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課題・解決手段

本発明は、プロトロンビン吸着剤として所与のBaSO4試薬を用いてプロトロンビンの供給源からトロンビン生産するための方法、並びにトロンビンの調製で用いる所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法に関する。少なくとも一実施形態において、本方法は、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させてBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、続いてBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む。別の実施形態では、本方法は、正常な哺乳類血漿の凝血促進活性に対して評価する工程を含む。

概要

背景

トロンビンは、フィブリノゲンフィブリンへの変換を触媒することによって血液凝固を促進するセリンプロテアーゼである。トロンビンはまた、血小板活性化の原因、並びにそれ自体の生産の調節及び複数のタンパク質分解フィードバック機構を介した抑制の間接的な原因でもある。トロンビンはまた、血漿VIII因子、第V因子、第XI因子、第XIII因子、及びプロテインCの活性化にも関与している。トロンビンは、フィブリノゲンのフィブリンへの変換によって創傷出血を止めるための凝固因子として臨床用途において広く使用されている。トロンビンは、縫合剤共通成分であり、フィブリン糊接着剤、及び封止剤などの2成分性止血系においてフィブリノゲン及びその他の凝固タンパク質と組み合わせて使用されてきた。

トロンビンは、前駆体(酵素原プロトロンビンタンパク質分解活性によって生成される。トロンビンの生産に関しては、プロトロンビンを、中間産物を生成する2つの部位で切断する必要がある。体内におけるプロトロンビンのトロンビンへの変換は、活性化した第X因子及び第V因子を含み、カルシウムイオンの存在下で負に帯電したリン脂質膜上に会合する、プロトロンビナーゼ複合体によって触媒される。

トロンビンは、プロトロンビンの供給源(血漿又は血液画分など)を、プロトロンビンの供給源からプロトロンビンを吸着できる固体吸着剤、例えば、硫酸バリウム(BaSO4)と接触させることによってプロトロンビンから製造され得る。固体吸着剤は、非結合タンパク質などの汚染物質を除去するために、通常、洗浄液を使用して洗浄され、続いて、溶離液を使用してプロトロンビンをそこから溶出する。追加的な任意の精製及び処理工程の後で、溶出されたプロトロンビンを、例えばカルシウムイオンなどの活性化剤を使用した活性化によってトロンビンに変換することができる。

異なるBaSO4試薬(異なる製造業者から入手したBaSO4試薬又は更には特定の製造業者によって生産された試薬の異なるバッチなど)を使用すると、一定量のプロトロンビンの供給源からのトロンビンの収率有意差が見られることが報告されている。

報告では、トロンビン収率の差は、少なくとも部分的に、異なるBaSO4試薬によるプロトロンビンの吸着の変化に起因すること、及び吸着容量は、プロトロンビン吸着のためのBaSO4試薬の選択において重要な要素であることが提唱されてきた。Surgenor及びNeortker(1952)は、特定のBaSO4試薬が、血漿からのプロトロンビンの吸着において他のものよりも効果があると述べ、更にVoss D.(1965)は、プロトロンビン複合体の吸着に異なるBaSO4試薬を使用するとき、同じ量のプロトロンビン(prothormbin)複合体を吸着するのに必要なBaSO4の量に有意差が見られたと指摘し、このことは、それらの結晶構造の違いのためであったと推測した。しかし、本出願人の場合は、BaSO4の異なるバッチの形態を試験して、有意差は判定されなかった。また一部のイオン(例えば、Ca2+)は、異なるBaSO4バッチでの異なる吸着量に寄与することが報告されており、この場合には、BaSO4の異なるバッチにおけるCa2+の存在もそれほど差がなかった。

トロンビン製造業者らは、複数の異なるBaSO4試薬の中から好適なBaSO4試薬を選択する試行錯誤法に頼ることによってトロンビン収率を増加させようと試みている。

概要

本発明は、プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を用いてプロトロンビンの供給源からトロンビンを生産するための方法、並びにトロンビンの調製で用いる所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法に関する。少なくとも一実施形態において、本方法は、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させてBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、続いてBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む。別の実施形態では、本方法は、正常な哺乳類血漿の凝血促進活性に対して評価する工程を含む。

目的

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することは、BaSO4試薬に吸着される間のBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである

効果

実績

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請求項1

プロトロンビン吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、a.前記所与のBaSO4試薬及び前記プロトロンビンの供給源を準備することと、b.前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、c.前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、cの前記評価が前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための前記所与のBaSO4試薬の適合性は、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。

請求項2

プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、請求項1に記載の工程「a」〜「c」を含み、d.プロトロンビン吸着を可能にする条件下で前記好適なBaSO4とプロトロンビンの供給源とを接触させることと、e.溶出緩衝液を使用して、前記BaSO4吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分溶出することと、f.前記溶出した画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を更に含む、方法。

請求項3

プロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法であって、a.前記所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、b.前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、c.前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、cの前記評価が前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンを調製するためのプロセスにおいてプロトロンビン吸着剤として使用するための前記所与のBaSO4試薬の適合性は、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。

請求項4

凝血促進活性を評価することが、凝血促進アッセイを実行することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

前記凝血促進アッセイが、機能アッセイを含む、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記機能アッセイが、凝固アッセイである、請求項5に記載の方法。

請求項7

前記凝固アッセイが、NAPTTアッセイ、APTTアッセイ、及びプロテアーゼ発色アッセイからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記プロトロンビンの供給源が、血漿、又は血漿画分からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

