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課題・解決手段

本発明は、植物起源の精製されたスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の最初の特定の混合物に関し、前記混合物が、3つのスーパーオキシドジスムターゼ:マンガンスーパーオキシドジスムターゼ、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ、並びに2つのアイソフォームで提供される鉄スーパーオキシドジスムターゼで本質的に構成されることを特徴とし、それらスーパーオキシドジスムターゼは、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核性細胞に前記SODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞の抽出物から得ることができる。本発明による特定の混合物は、放射線照射により誘発される線維形成心臓血管疾患肥満アテローム性動脈硬化症口唇ヘルペス及びミオパチー等の炎症及び/若しくは酸化的ストレスと関連する疾患の治療又は予防において、並びに栄養、医薬獣医用又は化粧用の使用において同様のより強い効果を含有する組成物を与える。

概要

背景

酸素は、身体機能に必須である、しかし身体に対し負の作用を有する有毒反応性酸化形態を生成する。これらの反応性酸化形態は、ほとんどの場合、スーパーオキシドラジカル(O2.-)、ヒドロキシラジカル(HO.)、一酸化窒素(.NO)、又は脂質起源過酸化物ラジカル(L-OO.)等のフリーラジカルである。スーパーオキシドイオンは、活性酸素種の中では最も豊富であり、酸素から直接形成され;他の全ての活性酸素種は、それ、特に最も強力なヒドロキシラジカル(HO.)から生じる。

これらのフリーラジカルは、原子又は分子であり、その電子配置は、不対電子の存在により特徴づけられる。この特殊性は、そのラジカル不安定化し、それ自身を安定化するために核酸(DNA)、酵素タンパク質又は膜脂質、特に高度不飽和脂肪酸(PUFA)等他の生体分子を迅速に酸化する場合がある。

身体は、細胞破壊する活性酸素種の形成に逆らって常に作用する。全ての細胞は、細胞解毒のための構成的防衛線を有する。

第1の防衛線は、金属酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)と呼ばれる酵素により確実にされる(Mac Cord及びFridovich、J. Biol. Chem. 244: 6049〜55頁、1969)。植物界には3つの形態のSODがあり(Michalski、J. Chromatogr. B 684: 59〜75頁、1996)、それぞれが、その活性部位に配置されている金属イオンの存在によって特徴づけられ:
- SODの1つの形態は、銅及び亜鉛を含有し(Cu/Zn-SOD)、主に細胞質及び葉緑体に位置し;
- 別の形態は、マンガンを含有し(Mn-SOD)、ミトコンドリア及びペルオキシソームに位置し;
- 最後に、いくつかの植物種において、SODは鉄を含有し(Fe-SOD)、葉緑体に位置する。

SODは、スーパーオキシドイオンを排除できるので、それらはフリーラジカルとの戦いに重要な役割を果たす。スーパーオキシドジスムターゼは、以下の反応:
2O2.-+2H2O→O2+H2O2+2OH-(式1)
のようにスーパーオキシドイオンの不均化反応誘導することができる酵素である。

SODの作用は、H2O2を排除する第2の防衛線:過酸化水素H2O2の破壊を確実にするカタラーゼ及び/又はセレン依存的グルタチオンペルオキシダーゼ(SeGPx)により完了する。

正常な生物学的条件下で、人体は少量のフリーラジカルを常に産生しており、そのラジカルは、既存の防御系により直ちに中和される。いくつかの場合において、フリーラジカルの産生が増加する(タバコストレス汚染太陽光線、偏食等)場合、及び/又は抗酸化物質欠乏する場合、これは、高分子(DNA、タンパク質、糖、炭水化物の酸化)においてだけでなく細胞小器官、特に低下した場合にフリーラジカルの大きな供給源になる、細胞のためのエネルギーの主要な運搬装置であるミトコンドリアにおける、大きな細胞変化を誘導する酸化/抗酸化不均衡をもたらす。この不均衡は、多数の病変及び多数の不均衡と次第に近い相関を有する。SODは、全ての活性酸素種、それゆえ酸化的ストレスの原因であるスーパーオキシドアニオンを中和することにより、酸化的ストレスの調節に重要な役割を果たし、外来性SODの投与が、酸化的ストレスに関連する病変の治療に意図される。

現在まで、利用可能な唯一の精製SODは動物界から得られており、特にウシ赤血球(Markovitz、J. Biol. Chem.、234、40頁、1959)、大腸菌(Escherichia Coli)(Keele及びFridovitch、J. Biol.、245、6176頁、1970)、及び海洋細菌株(仏国特許第2225443号及び第2240277号)から抽出されている。

SOD、主にウシCu-Zn-SOD形態は、Orgotein(登録商標)という名の医薬品に至る医薬開発の対象であった。それは、フリーラジカルにより誘導される病変、特にクローン病(Emeritら、1991、Free Rad. Res. Comms、12〜13、563〜569頁)、又は放射線療法に誘導される線維症(Delanianら、1994、Radiotherapy and Oncology、32、12〜20頁)の治療において等慢性炎症の場合に使用されてきた。

しかし、そのような材料に含有される可能性がある感染性物質に主に関連する理由のため、これらの動物性SODは、少なくともフランスにおいては1990年代にすぐに禁止された。この理由により、植物界から得られるSOD供給源の探索が、医薬分野において増加する関心の中心であった。

従って植物起源、特にメロンのSODを含む別の組成物が提案された。Milindらによる論文(International Research Journal of Pharmacy、2011、8、52〜57頁)、Voudoukis及びLacanらによる論文(Journal of Ethnopharmacology 2004、94、67〜75頁)、又はGeneらによる論文(Journal of Agricultural and Food Chemistry、2008、56、3694〜3698頁)に例示されるように、メロンに基づく栄養補助食品の使用から得られる利益は、周知である。

加えて、メロンは、他の果物と比較して特に高いSOD含有量を一般に有する。従ってメロンからのSOD抽出収量は高く、経済的に有益である。SODの存在による効果を観察するのに十分に高い含有量がある他の果物由来抽出物がまだ市販されていないことにも注目すべきである。

経口経路による投与を目的としたSOD含有組成物胃液に対して保護するために小麦グリアジン基質コーティングした植物起源、特にメロン由来のSODの製剤について、例えば、仏国特許出願第2729296号、又は製品GLISODIN(登録商標)に記述されている。

また、仏国特許第2716884号は、キューカミス・メロ、好ましくは可溶性タンパク質の30単位/mgでより高いスーパーオキシドジスムターゼ酵素作用を有する品種95LS444のタンパク質抽出物、その調製の方法及び外部局所用としての医薬又は化粧用組成物におけるその使用について記述している。しかしながら、前記タンパク質抽出物は、十分に精製されておらず、十分な活性もないので、スーパーオキシドジスムターゼが豊富であるにもかかわらず、特に多くの医薬適用に使用することができない。95LS444品種のキューカミス・メロのタンパク質抽出物が、スーパーオキシドジスムターゼ酵素活性126U/mgタンパク質を有することが、実施例1に示される。Lacanら(Planta 1998、204、377〜382頁)において、クリッパーメロン(キューカミス・メロ95LS444品種の子孫)から得られる前記抽出物も、同じ全体SOD含有量で記述されている。この論文が、Fe-SODの単一のアイソフォームについて記述していることに注目されたい。

従って、酸化的ストレスに関連する疾患及びその転帰、特に心臓血管疾患及び肥満並びにその転帰と闘うために、医薬活性を改善した植物起源のSODの混合物を得る必要性がある。

驚くべきことに、本出願者は、先行技術にあるSOD混合物より高い抗酸化特性を有する植物起源のSODの混合物を見出した。特に、本発明のSOD混合物は、キューカミス・メロの95LS444品種又はクリッパーメロン等その子孫のうち1つのタンパク質抽出物から得られるSOD混合物より活性がある。

しかしながらこの解釈に限定されることなく、現在まで記述されてこなかった前記混合物中の鉄スーパーオキシドジスムターゼの特定のアイソフォームの存在は、本発明の混合物に一層大きな医薬特性を与え得ると思われる。

概要

本発明は、植物起源の精製されたスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の最初の特定の混合物に関し、前記混合物が、3つのスーパーオキシドジスムターゼ:マンガンスーパーオキシドジスムターゼ、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ、並びに2つのアイソフォームで提供される鉄スーパーオキシドジスムターゼで本質的に構成されることを特徴とし、それらスーパーオキシドジスムターゼは、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核性細胞に前記SODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞の抽出物から得ることができる。本発明による特定の混合物は、放射線照射により誘発される線維形成、心臓血管疾患、肥満、アテローム性動脈硬化症口唇ヘルペス及びミオパチー等の炎症及び/若しくは酸化的ストレスと関連する疾患の治療又は予防において、並びに栄養、医薬、獣医用又は化粧用の使用において同様のより強い効果を含有する組成物を与える。

目的

本発明の化粧用組成物は、ケア製品シャンプーローションゲル等外局所使用を目的とする

効果

実績

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請求項1

3つのスーパーオキシドジスムターゼ:マンガンスーパーオキシドジスムターゼ、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ、並びに少なくとも2つのアイソフォームの鉄スーパーオキシドジスムターゼから本質的になることを特徴とする植物起源のスーパーオキシドジスムターゼの混合物であって、鉄スーパーオキシドジスムターゼの第1のアイソフォームは、分子量28000〜36000Daを有し、鉄スーパーオキシドジスムターゼの第2のアイソフォームは、分子量75000〜85000Daを有し、前記混合物は、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞の抽出物から得ることができる、混合物。

請求項2

前記混合物1mg当たり130Uと同等又はより高い総SOD活性を有することを特徴とする、請求項1に記載のスーパーオキシドジスムターゼの混合物。

請求項3

鉄スーパーオキシドジスムターゼの第1のアイソフォームが、分子量約32200Daを有することを特徴とする、請求項1又は2に記載のスーパーオキシドジスムターゼの混合物。

