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図面 (16)

課題・解決手段

本発明は、トランスサイレチンTTR)に特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、TTR蓄積またはTTR沈着物の蓄積と関連する疾患または障害(例えば、TTRアミロイドーシス)を治療または予防するために使用できる。この抗体はまた、諸用途のなかでもとりわけ、TTRアミロイドーシスを診断するためおよびTTRの凝集阻害または軽減するために使用できる。

概要

背景

疾患特異的タンパク質フォールディングおよび凝集の異常が原因であると考えられている疾患がいくつかある。このようなタンパク質は、アミロイドとして知られる病理診断的な蓄積物として蓄積することがあり、特定の組織学的染色によって可視化される。アミロイドは、炎症性応答を誘発すると考えられており、関係のある組織に複数の負の結果をもたらす。さらに、フォールディングが異常なタンパク質の小さい凝集体が存在し細胞毒性効果をもたらすこともある。

トランスサイレチンTTR)は、ミスフォールドして凝集する(例えば、アミロイドを形成する)ことが知られている多数のタンパク質の1つである。トランスサイレチン関連アミロイドーシスには、変異TTRまたはバリアントTTRのミスフォールディングによって生じる家族性疾患、および野生型TTRの不適切な凝集を原因とする孤発性遺伝性疾患の2つの形態の疾患が含まれる。TTRアミロイド形成過程で、神経系および/または心臓ならびにそれ以外の組織に病態が生じることがある。

概要

本発明は、トランスサイレチン(TTR)に特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、TTR蓄積またはTTR沈着物の蓄積と関連する疾患または障害(例えば、TTRアミロイドーシス)を治療または予防するために使用できる。この抗体はまた、諸用途のなかでもとりわけ、TTRアミロイドーシスを診断するためおよびTTRの凝集を阻害または軽減するために使用できる。A.1、A.2、B

目的

本発明は、トランスサイレチンに結合し、実質的に抗体14G8に由来する3つの重鎖CDRと3つの軽鎖CDRとを含む、抗体を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

トランスサイレチンに結合しかつ実質的に抗体14G8に由来する3つの重鎖CDRと3つの軽鎖CDRとを含む、抗体。

請求項2

前記抗体14G8の3つのKabat重鎖CDRと3つのKabat軽鎖CDRとを含み、例外的にH52位およびL26位がそれぞれNまたはSであり得る、請求項1に記載の抗体。

請求項3

前記抗体14G8の3つのKabat重鎖CDRと3つのKabat軽鎖CDRとを含む、請求項1または2に記載の抗体。

請求項4

CDR−H1が、前記抗体14G8のKabat−ChothiaCDR複合体である、請求項1、2または3に記載の抗体。

請求項5

抗体9D5の3つのKabat重鎖CDRを含む、請求項1または2に記載の抗体。

請求項6

CDR−H1が、前記抗体9D5のKabat−ChothiaCDR複合体である、請求項1、2または5に記載の抗体。

請求項7

9D5または14G8と同じトランスサイレチン上のエピトープに結合しかつ3つの軽鎖CDRと3つの重鎖CDRとを含み、(a)各CDRが、9D5の重鎖可変領域および軽鎖可変領域由来の対応するCDRに少なくとも90%の配列同一性を有するか、または(b)各CDRが、14G8の重鎖可変領域および軽鎖可変領域由来の対応するCDRに少なくとも90%の配列同一性を有し、例外的にL26位がNまたはSであり得る、請求項1に記載の抗体。

請求項8

(a)前記9D5の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDR;または(b)例外的にL26位がNもしくはSであり得る、前記14G8の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRを含む、請求項7に記載の抗体。

請求項9

(a)前記9D5の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRが、それぞれ配列番号13〜15および配列番号24〜26であり、かつ(b)前記14G8の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRが、それぞれ配列番号67〜69および配列番号77〜79であり、例外的にL26位がNまたはSであり得る、請求項7または8に記載の抗体。

請求項10

モノクローナル抗体である、請求項1〜9のいずれかに記載の抗体。

請求項11

キメラ抗体ヒト化抗体ベニヤ化(veneered)抗体、またはヒト抗体である、請求項1〜10のいずれかに記載の抗体。

請求項12

ヒトIgGアイソタイプを有する、請求項1〜11のいずれかに記載の抗体。

請求項13

ヒトIgG2アイソタイプまたはヒトIgG4アイソタイプを有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体。

請求項14

トランスサイレチンに特異的に結合するマウス抗体のヒト化抗体またはキメラ抗体である請求項1に記載の抗体であって、前記マウス抗体が、配列番号61の成熟重鎖可変領域および配列番号70の成熟軽鎖可変領域を特徴とし、例外的にH52位がSまたはNであり得、H69位がFまたはIであり得、L26位がSまたはNであり得、かつL107位のRが任意選択である、抗体。

請求項15

トランスサイレチンに特異的に結合するヒト化9D5抗体、キメラ9D5抗体、ヒト化14G8抗体またはキメラ14G8抗体である請求項14に記載の抗体であって、9D5が、配列番号1の成熟重鎖可変領域および配列番号16の成熟軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体であり、かつ14G8が、配列番号61の成熟重鎖可変領域および配列番号70の成熟軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である、抗体。

請求項16

(a)前記9D5の3つの重鎖CDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域および前記9D5の3つの軽鎖CDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域;または(b)例外的にL26位がNもしくはSであり得る、前記14G8の3つの重鎖CDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域および前記14G8の3つの軽鎖CDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域を含む、請求項15に記載のヒト化抗体。

請求項17

(a)前記9D5の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRが、それぞれ配列番号13〜15および配列番号24〜26であり、かつ(b)前記14G8の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRが、それぞれ配列番号67〜69および配列番号77〜79であり、例外的にL26位がNまたはSであり得る、請求項16に記載のヒト化抗体。

請求項18

配列番号5〜12のいずれか1つに少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と配列番号19〜23のいずれか1つに少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域とを含み、例外的にH19位がRまたはKであり得、H40位がAまたはTであり得、H44位がGまたはRであり得、H49位がSまたはAであり得、H77位がSまたはTであり得、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、かつH89位がVまたはMであり得る、請求項14〜17のいずれか1項に記載のヒト化抗体。

請求項19

以下に挙げる位置の少なくとも1つが、指定のアミノ酸によって占められている、すなわち、H42位がEによって占められ、H47位がLによって占められ、H69位がFによって占められ、H82位がSによって占められ、H82b位がLによって占められ、H108位がLによって占められ、L8位がAによって占められ、L9位がPによって占められ、L18位がSによって占められ、L19位がVによって占められ、L36位がFによって占められ、L39位がRによって占められ、L60位がSによって占められ、L70位がAによって占められ、かつL74位がRによって占められている、請求項18のいずれか1項に記載のヒト化抗体。

請求項20

H47位、H69位、およびH82位が、それぞれL、F、およびSによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項21

H47位、H69位、H82位、およびH82b位が、それぞれL、F、S、およびLによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項22

H42位、H47位、およびH108位が、それぞれE、L、およびLによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項23

H69位、H82位、およびH82b位が、それぞれF、S、およびLによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項24

H47位およびH108位が、それぞれLによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項25

H82位およびH82b位が、それぞれSおよびLによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項26

H42位、H47位、およびH82b位が、それぞれE、L、およびLによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項27

L36位が、Fによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項28

L60位が、Sによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項29

L8位、L9位、L19位、L36位、L39位、L60位、L70位、およびL74位が、それぞれA、P、V、F、R、S、A、およびRによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項30

L8位、L9位、L18位、L19位、L36位、L39位、L60位、L70位、およびL74位が、それぞれA、P、S、V、F、R、S、A、およびRによって占められている、請求項19に記載のヒト化抗体。

請求項31

配列番号5〜12のいずれか1つに少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号19〜23のいずれか1つに少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含み、例外的にH19位がRまたはKであり得、H40位がAまたはTであり得、H44位がGまたはRであり得、H49位がSまたはAであり得、H77位がSまたはTであり得、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、かつH89位がVまたはMであり得る、請求項18に記載のヒト化抗体。

請求項32

配列番号5〜12のいずれか1つに少なくとも98%同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号19〜23のいずれか1つに少なくとも98%同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含み、例外的にH19位がRまたはKであり得、H40位がAまたはTであり得、H44位がGまたはRであり得、H49位がSまたはAであり得、H77位がSまたはTであり得、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、かつH89位がVまたはMであり得る、請求項31に記載のヒト化抗体。

請求項33

前記成熟重鎖可変領域が、配列番号5〜12のいずれか1つのアミノ酸配列を有し、かつ前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号19〜23のいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項32に記載のヒト化抗体。

請求項34

前記成熟重鎖可変領域が、配列番号11のアミノ酸配列を有し、かつ前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号19のアミノ酸配列を有する、請求項33に記載のヒト化抗体。

請求項35

配列番号64〜66のいずれか1つに少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と配列番号74〜76のいずれか1つに少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域とを含み、例外的にH82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、H89位がVまたはMであり得、かつL18位がSまたはPであり得る、請求項14〜17のいずれか1項に記載のヒト化抗体。

請求項36

以下に挙げる位置の少なくとも1つが、指定のアミノ酸によって占められている、すなわち、H1位がEによって占められ、H47位がLによって占められ、かつL36位がFによって占められている、請求項35に記載のヒト化抗体。

請求項37

H1位およびH47位が、それぞれEおよびLによって占められている、請求項36に記載のヒト化抗体。

請求項38

L36位が、Fによって占められている、請求項36に記載のヒト化抗体。

請求項39

以下に挙げる位置の少なくとも1つが、指定のアミノ酸によって占められている、すなわち、H3位がKによって占められ、H105位がTによって占められ、L8位がAによって占められ、L9位がPによって占められ、L19位がVによって占められ、L26位がSによって占められ、L60位がSによって占められ、かつL70位がAによって占められている、請求項35〜38のいずれか1項に記載のヒト化抗体。

請求項40

H3位およびH105位が、それぞれKおよびTによって占められている、請求項39に記載のヒト化抗体。

請求項41

L8位、L9位、L19位、およびL70位が、それぞれA、P、V、およびAによって占められている、請求項39に記載のヒト化抗体。

請求項42

L26位およびL60位が、それぞれSによって占められている、請求項39に記載のヒト化抗体。

請求項43

配列番号64〜66のいずれか1つに少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号74〜76のいずれか1つに少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含み、例外的にH82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、H89位がVまたはMであり得、かつL18位がSまたはPであり得る、請求項35に記載のヒト化抗体。

請求項44

配列番号64〜66のいずれか1つに少なくとも98%同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号74〜76のいずれか1つに少なくとも98%同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含み、例外的にH82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、H89位がVまたはMであり得、かつL18位がSまたはPであり得る、請求項43に記載のヒト化抗体。

請求項45

前記成熟重鎖可変領域が、配列番号64〜66のいずれか1つのアミノ酸配列を有し、かつ前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号74〜76のいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項44に記載のヒト化抗体。

請求項46

前記成熟重鎖可変領域が、配列番号65のアミノ酸配列を有し、かつ前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号76のアミノ酸配列を有する、請求項45に記載のヒト化抗体。

請求項47

インタクト抗体である、請求項1〜46のいずれか1項に記載の抗体。

請求項48

結合フラグメントである、請求項1〜46のいずれか1項に記載の抗体。

請求項49

前記結合フラグメントが、一本鎖抗体フラグメントFabフラグメント、またはFab’2フラグメントである、請求項48に記載の抗体。

請求項50

前記成熟軽鎖可変領域が、軽鎖定常領域に融合され、かつ前記成熟重鎖可変領域が、重鎖定常領域に融合される、請求項14〜47のいずれか1項に記載のヒト化抗体。

請求項51

前記重鎖定常領域が、天然ヒト重鎖定常領域に比してFcγ受容体への低下した結合を有する前記天然ヒト重鎖定常領域の変異体である、請求項50に記載のヒト化抗体。

請求項52

前記重鎖定常領域が、IgG1アイソタイプのものである、請求項50または51に記載のヒト化抗体。

請求項53

前記成熟重鎖可変領域が、配列番号103の配列を有する重鎖定常領域に融合され、かつ/または前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号104もしくは105の配列を有する軽鎖定常領域に融合される、請求項50に記載のヒト化抗体。

請求項54

請求項14〜53のいずれか1項に記載のヒト化抗体であって、(a)それぞれ配列番号1および16由来の前記成熟重鎖可変領域および前記成熟軽鎖可変領域中のCDRにおけるいずれの差異も、H60位〜H65位にあるか、(b)それぞれ配列番号61および70由来の前記成熟重鎖可変領域および前記成熟軽鎖可変領域中のCDRにおけるいずれの差異も、H60位〜H65位にあり、例外的にL26位がNまたはSであり得る、ヒト化抗抗体

請求項55

請求項1〜54のいずれかに記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物

請求項56

請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸

請求項57

配列番号40、42、44〜56、87、89、91〜96、および106〜108のいずれか1つを含む配列を有する、請求項56に記載の核酸。

請求項58

請求項56または57に記載の核酸を含む組換え発現ベクター

請求項59

請求項58に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞

請求項60

抗体をヒト化する方法であって、(a)1つまたは複数のアクセプター抗体を選択することと、(b)保持されるべきマウス抗体のアミノ酸残基を特定することと、(c)前記マウス抗体の重鎖のCDRを含むヒト化重鎖をコードする核酸および前記マウス抗体の軽鎖のCDRを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成することと、(d)前記核酸を宿主細胞内で発現させてヒト化抗体を作製することとを含み、前記マウス抗体が、9D5または14G8であり、9D5が、配列番号1の成熟重鎖可変領域および配列番号16の成熟軽鎖可変領域を特徴とし、かつ14G8が、配列番号61の成熟重鎖可変領域および配列番号70の成熟軽鎖可変領域を特徴とする、方法。

請求項61

ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化(veneered)抗体を作製する方法であって、(a)細胞が抗体を分泌するように、前記抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸で形質転換された細胞を培養することと、(b)細胞培地から前記抗体を精製することとを含み、前記抗体が、ヒト化型、キメラ型、またはベニヤ化(veneered)型の9D5または14G8である、方法。

請求項62

ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化(veneered)抗体を産生する細胞系を作製する方法であって、(a)細胞内に抗体の重鎖および軽鎖と選択マーカーとをコードするベクターを導入することと、(b)前記ベクターの増加したコピー数を有する細胞を選択する条件下で前記細胞を増殖させることと、(c)前記選択された細胞から単一の細胞を単離することと、(d)抗体の産生量に基づいて選択された単一の細胞からクローン化された細胞をバンク化することとを含み、前記抗体が、ヒト化型、キメラ型、またはベニヤ化(veneered)型の9D5または14G8である、方法。

請求項63

前記細胞を選択的条件下で増殖させることと24時間で細胞106個当たり少なくとも100mg/Lを天然に発現し分泌する細胞系をスクリーニングすることとをさらに含む、請求項62に記載の方法。

請求項64

トランスサイレチン介在性アミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中でトランスサイレチンの凝集阻害または軽減する方法であって、前記対象に請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体の有効なレジメンを実施し、それにより前記対象中でトランスサイレチンの凝集を阻害または軽減することを含む、方法。

請求項65

トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中でトランスサイレチン原線維形成を阻害または軽減する方法であって、前記対象に請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体の有効なレジメンを実施し、それにより前記対象中でトランスサイレチン蓄積を阻害または軽減することを含む、方法。

請求項66

トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中でトランスサイレチン沈着物を減少させる方法であって、前記対象に請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体の有効なレジメンを実施し、それにより前記対象中でトランスサイレチン沈着物を減少させることを含む、方法。

請求項67

トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中で凝集トランスサイレチンを除去する方法であって、前記対象に請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体の有効なレジメンを実施し、それにより前記抗体を受けていないトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象に比して前記対象から凝集トランスサイレチンを除去することを含む、方法。

請求項68

トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中でトランスサイレチンの非毒性立体構造を安定化させる方法であって、前記対象に請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体の有効なレジメンを実施し、それにより前記対象中でトランスサイレチンの非毒性立体構造を安定化させることを含む、方法。