前記血漿が、シュウ酸塩添加血漿を含む、請求項8に記載の方法。

請求項10

前記プロトロンビンの供給源が、哺乳類から採取された血漿を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記哺乳類が、ヒト、ウマウシ、及びブタからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする前記条件が、pH7.4〜8.6を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させることが、約1%(w/v)のBaSO4試薬を前記プロトロンビンの供給源である前記採取された血漿に追加することを含む、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することが、前記BaSO4試薬に吸着される間の前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

「b」の後かつ「c」の前に、前記BaSO4試薬から前記BaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記溶出したBaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

前記BaSO4吸着プロトロンビンからプロトロンビン含有画分を溶出することが、約6.3〜7.4のpHでのカルシウムキレート塩の使用を含む、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記キレート塩が、クエン酸ナトリウムを含む、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記クエン酸ナトリウムの濃度が、約3%(w/v)〜約4.4%(w/v)である、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記プロトロンビンの供給源が、ブタ血漿を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。

請求項20

1つを超えるBaSO4試薬を評価するとき、好適なBaSO4試薬が、プロトロンビンの吸着について選択される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、トロンビン生産の分野、より具体的には、トロンビンの調製においてプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬適合性を評価するための方法に関する。

背景技術

0002

トロンビンは、フィブリノゲンフィブリンへの変換を触媒することによって血液凝固を促進するセリンプロテアーゼである。トロンビンはまた、血小板活性化の原因、並びにそれ自体の生産の調節及び複数のタンパク質分解フィードバック機構を介した抑制の間接的な原因でもある。トロンビンはまた、血漿VIII因子、第V因子、第XI因子、第XIII因子、及びプロテインCの活性化にも関与している。トロンビンは、フィブリノゲンのフィブリンへの変換によって創傷出血を止めるための凝固因子として臨床用途において広く使用されている。トロンビンは、縫合剤共通成分であり、フィブリン糊接着剤、及び封止剤などの2成分性止血系においてフィブリノゲン及びその他の凝固タンパク質と組み合わせて使用されてきた。

0003

トロンビンは、前駆体(酵素原)プロトロンビンのタンパク質分解活性によって生成される。トロンビンの生産に関しては、プロトロンビンを、中間産物を生成する2つの部位で切断する必要がある。体内におけるプロトロンビンのトロンビンへの変換は、活性化した第X因子及び第V因子を含み、カルシウムイオンの存在下で負に帯電したリン脂質膜上に会合する、プロトロンビナーゼ複合体によって触媒される。

0004

トロンビンは、プロトロンビンの供給源(血漿又は血液画分など)を、プロトロンビンの供給源からプロトロンビンを吸着できる固体吸着剤、例えば、硫酸バリウム(BaSO4)と接触させることによってプロトロンビンから製造され得る。固体吸着剤は、非結合タンパク質などの汚染物質を除去するために、通常、洗浄液を使用して洗浄され、続いて、溶離液を使用してプロトロンビンをそこから溶出する。追加的な任意の精製及び処理工程の後で、溶出されたプロトロンビンを、例えばカルシウムイオンなどの活性化剤を使用した活性化によってトロンビンに変換することができる。

0005

異なるBaSO4試薬(異なる製造業者から入手したBaSO4試薬又は更には特定の製造業者によって生産された試薬の異なるバッチなど)を使用すると、一定量のプロトロンビンの供給源からのトロンビンの収率有意差が見られることが報告されている。

0006

報告では、トロンビン収率の差は、少なくとも部分的に、異なるBaSO4試薬によるプロトロンビンの吸着の変化に起因すること、及び吸着容量は、プロトロンビン吸着のためのBaSO4試薬の選択において重要な要素であることが提唱されてきた。Surgenor及びNeortker(1952)は、特定のBaSO4試薬が、血漿からのプロトロンビンの吸着において他のものよりも効果があると述べ、更にVoss D.(1965)は、プロトロンビン複合体の吸着に異なるBaSO4試薬を使用するとき、同じ量のプロトロンビン(prothormbin)複合体を吸着するのに必要なBaSO4の量に有意差が見られたと指摘し、このことは、それらの結晶構造の違いのためであったと推測した。しかし、本出願人の場合は、BaSO4の異なるバッチの形態を試験して、有意差は判定されなかった。また一部のイオン(例えば、Ca2+)は、異なるBaSO4バッチでの異なる吸着量に寄与することが報告されており、この場合には、BaSO4の異なるバッチにおけるCa2+の存在もそれほど差がなかった。

0007

トロンビン製造業者らは、複数の異なるBaSO4試薬の中から好適なBaSO4試薬を選択する試行錯誤法に頼ることによってトロンビン収率を増加させようと試みている。

課題を解決するための手段

0008

本発明は、そのいくつかの実施形態において、プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を用いてプロトロンビンの供給源からトロンビンを生産するための方法、並びに所与のBaSO4試薬とプロトロンビンの供給源を接触させてBaSO4吸着プロトロンビンを得ること、及びいくつかの実施形態においては正常な哺乳類血漿の凝血促進活性に対するBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することによって、トロンビンの調製に用いる所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法に関する。

0009

接触は、本明細書において広義に使用され、結合相互作用がBaSO4と供給源内のプロトロンビンとの間で生じるような、例えば、プロトロンビンの供給源をBaSO4に十分に近接させる、任意のタイプの結合作用を指す。接触には、混合、混和、及び/又はBaSO4への供給源の添加、若しくは供給源へのBaSO4の添加が挙げられるが、これらに限定されない。

0010

本発明では、意外にも、いくつかのBaSO4試薬とのプロトロンビンの接触が、トロンビンへの変換(すなわち、プロトロンビンのその中間生成物及び/又はトロンビンへの変換)を引き起こすことがわかった。これは、生産工程の終了時でトロンビン収率に支障を来す早期変換であることがわかった。