請求項4

鉄スーパーオキシドジスムターゼの第2のアイソフォームが、分子量約79800Daを有することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のスーパーオキシドジスムターゼの混合物。

請求項5

鉄スーパーオキシドジスムターゼの2つのアイソフォームの累計SOD活性が、混合物の総SOD活性の20%〜26%、有利には22%〜26%であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載のスーパーオキシドジスムターゼの混合物。

請求項6

鉄スーパーオキシドジスムターゼの2つのアイソフォームの累計SOD活性が、混合物の総SOD活性の20%〜26%であり、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの活性が、混合物の総SOD活性の60%〜70%であり、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの活性が、混合物の総SOD活性の7〜12%であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載のスーパーオキシドジスムターゼの混合物。

請求項7

マンガンスーパーオキシドジスムターゼが、分子量70000〜90000Daを有し、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼが、分子量27000〜33000Daを有することを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載のスーパーオキシドジスムターゼの混合物。

請求項8

キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞を、水性媒体中で、好ましくはpH5〜9で粉砕又は押圧する工程と、その後上清回収する工程と、クロマトグラフィー、特にIMACクロマトグラフィーによって精製する工程とにより得られることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載のスーパーオキシドジスムターゼの混合物。

請求項9

活性成分として請求項1から7のいずれか一項に記載のスーパーオキシドジスムターゼの混合物及び薬学的又は化粧的に許容できる食品用賦形剤を少なくとも1つ含有する、栄養、化粧用又は医薬組成物

請求項10

ケア製品シャンプーローションゲル等外局所使用を目的とすることを特徴とする、請求項9に記載の化粧用組成物

請求項11

局所、経口、経鼻又は非経口経路による投与を目的とし、例えば錠剤硬カプセル剤軟カプセル剤発泡錠希釈用サッシュ若しくはスティックシロップエリキシルハーブティーチューインガムスプレーエアロゾル又は注射用溶液の形態であることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。

請求項12

別の活性成分、有利には別の抗酸化物を含有することを特徴とする、請求項9又は11に記載の医薬組成物。

請求項13

医薬品として使用するための、請求項9、11又は12のいずれか一項に記載の医薬組成物。

請求項14

医薬品が、酸化的ストレスに関連する疾患及び/若しくは炎症を治療若しくは予防する、並びに/又は他の医薬分子、特に利用される他の抗酸化物の作用を増強する、又は動物における希少疾患を治療することを目的とすることを特徴とする、請求項13に記載の使用のための医薬組成物。

請求項15

医薬品が、動物において細胞生命力刺激することを目的とすることを特徴とする、請求項14に記載の、使用のための医薬組成物。

請求項16

動物がヒトであることを特徴とする、請求項14又は15に記載の使用のための医薬組成物。

請求項17

医薬品が、特にヒトにおける心臓血管疾患肥満動脈硬化及び口唇ヘルペスの治療を目的とすることを特徴とする、請求項13に記載の使用のための医薬組成物。

請求項18

経口経路による投与を目的とし、例えば錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、発泡錠、希釈用のサッシュ若しくはスティック、チューインガム、飲料、ジュースヨーグルト菓子類ビスケット又はバーの形態であることを特徴とする、請求項9に記載の栄養組成物

技術分野

0001

本発明は、キューカミス・メロ(Cucumis melo)、特にMA7950と呼ばれる雑種第一代メロン品種から、又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞から抽出されるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の混合物;その調製方法活性成分として同じものを含有する化粧用、栄養、獣医用又は医薬組成物、及び化粧用ケア製品栄養補助食品、飲料又は医薬品としてそれを使用するための前記組成物に関する。

背景技術

0002

酸素は、身体機能に必須である、しかし身体に対し負の作用を有する有毒反応性酸化形態を生成する。これらの反応性酸化形態は、ほとんどの場合、スーパーオキシドラジカル(O2.-)、ヒドロキシラジカル(HO.)、一酸化窒素(.NO)、又は脂質起源過酸化物ラジカル(L-OO.)等のフリーラジカルである。スーパーオキシドイオンは、活性酸素種の中では最も豊富であり、酸素から直接形成され;他の全ての活性酸素種は、それ、特に最も強力なヒドロキシラジカル(HO.)から生じる。

0003

これらのフリーラジカルは、原子又は分子であり、その電子配置は、不対電子の存在により特徴づけられる。この特殊性は、そのラジカル不安定化し、それ自身を安定化するために核酸(DNA)、酵素タンパク質又は膜脂質、特に高度不飽和脂肪酸(PUFA)等他の生体分子を迅速に酸化する場合がある。

0004

身体は、細胞を破壊する活性酸素種の形成に逆らって常に作用する。全ての細胞は、細胞解毒のための構成的防衛線を有する。

0005

第1の防衛線は、金属酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)と呼ばれる酵素により確実にされる(Mac Cord及びFridovich、J. Biol. Chem. 244: 6049〜55頁、1969)。植物界には3つの形態のSODがあり(Michalski、J. Chromatogr. B 684: 59〜75頁、1996)、それぞれが、その活性部位に配置されている金属イオンの存在によって特徴づけられ:
- SODの1つの形態は、銅及び亜鉛を含有し(Cu/Zn-SOD)、主に細胞質及び葉緑体に位置し;
- 別の形態は、マンガンを含有し(Mn-SOD)、ミトコンドリア及びペルオキシソームに位置し;
- 最後に、いくつかの植物種において、SODは鉄を含有し(Fe-SOD)、葉緑体に位置する。

0006

SODは、スーパーオキシドイオンを排除できるので、それらはフリーラジカルとの戦いに重要な役割を果たす。スーパーオキシドジスムターゼは、以下の反応:
2O2.-+2H2O→O2+H2O2+2OH-(式1)
のようにスーパーオキシドイオンの不均化反応誘導することができる酵素である。

0007

SODの作用は、H2O2を排除する第2の防衛線:過酸化水素H2O2の破壊を確実にするカタラーゼ及び/又はセレン依存的グルタチオンペルオキシダーゼ(SeGPx)により完了する。

0008

正常な生物学的条件下で、人体は少量のフリーラジカルを常に産生しており、そのラジカルは、既存の防御系により直ちに中和される。いくつかの場合において、フリーラジカルの産生が増加する(タバコストレス汚染太陽光線、偏食等)場合、及び/又は抗酸化物質欠乏する場合、これは、高分子(DNA、タンパク質、糖、炭水化物の酸化)においてだけでなく細胞小器官、特に低下した場合にフリーラジカルの大きな供給源になる、細胞のためのエネルギーの主要な運搬装置であるミトコンドリアにおける、大きな細胞変化を誘導する酸化/抗酸化不均衡をもたらす。この不均衡は、多数の病変及び多数の不均衡と次第に近い相関を有する。SODは、全ての活性酸素種、それゆえ酸化的ストレスの原因であるスーパーオキシドアニオンを中和することにより、酸化的ストレスの調節に重要な役割を果たし、外来性SODの投与が、酸化的ストレスに関連する病変の治療に意図される。

0009

現在まで、利用可能な唯一の精製SODは動物界から得られており、特にウシ赤血球(Markovitz、J. Biol. Chem.、234、40頁、1959)、大腸菌(Escherichia Coli)(Keele及びFridovitch、J. Biol.、245、6176頁、1970)、及び海洋細菌株(仏国特許第2225443号及び第2240277号)から抽出されている。

0010

SOD、主にウシCu-Zn-SOD形態は、Orgotein(登録商標)という名の医薬品に至る医薬開発の対象であった。それは、フリーラジカルにより誘導される病変、特にクローン病(Emeritら、1991、Free Rad. Res. Comms、12〜13、563〜569頁)、又は放射線療法に誘導される線維症(Delanianら、1994、Radiotherapy and Oncology、32、12〜20頁)の治療において等慢性炎症の場合に使用されてきた。

0011

しかし、そのような材料に含有される可能性がある感染性物質に主に関連する理由のため、これらの動物性SODは、少なくともフランスにおいては1990年代にすぐに禁止された。この理由により、植物界から得られるSOD供給源の探索が、医薬分野において増加する関心の中心であった。

0012

従って植物起源、特にメロンのSODを含む別の組成物が提案された。Milindらによる論文(International Research Journal of Pharmacy、2011、8、52〜57頁)、Voudoukis及びLacanらによる論文(Journal of Ethnopharmacology 2004、94、67〜75頁)、又はGeneらによる論文(Journal of Agricultural and Food Chemistry、2008、56、3694〜3698頁)に例示されるように、メロンに基づく栄養補助食品の使用から得られる利益は、周知である。

0013

加えて、メロンは、他の果物と比較して特に高いSOD含有量を一般に有する。従ってメロンからのSOD抽出収量は高く、経済的に有益である。SODの存在による効果を観察するのに十分に高い含有量がある他の果物由来抽出物がまだ市販されていないことにも注目すべきである。

0014

経口経路による投与を目的としたSOD含有組成物胃液に対して保護するために小麦グリアジン基質コーティングした植物起源、特にメロン由来のSODの製剤について、例えば、仏国特許出願第2729296号、又は製品GLISODIN(登録商標)に記述されている。

0015

また、仏国特許第2716884号は、キューカミス・メロ、好ましくは可溶性タンパク質の30単位/mgでより高いスーパーオキシドジスムターゼ酵素作用を有する品種95LS444のタンパク質抽出物、その調製の方法及び外部局所用としての医薬又は化粧用組成物におけるその使用について記述している。しかしながら、前記タンパク質抽出物は、十分に精製されておらず、十分な活性もないので、スーパーオキシドジスムターゼが豊富であるにもかかわらず、特に多くの医薬適用に使用することができない。95LS444品種のキューカミス・メロのタンパク質抽出物が、スーパーオキシドジスムターゼ酵素活性126U/mgタンパク質を有することが、実施例1に示される。Lacanら(Planta 1998、204、377〜382頁)において、クリッパーメロン(キューカミス・メロ95LS444品種の子孫)から得られる前記抽出物も、同じ全体SOD含有量で記述されている。この論文が、Fe-SODの単一のアイソフォームについて記述していることに注目されたい。

