性に関する修飾ES突然変異体MS03、MS14、MS15、MS16、MS17、MS18、MS19、およびMS20の比較を示す。
図30は、内皮細胞移動阻害活性に関する修飾ES突然変異体MS03、MNSN1、MNSN2、MNSN3およびMNSN4の比較を示す。
図31は、ESの増幅のためのフォワードPCRプライマー配列(配列番号35)を示す。
図32は、ESの増幅のためのリバースPCRプライマー配列(配列番号36)を示す。
図33は、ES突然変異体36(配列番号25)、249(配列番号26)、381(配列番号27)、57(配列番号28)、114(配列番号29)、124(配列番号30)および125(配列番号31)の配列を示す。
図34は、ES突然変異体160(配列番号32)、163(配列番号33)および119(配列番号34)の配列を示す。
図35は、内皮細胞移動阻害活性に関する非修飾ES突然変異体36、249、381と修飾ES突然変異体M36、M249、M381の比較を示す。
図36は、内皮細胞移動阻害活性に関する修飾ES突然変異体NSN4、M249、M119、M160、M163、M125、M57、M124およびM114の比較を示す。
図37は、非修飾ES突然変異体Endu−E−M(配列番号37)、Endu−114(配列番号38)およびEndu−57(配列番号39)の配列を示す。
図38は、内皮細胞移動阻害活性に関する非修飾ES突然変異体Endu−E−M、Endu−114およびEndu−57の比較を示す。

0039

特に断りのない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者により共通に理解されている意味を有するものとする。一般に、本明細書で使用される細胞および組織培養分子生物学免疫学微生物学遺伝学およびタンパク質および核酸化学に関連する名称および技術は当技術分野で周知であり、慣用されている。

0040

特に断りのない限り、本明細書で使用される方法および技術は、一般に、常法または本明細書に引用されている参照文献に従って実施される。

0041

ES、ES突然変異体およびPEG修飾産物
ES(エンドスタチン)は、天然エンドスタチン、例えば、配列番号1の配列を有するヒトエンドスタチンを意味し、ヒトESが大腸菌で組換え発現された場合、アミノ酸残基Mが一部の産物のN末端に無作為に付加される(図3)。本出願では、ES突然変異体は、ATP結合モチーフにおけるアミノ酸欠失、挿入または置換など、ES変異体の1またはいくつかのアミノ酸残基を変異させることにより得られる突然変異体タンパク質を意味する。ES突然変異体は天然型であり得、例えば、ESが酵母で組換え発現される場合、N末端の無作為な欠失のためにN末端において4個のアミノ酸が欠失したES突然変異体が産生されることがあり、さらに、C末端のKも無作為に欠失していることがある。ES突然変異体はまた、例えば、タンパク質発現を促進し、安定性を改善するために人工的に構築することもでき、Enduは、遺伝子工学的手段により天然ESのN末端に9個の付加的アミノ酸残基MGGSHHHHHを付加することにより作出された突然変異体であり、大腸菌で組換え発現される場合に、最初のアミノ酸Mは無作為に欠失していることがあり、これによりEnduは配列番号2の配列を有することになる。

0042

本発明における非修飾型および修飾型のESおよびES突然変異体タンパク質は総てBeijing Protgen社により提供された。

0043

ポリエチレングリコール(PEG)修飾ESはM2ESと呼称され、PEG修飾ES突然変異体は、突然変異体名称の前に「M」を付けて呼称される:例えば、PEG修飾ES突然変異体S03はMS03と呼称され、PEG修飾ES突然変異体NSN1はMNSN1と呼称される。例えば、本発明のいくつかの詳細な実施形態では、MS03またはMNSN1と呼称される分子は、分子量20kDのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド(mPEG−ALD)により修飾された、S03またはNSN1と呼ばれる突然変異体の産物であり得、それらのカップリング部位は、活性化されたmPEG−ALDアルデヒド基とS03またはNSN1のN末端αアミノ基である。

0044

ATP結合モチーフは、ATPアーゼ活性を有するタンパク質分子内の、ATPと結合する典型的なアミノ酸配列を意味する。ATP結合モチーフは通常、1つのPループ構造を有し、このPループ構造は以下の典型的な配列:GXXGXXK、(G/A)XXXXGK(T/S)、GXXXXGKSおよびGXXGXGKSを有する。ヒトESでは、ATP結合モチーフは主としてGXXGXXKの形態の配列を意味し、配列中、Xで置換されないアミノ酸残基はより保存性が高い。一般に、これらのATP結合モチーフはまた、GTP、UTP、CTPなどとも結合できる。