0011

本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、凝血促進活性は、プロトロンビンのその中間生成物及び/又はトロンビンへの変換に続いて発生する。そのような中間生成物は、プロトロンビンのトロンビンへのタンパク質分解変換中に形成され得る。中間生成物の非限定的な例は、プレトロンビン及びメイゾトロンビンである。

0012

本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態は、プロトロンビン吸着剤としての使用に好適なBaSO4試薬を、好ましくは、実規模のトロンビン生産プロセスの一部として所与のBaSO4試薬を吸着剤として使用する前に、特定できるようにする。

0013

具体的には、いくつかの実施形態において、所与のBaSO4試薬のサンプルは、BaSO4吸着プロトロンビンを得るために、プロトロンビンの供給源と接触してそこからプロトロンビンを吸着し、続いて、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が評価される。典型的には、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が低いほど、所与のBaSO4試薬がプロトロンビン吸着剤としての使用により好適である。いくつかの実施形態において、トロンビンを調製するためのプロセスでプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿(例えば、正常なヒト血漿)の凝血促進活性以下であることによって示される。

0014

ヒト血漿などの正常な哺乳類血漿は、様々な凝固試験較正血漿として使用することを意図した、周知のプール又は単一ドナー血漿製剤である。

0015

正常なヒト血漿は、クエン酸カリウム若しくはクエン酸ナトリウム、又はその両方の溶液を加えた、例えば8人又はそれ以上の健康な成人からの全血液体部分をプールすることによって、並びにそれを紫外線露出して細菌性及びウイルス性の汚染物質を破壊することによって得られる無菌血漿であり得る。

0016

正常なヒト血漿は、Unicalibrator calibration Plasma for Coagulation Tests 00625であり得る。

0017

少なくともいくつかの場合において、本明細書に記載される方法は、試行錯誤による好適なBaSO4試薬の選択の必要性を排除する。

0018

本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態は、使用するのに迅速かつ簡便であり、時間及び/又は生産コストの節約を潜在的にもたらす。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態は、所与のプロトロンビンの供給源からのトロンビンの収率の増加を可能にする。

0019

本発明の態様及び実施形態は、以下の本明細書に、及び添付の請求項に記載されている。

0020

本明細書に記載されるいくつかの実施形態の態様によると、プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
a.所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.所与のBaSO4試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
c.の評価がBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される、方法が提供される。

0021

更なる態様によると、プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、上記工程a〜cを含み、
d.プロトロンビン吸着を可能にする条件下で好適なBaSO4とプロトロンビンの供給源とを接触させることと、
e.溶出緩衝液を使用して、BaSO4吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
f.溶出した画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を更に含む方法が、提供される。

0022

いくつかの実施形態において、本方法は、工程「e」に続いて、溶出した画分を採取することを含む。

0023

いくつかの実施形態において、本方法は、プロトロンビンのトロンビンへの早期変換を実質的に回避する。「プロトロンビンからトロンビンへの早期変換」は、工程「d」でのプロトロンビンのトロンビンへの変換を意味する。

0024

多くの場合、本明細書に開示されるような「溶出」という用語は、「脱着」という用語と交換可能である。

0025

一実施形態において、トロンビンの調製におけるBaSO4へのプロトロンビン吸着を可能にする条件は、pH7.4〜8.6及び/又は約1%〜22%(w/v)、例えば約1%の濃度範囲のBaSO4を含む。

0026

一実施形態において、トロンビンの調製中の溶出緩衝液は、クエン酸ナトリウムなどのカルシウムキレート塩を、例えば、3.0〜4.4%(w/v)の濃度で含み、かつ/又は6.3〜7.4のpHを有する。

0027

一実施形態において、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件は、プロトロンビンにカルシウムイオンなどの活性化剤を施すことを含む。

0028

本明細書に記載されるいくつかの実施形態の更なる態様によると、プロトロンビンの供給源からトロンビンの調製に使用するための所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法であって、
a.所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.プロトロンビンの供給源から所与のBaSO4試薬へのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
c.の評価がBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される、方法が提供される。

0029

本発明のいくつかの実施形態の態様によると、プロトロンビン吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
a.所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.所与のBaSO4試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、トロンビンを調製するためのプロセスでプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される。いくつかの実施形態において、c.の評価は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を正常な哺乳類血漿の凝血促進活性と比較することにより行われる。

0030

本発明のいくつかの実施形態の態様によると、プロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法であって、
a.所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.所与のBaSO4試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、トロンビンを調製するためのプロセスでプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される。いくつかの実施形態において、c.の評価は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を正常な哺乳類血漿の凝血促進活性と比較することにより行われる。

0031

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、凝血促進活性を評価することは、凝血促進アッセイを実行することを含む。

0032

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、凝血促進アッセイは、凝固アッセイ(例えば、NAPTTアッセイ、APTTアッセイ)、プロテアーゼ発色アッセイ又は表示アッセイ(例えば、イムノアッセイ)からなる群から選択される機能アッセイなどの機能アッセイを含む。

0033

いくつかの実施形態において、NAPTT比が0.8以上である溶出液を生じたBaSO4試薬は、トロンビンの調製において使用するのに好適であると考えられた。

0034

いくつかの実施形態において、NAPTT比が0.8以下である溶出液を生じる又は凝塊が直ちに目視観察される(カルシウムの添加時に、かつ凝固時間凝固剤測定機で記録可能になるまでに発生する凝固)BaSO4試薬は、トロンビンの調製において使用するのに好適ではないと考えられる。