0016

従って、酸化的ストレスに関連する疾患及びその転帰、特に心臓血管疾患及び肥満並びにその転帰と闘うために、医薬活性を改善した植物起源のSODの混合物を得る必要性がある。

0017

驚くべきことに、本出願者は、先行技術にあるSOD混合物より高い抗酸化特性を有する植物起源のSODの混合物を見出した。特に、本発明のSOD混合物は、キューカミス・メロの95LS444品種又はクリッパーメロン等その子孫のうち1つのタンパク質抽出物から得られるSOD混合物より活性がある。

0018

しかしながらこの解釈に限定されることなく、現在まで記述されてこなかった前記混合物中の鉄スーパーオキシドジスムターゼの特定のアイソフォームの存在は、本発明の混合物に一層大きな医薬特性を与え得ると思われる。

0019

仏国特許第2225443号
仏国特許第2240277号
仏国特許出願第2729296号
仏国特許第2716884号
仏国特許第2822381号
WO2006/030111

先行技術

0020

Mac Cord及びFridovich、J. Biol. Chem. 244: 6049〜55頁、1969
Michalski、J. Chromatogr. B 684: 59〜75頁、1996
Markovitz、J. Biol. Chem.、234、40頁、1959
Keele及びFridovitch、J. Biol.、245、6176頁、1970
Emeritら、1991、Free Rad. Res. Comms、12〜13、563〜569頁
Delanianら1994、Radiotherapy and Oncology、32、12〜20頁
Milindら、International Research Journal of Pharmacy、2011、8、52〜57頁
Voudoukis及びLacanら、Journal of Ethnopharmacology 2004、94、67〜75頁
Geneら、Journal of Agricultural and Food Chemistry、2008、56、3694〜3698頁
Beauchamp及びFridovich、Anal. Biochem. 44 :276〜82頁 (1971)
Oberley及びSpitz、Boca RatonCRCPress; In R.A. Grenwald 1985、編: Handbook of Methodsfor oxygen radical research、217〜230頁
Paul及びVan Alstyne、J Exp. Mar. Biol. Ecol. 160: 191〜203頁 1992
Smith及びWaterman (1981)、Ad. App. Math. 2:482頁
Neddleman及びWunsch (1970)、J. Mol. Biol. 48:443頁
Pearson及びLipman (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444頁
Tatusovaら、「Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」、FEMS Microbiol. Lett.、1999、174:247〜250頁
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Chenら、Am. J. Renal. Physiol. 289 F 749〜53頁 2005

発明が解決しようとする課題

0021

従って、本発明は第1に、3つのスーパーオキシドジスムターゼから本質的になる植物起源のスーパーオキシドジスムターゼの混合物に関する。

0022

本発明のSODの混合物は、心脈管系、特に心臓肥大に対して驚くべき特性及び有益な効果を有する。本発明のSODの混合物は、NPPA又はRXFP1遺伝子等、心臓病変及び肥満と関わるいくつかの遺伝子の発現を驚くべきことにモジュレートする。

0023

本発明は、特定の対象の抗酸化活性を有する植物起源の鉄SOD(Fe-SOD)のアイソフォームにも関する。

0024

本発明は、3つのスーパーオキシドジスムターゼから本質的になる植物起源のスーパーオキシドジスムターゼの前記混合物を調製する方法にも関する。

0025

本発明は、特定の対象の抗酸化活性を有する植物起源の鉄SOD(Fe-SOD)の前記アイソフォームを調製する方法にも関する。

0026

本発明は、活性成分として本発明の精製されたスーパーオキシドジスムターゼの混合物又は本発明による植物起源の鉄SOD(Fe-SOD)のアイソフォーム及び薬学的若しくは化粧的に許容できる食品用賦形剤を少なくとも1つ含有する、化粧用、栄養、獣医用若しくは医薬組成物にも関する。

0027

本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物にも関する。

課題を解決するための手段

0028

従って、本発明は第1に、3つのスーパーオキシドジスムターゼ:マンガンスーパーオキシドジスムターゼ、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ、並びに少なくとも2つのアイソフォームの鉄スーパーオキシドジスムターゼから本質的になる植物起源のスーパーオキシドジスムターゼの最初の混合物であって、鉄スーパーオキシドジスムターゼの第1のアイソフォームは、分子量28000〜36000Daを有し、鉄スーパーオキシドジスムターゼの第2のアイソフォームは、分子量75000〜85000Daを有し、前記混合物は、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞の抽出物から得ることができる、並びに混合物1mg当たり130Uと同等又はより高い総SOD活性を好ましくは有する前記混合物に関する。

0029

好ましくは、前記混合物は、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞の抽出物から得ることができ、より好ましくは、前記混合物は、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種の抽出物から得ることができる。MA7950細胞系、又はMA7950から得られるハイブリッド品種の1つから伝わるキューカミス・メロが、他の果物との比較及び他のメロン品種との比較の両方で特に高いSOD含有量を有することは注目される。従って、これら特定のキューカミス・メロからのSOD抽出収量は特に高く、経済的に有益である。

0030

本発明の意味において「から本質的になる」は、混合物が、70〜99.9%、有利には80〜99.9重量%のスーパーオキシドジスムターゼを含むことを意味する。混合物の他の構成要素は、その酵素活性に最小限の影響を有する。好ましくは、他の構成要素は、スーパーオキシドジスムターゼ酵素活性と干渉しない。

0031

好ましくは、本発明の混合物は、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種、又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞から抽出される。より好ましくは、本発明の混合物は、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞から抽出される。

0032

それらについて一般的な知見を有する当業技術者は、本発明の混合物のSODのペプチド配列を得ることができ、次いで周知の技術を使用して対応するメッセンジャーRNA(mRNA)及び相補的DNA(cDNA)を生成できることに注目されたい。後者は、周知の技術を使用して、本発明のSOD混合物を産生するために後に使用する原核又は真核細胞に導入することができる。

0033

「in vitroで培養したキューカミス・メロMA7950細胞」は、本発明の意味において植物から直接得られ、当業者に周知の技術を使用してin vitroで培養した細胞、特に幹細胞とこれら第1の細胞から得られる細胞の両方の細胞を含む。

0034

種子が、ブダペスト条約に準拠して2013年7月8日に番号NCIMB 42154でNCIMBコレクション(National Collection of Industrial and Marine Bacteria-ABERDEEN AB21 9YA[スコトランド、GB] Ferguson Building Craibstone Estate Bucksburn)に寄託されている、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種は、その外見、そのストレス耐性及びSOD組成物に関して固有の特性を有する。このSOD混合物は、他の植物供給源、特に他のメロンの品種から得られるSODの他の混合物より強い抗酸化特性を有する。

0035

本発明の意味において「抽出物」は、タンパク質抽出物、好ましくは可溶性タンパク質抽出物を意味する。

0036

本発明の意味において「SOD」は、スーパーオキシドジスムターゼ型の酵素を意味する。本発明のスーパーオキシドジスムターゼは、天然である、即ち化学修飾されていないことに注目すべきである。特に、本発明はSOD全体に関し、その断片には関しない。SODは、活性部位に含有される金属に従って、3つの区分:マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Mn-SOD)、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn-SOD)並びに鉄スーパーオキシドジスムターゼ(Fe-SOD)に分類される。

0037

本発明の混合物において、Fe-SODの少なくとも2つのアイソフォームがある。タンパク質のアイソフォームは、異なる遺伝子から、又は選択的スプライシングにより同じ遺伝子から得られる場合、仮定される形態と異なる。これ以後、Fe-SODのこれら2つのアイソフォームを、その分子量に応じて「第1のアイソフォーム」及び「第2のアイソフォーム」と呼ぶこととする。従って、本発明の「第1のアイソフォーム」は、「第2のアイソフォーム」より低い分子量を有する。

0038

他のSOD(Mn-SOD及び/又はCu/Zn-SOD)も、いくつかのアイソフォームの混合物で含有され得ることに注目すべきである。従って、本発明によれば、用語Mn-SOD(それぞれCu/Zn-SOD)は、混合物に含有されるMn-SOD(それぞれCu/Zn-SOD)の全てのアイソフォームを網羅する。

0039

SODは、反応:
2O2.-+2H2O→O2+H2O2+2OH-(式1)
のようにスーパーオキシドイオンの不均化反応を触媒する。

0040

本発明の混合物は、その総SOD活性により特徴づけられる。本発明の意味において「総SOD活性」は、本発明の混合物による式1に記述される不同変化反応の定量化を意味する。この総SOD活性は、当業者に周知の技術を使用して測定され、タンパク質のmg当たりのU(酵素単位又は単位)で表される。好ましくは、それはテトラゾリウム塩還元に基づく方法を使用して測定される。特に、SODによるニトロブルーテトラゾリウム(N5514 Sigma-Aldrich社、フランス)の還元の阻害に基づき、1985年にOberley及びSpitz (Boca RatonCRCPress; In R.A. Grenwald 1985、編: Handbook of Methodsfor oxygen radical research、217〜230頁)により修正された、Beauchamp及びFridovichの方法(Anal. Biochem. 44 :276〜82頁(1971))を引用することができる。またテトラゾリウム塩の還元に基づくSODアッセイキット(19160、Sigma-Aldrich社、フランス)を使用することもでき、これは、先行する方法の変形であるが、実施がより容易である。

0041

本発明のSOD混合物は、好ましくは前記混合物1mg当たり130Uより高い、より好ましくは前記混合物1mg当たり300Uより高い、最も好ましくは前記混合物1mg当たり500Uより高い総SOD活性を有する。