0045

本発明で言及されるATP結合モチーフは、Aモチーフ(Walker Aモチーフ)、Bモチーフ(Walker Bモチーフ)およびCモチーフ(Walker Cモチーフ)を含む。Aモチーフは、GXXGXXKの形態の配列を有する部位を意味し、配列中、Xは可変アミノ酸残基である。Aモチーフは、ESおよびATP結合および触媒的加水分解の主要部位である。Bモチーフは、hhhhEの形態の配列を有する部位を意味し、配列中、hは疎水性アミノ酸残基である。BモチーフはATPとESの結合に関与し、ESとATPの結合に影響を及ぼすことによりESのATPアーゼ活性に影響を及ぼす。Cモチーフは、ES分子においてGlu−Ala−Pro−Ser(すなわち、EAPS)の配列を有する部位を意味し、ESとATPとの結合に間接的に影響を及ぼすことによりESのATPアーゼ活性に影響を与える可能性があり、このことはES−ATP複合体結晶構造の情報によって確認する必要がある。加えて、タンパク質の空間的立体配座はペプチド鎖の折り畳みにより形成されるので、一次配列において隣接するアミノ酸残基は空間的立体配座では互いに近接し、逆に、一次配列では遠隔のアミノ酸残基が空間的立体配座では互いに近接することも多い。タンパク質分子の局部的な立体配座の安定性は、全体的な分子の立体配座の安定性に大きく依存し、局部的なアミノ酸配列の変化は全体的な分子の立体配座の変化をもたらし得る。よって、当業者には、A、B、およびCの3つのモチーフから離れた、ESとATPの相互作用の調節に関与する他の部位も存在し、それらの部位もまたESのATPアーゼ活性に影響を与え、血管新生を阻害し得ることが認識されるであろう。これらの部位は、単独で、またはA、B、Cモチーフもしくはそれらの任意の組合せとの組合せにおいて、ESのATPアーゼ活性に影響を及ぼし、血管新生を阻害する役割を果たす可能性がある。よって、本発明のいくつかの実施形態では、A、B、Cモチーフまたはそれらの組合せにおける突然変異に加え、より良い結果を達成するために、前記3つのモチーフ以外の部位にも突然変異を導入した。

0046

本発明者らは、供試したES、ES変異体、ES突然変異体およびそれらのmPEG修飾産物のATPアーゼ活性が内皮細胞移動阻害活性に正の相関があり、すなわち、内皮細胞移動阻害活性が高いES突然変異体はATPアーゼ活性も高いことを見出した。この発見に基づき、内皮細胞移動阻害活性が高いESを得るために、本発明者らは、ESのATP結合モチーフにおけるアミノ酸欠失、挿入または置換により、ESのATPアーゼ活性を増加させることができる。

0047

よって、本発明はまた、ESまたはその変異体のATPアーゼ活性を増加させることを含む、ESまたはその変異体の、血管新生および腫瘍成長を阻害する活性を増加させる方法を提供する。具体的には、遺伝子工学的手段により、ATPアーゼ活性を増加させたESまたはその変異体の突然変異体を得るために、ESまたはその変異体の、ATP結合に関与するAモチーフGXXGXXKに、またはAモチーフとBモチーフに同時に、またはCモチーフに、またはA、BおよびCモチーフの任意の組合せに突然変異を導入することができる。これらの突然変異体は、血管新生を阻害する(例えば、内皮細胞の移動を阻害する)活性の増加および腫瘍成長を阻害する活性の増加などの、改良された生物学的活性を有する。とりわけ、Bモチーフにおける突然変異は、通常、血管新生および腫瘍成長を阻害する活性の低下をもたらすので、Bモチーフの突然変異には特に注意払うべきである。