0035

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、プロトロンビンの供給源は、血漿(シュウ酸塩添加血漿など)又は血漿画分からなる群から選択される。いくつかのそのような実施形態では、プロトロンビンの供給源は、哺乳類(ヒト、ウマウシ、及びブタなど)から採取された血漿を含む。いくつかの実施形態において、プロトロンビンの供給源は、ブタの血漿を含む。いくつかの実施形態において、プロトロンビンの供給源は、リコンビナントプロトロンビンである。いくつかの実施形態において、プロトロンビンの供給源には、ウイルス不活性化処理が施される。例えば、供給源は、溶媒洗剤(SD)処理血漿である。

0036

「溶媒洗剤(SD)ウイルス不活性化処理」は、典型的には、それらの脂質エンベロープを破壊することによって、エンベロープウイルス又は脂質被覆ウイルス不活性化するプロセスを指す。この処理は、洗剤(Triton X−45、Triton X−100又はポリソルベート80など)及び溶媒[トリn−ブチルホスフェート(TnBP)、ジ又はトリアルキルホスフェートなど]の添加によって行うことができる。脂質被覆ウイルスを不活性化するのに使用される溶媒−洗剤の組み合わせは、TnBP及びTriton X−100;polysorbate 80及びコール酸ナトリウム、並びにその他の組み合わせなど、当該技術分野において既知の任意の溶媒−洗剤の組み合わせであってよい。

0037

使用される溶媒(複数可)洗剤(複数可)の濃度は、例えば、米国特許第5094960A号、同第4789545A号で行われるような当該技術分野において一般的に使用されるものであり得る。使用される溶媒(複数可)洗剤(複数可)の濃度は、>0.1%のTnBP及び>0.1%のTriton X−100の組み合わせであり得る。使用される溶媒(複数可)洗剤(複数可)の濃度は、1%のTriton X−100及び0.3%のTnBPの組み合わせであり得る。しかしながら、溶媒/洗剤のその他の組み合わせ、及びその他の好適な条件は、当業者には明らかであろう。

0038

一実施形態では、0.5%のTween−80及び0.15%のTnBPが、SD処理に使用される。pHは、7.4〜8.6の範囲である。この溶液を室温にて1時間にわたってインキュベートする。

0039

一実施形態では、1%のTween−80及び0.3%のTnBPが、SD処理に使用される。pHは、7.4〜8.6の範囲である。この溶液を室温にて6時間にわたってインキュベートする。

0040

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させることは、約1%〜約22%又は約1%〜約10%(w/v)のBaSO4試薬をプロトロンビンの供給源(例えば、採取された血漿)に添加することを含む。いくつかの実施形態では、約1%(w/v)のBaSO4試薬を添加する。

0041

いくつかの実施形態では、所与のBaSO4試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件は、pH7.4〜8.6を含む。いくつかの実施形態では、この条件は、例えば、20℃〜25℃の範囲の室温を含む。

0042

BaSO4試薬によるプロトロンビンの吸着は、バッチ方式で、又はBaSO4を充填したカラムで行うことができる。

0043

一実施形態において、BaSO4によるプロトロンビンの吸着は、バッチ方式で室温にて、例えば25℃にて、2時間にわたってpH7.4〜8.6で行われる。

0044

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することは、BaSO4試薬に吸着される間のBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである。

0045

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、「b」に続いてかつ「c」の前に、BaSO4試薬からBaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することは、溶出したBaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである。いくつかのそのような実施形態において、BaSO4試薬からのBaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの溶出は、BaSO4試薬をpH6.0以上かつ7.0以下で溶離液と接触させることを含む。

0046

いくつかの実施形態では、溶離液のpHは、6.1以上、6.2以上及び更には6.3以上である。いくつかの実施形態では、溶離液のpHは、6.5以下、6.6以下、及び更には6.7以下、又は約pH6.3〜6.7である。いくつかの実施形態では、溶離液のpHは、6.3〜7.4である。

0047

いくつかの実施形態では、溶離液は、キレート塩を含む。いくつかの実施形態では、溶離液中のキレート塩の濃度は、約0.2%(w/v)〜約4.4%(w/v)、又は約3.0%(w/v)〜約4.4%(w/v)である。いくつかの実施形態では、キレート塩は、クエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、溶離液中のクエン酸ナトリウムの濃度は、約0.2%(w/v)〜約4.4%(w/v)、又は約3.0%(w/v)〜約4.4%(w/v)である。

0048

いくつかの実施形態では、所与のBaSO4試薬は、少なくとも75%(w/w)((重量/重量)による)のBaSO4、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97.5%、及び更には少なくとも88%(w/w)のBaSO4を含む試薬である。

0049

別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。加えて、説明、材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、限定することを意図するものではない。本発明を実施する上で、本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができる。

0050

本明細書において使用するとき、用語「所与のBaSO4試薬」は、特定の供給元の特定のロットからのBaSO4試薬を指す。したがって、異なる所与のBaSO4試薬は、異なる供給元によって提供される試薬、又は同じ供給元によって提供される異なるロットの試薬であってもよい。

0051

本明細書において使用するとき、用語「凝血促進活性」は、血液凝固の促進を指す。

0052

本明細書において使用するとき、用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、「有する」、及びその文法的変形は、記載される特徴、完全体、工程、又は構成要素を特定するものとして理解されるが、1つ以上の追加的特徴、完全体、工程、構成要素、又はこれらの群の添加を排除するものではない。これらの用語は、用語「〜からなる」、及び「〜から本質的になる」を包含する。

0053

本明細書において使用するとき、不定詞「a」及び「an」は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、「少なくとも1つの」又は「1つ以上の」を意味する。

