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課題・解決手段

本発明は、成熟ヒトFGF21の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位及び特に180位又は181位に対応する位置にシステイン残基を有するFGF21タンパク質誘導体、並びにこのシステインに結合している側鎖を有するその誘導体に関する。本発明のFGF21誘導体はFGF受容体に対して高い効力を示す。本発明は、そのようなFGF21誘導体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物、並びにFGF21誘導体の医学的使用にも関する。

概要

背景

FGF21は分裂促進的というよりむしろ代謝的効果がある非定型線維芽細胞増殖因子(FGF)のFGF19サブファミリーに属する。FGF21はFGF受容体(FGFR1c、FGFR2c及びFGFR3c)に結合してこれを活性化するが、それが起こるのは非シグナル伝達共受容体ベータクロトー(BKL)の存在下でのみである。BKLの組織特異的発現はFGF21の代謝活性を決定する。FGF21トランスジェニックマウス食事性肥満に対して抵抗性であり、寿命が延びている。FGF21はエネルギー消費グルコース及び脂質代謝代謝調節因子であり、糖尿病及び異脂肪血症に罹っている肥満患者において体重、高血糖及び異脂肪血症を元に戻す大きな潜在力がある。

FGF21はタンパク質分解のためin vivo不安定性被り内在性循環ヒトFGF21のうち不活性なものは半分に上る。活性の消失はC終端の分解により、これらの代謝物大多数がS181ではなくP171で終止する。したがって、C終端領域での代謝分解からの保護は治療FGF21分子には望ましい。C終端領域を操作すれば分解から保護することができるが、現在までのところそのような操作により、操作されたFGF21化合物効力は低下する又は失われるという代償を払っている。FGF21のN終端領域はFGFRに結合し、一方でFGF21のC終端領域はBKLに結合する。C終端アミノ酸トランケートすると効力が著しく失われる。

FGF21の180位[180C]でペグ化するとin vitro活性が劇的に減少する(J. Xuら、Bioconjugate Chemistry(2013)、24巻、915〜925頁)。FcをFGF21のC終端に結合させることから生じるFc融合タンパク質天然のFGF21及びFGF21のN終端Fc融合物よりもはるかに効力が低い(Hechtら、PLoS One 2012年、7巻(11号)、e49345)。

概要

本発明は、成熟ヒトFGF21の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位及び特に180位又は181位に対応する位置にシステイン残基を有するFGF21タンパク質誘導体、並びにこのシステインに結合している側鎖を有するその誘導体に関する。本発明のFGF21誘導体はFGF受容体に対して高い効力を示す。本発明は、そのようなFGF21誘導体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物、並びにFGF21誘導体の医学的使用にも関する。

目的

本発明は物理的安定性が改善されたFGF21誘導体を提供する

効果

実績

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請求項1

FGF21タンパク質誘導体であって、前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位に対応する位置にCys残基を含み、前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合したプロトクターを含み、プロトラクターがChem.1A:HOOC-(CH2)x-CO-*、Chem.1B:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)x-CO-*及びChem.1C:HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*の群から選択されxは8〜18の範囲の整数であり、リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、Chem.2が*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*、*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*及び*-NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO-*から選択され、mは1〜5の範囲の整数であり、Chem.3が*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*であり、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、Chem.4が*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*及び*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*から選択され、mは1〜5の範囲の整数であり、Chem.2、Chem.3、及びChem.4がアミド結合を介して相互接続されており、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びそのCH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位若しくは181位に対応する位置においてCys残基の硫黄原子に接続されているFGF21タンパク質の誘導体、又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステル

請求項2

Chem.1がChem.1a:HOOC-(CH2)16-CO-、*Chem.1b:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)9-CO-*及びChem.1c:HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*の群から選択される、請求項1に記載の誘導体。

請求項3

Chem.2がChem.2a:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、Chem.2b:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*及びChem.2c:*-NH-CH2-シクロヘキサン-CO-*の群から選択される、請求項1又は請求項2に記載の誘導体。

請求項4

Chem.4がChem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*及びChem.4b:*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項5

前記タンパク質が、成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位に対応する位置、例えば、成熟ヒトFGF21の180位に、Cys残基を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項6