請求項69

対象中でトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを治療または予防する方法であって、前記対象に請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体の有効なレジメンを実施することを含む、方法。

請求項70

対象中でトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスの発症を遅らせる方法であって、前記対象に請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体の有効なレジメンを実施することを含む、方法。

請求項71

対象中でトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを診断する方法であって、前記対象由来生体試料を有効量の請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体と接触させることを含む、方法。

請求項72

トランスサイレチンへの抗体の結合を検出することをさらに含み、結合した抗体の存在が、前記対象がトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有することを示す、請求項71に記載の方法。

請求項73

前記生体試料への前記抗体の結合を対照試料への前記抗体の結合と比較することをさらに含み、前記対照試料に比して前記生体試料への前記抗体の増大した結合が、前記対象がトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有することを示す、請求項71または72に記載の方法。

請求項74

前記生体試料と前記対照試料が、同じ組織起源の細胞を含む、請求項73に記載の方法。

請求項75

前記生体試料および/または前記対照試料が、血液、血清血漿、または固形組織である、請求項71〜74のいずれか1項に記載の方法。

請求項76

前記固形組織が、心臓末梢神経系、自律神経系腎臓眼球、または消化管由来である、請求項75に記載の方法。

請求項77

前記トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスが、家族性トランスサイレチンアミロイドーシスまたは孤発性トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項64〜76のいずれか1項に記載の方法。

請求項78

前記家族性トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイド心筋症FAC)、家族性アミロイドニューロパチー(FAP)、または中枢神経選択性アミロイドーシス(CNSA)である、請求項77に記載の方法。

請求項79

前記孤発性トランスサイレチンアミロイドーシスが、老人性全身性アミロイドーシスSSA)または老人性心アミロイドーシス(SCA)である、請求項77に記載の方法。

請求項80

前記トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスが、前記対象の心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管へのアミロイド蓄積と関連する、請求項64〜76のいずれか1項に記載の方法。

請求項81

対象中のトランスサイレチン沈着物の有無を検出する方法であって、前記アミロイド蓄積を有することが疑われる前記対象由来の生体試料を有効量の請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体と接触させることを含む、方法。

請求項82

トランスサイレチンへの抗体の結合を検出することをさらに含み、結合した抗体の検出が、トランスサイレチン沈着物の存在を示す、請求項81に記載の方法。

請求項83

前記生体試料への前記抗体の結合を対照試料への前記抗体の結合と比較することをさらに含み、前記対照試料に比して前記生体試料への前記抗体の増大した結合が、前記対象がトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有することを示す、請求項81または82に記載の方法。

請求項84

前記生体試料と前記対照試料が、同じ組織起源の細胞を含む、請求項83に記載の方法。

請求項85

前記生体試料および/または前記対照試料が、血液、血清、血漿、または固形組織である、請求項80〜84のいずれか1項に記載の方法。

請求項86

前記固形組織が、心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管由来である、請求項85に記載の方法。

請求項87

対象中のトランスサイレチン沈着物のレベルを決定する方法であって、請求項1〜54のいずれか1項に記載の抗体を投与することと前記対象中の結合した抗体の存在を検出することとを含む、方法。

請求項88

結合した抗体の存在が、陽電子放射断層撮影法(PET)によって決定される、請求項87に記載の方法。

技術分野

0001

(関連出願の相互参照
本願は、2015年1月28日に出願された米国仮特許出願第62/109,002号および2015年12月11日に出願された米国仮特許出願第62/266,556号に関するものであり、上記出願はそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる。

0002

配列表の参照)
本願には、ファイル名473373_SEQLST.TXT、作成日2016年1月28日、容量135,083バイトの電子配列表が含まれ、この配列表は、その全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術

0003

疾患特異的タンパク質フォールディングおよび凝集の異常が原因であると考えられている疾患がいくつかある。このようなタンパク質は、アミロイドとして知られる病理診断的な蓄積物として蓄積することがあり、特定の組織学的染色によって可視化される。アミロイドは、炎症性応答を誘発すると考えられており、関係のある組織に複数の負の結果をもたらす。さらに、フォールディングが異常なタンパク質の小さい凝集体が存在し細胞毒性効果をもたらすこともある。

0004

トランスサイレチンTTR)は、ミスフォールドして凝集する(例えば、アミロイドを形成する)ことが知られている多数のタンパク質の1つである。トランスサイレチン関連アミロイドーシスには、変異TTRまたはバリアントTTRのミスフォールディングによって生じる家族性疾患、および野生型TTRの不適切な凝集を原因とする孤発性遺伝性疾患の2つの形態の疾患が含まれる。TTRアミロイド形成過程で、神経系および/または心臓ならびにそれ以外の組織に病態が生じることがある。

0005

本発明は、トランスサイレチンに結合し、実質的に抗体14G8に由来する3つの重鎖CDRと3つの軽鎖CDRとを含む、抗体を提供する。いくつかの抗体は、抗体14G8の3つのKabat重鎖CDRと3つのKabat軽鎖CDRとを含むが、ただし、H52位およびL26位はそれぞれNまたはSである。いくつかの抗体は、抗体14G8の3つのKabat重鎖CDRと3つのKabat軽鎖CDRとを含む。CDR−H1は任意選択で、抗体14G8のKabat−Chothia CDR複合体である。いくつかの抗体は、抗体9D5の3つのKabat重鎖CDRを含む。CDR−H1は任意選択で、抗体9D5のKabat−Chothia CDR複合体である。

0006

いくつかの抗体は、トランスサイレチン上の9D5または14G8と同じエピトープに結合し、3つの軽鎖CDRと3つの重鎖CDRとを含み、(a)各CDRが、9D5の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対応するCDRと少なくとも90%の配列同一性を有するか、(b)各CDRが、14G8の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対応するCDRと少なくとも90%の配列同一性を有するが、ただし、L26位がNまたはSであり得る。いくつかの抗体は、(a)9D5の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDR、または(b)14G8の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRであるが、ただし、L26位がNまたはSであり得るものを含む。いくつかの抗体では、9D5の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRは、それぞれ配列番号13〜15および24〜26である。いくつかの抗体では、14G8の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRは、それぞれ配列番号67〜69および77〜79であるが、ただし、L26位がNまたはSであり得る。

0007

上記のいずれかの抗体はモノクローナル抗体であり得る。上記のいずれかの抗体は、キメラ抗体ヒト化抗体ベニヤ化(veneered)抗体、またはヒト抗体であり得る。上記のいずれかの抗体は、ヒトIgGアイソタイプ、ヒトIgG2アイソタイプ、またはヒトIgG4アイソタイプを有し得る。

0008

本発明はさらに、トランスサイレチンに特異的に結合するマウス抗体のヒト化抗体またはキメラ抗体を提供し、ここでは、マウス抗体は配列番号61の成熟重鎖可変領域および配列番号70の成熟軽鎖可変領域を特徴とするが、ただし、H52位はSまたはNであり得、H69位はFまたはIであり得、L26位はSまたはNであり得、L107位のRは任意選択である。抗体は任意選択で、トランスサイレチンに特異的に結合するヒト化9D5抗体、キメラ9D5抗体、ヒト化14G8抗体またはキメラ14G8抗体であり、ここでは、9D5は配列番号1の成熟重鎖可変領域および配列番号16の成熟軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体であり、14G8は配列番号61の成熟重鎖可変領域および配列番号70の成熟軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である。ヒト化抗体は任意選択で、(a)9D5の3つの重鎖CDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域および9D5の3つの軽鎖CDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域、または(b)14G8の3つの重鎖CDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域および14G8の3つの軽鎖CDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域であるが、ただし、L26位がNまたはSであり得るものを含む。9D5の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRは任意選択で、それぞれ配列番号13〜15および24〜26である。14G8の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRは任意選択で、それぞれ配列番号67〜69および77〜79であるが、ただし、L26位がNまたはSであり得る。任意選択で、それぞれ配列番号1および16由来の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のCDRにおける差異はいずれも、H60位〜H65位にある。任意選択で、それぞれ配列番号61および70由来の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域におけるCDRの差異はいずれも、H60位〜H65位にあるが、ただし、L26位はNまたはSであり得る。

0009

ヒト化抗体は任意選択で、配列番号5〜12のうちのいずれか1つに少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と、配列番号19〜23のうちのいずれか1つに少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域とを含むが、ただし、H19位がRまたはKであり得、H40位がAまたはTであり得、H44位がGまたはRであり得、H49位がSまたはAであり得、H77位がSまたはTであり得、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、かつH89位がVまたはMであり得る。任意選択で、以下に挙げる位置のうち少なくとも1つが指定のアミノ酸によって占められている:H42位はEによって占められ、H47位はLによって占められ、H69位はFによって占められ、H82位はSによって占められ、H82b位はLによって占められ、H108位はLによって占められ、L8位はAによって占められ、L9位はPによって占められ、L18位はSによって占められ、L19位はVによって占められ、L36位はFによって占められ、L39位はRによって占められ、L60位はSによって占められ、L70位はAによって占められ、かつL74位はRによって占められている。任意選択で、H47位、H69位、およびH82位がそれぞれL、F、およびSによって占められている。任意選択で、H47位、H69位、H82位、およびH82b位がそれぞれL、F、S、およびLによって占められている。任意選択で、H42位、H47位、およびH108位がそれぞれE、L、およびLによって占められている。任意選択で、H69位、H82位、およびH82b位がそれぞれF、S、およびLによって占められている。任意選択で、H47位およびH108位がそれぞれLによって占められている。任意選択で、H82位およびH82b位がそれぞれSおよびLによって占められている。任意選択で、H42位、H47位、およびH82b位がそれぞれE、L、およびLによって占められている。任意選択で、L36位がFによって占められている。任意選択で、L60位がSによって占められている。任意選択で、L8位、L9位、L19位、L36位、L39位、L60位、L70位、およびL74位がそれぞれA、P、V、F、R、S、A、およびRによって占められている。任意選択で、L8位、L9位、L18位、L19位、L36位、L39位、L60位、L70位、およびL74位がそれぞれA、P、S、V、F、R、S、A、およびRによって占められている。

0010

ヒト化抗体は任意選択で、配列番号5〜12のうちのいずれか1つに少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号19〜23のうちのいずれか1つに少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含むが、ただし、H19位がRまたはKであり得、H40位がAまたはTであり得、H44位がGまたはRであり得、H49位がSまたはAであり得、H77位がSまたはTであり得、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、かつH89位がVまたはMであり得る。ヒト化抗体は任意選択で、配列番号5〜12のうちのいずれか1つに少なくとも98%同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号19〜23のうちのいずれか1つに少なくとも98%同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含むが、ただし、H19位がRまたはKであり得、H40位がAまたはTであり得、H44位がGまたはRであり得、H49位がSまたはAであり得、H77位がSまたはTであり得、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、かつH89位がVまたはMであり得る。任意選択で、成熟重鎖可変領域は配列番号5〜12のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号19〜23のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有する。いくつかの抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号11のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号19のアミノ酸配列を有する。

0011

ヒト化抗体は任意選択で、配列番号64〜66のうちのいずれか1つに少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と、配列番号74〜76のうちのいずれか1つに少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域とを含むが、ただし、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、H89位がVまたはMであり得、かつL18位がSまたはPであり得る。任意選択で、以下に挙げる位置のうち少なくとも1つが指定のアミノ酸によって占められている:H1位はEによって占められ、H47位はLによって占められ、かつL36位はFによって占められている。任意選択で、H1位およびH47がそれぞれEおよびLによって占められている。任意選択で、L36位がFによって占められている。以下に挙げる位置のうち少なくとも1つは任意選択で、指定のアミノ酸によって占められている:H3位はKによって占められ、H105位はTによって占められ、L8位はAによって占められ、L9位はPによって占められ、L19位はVによって占められ、L26位はSによって占められ、L60位はSによって占められ、かつL70位はAによって占められている。任意選択で、H3位およびH105位がそれぞれKおよびTによって占められている。任意選択で、L8位、L9位、L19位、およびL70位がそれぞれA、P、V、およびAによって占められている。任意選択で、L26位およびL60位がそれぞれSによって占められている。

0012

ヒト化抗体は任意選択で、配列番号64〜66のうちのいずれか1つに少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号74〜76のうちのいずれか1つに少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含むが、ただし、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、H89位がVまたはMであり得、かつL18位がSまたはPであり得る。ヒト化抗体は任意選択で、配列番号64〜66のうちのいずれか1つに少なくとも98%同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号74〜76のうちのいずれか1つに少なくとも98%同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含むが、ただし、H82a位がNまたはSであり得、H83位がRまたはKであり得、H84位がAまたはSであり得、H89位がVまたはMであり得、かつL18位がSまたはPであり得る。任意選択で、成熟重鎖可変領域は配列番号64〜66のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号74〜76のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有する。いくつかの抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号65のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号76のアミノ酸配列を有する。

0013

上記のいずれかの抗体は、インタクト抗体結合フラグメント一本鎖抗体フラグメントFabフラグメント、またはFab’2フラグメントであり得る。上記のいずれかの抗体では、成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合し、成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合していてよい。重鎖定常領域は任意選択で、天然ヒト重鎖定常領域に比してFcγ受容体への結合が低下した天然ヒト重鎖定常領域の変異体である。重鎖定常領域は任意選択で、IgG1アイソタイプのものである。任意選択で、成熟重鎖可変領域は配列番号103の配列を有する重鎖定常領域に融合し、かつ/または成熟軽鎖可変領域は配列番号104もしくは105の配列を有する成熟軽鎖可変領域に融合している。

0014

本発明はさらに、上記のいずれかの抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

0015

本発明はさらに、上記のいずれかの抗体の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸、例えば配列番号40、42、44〜56、87、89、91〜96、および106〜108のいずれか1つなどを提供する。

0016

本発明はさらに、上記の核酸を含む組換え発現ベクター、およびこの組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。

0017

本発明はさらに、抗体をヒト化する方法であって、(a)1つまたは複数のアクセプター抗体を選択することと、(b)保持されるべきマウス抗体のアミノ酸残基を特定することと、(c)マウス抗体重鎖のCDRを含むヒト化重鎖をコードする核酸およびマウス抗体軽鎖のCDRを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成することと、(d)核酸を宿主細胞内で発現させてヒト化抗体を作製することとを含み、マウス抗体が9D5または14G8であり、9D5が配列番号1の成熟重鎖可変領域および配列番号16の成熟軽鎖可変領域を特徴とし、14G8が配列番号61の成熟重鎖可変領域および配列番号70の成熟軽鎖可変領域を特徴とする、方法を提供する。

0018

本発明はさらに、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化(veneered)抗体を作製する方法であって、(a)細胞が抗体を分泌するように、抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸で形質転換した細胞を培養することと、(b)細胞培地から抗体を精製することとを含み、抗体がヒト化型、キメラ型、またはベニヤ化(veneered)型の9D5または14G8である、方法を提供する。

0019

本発明はさらに、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化(veneered)抗体を産生する細胞系を作製する方法であって、(a)細胞内に抗体の重鎖および軽鎖と選択マーカーとをコードするベクターを導入することと、(b)ベクターのコピー数が増加した細胞を選択する条件下で細胞を増殖させることと、(c)選択された細胞から単一の細胞を単離することと、(d)抗体の産生量に基づいて選択された単一の細胞からクローン化した細胞をバンク化することとを含み、抗体がヒト化型、キメラ型、またはベニヤ化(veneered)型の9D5または14G8である、方法を提供する。この方法は任意選択で、細胞を選択条件下で増殖させることと、24時間で細胞106個当たり少なくとも100mg/Lを天然に発現し分泌する細胞系をスクリーニングすることとをさらに含む。

0020

本発明はさらに、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中のトランスサイレチンの凝集を阻害または軽減する方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより対象中のトランスサイレチンの凝集を阻害または軽減することを含む、方法を提供する。