0054

本明細書で使用するとき、「約」という用語は、±10%を指す。

図面の簡単な説明

0055

本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、本明細書において記載される。図面と共に説明を読むことにより、本発明のいくつかの実施形態がどのように実施され得るかということが、当業者にとって明らかとなる。図面は、例示的な説明の目的のためであり、実施形態の構造の詳細を、本発明の基本的理解に必要である以上に詳細に示そうとするものではない。明確性のため、図面に示されるいくつかの物体は、縮尺通りではない。

0056

図面の説明
異なる供給元からのBaSO4試薬を使用して生産規模のトロンビンの製造中に調製された実規模のBaSO4吸着プロトロンビンサンプルから得られた溶出液のウエスタンブロット解析を示す。
同じ供給元からの異なるロットのBaSO4試薬を使用して調製された、ブタ血漿から得られた溶出液のウエスタンブロット解析を示す。
異なる供給元からのBaSO4試薬を使用して調製された、ブタ血漿から得られた溶出液のウエスタンブロット解析を示す。

0057

本発明は、そのいくつかの実施形態において、プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法、並びに所与のBaSO4試薬とプロトロンビンの供給源を接触させてBaSO4吸着プロトロンビンを得ること、及びいくつかの実施形態において、正常な哺乳類血漿の凝血促進活性に対するBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することによって、トロンビンの調製で用いる所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法に関する。

0058

本明細書における教示の原理使用法、及び実施は、添付の説明を参照してよりよく理解され得る。この説明を精査することにより、当業者は、過度努力又は実験を行うことなく、本発明を実施することができる。

0059

少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、理解されたいこととして、本発明は、その用途において、以下の説明に記載した構成要素及び/又は方法の構造又は構成の詳細に必ずしも限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法によって実行又は実施することが可能である。本明細書において使用される表現及び用語は、記述的目的のためであり、限定としてみなされるべきではない。

0060

材料及び方法
材料
表1で以下に示されるようなBaSO4試薬が準備された。

0061

0062

塩化ナトリウムは、Sigma−Aldrichから入手した(Cat#S1679、分析グレード、少なくとも99.0重量%)。

0063

クエン酸三ナトリウム二水和物は、Sigma−Aldrichから入手した(Cat#S1804、分析グレード、少なくとも99.0重量%)。シュウ酸塩添加ブタ血液(0.25%(w/w)のシュウ酸塩溶液を含む)は、Kibbutz Lahav,Israelの食肉処理場(abbatoir)から入手した。

0064

BaSO4吸着プロトロンビンは、トロンビンの本格的な生産中に入手され(本明細書では実規模サンプルとも呼ばれる)、プロトロンビンを吸着するために使用されるBaSO4は、表1で上記規定されたBaSO4−試薬A、B1のうちの1つから選択された。

0065

Tween(登録商標)−80は、Sigma−Aldrichから入手した(Cat#P8074、BioXtra、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート)。

0066

トリ−n−ブチルホスフェート(TnBP)は、Merck−Milliporeから入手した(Cat#100002、医薬品グレード)。

0067

フィルタ1.2μmは、Sartorius Stedim India Pvt Ltd.(Bangalore,India)から入手し(Cat#Sartopore(登録商標)2 300)、フィルタ0.45+0.2μmは、Sartorius Stedim India Pvt Ltdから入手した(Cat#Sartopore(登録商標)300)。

0068

ゲル電気泳動に関しては、プレキャストポリアクリルアミドゲルを、Bio−Rad Laboratories Inc.から入手した(Mini−gel 4〜20%は、Cat.#:456−1096から入手した)。

0069

ヒツジ抗ヒトトロンビンは、Affinity Biologicals Inc.(Canada)から入手した(Cat#SAHT−IG)。

0070

抗ヒツジIgGアルカリホスファターゼ抱合体は、Sigma−Aldrichから入手した(Cat#A−5187)。

0071

実施例1:溶媒/洗剤(SD)ウイルス不活性化血漿の調製
シュウ酸塩添加ブタ血液を上で供給した。この血液を、5,000g(5440rpm)の相対遠心力(rcf)及び4℃の温度で15分間にわたって遠心分離した。血漿を含む上清を採取し、アリコート(300〜500mL)に分割し、必要とされるまで−30℃で凍結保存した。

0072

SD処理血漿(「SD血漿」)の調製に関しては、凍結保存した血漿のアリコートを、約1時間にわたって37℃で解凍し、それから1.2μmフィルタ、次いで0.45+0.2μmフィルタを通過させた。0.5%のTween−80及び0.15%(v/v)のTnBPを、SD処理のためにpH7.4〜8.6で添加した。溶液を、室温にて1時間にわたって攪拌し、pHを7.4〜8.6で監視した。

0073

実施例2:ブタSD血漿からのBaSO4吸着プロトロンビンの実験室規模の溶出液の調製
表1に列挙された所与のBaSO4試薬のサンプルにプロトロンビンの供給源として実施例1で上述したSD血漿を接触させた。

