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技術 多価リガンド−脂質構築物

出願人 ボヴィン、ニコライウラジミロヴィチヘンリースティーブンマイケルコルチャーギナ、エレナロディオノフ、イーゴリレオニードヴィチツジコフ、アレクサンドルボリソヴィチ
発明者 ボヴィン、ニコライウラジミロヴィチヘンリー、スティーブンマイケルコルチャーギナ、エレナロディオノフ、イーゴリレオニードヴィチツジコフ、アレクサンドルボリソヴィチ
出願日 2015年11月23日 (5年0ヶ月経過) 出願番号 2017-545848
公開日 2018年3月8日 (2年8ヶ月経過) 公開番号 2018-506576
状態 特許登録済
技術分野 有機低分子化合物及びその製造 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質 医薬品製剤
主要キーワード 水性イソプロピルアルコール フシトール 丸め方 血液型検査 付随物 溶解対 代替表現 スタートライン
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2018年3月8日)のものです。
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図面 (2)

課題・解決手段

自然にかつ安定して膜に組み込まれる水分散性多価リガンド脂質構築物が開示される。

概要

背景

Bovinら(2005)の文献は、細胞膜を含む脂質二重膜に自然にかつ安定して組み込まれる合成分子を開示している。この合成分子は、スペーサー(S)を介してホスファチジルエタノールアミン等の脂質部分(L)に共有結合された単糖二糖三糖又はオリゴ糖等の機能性部分(F)からなる。スペーサーは、界面活性剤溶媒を使用せずに水中に容易に分散する合成分子を提供するように選択され、細胞表面抗原発現における定性的及び定量的変化をもたらすために使用され得る。この文献は、制御された量の血液型関連グリカンを発現する赤血球を調製する方法におけるこれらの合成分子の使用を開示している。これらの改変又は形質転換された細胞(ここでは「コデサイト(kodecyte)」と呼ぶ)は、血液型検査試薬品質保証において陽性対照として使用され得る。

Bovinら(2009)の文献は、長いスペーサー(S)を介して脂質(L)部分に共有結合された機能性部分(F)からなる機能的脂質構築物を開示している。この構築物は水に容易に分散可能であるにもかかわらず、Bovinら(2005)の文献に開示された合成分子と共通に、細胞膜に自然に組み込まれる。この構築物は、機能性部分(F)が細胞膜の表面から離れて提示されるという更なる利点を提供する。Bovinら(2010)の文献は、機能性部分(F)が受容体リガンドである構築物を開示している。この文献は、三又は四アンテナ構造マルチリガンド構築物を開示している。構築物のリガンド間の間隔は、リガンドとリガンド結合タンパク質又は受容体との間の多価相互作用を促進するように意図されている。

リガンド結合タンパク質には、グリカン結合タンパク質(GBP)が含まれる。これらのタンパク質は、免疫及び微生物宿主相互作用の機構において重要な役割を果たす。GBPはすべての個体の血清中に存在する。免疫系は、これらのGBPの有能かつ十分なレパートリーの存在に依存するところが大きい。GBPの多くは、正常ヒト組織で発現されるグリカンリガンドに結合する自然抗体(NAb)である(自己抗体)。しかし、NAbは多くの疾患とも関連している場合があり、例えば腫瘍関連炭水化物抗原(TACA)に対する抗体がある。健常から前悪性及び悪性への細胞の形質転換は、細胞の表面に提示されるタンパク質及び脂質における異常なグリコシル化出現と関連する。したがって、個体のNAbプロファイルの変化は、癌を含む多くの疾患の発症及び進行と関連し得る。

本発明の目的の一つは、リガンド結合タンパク質へのアビディティが増大したコデサイトの調製に使用するための多価リガンド−脂質構築物を提供することにある。上記の目的は、少なくとも有用な選択を提供するための目的と代替的に読み取られるべきである。

概要

自然にかつ安定して膜に組み込まれる水分散性多価リガンド−脂質構築物が開示される。

目的

スペーサーは、界面活性剤や溶媒を使用せずに水中に容易に分散する合成分子を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

下記構造の構築物であって:Fはリガンドであり、Sはテトラアンテナスペーサであり、Lは共役ホスファチジルエタノールアミドである、構築物。

請求項2

Sは下記構造:のテトラアンテナスペーサであり、ここで、mは1、2又は3の整数であり、Rは下記構造:のものであり、ここで、Mは一価カチオン又は置換基であり、nは2、3、4、5、6又は7の整数であり、*はF又はLの結合箇所である、請求項1に記載の構築物。

請求項3

MはH+であり、nは整数5である、請求項2に記載の構築物。

請求項4

Lは下記構造:の共役ホスファチジルエタノールアミドであり、ここで、M’は一価のカチオンであり、pは3、4又は5の整数であり、W1及びW2は独立してC16〜20アルキルあるいはモノ−又はジ−不飽和C16〜20アルケニル基から選択され、*はSの結合箇所である、請求項3に記載の構築物。

請求項5

多価リガンド脂質構築物が、下記の部分構造:を有する、請求項4に記載の構築物。

請求項6

前記構築物が下記の部分構造:を有する、請求項5に記載の構築物。

請求項7

Fはアミノアルキルグリコシドであり、多価リガンド−脂質構築物が下記構造:のものであり、ここで、Glycはグリカンであり、q及びrは1、2、3及び4から独立に選択される整数である、請求項6に記載の構築物。

請求項8

Glycは、単糖二糖三糖及びオリゴ糖:(Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ2Manα)23,6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ(YDS);Fucα2Galβ(Hdi);Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Leb);Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNFPI);Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Ley);Fucα2Galβ4GlcNAcβ(H2);Galα;Galβ1−3(Fucα1−3)GlcNAc;Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−3GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−3GlcNAc;Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−4GlcNAc;Galα3(Fucα2)Galβ(Btri);Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Bleb);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(B3);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(B4);Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(B1);Galα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Bley);Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(B2);Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili);Galα4Galβ4GlcNAcβ(P1);Galα4Galβ4Glcβ(Gb3(Pk));Galα4GlcNAcβ(α−LN);GalNAcα3(Fucα2)Galβ(Atri);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(ALeb);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(A3);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(A4);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(A1);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(ALey);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(A2);GalNAcα3GalNAcβ(Fs2);GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(Fs5);GalNAcα3Galβ(Adi);GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ;GalNAcβ;GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(P);GalNH2α3(Fucα2)Galβ(AcqB);Galβ;Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Lea);Galβ3GalNAcα(TF);Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ(GA1);Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Lex);Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ(i(LN2));Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNnT);Galβ4Glcβ(Lac);GlcAβ3[GlcNAcβ4GlcAβ3]nGlcNAc−aminoalditol(hyaluronate);Manα6(Manα3)Manβ(Man3);Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac3’LN);Neu5Acα3Galβ4Glcβ(Neu5Ac3’Lac);Neu5Acα6GalNAcαβ(SiaTn);Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac6’LN);Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Gc3’LN);SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAβ2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4Gal;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4Gal;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4(GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcandSAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcの群からなる群から選択されるグリカンである、請求項7に記載の構築物。

請求項9

Glycは、単糖、二糖、三糖及びオリゴ糖:(Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ2Manα)23,6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ(YDS);Fucα2Galβ(Hdi);Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Leb);Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNFPI);Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Ley);Fucα2Galβ4GlcNAcβ(H2);Galα;Galα3(Fucα2)Galβ(Btri);Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Bleb);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(B3);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(B4);Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(B1);Galα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Bley);Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(B2);Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili);Galα4Galβ4GlcNAcβ(P1);Galα4Galβ4Glcβ(Gb3(Pk));Galα4GlcNAcβ(α−LN);GalNAcα3(Fucα2)Galβ(Atri);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(ALeb);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(A3);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(A4);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(A1);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(ALey);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(A2);GalNAcα3GalNAcβ(Fs2);GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(Fs5);GalNAcα3Galβ(Adi);GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ;GalNAcβ;GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(P);GalNH2α3(Fucα2)Galβ(AcqB);Galβ;Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Lea);Galβ3GalNAcα(TF);Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ(GA1);Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Lex);Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ(i(LN2));Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNnT);Galβ4Glcβ(Lac);GlcAβ3[GlcNAcβ4GlcAβ3]nGlcNAc−aminoalditol(hyaluronate);Manα6(Manα3)Manβ(Man3);Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac3’LN);Neu5Acα3Galβ4Glcβ(Neu5Ac3’Lac);Neu5Acα6GalNAcαβ(SiaTn);Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac6’LN)及びNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Gc3’LN)の群からなる群から選択されるグリカンである、請求項8に記載の構築物。

請求項10

Glycは、Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili)及びGalNAcα3Galβ4GlcNAcβのうちから選択されるグリカンである、請求項9に記載の構築物。

請求項11

Fは、N−マレオイルβ−アラニン結合Cys残基であり、多価リガンド−脂質構築物は下記構造:のものであり、ここで、Xaaはアミノ酸残基であり、i及びjは独立してゼロ又は整数であり、ただしその合計は5〜30の範囲内にある、請求項6に記載の構築物。

請求項12

iは5〜30の範囲の整数であり、jはゼロである、請求項11に記載の構築物。

請求項13

iは整数13であり、jはゼロである、請求項12に記載の構築物。

請求項14

オリゴペプチドが配列番号01のペプチドである、請求項13に記載の構築物。

請求項15

1つ以上の請求項1〜14のいずれか一項に記載の構築物から本質的になる組成物腫瘍内注射により、腫瘍を有する患者治療する方法。

技術分野

0001

本発明は、自然にかつ安定して膜に組み込まれる水分散性多価リガンド脂質構築物、ならびに診断予後判定(prognostic)、予防及び治療用途におけるこのような構築物の使用に関する。特に、本発明は、リガンド結合タンパク質に対するアビディティが増大したコデサイト(kodecyte)の調製における多価リガンド−脂質構築物の使用に関する。

背景技術

0002

Bovinら(2005)の文献は、細胞膜を含む脂質二重膜に自然にかつ安定して組み込まれる合成分子を開示している。この合成分子は、スペーサー(S)を介してホスファチジルエタノールアミン等の脂質部分(L)に共有結合された単糖二糖三糖又はオリゴ糖等の機能性部分(F)からなる。スペーサーは、界面活性剤溶媒を使用せずに水中に容易に分散する合成分子を提供するように選択され、細胞表面抗原発現における定性的及び定量的変化をもたらすために使用され得る。この文献は、制御された量の血液型関連グリカンを発現する赤血球を調製する方法におけるこれらの合成分子の使用を開示している。これらの改変又は形質転換された細胞(ここでは「コデサイト(kodecyte)」と呼ぶ)は、血液型検査試薬品質保証において陽性対照として使用され得る。

0003

Bovinら(2009)の文献は、長いスペーサー(S)を介して脂質(L)部分に共有結合された機能性部分(F)からなる機能的脂質構築物を開示している。この構築物は水に容易に分散可能であるにもかかわらず、Bovinら(2005)の文献に開示された合成分子と共通に、細胞膜に自然に組み込まれる。この構築物は、機能性部分(F)が細胞膜の表面から離れて提示されるという更なる利点を提供する。Bovinら(2010)の文献は、機能性部分(F)が受容体リガンドである構築物を開示している。この文献は、三又は四アンテナ構造マルチリガンド構築物を開示している。構築物のリガンド間の間隔は、リガンドとリガンド結合タンパク質又は受容体との間の多価相互作用を促進するように意図されている。

0004

リガンド結合タンパク質には、グリカン結合タンパク質(GBP)が含まれる。これらのタンパク質は、免疫及び微生物宿主相互作用の機構において重要な役割を果たす。GBPはすべての個体の血清中に存在する。免疫系は、これらのGBPの有能かつ十分なレパートリーの存在に依存するところが大きい。GBPの多くは、正常ヒト組織で発現されるグリカンリガンドに結合する自然抗体(NAb)である(自己抗体)。しかし、NAbは多くの疾患とも関連している場合があり、例えば腫瘍関連炭水化物抗原(TACA)に対する抗体がある。健常から前悪性及び悪性への細胞の形質転換は、細胞の表面に提示されるタンパク質及び脂質における異常なグリコシル化出現と関連する。したがって、個体のNAbプロファイルの変化は、癌を含む多くの疾患の発症及び進行と関連し得る。

0005

本発明の目的の一つは、リガンド結合タンパク質へのアビディティが増大したコデサイトの調製に使用するための多価リガンド−脂質構築物を提供することにある。上記の目的は、少なくとも有用な選択を提供するための目的と代替的に読み取られるべきである。

0006

第1の態様において、本発明は、以下の構造の多価リガンド−脂質構築物を提供する。

0007

0008

Fはリガンドであり、Sは四アンテナ型スペーサーであり、Lは共役ホスファチジルエタノールアミドである。
好ましくは、Sは以下の構造の四アンテナ型スペーサーである:

0009

0010

mは1、2又は3の整数であり、Rは以下の構造であり:

0011

0012

Mは一価カチオン又は置換基であり、nは2、3、4、5、6又は7の整数であり、*は好ましくはF又はLの結合箇所である。好ましくは、MはH+であり、nは整数5である。

0013

好ましくは、Lは以下の構造の共役ホスファチジルエタノールアミドである:

0014

0015

M’は一価のカチオンであり、pは3、4又は5の整数であり、W1及びW2は独立してC16−20アルキル基あるいはモノ−又はジ−不飽和C16−20アルケニル基から選択され、*はSの結合箇所である。

0016

好ましくは、多価リガンド−脂質構築物は以下の部分構造を含む:

0017

0018

より好ましくは、多価リガンド−脂質構築物は以下の部分構造を含む:

0019

0020

本発明の第1の態様の第1の実施形態では、Fはアミノアルキルグリコシドであり、多価リガンド−脂質構築物は以下の構造のものである:

0021

0022

ここで、Glycはグリカンであり、q及びrは、1、2、3及び4から独立して選択される整数である。
好ましくは、Glycは、下記のものからなる群から選択されるグリカンである:(Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ2Manα)23,6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ(YDS);Fucα2Galβ(Hdi);Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Leb);Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNFPI);Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Ley);Fucα2Galβ4GlcNAcβ(H2);Galα;Galβ1−3(Fucα1−3)GlcNAc;Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−3GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−3GlcNAc;Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−4GlcNAc;Galα3(Fucα2)Galβ(Btri);Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Bleb);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(B3);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(B4);Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(B1);Galα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Bley);Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(B2);Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili);Galα4Galβ4GlcNAcβ(P1);Galα4Galβ4Glcβ(Gb3(Pk));Galα4GlcNAcβ(α−LN);GalNAcα3(Fucα2)Galβ(Atri);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(ALeb);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(A3);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(A4);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(A1);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(ALey);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(A2);GalNAcα3GalNAcβ(Fs2);GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(Fs5);GalNAcα3Galβ(Adi);GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ;GalNAcβ;GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(P);GalNH2α3(Fucα2)Galβ(AcqB);Galβ;Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Lea);Galβ3GalNAcα(TF);Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ(GA1);Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Lex);Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ(i(LN2));Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNnT);Galβ4Glcβ(Lac);GlcAβ3[GlcNAcβ4GlcAβ3]nGlcNAc−aminoalditol(hyaluronate);Manα6(Manα3)Manβ(Man3);Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac3’LN);Neu5Acα3Galβ4Glcβ(Neu5Ac3’Lac);Neu5Acα6GalNAcαβ(SiaTn);Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac6’LN);Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Gc3’LN);SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAβ2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4Gal;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4Gal;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4(GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcandSAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc。より好ましくは、Glycは、下記のものからなる群から選択されるグリカンである:(Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ2Manα)23,6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ(YDS);Fucα2Galβ(Hdi);Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Leb);Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNFPI);Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Ley);Fucα2Galβ4GlcNAcβ(H2);Galα;Galα3(Fucα2)Galβ(Btri);Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Bleb);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(B3);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(B4);Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(B1);Galα3(Fucα2)Ga
lβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Bley);Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(B2);Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili);Galα4Galβ4GlcNAcβ(P1);Galα4Galβ4Glcβ(Gb3(Pk));Galα4GlcNAcβ(α−LN);GalNAcα3(Fucα2)Galβ(Atri);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(ALeb);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(A3);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(A4);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(A1);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(ALey);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(A2);GalNAcα3GalNAcβ(Fs2);GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(Fs5);GalNAcα3Galβ(Adi);GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ;GalNAcβ;GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(P);GalNH2α3(Fucα2)Galβ(AcqB);Galβ;Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Lea);Galβ3GalNAcα(TF);Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ(GA1);Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Lex);Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ(i(LN2));Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNnT);Galβ4Glcβ(Lac);GlcAβ3[GlcNAcβ4GlcAβ3]nGlcNAc−aminoalditol(hyaluronate);Manα6(Manα3)Manβ(Man3);Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac3’LN);Neu5Acα3Galβ4Glcβ(Neu5Ac3’Lac);Neu5Acα6GalNAcαβ(SiaTn);Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac6’LN)及びNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Gc3’LN)。最も好ましくは、GlycはGalα3Galβ4GlcNAcβ(Galili)及びGalNAcα3Galβ4GlcNAcβからなる群から選択されるグリカンである。

0023

本発明の第1の態様の第2の実施形態では、FはN−マレオイルβ−アラニン結合Cys残基を含むオリゴペプチドであり、多価リガンド−脂質構築物は以下の構造のものである:

0024

0025

ここで、Xaaはアミノ酸残基であり、i及びjは0であるか、合計が5〜30の範囲である整数のいずれかである。好ましくは、iは5〜30の範囲の整数であり、jは0である。より好ましくは、iは整数13であり、jは0である。最も好ましくは、オリゴペプチドは配列番号01のペプチドである。

0026

第2の態様において、本発明は、以下の工程を含む、被験体から得られた生物学的試料中のリガンド結合タンパク質の存在を検出する改良された方法を提供する:
・本発明の第1の態様の細胞の多価リガンド−脂質構築物を細胞の膜に組み込ませることによって改変された前記細胞の第1の懸濁液と生物学的試料を接触させて、第2の懸濁液を提供する工程;
・ある量の抗被験体結合タンパク質を第2の懸濁液に添加し、前記細胞の凝集に十分な温度及び時間でインキュベートする工程;及び
・凝集の程度を決定する工程、
ここで、リガンド結合タンパク質は、本発明の第1の態様のリガンド−脂質構築物のFに結合する。

0027

この改良された方法における改善は、生物学的試料中のリガンド結合タンパク質の存在を検出する方法の、一価のリガンド−脂質構築物の使用と比較したアビディティ、感度及び/又は特異性の向上である。

0028

第3の態様において、本発明は、以下の工程を含む、被験体の血清中の補体媒介性細胞溶解を誘導するリガンドの能力を決定する方法を提供する:
・被験体から得られた血清試料を、本発明の第1の態様の細胞の多価リガンド−脂質構築物を細胞の膜に組み込ませることによって改変されたO型赤血球の懸濁液と接触させる工程;その後
溶血速度を監視する工程、
ここで、Fはリガンドである。

0029

第4の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の1つ以上の多価リガンド−脂質構築物の構築物から本質的になる組成物腫瘍内注射することにより、腫瘍を有する患者治療する方法を提供する。

0030

本明細書の説明及び特許請求の範囲において、以下の略語記号、用語及び語句は、提示された意味を有する:「親和性」は、2つの物の間の、例えば酵素基質又は受容体とリガンドとの間の相互作用の強さを意味する;「アビディティ」は、結合相互作用の強さ、例えば抗体と抗原の結合相互作用の強さを意味する;「生体適合性」は、生体組織に対し有害でも有毒でもないことを意味する;「含む(comprising)」とは、「含む(including)」、「含有する(containing)」又は「〜を特徴とする(characterized by)」ことを意味し、追加の要素、成分又は工程を除外しない;「からなる(consisting of)」は、不純物及びその他の付随物を除き、特定されていない要素、成分又は工程を除外することを意味する;「本質的に〜からなる」は、物質的な限定となる要素、成分又は工程を排除することを意味する;「診断」は、病気又は他の問題の診断に関係することを意味する;「DOPE」は、1,2−O−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミンを意味する;「グリカン」は、単糖、二糖、三糖又はオリゴ糖を意味する;「コデサイト」は、構築物の細胞膜への組み込みによって改変された細胞を意味する;「PBS」はリン酸緩衝生理食塩水を表す;「PCV」又は「pcv」は、血球容積(packed cell volume)を表す;「血漿」は、血球又は脂肪球が懸濁されている血液又はリンパの無色の液体部分を意味する;「予後判定」は、疾患又は病気の推定される原因又は発症を予測することを意味する;「予防的(prophylactic)」は、疾患の予防用であることを意味する;「RBC」は赤血球を表す;「反応生成物」は、精製前の反応の生成物を意味する;「生理食塩水」は、1種以上の塩の溶液を意味する;「血清」は、血液が凝固した際に分離する琥珀色のタンパク質に富んだ液体を意味する;「合成」は、化学合成によって調製されることを意味する;「治療的(therapeutic)」は、疾患の治癒に関連することを意味する;「水分散性である」は、構築物の特性を記載する文脈においては、有機溶媒も界面活性剤もない状態で構築物を少なくとも100μg/mLの濃度で水と接触させたときに、25℃の温度で安定な単相系が形成されることを意味する。

0031

アミノ酸残基は、(2015年7月1日から施行されているように)特許協力条約の附属書Cの付録2の表3に示された記号を用いて同定される。「機能的に類似のアミノ酸」は、中性−弱疎水性(Ala、Gly、Pro、Ser、Thr);親水性酸性アミン(Asn、Asp、Gln、Glu);親水性−塩基性(Arg、His、Lys);疎水性(Ile、Met、Leu、Val);疎水性−芳香族(Phe、Trp、Tyr)及び架橋性(Cys)のグループ分けに従って類似の特性を有するアミノ酸を意味する。

0032

糖残基及びその誘導体は、McNaught(1996)の文献の付録及び表2に示された記号を用いて同定される。具体的には、次の記号の意味は提示されるとおりである:「Abe」はアベクォースを意味する;「All」はアロースを意味する;「Alt」はアルトロースを意味する;「Api」はアピオースを意味する;「Ara」はアラビノースを意味する;「dRib」は2−デオキシリボースを意味する;「Fru」はフルクトースを意味する;「Fuc」はフコースを意味する;「Fuc−ol」はフシトールを意味する;「Gal」はガラクトースを意味する;「Gal」はガラクトースを意味する;「GalN」はガラクトサミンを意味する;「GalNAc」はN−アセチルガラクトサミンを意味する;「Glc」はグルコースを意味する;「GlcA」はグルクロン酸を意味する;「GlcN」はグルコサミンを意味する;「GlcN3N」は、2,3−ジアミノ−2,3−ジデオキシ−D−グルコースを意味する;「GlcNAc」はN−アセチルグルコサミンを意味する。「Glc−ol」はグルシトールを意味する。「GlcpA6Et」はグルコピラヌロンエチルを意味する;「Gul」はグロースを意味する;「Gul」はグロースを意味する;「Ido」はイドースを意味する;「IdoA」はイズロン酸を意味する;「Kdo」は3−デオキシ−D−マンノ−オクト−2−ウロソン酸を意味する;「Lyx」はリキソースを意味する;「Man」はマンノースを意味する;「Mur」は、ムラミン酸を意味する;「Neu」はノイラミン酸を意味する;「Neu2en5Ac」はN−アセチル−2−デオキシノイル−2−エナミン酸を意味する;「Neu5Ac」は、n−アセチルノイラミン酸を意味する;「Neu5Gc」はN−グルコロイル(glucoloyl)ノイラミン酸を意味する;「Psi」はプシコースを意味する;「Qui」はキノボースを意味する;「Rha」はラムノースを意味する;「Rha3,4Me2」は3,4−ジ−O−メチルラムノースを意味する;「Rib」はリボースを意味する;「Rib5P」はリボース5−リン酸を意味する;「Ribulo(又はRul)」はリブロースを意味する;「SA」はシアル酸を意味する;Sor」はソルボースを意味する;「Tag」はタガトースを意味する;「Tal」はタロースを意味する;「Xyl」はキシロースを意味する;「Xyl2CMe」は2−C−メチルキシロースを意味する;「Xylulo(又はXul)」はキシルロースを意味し、「β−D−Galp4S」はβ−D−ガラクトピラノース4−硫酸を意味する。

0033

本願明細書及び特許請求の範囲において定義される主題の要素、特徴又は整数を参照して使用される、あるいは本発明の代替の態様又は実施形態を参照して使用される場合の用語「第1」、「第2」、及び「第3」等は、優先順位暗示することを意図するものではない。

0034

試薬の濃度又は比が特定される場合、特定される濃度又は比は、試薬の初期の濃度又は比である。値が小数第1位又はそれ以上まで表される場合、標準的な丸め方が適用される。例えば、1.7には1.65000…から1.74999…の範囲が含まれる。

0035

さらなる限定がない場合、化合物の構造の表現におけるシンプルな結合の使用は、化合物のジアステレオマーエナンチオマー及びそれらの化合物の混合物包含する。構築物の構造、部分構造又はサブ構造の表現において、二価ラジカルの繰り返しは、

0036

0037

で表され、−X−はn回繰り返される二価ラジカルである。二価ラジカルがメチレン(−CH2−)である場合、この二価ラジカルの繰り返しは

0038

0039

で表される。
それでは、本発明を実施形態又は実施例、及び添付図面の図を参照して説明する。

図面の簡単な説明

0040

MUT21−Mal−βAla−CMG3−NHCH2)3CCH2NH−CMG3−Ad−DOPE(26)と称する構築物の代替表現
補体誘導性溶解後の試験管写真。写真中の注記は、コデサイトの調製における下記の構築物の(示された濃度での)使用に対応する:Gal SA1−L1(49)、Gal T17(35)、Gal CMG 2(47)及びGalNAcα1(48)。