0021

本発明はさらに、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中のトランスサイレチン原線維形成を阻害または軽減する方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより対象中のトランスサイレチン蓄積を阻害または軽減することを含む、方法を提供する。

0022

本発明はさらに、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中のトランスサイレチン沈着物を減少させる方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより対象中のトランスサイレチン沈着物を減少させることを含む、方法を提供する。

0023

本発明はさらに、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中の凝集トランスサイレチンを除去する方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより、対象から、抗体を投与していないトランスサイレチンによるアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象に比して凝集トランスサイレチンを除去することを含む、方法を提供する。

0024

本発明はさらに、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有するかこれを発現するリスクのある対象中の非毒性立体構造のトランスサイレチンを安定化させる方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施し、それにより対象中の非毒性立体構造のトランスサイレチンを安定化させることを含む、方法を提供する。

0025

本発明はさらに、対象中のトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを治療するまたは予防する方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施することを含む、方法を提供する。

0026

本発明はさらに、対象中のトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスの発症を遅らせる方法であって、対象に上記のいずれかの抗体の有効なレジメンを実施することを含む、方法を提供する。

0027

本発明はさらに、対象中のトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを診断する方法であって、対象由来生体試料を有効量の上記のいずれかの抗体と接触させることを含む、方法を提供する。この方法は任意選択で、トランスサイレチンへの抗体の結合を検出することをさらに含み、結合した抗体の存在が対象にトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスがあることを示す。この方法は任意選択で、生体試料への抗体の結合を、対照試料への抗体の結合と比較することをさらに含み、生体試料への抗体の結合が対照試料に比して増大していることが対象にトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスがあることを示す。生体試料と対照試料は任意選択で、同じ組織起源の細胞を含む。生体試料および/または対照試料は任意選択で、血液、血清血漿、または固形組織である。固形組織は任意選択で、心臓、末梢神経系、自律神経系腎臓眼球、または消化管に由来する。

0028

上記のいずれかの方法では、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスは任意選択で、家族性トランスサイレチンアミロイドーシスまたは孤発性トランスサイレチンアミロイドーシスであり得る。家族性トランスサイレチンアミロイドーシスは任意選択で、家族性アミロイド心筋症FAC)、家族性アミロイドニューロパチー(FAP)、または中枢神経選択性アミロイドーシス(CNSA)である。孤発性トランスサイレチンアミロイドーシスは任意選択で、老人性全身性アミロイドーシスSSA)または老人性心アミロイドーシス(SCA)である。上記のいずれかの方法では、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスは任意選択で、対象の心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管でのアミロイド蓄積と関連し得る。

0029

本発明はさらに、対象中のトランスサイレチン沈着物の有無を検出する方法であって、アミロイド蓄積を有することが疑われる対象由来の生体試料を、有効量の上記のいずれかの抗体と接触させることを含む、方法を提供する。この方法は任意選択で、トランスサイレチンへの抗体の結合を検出することをさらに含み、結合した抗体の検出がトランスサイレチン沈着物の存在を示す。この方法は任意選択で、生体試料への抗体の結合を、対照試料への抗体の結合と比較することをさらに含み、生体試料への抗体の結合が対照試料に比して増大していることが、対象にトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスがあることを示す。生体試料と対照試料は任意選択で、同じ組織起源の細胞を含む。生体試料および/または対照試料は任意選択で、血液、血清、血漿、または固形組織である。固形組織は任意選択で、心臓、末梢神経系、自律神経系、腎臓、眼球、または消化管に由来する。

0030

本発明はさらに、対象中のトランスサイレチン沈着物のレベルを決定する方法であって、上記のいずれかの抗体を投与することと、対象中の結合した抗体の存在を検出することとを含む。任意選択で、結合した抗体の存在を陽電子放射断層撮影法(PET)によって決定する。

図面の簡単な説明

0031

マウス9D5抗体、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、およびヒト化型9D5抗体の重鎖可変領域のアライメントを示す図である。Kabatによって定義されるCDRが四角で囲われており、例外的に最初の四角で囲われた部分はChothia CDR−H1とKabat CDR−H1の複合体であり、下線が施された太字の部分がKabat CDR−H1である。
マウス9D5抗体、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、およびヒト化型9D5抗体の軽鎖可変領域のアライメントを示す図である。Kabatによって定義されるCDRが四角で囲われている。
マウス14G8抗体、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、およびヒト化型14G8抗体の重鎖可変領域のアライメントを示す図である。Kabatによって定義されるCDRが四角で囲われており、例外的に最初の四角で囲われた部分はChothia CDR−H1とKabat CDR−H1の複合体であり、下線が施された太字の部分がKabat CDR−H1である。
マウス14G8抗体、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、およびヒト化型14G8抗体の軽鎖可変領域のアライメントを示す図である。Kabatによって定義されるCDRが四角で囲われている。
図3Aは、pH4処理TTRに対するマウス5A1抗体、6C1抗体、9D5抗体、および14G8抗体の結合曲線を示す図である。
図3Bは、天然TTRに対するマウス5A1抗体、6C1抗体、9D5抗体、および14G8抗体の結合曲線を示す図である。
図4Aは、mis−TTR抗体によるTTR−Y78F線維形成の阻害を示す図である。
図4Bは、14G8によるTTR−V122I線維形成の阻害を示す図である。
図4Cは、対照抗体によるTTR−V122I線維形成の阻害を示す図である。
図5Aは、9D5 mis−TTR抗体を用いた、V30M ATTRが確認された患者由来血漿試料試料番号11、12、15、18、19、20)および正常対象由来の試料(試料番号21、22、23、24、25、27)のウエスタンブロット解析デンシトメトリー解析を示す図である。
図5Bは、5A1 mis−TTR抗体を用いた同じ試料のウエスタンブロット解析のデンシトメトリー解析を示す図である。
6C1抗体を用いた、V30M ATTRが確認された患者由来の血漿試料(試料番号11、12、15、18、19、20)および正常対象由来の試料(番号21、22、23、24、25、27)のMesoScale Discovery(MSD)プレートアッセイを示す図である。
図7Aは、THP−1細胞によるF87M/L110M TTR取込みに対する抗体14G8の効果を示す図である。
図7Bは、THP−1細胞によるV30M TTR取込みに対する各mis−TTR抗体の効果を示す図である。

実施例

0032

配列の簡単な説明
配列番号1は、マウス9D5抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。

0033

配列番号2は、マウス重鎖可変領域構造の鋳型1SEQ_Hのアミノ酸配列を表す。

0034

配列番号3は、重鎖可変アクセプターACC番号BAC02114のアミノ酸配列を表す。

0035

配列番号4は、重鎖可変アクセプターACC番号AAX82494.1のアミノ酸配列を表す。

0036

配列番号5は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン1(Hu9D5VHv1)のアミノ酸配列を表す。

0037

配列番号6は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン2(Hu9D5VHv2)のアミノ酸配列を表す。

0038

配列番号7は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン2b(Hu9D5VHv2b)のアミノ酸配列を表す。

0039

配列番号8は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン3(Hu9D5VHv3)のアミノ酸配列を表す。

0040

配列番号9は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン3b(Hu9D5VHv3b)のアミノ酸配列を表す。

0041

配列番号10は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン4(Hu9D5VHv4)のアミノ酸配列を表す。

0042

配列番号11は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン4b(Hu9D5VHv4b)のアミノ酸配列を表す。

0043

配列番号12は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン5(Hu9D5VHv5)のアミノ酸配列を表す。

0044

配列番号13は、マウス9D5抗体のKabatCDR−H1のアミノ酸配列を表す。

0045

配列番号14は、マウス9D5抗体のKabatCDR−H2のアミノ酸配列を表す。

0046

配列番号15は、マウス9D5抗体のKabatCDR−H3のアミノ酸配列を表す。

0047

配列番号16は、マウス9D5抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。

0048

配列番号17は、マウス軽鎖可変領域構造の鋳型1MJU_Lのアミノ酸配列を表す。

0049

配列番号18は、軽鎖可変アクセプターACC番号ABC66952のアミノ酸配列を表す。

0050

配列番号19は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン1(Hu9D5VLv1)のアミノ酸配列を表す。

0051

配列番号20は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン2(Hu9D5VLv2)のアミノ酸配列を表す。

0052

配列番号21は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン3(Hu9D5VLv3)のアミノ酸配列を表す。

0053

配列番号22は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン4(Hu9D5VLv4)のアミノ酸配列を表す。

0054

配列番号23は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン5(Hu9D5VLv5)のアミノ酸配列を表す。

0055

配列番号24は、マウス9D5抗体のKabatCDR−L1のアミノ酸配列を表す。

0056

配列番号25は、マウス9D5抗体のKabatCDR−L2のアミノ酸配列を表す。

0057

配列番号26は、マウス9D5抗体のKabatCDR−L3のアミノ酸配列を表す。

0058

配列番号27は、ヒト化9D5重鎖バージョン1のアミノ酸配列を表す。

0059

配列番号28は、ヒト化9D5重鎖バージョン2のアミノ酸配列を表す。

0060

配列番号29は、ヒト化9D5重鎖バージョン2bのアミノ酸配列を表す。

0061

配列番号30は、ヒト化9D5重鎖バージョン3のアミノ酸配列を表す。

0062

配列番号31は、ヒト化9D5重鎖バージョン3bのアミノ酸配列を表す。

0063

配列番号32は、ヒト化9D5重鎖バージョン4のアミノ酸配列を表す。

0064

配列番号33は、ヒト化9D5重鎖バージョン4bのアミノ酸配列を表す。

0065

配列番号34は、アミノ酸配列ヒト化9D5重鎖バージョン5を表す。

0066

配列番号35は、ヒト化9D5軽鎖バージョン1のアミノ酸配列を表す。

0067

配列番号36は、ヒト化9D5軽鎖バージョン2のアミノ酸配列を表す。

0068

配列番号37は、ヒト化9D5軽鎖バージョン3のアミノ酸配列を表す。

0069

配列番号38は、ヒト化9D5軽鎖バージョン4のアミノ酸配列を表す。

0070

配列番号39は、ヒト化9D5軽鎖バージョン5のアミノ酸配列を表す。

0071

配列番号40は、シグナルペプチドを有するマウス9D5抗体の重鎖可変領域の核酸配列を表す。

0072

配列番号41は、シグナルペプチドを有するマウス9D5抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。

0073

配列番号42は、シグナルペプチドを有するマウス9D5抗体の軽鎖可変領域の核酸配列を表す。

0074

配列番号43は、シグナルペプチドを有するマウス9D5抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。

0075

配列番号44は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン1(Hu9D5VHv1)の核酸配列を表す。

0076

配列番号45は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン2(Hu9D5VHv2)の核酸配列を表す。

0077

配列番号46は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン2b(Hu9D5VHv2b)の核酸配列を表す。

0078

配列番号47は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン3(Hu9D5VHv3)の核酸配列を表す。

0079

配列番号48は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン3b(Hu9D5VHv3b)の核酸配列を表す。

0080

配列番号49は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン4(Hu9D5VHv4)の核酸配列を表す。

0081

配列番号50は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン4b(Hu9D5VHv4b)の核酸配列を表す。

0082

配列番号51は、ヒト化9D5抗体の重鎖可変領域バージョン5(Hu9D5VHv5)の核酸配列を表す。

0083

配列番号52は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン1(Hu9D5VLv1)の核酸配列を表す。

0084

配列番号53は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン2(Hu9D5VLv2)の核酸配列を表す。

0085

配列番号54は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン3(Hu9D5VLv3)の核酸配列を表す。

0086

配列番号55は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン4(Hu9D5VLv4)の核酸配列を表す。

0087

配列番号56は、ヒト化9D5抗体の軽鎖可変領域バージョン5(Hu9D5VLv5)の核酸配列を表す。

0088

配列番号57は、マウス9D5重鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を表す。

0089

配列番号58は、マウス9D5重鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を表す。

0090

配列番号59は、マウス9D5軽鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を表す。

0091

配列番号60は、マウス9D5軽鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を表す。

0092

配列番号61は、マウス14G8抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。

0093

配列番号62は、マウス重鎖可変領域構造の鋳型1MQK_Hのアミノ酸配列を表す。

0094

配列番号63は、重鎖可変アクセプターACC番号AAD30410.1のアミノ酸配列を表す。

0095

配列番号64は、ヒト化14G8抗体の重鎖可変領域バージョン1(Hu14G8VHv1)のアミノ酸配列を表す。

0096

配列番号65は、ヒト化14G8抗体の重鎖可変領域バージョン2(Hu14G8VHv2)のアミノ酸配列を表す。

0097

配列番号66は、ヒト化14G8抗体の重鎖可変領域バージョン3(Hu14G8VHv3)のアミノ酸配列を表す。

0098

配列番号67は、マウス14G8抗体のKabatCDR−H1のアミノ酸配列を表す。

0099

配列番号68は、マウス14G8抗体のKabatCDR−H2のアミノ酸配列を表す。

0100

配列番号69は、マウス14G8抗体のKabatCDR−H3のアミノ酸配列を表す。

0101

配列番号70は、マウス14G8抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。

0102

配列番号71は、マウス軽鎖可変領域構造の鋳型1MJU_Lのアミノ酸配列を表す。

0103

配列番号72は、軽鎖可変アクセプターACC番号ABA71374.1のアミノ酸配列を表す。

0104

配列番号73は、軽鎖可変アクセプターACC番号ABC66952.1のアミノ酸配列を表す。

0105

配列番号74は、ヒト化14G8抗体の軽鎖可変領域バージョン1(Hu14G8VLv1)のアミノ酸配列を表す。

0106

配列番号75は、ヒト化14G8抗体の軽鎖可変領域バージョン2(Hu14G8VLv2)のアミノ酸配列を表す。

0107

配列番号76は、ヒト化14G8抗体の軽鎖可変領域バージョン3(Hu14G8VLv3)のアミノ酸配列を表す。

0108

配列番号77は、マウス14G8抗体のKabatCDR−L1のアミノ酸配列を表す。

0109

配列番号78は、マウス14G8抗体のKabatCDR−L2のアミノ酸配列を表す。

0110

配列番号79は、マウス14G8抗体のKabatCDR−L3のアミノ酸配列を表す。

0111

配列番号80は、ヒト化14G8抗体バージョン3(Hu14G8VLv3)のKabatCDR−L1のアミノ酸配列を表す。

0112

配列番号81は、ヒト化14G8重鎖バージョン1のアミノ酸配列を表す。

0113

配列番号82は、ヒト化14G8重鎖バージョン2のアミノ酸配列を表す。

0114

配列番号83は、ヒト化14G8重鎖バージョン3のアミノ酸配列を表す。

0115

配列番号84は、ヒト化14G8軽鎖バージョン1のアミノ酸配列を表す。

0116

配列番号85は、ヒト化14G8軽鎖バージョン2のアミノ酸配列を表す。

0117

配列番号86は、ヒト化14G8軽鎖バージョン3のアミノ酸配列を表す。

0118

配列番号87は、シグナルペプチドを有するマウス14G8抗体の重鎖可変領域の核酸配列を表す。

0119

配列番号88は、シグナルペプチドを有するマウス14G8抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。

0120

配列番号89は、シグナルペプチドを有するマウス14G8抗体の軽鎖可変領域の核酸配列を表す。

0121

配列番号90は、シグナルペプチドを有するマウス14G8抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。

0122

配列番号91は、ヒト化14G8抗体の重鎖可変領域バージョン1(Hu14G8VHv1)の核酸配列を表す。

0123

配列番号92は、ヒト化14G8抗体の重鎖可変領域バージョン2(Hu14G8VHv2)の核酸配列を表す。

0124

配列番号93は、ヒト化14G8抗体の重鎖可変領域バージョン3(Hu14G8VHv3)の核酸配列を表す。

0125

配列番号94は、ヒト化14G8抗体の軽鎖可変領域バージョン1(Hu14G8VLv1)の核酸配列を表す。

0126

配列番号95は、ヒト化14G8抗体の軽鎖可変領域バージョン2(Hu14G8VLv2)の核酸配列を表す。

0127

配列番号96は、ヒト化14G8抗体の軽鎖可変領域バージョン3(Hu14G8VLv3)の核酸配列を表す。

0128

配列番号97は、マウス14G8重鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を表す。

0129

配列番号98は、マウス14G8重鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を表す。

0130

配列番号99は、マウス14G8軽鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を表す。

0131

配列番号100は、マウス14G8軽鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を表す。

0132

配列番号101は、例示的ヒトIgG1重鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。

0133

配列番号102は、IgG1 G1m3アロタイプの例示的ヒトIgG1重鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。