0074

具体的には、表1に列挙された6種のBaSO4試薬の1種ずつに関して以下のとおりである。
(i)BaSO4(1%w/v)試薬のサンプルをSD血漿の単位に添加した。
(ii)SD血漿/BaSO4試薬混合物を、磁気攪拌器を使用して25℃で2時間にわたって攪拌し(pH7.4〜8.6)、BaSO4試薬によってSD血漿中のプロトロンビンを吸着させた。
(iii)混合物を、5,000g(5,440rpm)にて、4℃で15分間にわたって遠心分離した。
(iv)上清及び沈降物(BaSO4吸着プロトロンビンを含む)を分離し、各沈降物を必要とされるまで−80℃で別個に保存した。
(v)使用する前に、沈降物を室温(20〜25℃)で15分間にわたって解凍した。
(vi)沈降物を、BaSO4:洗浄緩衝液(w/w)の比1:1.4で洗浄緩衝液(78mM NaCl pH6.9〜7.1)中に再懸濁させ、チューブローラーを使用して室温にて15分間にわたって混合した。
(vii)次に、洗浄緩衝液中の沈降物を5,000g(5,440rpm)にて、4℃で15分間にわたって遠心分離し、上清を採取し、必要とされるまで−80℃で保存した。この工程を2回繰り返した(すなわち、合計3回の洗浄を行った)。
(viii)洗浄工程の後に、洗浄した沈降物(BaSO4吸着プロトロンビンを含む)を、BaSO4:溶出緩衝液(w/w)の比1:1.4で溶出緩衝液(3%クエン酸ナトリウムpH6.3〜6.7)中に再懸濁させ、チューブローラーを使用して15分間にわたって混合した。
(ix)次いで、沈降物/溶出緩衝液を、5,000g(5,440rpm)にて、4℃で15分間にわたって遠心分離した。プロトロンビンを含む溶出液を氷上に定置した清潔な容器の中に採取し、この溶出工程を4回繰り返した(すなわち、合計5回の溶出サイクルを実行した)。
(x)5回の溶出サイクルから得た溶出液(脱着されたプロトロンビンを含む)を単一の溶出液中に混ぜ合わせ、0.2μmのPVDFフィルタによって濾過し、NAPTT又はウエスタンブロットで試験されるまで清潔な容器内に−80℃で保存した。

0075

実施例3:ブタSD血漿からのBaSO4吸着プロトロンビンの実規模の溶出液の調製
ブタ血漿から凍結プロトロンビン吸着BaSO4の実規模サンプルを調製した。

0076

使用されたBaSO4試薬は、表1に定義されたA及びB1であった。

0077

SD処理のために1%のTween−80及び0.3%のTnBPを使用してSDを行った。pHは、7.4〜8.6の範囲であった。溶液を24〜26℃で6時間にわたってSDでインキュベートした。

0078

実規模サンプルでは、工程vは、実験室規模サンプルの対応する工程に代わり、サンプルは工程xまで処理された。

0079

実施例4:溶出液のプロトロンビン及びトロンビン含量のウエスタンブロット解析
ウエスタンブロットアッセイ用のローディング容量を計算するために、及び残留の非結合タンパク質及びその他の汚染物質が洗浄工程(vi及びvii)によって除去されたことを確認するために、ビウレット法を使用して、実施例2及び3で上述のように得られたそれぞれの溶出液(表1の6種のBaSO4試薬のうちの1種に対応するそれぞれの溶出液)中の総タンパク質測定を実行した。

0080

各溶出液からタンパク質のより良好な分解能を得るために、溶出液サンプルから得たタンパク質を、還元条件下でSDS−PAGEグラディエントミニプレキャストゲル(4%〜20%)を使用して分離した。タンパク質を、ゲルからニトロセルロース膜に移した。ウエスタンブロットを、ヒツジ抗ヒトトロンビン及び二次抗体、アルカリホスファターゼに抱合された抗ヒツジIgGを使用して実行した。

0081

いくつかのBaSO4吸着プロトロンビンサンプルが、トロンビンを含んでいたことがわかった(下記「結果」セクション参照)。

0082

実施例5:溶出液の凝血促進活性
基本的にPh.Eur.(2.6.22)に記載されるように非活性化部分トロンボプラスチン時間(NAPTT)アッセイを使用して、ブタSD血漿から調製された8種(実施例2にある6種及び実施例3にある2種)の溶出液の1種ずつの凝血促進活性を評価した。簡潔にかつ当業者に周知のように、NAPTTアッセイは、リン脂質ウサギセファリン)及びカルシウムイオン(CaCl2のままで)を、試験された溶出液又は吸着されたBaSO4吸着プロトロンビンサンプル、及び正常なヒト血漿コントロール[Unicalibrator calibration Plasma for Coagulation Tests 00625](本来プロトロンビンを含む)に同時に添加することを含み、カルシウムイオンは、プロトロンビンのトロンビンへの変換によって試験サンプル中で凝固を開始する。トロンビンは、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリンへの変換によって凝塊形成を引き起こす。凝固時間を、凝固計(START4 Stago machine)を使用して測定する。

0083

より具体的には、4つの試験ウェルのそれぞれに45μLのヒト血漿を加えた。コントロールサンプルについては、2つのコントロールウェルのそれぞれに45μLのTBSアルブミン緩衝液を加え、2つの更なるコントロールウェルのそれぞれに45μLの希釈した試験サンプルを加えた。次いで、4つの試験ウェルのそれぞれに45μLのウサギ脳セファリン0.02%溶液を加え、続いて穏やかに振盪することによってウェルの内容物を混合し、37℃で1分間にわたってインキュベーションを行った。45μLの0.025M CaCl2(予め37℃でインキュベートされた)を全てのウェルに加えることにより反応が開始され、凝固時間を測定した。試験サンプルの凝固時間(秒単位)を正常なヒト血漿コントロールの凝固時間で除して、NAPTT比を計算した。

0084

活性トロンビンが特定された溶出液(実施例4)では、凝固時間が、正常なヒト血漿コントロールの凝固時間よりも実質的に短かったことがわかった。一部の溶出液では、凝固が即時であったことがわかった。一部の溶出液では、凝固時間が450秒超であったことがわかった。