0048

よって、本発明の一例では、以下の突然変異がESのAモチーフまたはBモチーフに導入された。
S03−配列番号3(図4
S04−配列番号4(図5
S05−配列番号5(図6
S06−配列番号6(図7
S07−配列番号7(図8
S08−配列番号8(図9
S11−配列番号9(図10
S13−配列番号10(図11
S14−配列番号11(図12
S15−配列番号12(図13
S16−配列番号13(図14
S17−配列番号14(図15
S18−配列番号15(図16
S19−配列番号16(図17
S20−配列番号17(図18
NSN1−配列番号18(図19
NSN2−配列番号19(図20
NSN3−配列番号20(図21
NSN4−配列番号21(図22
E176A−配列番号22(図23
C174E−配列番号23(図24
E−M−配列番号24(図25
36−配列番号25(図33
249−配列番号26(図33
381−配列番号27(図33
57−配列番号28(図33
114−配列番号29(図33
124−配列番号30(図33
125−配列番号31(図33
160−配列番号32(図34
163−配列番号33(図34
119−配列番号34(図34
Endu−E−M−配列番号37(図37
Endu−57−配列番号38(図37
Endu−114−配列番号39(図37

0049

ATPアーゼ活性を生化学的方法により測定した場合に、内皮細胞移動阻害活性を増加させた突然変異体のATPアーゼ活性は、ESの内皮細胞移動阻害活性よりも有意に高かったことが判明した(表1)。

0050

ATP結合モチーフにおける突然変異により生じたEnduのATPアーゼ活性および内皮細胞移動阻害活性の変化は、同じ突然変異によって生じたES関連活性の変化と同等であったことが判明した。従って、本発明者らは、ESにおけるATP結合モチーフを変異させることによりATPアーゼ活性および内皮細胞移動阻害活性を変化させる方法をES突然変異体に適用することも可能であると考える。

0051

よって、本発明はまた、血管新生阻害活性を増加させたES突然変異体であって、それらのAモチーフおよび/またはBモチーフおよび/またはCモチーフに突然変異を含んでなり、そのATPアーゼ活性が、対応する野生型ESまたはその変異体に比べて増加した突然変異体も提供する。

0052

好ましくは、ES突然変異体のATPアーゼ活性は、野生型ESに比べて少なくとも100%増加し、すなわち、前記突然変異体のATPアーゼ活性は野生型ESの活性の200%であり、野生型ESの活性の300%またはそれを超える。

0053

いくつかの実施形態では、前記突然変異体は、対応する野生型ESまたはES変異体と比較した場合に、それらのATP結合モチーフに突然変異を含んでなる。例えば、前記突然変異体は、配列番号1の89〜95番のアミノ酸残基からなるGly−Ser−Glu−Gly−Pro−Leu−Lysモチーフに対応する配列に突然変異を有し、前記突然変異は1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの組合せから選択され、これにより前記突然変異体は増加したATPアーゼ活性を有することとなる。

0054

好ましくは、以下の操作スキームをESまたはその変異体に適用すると、そのATPアーゼ活性を増加させる(1)配列番号1のAモチーフGXXGXXKにおいて保存されているアミノ酸残基G89、G92、およびK95に対応するものを変更せずに維持すること;(2)AモチーフGXXGXXK内の可変残基Xを調製することによりAモチーフに対応するペプチドの空間的立体配座の柔軟性を高めること;(3)場合により、古典的AモチーフGXXGXXKの配列の残基K95の後にSerまたはThrを付加すること;(4)Aモチーフの変化に応じてBモチーフを調整すること;(5)Cモチーフのアミノ酸残基を部分的にまたは完全に変異させること;(6)Bモチーフの変化に応じてCモチーフを調整すること;(7)Aモチーフの変化に応じてCモチーフを調整すること;(8)A、B、およびCモチーフを同時に変化させること。

0055

詳細な実施形態では、本発明のES突然変異体は、以下:配列番号3〜21、および24からなる群から選択される配列を含んでなる。好ましくは、本発明のエンドスタチン突然変異体は、以下:配列番号3、配列番号20、配列番号21、および配列番号24からなる群から選択される配列を含んでなる。

0056

好ましくは、本発明のES突然変異体はヒトES突然変異体である。

0057

本発明はまた、患者に有効量の、上記のような本発明のエンドスタチン突然変異体または上記のような本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、腫瘍を治療する方法も提供する。血管新生関連疾患には、腫瘍、肥満、脂肪肝およびインスリン抵抗性が含まれる。好ましくは、血管新生関連疾患は腫瘍である。