0042

加えて、各SOD(Mn-SOD、Cu/Zn-SOD及びFe-SOD)のSOD活性を決定することもできる。この「相対的」SOD活性は、混合物の総SOD活性に対する各SOD(又はそのアイソフォームのうち1つ)の寄与を定量化する。従ってそれは、混合物の総SOD活性のパーセンテージとして表される。各SOD(又はそのアイソフォームのうち1つ)のSOD活性は、当業技術者に周知の技術を使用して測定される。異なるSOD形態は、異なる阻害剤を使用して同定することができ:KCNは、Cu/Zn SODの活性を阻害し;H2O2は、Fe SOD及びCu/Zn SODの活性を阻害し、一方でMn SODは、H2O2及びKCNに反応しない(Paul及びVan Alstyne、J Exp. Mar. Biol. Ecol. 160: 191〜203頁 1992)。

0043

従って、最初に混合物の総SOD活性が、測定される。

0044

SODの異なる形態を決定するための当業者に周知の方法は、天然条件下におけるアクリルアミドゲルでの電気泳動による分離、その後のゲル上でのSOD活性の検出を含む。

0045

本発明のSOD混合物のサンプルは、電気泳動ゲルの異なるウェル沈澱される。非変性条件下で泳動を行う。ゲル検出工程において、ゲルは3つの部分に切断される。1つ目は総SOD活性を検出し、2つ目は2mM KCNとプレインキュベートされ、同じ条件下でSOD活性が決定され、最後に、最後は5mM H2O2とプレインキュベートされ、SOD活性が同じ条件下で決定される。異なるバンドの強度は、曲線下領域の積分により測定され、その比は、本発明の混合物中にある異なるSOD(又はそのアイソフォーム)の「相対的」SOD活性を示す。混合物中にある異なるSODの「相対的」SOD活性の決定の例は、実施例に例示されている。

0046

従って、本発明のスーパーオキシドジスムターゼの混合物は、有利には、鉄スーパーオキシドジスムターゼの2つのアイソフォームの累計SOD活性が、混合物の総SOD活性の20%〜26%、有利には22%〜26%のものである。

0047

本発明の好ましい一変形によると、精製したスーパーオキシドジスムターゼの混合物は、鉄スーパーオキシドジスムターゼの2つのアイソフォームの累計SOD活性が、混合物の総SOD活性の20%〜26%、有利には25%であり、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの活性が、混合物の総SOD活性の60%〜70%、有利には65%であり、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの活性が、混合物の総SOD活性の9〜15%、有利には7〜12%、より有利には10%のものである。

0048

SODは、全てのタンパク質の様に、2つの生化学的特性:分子量及び等電点に応じて分離することができる。

0049

SODの異なる形態の分離は、天然条件下におけるアクリルアミドゲル電気泳動、その後のゲル上でのSOD活性の検出により実行することができる。異なるSODの可視化及びSOD活性の測定は、Beauchamp及びFridovich(Anal. Biochem. 44 :276〜82頁、(1971))の方法を使用して遂行される。

0050

異なるSOD形態の分子量は、分子量マーカー(公知の分子量のタンパク質)を使用して電気泳動ゲルを換算して決定することができる。異なるSOD形態は上記のように同定され、得られたバンドの位置を分子量マーカーのそれと比較して、各SODアイソフォームの分子量が決定される。

0051

従って、好ましくは、本発明の混合物は、少なくとも2つのアイソフォーム、分子量28000〜36000Daを有する第1のアイソフォーム、及び分子量75000〜85000Daを有する第2アイソフォームに含有される鉄スーパーオキシドジスムターゼを含む。

0052

有利には、本発明のSOD混合物中の鉄スーパーオキシドジスムターゼの第1のアイソフォームは、分子量約32200Daを有する。

0053

有利には、本発明のSOD混合物中の鉄スーパーオキシドジスムターゼの第2のアイソフォームは、分子量約79800Daを有する。

0054

好ましい一実施形態において、マンガンスーパーオキシドジスムターゼは、分子量70000〜90000Daを有し、銅及び亜鉛スーパーオキシドジスムターゼは、分子量27000〜35000Daを有する。

0055

本発明の好ましい一変形によると、Cu/Zn-SODは、分子量27000〜35000Daを有し、有利には、分子量は31800Daであり;Mn-SODは、分子量70000〜90000Daを有し、有利には、分子量は80600Daである。Fe-SODの場合、第1のアイソフォームは、分子量28000〜36000Daを有し、有利には、分子量は32200Daであり、第2のFe-SODアイソフォームは、分子量75000〜85000Daを有し、有利には、分子量は79800Daである。

0056

電荷に応じたSODの分離は、等電点電気泳動法(IEF)により実行される。SODは、電場中を泳動し、pH環境により正味の電荷がもはや全く無くなったときに固定化される。異なるSOD形態の等電点(又は、pHi)は、公知の等電点マーカー(IEFマーカー3.6〜9.3、参照56733、Sigma-Aldrich社、フランス)との比較によりIEFゲル上で決定することができる。

0057

本発明の意味において、等電点又はpHiにより、この分子の正味の電荷がであるpH、換言すれば、分子が電気的に中性であるpHが意味される。

0058

好ましくは、Cu/Zn-SODは、pHi 4.3を有する。

0059

有利には、Fe-SODの2つのアイソフォーム(第1及び第2)は、pHi 4.4及び4.7をそれぞれ有する。

0060

本発明の好ましい一変形によると、Cu/Zn-SODは、pHi 4.3を有し、Fe-SODは、pHi 4.4及び4.7を有し、Mn-SODの異なるアイソフォームは、pHi値4.1;4.4;5.3;5.5;5.7;5.85;6.1を有する。

0061

更に、本発明は、発明のスーパーオキシドジスムターゼの混合物を調製する方法に関する。前記方法は、連続した工程:
-キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞を、水性媒体中で、好ましくはpH5〜9で粉砕又は押圧する工程と、
-上清回収する工程と、
-クロマトグラフィー、特にIMACクロマトグラフィー(固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)により精製する工程と
を含む。

0062

従って、好ましくは精製される本発明のスーパーオキシドジスムターゼの混合物は、連続した工程:
-キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞を、水性媒体中で、好ましくはpH5〜9で粉砕又は押圧する工程と、
-上清を回収する工程と、
-クロマトグラフィー、特にIMACクロマトグラフィー(固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)により精製する工程と
を含む方法により得ることができる。

0063

固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)は、金属に対するいくつかのアミノ酸、特にヒスチジントリプトファン及びシステインの親和性に基づく。従って、このクロマトグラフィー技術は、金属イオンに親和性を有するタンパク質を、コバルトニッケル、銅等の固定化された金属イオンを含有するカラム上に保持できるようにすることにより作動する。一般に使用される溶離液は、pH勾配、又はカラムのイオンへの結合に対する競合分子イミダゾール等の濃度勾配を有する。好ましくは、IMACクロマトグラフィーは、固定化金属イオンとして銅イオンを含むカラムを使用して適用される。従って、タンパク質の溶離速度は、その電荷及び金属イオン、特に銅に対するその親和性によって決まり、このためタンパク質配列中のトリプトファン、ヒスチジン、システイン等のアミノ酸の存在と相関する。有利には、溶離液として、NH4Cl及びCuSO4水溶液の勾配が使用される。

0064

別法として、本発明の方法は、連続した工程:
-キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによる細胞を、水性媒体中で、好ましくはpH5〜9で粉砕又は押圧する工程と、
-上清を回収する工程と、
- 特に上清を様々な多孔性の膜に通すことによる連続した膜精製の工程と
を含む。

0065

当業技術者は、メロンの成熟度及び乾燥物質含有量に応じて、特に膜の目詰まりを防止しようとすることにより、方法に対して膜の多孔性勾配適応することができる。

0066

前述の通り、現在まで記述されてこなかった鉄スーパーオキシドジスムターゼの第2のアイソフォームの存在は、本発明の混合物に一層高生物学的特性を与え得ると思われる。

0067

キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種の抽出物から得ることができる鉄スーパーオキシドジスムターゼのこの第2のアイソフォームは、分子量75000〜85000Daを有する。

0068

従って、より一般には、本発明は、(合成又は天然の)スーパーオキシドジスムターゼSODiに関し、そのポリペプチド配列は、第2のアイソフォームの配列と相同であり、特に第2のアイソフォームの配列と同等か又は80%、好ましくは85%、90%、95%若しくは98%を超える配列同一性を有する。

0069

第2のアイソフォームの相同なポリペプチド配列は、第2のアイソフォームの生物活性を有することを条件として、突然変異、挿入、欠失又は1つ若しくは複数のアミノ酸の置換により第2のアイソフォームの配列と異なる任意のポリペプチド配列を含む。

0070

本発明の意味において、アミノ酸の2つの配列間の「パーセント同一性」は、最良整列化(最適な整列化)後に得られる比較しようとする2つの配列間で同一のアミノ酸残基のパーセンテージを指定することを意味し、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、2つの配列間の差異は、その全長にわたって無作為分布する。アミノ酸の2つの配列間の配列比較は、その最適な整列化後にこれらの配列を比較することにより従来通りに実行され、前記比較は、区域毎又は「比較ウインドウ」毎に遂行することができる。比較のための配列の最適な整列は、手作業以外にも、Smith及びWaterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482頁]の局所相同性アルゴリズムを使用する、Neddleman及びWunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443頁]の局所的相同性アルゴリズムを使用する、Pearson及びLipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444頁]の類似性探索方法を使用する、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIのGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)を適用するコンピューターソフトウェアを使用する、又はBLASTN若しくはBLASTP比ソフトウェアを使用することにより得ることができる。

0071

アミノ酸の2つの配列間のパーセント同一性は、最適に整列されたこれら2つの配列を比較することにより決定され、比較しようとするアミノ酸の配列は、これら2つの配列間の最適な整列化のための参照配列と比較して付加又は欠失を含むことができる。アミノ酸残基が2つの配列間で同一である同一位置の数を決定し、比較ウインドウ内の位置の総数で同一位置の数を割り、得られた結果に100を掛けてこれら2つの配列間のパーセント同一性を得ることによりパーセント同一性は算出される。