0085

BaSO4 B1及びB2から得られる溶出液は、プロセス終了時に高いトロンビンの収率をもたらしたことがわかった。

0086

結果は、トロンビン生産に好適なBaSO4試薬を特定するためにNAPTTアッセイを使用することができることを示している。

0087

実施例6:ブタSD血漿からのBaSO4吸着プロトロンビンの調製
表1中の6つのBaSO4試薬のそれぞれに関して上記工程(i)〜(ii)を繰り返す。

0088

ブタSD血漿から調製された、吸着されたBaSO4吸着プロトロンビンのサンプルの凝血促進活性を、非活性化部分トロンボプラスチン時間(NAPTT)アッセイを使用して評価する。

0089

結果
ウエスタンブロット解析
BaSO4試薬A及びB1(表1)を使用した溶出液(実施例3)のウエスタンブロット解析を図1に示す。

0090

レーン番号は、以下を表す。
1−MWラダー
2−ヒトプロトロンビン標準
3−BaSO4試薬Aを使用して得られた実規模溶出液
4−BaSO4試薬B1を使用して得られた実規模溶出液
5−ヒトプレトロンビン2標準
6−ヒトαトロンビン標準

0091

図1において、BaSO4試薬B1を使用して得られた実規模溶出液では(レーン4)、プロトロンビンに対応する帯は、はっきり見える。

0092

図1において、BaSO4試薬Aを使用して得られた実規模溶出液では(レーン3)、プロトロンビンに対応する帯は、かろうじて見える。プロトロンビン中間タンパク質並びにαトロンビンに対応するその他の帯は、明らかである。

0093

BaSO4試薬A、B1、及びB2(表1)を使用してブタSD血漿から得られた溶出液(実施例2)のウエスタンブロット解析を図2に示す。

0094

レーン番号は、以下を表す。
1−MWラダー
2−ヒトプロトロンビン標準
3−BaSO4試薬Aを使用して得られた溶出液
4−BaSO4試薬B1を使用して得られた溶出液
5−BaSO4試薬B2を使用して得られた溶出液
6−ヒトαトロンビン標準

0095

図2に示される結果は、同じ製造業者によって供給された異なるロットのBaSO4を使用して得られた溶出液(B1−レーン4、B2−レーン5)が、類似の横縞模様を表示したことを示す。BaSO4試薬A(レーン3)を使用して得られた溶出液を参照として実行した。

0096

BaSO4試薬A、B2、D2、D1及びCを使用してブタSD血漿から得られた溶出液(実施例2)のウエスタンブロット解析を図3に示す。

0097

レーン番号は、以下を表す。
1−MWラダー
2−ヒトプロトロンビン標準
3−BaSO4試薬Aを使用して得られた溶出液
4−BaSO4試薬B2を使用して得られた溶出液
5−BaSO4試薬D2を使用して得られた溶出液
6−BaSO4試薬D1を使用して得られた溶出液
7−BaSO4試薬Cを使用して得られた溶出液
8−ヒトプレトロンビン2標準
9−ヒトαトロンビン標準

0098

図3に示される結果は、医薬品グレードのBaSO4を使用してブタSD血漿から得られた溶出液(C−レーン7、D1−レーン6)は、プロトロンビン及び中間生成物と一致する帯を含む類似の横縞模様を示したことを示す。この横縞模様は、BaSO4試薬Aを使用して得られた溶出液(レーン3)のものと同様であった。ホワイト標準グレードBaSO4を用いて得られた溶出液(「D2」−レーン5)は、プロトロンビンに対応する非常に弱い帯並びに中間生成物及びαトロンビンに対応するより強い帯を示した。試薬B2を使用して得られた溶出液(レーン4)は、最も強いプロトロンビンの帯、及び中間生成物に対応する最も暗い帯を示した。

0099

APPTアッセイの結果

0100

0101

BaSO4試薬A、B1、B2、C、D1、及びD2を使用して得られた実規模及び実験室規模の溶出液に関するNAPTTアッセイの結果を表2に示す。

0102

結果は、プロトロンビン供給源に関係なく、ウエスタンブロットによってトロンビンを殆ど又は全く有しないことが示されたBaSO4試薬B1及びB2が、コントロール血漿より遅い凝固を引き起こしたことを示す。

0103

結果はまた、プロトロンビン供給源に関係なく、ウエスタンブロットによって有意なトロンビン含量を有することが示されたBaSO4試薬Aが、コントロール血漿より速い凝固を引き起こしたことも示す。

0104

異なるBaSO4試薬を使用して血漿から得られたBaSO4吸着プロトロンビンを含む溶出液は、ウエスタンブロットによってタンパク質組成について、及びNAPTTによって凝血促進活性について分析された。

0105

ウエスタンブロット解析結果(図1)は、BaSO4試薬A及びB(それぞれレーン3及び4)を使用して得られたサンプルからの溶出液間での横縞模様の違いを示している。この結果は、試薬Aを使用して得られたサンプル中のプロトロンビンが、トロンビンへ部分変換していたことを示唆するものである。

0106

NAPTT凝固アッセイにおいて、BaSO4試薬Aを使用して得られた溶出液を試験すると直ちに凝塊が形成されたのに対して、試薬Bを使用して得られた溶出液では、450秒後でも凝固は観察されなかった。正常なヒト血漿は、NAPTTアッセイにおいて約200〜300秒以内に凝塊を発生させることが期待されるが、実際に、表2に見られるように観察されたことに留意するべきである。