0058

本発明を以下の限定されない例によりさらに説明する。本発明はこれらの例に限定されないと理解されるべきである。

0059

実施例1:ES組換え株の構築
本実施例では、エンドスタチンをヒト肺癌細胞A549のcDNAからクローニングし、pET30aプラスミドに連結した。遺伝子増幅に使用した5’プライマーはGGAATTCCATTGCACAGCACCGCGACTTC(図31、配列番号35)であり、3’プライマーはCCGCTCGAGTTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG(図32、配列番号36)であった。エンドヌクレアーゼはそれぞれNdeIおよびXhoIであった。

0060

上記の組換えプラスミドを、従来の分子クローニング技術に従って大腸菌に形質転換し、発現させた。

0061

実施例2:ATP結合モチーフ突然変異を有するES突然変異株の構築
本実施例では、野生型ヒトESのATP結合モチーフに対して突然変異操作を行った。上流および下流プライマーならびに形質転換法は実施例1と同じであった。突然変異体の番号および生じた変化は次の通りである。
S03−配列番号3(図4)N末端の4つのアミノ酸残基HSHRを欠失させるとともに、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した;
S04−配列番号4(図5) N末端の4つのアミノ酸残基HSHRを欠失させ、Aモチーフの後にSを挿入した。同時に、BモチーフのEとそれに続くアミノ酸残基NSFMTASKを欠失させた;
S05−配列番号5(図6) N末端の4つのアミノ酸残基HSHRを欠失させ、Aモチーフの後にTを挿入した。同時に、BモチーフのEとそれに続くアミノ酸残基NSFMTASKを欠失させた;
S06−配列番号6(図7) N末端の4つのアミノ酸残基HSHRを欠失させるとともに、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、次いで、Tを挿入した。同時に、BモチーフのEとそれに続くアミノ酸残基NSFMTASKを欠失させた;
S07−配列番号7(図8) AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。同時に、C末端アミノ酸残基SFMTASKを欠失させた;
S08−配列番号8(図9) AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。同時に、C末端アミノ酸残基TASKを欠失させた;
S11−配列番号9(図10) C末端アミノ酸残基SFMTASKを欠失させた;
S13−配列番号10(図11) N末端残基HSを欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。同時に、C末端のSFMTASKを欠失させた;
S14−配列番号11(図12) N末端残基HSを欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。同時に、C末端のTASKを欠失させた;
S15−配列番号12(図13) N末端残基HSを欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。同時に、C末端のKを欠失させた;
S16−配列番号13(図14) N末端残基Hを欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。同時に、C末端のKを欠失させた;
S17−配列番号14(図15) N末端残基Hを欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。同時に、C末端のSFMTASKを欠失させた;
S18−配列番号15(図16) N末端残基Hを欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。同時に、C末端のTASKを欠失させた;
S19−配列番号16(図17) N末端残基Hを欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した;
S20−配列番号17(図18) N末端残基HSを欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した;
NSN1−配列番号18(図19) Ser−88を欠失させ、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した;
NSN2−配列番号19(図20) AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、P96TおよびG97P;
NSN3−配列番号20(図21) AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、P96T;
NSN4−配列番号21(図22) AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、P96T、Gly−98を挿入した;
E176A−配列番号22(図23) E176A;
C174E−配列番号23(図24) C174E;
E−M−配列番号24(図25) AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、Tを挿入した。

0062

実施例3:組換えESおよびその突然変異体の発現および調製
本実施例では、ESおよびその突然変異体の発現および調製は、一例としてS03を挙げて以下に簡単に記載される:ESまたはその突然変異体操作株を、振盪フラスコ内のLB培地中で一晩、分散培養し、5Lのファーメンター(Sartorius)に播種し、誘導のためにIPTGを適時に加えた。誘導後、培養を約4時間続け、次いで、細菌を回収し、電気泳動により分析した(図1)。

0063

菌体PBSバッファー再懸濁させ、高圧ホモジナイザーで3回繰り返して十分に破砕し、各回の破砕の後に遠心分離を行って沈降物を回収し、その後、これをPBSバッファーに再懸濁させた。破砕した細菌の沈降物を、8M尿素を含有するTris−HClバッファー(pH8.5)に溶解した後、DEAEクロマトグラフィー媒体(GE Healthcare)を用い、Tris−HClバッファー pH8.5で溶出させた。浸透画分を回収し、再生前に精製タンパク質を得た。タンパク質の再折りたたみの後に、CMクロマトグラフィー媒体(GE Healthcare)を用い、0〜500mMの塩濃度範囲のNaClを含むTris−HClバッファー pH8.5を用いて勾配溶出を行い、95%より高い純度の再折り畳みタンパク質を得た(図2A、B)。再折り畳みタンパク質をNaAc−HAc(pH6.0)に対して透析した。平均分子量20kDのモノメトキシポリエチレングリコールプロパナール(mPEG−ALD、20kDa、Beijing JianKai Technology Co.,Ltd)を用い、製品仕様書に記載の操作法に従って、再折り畳みタンパク質のN末端単一修飾を行った。この修飾産物を、SPカラム(GE Healthcare)を用いて精製し、0〜500mM濃度のNaClを用いて勾配溶出を行い、目的画分を得た(図2C)。