0134

配列番号103は、IgG1 G1m3アロタイプの例示的ヒトIgG1重鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。

0135

配列番号104は、N末端アルギニンを有する例示的ヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。

0136

配列番号105は、N末端アルギニンを有さない例示的ヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。

0137

配列番号106は、G1m3アロタイプの例示的重鎖定常領域の核酸配列を表す。

0138

配列番号107は、N末端アルギニンを有する例示的軽鎖定常領域の核酸配列を表す。

0139

配列番号108は、N末端アルギニンを有さない例示的軽鎖定常領域の核酸配列を表す。

0140

配列番号109は、アクセッション番号P02766.1(UniProt)で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列を表す。

0141

配列番号110は、アクセッション番号AAB35639.1(GenBank)で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列を表す。

0142

配列番号111は、アクセッション番号AAB35640.1(GenBank)で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列を表す。

0143

配列番号112は、アクセッション番号およびABI63351.1(GenBank)で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列を表す。

0144

配列番号113は、ヒトトランスサイレチンの残基89〜97のアミノ酸配列を表す。

0145

配列番号114は、潜在的トランスサイレチン免疫原のアミノ酸配列を表す。

0146

配列番号115は、潜在的トランスサイレチン免疫原のアミノ酸配列を表す。

0147

配列番号116は、潜在的トランスサイレチン免疫原のアミノ酸配列を表す。

0148

配列番号117は、マウス9D5抗体のChothia−KabatCDR−H1複合体のアミノ酸配列を表す。

0149

配列番号118は、マウス14G8抗体のChothia−KabatCDR−H1複合体のアミノ酸配列を表す。

0150

定義
モノクローナル抗体をはじめとする生物学的実体は通常、単離形態で提供される。このことは、抗体をはじめとする生物学的実体が通常、その作製または精製から生じる妨害タンパク質をはじめとする夾雑物に対し純度が少なくとも50重量%であることを意味するが、モノクローナル抗体が、その使用を容易にすることを目的とする過剰の薬学的に許容される担体(1つまたは複数)をはじめとする媒体と組み合わされる可能性を排除するものではない。モノクローナル抗体は場合によっては、作製または精製から生じる妨害タンパク質をはじめとする夾雑物に対し純度が少なくとも60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、95重量%または99重量%である。多くの場合、単離されたモノクローナル抗体をはじめとする生物学的実体は、その精製後に残っている主要な高分子種である。

0151

その標的抗原への抗体の特異的な結合とは、親和性が少なくとも106M−1、107M−1、108M−1、109M−1、または1010M−1であることを意味する。特異的結合は、強度が検出可能により高く、少なくとも1つの無関係な標的に対して起こる非特異的結合区別可能である。特異的結合は、特定の官能基の間の結合形成または特定の空間的嵌合(例えば、鍵−鍵穴型)の結果であり得るが、これに対し非特異的結合は通常、ファンデルワールス力の結果である。特異的結合はしかし、抗体がただ1つの標的のみを結合することを必ずしも意味しない。

0152

抗体の基本的な構造単位サブユニット四量体である。各四量体にはポリペプチド鎖の同一のペアが2組含まれており、各ペアは1つの「軽鎖」(約25kDa)と1つの「重鎖」(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。この可変領域は最初、切断可能なシグナルペプチドに連結されて発現する。シグナルペプチドを有さない可変領域を成熟可変領域と呼ぶこともある。したがって、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを有さない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定める。

0153

軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマミューアルファデルタ、またはイプシロンに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプIgG、IgMIgAIgDおよびIgEを定める。軽鎖および重鎖内では、約12個以上のアミノ酸の「J」領域によって可変領域と定常領域が連結され、重鎖はまた、約10個以上のアミノ酸の「D」領域も含む。全般的には、Fundamental Immunology,Paul,W.編,第2版,Raven Press,N.Y.,1989,第7章(その全体があらゆる目的において参照により組み込まれる)を参照されたい。

0154

免疫グロブリンの軽鎖可変領域または重鎖可変領域(本明細書ではそれぞれ「軽鎖可変ドメイン」(「VLドメイン」)または「重鎖可変ドメイン」(「VHドメイン」)とも呼ぶ)は、3つの「相補性決定領域」または「CDR」によって分断される「フレームワーク」領域からなる。「フレームワーク領域」には、抗原のエピトープへの特異的結合のためにCDRを整列させる役割がある。CDRは、主に抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を含む。VLドメインおよびVHドメインはともに、アミノ末端からカルボキシル末端へと、以下のフレームワーク(FR)領域およびCDR領域:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。VLドメインのCDR1、CDR2およびCDR3は、本明細書ではそれぞれCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3とも呼び、VHドメインのCDR1、CDR2、およびCDR3は、本明細書ではそれぞれCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3とも呼ぶ。

0155

各VLドメインおよびVHドメインへのアミノ酸の割当ては、従来のCDRの定義に準ずるものである。従来の定義としては、Kabatの定義(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987 and 1991)、Chothiaの定義(ChothiaおよびLesk,J.Mol.Biol.196:901−917,1987;Chothiaら,Nature 342:878−883,1989);CDR−H1がChothia CDRとKabat CDRの複合体であるChothia Kabat CDR複合体;Oxford Molecular社の抗体モデリングソフトウェアで使用されるAbM定義;およびMartinらの接触定義(contact definition)(bioinfo.org.uk/abs)が挙げられる(表1を参照されたい)。Kabatは、広く用いられている慣例的な番号付け(Kabat番号付け)を提供しており、この番号付けでは、異なる重鎖同士または異なる軽鎖同士で対応する残基に同じ番号を割り当てる。抗体が特定のCDRの定義(例えば、Kabat)によるCDRを含むと言う場合、その定義は抗体に存在するCDR残基の最小数明記する(すなわち、Kabat CDR)。それは、別の従来のCDRの定義には当てはまるが、指定される定義には当てはまらない他の残基を排除するものではない。例えば、Kabatによって定義されるCDRを含む抗体としては、考え得る抗体のなかでもとりわけ、CDRにKabat CDR残基を含み他のCDR残基を含まない抗体および、CDR H1がChothia−Kabat CDR H1複合体であり他のCDRがKabat CDR残基を含み別の定義に基づく追加のCDR残基を含まない抗体が挙げられる。

0156

*ChothiaによるCDR−H1はH32、H33、またはH34で終わる可能性がある(ループの長さに応じて)。これは、Kabat番号付けスキームでは、余分な残基の挿入を35Aおよび35Bに位置付けるのに対し、Chothia番号付けでは、それを31Aおよび31Bに位置付けることによる。H35AおよびH35B(Kabat番号付け)がともに存在しない場合、Chothia CDR−H1ループはH32で終わる。H35Aのみが存在する場合、それはH33で終わる。H35AおよびH35Bがともに存在する場合、それはH34で終わる。

0157

「抗体」という用語は、「インタクト抗体」およびその結合フラグメントを包含する。フラグメントは通常、標的への特異的結合に関して元のインタクト抗体と競合し、分離した重鎖、分離した軽鎖、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab)c、Dab、ナノボディ、およびFvを含む。フラグメントは、組換えDNA技術により、またはインタクト免疫グロブリンの酵素的分離もしくは化学的分離によって作製できる。「抗体」という用語はまた、二重特異性抗体および/またはヒト化抗体も包含する。二重特異性抗体または二機能性抗体とは、2種類の異なる重鎖/軽鎖ペアと2種類の異なる結合部位とを有する人工ハイブリッド抗体である(例えば、SongsivilaiおよびLachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315−321(1990);Kostelnyら,J.Immunol.,148:1547−53(1992)を参照されたい)。いくつかの二重特異性抗体では、2種類の異なる重鎖/軽鎖ペアは、ヒト化9D5重鎖/軽鎖ペアと、9D5が結合するものとは異なるトランスサイレチン上のエピトープに対して特異的な重鎖/軽鎖ペアとを含む。いくつかの二重特異性抗体では、2種類の異なる重鎖/軽鎖ペアは、ヒト化14G8重鎖/軽鎖ペアと、14G8が結合するものとは異なるトランスサイレチン上のエピトープに対して特異的な重鎖/軽鎖ペアとを含む。

0158

いくつかの二重特異性抗体では、一方の重鎖/軽鎖ペアが、のちにさらに開示するヒト化9D5抗体または14G8抗体であり、他方の重鎖/軽鎖ペアが、血液脳関門に発現する受容体、例えばインスリン受容体インスリン様成長因子(IGF)受容体、レプチン受容体リポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体などに結合する抗体に由来する(Fridenら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4771−4775,1991;Fridenら,Science 259:373−377,1993)。このような二重特異性抗体は、受容体介在型トランスサイトーシスによって血液脳関門を通過可能である。血液脳関門受容体に対するその親和性が低下するよう二重特異性抗体を設計することによって、二重特異性抗体の脳での取込みをさらに増大させることができる。受容体に対する親和性を低下させることによって、脳内にさらに広範囲分布するという結果が得られている(例えば、Atwalら,Sci.Trans.Med.3,84ra43,2011;Yuら,Sci.Trans.Med.3,84ra44,2011を参照されたい)。

0159

例示的な二重特異性抗体はまた、(1)各軽鎖および重鎖が短いペプチド結合を介して2つの可変ドメインタンデムに含む、二重可ドメイン抗体(DVD−Ig)(Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010)のWuら,Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD−Ig(商標))Molecule);(2)各標的抗原に対して2つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす2つの単一鎖ダイアボディ融合物である、Tandab;(3)多価分子をもたらすscFvとダイアボディの組み合わせである、フレキシボディ(flexibody);(4)Fabに適用すると、異なる1つのFabフラグメントに連結される2つの同一のFabフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質をもたらす、プロテインキナーゼAでの「二量体化ドッキングドメイン」を土台とする、いわゆる「ドックアンドロック(dock and lock)」分子;または(5)例えばヒトFc領域の両端に融合される2つのscFvを含む、いわゆるScorpion分子であってよい。二重特異性抗体の調製に有効なプラットフォームの例としては、BiTE(Micromet社)、DART(MacroGenics社)、FcabおよびMab2(F−star社)、Fc操作IgG1(Xencor社)またはDuoBody(Fabアーム交換に基づくもの、Genmab社)が挙げられる。

0160

「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸または1つまたは複数のタンパク質の三次フィールディングによって並列される非連続のアミノ酸から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープ(直線状エピトープとしても知られる)は通常、変性溶媒曝露しても保持されるのに対し、三次フォールディングによって形成されるエピトープ(立体構造エピトープとしても知られる)は通常、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは通常、固有空間的構造の少なくとも3個、より通常には少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的構造を明らかにする方法としては、例えばX線結晶構造解析および2次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Methodsin Molecular Biology,第66巻,Glenn E.Morris編(1996)のEpitope MappingProtocolsを参照されたい。エピトープは、例えば、配列番号109の2〜5、3〜5、3〜9、または5〜9の連続するアミノ酸からなるエピトープのような直線状であり得る。エピトープはまた、例えば、配列番号109の残基89〜97内のアミノ酸の2つ以上の非連続セグメントを含む立体構造エピトープであり得る。

0161

抗体がトランスサイレチン(TTR)のアミノ酸89〜97内のエピトープに結合すると言う場合、例えばその意味は、エピトープが、範囲の外側の境界を定めるものを含み記載されるアミノ酸の範囲内にあるということである。それは必ずしも、その範囲内のあらゆるアミノ酸がエピトープの一部を構成することを意味するわけではない。したがって、例えば、TTRのアミノ酸89〜97内のエピトープは、配列番号113の直線状のセグメントのなかでもとりわけ、アミノ酸89〜97、89〜96、90〜96、91〜96、92〜96、93〜96、94〜96、89〜96、89〜95、89〜94、89〜93、89〜92または89〜93からなるか、立体構造エピトープの場合、配列番号113のアミノ酸の非連続セグメントからなるものであり得る。

0162

同じエピトープまたは重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原への結合に関して別の抗体と競合するある抗体の能力を示す単純なイムノアッセイで特定できる。抗体のエピトープもまた、接触残基を特定するためにその抗原に結合した抗体のX線結晶構造解析によって明らかにできる。あるいは、一方の抗体の結合を低下または消失させる抗原中の全てのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を低下または消失させる場合、2つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低下または消失させるいくつかのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を低下または消失させる場合、2つの抗体は重複するエピトープを有する。

0163

抗体間の競合は、被験抗体が共通の抗原への参照抗体の結合を阻害するアッセイにより決定される(例えば、Junghansら,Cancer Res.50:1495,1990を参照されたい)。競合結合アッセイで測定して過剰の被験抗体(例えば、少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍または100倍)が参照抗体の結合を少なくとも50%阻害する場合、被験抗体は参照抗体と競合する。参照抗体の結合を少なくとも75%、90%または99%阻害する被験抗体もある。競合アッセイによって特定される抗体(競合抗体)としては、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および、立体障害を起こす程度に参照抗体が結合するエピトープに近い位置にある近接エピトープに結合する抗体が挙げられる。

0164

構造トランスサイレチン(TTR)に関する「天然の」という用語は、正常にフォールドし正しく機能する状態にあるTTRの構造(すなわち、TTR四量体)を指す。TTRは天然にフォールドした形態で四量体であることから、非天然形態のTTRとしては、例えば、ミスフォールドしたTTR四量体、TTR単量体凝集形態のTTR、および原線維形態のTTRが挙げられる。非天然形態のTTRは、野生型TTRのアミノ酸配列または変異を含む分子を含み得る。

0165

TTRに関する「ミスフォールドした」という用語は、TTRポリペプチドの単量体または多量体二次構造または三次構造を指し、ポリペプチドが、正しく機能する状態にあるそのタンパク質には正常ではない立体構造をとっていることを表す。TTRのミスフォールディングはタンパク質の変異(例えば、欠失置換、または付加)によって引き起こされ得るが、野生型TTRタンパク質が疾患でミスフォールドすることもあり、特定のエピトープを曝露する。

0166

「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、補形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合し、その被投与者に実質的に有害でないことを意味する。

0167

患者」という用語は、予防処置または治療処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を包含する。

0168

ある個体は、既知危険因子(例えば、遺伝学因子生化学的因子家族歴、および環境曝露)であって、その危険因子を有する個体がそれをもたない個体よりも疾患を発症するリスクが統計的に有意に高い危険因子をその対象が少なくとも1つ有する場合、その疾患のリスクが高い。

0169

「生体試料」という用語は、生物学的供給源、例えばヒトまたは哺乳動物対象中の、またはそれらの対象から採取できる生物学的材料の試料を指す。このような試料は、器官細胞小器官、組織、組織切片体液末梢血、血漿、血清、細胞、タンパク質およびペプチドなどの分子、およびそれらに由来する任意の部分または組合せであり得る。生体試料という用語はまた、試料を処理することによって得られる任意の材料を包含し得る。得られる材料は、細胞またはそれらの子孫を含み得る。生体試料の処理は、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、固定、妨害成分不活化などの1つまたは複数を含み得る。