0072

例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用可能なBLASTプログラム「BLAST 2 sequences」(Tatusovaら、「Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」、FEMS Microbiol. Lett.、1999、174:247〜250頁)を使用することができ、使用されるパラメーターは、初期設定で与えられるものであり(特に「ギャップ開始ペナルティ」:5、及び「ギャップ伸長ペナルティ」:2パラメーター;選択される行列は、例えばプログラムにおいて提案される「BLOSUM 62」行列である)、比較しようとする2つの配列間のパーセント同一性は、プログラムにより直接算出される。

0073

本発明の意味において「アミノ酸」は、D又はL型の天然のα-アミノ酸(例えば、アラニン(Ala)、アルギニン(Arg)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)、システイン(Cys)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リジン(Lys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン(Pro)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)及びバリン(Val))の全ての残基、並びに非天然のアミノ酸(例えばβ-アラニンアリルグリシン、tert-ロイシン、3-アミノアジピン酸、2-アミノ安息香酸、3-アミノ安息香酸、4-アミノ安息香酸、2-アミノブタン酸、4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン、1-アミノ-1-シクロブタンカルボン酸、4-アミノシクロヘキサン酢酸、1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸、(1R,2R)-2-アミノシクロヘキサンカルボン酸、(1R,2S)-2-アミノシクロヘキサンカルボン酸、(1S,2R)-2-アミノシクロヘキサンカルボン酸、(1S,2S)-2-アミノシクロヘキサンカルボン酸、3-アミノシクロヘキサンカルボン酸、4-アミノシクロヘキサンカルボン酸、(1R,2R)-2-アミノシクロペンタンカルボン酸、(1R,2S)-2-アミノシクロペンタンカルボン酸、1-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸、1-アミノ-1-シクロプロパンカルボン酸、4-(2-アミノエトキシ)安息香酸、3-アミノメチル安息香酸、4-アミノメチル安息香酸、2-アミノブタン酸、4-アミノブタン酸6-アミノヘキサン酸、1-アミノインダン-1-カルボン酸、4-アミノメチル-フェニル酢酸、4-アミノフェニル酢酸、3-アミノ-2-ナフトエ酸、4-アミノフェニルブタン酸、4-アミノ5-(3-インドリル)-ペンタン酸、(4R,5S)-4-アミノ-5-メチルヘプタン酸、(R)-4-アミノ-5-メチルヘキサン酸、(R)-4-アミノ-6-メチルチオヘキサン酸、(S)-4-アミノ-ペンタン酸、(R)-4-アミノ-5-フェニルペンタン酸、4-アミノフェニルプロピオン酸、(R)-4-アミノピメリン酸、(4R,5R)-4-アミノ-5-ヒドロキシヘキサン酸、(R)-4-アミノ5-ヒドロキシペンタン酸、(R)-4-アミノ5-(p-ヒドロキシフェニル)-ペンタン酸、8-アミノオクタン酸、(2S,4R)-4-アミノ-ピロリジン-2-カルボン酸、(2S,4S)-4-アミノ-ピロリジン-2-カルボン酸、アゼチジン-2-カルボン酸、(2S,4R)-4-ベンジル-ピロリジン-2-カルボン酸、(S)-4,8-ジアミノオクタン酸、tert-ブチルグリシン酸、γ-カルボキシグルタミン酸、β-シクロヘキシルアラニン、シトルリン、2,3-ジアミノプロピオン酸馬尿酸ホモシクロヘキシルアラニン、モロイシン(moleucine)、ホモフェニルアラニン、4-ヒドロキシプロリンインドリン-2-カルボン酸、イソニペコチン酸、α-メチル-アラニン、ニペコ酸ノルロイシンノルバリンオクタハイドロインドール-2-カルボン酸、オルニチンペニシラミンフェニルグリシン、4-フェニル-ピロリジン-2-カルボン酸、ピペコール酸プロパルギルグリシン、3-ピリジニルアラニン、4-ピリジニルアラニン、1-ピロリジン-3-カルボン酸、サルコシンスタチンテトラヒドロイソキノリン-1-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、トラネキサム酸)を意味する。本用語は、従来のアミノ保護基(例えばアセチル、tert-ブチルオキシカルボニルベンジルオキシカルボニル又は9-フルオレニルメチルカルボニル基)を保有する天然及び非天然のアミノ酸、並びにカルボキシル末端で保護されている(有利には、C1〜C18アルキル基エステル、フェニル又はベンジルアミド若しくはアミドによる、これらは以下の式:-CO[C1〜C18アルキル]、-COO[C1〜C18アルキル]、-CONHフェニル、CONHベンジル又はCONH2のカルボキシル末端をそれぞれ与える)天然及び非天然のアミノ酸も含む。

0074

参照アミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有するアミノ酸配列により、参照配列と比較していくつかの修飾、特に少なくとも1アミノ酸の欠失、付加若しくは置換、短縮又は伸長を有するその配列に優先傾向が与えられる。1つ若しくは複数の連続又は非連続アミノ酸の置換の場合、優先傾向は、置換されたアミノ酸が「同等の」アミノ酸により置き換えられている置換に与えられる。本明細書において表現「同等のアミノ酸」は、基本構造のアミノ酸のうち1つと置換され得るが、対応する抗体の生物活性を本質的に修飾することがない任意のアミノ酸を指定し、これ以後、特に実施例において定義されるものである。

0075

これら同等のアミノ酸は、例えば置換するアミノ酸が有する構造的相同性を参照することにより決定することができる。

0076

ポリペプチド配列中にある類似性のこの探索は、非荷電側鎖を持つアミノ酸(例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシン)、塩基性側鎖を持つアミノ酸(例えばリジン、アルギニン及びヒスチジン)、酸性側鎖を持つアミノ酸(例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸);極性側鎖を持つアミノ酸(例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステイン)の置換等、同じ分類内のアミノ酸の置換である保存的置換を考慮する。

0077

好ましくは、「異なる」、「相同な」又は「得られる」スーパーオキシドジスムターゼは、参照配列と同じ長さを有する。従って、有利には、本発明SODiのスーパーオキシドジスムターゼの配列は、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種の抽出物から得ることができ、分子量75000〜85000Daを有する鉄スーパーオキシドジスムターゼの第2のアイソフォームの配列からなる。

0078

特に有利な様式において、本発明は、キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種の抽出物から得ることができ、分子量75000〜85000Daを有する鉄スーパーオキシドジスムターゼの第2のアイソフォームに関する。それは、連続した工程:
- キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種又はin vitroで培養したその細胞又は原核若しくは真核細胞にこれらSODの遺伝子を導入し発現させることによるその細胞を、水性媒体中で、pH5〜9で粉砕又は押圧する工程と、
-上清を回収する工程と、
-クロマトグラフィー、特にIMACクロマトグラフィーにより精製する工程と
を含む方法により得ることができる。

0079

本発明は、前記スーパーオキシドジスムターゼSODiを含む任意の混合物にも関する。

0080

本発明は、活性成分として、スーパーオキシドジスムターゼSODi又は本発明のスーパーオキシドジスムターゼの混合物及び食品用又は薬学的若しくは化粧的に許容できる賦形剤を少なくとも1つ含有する、化粧用、栄養、獣医用又は医薬組成物にも関する。

0081

本発明の意味において、用語「医薬組成物」は、医薬又は獣医用使用の両方の組成物を網羅し、即ち、ヒトを含めた動物を治療するために使用されるものとする。

0082

本発明の意味において「動物」は、例えば哺乳動物魚類甲殻類爬虫類鳥類を意味する。特に、哺乳動物はヒトを含む。

0083

本発明の意味において、用語「栄養組成物」は、機能性食品組成物(特に、例えば固形又は液体形態の栄養補助食品)、健康食品組成物及び抗酸化特性を有する飲料等特に食事又は栄養的性質の飲料、を特に包含する。好ましくは、栄養組成物は、機能性食品組成物及び抗酸化特性を有する飲料等の健康飲料を含む。

0084

本説明において、食品用又は薬学的若しくは化粧的に許容できる賦形剤により、栄養、医薬又は化粧用組成物に含まれる化合物若しくは化合物の組み合わせが意味され、その化合物は二次反応を引き起こさず、例えば活性化合物の容易な投与、体内でのその有効期間及び/若しくは有効性の増加、溶液中での溶解性の増加又は貯蔵寿命の改善を可能にする。これらの許容できる賦形剤は周知であり、当業技術者により選択された活性化合物の投与の型及び機序適合され得る。

0085

有利には、本発明の栄養、化粧用又は医薬組成物は、組成物の総重量と比較して0.01〜10重量%のスーパーオキシドジスムターゼ含有量、例えばスーパーオキシドジスムターゼ0.01〜5重量%、又は0.01〜1重量%を有する。

0086

一実施形態において、本発明の化粧用組成物は、ケア製品、シャンプーローション、ゲル等外局所使用を目的とする。

0087

本発明の組成物が栄養使用を目的とする場合、有利には経口経路による投与を目的とする。例えば、本発明の栄養組成物は、錠剤硬カプセル剤軟カプセル剤発泡錠希釈用サッシュ若しくはスティックチューインガム、飲料、ジュースヨーグルト菓子類ビスケット又はバーの形態である。

0088

本発明の組成物が医薬使用を目的とする場合、局所、経口、経鼻又は非経口経路による投与を目的とする。例えば、本発明の医薬組成物は、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、発泡錠、希釈用のサッシュ若しくはスティック、シロップエリキシルハーブティー、チューインガム、スプレーエアロゾル又は注射用溶液の形態である。

0089

好ましい一実施形態において、本発明の医薬組成物は、経口経路による投与を目的とする。

0090

経口経路の場合、本発明の組成物は、当業技術者に周知の被覆剤、特に植物脂性物質の被覆剤(仏国特許第2822381号を参照のこと)により又は加工澱粉粒子(国際出願WO2006/030111を参照のこと)内で、胃液に対して効率的に保護され得る。

0091

従って、本発明の組成物は、経口経路によって効率的に送達され、酸化的ストレスが存在するあらゆる器官において内在性のスーパーオキシドジスムターゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼの合成の増加を誘導することができ、それにより酸化的ストレスに関連する病変と効果的且つ恒常的な闘いができる。