実施例

0041

リガンドの多価提示は、リガンドがグリカンである場合に特に有利である。一価状態のグリカンリガンドに対するグリカン結合タンパク質(GBP)の親和性は、一般に非常に低い。グリカンリガンドの多価提示は、抗体などのGBPがより高いアビディティで結合することを可能にする。GBPのそれらのグリカンリガンドに対する固有の低い親和性と比較して、一般にグリカンリガンドの多価提示は、GBPの結合の特異性における差異増幅する。その結果、ヒト血清中のGBPの存在を、単純な凝集又は細胞溶解アッセイを用いて検出することができる。

0042

化学
(Boc−Gly2−HNCH2)4C(3)の調製(スキームIのステップi)
テトラアミン(H2N−CH2)4C(1)をLitherlandら(1938)の文献に開示された方法に従って合成した。1M NaHCO3水溶液(18.2ml)及びi−PrOH(9ml)の混合物中のテトラアミン1(500mg、1.52mmol)の撹拌溶液に、Boc−GlyGlyNos(2)(4012mg、12.18mmol)を添加した(CO2発生、発泡)。反応混合物を30分間撹拌し、次いで6mlの1M NaHCO3水溶液を加え、混合物を一晩撹拌した。(Boc−Gly2−HNCH2)4C(3)の沈殿濾過し、メタノール水混合物(1:1、20ml)で十分に洗浄し、真空で乾燥させた。収量1470mg(98%)、白色固体

0043

1H NMR(500MHz,[D6]DMSO,30℃)δ,ppm:8.491(t,J=5.6Hz,1H;NHCO),7.784(t,J=6.6Hz,1H;C−CH2−NHCO),6.858(t,J=6Hz,1H;NHCOO),3.696(d,J=5.6Hz,2H;COCH2NH),3.675(d,J=6Hz,2H;COCH2NHCOO),2.685(d,J=6.6Hz,2H;C−CH2NH),1.375(s,9H;C(CH3)3。

0044

(CF3COOH・H−Gly2−NHCH2)4C(4)の調製(スキームIのステップii)
(Boc−Gly2−HNCH2)4C(3)(1450mg、1.466mmol)をCF3COOH(5ml)に溶解し、溶液を室温で2時間維持した。トリフルオロ酢酸を真空下で除去し、残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出(30mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)することで残留CF3COOHを除去した。固体残留物を真空下で乾燥させ、最小量の水に溶解し、Sephadex(登録商標LH−20カラムに通して水で溶出した。生成物4を含む画分を合わせ、c.5mlまで蒸発させて、凍結乾燥させた。収量1424mg(93%)、白色固体。TLC:Rf0.5(エタノール/濃NH3;2:1(v/v))。

0045

1H NMR(500MHz,[D2]H2O,30℃)δ,ppm:4.028(s,2H;COCH2NH),3.972(s,2H;COCH2NH),2.960(s,2H;C−CH2NH)。

0046

{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノアセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチルアミノ}−酢酸メチルエステル(7)の調製(スキームIIのステップi)
DMF(15ml)中の(メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステル塩酸塩(5)(988mg、5mmol)の撹拌溶液に、Boc−GlyGlyNos(2)(3293mg、10mmol)及び(CH3CH2)3N(3475μL、25mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いでo−キシレン(70ml)で希釈し、蒸発させた。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィートルエン中に充填し、酢酸エチルで溶出)により粗生成物を得た。粗生成物をクロロホルムに溶解し、水、0.5M NaHCO3及び飽和KClで順次洗浄した。クロロホルム抽出液を蒸発させ、生成物をシリカゲルカラム(クロロホルム中に充填し、15:1(v/v)クロロホルム/メタノールで溶出)で精製した。画分を蒸発させ、残留物を真空下で乾燥させて、無色の濃いシロップ状の生成物7を得た。収量1785mg、(95%)。TLC:Rf=0.49(7:1(v/v)のクロロホルム/メタノール)。

0047

1H NMR(500MHz,[D6]DMSO,30℃)δ,ppm:7.826(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.979(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.348及び4.095(s,2H;NCH2COO),3.969(d,J=5.1Hz,2H;COCH2NH),3.689及び3.621(s,3H;OCH3),3.559(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.380(s,9H;C(CH3)3)。

0048

{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸(8)の調製(スキームIIのステップii)
メタノール(25ml)中の7(1760mg、4.69mmol)の撹拌溶液に、0.2MNaOH水溶液(23.5ml)を加え、溶液を室温で5分間保持した。次いで、溶液を酢酸(0.6ml)で酸性化し、蒸発乾固させた。シリカゲルでの残留物のカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル中に充填し、2:3:1(v/v/v)のi−PrOH/酢酸エチル/水で溶出)により、回収された7(63mg、3.4%)と目的化合物8(1320mg)を得た。次いで、中間生成物をメタノール/水/ピリジン混合物(20:10:1、30ml)に溶解し、イオン交換カラム(Dowex(登録商標)50X4−400、ピリジン形態、5ml)に通して残留ナトリウムイオンを除去した。続いて、カラムを同じ溶媒混合物で洗浄し、溶離液を蒸発させ、残留物をクロロホルム/ベンゼン混合物(1:1、50ml)に溶解し、次いで蒸発させ、真空下で乾燥させた。生成物8の収量は1250mg(74%)、白色固体であった。TLC:Rf0.47(4:3:1(v/v/v)のi−PrOH/酢酸エチル/水)。

0049

1H NMR(500MHz,[D6]DMSO,30℃),N−カルボキシメチルグリシンユニットシス異性体及びトランス異性体のc.3:1の混合物。主な異性体;δ,ppm:7.717(t,J=5Hz,1H;NHCO),7.024(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.051(s,2H;NCH2COOCH3),3.928(d,J=5Hz,2H;COCH2NH),3.786(s,2H;NCH2COOH),3.616(s,3H;OCH3),3.563(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.381(s,9H;C(CH3)3)ppm;副異性体,δ=7.766(t,J=5Hz,1H;NHCO),7.015(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.288(s,2H;NCH2COOCH3),3.928(d,J=5Hz,2H;COCH2NH),3.858(s,2H;NCH2COOH),3.676(s,3H;OCH3),3.563(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.381(s,9H;C(CH3)3)。

0050

0051

{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸N−オキシスクシンイミドエステル(Boc−Gly2(MCMGly)Nos)(9)の調製(スキームIIIのステップiii)
DMF(10ml)中の8(1200mg、3.32mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(420mg、3.65mmol)の氷冷した撹拌溶液中に、N、N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(754mg、3.65mmol)を加えた。混合物を0℃で30分間、次いで室温で2時間撹拌した。N,N’−ジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾別し、DMF(5ml)で洗浄し、濾液を最小体積まで蒸発させた。次いで、残留物を(CH3CH2)2O(50ml)と共に1時間撹拌し、エーテル抽出物をデカンテーションにより除去した。残留物を真空下で乾燥させ、エステル9(1400mg、92%)を白色の泡状物として得た。TLC:Rf0.71(40:1(v/v)のアセトン/酢酸)。

0052

1H NMR(500MHz,[D6]DMSO,30℃),N−カルボキシメチルグリシンユニットのシス異性体及びトランス異性体のc.3:2の混合物。
主異性体;δ,ppm:7.896(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.972(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.533(s,2H;NCH2COON),4.399(s,2H;NCH2COOCH3),3.997(d,

0053

0054

J=5.1Hz,2H;COCH2NH),3.695(s,3H;OCH3),3.566(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.380(s,9H;C(CH3)3)。

0055

副異性体;δ,ppm:7.882(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.963(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.924(s,2H;NCH2COON),4.133(s,2H;NCH2COOCH3),4.034(d,J=5.1Hz,2H;COCH2NH),3.632(s,3H;OCH3),3.572(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.380(s,9H;C(CH3)3)。

0056

エステル9(1380mg)をDMSOに溶解して6mlの体積とし、0.5Mの溶液として使用した(−18℃で保存)。
{Boc−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(10)の調製(スキームIIIのステップi)
DMSO(2ml)中の(CF3COOH・H−Gly2−HNCH2)4C(4)(277mg、0.265mmol)の撹拌溶液に、エステル9(1.591mmol、DMSO中の0.5Mの溶液3.18ml)及び(CH3CH2)3N(295μL、2.121mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、150μLのAcOHで酸性化し、真空下で溶媒を除去した(凍結乾燥)。残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出した(20mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)。固体残留物を最小量のアセトンに溶解し、シリカゲルカラムで分画した(アセトン中に充填し、アセトン、20:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水、及び15:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水で溶出)。選択した画分を蒸発させ、残留物を真空下で乾燥させた。純粋な{Boc−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(10)の収量は351mg(68%)、白色固体であった。TLC:Rf0.38(15:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水)。

0057

1H NMR(500MHz、[D6]DMSO、30℃)、N−カルボキシメチルグリシンユニットのシス異性体及びトランス異性体の鎖中c.3:2の混合物。
主異性体;δ,ppm:8.593(t,J=5Hz,1H;NHCO),8.335(t,J=5.4Hz,1H;NHCO),7.821(t,J=6.4Hz,1H;C−CH2−NHCO),7.786(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.993(t,J=6Hz,1H;NHCOO),4.139(s,2H;NCH2CO),4.074(s,2H;NCH2COO(CH3)),3.985(d,J=5Hz,2H;COCH2NH),3.887(d,J=5.4Hz,2H;COCH2NH),3.726(d,J=5.1Hz,2H;COCH2NH),3.634(s,3H;OCH3),3.567(d,J=6Hz,2H;COCH2NHCOO),2.686(broad.d,J=6.4Hz,2H;C−CH2NH),1.379(s,9H;C(CH3)3)。

0058

副異性体;δ,ppm:8.511(t,J=5Hz,1H;NHCO),8.158(t,J=5.4Hz,1H;NHCO),7.821(t,J=6.4Hz,1H;C−CH2−NHCO),7.786(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.993(t,J=6Hz,1H;NHCOO),4.292(s,2H;NCH2CO),3.998(s,2H;NCH2COOCH3),3.954(d,J=5Hz,2H;COCH2NH),3.826(d,J=5.4Hz,2H;COCH2NH),3.715(d,J=5.1Hz,2H;COCH2NH),3.692(s,3H;OCH3),3.567(d,J=6Hz,2H;COCH2NHCOO),2.686(broad.d,J=6.4Hz,2H;C−CH2NH),1.379(s,9H;C(CH3)3)。

0059

{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(11)の調製(スキームIIIのステップii)
{Boc−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(10)(330mg、0.168mmol)をCF3COOH(2ml)に溶解し、溶液を室温で40分間維持した。トリフルオロ酢酸を真空下で蒸発させ、残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出(20mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)することで残留CF3COOHを除去し、次いで真空下で乾燥させた。{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(11)の収量は337mg(99%)、白色固体のであった。

0060

1H NMR(500MHz、[D2]H2O、30℃)、N−カルボキシメチルグリシンユニットのシス異性体及びトランス異性体の鎖中c.11:10の混合物。
主異性体;δ,ppm:4.370(s,2H;NCH2CO),4.265(s,2H;NCH2COOCH3),4.215(s,2H;COCH2NH),4.138(s,2H;COCH2NH),3.968(s,2H;COCH2NH),3.919(s,2H;COCH2NH2+),3.775(s,3H;OCH3),2.914(s,2H;C−CH2NH)。

0061

副異性体;δ,ppm:4.431(s,2H;NCH2CO),4.241(s,2H;NCH2COOCH3),4.239(s,2H;COCH2NH),4.074(s,2H;COCH2NH),3.960(s,2H;COCH2NH),3.919(s,2H;COCH2NH2+),3.829(s,3H;OCH3),2.914(s,2H;C−CH2NH)。

0062

{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]2Gly2−NHCH2}4C(13)の調製(スキームIVのステップi及びii)
DMSO(2ml)中の(CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]Gly2−HNCH2)4C(11)(272mg、0.135mmol)の撹拌溶液に、エステル9(0.809mmol、DMSO中の0.5Mの溶液1.62ml)及び(CH3CH2)3N(112μL、0.809mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、70μLのAcOHで酸性化し、溶媒を真空下で除去した(凍結乾燥)。残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出した(15mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)。固体残留物を最小量の7:1(v/v)アセトン/メタノール混合物に溶解し、シリカゲルカラムで分画した(アセトン中に充填し、7:1(v/v)アセトン/メタノール、10:2:1(v/v/v)、9:2:1(v/v/v)、8:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水で溶出)。選択した画分を蒸発させ、残留物を真空下で乾燥させた。純粋な{Boc−[Gly2(MCMGly)]2Gly2−NHCH2}4C(12)の収量は279mg(71%)、白色固体であった。TLC:Rf0.42(8:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水)。