タンパク質が、成熟ヒトFGF21(配列番号1)の121位又は168位のうちの1つ又は複数に対応する1つ又は複数の位置にアミノ酸変化を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項7

アミノ酸変化のうちの1つが成熟ヒトFGF21(配列番号1)のN終端に対応する位置におけるAla残基の付加である、請求項1から6のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項8

タンパク質が121Q若しくは168L又は両方等、121Q及び168Lのうちの1つ又は複数を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項9

タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)と少なくとも80%同一性を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項10

プロトラクターが、Chem.1a:HOOC-(CH2)16-CO-*を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項11

リンカーが、Chem.2a:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、Chem.3a:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*、及びChem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*のうちの1つ、2つ又は3つを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項12

リンカーが、1つのChem.2エレメント、2つのChem.3エレメント及び1つのChem.4エレメントからなる、請求項1から11のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項13

誘導体が、a.化合物13から24b.化合物35から41及び/又はc.化合物43から56の群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項14

前記誘導体が、S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物13);S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物14);S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物15);S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物16);S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物17);S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21(化合物18);S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物19);S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物20);S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物21);S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物22);S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物23);S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Met[Cys181]FGF21(化合物24)のうちの1つである、FGF21タンパク質の誘導体。

請求項15

医薬としての使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の誘導体。

請求項16

肥満摂食障害心血管疾患糖尿病合併症等のあらゆる形態の糖尿病及び関連疾患のいずれか1つの処置及び/若しくは予防の方法における使用のための、並びに/又はβ細胞機能を改善することで、脂質パラメータを改善するための、並びに/又は糖尿病進行を遅延する若しくは予防するための、並びに/又は脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の処置及び/若しくは予防のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の誘導体。

技術分野

0001

本発明はFGF21の類似体誘導体、さらに詳細には、167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位に側鎖を有するFGF21の類似体及びその医薬使用に関する。

0002

配列表の参照による組込み
「配列表」という表題付きの配列表は33kbであり、2015年12月21日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術

0003

FGF21は分裂促進的というよりむしろ代謝的効果がある非定型線維芽細胞増殖因子(FGF)のFGF19サブファミリーに属する。FGF21はFGF受容体(FGFR1c、FGFR2c及びFGFR3c)に結合してこれを活性化するが、それが起こるのは非シグナル伝達共受容体ベータクロトー(BKL)の存在下でのみである。BKLの組織特異的発現はFGF21の代謝活性を決定する。FGF21トランスジェニックマウス食事性肥満に対して抵抗性であり、寿命が延びている。FGF21はエネルギー消費グルコース及び脂質代謝代謝調節因子であり、糖尿病及び異脂肪血症に罹っている肥満患者において体重、高血糖及び異脂肪血症を元に戻す大きな潜在力がある。

0004

FGF21はタンパク質分解のためin vivo不安定性被り内在性循環ヒトFGF21のうち不活性なものは半分に上る。活性の消失はC終端の分解により、これらの代謝物大多数がS181ではなくP171で終止する。したがって、C終端領域での代謝分解からの保護は治療FGF21分子には望ましい。C終端領域を操作すれば分解から保護することができるが、現在までのところそのような操作により、操作されたFGF21化合物効力は低下する又は失われるという代償を払っている。FGF21のN終端領域はFGFRに結合し、一方でFGF21のC終端領域はBKLに結合する。C終端アミノ酸トランケートすると効力が著しく失われる。

0005

FGF21の180位[180C]でペグ化するとin vitro活性が劇的に減少する(J. Xuら、Bioconjugate Chemistry(2013)、24巻、915〜925頁)。FcをFGF21のC終端に結合させることから生じるFc融合タンパク質天然のFGF21及びFGF21のN終端Fc融合物よりもはるかに効力が低い(Hechtら、PLoS One 2012年、7巻(11号)、e49345)。

0006

WO 2006/050247、Table 6
WO12010553
WO10029159

先行技術

0007

J. Xuら、Bioconjugate Chemistry(2013)、24巻、915〜925頁
Hechtら、PLoS One 2012年、7巻(11号)、e49345
Needleman、S.B. and Wunsch、C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48巻:443〜453頁
Myers and W. Miller in「Optimal Alignments in Linear Space」CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988) 4巻:11〜17頁
IUPAC(INTERNATIONALUNION OF PURE ANDAPPLIED CHEMISTRY;http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/参照)による推奨セクション3AA-1
Protein Purification、J.-C. Janson and Lars Ryden, editors、VCH Publishers、New York、1989年
Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版(1995)、及び後続する任意の版)
Nishimuraら、in Biochim. Biophys. Acta 1492巻(1号):203〜206頁(2000)