0064

他のES突然変異体およびそれらの修飾産物の調製も上記と同じとした。

0065

実施例4:ES、ES突然変異体およびそれらのmPEG修飾産物のATPアーゼ活性アッセイ
本実施例では、従来技術(PCT/CN2012/081210)に開示されている、ATPアーゼ活性を試験するための方法を使用した。ES、ES突然変異体およびそれらのmPEG修飾産物ATPアーゼ活性を試験した。これらの結果を表1に示す。比較的高いATPアーゼ活性を有するタンパク質ミオシン(ブタ心臓から抽出、Sigma)をこのアッセイの陽性対照として使用した。

0066

実施例5:ESおよびES突然変異体の内皮細胞移動阻害活性
本実施例では、従来技術(PCT/CN2012/081210)に開示されているトランスウェル内皮細胞アッセイを使用した。内皮細胞HMECを以下の群に分け、異なる処理を施した。第1群:陰性対照群、無ES(同量バッファー溶液を加えた)処理;第2群:ES(20μg/mL)処理;第3群:ES突然変異体YH−16(20μg/mL)処理;第4群:ES突然変異体S03(20μg/mL)処理;第5群:ES突然変異体NSN4(20μg/mL)処理;第6群:ES突然変異体E−M(20μg/mL)処理。結果は、S03、NSN4およびE−Mの内皮細胞移動阻害活性がESに比べて有意に増加したことを示した。S03、NSN4およびE−M処理群の移動細胞の数は、ES処理群のそれぞれおよそ30%、16%および40%であった(図26)。

0067

ES突然変異体E176AおよびC174Eの内皮細胞移動阻害活性も同じアッセイを用いて試験した。E176AおよびC174Eの内皮細胞移動阻害活性は両方ともESより低かった(図27)。

0068

実施例6:mPEG修飾ES、ES突然変異体の内皮細胞移動阻害活性
mPEG修飾ES、ES突然変異体の内皮細胞移動阻害活性は、実施例5に記載の方法によって試験した。内皮細胞移動阻害活性の増強は、突然変異タンパク質間の活性の違いをより明瞭に反映するために多くの突然変異タンパク質に関して有意であったことから、本実施例では、低用量(すなわち、5μg/mL)を用いて細胞を処理したところ、次のように、なお明確な阻害効果観測することができた。

0069

mPEG修飾ES突然変異体MS03、MS04、MS05、MS06、MS07、MS08、MS11、MS13の内皮細胞移動阻害活性(図28)。とりわけ、MS03、MS04、MS07、MS11、MS13の内皮細胞移動阻害活性は、M2ESの活性よりも有意に良好であり、MS03処置群の移動細胞数はM2ES処理群の約1/8であり、MS04、MS07、MS11およびMS13処理群の移動細胞数はM2ES処理群の約1/2であり、MS05、MS06およびMS08の内皮細胞移動阻害活性はM2ESの活性よりも低かった。

0070

mPEG修飾ES突然変異体MS03、MS14、MS15、MS16、MS17、MS18、MS19、MS20の内皮細胞移動阻害活性(図29)。とりわけ、MS03、MS14、MS17の内皮細胞移動阻害活性は、M2ESの活性より有意に良好であり、MS15、MS19の内皮細胞移動阻害活性は、M2ESの活性と有意差は無く、MS16、MS18、MS20の内皮細胞移動阻害活性は、M2ESの活性より低かった。

0071

mPEG修飾ES突然変異体MS03、MNSN1、MNSN2、MNSN3、MNSN4の内皮細胞移動阻害活性(図30)。とりわけ、MS03、MNSN1、MNSN2、MNSN3およびMNSN4の内皮細胞移動阻害活性は、M2ESの活性よりも有意に良好であり、MNSN4処理群の移動細胞数はM2ESの約1/20であった。