0170

「対照試料」という用語は、単量体形態ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のトランスサイレチン(TTR)、例えばTTRアミロイド沈着物などを含むと知られていない、または推測されない生体試料を指す。対照試料は、TTRアミロイドーシスまたは具体的に選択した種類のTTRアミロイドーシスに罹患していない個体から得られる。あるいは、対照試料は、TTRアミロイドーシスまたは具体的に選択した種類のTTRアミロイドーシスに罹患している患者から得られる。このような試料は、TTRアミロイドーシスを含むと考えられる生体試料と同時に得ても、または異なる機会に得てもよい。生体試料および対照試料はともに、同じ組織(例えば、TTRアミロイド沈着物と周囲の正常組織の両方を含む組織切片)から得てもよい。好ましくは、対照試料は実質的にまたは完全に、TTRアミロイド沈着物を含まない組織からなり、TTRアミロイド沈着物を含むと考えられる生体試料との比較に用いることができる。好ましくは、対照試料中の組織は、生体試料中の組織と同じ種類(例えば、心臓中の心筋細胞)である。

0171

「疾患」という用語は、生理的機能を損なう任意の異常な状態を指す。この用語は広義に使用され、病因性質に関係なく生理的機能が損なわれる任意の障害病気、異常、病態、疾病、状態、または症候群を包含する。

0172

「症状」という用語は、対象によって知覚される疾患の主観証拠、例えば歩行異常などを指す。「徴候」は、医師によって観察される疾患の客観的証拠を指す。

0173

アミノ酸置換保存的置換または非保存的置換に分類する目的で、アミノ酸を以下のグループに分ける:グループI(疎水性側鎖):met、ala、val、leu、ile;グループII(中性親水性側鎖):cys、ser、thr;グループIII(酸性側鎖):asp、glu;グループIV(塩基性側鎖):asn、gln、his、lys、arg;グループV(鎖配向に影響を及ぼす残基):gly、pro;およびグループVI(芳香族側鎖):trp、tyr、phe。保存的置換は、同じクラスのアミノ酸の間で置換を含む。非保存的置換は、上記のうちの1つクラスのメンバーが別のクラスのメンバーに置き換わるものである。

0174

配列同一性のパーセントは、慣習的なKabat番号付けによって最大に整列させた抗体の配列によって求められる。整列後、目的の抗体領域(例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体)を参照抗体の同じ領域と比較する場合、目的の抗体の領域と参照抗体の領域との間の配列同一性のパーセントは、目的の抗体の領域および参照抗体の領域の両方で同じアミノ酸によって占められる位置の数を、この2つの領域の整列された位置の総数で除し、ギャップカウントせずに、100を乗じてパーセントに変換したものである。

0175

1つまたは複数の記載される要素を「含む」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む」組成物は、抗体を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。

0176

数値の範囲の指定は、その範囲内に含まれる整数またはその範囲を定める整数、およびその範囲内の整数によって定められる全ての部分範囲を含む。

0177

「約」という用語は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、記載される数値の測定標準誤差(例えば、SEM)内の数値を包含する。

0178

統計的に有意であるとは、p≦0.05を意味する。

0179

単数形の詞「a」、「an」および「the」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数形の指示対象を包含する。例えば、「化合物(a compound)」または「少なくとも1つの化合物」は、複数の化合物をその混合物も含んで包含し得る。

0180

(詳細な説明)
I.概略
本発明は、トランスサイレチン(TTR)の残基89〜97に特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRに結合する能力を有する。この抗体は、TTRの蓄積またはTTR沈着物の蓄積に関連する疾患または障害(例えば、TTRアミロイドーシス)を治療または予防するために使用できる。この抗体はまた、諸用途のなかでもとりわけ、TTRアミロイドーシスを診断するためおよびTTR凝集を阻害または軽減するために使用できる。

0181

II.標的分子
トランスサイレチン(TTR)は、血清中および脳脊髄液中に存在する127アミノ酸、55kDaの輸送タンパク質であり、主に肝臓で合成される。それはまたプレアルブミンチロキシン結合プレアルブミン、ATTR、およびTBPAとも呼ばれている。その天然の状態では、TTRは四量体として存在する。ホモ接合体では、四量体は同一の127アミノ酸ベータシートリッチサブユニットを含む。ヘテロ接合体では、TTR四量体は、通常は統計的に組み合わされるバリアントサブユニットおよび/または野生型サブユニットからなる。

0182

液中での確立されたTTRの機能は、ホロレチノール結合タンパク質の輸送である。げっ歯類の血液中でTTRはチロキシン(T4)の主要な担体であり、ホロ−レチノール結合タンパク質に用いられるものと直交する結合部位を利用するが、ヒトではこのT4結合部位は事実上空いている。

0183

TTRは、様々な凝集構造へのその細胞外でのミスフォールドおよび/または誤会合(アミロイド形成)がアミロイド疾患と呼ばれる変性性疾患を引き起こすと考えられる、少なくとも30種類の異なるヒトタンパク質のうちの1つである。TTRは立体構造変化を受けてアミロイド原性となる。部分的なアンフォールディングによって、伸長した立体構造の、大部分が非荷電で疎水性のひと続きの残基が露出し、これがほぼ不定形球状凝集体へと効率的に誤会合し、最終的にはクロスベータシートアミロイド構造へと立体構造変換する。

0184

文脈上そうでないことが明らかでない限り、トランスサイレチン(TTR)またはそのフラグメントもしくはドメインへの言及は、アイソフォーム、変異体、および対立遺伝子変異体を含む天然のヒトアミノ酸配列を含む。例示的なTTRポリペプチド配列は、アクセッション番号P02766.1(UniProt)、AAB35639.1(GenBank)、AAB35640.1(GenBank)、およびABI63351.1(GenBank)(それぞれ配列番号109〜112)で表される。残基はSwiss Prot P02766.1に従って番号付けされ、成熟タンパク質(すなわち、20アミノ酸のシグナル配列を含まない)の最初のアミノ酸を残基1と表す。他の任意のTTRタンパク質では、最大アライメントでP02766.1中の対応する残基に合わせて残基を番号付けする。

0185

III.トランスサイレチンアミロイドーシス
トランスサイレチン(TTR)アミロイドーシスは、病原性のミスフォールドTTRおよびTTRからなるアミロイド原線維の細胞外沈着を特徴とする全身障害である。TTRアミロイドーシスは、天然のTTR四量体形態の不安定化環境条件または遺伝条件による)により一般に引き起こされ、TTRの解離、ミスフォールディング、およびアミロイド原線維への凝集が起こり、これが様々な器官および組織に蓄積し、進行性機能不全を引き起こす。例えば、AlmeidaおよびSaraiva,FEBSLetters 586:2891−2896(2012);Andoら,Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31(2013)を参照されたい。

0186

ヒトでは、野生型TTR四量体および変異体サブユニットと野生型サブユニットとからなる混合型四量体の両方が、有糸分裂終了組織の変性をもたらすアミロイド形成の過程で、解離、ミスフォールド、および凝集し得る。したがって、TTRアミロイドーシスは、TTRにおける変異により生じるまたは変異していないミスフォールドTTRによって生じる病原性のミスフォールドTTRを原因とする疾患を包含する。

0187

例えば、老人性全身性アミロイドーシス(SSA)および老人性心アミロイドーシス(SCA)は加齢に関連する種類のアミロイドーシスであり、心臓の心筋細胞の外側と内側に野生型TTRアミロイドが沈着することによって起こる。TTRアミロイドーシスはまた、最も頻度の高い形態の遺伝性(家族性)アミロイドーシスでもあり、TTRタンパク質を不安定化する変異を原因とする。TTR遺伝子中の点変異に関連するTTRアミロイドーシスとしては、家族性アミロイドニューロパチー(FAP)、家族性アミロイド心筋症(FAC)、およびまれな中枢神経系選択性アミロイドーシス(CNSA)が挙げられる。遺伝性(家族性)TTRアミロイドーシスの患者はほぼ例外なくヘテロ接合体であり、このことは、TTR四量体が、一般には統計的に分布する変異体TTRサブユニットおよび/または野生型TTRサブユニットからなることを意味する。遺伝性(家族性)のTTRアミロイドーシスは一般に常染色体優性であり、通常、孤発性の疾患(SSAおよびSCA)よりも早期に発症する。

0188

TTRをコードする遺伝子中の変異で、常染色体優性障害のFAPおよびFACに関与すると考えられているものは100を超える。例えば、米国特許出願公開第2014/0056904号;Saraiva,Hum.Mutat.17(6):493−503(2001);DamasおよびSaraiva,J.Struct.Biol.130:290−299;DwuletおよびBenson,Biochem.Biophys.Res.Commun.114:657−662(1983)を参照されたい。これらのアミロイドを生じる変異はTTRの分子全体にわたって分布している。一般に、変異体サブユニットがTTRの四量体構造をより不安定化させるほど、アミロイド疾患の発症がより早くなる。TTRバリアントが病原性となる可能性は一般に、その不安定性細胞分泌効率とを組み合わせて求められる。TTRバリアントが引き起こす初期の病態は、TTRバリアントが心組織を選択的に破壊することによるものもあれば、TTRバリアントによって末梢神経系および自律神経系が損なわれることによるものもある。TTRアミロイド形成を原因とする組織損傷は、小さい拡散性のTTR凝集体の毒性によるものがほとんどであると思われるが、細胞外アミロイドの蓄積が一因であることもあり、その場合、TTRアミロイドーシスの後期に器官構造がほぼ確実に損なわれる。

0189

TTRアミロイドーシスには多数の異なる形態がみられ、表現型に相当な個体差および地域差がある。例えば、TTRアミロイドーシスは進行性の軸索性感覚性自律神経性運動性ニューロパチーとしてみられることがある。TTRアミロイドーシスはまた、浸潤性心筋症としてみられることがある。

0190

疾患関連症状が発現する年齢は10代〜80代の間で様々であり、集団間で大きなばらつきがみられる。TTRアミロイドーシスが多系統に及ぶことは、その診断の手掛かりの1つとなる。例えば、以下に挙げるものが1つまたは複数みられる場合、TTRアミロイドーシスの診断が考慮される:(1)特に心不全に関わる、神経障害性疾患の家族歴;(2)原因不明神経因性疼痛または進行性感覚障害;(3)原因が明らかでなく、特に両側性外科開放を必要とする手根管症候群;(4)原因不明の消化管運動障害または自律神経機能不全(例えば、勃起不全起立性低血圧症神経因性膀胱);(5)高血圧がみられず心室壁肥厚を特徴とする心疾患;(6)原因が不明であり、特に心肥大を伴う高度房室ブロック;および(6)綿花状の硝子体封入体。Andoら,Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31(2013)を参照されたい。その他の症状としては、例えば、多発性ニューロパチー、間隔消失、疼痛下肢脱力発汗異常下痢便秘体重減少、および尿失禁尿閉が挙げられる。

0191

TTRアミロイドーシスの診断は通常、標的器官生検を頼りにし、次いで、摘出組織をアミロイド特異的色素であるコンゴー赤で組織学的に染色する。検査結果がアミロイド陽性である場合、次いでTTRの免疫組織化学染色を実施してアミロイド形成の原因である前駆体タンパク質が実際にTTRであることを確認する。家族性の疾患では、TTRをコードする遺伝子に変異があることを次いで明らかにしてから診断を下す必要がある。これは、例えば、等電点電気泳動ポリメラーゼ連鎖反応、またはレーザー分析液体クロマトグラフィータンデム質量分析によって遂行され得る。例えば、米国特許出願公開第2014/0056904号;RubergおよびBerk,Circulation 126:1286−1300(2012);Andoら,Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31(2013)を参照されたい。

0192

IV.抗体
A.結合特異性および機能的特性
本発明は、トランスサイレチン(TTR)タンパク質に、より具体的にはTTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号113)内のエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。このようなエピトープは天然のTTR四量体では埋没しており、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRでは露出している。

0193

9D5および14G8と称する抗体は、このようなマウス抗体の2つの例である。9D5または14G8と言う場合、文脈上そうでないことが明らかでない限り、マウス型、キメラ型、ベニヤ化(veneered)型、およびヒト化型のいずれかの上記抗体を指すものと理解されるべきである。これらの抗体はTTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号113)内に特異的に結合する。これらの抗体は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRに結合できるが、天然の四量体形態のTTRには結合できないという特徴をさらに有する。さらに、これらの抗体は、TTR媒介性アミロイドーシスの心組織に対して免疫反応を示すが、健常な心組織に対しては免疫反応を示さないという特徴を有する。特定のタンパク質またはそのフラグメントに結合する能力は、実施例に記載する例示的アッセイフォーマットを用いて示され得る。

0194

いくつかの抗体は、9D5または14G8と称する抗体と同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する。これらの抗体の重鎖成熟可変領域および軽鎖成熟可変領域の配列は、それぞれ配列番号1および16(9D5)、ならびに配列番号61および70(14G8)と称される。このような結合特異性を有する他の抗体は、マウスをTTRまたは所望のエピトープを含むTTRの一部分(例えば、配列番号113)で免疫し、得られた抗体について単量体TTRまたは配列番号113を含むペプチドに結合するかどうかを、任意選択でマウス9D5または14G8の可変領域を有する抗体(IgG1カッパ)と競合させて、スクリーニングすることによって作製できる。所望のエピトープを含むTTRのフラグメントを、フラグメントに対する抗体応答を誘発しやすくする担体に連結し、かつ/またはそのような応答を誘発しやすくするアジュバントと組み合わせてもよい。このような抗体について、野生型TTR、単量体型TTRまたはそのフラグメント(例えば、配列番号113)への差異的結合を特定の残基の変異体と比較してスクリーニングできる。このような変異体に対するスクリーニングは、より正確に結合特異性を明らかにして、特定の残基の変異誘発によってその結合が阻害されかつ他の例示抗体と同じ機能的特性を有する可能性のある抗体の特定を可能にする。変異は、標的全体でまたはエピトープが存在することがわかっているその区画全体で、1回に1残基またはさらに間隔を空けて実施するアラニン(または既にアラニンが存在する場合はセリン)による系統的置換であり得る。同じ変異のセットによって2つ抗体の結合が有意に低下すれば、その2つの抗体は同じエピトープを結合する。

0195

選択したマウス抗体(例えば、9D5または14G8)の結合特異性を有する抗体はまた、ファージディスプレイ方法の変法を用いて作製できる。Winterの国際公開第92/20791号を参照されたい。この方法は、ヒト抗体の作製に特に適している。この方法では、選択したマウス抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかを出発物質として用いる。例えば、軽鎖可変領域を出発物質として選択する場合、メンバーが同じ軽鎖可変領域(すなわち、マウス出発物質)および異なる重鎖可変領域を提示するファージライブラリー構築される。重鎖可変領域は、例えば、再編成されたヒト重鎖可変領域ライブラリーから得ることができる。単量体TTRまたはそのフラグメント(例えば、アミノ酸残基89〜97)に対して強い特異的結合(例えば、少なくとも108M−1、好ましくは少なくとも109M−1)を示すファージを選択する。このファージから得た重鎖可変領域は、次いでさらなるファージライブラリーを構築するための出発物質となる。このライブラリーでは、各ファージは同じ重鎖可変領域(すなわち、最初のディスプレイライブラリーで特定された領域)および異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、例えば、再編成したヒト可変軽鎖領域のライブラリーから得ることができる。同じく、単量体TTRまたはそのフラグメント(例えば、アミノ酸残基89〜97)に対して強い特異的結合を示すファージを選択する。得られる抗体は通常、マウス出発物質と同じないし類似のエピトープ特異性を有する。9D5の重鎖のKabatCDRをそれぞれ配列番号13〜15で表し、9D5の軽鎖のKabat CDRをそれぞれ配列番号24〜26で表す。9D5のChothia−Kabat CDR−H1複合体を配列番号117で表す。14G8の重鎖のKabat CDRをそれぞれ配列番号67〜69で表し、14G8の軽鎖のKabat CDRをそれぞれ配列番号77〜79で表す。14G8のChothia−Kabat CDR−H1複合体を配列番号118で表す。14G8のCDR−L1のバリアントを配列番号80で表す。

0196

9D5または14G8などの例示的抗体の重鎖および軽鎖をコードするcDNAの変異誘発によって、他の抗体を得ることができる。成熟重鎖可変領域および/もしくは成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列において9D5もしくは14G8に少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であり、その機能的特性を維持し、かつ/または少数の機能的に重要ではないアミノ酸の置換(例えば、保存的置換)、欠失、もしくは挿入を有する点で各抗体と異なるモノクローナル抗体も本発明に含まれる。任意の従来の定義(ただし、Kabatが好ましい)によって定義されるCDRを少なくとも1つまたは6つとも有し、9D5または14G8の対応するCDRに90%、95%、99%または100%同一であるモノクローナル抗体も含まれる。