0063

1H NMR(500MHz、[D6]DMSO、30℃)、鎖当たり2つのN−カルボキシメチル−グリシンユニットによる配座異性体の混合物、δ,ppm:8.604,8.519,8.397,8.388,8.346,8.211,8.200,8.167,8.034,8.024,7.925,7.912,7.819及び7.773(t,6H;6NHCO),6.992(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.302−3.723(18H;2NCH2CO,2NCH2COOCH3,5COCH2NH),3.692,3.689及び3.632(s,6H;2OCH3),3.566(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),2.686(broad.d,2H;C−CH2NH),1.380(s,9H;C(CH3)3)。

0064

{Boc−[Gly2(MCMGly)]2Gly2−NHCH2}4C(12)(269mg、91.65μmol)をCF3COOH(2ml)に溶解し、溶液を室温で40分間維持した。トリフルオロ酢酸を真空下で蒸発させ、残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出(15mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)することで残留CF3COOHを除去し、次いで真空下で乾燥させた。{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]2Gly2−NHCH2}4C(13)の収量は270mg(98%)、白色固体であった。

0065

0066

1H NMR(500MHz、[D2]H2O、30℃)、鎖当たり2つのN−カルボキシメチル−グリシンユニットによる配座異性体の混合物、δ,ppm:4.441−3.963(一重項,18H;2NCH2CO,2NCH2COOCH3,5COCH2NH),3.920(s,2H;COCH2NH2+),3.833,3.824,3.780及び3.773(s,6H;2OCH3),2.918(s,2H;C−CH2NH)。

0067

{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4C(15)の調製(スキームIVのステップiii及びiv)
DMSO(2ml)中の(CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]2Gly2−HNCH2)4C(13)(175mg、58.5μmol)の撹拌溶液に、エステル9(0.351mmol、DMSO中の0.5Mの溶液0.702ml)及び(CH3CH2)3N(49μL、0.351mmol)を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、30μLのAcOHで酸性化し、真空下で溶媒を除去した(凍結乾燥)。残留物を最小量の1:1(v/v)アセトニトリル/水の混合物に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラム(1:1(v/v)アセトニトリル/水で溶出)で分画した。選択した画分を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させた。純粋な{Boc−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4C(14)の収量は279mg(71%)、白色固体であった。TLC:Rf0.42(8:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水)。{Boc−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4C(14)を含む画分を合わせ、c.2ml体積まで蒸発させて凍結乾燥した。最初の収量は215mg(94%)であった。シリカゲルカラムでの更なる精製(アセトニトリル中に充填し、4:5:2(v/v/v)のi−PrOH/アセトニトリル/水で溶出)により、169mgのBoc−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4Cを得た(収率74%、白色固体)。TLC:Rf0.45(4:5:2(v/v/v)のi−PrOH/アセトニトリル/水)。

0068

1H NMR(500MHz、[D6]DMSO、30℃)、鎖当たり3つのN−カルボキシメチル−グリシンユニットによる配座異性体の混合物、δ,ppm:8.594−7.772(三重項,共に8H;8NHCO),6.989(t,J=5.6Hz,1H;NHCOO),4.303−3.722(26H;3NCH2CO,3NCH2COOCH3,7COCH2NH),3.692及び3.632(s,9H;3OCH3),3.565(d,J=5.6Hz,2H;COCH2NHCOO),2.687(broad.d,2H;C−CH2NH),1.380(s,9H;C(CH3)3)。

0069

{Boc−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4C(146mg、37.36μmol)(14)をCF3COOH(1ml)に溶解し、溶液を室温で40分間維持した。トリフルオロ酢酸を真空下で蒸発させ、残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出(10mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)することで残留CF3COOHを除去し、次いで真空下で乾燥させた。{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4C(15)の収量は147mg(99%)、白色固体であった。

0070

1H NMR(500MHz、[D2]H2O、30℃)、鎖当たり3つのN−カルボキシメチル−グリシンユニットによる配座異性体の混合物、δ,ppm:4.446−3.964(一重項,26H;3NCH2CO,3NCH2COOCH3,7COCH2NH),3.924(s,2H;COCH2NH2+),3.836,3.828,3.824,3.783,3.778及び3.773(s,9H;3OCH3),2.919(s,2H;C−CH2NH)。

0071

{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]4Gly2−NHCH2}4C(17)の調製(スキームIVのステップv及びvi)
DMSO(1ml)中の(CF3COOH・H−Gly2(MCMGly)]3−HNCH2)4C(15)(68mg、17.16μmol)の撹拌溶液に、エステル9(0.137mmol、DMSO中の0.5Mの溶液0.275ml)及び(CH3CH2)3N(14.3μL、0.103mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、100μLのAcOHで酸性化し、真空下で溶媒を除去した(凍結乾燥)。残留物を最小量の1:1(v/v)アセトニトリル/水(0.25%AcOH)の混合物に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラム(1:1(v/v)アセトニトリル/水(0.25%AcOH)で溶出)で分画した。{Boc−[Gly2(MCMGly)]4Gly2−NHCH2}4C(16)を含有する画分を合わせ、c.2ml体積まで蒸発させて凍結乾燥した。収量は81mg(96%)、白色固体であった。TLC:Rf0.24(4:5:2(v/v/v)のi−PrOH/アセトニトリル/水)。

0072

0073

1H NMR(500MHz、[D6]DMSO、30℃)、鎖当たり4つのN−カルボキシメチル−グリシンユニットによる配座異性体の混合物、δ,ppm:8.590−7.773(三重項,10H;10NHCO),6.989(t,J=5.6Hz,1H;NHCOO),4.303−3.722(34H;4NCH2CO,4NCH2COOCH3,9COCH2NH),3.691及び3.631(s,12H;4OCH3),3.565(d,J=5.6Hz,2H;COCH2NHCOO),2.684(broad.d,2H;C−CH2NH),1.379(s,9H;C(CH3)3)。

0074

{Boc−[Gly2(MCMGly)]4Gly2−NHCH2}4C(16)(74mg、15.16μmol)をCF3COOH(1ml)に溶解し、溶液を室温で40分間維持した。トリフルオロ酢酸を真空下で蒸発させ、残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出(10mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)することで残留CF3COOHを除去し、次いで真空下で乾燥させた。{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]4Gly2−NHCH2}4C(17)の収量は72mg(96%)、白色固体であった。

0075

1H NMR(500MHz、[D2]H2O、30℃)、鎖当たり4つのN−カルボキシメチル−グリシンユニットによる配座異性体の混合物、δ,ppm:4.446−3.964(一重項,34H;4NCH2CO,4NCH2COOCH3,9COCH2NH),3.925(s,2H;COCH2NH2+),3.836,3.829,3.827,3.822,3.783,3.779,3.777及び3.772(s,12H;4OCH3),2.919(s,2H;C−CH2NH)。

0076

{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]5Gly2−NHCH2}4C(19)の調製(スキームIVのステップvii及びviii)
DMSO(1ml)中の(CF3COOH・H−Gly2(MCMGly)]4−HNCH2)4C(17)(16.8mg、3.403μmol)の撹拌溶液に、エステル9(27.2mmol、DMSO中の0.5Mの溶液63μl)及び(CH3CH2)3N(3μl、21.6μmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、100μLのAcOHで酸性化し、真空下で溶媒を除去した(凍結乾燥)。残留物を最小量の1:1(v/v)アセトニトリル/水(0.25%AcOH)の混合物に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラム(1:1(v/v)アセトニトリル/水(0.25%AcOH)で溶出)で分画した。{Boc−[Gly2(MCMGly)]5Gly2−NHCH2}4C(18)を含有する画分を合わせ、c.1ml体積まで蒸発させて凍結乾燥した。収量は19mg(95%)、白色固体であった。TLC:Rf0.15(4:3:2(v/v/v)のi−PrOH/アセトニトリル/水)。

0077

1H NMR(500MHz、[D6]DMSO、30℃)、鎖当たり5つのN−カルボキシメチル−グリシンユニットによる配座異性体の混合物、δ,ppm:8.595−7.772(三重項,12H;12NHCO),6.989(t,J=5.6Hz,1H;NHCOO),4.303−3.723(42H;5NCH2CO,5NCH2COOCH3,11COCH2NH),3.692及び3.631(s,15H;5OCH3),3.565(d,J=5.6Hz,2H;COCH2NHCOO),2.686(broad.d,2H;C−CH2NH),1.380(s,9H,C(CH3)3)。

0078

{Boc−[Gly2(MCMGly)]5Gly2−NHCH2}4C(18)(19mg、3.25μmol)をCF3COOH(0.5ml)に溶解し、溶液を室温で40分間維持した。トリフルオロ酢酸を真空下で蒸発させ、残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出(5mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)することで残留CF3COOHを除去し、次いで真空下で乾燥させた。{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]5Gly2−NHCH2}4C(19)の収量は20mg(99%)、白色固体であった。

0079

1H NMR(500MHz、[D2]H2O、30℃)、鎖当たり5つのN−カルボキシメチル−グリシンユニットによる配座異性体の混合物、δ,ppm:4.446−3.965(一重項,42H;5NCH2CO,5NCH2COOCH3,11COCH2NH),3.924(s,2H;COCH2NH2+),3.835,3.829,3.827,3.825,3.823,3.783,3.779,3.777及び3.773(s,15H;5OCH3),2.919(s,2H;C−CH2NH)。

0080

[CF3COOH・H−(Gly2CMGly)5Gly2−NHCH2]4C、Et3N塩(20)の調製(スキームIV)
水(26mL)中の生成物19(463mg、0.07835mmol)の溶液に、Et3N(523μL、3.761mmol)を添加し、溶液を室温で18時間維持した。蒸発させた後の残留物を真空中で凍結乾燥した。生成物20の収量は587mg(98%)、白色固体であった。TLC:Rf0.39(1:2:1(v/v/v)のCHCl3/MeOH/水)。

0081

1H NMR(600MHz,[D2]H2O,30℃)δ,ppm:4.309−3.919(176H;20NCH2CO,20NCH2COOH,48COCH2NH),3.226(q,120H,J=7.3Hz;60NCH2CH3),2.964(broad.s,8H;4C−CH2NH),1.305(t,180H,J=7.3Hz;60NCH2CH3)。MALDI TOFマススペクトル,M/Z:5174,M+H;5196,M+Na。

0082

活性化1,2−O−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DE−Ad−OSu)(23)の調製(スキームVのステップi)
無水N,N−ジメチルホルムアミド(1.5ml)中のビス(N−ヒドロキシスクシンイミジルアジペート(21)(70mg、205mmol)の溶液に、クロロホルム(1.5ml)中の1,2−O−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(22)(40μmol)を、次いでトリエチルアミン(7μl)を加えた。混合物を室温で2時間維持し、次いで酢酸で中和し、真空下で部分的に濃縮した。残留物のカラムクロマトグラフィー(Sephadex(登録商標)LH−20、1:1のクロロホルム−メタノール、0.2%酢酸)により、生成物23(37mgの95%)を無色シロップとして得た。

0083

1H NMR(CDCl3/CD3OD,2:1),5.5(m,4H,2×(−CH=CH−),5.39(m,1H,−OCH2−CHO−CH2O−),4.58(dd,1H,J=3.67,J=11.98,−CCOOHCH−CHO−CH2O−),4.34(dd,1H,J=6.61,J=11.98,−CCOOHCH−CHO−CH2O−),4.26(m,2H,PO−CH2−CH2−NH2),4.18(m,2H,−CH2−OP),3,62(m,2H,PO−CH2−CH2−NH2),3.00(s,4H,ONSuc),2.8(m,2H,−CH2−CO(Ad),2.50(m,4H,2×(−CH2−CO),2.42(m,2H,−CH2−CO(Ad),2.17(m,8H,2×(−CH2−CH=CH−CH2−),1.93(m,4H,COCH2CH2CH2CH2CO),1.78(m,4H,2×(COCH2CH2−),1,43,1.47(2bs,40H,20CH2),1.04(m,6H,2CH3)。Rf0.5(クロロホルム−メタノール−水),6:3:0.5。