0072

ATPアーゼ活性を増加させた突然変異は、ESの場合と同等かまたは有意に高い内皮細胞移動阻害活性を示し、ATPアーゼ活性と内皮細胞移動阻害活性の間の正の相関と一致する。

0073

実施例7:ES突然変異株の構築
本実施例では、野生型ヒトESに対して突然変異操作を行い、具体的な方法、上流および下流プライマーおよび操作方法は実施例1と同じとした。突然変異体の番号およびそれらの配列を図33および図34に示す。

0074

36−配列番号25(図33)N末端の3つのアミノ酸残基HSHを欠失させ、A39Q、およびGly−89を欠失させた;
249−配列番号26(図33) N末端の3つのアミノ酸残基HSHを欠失させ、AモチーフをGSQGQLQとなるように変異させ、CモチーフをDERGとなるように変異させた;
381−配列番号27(図33) AモチーフをGSEAPLRとなるように変異させた;
57−配列番号28(図33) AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、CモチーフをDSRAとなるように変異させた;
114−配列番号29(図33) BモチーフをVLCIAとなるように変異させ、CモチーフをDSRAとなるように変異させた;
124−配列番号30(図33) N末端の4つのアミノ酸残基HSHRを変異させ、AモチーフをGSEGPLRとなるように変異させ、CモチーフをDSRAとなるように変異させた;
125−配列番号31(図33) N末端の4つのアミノ酸残基を変異させ、AモチーフをGSEGPLRとなるように変異させ、CモチーフをDSRAとなるように変異させ、かつ、KをC末端に付加した;
160−配列番号32(図34) A、B、およびCモチーフ以外のアミノ酸残基を変異させた、配列を参照;
163−配列番号33(図34) AモチーフをGSQGQLQとなるように変異させ、CモチーフをETTGとなるように変異させた;
119−配列番号34(図34) AモチーフをVSQGQLQとなるように変異させた。

0075

実施例8:mPEG修飾ESおよびES突然変異体の内皮細胞移動阻害活性
mPEG修飾ESおよびES突然変異体の内皮細胞移動阻害活性は、実施例6に記載の方法によって試験され、次のように詳述される:
mPEG修飾ES突然変異体36、249、381および修飾S突然変異体M36、M249、M381の内皮細胞移動阻害活性(図35)。とりわけ、36処理群の移動細胞数は、ES処理群の約70%であった。249および381群の活性とES群の活性の間の内皮細胞移動阻害には有意な差は無く、修飾突然変異体M36処理群の移動細胞数はES処理群の約50%であり、M249、M381群の活性とES群の活性の間の内皮細胞移動阻害には有意な差は無かった。

0076

mPEG修飾ES突然変異体NSN4、M249、M119、M160、M163、M125、M57、M124、M114の内皮細胞移動阻害活性(図36)。NSN4、M249、M160、M163、M125、M57、M124、M114の内皮細胞移動阻害活性は、M2ESの活性に比べて有意に高かった。M119は、M2ESに比べて有意差は無かった。とりわけ、M57、M124およびM114処理群の移動細胞数は、M2ES処理群のそれぞれ約34%、28%および24%であった。

0077

実施例9:ES突然変異株の構築
本実施例では、Enduに対して突然変異操作を行い、具体的な方法、上流および下流プライマーおよび形質転換法は実施例1と同じとした。突然変異体の番号およびそれらの配列を図37に示す。

0078

Endu−E−M−配列番号37(図37)N末端にMGGSHHHHHを付加し、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、その後にTを挿入した;
Endu−57−配列番号38(図37) N末端にMGGSHHHHHを付加し、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、その後にTを挿入した;
Endu−114−配列番号39(図37) N末端にMGGSHHHHHを付加し、AモチーフをGESGAGKとなるように変異させ、その後にTを挿入した。

0079

実施例10:mPEG修飾ES突然変異体の内皮細胞移動阻害活性
mPEG修飾ES突然変異体Endu−E−M、Endu−57、Endu−114の内皮細胞移動阻害活性を、実施例6に記載の方法により試験した(図38)。

0080

Endu−E−M、Endu−57およびEndu−114の内皮細胞移動阻害活性は、Endu(対照)の活性よりも有意に良好であり、阻害率はそれぞれ64%、50%および34%であった。

実施例

0081

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