0197

本発明はまた、完全にまたは実質的に9D5または14G8に由来するCDRを一部または全部(例えば、3つ、4つ、5つ、および6つ)有する抗体も提供する。このような抗体は、9D5もしくは14G8の重鎖可変領域に完全にもしくは実質的に由来するCDRを2つ、通常は3つとも有する重鎖可変領域および/または9D5もしくは14G8の軽鎖可変領域に完全にもしくは実質的に由来するCDRを少なくとも2つ、通常は3つとも有する軽鎖可変領域を含み得る。抗体は重鎖および軽鎖の両方を含み得る。CDRは、4つ以下、3つ以下、2つ以下、または1つ以下の置換、挿入、または欠失を含む場合、対応する9D5または14G8のCDRに実質的に由来するが、ただし、CDR−H2(Kabatによって定義される場合)は、6つ以下、5つ以下、4つ以下、3つ以下、2つ以下、または1つ以下の置換、挿入、または欠失を有し得る。このような抗体は、成熟重鎖可変領域および/もしくは成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列において9D5もしくは14G8に少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有し、それらの機能的特性を維持し、かつ/または少数の機能的に重要ではないアミノ酸の置換(例えば、保存的置換)、欠失、もしくは挿入を有する点で9D5または14G8と異なり得る。

0198

上記のようなアッセイによって特定されるいくつかの抗体は、実施例をはじめとする箇所に記載されるように、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRに結合できるが、天然の四量体形態のTTRには結合できない。同じように、TTR媒介性アミロイドーシスの組織に対して免疫反応を示すが、健常組織に対しては免疫反応を示さない抗体もある。

0199

いくつかの抗体は、動物モデルまたは臨床試験でTTRの凝集を阻害もしくは軽減し、TTR原線維形成を阻害もしくは軽減し、TTR沈着物もしくは凝集したTTRを減少させるか除去し、またはTTRの非毒性立体構造を安定化させ得る。いくつかの抗体は、動物モデルまたは臨床試験で示されるように、TTRアミロイドーシスを治療もしくは予防し得るか、TTRアミロイドーシスの発症を遅らせ得る。TTRアミロイドーシスに対する活性を検討するための例示的動物モデルとしては、Kohnoら,Am.J.Path.150(4):1497−1508(1997);Tengら,Laboratory Investigations 81:385−396(2001);Wakasugiら,Proc.Japan Acad.63B:344−347(1987);Shimadaら,Mol.Biol.Med.6:333−343(1989);Nagataら,J.Biochem.117:169−175(1995);Sousaら,Am.J.Path.161:1935−1948(2002);およびSantosら,Neurobiology of Aging 31:280−289(2010)に記載されているものが挙げられる。

0200

B.非ヒト抗体
単量体TTRまたはそのフラグメント(例えば、アミノ酸残基89〜97)に対する他の非ヒト抗体、例えば、マウス抗体、モルモット抗体、霊長類抗体、ウサギ抗体またはラット抗体の作製は、例えば、動物をTTRまたはそのフラグメントで免疫することによって遂行できる。HarlowおよびLane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988)(あらゆる目的において参照により組み込まれる)を参照されたい。このような免疫原は、天然源から、ペプチド合成によって、または組換え発現によって得ることができる。任意選択で、融合をはじめとする方法で免疫原を担体タンパク質複合体形成させて投与してもよい。任意選択で、免疫原をアジュバントとともに投与してもよい。のちに記載する通り、いくつかの種類のアジュバントを用いることができる。実験動物免疫感作には、フロイント完全アジュバント、次いで不完全アジュバントが好ましい。ポリクローナル抗体の作製には通常、ウサギまたはモルモットを用いる。モノクローナル抗体の作製には通常、マウスを用いる。単量体TTRまたはTTR内のエピトープ(例えば、アミノ酸残基89〜97のうちの1つまたは複数のものを含むエピトープ)に特異的に結合する抗体をスクリーニングする。このようなスクリーニングは、単量体TTRバリアント、例えばアミノ酸残基89〜97を有するかその残基内に変異を有するTTRバリアントなどの収集物への抗体の結合を決定し、その抗体にどのTTRバリアント抗体が結合するかを決定することによって遂行できる。結合は、例えば、ウエスタンブロットFACSまたはELISAによって評価できる。

0201

C.ヒト化抗体
ヒト化抗体は、遺伝子操作によって非ヒトドナー」抗体のCDRをヒト「アクセプター」抗体配列内に移植した抗体である(例えば、Queen,米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号;Winter,米国特許第5,225,539号;Carter,米国特許第6,407,213号;Adair,米国特許第5,859,205号;および米国特許第6,881,557号を参照されたい)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域の配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体に由来するCDRを少なくとも3つ、4つ、5つまたは全部ならびに、存在する場合は、完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同じように、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来するCDRを少なくとも1つ、2つ、通常は3つ全部ならびに、存在する場合は、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク配列および定常領域配列に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同じように、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖に由来するCDRを少なくとも1つ、2つ、通常は3つ全部ならびに、存在する場合は、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列および定常領域配列に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびdAb以外にも、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体のCDRは、各CDR間で対応する残基(任意の従来の定義、好ましくはKabatによって定義されるもの)の少なくとも85%、90%、95%または100%が一致する場合、非ヒト抗体での対応するCDRに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、任意の従来の定義、好ましくはKabatによって定義される対応する残基の少なくとも85%、90%、95%または100%が同一である場合、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。

0202

ヒト化抗体はマウス抗体由来の6つのCDR(任意の従来の定義、好ましくはKabatによって定義されるもの)を全て組み込むことが多いが、マウス抗体由来のCDRが全部に満たない(例えば、CDRが少なくとも3つ、4つまたは5つである)ヒト化抗体を作製することもできる(例えば、Pascalisら,J.Immunol.169:3076,2002;Vajdosら,J.of Mol.Biol.,320:415−428,2002;Iwahashiら,Mol.Immunol.36:1079−1091,1999;Tamuraら,J.Immunol.,164:1432−1441,2000)。

0203

いくつかの抗体では、ヒト化抗体での結合を保持するためにCDRの一部、すなわち、SDRと呼ばれる結合に必要なCDR残基のサブセットのみを必要とする。抗原と接触せずSDRにも存在しないCDR残基は、これまでの研究に基づき、分子モデリングおよび/または経験的に、またはGonzalesら,Mol.Immunol.41:863,2004に記載されている通りに、Chothia超可変ループ(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)の外側に存在するKabat CDRの領域から識別できる(例えば、CDR H2の残基H60〜H65は多くの場合必要とされない)。このようなヒト化抗体では、1つまたは複数のドナーCDR残基が存在しない位置またはドナーCDR全体が除去されている位置で、この位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列での対応する位置(Kabat番号付けによるもの)を占めるアミノ酸であり得る。CDR中に含まれるべきこのようなドナーアミノ酸からアクセプターアミノ酸への置換の数は、相容れない考慮事項バランスを反映する。このような置換は、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減らし、その結果、潜在的免疫原性を低下させるのに有利である可能性がある。しかし、置換によって親和性が変化する可能性もあり、親和性の大幅な低下は回避するのが好ましい。CDR内の置換の位置および置換するアミノ酸は、経験的に選択することもできる。

0204

ヒトアクセプター抗体配列は任意選択で、ヒトアクセプター配列の可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの間に高い配列同一性(例えば、65〜85%の同一性)が得られるよう多数の既知のヒト抗体配列のなかから選択できる。

0205

重鎖のアクセプター配列の例は、NCBIアクセッションコードBAC02114およびAAX82494.1(配列番号3および4)のヒト成熟重鎖可変領域ならびにヒトKabatサブグループ3の重鎖可変領域である。BAC02114はマウス9D5重鎖と同じカノニカル形態を有する。重鎖のアクセプター配列の他の例は、NCBIアクセッションコードAAD30410.1およびAAX82494.1(それぞれ配列番号63および4)のヒト成熟重鎖可変領域ならびにヒトKabatサブグループ1の重鎖可変領域である。AAD30410.1およびAAX82494.1は、マウス14G8重鎖と同じカノニカル形態を有するCDRを2つ含む。軽鎖のアクセプター配列の例は、NCBIアクセッションコードABC66952(配列番号18)のヒト成熟軽鎖可変領域およびヒトKabatサブグループ3の軽鎖可変領域である。ABC66952は、マウス9D5軽鎖と同じカノニカル形態を有するCDRを2つ含む。軽鎖のアクセプター配列の他の例は、NCBIアクセッションコードABA71374.1およびABC66952.1(それぞれ配列番号72および73)のヒト成熟軽鎖可変領域ならびにヒトKabatサブグループ2の軽鎖可変領域である。ABA71374.1およびABC66952.1はマウス14G8軽鎖と同じカノニカル形態を有する。

0206

ヒトアクセプター抗体配列を2つ以上選択する場合、それらのアクセプターの複合体またはハイブリッドを使用でき、ヒト化軽鎖可変領域および重鎖可変領域での様々な位置に使用するアミノ酸を、使用するいずれかのヒトアクセプター抗体配列から取ることができる。例えば、NCBIアクセッションコードBAC02114およびAAX82494.1(配列番号3および4)のヒト成熟重鎖可変領域を、9D5成熟重鎖可変領域のヒト化のためのアクセプター配列として用いた。これらの2つのアクセプターが異なっている位置の例としては、H19位(RまたはK)、H40位(AまたはT)、H44位(GまたはR)、H49位(SまたはA)、H77位(SまたはT)、H82a位(NまたはS)、H83位(RまたはK)、H84位(AまたはS)、およびH89位(VまたはM)が挙げられる。ヒト化型の9D5重鎖可変領域は、上記のいずれかの位置でいずれかのアミノ酸を含み得る。同じように、NCBIアクセッションコードAAD30410.1およびAAX82494.1(それぞれ配列番号63および4)のヒト成熟重鎖可変領域を、14G8成熟重鎖可変領域のヒト化のためのアクセプター配列として用いた。これらの2つのアクセプターが異なっている位置の例としては、H82a位(NまたはS)、H83位(RまたはK)、H84位(AまたはS)、およびH89位(VまたはM)が挙げられる。ヒト化型の14G8重鎖可変領域は、上記のいずれかの位置でいずれかのアミノ酸を含み得る。同じように、NCBIアクセッションコードABA71374.1およびABC66952.1(それぞれ配列番号72および73)のヒト成熟軽鎖可変領域を14G8成熟軽鎖可変領域のヒト化のためのアクセプター配列として用いた。これらの2つのアクセプターが異なっている位置の例としては、L18位(SまたはP)が挙げられる。ヒト化型の14G8軽鎖可変領域は、この位置でいずれかのアミノ酸を含み得る。

0207

ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸が、CDRの立体構造および/または抗原への結合に及ぼすそれらの予想される影響に基づき、選択され得る。そのような予想される影響の調査は、モデリング、特定の位置でのアミノ酸の特徴の検討、または特定のアミノ酸の置換または変異誘発の影響の経験的な観察による。

0208

例えば、あるアミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択したヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なっている場合、ヒトフレームワークのアミノ酸をマウス抗体からの同等のフレームワークのアミノ酸で置換可能であり、その場合、そのアミノ酸は、
(1)直接抗原と非共有結合する;
(2)KabatではなくChothiaによって定義されるCDR領域に隣接するか、そのCDR内にある;
(3)別の方法でCDR領域(例えば、CDR領域の約6Å以内にある)、(例えば、相同な既知の免疫グロブリン鎖で明らかになった構造上で軽鎖もしくは重鎖をモデル化することによって同定される)と相互作用する;または
(4)VL−VH界面に関与する残基である
ことが合理的に予想される。

0209

Queenの米国特許第5,530,101号によって定義されるクラス(1)〜(3)のフレームワーク残基は、カノニカル残基およびバーニヤ残基と代わりに呼ばれることがある。CDRループの立体構造を規程するのに役立つフレームワーク残基は、カノニカル残基と呼ばれることがある(ChothiaおよびLesk,J.Mol.Biol.196:901−917(1987);ThorntonおよびMartin,J.Mol.Biol.263:800−815(1996))。抗原結合ループの立体構造を支え、抗原への抗体の嵌合の微調整に何らかの役割を果たすフレームワーク残基は、バーニヤ残基と呼ばれることがある(FooteおよびWinter,J.Mol.Biol 224:487−499(1992))。

0210

置換の候補となる他のフレームワーク残基は、潜在的なグリコシル化部位を形成する残基である。また別の置換の候補は、ヒト免疫グロブリンのその位置には通常みられないアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の同等の位置からのアミノ酸またはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換できる。

0211

例示的なヒト化抗体は、ヒト化型のマウス9D5抗体または14G8抗体であり、それぞれHu9D5またはHu14G8と称される。マウス9D5抗体は、配列番号1および配列番号16をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域を含む。本発明は、8種類の例示されるヒト化成熟重鎖可変領域、すなわち、Hu9D5VHv1、Hu9D5VHv2、Hu9D5VHv2b、Hu9D5VHv3、Hu9D5VHv3b、Hu9D5VHv4、Hu9D5VHv4b、およびHu9D5VHv5(それぞれ配列番号5〜12)を提供する。本発明はさらに、5種類の例示されるヒト成熟軽鎖可変領域、すなわち、Hu9D5VLv1、Hu9D5VLv2、Hu9D5VLv3、Hu9D5VLv4、およびHu9D5VLv5(それぞれ配列番号19〜23)を提供する。図1に、9D5、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、および様々なヒト化抗体のアライメントを示す。

0212

マウス14G8抗体は、配列番号61および配列番号70をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域を含む。本発明は、3種類の例示されるヒト化成熟重鎖可変領域、すなわち、Hu14G8VHv1、Hu14G8VHv2、およびHu14G8VHv3(それぞれ配列番号64〜66)を提供する。本発明はさらに、3種類の例示されるヒト成熟軽鎖可変領域、すなわち、Hu14G8VLv1、Hu14G8VLv2、およびHu14G8VLv3(それぞれ配列番号74〜76)を提供する。図2に、14G8、マウスモデル抗体、ヒトアクセプター抗体、および様々なヒト化抗体のアライメントを示す。

0213

CDRの立体構造および/または抗原への結合に対する予想される影響、重鎖と軽鎖との間の相互作用を仲介すること、定常領域との相互作用、望ましい翻訳後修飾または望ましくない翻訳後修飾の部位であること、ヒト可変領域配列のその位置には通常みられない残基でありしたがって免疫原となる可能性があること、凝集能を獲得すること、および他の理由などのため、実施例でさらに明記する以下の15個の可変領域フレームワーク位置を、8種類の例示されるHu9D5成熟重鎖可変領域および5種類の例示されるHu9D5成熟軽鎖可変領域での置換の候補として考慮した:H42(G42E)、H47(W47L)、H69(I69F)、H82(M82S)、H82b(S82(b)L)、H108(T108L)、L8(P8A)、L9(L9P)、L18(P18S)、L19(A19V)、L36(Y36F)、L39(K39R)、L60(D60S)、L70(D70A)、およびL74(K74R)。同じように、実施例でさらに明記する以下の11個の可変領域フレームワーク位置を、3種類の例示されるHu14G8成熟重鎖可変領域および3種類の例示されるHu14G8成熟軽鎖可変領域での置換の候補として考慮した:H1(Q1E)、H3(Q3K)、H47(W47L)、H105(Q105T)、L8(P8A)、L9(L9P)、L19(A19V)、L26(N26S)、L36(Y36F)、L60(D60S)、およびL70(D70A)。