0092

特定の一実施形態において、本発明の医薬、化粧用、獣医用又は栄養組成物は、別の活性成分、有利には別の抗酸化物を含有する。

0093

本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物にも関する。

0094

SODi又は本発明のSOD混合物の投与は、SOD及び第2の防衛線における酵素:グルタチオンペルオキシダーゼの内在性の細胞合成を誘導する。これにより、細胞及び身体は、効率的及び持続的に酸化的ストレスと闘うことが可能になる。

0095

従って本医薬品は、酸化的ストレスに関連する疾患及び/若しくは炎症を治療若しくは予防する、並びに/又は動物に使用される他の抗酸化物の作用を増強することを好ましくは目的とする。医薬品は、動物細胞生命力刺激することを目的とすることもできる。

0096

一実施形態において、医薬品として使用するための本発明の組成物は、別の医薬品と併せて投与される。好ましくは、この医薬品も、酸化的ストレスに関連する疾患及び/若しくは炎症を治療若しくは予防する、並びに/又は他の医薬分子、特に動物に使用される他の抗酸化物の作用を増強することを目的とする。この医薬品は、希少疾患を治療することを目的とすることもできる。

0097

本発明の一実施形態において、動物は、家畜動物ペット又は実験動物の群の中から選択され、有利にはブタ、ウシ、ウマ科ヒツジヤギ動物、シカ科家禽ウサギ水産養殖動物、、甲殻類、有利にはエビ及びカニ、爬虫類、有利にはカメ及びワニトリネコ、齧歯動物、有利にはマウスラット及びモルモット並びにイヌ科よって形成される群の中から、有利には反芻動物及び単胃動物の中から選択される。

0098

そのような動物において、酸化的ストレス関連疾患及び/又は炎症は、変形性関節炎腱炎蹄葉炎自己免疫疾患乳中の細胞の存在に至る乳腺炎等の慢性炎症、動物の繁殖における胎児死亡率温度変化、食事、育種密度生息環境競合中、激しい及び/又は延長された運動下、例えば作業、歩行若しくは走行予防接種集約飼養又は出産授乳離乳等の移行期間中水槽交換養殖の開始、例えば養殖場抱卵領域への配置、稚魚放流泌乳輸送、計量により引き起こされるストレス作用、動物の生殖障害、例えば小胞及び/若しくは卵子の不十分な成熟、動物の特異的及び非特異的免疫障害、特に微生物ウイルス寄生虫攻撃、並びに/又は疾患に対する身体の抵抗性欠如及び酸化的過負荷の中から好ましくは選択される。

0099

本発明の別の実施形態において、動物はヒトである。この場合、酸化的ストレスに関連する疾患及び/又は炎症は、アレルギー、例えば湿疹白斑狼瘡UV照射に関連する障害、放射線照射により誘発される機能不全、特に様々な起源の線維症及び膀胱炎不妊性呼吸病変、特に喘息貧血関節リウマチ及び変形性関節炎病変、特に若しくは変形性指関節炎、尿生殖器障害、特にペイロニー病虚血-再灌流に関連する問題、神経系病変、特に低酸素症、心臓血管疾患、特に高血圧、肥満、II型糖尿病癌治療、特に結腸直腸癌若しくは黒色腫結腸直腸炎症、特にクローン病、神経変性病変、特にアルツハイマー若しくはパーキンソン病、若しくは筋萎縮性側索硬化症潰瘍性大腸炎視覚障害、例えばARMD、ミトコンドリア機能不全感染因子による変性、特にAIDS及びC型肝炎、又は薬物の使用若しくは毒性のある化学製品、例えば農薬への曝露に関連する変性、により形成される群の中から有利には選択される。記載は、希少疾患、嚢胞性線維症フリードライヒ運動失調症及び脱毛で行うこともできる。生殖能力の改善を挙げることもでき、幹細胞の改善された生命力は、細胞療法、特に炎症性関節疾患骨髄疾患及びアルツハイマー病等の神経変性疾患におけるより優れた使用及び有効性を可能にする。

0100

最後に、本発明の混合物は、その特に有利な抗酸化作用のため、ミオパチーの治療にも有用である(ミオパチーと酸化的ストレスを関連付ける参照については、以下を参照のこと:「Functional muscle impairment in fascioscapulohumeral muscular dystrophy is correlated with oxidative stress and mitochondrial dysfunction.」Turkiら、2012、Free Radical Biology and Medicine: 1:53 (5) 1068〜1079頁)。

0101

加えて、前述の通り、好ましい本発明のSOD混合物は、動物、特にヒトにおいて遺伝子NPPA及びRXFP1の発現をモジュレートする。

0102

NPPA遺伝子は、細胞外液体積及び電解質のホメオスタシスに関係するナトリウム利尿ペプチドファミリーに属するタンパク質をコードする。ヒトNPPA遺伝子は、151アミノ酸(AA)のプレプロホルモンをコードする。25AAのN末端シグナル配列の切断後に、得られたプロホルモン(プロANP)は、126AAを有し、心房分泌顆粒貯蔵される。分泌される際に、プロANPは活性ANP(心房性ナトリウム利尿ペプチド)に変換される(1)。

0103

ANPの分泌は、機械的刺激に依存的であり;その刺激は、心房壁緊張の変動によるANPを調節する血液量の変動であり、そのため、ANPの作用によって血圧の低下が促進される。従って、ANPは抗肥大作用を有する。肥大又は心不全の場合、プロANP及びANPは心室筋に分泌され、心臓疾患の場合には血漿中で増加する(1)。

0104

ANPは、自律神経系に作用することにより、交感神経活性を阻害し、副交感神経活性を活性化し、心臓イオンチャンネルの特異的調節を引き起こすことにより心臓電気生理の調節で役割を果たす(2)。NPPA遺伝子は、心臓疾患の場合に刺激されるので(3)、心臓血管疾患の進行の選択的調節のための治療標的を形成する(1)。NPPA遺伝子と関わる疾患は、急性心筋梗塞僧帽弁の疾患、心不全、高血圧、体液過負荷又は心肥大である。この遺伝子の突然変異は、心房細動に関わる(2)。心臓におけるより高いNPPA発現は、高血圧及び心不全の病態生理学に関係する(3)。

0105

RXFP1受容体、別名LGR7(ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体7)は、インスリンスーパーファミリーに属する757アミノ酸のポリペプチドである。その受容体は、高い親和性でリラキシンに結合する膜貫通型受容体である。その受容体は、Gタンパク質と結合し、7つの膜貫通ドメインを有する。加えて、その細胞外ドメインは10個の「ロイシンリッチリピート」(LRR)を有し、末端アミンとしてクラスAリポタンパク質:LDLa(低密度リポタンパク質a)からなる。そのリポタンパク質は、受容体の成熟、細胞表面におけるその位置決め及びリラキシン[L]の信号伝達に影響を与える。この受容体は、従って細胞内信号伝達及びシグナル伝達根本である。リラキシン受容体は、リラキシンの作用が証明されている生殖組織、脳、腎臓、心臓、に見られる(4)。心臓において、RXFP1受容体は、心室よりも心房に第1に見られる。しかしながら、RXFP1のmRNAの発現が、ラット、マウス及びヒトの心室においても起こることは確定されている。心房における高密度のRXFP1は、リラキシンの変力性及び変時性応答と関連がある。

0106

RXFP1受容体の活性化及びシグナルの伝達に加えて、リラキシンは、異なる効果を有することになる。リラキシンの機能は、生殖系に限定されず、このペプチドは、心機能に影響を及ぼし、とりわけ血圧、血流水分平衡の調節に関与する(5)。リラキシンは、抗線維化、抗肥大性抗炎症性及び血管拡張効果を有する。それは、動脈圧を減少させ、心拍数を増加させ、心筋再生を刺激することもできる(4)(5)。

0107

RXFP1mRNAのレベルは、MIラット(心筋梗塞)の心房及び左心室において減少する(4)。

0108

従って、本発明のSOD混合物は、特にヒトにおける心臓血管疾患、特に急性心筋梗塞、僧帽弁の疾患、心不全、高血圧、体液過負荷、心臓肥大、高血圧及び心不全の治療に有利に使用される。

0109

本発明のSOD混合物は、肥満及び動脈硬化の治療にも有利に使用される。

0110

更に、本発明のSOD混合物が、特にヒトにおけるヘルペス、特に口唇ヘルペスの治療に有用であることが確認された。

0111

本発明は、栄養、食品又は化粧用組成物としてそれを使用するための本発明の組成物にも関する。この場合において、組成物は、酸化的ストレスの毎日の効果:疲労、ストレス、不安、関節問題、スポーツ後の回復男性又は女性生殖能力問題、勃起視覚問題、治癒蜂巣炎、UV照射、ざ瘡等と闘うことを目的とする。

図面の簡単な説明

0112

MA7950メロンの雑種第一代品種から得られる異なるSODの決定を示す図である(アクリルアミドゲル上での検出後に得られた結果の略図)。総SOD活性(ウェル1)、2mM KCN(ウェル2)、H2O2 (ウェル3)。
MA7950メロンの雑種第一代品種から得られる異なるSODの電気泳動的プロファイルを示す図である(IEFゲル上での検出後に得られた結果の略図);左から右に: MA7950メロン(ウェル1及び2)、スイカ(ウェル3及び4)、(ウェル5及び6)及びネクタリン(ウェル7及び8)。
MA7950メロンの雑種第一代品種から得られる異なるSODの電気泳動的なプロファイルを示す図である(IEFゲル上での検出後に得られた結果の略図);左から右に: MA7950メロン(ウェル1及び2)、カナリアメロン(ウェル3及び4)、アンズ(ウェル5及び6)及びサクランボ(ウェル7及び8)。
採集直後(t0)の2個のメロンの写真である。左、一般的な雑種第一代メロン、右、MA7950と呼ばれる雑種第一代メロンから得られたメロン。
7日後に撮った同じ2個のメロンの写真である。左、一般的な型の雑種第一代メロン、右、MA7950として公知の、メロンの雑種第一代品種から得られたメロン。