0084

[H−(Gly2CMGly)5Gly2−NHCH2]3[DE−CO(CH2)4CO−(Gly2CMGly)5Gly2−NHCH2]C、Na、Et3N塩(24)の調製(スキームVのステップii)
水/2−プロパノール混合物(16mL、2:3)中の生成物20(522mg、0.06821mmol)の撹拌溶液に、ジクロロエタン(368μL)中の1M NaHCO3(547μL、0.547mmol)及びDE−Ad−OSu(23)(66.1mg、0.06821mmol)の溶液を加え、溶液を室温で1.5時間撹拌した。AcOH(94μL)で酸性化した後、溶液を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させた。乾燥混合物を3mLの水/MeOH(15:1)に溶解させ、C18逆相カラム(75%MeOH、次いで15:1の水/MeOHで洗浄した約45mLの相)に置いた。物質を水/MeOH(15:1−50mL;9:1−50mL;7.5:2.5−50mL;1:1−50mL;2.5:7.5−100mL)で順次溶出した。未反応の20を、15:1の水/メタノール(NMRデータによりNa塩、116mg、30.8%の回収率)及び9:1の水/メタノール(NMRデータによりEt3N塩、63mg、13.6%の回収率)で溶出した。目的の(H−CMG5)3C(CMG5−Ad−DE)(24)を1:1の水/メタノールで溶出した。純粋な凍結乾燥生成物24の収量は135mg((24)で25.5%)、白色固体であった。TLC(1:2:1(v/v/v)のMeOH/酢酸エチル/水):20 Rf0.06;24 Rf0.17。

0085

(H−CMG5)3C(CMG5−Ad−DE) Na1(Et3N)20(24):1H NMR(700MHz,[D2]H2O/[D4]CH3OH 2:1(v/v),30℃)δ,ppm:5.561(m,4H;DEの2シスCH=CH),5.454(m,1H;DEのOCH2−CH(OCO)CH2O),4.629(dd,1H,J=12.3Hz/2Hz;DEのOCH2−CH(OCO)CHOCO),4.462−4.057(181H;20NCH2CO,20NCH2COOH,48COCH2NH,DEのOCH2−CH(OCO)CHOCO,DEのOCH2CH2NH),3.597(t,2H,J=5Hz;DEのOCH2CH2NH),3.226(q,102H,J=7.3Hz;51NCH2CH3),3.099(broad.s,8H;4C−CH2NH),2.557,2.532,2.522及び2.456(三重項,合計8H;4CO−CH2CH2),2.203(〜dd,8H,J=12Hz/5.8Hz;DEの2CH2−CH=CH−CH2),1.807及び1.783(多重項,8H;4CO−CH2CH2),1.526及び1.475(重複m及びt,合計193H;m,DEの20CH2,t,J=7.3Hz,51NCH2CH3),1.063(t,6H,J=7Hz;DEの2CH3)。MALDI TOFマススペクトル,M/Z:6028,M+H;6050,M+Na。

0086

3−トリフルオロアセトアミドプロピル−3,4−ジ−O−アセチル−2,6−ジ−O−ベンジル−α−D−ガラクトピラノシル−(1→3)−2,4−ジ−O−アセチル−6−O−ベンジル−β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−2−アセトアミド−3−О−アセチル−6−O−ベンジル−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(27)の調製(スキームVIのステップi)
グリコシル受容体(3−トリフルオロアセトアミドプロピル)−2−アセトアミド−3−O−アセチル−6−O−ベンジル−2−デオキシ−4−O−(2,4−ジ−O−アセチル−6−O−ベンジル−β−D−ガラクトピラノシル)−β−D−グルコピラノシド(25)を、Pazyninaら(2008)の文献に開示された方法に従って調製した。グリコシル受容体25(500mg、0.59mmol)、チオガラクトピラノシド26(576mg、1.18mmol)、NIS(267mg、1.18mmol)、無水CH2Cl2(25ml)及びモレキュラーシーブ4Å(500mg)の混合物を、−45℃で30分間、Ar雰囲気下で撹拌した。次いで、無水CH2Cl2(0.5ml)中のTfOHの溶液(21μl、0.236mmol)の溶液を添加した。反応混合物を−45℃で2時間撹拌し、続いて温度を4時間かけて−20℃に上昇させた。混合物を一晩−20℃に維持した。次に、追加量のチオガラクトピラノシド26(144mg、0.295mmol)、NIS(66mg、0.295mmol)及びTfOH(5μl、0.06mmol)を添加し、−20℃で2時間の撹拌を続けた後、室温までゆっくりと温度上昇させた(1時間)。次いでNa2S2O3飽和水溶液を添加し、混合物を濾過した。濾液をCHCl3(300ml)で希釈し、H2O(2×100ml)で洗浄し、脱脂綿を通して濾過することにより乾燥させ、濃縮した。LH−20(CHCl3−MeOH)でのゲル濾過により、生成物27(600mg、80%)を白色泡状物として得た。

0087

1Н NMR(700MHz,CDCl3,特徴的なシグナル),δ,ppm:1.78−1.82(m,4H,CHCHC,OC(O)CH3),1.84−1.90(m,1H,CHCHC),1.91,1.94,1.97,1.98,2.06(5s,5×3Н,4OC(O)CH3,NH(O)CH3),3.23−3.30(m,1H,NCHH),3.59−3.65(m,1H,NCHH),4.05(m,1H,H−2I),4.33(d,1H,J1,27.55,H−1I),4.40(d,1H,J12.04,PhCHH),4.42(d,1H,J1,28.07,H−1II),4.45(d,1H,J11.92,PhCHH),4.48(d,1H,J12.00,PhCHH),4.50(d,1H,J12.00,PhCHH),4.52(d,1H,J12.04,PhCHH),4.54(d,1H,J12.00,PhCHH),4.57(d,1H,J12.00,PhCHH),4.64(d,1H,J11.92,PhCHH),4.99(dd≒t,1H,J8.24,H−2II),5.08−5.13(m,2H,H−3I,H−3III),5.23(d,1H,J1,23.31,H−1III),5.46(d,1H,J3,42.25,H−4II),5.54(d,1H,J3,43.11,H−4III),7.20−7.40(m,20H,ArH);7.49−7.54(m,1H,NHC(O)CF3)。Rf0.4(PhCH3−AcOEt,1:2)。

0088

3−アミノプロピル−α−D−ガラクトピラノシル−(1→3)−β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(29)の調製(スキームVIのステップii及びiii)
生成物27(252mg、0.198mmol)をZemplenに従って脱アセチル化し(8時間、40℃)、AcOHで中和し、濃縮した。得られた生成物のTLC(CH3Cl−MeOH、10:1)分析は、2つのスポットを示した:Rf0.45のメインスポットと、トリフルオロアセチルの部分的な損失を示す、スタートライン上の別のスポット(ニンヒドリン陽性スポット)。したがって、生成物をMeOH(10ml)中のCF3COOMe(0.1ml)及びEt3N(0.01ml)で1時間処理することによりN−トリフルオロアセチル化し、濃縮し、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(CHCl3−MeOH、15:1)に供して生成物28を白色泡状物として得た(163mg、77%)、Rf0.45(CH3Cl−MeOH、10:1)。生成物28を水素化分解し(200mgのPd/C、10mlのMeOH、2時間)、濾過し、N−脱フルオロアセチル化し(N−defluoroacetylated)(5%のEt3N/H2O、3時間)、濃縮した。Dowex(登録商標)50X4−400(H+)での陽イオン交換クロマトグラフィー(5%アンモニア水で溶出)により、生成物29(90mg、98%)を白色泡状物として得た。

0089

0090

0091

1Н NMR(D2O,特徴的なシグナル),δ,ppm:1.94−1.98(m,2H,CCH2C),2.07(s,3H,NHC(O)CH3),3.11(m,J6.92,2H,NCH2),4.54及び4.56(2d,2H,J1,28.06,J1,27.87,H−1I及びH−1II),5.16(d,1H,J1,23.87,H−1III)。Rf0.3(EtOH−BuOH−Py−H2O−AcOH;100:10:10:10:3)。

0092

3−アミノプロピル2−アセトアミド−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル−(1→3)−β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(33)の調製(スキームVIIのステップi〜iii)
塩化グリコシルの3,4,6−トリ−O−アセチル−2−アジド−2−デオキシ−β−D−ガラクトピラノシルクロリド(30)を、Paulsenら(1978)の文献に開示された方法に従って調製した。グリコシル受容体25(420mg、0.5mmol)、銀トリフラート(257mg、1.0mmol)、テトラメチル尿素(120μl、1.0mmol)及び無水ジクロロメタン(20ml)中の新しく焼成したモレキュラーシーブ4Åの溶液を、室温、暗所で30分間撹拌した。別量のシーブ4Åを加え、さらに無水ジクロロメタン(3ml)中の塩化グリコシル30(350mg、1.0mmol)の溶液を添加した。混合物を室温で20時間撹拌した。樹脂を濾過し、メタノールで洗浄した後(4×10ml)、溶媒を蒸発させた。シリカゲルでのクロマトグラフィー(クロロホルム中の5〜7%イソプロパノールで溶出)により、407mg(70%)の生成物31をアノマーの混合物(1H−NMR分光法で測定してα/β=3.0)として得た。

0093

メタノール(30ml)中の生成物31(407mg、0.352mmol)の溶液を、400mgの10% Pd/C上で16時間水素化分解した。次いで、樹脂を濾別し、メタノールで洗浄し(4×10ml)、生成物を真空中で濃縮した。乾燥残留物を、20℃で16時間、2:1のピリジン−無水酢酸混合物(6ml)でアセチル化し、試薬をトルエンと共蒸発させた。シリカゲルでの2つのクロマトグラフィー工程(酢酸エチル中の10%イソプロパノール、及びクロロホルム中の5〜10%メタノールでの溶出)により、160mg(42%)の生成物32及び39mg(10%)の生成物32βを得た。

0094

メタノール(200μl)中の2Mナトリウムメチラートの溶液を、無水メタノール(4ml)中の生成物32(160mg、0.149mmol)の溶液に加えた。1時間後に溶液を蒸発させ、水4mlを加え、溶液を16時間維持した後、Dowex(登録商標)−H+カラムでのクロマトグラフィー(1Mアンモニアで溶出)にかけた。溶出液を蒸発させ、凍結乾燥させて87.2mg(91%)の3−アミノプロピルトリサッカライド(33)を得た。

0095

303Kでの1HNMRスペクトルをブルカー・バイオスピン社の分光計で記録した。特徴的プロトン化学シフト(δ)はppmで示され、基準としてHOD(4.750)、CHCl3(δ7.270)を用いている。結合定数(J)はHzで示される。1H NMRスペクトルのシグナルは、スピンスピンデカップリング二重共振)の手法及び2D−1H、1H−COSYの実験を使用して割り当てた。

0096

旋光度の値を、デジタル偏光計Perkin Elmer341により25℃で測定した。
マススペクトルを、マトリックスとしてジヒドロキシ安息香酸を使用して、MALDI−TOF Vision−2000分光計に登録した。

0097

32:1H−NMR(700MHz,CDCl3):1.759−1.834(m,1H,CHsp);1.853−1.927(m,1H,CHsp);1.972,1.986,1.996,2.046,2.053,2.087,2.106,2.115,2.130,2.224(10s,10×3H,COCH3);3.222−3.276(m,1H,NCHsp);3.544−3.583(m,1H,OCHsp);3.591−3.661(m,2H,NCHsp,H−5a);3.764(dd≒t,1H,H−4a,J8.8);3.787(dd,1H,H−3b,J3,43.7,J2,39.9);3.836(br.t,1H,H−5b,J7.3);3.882−3.920(m,1H,OCHsp);3.950(dd,1H,H−6’c,J6’,6”10.6,J5,6’5.2);4.009(ddd,1H,H−2a,J1,27.9,J2,310.0,J2,NH9.0);4.076−4.188(m,5H,H−6’a,H−6’b,H−6”b,H−5c,H−6”c);4.415(d,1H,H−1a,J1,27.9);4.443(d,1H,H−1b,J1,27.9);4.529(dd,1H,H−6”a,J6’,6”12.0,J5,6”2.5);4.548(ddd,1H,H−2c,J1,23.4,J2,311.6,J2,NH9.4);4.893(dd,1H,H−3c,J3,43.1,J2,311.6);5.021(d,1H,H−1c,J1,23.4);5.039−5.075(m,2H,H−3a,H−2b);5.339(dd≒d,1H,H−4b,J2.9);5.359(dd,1H,H−4c,J3,42.7,J4,50.9);5.810(d,1H,NHAc a,J2,NH9.0);6.184(d,1H,NHAc c,J2,NH9.4);7.310−7.413(m,1H,NHCOCF3SP)。Rf0.31(EtOAc−iPrOH,10:1)。[C43H60N3F3O25]H+について計算されたMS,m/z:1076.35,found1076。