課題を解決するための手段

0008

本発明は、成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合に、167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位のうちの1つに対応する位置に側鎖を有するFGF21誘導体に関する。本発明は、成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合に、180位又は181位のうちの1つに対応する位置に側鎖を有するFGF21誘導体に関する。さらに詳細には、側鎖は成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位に対応するFGF21類似体の位置に共有結合している、又は成熟ヒトFGF21(配列番号1)の181位に対応するFGF21類似体の位置に共有結合している。

0009

更に詳細には、側鎖は成熟ヒトFGF21(配列番号1)の170位、174位若しくは175位に対応するFGF21類似体の位置に共有結合している、又は成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、171位、172位若しくは173位に対応するFGF21類似体の位置に共有結合している。

0010

システインはFGF21類似体の、側鎖が結合する位置に存在している。側鎖はそれが結合しているシステイン残基硫黄原子に共有結合している。側鎖はリンカー及びプロトクターを含む。プロトラクターは脂肪二価酸であってよい。

0011

リンカーは、1つ若しくは複数のgGlu残基、及び/又は1つ若しくは複数のAdo残基(Adoは8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸である)、並びに/又は*-NH基及び*-CO基を組み込んでいる1つ若しくは複数の他のジラジカル等のいくつかのリンカーエレメントを含むことができる。プロトラクターとリンカーはアミド結合を介して接続されている。リンカーはチオエーテル結合を介してFGF21タンパク質の180Cys又は181Cysの硫黄原子に接続されている。

0012

リンカーは、1つ若しくは複数のgGlu残基、及び/又は1つ若しくは複数のAdo残基(Adoは8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸である)、及び/又は1つ若しくは複数のTrxエレメント(TRXはトラネキサム酸である)、及び/又は1つ若しくは複数の*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*、並びに/又は*-NH基及び*-CO基を組み込んでいる1つ若しくは複数の他のジラジカル等のいくつかのリンカーエレメントを含むことができる。プロトラクターとリンカーはアミド結合を介して接続されており、一方でリンカーは167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位のシステインの硫黄原子を介してチオエーテル結合を通じてFGF21タンパク質に接続されている。

0013

本発明のFGF21誘導体に組み込まれているFGF21タンパク質は成熟ヒトFGF21(配列番号1)の類似体であり、この類似体は成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置のうちの1つにシステイン残基を含む。

0014

本発明の誘導体のFGF21類似体は成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合に、全部で30のアミノ酸変化まで有することができ、その成熟ヒトFGF21の180位又は181位の1つにおけるシステイン残基は1アミノ酸変化に値する。最大29の追加の変化は、独立して、1つ若しくは複数の伸長、1つ若しくは複数の挿入、1つ若しくは複数の欠失、及び/又は1つ若しくは複数の置換であってよい。

0015

特に、発明は、第1の態様では、FGF21タンパク質の誘導体であって、前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位に対応する位置にCys残基を含み、前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合したプロトラクターを含み、プロトラクターが
Chem.1A:HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)x-CO-*
Chem.1C:HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
の群から選択され
xは8〜18の範囲の整数であり、リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、
Chem.2が
Chem.2A:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem.2B:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*及び
Chem.2C:*-NH-CH2-シクロヘキサン-CO-*
から選択され、
Chem.3が*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*であり、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.4が
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*及び
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
から選択され、mは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.2、Chem.3、及びChem.4がアミド結合を介して相互接続されており、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びそのCH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位若しくは181位に対応する位置においてCys残基の硫黄原子に接続されているFGF21タンパク質の誘導体、又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステルに関する。