0113

以下の実施例は、例示目的で挙げられるものであり、いかなる様式においても本発明を限定しない。

0114

(実施例1)
MA7950と呼ばれるメロンの雑種第一代品種の特異性
簡単な実験を遂行して、MA7950と呼ばれる雑種第一代品種から得たメロンの特定の特性、特にその抗酸化活性を実証した。

0115

一方が一般的な型、他方がMA7950と呼ばれるメロンの雑種第一代品種から得た2個のメロンを、室温で大気圧下に、室内にD1で置いた(図4)。メロンを、同じ条件(室温、大気圧)下で7日間この部屋に保った(図5: D8で撮った同じメロンの写真)。7日後に、MA7950と呼ばれるメロンの雑種第一代品種から得たメロンは、依然として良好な外観だが、一般的な型の雑種第一代メロンは、分解の進んだ状態であることがはっきりと見られる。MA7950メロンの雑種第一代品種のSOD混合物の、2倍高い含有量及び組成物により、天然の分解過程に対してより効果的な抵抗性を有するメロンの細胞が提供される。

0116

(実施例2)
抽出物の調製及び異なるSODの精製、SOD活性のアッセイ
MA7950と呼ばれる雑種第一代品種のキューカミス・メロの果肉又はその細胞5gを、乳鉢で冷却破砕した。50mMリン酸緩衝液(pH: 7.8; 1mMEDTA; 5%グリセロール)を植物量の3倍と同体積添加した。均質化後に、懸濁液を4℃で、5000gで30分間遠心分離した。上清を回収し、濾過した。この粗抽出物を使用して、異なるSOD形態を精製した。異なるSODを、当業者に周知の技術:IMAC(固定化金属アフィニティークロマトグラフィー)を適用して精製した。この方法の場合、銅を、カラム上に固定化する金属イオンとして使用し;タンパク質の付着は、その電荷によって決まり、従ってトリプトファン、ヒスチジン、システイン等のアミノ酸の存在と相関する。SODは、ヒスチジン含有量が高いことが公知なので、IMACの使用が正当化される。

0117

MA7950メロンの抽出物から得たSODを、FPLC装置(Pharmacia Amersham社)により、Superose HR 10/2カラム又はHitrapキレートカラム(Pharmacia-Biotech社)で精製した。サンプル3mLを、事前にCuSO4溶液(600mL、23mmol/mL)で処理し、0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH 7.8)10mLで平衡化したカラムにスーパーループによって注入した。SODの溶離を、一定速度1mL/分で、0.75M NH4Cl溶液の10%直線勾配(10分間で到達する)で遂行した。残りのCu-タンパク質複合体を、1MEDTA水溶液5mLで除去した。異なるSODを含有する画分2mLを捕集し、アッセイし、0.05Mリン酸緩衝液、pH 7.8の4体積でAmicon PM 10チャンバーで直ちに脱塩し、次いで凍結乾燥した。

0118

(実施例3)
異なるSOD形態及び分子量の決定:
SOD活性を、Beauchamp及びFridovich Anal. Biochem. 44 :276〜82頁(1971)の方法に従って、天然の条件(タンパク質が直鎖化される変性条件とは対照的に、タンパク質が天然の状態のままである、即ち細胞中にあるような条件)下で、アクリルアミドゲル上で検出した。その方法は、ニトロブルーテトラゾリウム(N5514 Sigma-Aldrich社、フランス)のSODに阻害される還元に基づく。反応後に、SOD活性に対応する異なるバンドが、濃青色ゲルのバックグラウンドに対して白色に現れる。精製SODの混合物のサンプル(溶液A45μL+泳動緩衝液15μL)を、電気泳動ゲル(4%/10%アクリルアミド)の異なるウェルに沈澱させた。泳動時間は、70mA及び300Vで、75分間であった。非変性条件下で泳動させたゲルの分割工程において、ゲルを3つの部分に切断した。1つ目の活性を以下の手順に従って決定し、2つ目を、2mM KCNとプレインキュベートし、活性を決定し、最後に、3つ目を、5mM H2O2とプレインキュベートし、活性を決定した。

0119

SOD活性同定条件:
精製SODの活性を、SODアッセイキット(19160、Sigma-Aldrich社、フランス)で測定した。この総SOD活性は、タンパク質の500IU SOD/mgより高く、精製した抽出物のタンパク質含有量は、70%より高かった(Bradford method、Anal. Biochem. 72: 248〜54頁、1976)。泳動後に、ゲルを:
- 2mM NBTを含有するK+リン酸緩衝液(50mM; pH7.8)中に150分間;
- 次いで28mMTEMED及び0.0028mMリボフラビン(リボフラビンの50mg溶液は、リン酸緩衝液1mL中に調製した)を含有するK+リン酸緩衝液(50mM; pH7.8)中に15分間浸漬した。

0120

次いで、ゲルをKリン酸緩衝液(50mM; pH7.8)中でリンスした。電気泳動ゲルを、その後Perfect Image写真取り込みモジュールを使用してデジタル化し、Gel Analystモジュール(Claravision社、2000、フランス)で分析した。

0121

図1に見られるように、阻害剤の非存在下で、SOD混合物は、SOD活性の2つの太いバンド(ウェル1)を呈し、ゲルの最上部の方に位置するバンドは、高分子量のタンパク質(低分子量タンパク質より速く泳動しない)を示し、ゲルの下方にある他のバンドは、1つ又は複数の低分子量のSODによる活性を示す。

0122

2mM KCNの存在下では(ウェル2)、Cu/Zn-SODだけが阻害され、これはゲルの下部に位置するバンドに対応し、この活性バンドの最大の部分に相当する。

0123

5mM H2O2の存在下では(ウェル3)、Fe-SOD及びCu/Zn-SODが、阻害される。ゲル上に唯一残っているバンド(最上部)は、Mn-SOD(KCN及びH2O2に無反応)に対応する。Mn-SODは、ゲルの最上部に位置するSOD活性バンドの部分に相当し、他の部分は、H2O2により阻害されるFe-SODである。Fe-SODの他の形態は、ゲルの下部でCu/Zn-SODの近くに位置する。

0124

SOD活性の異なるバンドの強度を、Gel Analystモジュール(Claravision社、2000、フランス)を使用して積分し、こうして各SODアイソフォームの比を算出した:

0125

0126

0127

Mn-SOD(バンド3)の場合、バンドの強度は、総強度(阻害剤のないSOD)619684に対して62124であり、従ってMn-SODは、総SOD活性の10%に相当する。Cu/Zn-SODの場合、バンドの強度は、(442524〜43594)/619684であり、総活性の65%に対応する。最後に、Fe-SODは25%に対応し、一方のアイソフォームは7%(Mn-SODの近く)、他方は18%(Cu/Zn-SODの近く)に相当する。

0128

キューカミス・メロMA7950メロンの雑種第一代品種から抽出したSOD混合物に対して実行した上の解析を、同じ条件下で異なる果物:アナスタメロン(Anasta melon)、スペインメロン(Canari)、クリッパーメロン(キューカミス・メロ95LS444の雑種第一代品種の子孫)、スイカ、桃、ネクタリン、サクランボから得られた他のSODに対して実施した(図2及び図3)。

0129

図2及び図3に見られるように、異なる型の果物から得られたSOD活性の電気泳動プロファイルは、キューカミス・メロであるメロンMA7950の雑種第一代品種から抽出した精製SODの混合物のそれと大きく異なる(左端)。

0130

阻害剤(2mM KCN及び5mM H2O2)の使用後の各形態のパーセンテージを、Table 1(表3)に表す。

0131

0132

これらの同じ電気泳動ゲルにおいて、分子量マーカー(公知の分子量のタンパク質)を、マーカーキット(M3913、Sigma-Aldrich社、フランス)を使用してゲルの第1のウェルに入れて、分子量に対してゲルを換算し、比較により異なるSODの分子量を決定した。

0133

同じ分析を、他の果物由来の精製SODの混合物、3つの形態のSODを含有する果物のみ:スイカ、スペインメロン(Canari)、他のメロン品種(Anasta)に対して実行した。

0134

異なるSODの分子量を、Table 2(表4)に表す。

0135

0136

特にFe-SODの第2のアイソフォームが存在するという理由で、キューカミス・メロMB17415の雑種第一代品種から抽出した精製SODの混合物が、(異なる果物から得られる他のSODと比較して)固有であることは、容易に分かる。その混合物は、3つの分類のSOD(その金属群によって区別される)及び4つのアイソフォーム:
・Cu/Zn-SODは、総SOD活性の65%に相当し、分子量31800Daを有する。
・Mn-SODは、総SOD活性の10%に相当し、分子量80600Daを有する。
・Fe-SODの異なる2つの形態は、総活性の25%に相当し:32200Daの一方のFe-SODは、総SOD活性の18%に相当する。79800Daの他方のFe-SODは、総SOD活性の7%に相当する。
を含有する。

0137

異なるSODの等電点の決定
この分析技術は、メロンから精製したSODのアイソフォームのpHiについて追加の情報を得るための対象のものである。従って、それは活性技術である。電荷に応じたSODの分離は、等電点電気泳動法(IEF)により得られる。SODは、電場中を泳動し、pH環境がそれらの正味の電荷を失わせるときに固定化される。異なるSOD形態の等電点は、公知の等電点のマーカー(IEFマーカー3.6〜9.3、参照56733、Sigma-Aldrich社、フランス)との比較によりIEFゲル上で決定することができる。