0098

32β:1H−NMR(700MHz、CDCl3):1.766−1.832(m、1H、CHsp);1.850−1.908(m、1H、CHsp);1.923、1.969、1.982、2.059、2.071、2.099(2)、2.120、2.136、2.148(10s、10×3H、COCH3);3.230−3.289(m、1H、NCHsp);3.521(ddd、1H、H−2c、J1,28.2、J2,311.2、J2、NH7.8);3.548−3.591(m、1H、OCHsp);3.591−3.648(m、2H、NCHsp、H−5a);3.743(dd≒t、1H、H−4a、J8.6);3.795(br.t、1H、H−5b、J6.5);3.852(dd、1H、H−3b、J3,43.6、J2,39.9);3.873−3.923(m、2H、H−5c、OCHsp);4.002(ddd、1H、H−2a、J1,28.0、J2,39.5、J2、NH8.9);4.039(dd、1H、H−6’b、J6’、6”11.6、J5,6’6.9);4.087−4.144(m、3H、H−6’a、H−6”b、H−6’c);4.160(dd、1H、H−6”c、J6’、6”11.2、J5,6”6.0);4.409、4.417(2d≒t、2×1H、H−1a、H−1b、J7.6);4.519(dd、1H、H−6”a、J6’、6”11.8、J5,6”2.5);4.992(d、1H、H−1c、J1,28.2);5.043(dd、1H、H−3a、J3,48.6、J2,39.5);5.066(dd、1H、H−2b、J1,28.0、J2,39.8);5.350(dd≒d、1H、H−4c、J3.2);5.372(dd≒d、1H、H−4b、J3.4);5.399(d、1H、NHAc c、J2、NH7.8);5.449(dd、1H、H−3c、J3,43.4、J2,311.3);5.856(d、1H、NHAc a、J2、NH8.9);7.361−7.466(m、1H、NHCOCF3sp)。Rf0.24(EtOAc−iPrOH、10:1)。[C43H60N3F3O25]H+について計算されたMS、m/z:1076.35、found1076。

0099

0100

33:1H−NMR(700MHz,D2O):1.924−2.002(m,2H,CH2sp);2.060,2.064(2s,2×3H,NCOCH3);3.102(m≒t,2H,NCH2sp,J6.8);3.592−3.644(m,1H,H−5a);3.655(dd,1H,H−2b,J1,27.9,J2,39.9);3.702(br.dd,1H,H−5b,J5,6’3.8,J5,6”8.2,J4,5≦1);3.713−3.815(m,9H);3.846(dd,1H,H−6’a,J6’,6”12.3,J5,6’5.3);3.984−4.062(m,4H,OCHsp,H−6”a,H−4b,H−3c);4.123(dd≒d,1H,H−4c,J2.9);4.206(br.t,1H,H−5c,J6.3);4.248(dd,1H,H−2c,J1,23.6,J2,311.0);4.542(2d≒t,2H,H−1a,H−1b,J7.4);5.100(d,1H,H−1c,J1,23.5)。Rf0.55(MeOH−1M Py・AcOH水溶液,5:1)。[C25H45N3O16]H+について計算されたMS,m/z:644.28;found644。[α]546nm+128(c0.3;MeCN−H2O,1:1)。

0101

33β:1H−NMR(700MHz,D2O):1.938−1.991(m,2H,CH2sp);2.055,2.062(2s,2×3H,NCOCH3);3.100(m≒t,2H,NCH2sp,J6.9);3.610(dd,1H,H−2b,J1,27.9,J2,39.9);3.603−3.636(m,1H,H−5a);3.682(br.dd,1H,H−5b,J5,6’4.9,J5,6”7.8,J4,5≦1);3.693−3.826(m,11H);3.842(dd,1H,H−6’a,J6’,6”12.1,J5,6’5.2);3.934−3.972(m,2H,H−4b,H−2c);4.012(dd,1H,H−6”a,J6’,6”12.2,J5,6”2.0);4.023−4.057(m,1H,OCHsp);4.175(dd≒d,1H,H−4c,J2.9);4.478(d,1H,H−1b,J1,27.9);4.531(d,1H,H−1a,J1,28.1);4.638(d,1H,H−1c,J1,28.4)。Rf0.48(MeOH−1M Py・AcOH水溶液,5:1)。[C25H45N3O16]H+について計算されたMS,m/z:644.28;found644。[α]546nm+6(c0.3;MeCN−H2O,1:1)。

0102

Galili−T−17−DE(35)の調製(スキームVIIIのステップii)
無水DMSO中の化合物34(5mg、6μmol)の撹拌溶液に、化合物24(4.3mg、5μmol)及びEt3N(0.5μl)を1.5時間かけて3回に分けて添加した。混合物を室温で24時間撹拌し、次いでカラムクロマトグラフィー(Sephadex(登録商標)LH−20、MeOH−H2O、3:7)にかけて粗生成物35を得た。生成物を水から凍結乾燥させ、残留物を3mlの水に溶解し、NaHCO3の水溶液(10mM)を加えてpH6.5にし、溶液を凍結乾燥して3.7mgの化合物35をNa塩として得た。

0103

1H NMR(700MHz,D2O/CD3OD,2:1(v/v),選択された化学シフト)δ,ppm:1.06(t,J7.03Hz,DEのCH3),1.28−1.61(m,DEのCH2),1.71−1.88(m,−COCH2CH2CH2CH2CO及び−COCH2CH2−),1.90−1.99(m,OCH2CH2CH2N),2.13−2.27(m,−CH2CH=CHCH2−,−NHC(O)CH3),2.35−2.58(m,COCH2CH2CH2CH2CO−及び−COCH2CH2−),2.93−3.24(broad.s,8H;4C−CH2NH),4.63(dd,J2.49,J12.32,C(O)OCHHCHOCH2O−),4.67及び4.70(2d,J1,27.81,J1,27.95,H−1I,H−1II),5.30(d,J1,23.92,H−1III),5.42−5.47(m,−OCH2−CHO−CH2O−),5.52−5.58(m,4H,2×−CH=CH−)。MALDI TOFマススペクトル,M/Z:8188(M+Na);8204(M+K);8226(MNa+K)。

0104

0105

(Mal−βAla−(Gly2CMGly)5Gly2−NHCH2)3[DE−CO(CH2)4CO−(Gly2CMGly)5Gly2−NHCH2]C(37)の調製(スキームIX)
4mLの25%水性イソプロピルアルコール(IPA)中の25.3mg(3.3μmol)の化合物24の溶液に、MeCN(500μL)中のN−マレオイル−β−アラニンN’−ヒドロキシスクシンイミドエステル(36)(5.3mg、20μmol)の溶液を添加する。反応混合物のpHを、NMM(IPA中1:10(v/v)、約20μL)の添加により7〜8に調整する。透明な溶液を室温で一晩維持し、反応終了点を定性的スポットニンヒドリン試験により確認する。(試験における陰性の結果は、アミノ成分が消費されたことを示す)。ロータリーエバポレータを用いて溶媒を真空中で除去し、油状残留物をMeCN(500μL)でトリチュレートし、混合物を10分間超音波処理する。得られたスラリーエッペンドルフチューブに移し、遠心分離する。固体を超音波処理しながら無水エーテル及びMeCN(3×400μL)で繰り返し洗浄し、続いて出発試薬(Mal−βAla−ONSu)がTLC(CHCl3−MeOH−AcOH、90:8:2 v/v)で検出されなくなるまで遠心分離する。最後のエーテル洗浄後の沈殿物を、真空中、4Åモレキュラーシーブ上で一定重量まで乾燥させる。18.9mg(70%)の量の(Mal−βAla−CMG3−NHCH2)3CCH2NH−CMG3−Ad−DOPE(37)が、非晶質の白色粉末として得られた。単離された物質は、1モルの37当たり約17モルの第三級アミン及び1モルのナトリウムイオン(Na+)のモルを含み得る。

0106

Rf0.4−0.5、(CHCl3−MeOH−H2O、1:3:1(v/v/v)プラス0.5%ピリジン)。
1H NMR(700MHz、[D2]H2O/[D4]CH3OH 1:1(v/v)、30℃)のNa/Et3N塩(約7.3M/MのEt3N)δ、ppm:7.038(s、6H;3CH=CH)、5.542(m、4H;DEの2つのシスCH=CH)、5.446(m、1H;DEのOCH2−CH(OCO)CH2O)、4.635(dd、1H、J=12.2Hz/2.3Hz;DEのOCH2−CH(OCO)CHOCO)、4.516−4.041(181H;20NCH2CO、20NCH2COOH、48COCH2NH、DEのOCH2−CH(OCO)CHOCO、DEのOCH2CH2NH)、3.985(t、J=6.8Hz、6H;Alaの3NCH2)、3.594(t、2H、J=4.5Hz;DEのOCH2CH2NH)、3.384(q、44H、J=7.3Hz;22NCH2CH3)、3.079(broad.s、8H、4C−CH2NH)、2.777(t、6H、J=6.8Hz;Alaの3CH2CO)、2.548、2.522、2.515及び2.449(三重項、合計8H;4CO−CH2CH2)、2.195(約dd、8H、J=11.5Hz/5.8Hz;DEの2CH2−CH=CH−CH2)、1.812及び1.776(多重項、8H;4CO−CH2CH2)、1.484及び1.454(重複するt及びm、合計106H;t、J=7.3Hz、22NCH2CH3;m、DEの20CH2)、1.061(t、6H、J=7.1Hz;DEの2CH3)。

0107

0108

0109

(MUT21−Mal−βAla−(Gly2CMGly)5Gly2−NHCH2)3[DE−CO(CH2)4CO−(Gly2CMGly)5Gly2−NHCH2]C(38)の調製(スキームX)
MUT21と命名された、ある量(12.5mg、7.4μmol)の14マーのオリゴペプチド(m.w.1693.17Da):
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrProCys(配列番号01)
を、30%水性イソプロピルアルコール(pH6.6)中の4mL 0.1M NMM中の溶液として調製する。溶液を、ある量(13.5mg、1.64μmol)の37を溶解させた5mLの同じバッファーと合わせる。反応混合物を室温で一晩撹拌し、遠心分離する。上清を、分画分子量3.5kDaの透析バッグ(Spectra/Por3)を用いて、緩衝化していない30%(v/v)IPA−水に対して24時間、及びMilli−Q水に対して透析し、残留オリゴペプチド物質を除去する。次いで、得られたスラリーを凍結乾燥用フラスコに移し、一定重量まで凍結乾燥させる。18.4mg(84%)の量の構築物38が、非晶質の白色粉末として得られる。構築物のペプチドと脂質部分の特徴を示す低磁場プロトンの予期される信号の比が1H NMRで明らかにされる(D2O/CD3OD2:1中3mg/mL、303K、700MHz)(図8)。

0110

・比較化学
{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸メチルエステル(7)の調製(比較スキームIのステップi)
化合物7を調製する代替法を採用した。150mlの塩化メチレン中のBoc−グリシル−グリシン(23.2g、0.1mol)の撹拌懸濁液に、N−メチルモルホリン(11.0ml、0.1mol)を添加し、溶液を−15℃に冷却してクロギ酸イソブチル(13.64g、0.1mol)を10分間にわたって加えた。次いで、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び50mlのDMF中の(メトキシカルボニルメチルアミノ)−酢酸メチルエステル(7)(16.1g、0.1mol)の溶液を、化合物39を含有する同じ温度の反応混合物に添加した。得られた混合物を0℃で30分間、次いで周囲温度で2時間撹拌し、蒸発乾固させた。残留物を200mlの塩化メチレンに溶解し、100mlの0.5M HCl及び200mlの2%NaHCO3水溶液で洗浄した。溶媒を真空中で蒸発させ、残留物をシリカゲル(CHCl3中の3%MeOH)でのカラムクロマトグラフィーで精製し、純粋な化合物7(34.08g、91%)を無色ガラスとして得た。TLC:Rf=0.40(CHCl3中の5%MeOH)、Rf=0.49(7:1(v/v)のクロロホルム/メタノール)。

0111

1H NMR(500MHz,[D6]DMSO,30℃)δ,ppm:7.826(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.979(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.348及び4.095(s,2H;NCH2COO),3.969(d,J=5.1Hz,2H;COCH2NH),3.689及び3.621(s,3H;OCH3),3.559(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.380(s,9H;C(CH3)3)。Rf0.49(7:1(v/v)のクロロホルム/メタノール)。

0112

{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸(8)の調製(比較スキームIのステップii)
メタノール(325ml)中の{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸メチルエステル(8)(24.42g、65.12mmol)の撹拌溶液に、0.2MのNaOH水溶液(325ml)を加え、反応混合物を周囲温度で15分間維持し、酢酸(5ml)で酸性化し、蒸発乾固させた。シリカゲルでの残留物のカラムクロマトグラフィー(メタノール−酢酸エチル1:1)により、目的化合物をNa塩(20.44g)として得、これをメタノール/水/ピリジン混合物(20:10:1、350ml)に溶解し、イオン交換カラム(Dowex(登録商標)50X4−400、ピリジン形態、300ml)に通してNaカチオンを除去した。カラムを同じ混合物で洗浄し、溶出物を真空中で蒸発及び乾燥させて、純粋な化合物8(20.15g、86%)を白色固体として得た。TLC:Rf=0.47(iPrOH/酢酸エチル/水 4:3:1)。