0107

ブタSD血漿からプロトロンビンを分離するために、かつトロンビン生産のために、様々な異なるBaSO4試薬を使用した。医薬品グレードのBaSO4試薬A、C、及びD1は、低いグレードのBaSO4試薬A及びD2など不満足な結果をもたらしたが、一部の医薬品グレードのBaSO4試薬B1及びB2は、優れた結果を提供する。

0108

結果は、使用された特定のBaSO4試薬が、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性、及びトロンビンの収率に大きな影響を及ぼすことを示した。

0109

プロトロンビンのうち少なくともいくらかが、トロンビン及び/又はトロンビン中間生成物に変換されることも示される。実験結果は、本明細書に記載されるように凝血促進アッセイを使用して、所与のBaSO4試薬が、プロトロンビン吸着剤としての使用及びプロセスの終了時に増大したトロンビンの収率の生成に適しているかどうかを定性的に判定できることを示す。

0110

本発明の特定の特徴は、明確性のために別個の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、単一の実施形態において組み合わせて提示されてもよいことが認識される。逆に、本発明の様々な特徴は、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、別個に、若しくは任意の好適なサブコンビネーションで、又は本発明のその他の記載される実施形態において好適に提供され得る。様々な実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしには動作不可能である場合を除き、これらの実施形態の本質的特徴であるとして考慮されるべきではない。

0111

本発明は、その特定の実施形態と共に記載されてきたが、多くの代替修正、及び変異が当業者には明白であることが、明らかである。したがって、添付の請求項の範囲内にあるこれらの代替、修正、及び変異全てを包含することが意図される。

0112

本出願におけるいずれの参照文献の引用又は指定も、このような文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。

0113

実施例7:BaSO4試薬からのプロトロンビン溶出後のプロトロンビン活性化
BaSO4A及びB1(以下で定義)から溶出されたプロトロンビンを次のように活性化した。

0114

0115

溶出されたプロトロンビン溶液を、CaCl2(6g/リットル)及びグリシン(10g/リットル)と混合し、pHを調整した。次に、溶液を、0.22μMフィルタを通して濾過し、20〜25℃で8時間にわたってインキュベートし、続いて2〜8℃で最大72時間にわたってインキュベーションを行った。吸着剤としてBaSO4B1を使用して得られたトロンビン収率は、吸着剤としてBaSO4Aを使用して得られた収率と比較して約9倍であった。

0116

この実施例は、トロンビン収率を最大にするために、実規模トロンビン製造の前に好適なBaSO4試薬を選択することが有利であることを実証する。

0117

〔実施の態様〕
(1)プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
a.前記所与のBaSO4試薬及び前記プロトロンビンの供給源を準備することと、
b.前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
cの前記評価が前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための前記所与のBaSO4試薬の適合性は、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。
(2) プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、実施態様1に記載の工程「a」〜「c」を含み、
d.プロトロンビン吸着を可能にする条件下で前記好適なBaSO4とプロトロンビンの供給源とを接触させることと、
e.溶出緩衝液を使用して、前記BaSO4吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
f.前記溶出した画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を更に含む、方法。
(3) プロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法であって、
a.前記所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
cの前記評価が前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンを調製するためのプロセスにおいてプロトロンビン吸着剤として使用するための前記所与のBaSO4試薬の適合性は、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。
(4) 凝血促進活性を評価することが、凝血促進アッセイを実行することを含む、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
(5) 前記凝血促進アッセイが、機能アッセイを含む、実施態様4に記載の方法。

0118

(6) 前記機能アッセイが、凝固アッセイである、実施態様5に記載の方法。
(7) 前記凝固アッセイが、NAPTTアッセイ、APTTアッセイ、及びプロテアーゼ発色アッセイからなる群から選択される、実施態様6に記載の方法。
(8) 前記プロトロンビンの供給源が、血漿、又は血漿画分からなる群から選択される、実施態様1〜7のいずれかに記載の方法。
(9) 前記血漿が、シュウ酸塩添加血漿を含む、実施態様8に記載の方法。
(10) 前記プロトロンビンの供給源が、哺乳類から採取された血漿を含む、実施態様1〜9のいずれかに記載の方法。

0119

(11) 前記哺乳類が、ヒト、ウマ、ウシ、及びブタからなる群から選択される、実施態様10に記載の方法。
(12) 前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする前記条件が、pH7.4〜8.6を含む、実施態様1〜11のいずれかに記載の方法。
(13) 前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させることが、約1%(w/v)のBaSO4試薬を前記プロトロンビンの供給源である前記採取された血漿に追加することを含む、実施態様9〜12のいずれかに記載の方法。
(14) 前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することが、前記BaSO4試薬に吸着される間の前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである、実施態様1〜13のいずれかに記載の方法。
(15) 「b」の後かつ「c」の前に、前記BaSO4試薬から前記BaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、
前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記溶出したBaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである、実施態様1〜13のいずれかに記載の方法。

実施例

0120

(16) 前記BaSO4吸着プロトロンビンからプロトロンビン含有画分を溶出することが、約6.3〜7.4のpHでのカルシウムキレート塩の使用を含む、実施態様15に記載の方法。
(17) 前記キレート塩が、クエン酸ナトリウムを含む、実施態様16に記載の方法。
(18) 前記クエン酸ナトリウムの濃度が、約3%(w/v)〜約4.4%(w/v)である、実施態様17に記載の方法。
(19) 前記プロトロンビンの供給源が、ブタ血漿を含む、実施態様1〜18のいずれかに記載の方法。
(20) 1つを超えるBaSO4試薬を評価するとき、好適なBaSO4試薬が、プロトロンビンの吸着について選択される、実施態様1〜19のいずれかに記載の方法。

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