0138

ゲル(30%アクリルアミド/ビスアクリルアミド、50%グリセロール、アンフォラインpH 3.5〜10 Amersham社、過硫酸アンモニウム、及びTEMED)に沈澱させたサンプルを、サンプル緩衝液(グリセロール:75%体積/体積、アンフォライン:2%体積/体積)及び泳動緩衝液(陰極用25mM NaOH及び陽極用25mM CH3COOH)中を300V及び20mAで泳動させる。等電点マーカーも、ゲルウェルに沈澱させる。SOD活性のバンドの検出は、第2節に記載の通り得られる。pHiマーカーのバンドとの比較により、異なるアイソフォームのpHi値を決定する。アナスタメロンの場合、Fe-SODの割合が低い(2.5%)ため、異なるpHi値の同定ができない。3つの品種(MA7950;スイカ、カナリアメロン)の異なるSOD形態の等電点を、Table 3(表5)に表す。

0139

0140

キューカミス・メロMA7950の雑種第一代品種から抽出し、その金属群、分子量及びpHiにより特徴づけられる精製SODの混合物は、固有であり;その混合物は:
・Cu/Zn-SODは、総SOD活性の65%に相当し、分子量31800Da及びpHi 4.3を有し;
・Mn-SODは、総SOD活性の10%に相当し、分子量80600Daを有し、異なるpHi値4〜6の7つのアイソフォームを有し;
・Fe-SODの異なる2つの形態は、総活性の25%に相当し:32200Daの一方のFe-SODは、総SOD活性の18%に相当する。79800Daの他方のFe-SODは、総SOD活性の7%に相当する。それらは、pHi 4.4及び4.7を有する。
を含有することは注目される。

0141

本発明の混合物1mg中に、Cu/Zn SOD約0.71mg、Mn-SOD約0.06mg及びFe-SOD約0.23mgが存在する。

0142

(実施例4)
酸化的ストレスのマーカー:NADPHオキシダーゼにより産生されるスーパーオキシド陰イオン(O2°-)及び炎症マーカー:TNF-αに対する本発明の精製SODの混合物の有効性
マクロファージにおいて、インターフェロンγ又はLPS等の分子の使用は、酸化的バースト(NADPHオキシダーゼの刺激によるスーパーオキシドラジカルの過剰産生)及び炎症応答(TNF-α及びインターロイキンの産生の増加)を誘導する。

0143

その効果を、マウスRAW 264.7マクロファージの細胞系において、スーパーオキシドラジカル(O2.-)の産生及び炎症性サイトカイン(TNF-α)の産生について本発明の精製SODの混合物の異なる用量で評価した。

0144

細胞を、T175 cm2培養皿(Dutscher社、Brumath、フランス)中のウシ胎仔血清(10%、Life Technologies社)、ペニシリンストレプトマイシン抗生物質溶液(1%、Life Technologies社)及びフンギゾン(0.25%、Life Technologies社)を添加したRPMI培地(ロズウェルパーク記念研究所培地)中で、5% CO2に高めた湿った空気中で、37℃で培養した。細胞を計数し、トーマカバーグラスを使用して3日毎に継代し、次いで250000個細胞/mLの濃度で培養皿に分配した。その後細胞を、本発明の精製SODの混合物(0〜100IU SOD/mL)と12時間インキュベートした。その後、それを支持体から分離し、RPMI中に106個細胞/mLの濃度で懸濁した。この懸濁液890μLを、1mMルシゲニン100μLの存在下に入れ、37℃で30分間インキュベートした。この30分後、測定時に、10-7M PMA(ホルボール-12-ミリスチル-13-酢酸塩、Sigma Chemical社; St louis Mo; USA)10μLを添加して、スーパーオキシドラジカルの産生を測定した。TNF-αの産生を刺激するために、この測定の12時間前にリポ多糖(LPS)をウェルに添加した。

0145

O2°-の産生を、スーパーオキシド陰イオンに特異的な生物発光プローブであるルシゲニンの存在下(10μM)で化学発光技術(Chenら、Am. J. Renal. Physiol. 289 F 749〜53頁 2005)を使用して、測定した。簡潔には、O2°-の存在下で、ルシゲニンは、基本状態から励起状態に変化する。基本状態に戻る際に、ルシゲニンは光子放射する。放射される光子の数は、O2°-の形成に比例している。発光の強度は、発光マイクロプレートリーダー(Synergy 2、Biotek社、USA)により記録される。結果は、タンパク質のhit/mgで表される。

0146

マクロファージにおけるTNF-αの産生を、DY510分析キット(R&D system社、Mineapolis、USA)を用いてELISAにより測定する。結果は、3つの独立した複製の平均である。

0147

Table 4(表6)及びTable 5(表7)に見られるように、MA7950系から得られるSODの混合物は、NADPHオキシダーゼによるスーパーオキシド陰イオンの産生及びTNF-αの産生を阻害することによってマウスマクロファージの系の酸化的及び炎症応答をモジュレートする。

0148

0149

0150

(実施例5)
抗酸化酵素の内在性の合成に対する本発明の精製SODの混合物の有効性
本発明の精製SODの混合物を、経口経路で使用できるように、国際出願WO2006/030111に記述される方法に従って封入した。

0151

3週齢の雄のウィスターラット(Janvier社、Le Genest-St-Isle、フランス、で繁殖された)10匹を使用した。到着したら、それらを無作為に群に分け、温度23±1℃、70%湿度測定及び12時間の光周期(12時間明/12時間暗)の制御環境下で、プラスチックケージ内飼育した。ラットをNIH(米国学術研究会議)ガイドラインに従って扱った。

0152

動物には、飼料及び水を自由に摂取させた。摂食量を毎日測定し、動物の体重を一日おきに記録した。

0153

動物を、5匹ずつ2群に分けた。

0154

一方の群は、標準的な食事(EF R/M対照E 15000-00、SSNIFF社、ドイツ)を受けた。他方の群には、標準的な食事(EF R/M対照E 15000-00、SSNIFF社、ドイツ)及び1日当たり本発明の混合物の4IU SOD(又はU/mg SOD)の用量を28日間与えた。

0155

28日間の実験期間の終了時に、動物をペントバルビタール腹腔内注射麻酔した。肝臓に、0.15M NaClを注入し、次いでサンプル採取し、-80℃で貯蔵した。

0156

SOD及びGPx抗酸化酵素の発現を、ウェスタンブロットによって決定した。

0157

結果をTable 4(表6)に示す。図に示すように、ウィスターラットにおいて酸化的ストレスの非存在下で、MA7950メロンから得たSODの混合物の摂取は、抗酸化酵素SOD及びGPxの発現を誘導する。

0158

0159

酸化的ストレスの状態では、抗酸化タンパク質のこの貯蔵物を活性化し、使用することができ、それにより酸化的ストレスに対してより良く細胞応答できるようになる。

0160

(実施例6)
NPPA及びRXFP1遺伝子の発現に対する本発明のSOD混合物の効果
心肥大に関係する遺伝子に対する本発明の精製SODの混合物の効果を、自然発症高血圧ラット(SHR)のモデルで評価した。これらの自然発症高血圧ラットは、遺伝的な交雑育種由来する心肥大を有し、従って「使用できる状態」であるという長所を有する受容に使用することができる。

0161

本発明の精製SODの異なる混合物を、経口経路で使用できるように、国際出願WO2006/030111に記述される方法に従って封入した。

0162

3週齢の雄のSHRラット(Janvier社、Le Genest-St-Isle、フランス、で繁殖された) 40匹を使用した。到着したら、それらを無作為に群に分け、温度23±1℃、70%湿度測定及び12時間の光周期(12時間明/12時間暗)の制御環境下で、プラスチックケージ内で飼育した。ラットをNIH(米国学術研究会議)ガイドラインに従って扱った。

0163

動物には、飼料及び水を自由に摂取させた。摂食量を毎日測定し、動物の体重を一日おきに記録した。

0164

動物を、10匹ずつ4群(群1、2、3及び4)に分けた。

0165

群1は、標準的な食事(EF R/M対照E 15000-00、SSNIFF社、ドイツ)を受けた。

0166

群2には、標準的な食事(EF R/M対照E 15000-00、SSNIFF、ドイツ)及び1日当たり本発明のMA7950メロンから得られるSOD混合物の4IU SOD(又はU/mg SOD)の用量を4日間与えた。

0167

群3及び群4には、標準的な食事(EF R/M対照E 15000-00、SSNIFF、ドイツ)を4日間並びに1日当たりカナリアメロン(群3)又はアナスタメロン(群4)から得られるSOD混合物の4IU SOD(又はU/mg SOD)の用量を与えた。

0168

4実験日後に、動物をペントバルビタールの腹腔内注射で麻酔した。心臓を採取し、ANP及びRXFP1のアッセイを、左心室(LV)に対するウェスタンブロットにより実施した。

0169

LVからのタンパク質抽出は、150mM NaCl、1mM 1%EDTA、20% Triton、0.1% SDS、及びプロテアーゼインヒビターの1%混合物を含有する20mMトリス緩衝液(pH 6.8)を用いて上で遂行した。遠心分離(1500rpm、4℃で15分間)後に、上清を捕集し、組織タンパク質をSDS PAGEにより分離した。当量のタンパク質を、4%アクリルアミドの濃縮ゲルと共に10又は15%アクリルアミドゲルに沈澱させた。泳動を、Sigma-Aldrich社(Saint Quentin Fallavier、フランス)製トリス-グリシン-SDS緩衝液中で行った。分離後に、タンパク質をニトロセルロース膜(Whatman社、Dassel、ドイツ)に転写した。

0170

定量化は、1つの同じ並び内のGAPDHと比較して対象とする各バンドの密度を表すことにより膜内標準化した後に遂行した。結果を、プラセボ群と比較した変化として表す。プラセボ群と比較して** p<0.01。

0171

結果を以下のTable 7(表9)に示す。

0172

0173

上のTable 7(表9)に見られるように、MA7950メロンから得られるSODの混合物(本発明のSOD混合物)の摂取は、ANP及びRXFP1タンパク質の発現の変調を単独でもたらし、そのNPPA及びRXFP1遺伝子は心臓血管病変、特に心肥大及び肥満に関係する。上で説明した通り、この変調は、心臓血管疾患(ANP濃度の減少及びRXFP1濃度の増加)の場合に有益である。

0174

実施例

0175

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