0113

1H NMR(500MHz,[D6]DMSO,30℃),N−カルボキシメチルグリシンユニットのシス異性体及びトランス異性体のc.3:1の混合物。主な異性体;δ,ppm:7.717(t,J=5Hz,1H;NHCO),7.024(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.051(s,2H;NCH2COOCH3),3.928(d,J=5Hz,2H;COCH2NH),3.786(s,2H;NCH2COOH),3.616(s,3H;OCH3),3.563(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.381(s,9H;C(CH3)3)ppm;副異性体,δ=7.766(t,J=5Hz,1H;NHCO),7.015(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.288(s,2H;NCH2COOCH3),3.928(d,J=5Hz,2H;COCH2NH),3.858(s,2H;NCH2COOH),3.676(s,3H;OCH3),3.563(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.381(s,9H;C(CH3)3)。Rf0.47(4:3:1(v/v/v)のi−PrOH/酢酸エチル/水)。

0114

{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸N−オキシスクシンイミドエステル(BOC−Gly2(MCM)GlyOSu)(9)の調製(比較スキームIのステップiii)
N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(14.03g、68.10mmol)を、DMF(210ml)中の{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸(26.40g、73.13mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(8.70g、75.65mmol)の氷冷撹拌溶液に加えた。混合物を0℃で30分間、次いで周囲温度で2時間撹拌した。析出したN,N’−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、DMF(80ml)で洗浄した。濾液及び洗浄液を濃縮し、残留物をEt2O(500ml)と共に1時間撹拌した。エーテル抽出物をデカントし、残留物を濃縮して化合物9を白色の泡状物として得た(32.57g、97%)。TLC:Rf=0.71(アセトン/酢酸 40:1)。1H NMR(500MHz、DMSO[D6]、30℃)、N−カルボキシメチルグリシンユニットのシス異性体及びトランス異性体のc.3:2の混合物。

0115

0116

主な異性体;δ,ppm:7.896(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.972(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.533(s,2H;NCH2COON),4.399(s,2H;NCH2COOCH3),3.997(d,J=5.1Hz,2H;COCH2NH),3.695(s,3H;OCH3),3.566(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.380(s,9H;C(CH3)3)。

0117

副異性体;δ,ppm:7.882(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.963(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.924(s,2H;NCH2COON),4.133(s,2H;NCH2COOCH3),4.034(d,J=5.1Hz,2H;COCH2NH),3.632(s,3H;OCH3),3.572(d,J=5.9Hz,2H;COCH2NHCOO),1.380(s,9H;C(CH3)3)。

0118

Rf0.71(40:1(v/v)のアセトン/酢酸)。
H2N−CMG2−NH2(45)の調製(比較スキームII及びIII)
DMSO(50ml)中のBoc−Gly2−(MCM)Gly−OSu(9)(15.42g、33.68mmol)の撹拌溶液に、DMSO(5ml)中のエチレンジアミン(40)(808mg、13.47mmol)及びEt3N(1.87ml、13.5mmol)の溶液を添加した。反応混合物を周囲温度で30分間撹拌し、酢酸(1.2ml)で酸性化し、次いでSephadex(登録商標)LH−20カラム(カラム容量1200ml、溶離剤−MeOH/水 2:1+0.2%AcOH)で分画した。化合物のBoc2MCMG(41)を含む画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物を真空中で濃縮した。生成物を、溶離剤として2−プロパノール/酢酸エチル/水(2:6:1)を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。純粋なBoc2MCMG(41)を含む画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させて、目的のBoc2MCMG(41)を無色の泡状物(8.41g、84%)として得た。TLC:Rf=0.48(iPrOH/酢酸エチル/水 2:3:1)。

0119

1H NMR(500MHz,[D6]DMSO,30℃),配座異性体の混合物約3:2: 8.166,8.125,7.917及び7.895(m,合計2H;2CONHCH2),7.793(m,2H;NHCH2CH2NH),7.001(br.t,2H;2NHCOO),4.277−3.893(合計12H;2CH2COO,4NCH2CO),3.690及び3.635(s,合計6H;2COOCH3),3.567(d,J=5.8Hz,4H;2CH2NHCOO),3.131(m,4H;NHCH2CH2NH),1.379(s,18H;2C(CH3)3)ppm。

0120

MS,m/z:769[M+のNa],785[M+K]。
トリフルオロ酢酸(25ml)を塩化メチレン(25ml)中のBoc2MCMG(41)(4.88g、6.535mmol)の撹拌溶液に添加し、溶液を周囲温度で1時間維持した。次いで、反応混合物を濃縮し、残留物を無水メタノール(50ml)を用いて3回蒸発させ、その後、残留物をEt2O(100ml)で3回抽出して微量のトリフルオロ酢酸を除去した。(白色固体として)生じた沈殿物を乾燥させて、5.06g(約100%)のMCMG(42)をビス−トリフルオロ酢酸塩として得た。TLC:Rf=0.23(エタノール/水/ピリジン/酢酸5:1:1:1)。

0121

1H NMR(500MHz,D2O,30℃),配座異性体の混合物約5:4: 4.400−4.098(合計12H;2CH2COO,4NCH2CO),3.917(s,4H;2COCH2NH2),3.829及び3.781(s,合計6H;2COOCH3),3.394(m,4H;NHCH2CH2NH)ppm。

0122

MS、m/z:547[M+H]、569[M+Na]、585[M+K]。
DMSO(17ml)中のBoc−Gly2−(MCM)Gly−OSu(9)(7.79g、16.994mmol)及びEt3N(2.83ml、20.4mmol)の溶液を、DMSO(13ml)中のH2N−MCMG−NH2(42)(5.06g、6.796mmol)の撹拌溶液に添加した。反応混合物を周囲温度で2時間撹拌した後、酢酸(4.0ml)で酸性化し、Sephadex(登録商標)LH−20カラムクロマトグラフィー(カラム容量1200ml、溶離剤−MeOH/水 2:1+0.2%AcOH)で分画した。純粋なBoc2MCMG2(43)を含む画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させて、目的のBoc2MCMG2(43)を無色の泡状物(8.14g、97%)として得た。TLC:Rf=0.25(iPROH/酢酸エチル/水 2:3:1)。

0123

1H NMR(500MHz,[D6]DMSO,30℃),配座異性体の混合物:8.393−7.887(合計6H;6CONHCH2),7.775(m,2H;NHCH2CH2NH),6.996(br.t,2H;2NHCOO),4.299−3.730(合計28H;4CH2COO,10NCH2CO),3.691及び3.633(s,合計12H;4COOCH3),3.564(d,J=5.8Hz,4H;2CH2NHCOO),3.129(m,4H;NHCH2CH2NH),1.380(s,18H;2C(CH3)3)ppm。

0124

MS、m/z:1256[M+Na]、1271[M+K]。
Boc2MCMG2(43)(606mg、0.491mmol)をCF3COOH(2ml)に溶解し、溶液を室温で30分間維持した。トリフルオロ酢酸を真空中で蒸発させ、残留物をEt2Oで3回抽出して(25mlのEt2Oでのトリチュレーションの後に濾過)、残留CF3COOHを除去し、得られた白色粉末を真空中で乾燥させた。粉末を4mLの水に溶解し、次いで凍結乾燥させた。H2N−MCMG2−NH2(44)(TFA塩)の収率は定量的に推定された(実際の重量は水和物の安定性のために理論値よりも約10%大きかった)。TLC:Rf=0.21(エタノール/水/ピリジン/酢酸5:1:1:1)。

0125

1H NMR(500MHz,[D2]H2O,30℃),配座異性体の混合物:4.430−4.014(合計28H;4CH2COO,10NCH2CO),3.911(s,4H;2COCH2NH2),3.823及び3.772(s,合計12H;4COOCH3),3.386(m,4H;NHCH2CH2NH)ppm。

0126

MS、m/z:1034[M+H]、1056[M+Na]。
水(20mL)中のH2N−MCMG2−NH2(44)(約0.49mmol)の溶液に、Et3N(0.5mL)を添加し、溶液を室温で15時間維持した。反応混合物を蒸発乾固させ、残留物をSephadex(登録商標)LH−20カラムで脱塩した(2つの方法):方法A.残留物を水(3ml)に溶解し、溶液をSephadex(登録商標)LH−20カラム(カラム容量250mL、溶離剤−MeOH/水1:1+0.05M酢酸ピリジン)で脱塩した。塩で汚染されたH2N−CMG2−NH2(45)を含む画分を、別々に合わせ、蒸発させ、残留物を再度脱塩した。純粋なH2N−CMG2−NH2(45)を含む合わせた画分を、約4mLの体積まで蒸発させ、凍結乾燥させた。H2N−CMG2−NH2(45)(内部塩)の収量は431mg(90%)であった。方法B.残留物を水(3ml)に溶解し、溶液をSephadex(登録商標)LH−20カラム(カラム容量250mLの溶離液−MeOH/水 1:1+1%濃度NH3水溶液)で脱塩した。純粋なH2N−CMG2−NH2(45)を含む画分を、約4mlの体積まで蒸発させ、凍結乾燥させた。残留物(H2N−CMG2−NH2(45)のアンモニア塩)をiPrOH/水 1:1混合物(10mL)に溶解し、Et3N(0.2mL)を加え、溶液を蒸発乾固させた。この手順を2回繰り返した。残留物を4mLの水に溶解し、凍結乾燥させた。H2N−CMG2−NH2(45)のジ−Et3N塩の収量は549mg(95%)であった。

0127

TLC:Rf=0.50(iPrOH/MeOH/アセトニトリル/水 4:3:3:4+3%濃度NH3水溶液)、又はRf=0.43(iPrOH/EtOH/MeOH/水 1:1:1:1、0.75M NH3)。

0128

H2N−CMG2−NH2(45)内部塩の1H NMR(500MHz,[D2]H2O,30℃),配座異性体の混合物:4.328−4.006(合計28H;4CH2COO,10NCH2CO),3.907(s,4H;2COCH2NH2),3.381(m,4H;NHCH2CH2NH)ppm。

0129

MS、m/z:977[M+H]、999[M+Na]、1015[M+K]。
H2N−CMG2−Ad−DOPE(46)の調製(比較スキームIV)
激しく撹拌したi−PrOH/水混合物(i−PrOH/水 3:2、10mL)中のH2N−CMG2−NH2(45)(425mg、0.435mmolの内部塩)に、1MのNaHCO3水溶液(0.435mL、0.435mmol)を、次いでジクロロエタン(0.4mL)中のDOPE−Ad−OSu(23)(211mg、0.218mmol)を加えた。反応混合物を2時間撹拌し、次いで0.2mLのAcOHで酸性化し、35℃で最小体積まで蒸発させた。固体残留物を真空中で乾燥させ(固体の泡)、次いでCHCl3/MeOH混合物で十分に抽出した(CHCl3/MeOH 4:1、10mLで数回、TLC対照)。抽出された残留物は未反応のH2N−CMG2−NH2(45)及び塩から構成された(H2N−CMG2−NH2(45)合成に記載の手順に従うシリカゲルでのクロマトグラフィー後の画分及び残留物を合わせたものの脱塩により、H2N−CMG2−NH2(45)の約50%が回収された)。合わせたCHCl3/MeOH抽出物(H2N−CMG2−Ad−DOPE(46)、DOPE−Ad−CMG2−Ad−DOPE、N−オキシスクシンイミド、及び一部のH2N−CMG2−NH2(45)の溶液)を真空中で蒸発させ、乾燥させた。得られた混合物をシリカゲルカラム(CHCl3/MeOH 5:1中の2.8×33cm、約200mLのシリカゲル)で分離した。混合物をMeOH/CHCl3/水混合物(MeOH/CHCl3/水: 6:3:1+0.5%のピリジン)中のカラム上に置き、成分を段階的に、三元濃度勾配で溶出した。すなわち、6:3:1から6:2:1、次いで6:2:2(全てピリジン0.5%を含む)までのMeOH/CHCl3/水組成物である。DOPE−Ad−CMG2−Ad−DOPEが最初に溶出し(Rf=0.75、MeOH/CHCl3/水 3:1:1)、目的のH2N−CMG2−Ad−DOPE(46)が続き(Rf=0.63、MeOH/CHCl3/水 3:1:1)、最後に溶出したのがH2N−CMG2−NH2(45)であった(Rf=0.31、MeOH/CHCl3/水 3:1:1)。純粋なH2N−CMG2−Ad−DOPE(46)を含む画分を合わせ、蒸発乾固させた。低分子量の不純物及び可溶化したシリカゲルを除去するために、残留物をiPrOH/水 1:2混合物(2mL)に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラム(カラム容量130mL、溶離液−iPrOH/水 1:2+0.25%のピリジン)を通過させた。純粋なH2N−CMG2−Ad−DOPE(46)を含む画分を合わせて蒸発乾固させ(発泡を防止するために約20%の2−プロパノールを添加した)、残留物を水(約4mL)に溶解し、凍結乾燥させた。H2N−CMG2−Ad−DOPE(46)の収量は270mg(DOPE−Ad−OSuで68%又はH2N−CMG2−NH2(45)で34%)であった。