0214

別の箇所と同じくここでも、1番目に記載される残基は、KabatCDRまたはCDR−H1の場合はChothia−Kabat CDR複合体をヒトアクセプターフレームワーク(例えば、複合体またはハイブリッドのヒトアクセプターフレームワーク)内に移植することによって形成されるヒト化抗体の残基であり、2番目に記載される残基は、そのような残基を置き換えるのに考慮される残基である。したがって、可変領域フレームワーク内では、1番目に記載される残基はヒト残基であり、CDR内では、1番目に記載される残基はマウス残基である。

0215

例示されるHu9D5抗体は、例示される成熟重鎖可変領域と軽鎖可変領域の任意の順列または組合せ(例えば、VHv1/VLv1またはH1L1、VHv1/VLv2またはH1L2、VHv1/VLv3またはH1L3、VHv1/VLv4またはH1L4、VHv1/VLv5またはH1L5、VHv2/VLv1またはH2L1、VHv2/VLv2またはH2L2、VHv2/VLv3またはH2L3、VHv2/VLv4またはH2L4、VHv2/VLv5またはH2L5、VHv2b/VLv1またはH2bL1、VHv2b/VLv2またはH2bL2、VHv2b/VLv3またはH2bL3、VHv2b/VLv4またはH2bL4、VHv2b/VLv5またはH2bL5、VHv3/VLv1またはH3L1、VHv3/VLv2またはH3L2、VHv3/VLv3またはH3L3、VHv3/VLv4またはH3L4、VHv3/VLv5またはH3L5、VHv3b/VLv1またはH3bL1、VHv3b/VLv2またはH3bL2、VHv3b/VLv3またはH3bL3、VHv3b/VLv4またはH3bL4、VHv3b/VLv5またはH3bL5、VHv4/VLv1またはH4L1、VHv4/VLv2またはH4L2、VHv4/VLv3またはH4L3、VHv4/VLv4またはH4L4、VHv4/VLv5またはH4L5、VHv4b/VLv1またはH4bL1、VHv4b/VLv2またはH4bL2、VHv4b/VLv3またはH4bL3、VHv4b/VLv4またはH4bL4、VHv4b/VLv5またはH4bL5、VHv5/VLv1またはH5L1、VHv5/VLv2またはH5L2、VHv5/VLv3またはH5L3、VHv5/VLv4またはH5L4、およびVHv5/VLv5またはH5L5)を含む。

0216

本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域がヒト化Hu9D5VHv4b(配列番号11)に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を示し、かつヒト化成熟軽鎖可変領域がHu9D5VLv1(配列番号19)に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を示す、ヒト化9D5抗体のバリアントを提供する。いくつかのこのような抗体では、Hu9D5 H4bL1の復帰変異または他の変異の少なくとも1つ、2つ、または3つ全てが保持されている。本発明はまた、他の例示されるヒト化9D5抗体のバリアントも提供する。このようなバリアントは、例示されるヒト化抗体9D5 H1L1、H1L2、H1L3、H1L4、H1L5、H2L1、H2L2、H2L3、H2L4、H2L5、H2bL1、H2bL2、H2bL3、H2bL4、H2bL5、H3L1、H3L2、H3L3、H3L4、H3L5、H3bL1、Hb3L2、H3bL3、Hb3L4、H3bL5、H4L1、H4L2、H4L3、H4L4、H4L5、H4bL1、H4bL2、H4bL3、H4bL4、H4bL5、H5L1、H5L2、H5L3、H5L4、またはH5L5の成熟軽鎖可変領域および成熟重鎖可変領域に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を示す成熟軽鎖可変領域および成熟重鎖可変領域を有する。

0217

いくつかの抗体では、Vh領域中のH42位、H47位、H69位、H82位、H82b位、およびH108位のうち少なくとも1つをそれぞれE、L、F、S、L、およびLが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VHv1でのように、Vh領域中のH47位、H69位、およびH82位をそれぞれL、F、およびSが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VHv2でのように、Vh領域中のH47位、H69位、H82位、およびH82b位をそれぞれL、F、S、およびLが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VHv2bでのように、Vh領域中のH42位、H47位、およびH108位をそれぞれE、L、およびLが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VHv3でのように、Vh領域中のH69位、H82位、およびH82b位をそれぞれF、S、およびLが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VHv3bおよびHu9D5Vhv4bでのように、Vh領域中のH47位およびH108位をそれぞれLが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VHv4でのように、Vh領域中のH82位およびH82b位をそれぞれSおよびLが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VHv5でのように、Vh領域中のH42位、H47位、およびH82b位をそれぞれE、L、およびLが占める。いくつかの抗体では、Vk領域中のL8位、L9位、L18位、L19位、L36位、L39位、L60位、L70位、およびL74位のうち少なくとも1つをそれぞれA、P、S、V、F、R、S、A、およびRが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VLv1でのように、Vk領域中のL36位をFが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VLv3でのように、Vk領域中のL60位をSが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VLv4でのように、Vk領域中のL8位、L9位、L19位、L36位、L39位、L60位、L70位、およびL74位をそれぞれA、P、V、F、R、S、A、およびRが占める。いくつかの抗体では、Hu9D5VLv5でのように、Vk領域中のL8位、L9位、L18位、L19位、L36位、L39位、L60位、L70位、およびL74位をそれぞれA、P、S、V、F、R、S、A、およびRが占める。このようなヒト化抗体のCDR領域は、9D5マウスドナー抗体または上に例示したいずれかのヒト化9D5抗体のCDR領域に同一または実質的に同一であり得る。CDR領域は、任意の従来の定義(例えば、ChothiaまたはChothiaとKabatの複合体)によって定義され得るが、Kabatによって定義されるのが好ましい。

0218

可変領域フレームワークの位置は、特に明記されない限りKabat番号付けに従う。他のこのようなバリアントは通常、少数(例えば、通常1個以下、2個以下、3個以下、5個以下、10個以下、または15個以下)の置換、欠失または挿入により例示されるHu9D5重鎖および軽鎖の配列と異なる。このような差は通常、フレームワーク内にみられるが、CDRにみられることもある。

0219

例示されるHu14G8抗体は、例示される成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域の任意の順列または組合せ(例えば、VHv1/VLv1またはH1L1、VHv1/VLv2またはH1L2、VHv1/VLv3またはH1L3、VHv2/VLv1またはH2L1、VHv2/VLv2またはH2L2、VHv2/VLv3またはH2L3、VHv3/VLv1またはH3L1、VHv3/VLv2またはH3L2、およびVHv3/VLv3またはH3L3)を含む。

0220

本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域がHu14G8VHv2(Hu14G8 H2)(配列番号65)に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を示し、かつヒト化成熟軽鎖可変領域がHu14G8VLv3(Hu14G8 L3)(配列番号76)に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を示す、ヒト化14G8抗体のバリアントを提供する。いくつかのこのような抗体では、Hu14G8 H2L3の復帰変異または他の変異の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ全てが保持されている。本発明はまた、他の例示されるヒト化14G8抗体のバリアントも提供する。このようなバリアントは、例示されるヒト化抗体14G8 H1L1、H1L2、H1L3、H2L1、H2L2、H2L3、H3L1、H3L2、またはH3L3の成熟軽鎖可変領域および成熟重鎖可変領域に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を示す成熟軽鎖可変領域および成熟重鎖可変領域を有する。

0221

いくつかの抗体では、Vh領域中のH1位およびH47位のうち少なくとも1つをそれぞれEおよびLが占める。いくつかの抗体では、Hu14G8VHv2およびHu14G8VHv3でのように、Vh領域中のH1位およびH47位をそれぞれEおよびLが占める。いくつかの抗体では、Vh領域中のH3位およびH105位のうち少なくとも1つをそれぞれKおよびTが占める。いくつかの抗体では、Hu14G8VHv1でのように、Vh領域中のH3位およびH105位をそれぞれKおよびTが占める。いくつかの抗体では、Hu14G8VLv2でのように、Vk領域中のL36位をFが占める。いくつかの抗体では、Vk領域中のL8位、L9位、L19位、L26位、L60位、およびL70位のうち少なくとも1つをそれぞれA、P、V、S、S、およびAが占める。いくつかの抗体では、Hu14G8VLv1でのように、Vk領域中のL8位、L9位、L19位、およびL70位をそれぞれA、P、V、およびAが占める。いくつかの抗体では、Hu14G8VLv3でのように、Vk領域中のL26位およびL60位をそれぞれSが占める。このようなヒト化抗体のCDR領域は、14G8マウスドナー抗体のCDR領域に同一または実質的に同一であり得る。CDR領域は、任意の従来の定義(例えば、ChothiaまたはChothiaとKabatの複合体)によって定義され得るが、Kabatによって定義されるのが好ましい。

0222

可変領域フレームワークの位置は、特に明記されない限りKabat番号付けに従う。他のこのようなバリアントは通常、少数(例えば、通常1個以下、2個以下、3個以下、5個以下、10個以下、または15個以下)の置換、欠失または挿入により例示されるHu14G8の重鎖および軽鎖の配列と異なる。このような差は通常、フレームワーク内にみられるが、CDR内にみられることもある。

0223

ヒト化9D5または14G8での追加の変異として考えられるものは、可変領域フレームワーク中の追加の復帰変異である。ヒト化mAbにおいてCDRと接していないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスmAbまたは他のマウス抗体またはヒト抗体の対応する位置からのアミノ酸の置換を受け入れることができ、多くの潜在的なCDR接触残基もまた置換に適している。CDR内のアミノ酸でさえ、例えば、可変領域フレームワークを供給するのに使用されるヒトアクセプター配列の対応する位置にみられる残基で改変され得る。さらに、代替のヒトアクセプター配列を、例えば重鎖および/または軽鎖に使用できる。異なるアクセプター配列を使用する場合、上で推奨した復帰変異の1つまたは複数は、復帰変異がなくても対応するドナー残基アクセプター残基が既に同じであることを理由に実施されない。

0224

好ましくは、ヒト化9D5または14G8のバリアントにおける置換または復帰変異(保存的であるかどうかを問わず)は、ヒト化mAbの結合親和性にも力価にも、つまり、単量体TTRに結合するその能力に何ら実質的な影響を及ぼさない(例えば、バリアントヒト化9D5抗体または14G8抗体の本発明の実施例に記載されるアッセイのいくつかまたは全部における力価は、マウスの9D5抗体または14G8抗体の力価と実質的に同じである、つまり、実験誤差の範囲内にある)。

0225

D.キメラ抗体およびベニヤ化(veneered)抗体
本発明はさらに、キメラ型およびベニヤ化(veneered)型の非ヒト抗体、具体的には実施例の9D5抗体または14G8抗体を提供する。

0226

キメラ抗体は、非ヒト抗体(例えば、マウス抗体)の軽鎖および重鎖の成熟可変領域がヒト抗体の軽鎖定常領域および重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を実質的にまたは完全に保持しており、約3分の2がヒト配列である。

0227

ベニヤ化(veneered)抗体はヒト化抗体の一種であり、いくつかの、通常は全部のCDRおよび非ヒト抗体の非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部を保持しているが、B細胞エピトープまたはT細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)がヒト抗体配列の対応する位置からの残基に置き換わっている。その結果、抗体はCDRが完全にまたは実質的に非ヒト抗体由来であり、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってさらにヒト抗体様にされる。本発明にはベニヤ化(veneered)型の9D5抗体または14G8抗体が含まれる。

0228

E.ヒト抗体
以下に記載する様々な技術によって単量体TTRまたはそのフラグメント(例えば、TTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号113))に対するヒト抗体が得られる。いくつかのヒト抗体は、特定のマウス抗体、例えば実施例に記載されるマウスモノクローナル抗体の1つなどと同じエピトープ特異性を有するように、上記の競合結合実験により、Winterのファージディスプレイ法により選択される。ヒト抗体はまた、TTRのフラグメント、例えばTTRのアミノ酸残基89〜97のみを含むTTRバリアントなどのみを標的抗原として使用することによって、および/またはTTRバリアントの収集物、例えばTTRのアミノ酸残基89〜97内に様々な変異を有するTTRバリアントなどに対する抗体をスクリーニングすることによって、特定のエピトープ特異性に関してスクリーニングされ得る。

0229

ヒト抗体を作製する方法としては、Oestbergら,Hybridoma 2:361−367(1983);Oestberg,米国特許第4,634,664号;およびEnglemanら,米国特許第4,634,666号のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用(例えば、Lonbergら,国際公開第93/12227号(1993);米国特許第5,877,397号;同第5,874,299号;同第5,814,318号;同第5,789,650号;同第5,770,429号;同第5,661,016号;同第5,633,425号;同第5,625,126号;同第5,569,825号;同第5,545,806号;Neuberger,Nat.Biotechnol.14:826(1996);およびKucherlapati,国際公開第91/10741号(1991)を参照されたい)ならびにファージディスプレイ法(例えば、Dowerら,国際公開第91/17271号;McCaffertyら,国際公開第92/01047号;米国特許第5,877,218号;同第5,871,907号;同第5,858,657号;同第5,837,242号;同第5,733,743号;および同第5,565,332号を参照されたい)が挙げられる。

0230

F.定常領域の選択
キメラ抗体、ベニヤ化(veneered)抗体またはヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部分に連結できる。定常領域の選択は部分的に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、抗体依存性細胞食作用および/または補体依存性細胞傷害を所望するかどうかに左右される。例えば、ヒト同位体のIgG1およびIgG3には補体依存性細胞傷害性があり、ヒトアイソタイプのIgG2およびIgG4にはない。ヒトIgG1およびIgG3はまた、ヒトIgG2およびIgG4よりも強力な細胞仲介性エフェクター機能を誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパであり得る。

0231

軽鎖および/または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端で1つまたは複数のアミノ酸、例えば重鎖のC末端リジンは、分子の一部または全部で欠損しているか、誘導体化されていてよい。定常領域に置換を施して、補体仲介性細胞傷害性またはADCCなどのエフェクター機能を低下または増大させたり(例えば、Winterら,米国特許第5,624,821号;Tsoら,米国特許第5,834,597号;およびLazarら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006を参照されたい)、ヒトでの半減期を長くしたり(例えば、Hintonら,J.Biol.Chem.279:6213,2004を参照されたい)してもよい。例示的な置換としては、抗体の半減期を増大させるための250位のGlnおよび/または428位のLeu(この段落では定常領域にEU番号付けを用いる)が挙げられる。234位、235位、236位および/または237位のいずれかまたは全部での置換は、Fcγ受容体、特にFcγRI受容体に対する親和性を低下させる(例えば、米国特許第6,624,821号を参照されたい)。エフェクター機能を低下させるために、ヒトIgG1の234位、235位、および237位のアラニン置換を用いることができる。いくつかの抗体は、エフェクター機能を低下させるために、ヒトIgG1の234位、235位および237位にアラニン置換を有する。任意選択で、ヒトIgG2の234位、236位および/または237位をアラニンで置換し、235位をグルタミンで置換する(例えば、米国特許第5,624,821号を参照されたい)。いくつかの抗体では、ヒトIgG1のEU番号付けによる241位、264位、265位、270位、296位、297位、322位、329位、および331位の1つまたは複数の位置での変異を用いる。いくつかの抗体では、ヒトIgG1のEU番号付けによる318位、320位、および322位の1つまたは複数の位置での変異を用いる。いくつかの抗体では、234位および/または235位をアラニンで置換し、かつ/または329位をグリシンで置換する。いくつかの抗体では、配列番号102でのように、234位および235位をアラニンで置換する。いくつかの抗体では、アイソタイプはヒトIgG2またはIgG4である。

0232

例示的ヒト軽鎖カッパ定常領域は、配列番号104のアミノ酸配列を有する。配列番号104のN末端アルギニンが除去されていてもよく、その場合、軽鎖カッパ定常領域は配列番号105のアミノ酸配列を有する。例示的ヒトIgG1重鎖定常領域は、配列番号101のアミノ酸配列を有する(C末端リジンの有無を問わず)。抗体は、2つの軽鎖と2つの重鎖とが含まれる四量体として、分離した重鎖、軽鎖として、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFvとして、または重鎖と軽鎖の成熟可変ドメインがスペーサーを介して連結される一本鎖抗体として発現させてもよい。

0233

ヒト定常領域は個体間でアロタイプ変異およびイソアロタイプ変異を示し、つまり、定常領域は1つまたは複数の多型位置で個体によって異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が1つまたは複数の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点でアロタイプとは異なる。したがって、例えば、別の重鎖定常領域はIgG1 G1m3アロタイプのものであり、配列番号103のアミノ酸配列を有する。IgG1 G1m3アロタイプの別の重鎖定常領域は、配列番号102のアミノ酸配列を有する(C末端リジンの有無を問わず)。ヒト定常領域への言及は、任意の天然のアロタイプまたは天然のアロタイプでの位置を占める残基の任意の順列を含む。

0234

G.組換え抗体の発現
抗体発現細胞系(例えば、ハイブリドーマ)を用いてキメラ抗体およびヒト化抗体を作製する方法が多数知られている。例えば、周知の方法を用いて抗体の免疫グロブリン可変領域をクローン化し配列を決定できる。1つの方法では、ハイブリドーマ細胞から調製したmRNAを用いるRTPCRにより重鎖可変VH領域をクローン化する。翻訳開始コドンを含むVH領域リーダーペプチドに対しては、5’プライマーおよびg2b定常領域特異的3’プライマーとしてコンセンサスプライマーを用いる。例示的なプライマーはSchenkによる米国特許公開第2005/0009150号(以下「Schenk」)に記載されている。別個に得た複数のクローンの配列を比較して、増幅の際に変化が導入されないことを確実にできる。VH領域の配列はまた、5’RACE RT−PCR法および3’g2b特異的プライマーによって得られるVHフラグメントの配列のシーケンシングによって、決定または確認することができる。

0235

軽鎖可変VL領域は同じようにクローン化できる。1つの方法では、翻訳開始コドンを含むVL領域にハイブリダイズするよう設計した5’プライマーおよびV−J連結領域下流のCk領域に特異的な3’プライマーを用いるVL領域の増幅のために、コンセンサスプライマーセットを設計する。第二の方法では、5’RACERT−PCR法を用いてVLをコードするcDNAをクローン化する。例示的なプライマーは上記のSchenkに記載されている。次いで、クローン化した配列を、ヒト(またヒト以外の種)の定常領域をコードする配列と組み合わせる。ヒト定常領域をコードする例示的な配列としては、ヒトIgG1定常領域(配列番号103)をコードする配列番号106、ならびにヒトカッパ軽鎖定常領域(それぞれ配列番号104および105)をコードする配列番号107および108が挙げられる。

0236

1つの方法では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれのVDJ連結部またはVJ連結部の下流にスプライスドナー配列をコードするよう再設計し、哺乳動物発現ベクター中に、例えば重鎖はpCMV−hγ1中に、軽鎖はpCMV−Mcl中にクローン化する。これらのベクターは、挿入した可変領域カセットの下流のエキソンフラグメントとしてヒトγ1およびCk定常領域をコードする。配列を検証した後、重鎖および軽鎖の発現ベクターをCHO細胞中に共トランスフェクトしてキメラ抗体を産生させることができる。トランスフェクションから48時間後に馴化培地収集し、ウエスタンブロット解析により抗体産生に関してアッセイするか、ELISAにより抗原結合に関してアッセイする。キメラ抗体は上記のようにヒト化される。

0237

キメラ抗体、ベニヤ化(veneered)抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体は通常、組換え発現によって生産される。組換えポリヌクレオチド構築物は通常、プロモーターなどの天然に結合している発現制御エレメントまたは異種の発現制御エレメントを含む、抗体鎖のコード配列作動可能に連結された発現制御配列を含む。発現制御配列は、真核宿主細胞または原核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトできるベクター中のプロモーター系であり得る。ベクターをしかるべき宿主内に組み込んだ後、ヌクレオチド配列高レベル発現ならびに交差反応抗体の収集および精製に適した条件下で宿主を維持する。

0238

上記の発現ベクターは通常、エピソームとしてまたは宿主染色体DNAと一体になった部分として宿主生物体内で複製できる。発現ベクターは通常、所望のDNA配列で形質転換された細胞を検出できるように、選択マーカー、例えばアンピシリン耐性またはヒグロマイシン耐性を含む。

0239

大腸菌(E.coli)は、抗体、特に抗体フラグメントの発現に有用な原核宿主の1つである。酵母などの微生物も発現に有用である。サッカロミセス(Saccharomyces)は、所望に応じて発現制御配列、複製起点終止配列などを有する適切なベクターを持つ酵母宿主の1つである。典型的なプロモーターとしては、3−ホスホグリセリン酸キナーゼをはじめとする糖分解酵素が挙げられる。誘導性の酵母プロモーターとしてはとりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロームC、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素に由来するプロモーターが挙げられる。

0240

免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドの発現に、哺乳動物細胞を用いることができる。Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)を参照されたい。インタクトの異種タンパク質を分泌できる適切な宿主細胞系が多数開発されており、CHO細胞系、様々なCOS細胞系、HeLa細胞HEK293細胞、L細胞ならびに、Sp2/0およびNS0を含む非抗体産生骨髄腫を含む。細胞は非ヒト細胞であってよい。これらの細胞に用いる発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列(Queenら,Immunol.Rev.89:49(1986))ならびに、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含み得る。発現制御配列は、内在遺伝子サイトメガロウイルスSV40アデノウイルスウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターを含み得る。Coら,J.Immunol.148:1149(1992)を参照されたい。

0241

あるいは、抗体コード配列を導入遺伝子に組み込んで、トランスジェニック動物ゲノム内に導入した後トランスジェニック動物の乳の中に発現させてもよい(例えば、米国特許第5,741,957号;米国特許第5,304,489号;および米国特許第5,849,992号を参照されたい)。適切な導入遺伝子としては、カゼインまたはベータラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に連結された、軽鎖および/または重鎖のコード配列が挙げられる。

0242

目的とするDNAセグメントを含むベクターは、細胞宿主の種類に応じた方法により宿主細胞に導入できる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく用いられ、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーションリポフェクション遺伝子銃、またはウイルスベースのトランスフェクションを用いることができる。哺乳動物細胞の形質転換に用いられる方法としては、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合リポソーム、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられる。トランスジェニック動物の作製には、導入遺伝子をマイクロインジェクションにより受精卵母細胞内に注入するか胚性幹細胞のゲノム内に組み込み、そのような細胞の核を除核卵母細胞内に移入できる。

0243

抗体の重鎖および軽鎖をコードするベクター(1つまたは複数)を細胞培養物中に導入した後、細胞プール無血清培地中で増殖力および産物の品質についてスクリーニングできる。次いで、最も産生量の多い細胞プールをFACSベース単一細胞クローン化に供して、モノクローナル系を作製できる。培地1L当たり7.5g超に相当する、1日当たり50pg/細胞または100pg/細胞超の具体的な産生量を用いることができる。単一細胞クローンにより産生される抗体を濁度、ろ過特性、PAGE、IEF、UVスキャン、HP−SEC、炭水化物オリゴ糖マッピング質量分析ならびに、ELISAまたはBiacoreなどの結合アッセイについて試験できる。次いで、選択したクローンを複数のバイアル貯蔵しのちの使用のために凍結保存する。

0244

発現後、抗体をプロテインA捕捉HPLC精製、カラムクロマトグラフィーゲル電気泳動などを含む当該技術分野の標準的方法に従って精製できる(全般的には、Scopes,Protein Purification(Springer−Verlag,NY,1982)を参照されたい)。

0245

コドン最適化、プロモーターの選択、転写エレメントの選択、ターミネーターの選択、無血清単一細胞クローン化、細胞バンキング、コピー数増幅のための選択マーカーの使用、CHOターミネーター、またはタンパク質力価の向上を含む、抗体の商業的生産の方法論を用いることができる(例えば、米国特許第5,786,464号;同第6,114,148号;同第6,063,598号;同第7,569,339号;国際公開第2004/050884号;同第2008/012142号;同第2008/012142号;同第2005/019442号;同第2008/107388号;同第W02009/027471号;および米国特許第5,888,809号を参照されたい)。

0246

H.抗体スクリーニングアッセイ
抗体に結合アッセイ、機能スクリーニング、TTR沈着物による疾患の動物モデルを用いるスクリーニング、および診療試験を含むいくつかのスクリーニングを実施できる。結合アッセイでは、単量体TTRまたはそのフラグメントに対する特異的結合ならびに、任意選択で親和性およびエピトープ特異性を試験する。例えば、結合アッセイによって、天然のTTR四量体では埋没しており単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRでは露出しているエピトープである、TTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号113)に結合する抗体をスクリーニングできる。抗体はまた、天然のTTRの立体構造ではなく前原線維性の非天然の立体構造のTTRおよびTTRアミロイド原線維を結合する能力についてスクリーニングされる。例えば、抗体は、実施例その他に記載されるように、天然の四量体TTRの解離または脱凝集によって生じる単量体型TTRに結合する能力についてスクリーニングされ、かつ天然の四量体TTRに対してカウンタースクリーニングされる。同じように、抗体はまた、健常組織に対してではなくTTR媒介性アミロイドーシス組織に対するそれらの免疫反応性についてスクリーニングされる。このようなスクリーニングは場合によっては、9D5または14G8(IgG1カッパアイソタイプ)の可変領域を有する抗体などの例示的抗体と競合して実施する。このようなアッセイでは、任意選択で抗体またはTTR標的を固定化する。

0247

機能アッセイは、天然にTTRを発現する細胞またはTTRもしくはそのフラグメントをコードするDNAをトランスフェクトした細胞を含む細胞モデルで実施できる。適切な細胞としては、TTRアミロイド形成が認められる心組織または他の組織に由来する細胞が挙げられる。細胞は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRのレベル低下について(例えば、細胞の抽出物または上清ウエスタンブロッティングまたは免疫沈降によって)または単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRに起因する毒性低下に関してスクリーニングされる。例えば、抗体は、TTRの凝集を阻害もしくは軽減する能力、TTR原線維形成を阻害もしくは軽減する能力、TTR沈着物を減少させる能力、凝集したTTRを除去する能力、またはTTRの非毒性立体構造を安定化する能力について試験される。

0248

その他の機能アッセイを溶液中で実施でき、例えば、溶液中の単量体TTRまたはミスフォールドTTR中間体を抗体と接触させたとき、抗体がTTR原線維形成を妨害または軽減することができるかどうかなどを試験できる。原線維の形成度は、例えば、温度制御ユニットを備えた紫外可視光分光光度計で400nmでの濁度測定によって調べることができる。チオフラビンTもまた、アミロイド原線維の形成度の評価に用いることができる。例えば、5倍モル過剰のチオフラビンTをTTR試料に加え、室温で30分間放置した後、測定を実施できる。チオフラビンTの蛍光蛍光光度計を用いてモニターできる。米国特許出願公開第2014/0056904号を参照されたい。

0249

動物モデルを用いるスクリーニングでは、TTRまたはTTR沈着物の蓄積に関連するヒト疾患模倣する動物モデルにおける徴候または症状を治療または予防する抗体の能力を試験する。このような疾患としては、老人性全身性アミロイドーシス(SSA)、老人性心アミロイドーシス(SCA)、家族性アミロイドニューロパチー(FAP)、家族性アミロイド心筋症(FAC)、および中枢神経系選択性アミロイドーシス(CNSA)などの各種TTRアミロイドーシスが挙げられる。モニターし得る適切な徴候または症状としては、消化管または心臓などの様々な組織でのアミロイド沈着物の存在および程度が挙げられる。アミロイド沈着物の減少度は、しかるべき対照、例えば対照抗体(例えば、アイソタイプが一致する対照抗体)、プラセボを投与した対照動物、または治療を一切実施していない対照動物中のTTRアミロイド沈着物のレベルなどとの比較によって求めることができる。TTRアミロイドーシスに対する活性を試験するための例示的動物モデルは、内在性マウスTtr遺伝子座でのヌル変異と、家族性アミロイド性多発性ニューロパチーと関連するV30M変異を含むヒト変異型TTR遺伝子とを有するマウスモデルである。例えば、Kohnoら,Am.J.Path.150(4):1497−1508(1997);CardosoおよびSaraiva,FASEB J 20(2):234−239(2006)を参照されたい。同様のモデルも存在し、家族性のTTRアミロイドーシスの他のモデルおよび孤発性のTTRアミロイドーシスのモデルがこれに含まれる。例えば、Tengら,Lab.Invest.81(3):385−396(2001);Recent Advances in Transthyretin Evolution,Structure,and Biological Functions,pp.261−280のItoおよびMaeda,Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis(2009)(Springer Berlin Heidelberg)を参照されたい。トランスジェニック動物は、ヒトTTR導入遺伝子、例えばTTRアミロイドーシスに関連する変異を有するTTR導入遺伝子または野生型TTR導入遺伝子などを含み得る。動物モデルでの試験を容易にするため、動物モデルに適した定常領域を有するキメラ抗体を使用できる(例えば、ラットでの抗体の試験にはマウス−ラットキメラを使用し得る)。あるヒト化型の抗体は、対応するマウス抗体またはキメラ抗体がしかるべき動物モデルで効果的であり、かつそのヒト化抗体が同程度の結合親和性(例えば、1.5倍、2倍または3倍などの実験誤差の範囲内で)を有する場合、効果的であると結論付けることができる。

0250

臨床試験では、TTRアミロイドーシスに関連する疾患を有するヒトを対象に安全性および有効性を試験する。

0251

I.核酸
本発明はさらに、上記の重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸(例えば、配列番号40、42、44〜56、87、89、91〜96、および106〜108)を提供する。このような核酸は任意選択で、シグナルペプチドをさらにコードし、定常領域に連結されたシグナルペプチド(例えば、配列番号40および87(重鎖)ならびに配列番号42および89(軽鎖)によってそれぞれコードされ得る配列番号41および88(重鎖)ならびに配列番号43および90(軽鎖)のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド)とともに発現させることができる。コード配列を確実に発現させるため、核酸のコード配列はプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終止シグナルなどの制御配列と作動可能に連結され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、分離形態で存在しても、1つまたは複数のベクター中にクローン化されていてもよい。核酸は、例えば固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのPCRによって合成できる。重鎖と軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内で、1つの連続する核酸として連結されていてもよく、または例えばそれぞれの発現ベクター中にクローン化されて、分離していてもよい。

0252

J.コンジュゲート抗体
病原性形態のTTRでは露出しているが天然の四量体形態のTTRでは露出していない抗原、例えばTTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号113)に特異的に結合するコンジュゲート抗体は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、もしくは原線維形態のTTRの有無の検出;TTRアミロイドーシスと診断された患者の治療に使用される治療剤の有効性のモニタリングおよび評価;TTRの凝集の阻害もしくは軽減;TTR原線維形成の阻害もしくは軽減;TTR沈着物の減少もしくは除去;TTRの非毒性立体構造の安定化;または患者のTTRアミロイドーシスの治療もしくは予防に有用である。例えば、このような抗体は別の治療部分、別のタンパク質、別の抗体、および/または検出可能な標識とコンジュゲートできる。国際公開第03/057838号;米国特許第8,455,622号を参照されたい。

0253

コンジュゲートされる治療部分は、患者の望ましくない病態または疾患、例えばTTRアミロイドーシスを治療、対処寛解、予防、または改善するために使用し得る任意の薬剤であり得る。治療部分としては、例えば、抗体の活性を促進または増強する免疫調節物質または任意の生物学的に活性な薬剤が挙げられる。免疫調節物質は、免疫応答の発現または維持を刺激または抑制する任意の薬剤であり得る。このような治療部分を単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRに特異的な抗体、例えば本明細書に記載される抗体にカップリングすると、カップリングされた治療部分は、非天然の病原性形態のTTRに対して天然の四量体形態のTTRを上回る特異的親和性を有するようになる。このため、コンジュゲート抗体の投与は病原性形態のTTRを含む組織を直接標的とし、周囲の正常な健常組織への損傷は最小限である。これは、毒性が強すぎてそのものを投与できない治療部分に関して特に有用である。さらに、より少量の治療部分を使用できる。

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