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0131

0132

1H NMR(500MHz,[D2]H2O/[D4]CH3OH 2:1,30℃):5.505(m,4H;2CH2CH=CHCH2),5.476(m,1H;OCH2CHCH2O),4.626(dd,Jgem=11.6Hz,1H;OCHCHCH2O),4.461−4.084(合計37H;4CH2COO,11NCH2CO,OCHCHCH2O,OCH2CH2N),4.002(s,2H;COCH2NH2),3.573(m,4H;NHCH2CH2NH),2.536−2.463(m,合計8H;4CH2CO),2.197(m,8H;2CH2CH=CHCH2),1.807(m,8H;4CH2CH2CO),1.480(m,40H;20CH2),1.063(〜t,J≒6Hz,6H;2CH3)ppm。

0133

MS、m/z:1831[M+H]。
Galili−CMG2−Ad−DOPE(47)の調製(比較スキームV)
無水DMSO(6mL)中の化合物34(66mg、0.079mmol)の撹拌溶液に、15μlのEt3N及び粉末H2N−CMG2−Ad−DOPE(46)(95mg、0.0495mmol)を3回に分けて添加した。混合物を室温で24時間撹拌し、次いでカラムクロマトグラフィー(Sephadex(登録商標)LH−20、i−PrOH−H2O、1:2、0.5体積%のPy、0.25体積%のAcOH)にかけて粗化合物47をPy塩の形態で得た。化合物を水から2回凍結乾燥し、その後再び10mlの水に溶解し、化合物47をNa塩の形態で得るために、NaHCO3の水溶液(50mM)をpH6.5になるまで添加して、溶液を凍結乾燥させた。化合物47(Na塩)の収量は114mg(NH2−CMG2−DEに基づくと86%)、Rf0.6(i−PrOH−MeOH−MeCN−H2O、4:3:6:4)であった。1Н NMR(700MHz,D2O−CD3OD,1:1(v/v),40℃;選択されたシグナル)δ,ppm:1.05(t,J7.03Hz,6H;2CH3),1.40−1.58(m,40H;20CH2),1.73−1.87(m,12H;2×−COCH2CH2CH2CH2CO及び2×−COCH2CH2−),1.90−1.99(m,2H;OCH2CH2CH2N),2.15−2.25(m,11H;2×−CH2CH=CHCH2−,−NHC(O)CH3),2.39−2.59(2m,合計12H,2×−COCH2CH2CH2CH2CO−及び2×−COCH2CH2−)4.63(dd,1H,J2.51,J12.20,C(O)OCHHCHOCH2O−),4.67及び4.69(2d×1H,J1,27.81,J1,27.95,H−1I,H−1II),5.30(d,1H,J1,23.88,H−1III),5.42−5.46(m,1H,−OCH2−CHO−CH2O−),5.49−5.59(m,4H,2×−CH=CH−);MALDI TOFマススペクトル,M/Z:2567(M+Na);2583(M+K);2589(MNa+Na);2605(MNa+K);2611(MNa2+Na)。

0134

0135

0136

GalNAcα1−3Galβ1−4GlcNAc−Ad−DOPE(33)の調製(比較スキームVI)
N,N−ジメチルホルムアミド(1ml)中の生成物23(33μmol)の溶液に、30μmolの3−アミノプロピルトリサッカライド33及び5μlのトリエチルアミン(ET3N)を添加した。混合物を室温で2時間撹拌した。シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2−EtOH−H2O;6:5:1)により収率81%の構築物48を得た。

0137

48:1H NMR(700MHz,CDCl3−CD3OD,1:1v/v,選択),δ,ppm:1.05(t,6H,J7.05,2CH3),1.39−1.55(m,40H,20CH2),1.75−1.84(m,8H,COCH2CH2CH2CH2CO及び2×COCH2CH2−),1.84−1.96(m,2H,O−CH2CH2CH2−NH),2.15−2.22(m,14H,2×(−CH2−CH=CH−CH2−),2×NHC(O)CH3),2.34−2.46(m,4H,2×−CH2−CO),2.36−2.44(m,4H,2×−CH2−CO),3.29−3.34(m,1H,−CH2−CHH−NH),4.17−4.20(m,2H,−CHO−CH2OP−),4.34−4.39(m,2H,−CH2OPO−CH2−CH2),4.57(d,1H,J1,28.39,H−1I),4.50(dd,1H,J3.78,J10.82,−C(O)OCHHCHOCH2O−),4.58−4.61(m,2H,H−1II,C(O)OCHHCHOCH2O−),5.15(d,1H,J1,23.76,H−1III),5.38−5.42(m,1H,−OCH2−CHO−CH2O−),5.47−5.53(m,4H,2×−CH=CH−)。Rf0.5(CH2Cl2−EtOH−H2O;6:5:1)。

0138

0139

Galα1−3Galβ1−4GlcNAc−Ad−DOPE(49)の調製(比較スキームVII)
構築物49を構築物48の調製に用いたのと同じ方法に従って調製した。シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーのための溶離液:CH2Cl2−EtOH−H2O;6:5:1、構築物49の収率−84%;
49:1H NMR(700MHz,CDCl3−CD3OD,1:1v/v,選択されたシグナル),δ,ppm:1.05(t,6H,J6.98,2CH3),1.36−1.55(m,40H,20CH2),1.73−1.84(m,8H,COCH2CH2CH2CH2CO及び2×(COCH2CH2−),1.85−1.96(m,2H,O−CH2CH2CH2−NH),2.14−2.22(m,11H,2×(−CH2−CH=CH−CH2−),NHC(O)CH3),2.45−2.52(m,4H,2×−CH2−CO),2.36−2.45(m,4H,2×−CH2−CO),3.29−3.35(m,1H,−CH2−CHH−NH),3.52−3.62(m,3H,PO−CH2−CH2−NH,−CH2−CHH−NH),4.13−4.18(m,2H,−CHO−CH2OP−),4.19(d,1H,J3,42.48,H−4II),4.36(dd,1H,J6.8,J12.00,−C(O)OCHHCHOCH2O−),4.56(d,1H,J1,28.39,H−1I),4.60(dd,1H,J2.87,J12.00,C(O)OCHHCHOCH2O−),4.61(d,1H,J1,27.57,H−1II),5.18(d,1H,J1,22.52,H−1III),5.34−5.43(m,1H,−OCH2−CHO−CH2O−),5.45−5.54(m,4H,2×−CH=CH−)Rf0.45(CH2Cl2−EtOH−HF2O;6:5:1)。

0140

0141

生物
コデサイトの調製
構築物(35、47、48及び49)のストック溶液を、赤血球(RBC)保存溶液(CELPESOL(商標)、CSL社)中1mg/mLの濃度で調製した。希釈する前に、各ストック溶液を室温(rt)で45秒間ボルテックスした。100μLの体積の希釈ストック溶液を、100μLの体積の、遠心で押し固められたRBC(血球容積;PCV)に添加した。合計200μLの体積の懸濁RBCを37℃で2時間インキュベートした後、CELPRESOL(商標)で洗浄し、この改変させたRBC(「コデサイト」)を、CELPRESOL(商標)中5%のPCV濃度に再懸濁させた。

0142

ドラキン溶液の調製
200mgのフェリシアン化カリウム(K3Fe(CN)6)、50mgのシアン化カリウム(KCN)及び140mgのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)及び1mLの非イオン性界面活性剤(Triton(登録商標)X−100)を脱イオン水に溶解し、1Lの体積にした。溶液をガラス瓶中で暗所で貯蔵し、使用前にpHが7.0〜7.4の範囲にあることを確認した。

0143

EDTA溶液の調製
4.45gのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)をその二カリウム塩(K2H2EDTA)として、及び0.3gの水酸化ナトリウム(NaOH)を、脱イオン水に溶解し、100mLの体積にした。

0144

患者血漿中の抗体の検出
異なる構築物を用いて調製されたコデサイトが血漿試料中の抗体の存在を検出する能力を、Bovinら(2009)に記載の方法に類似した方法により比較した。結果は表1に示されており、対象の血清中のMUT21結合抗体(存在する場合)に対するアビディティの増大と一致している。

0145

補体誘導性細胞溶解
使用前にコデサイトを洗浄し、リン酸緩衝食塩水(PBS)中5%PCVに再懸濁した。1mLの体積のドラブキン溶液に40μLの体積のコデサイト懸濁液を添加し、540nmで測定されたドラブキン溶液(ブランク)に対する吸光度により、RBCの濃度の均一性を確認した。測定された吸光度の変動は、懸濁体積の調整によって10%未満に減少した。

0146

補体媒介性自己分解を誘導する構築物の能力を、HenryとKomarraju(2012)の文献に記載されている方法に類似した方法によって評価した。本研究では、構築物49を用いて調製したコデサイトを100%溶解対照として使用した。200μLの体積のプールしたAB血清と、構築物49を用いて調製した750μg/mLの濃度の100μLの体積のコデサイトを、100%溶解対照として使用した。200μLの体積のプールしたAB血清と、100μLの体積のO型RBC(構築物を添加せずにコデサイトのように調製されたもの)を、0%溶解対照として使用した。コデサイトの補体媒介性自己分解を誘導する構築物の能力を測定するために、200μLの体積のプールしたAB血清を2セットの試験チューブ分配した。100μLの体積のコデサイトをチューブに加え、37℃で1時間インキュベートした。インキュベート後、1μLの体積のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)をその二カリウム塩として、最終濃度0.1mMのEDTAになるように各試験チューブにそれぞれ添加した。次いで、試験チューブを遠心分離にかけ、沈降したRBC及び上清の特性を観察した(表2及び図2)。さらに、160μLの体積の無細胞上清を取り出し、1mLの体積のドラブキン溶液に添加した。次いで、1mLのドラブキン溶液に添加した160μLの体積のプールしたAB血清(ブランク)に対する溶液の吸光度を540nmで測定した。上清の吸光度を、コデサイトの懸濁液の初期吸光度に対する百分率として算出した。溶解した細胞のパーセンテージ標準曲線に対して計算した。

0147

0148

0149

0150

多価リガンド構築物35を用いて調製されたコデサイトは、自己分解のし易さが構築物49を用いて調製されたコデサイトの約2倍のようである。半モル当量及びモル当量は、ほぼ同程度の細胞溶解を生じた。構築物47を用いて調製されたコデサイトは、49と称される構築物を用いて調製されたコデサイトよりも、いくらか溶解し易かった。(この観察は、構築物38を用いて調製されたコデサイトでの抗体誘導性凝集の観察と一致している。)構築物48を用いて調製されたコデサイトは、構築物49を用いて調製されたコデサイトの約2倍、溶解し易いようである。Galiliら(2015)の文献に開示されているように、これらの観察は、腫瘍を有する患者を治療する方法に使用された際の構築物の有効性の予測となることが提起されている。

0151

本発明を実施例又は実施例を参照して説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく、これらの実施例又は実施例に変更及び修正を加えることができることを理解されたい。例えば、ビス(N−ヒドロキシスクシンイミジル)スクシネート、ビス(N−ヒドロキシスクシンイミジル)グルタル酸、ビス(N−ヒドロキシスクシンイミジル)ピメレート及びビス(N−ヒドロキシスクシンイミジル)スベレートの各々を、化合物23及び34の調製におけるビス(N−ヒドロキシスクシンイミジル)アジペート(21)使用の替わりに用いてもよいことが予想される。

0152

特定の要素、特徴又は整数に既知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、本明細書で具体的に言及されているかのように組み込まれる。例えば、本明細書に具体的に記載されているもの以外の3−アミノプロピルグリコシドの調製は、Audibertら(1987)、Bovinら(1993)、Galaninaら(1997)、Karelinら(2010)、KorchaginaとBovin(1992)、Korchaginaら(2009)、Krylovら(2007)、Nifant’evら(1996)、Pazyninaら(2003)、Pazyninaら(2014)、Ryzhovら(2012)、Shermanら(2001)、Vodovozovaら(2000)及びYashunskyら(2016)の文献に開示されている。特に、参照された文献に開示され、そこから選択される要素、特徴又は整数を含む実施形態又は実施例の変形及び修正は、特に断らない限り、本発明の範囲内である。他の場所に開示された3−アミノプロピルグリコシドを、ここに記載した合成スキームにおける化合物29及び33の代わりに用いてもよいことが予想される。

0153

本発明によって提供され、明細書において論じられる各利点は、本発明のこれらの様々な実施形態において択一的に又は一緒に提供され得る。
参考文献

0154

0155

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