0016

更に詳細には、本発明は、第1の態様では、FGF21タンパク質の誘導体であって、前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置にCys残基、及び成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合最大で30のアミノ酸改変を含み、前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合されたプロトラクターを含み、プロトラクターがChem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*であり、xは10〜18の範囲の整数であり、リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4
Chem.2:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem.3:*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*、及び
Chem.4:*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、mは1〜5の範囲の整数であり、Chem.2、Chem.3及びChem.4がアミド結合を介して相互接続されており、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びそのCH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位若しくは181位に対応する位置においてCys残基の硫黄原子に接続されている、FGF21タンパク質の誘導体に関する。

0017

化合物13から化合物24と命名された本発明の好ましいFGF21誘導体は実験のセクションに開示されている。

0018

化合物13から化合物18と命名された本発明のさらなる好ましいFGF21誘導体は実験のセクションに開示されている。

0019

化合物35から化合物41と命名された本発明のさらなる好ましいFGF21誘導体は実験のセクションに開示されている。

0020

化合物43から化合物56と命名された本発明のさらなる好ましいFGF21誘導体は実験のセクションに開示されている。

0021

さらなる態様では、本発明は、成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位に対応する位置にCys残基を含むFGF21類似体に関する。類似体はヒトFGF21(配列番号1)と高度な同一性を有することが好ましい。同一性の程度は、ヒトFGF21(配列番号1)と比べたアミノ酸置換又は改変の数により記述することができる。

0022

さらなる態様では、本発明は、成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置にCys残基、及び成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合最大で30のアミノ酸改変を含むFGF21類似体に関する。

0023

第3の態様では、本発明は、例えば、摂食障害心血管疾患糖尿病合併症等のあらゆる形態の糖尿病及び関連疾患の処置及び/若しくは予防において使用するための;並びに/又はβ細胞機能を改善することで、脂質パラメータを改善するための;並びに/又は糖尿病進行を遅延する若しくは予防するための;並びに/又は脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の処置及び/若しくは予防のための本発明のFGF21誘導体及び類似体の医薬使用に関する。

0024

本発明のFGF21誘導体は生物学的に活性である。例えば、本発明のFGF21誘導体は非常に強力であり、その上又は代わりに、FGF受容体に非常に良く結合する。その上、又は代わりに、本発明のFGF21誘導体は遅延性薬物動態プロファイルを有する。例えば、本発明のFGF21誘導体は、マウス及び/又はミニブタ静脈内投与された場合非常に長い消失半減期を有する。優れた効力と長い半減期の特定の組合せは高度に望ましいことがある。

0025

成熟ヒトFGF21の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位及び181位のうちの1つに対応する位置に側鎖を含むFGF21誘導体すべてが効力を保持することは興味深い。

0026

その上、又は代わりに、成熟ヒトFGF21の180位及び181位のうちの1つ、特に180位に対応する位置に側鎖を含むFGF21誘導体が高い効力を保持していることが認められる。

0027

以下では、ギリシャ文字はその記号又は対応する和名、例えば、α=アルファ;β=ベータ;ε-イプシロン;γ=ガンマ;ω=オメガ;等により表すことができる。その上、ギリシャ文字のμは"u"により、例えば、μl=ulで、又はμM=uMで表すことができる。

0028

化学式中アステリスク(*)は結合点を指摘している。

0029

本発明は第1の態様では、FGF21タンパク質の誘導体であって、前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位に対応する位置にCys残基を含み、前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合したプロトラクターを含み、プロトラクターが
Chem.1A:HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)x-CO-*
Chem.1C:HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
の群から選択され
xは8〜18の範囲の整数であり、リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、
Chem.2が
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*、
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*及び
*-NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO-*
から選択され、mは1〜5の範囲の整数として独立して選択され、
Chem.3が*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*であり、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.4が
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*及び
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
から選択され、mは1〜5の範囲の整数である、
FGF21タンパク質の誘導体に関する。

0030

さらなる実施形態では、Chem.2は
*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*及び
*-NH-CH2-シクロヘキサン-CO-*
から選択される。

0031

さらなる実施形態では、Chem.2は*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*である。

0032

さらなる実施形態では、Chem.2は*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*である。

0033

さらなる実施形態では、Chem.2は*-NH-CH2-シクロヘキサン-CO-*である。

0034

上記の通り、誘導体は、アミド結合を介して相互接続されたChem.2、Chem.3及びChem.4のそれぞれのうちの少なくとも1つを含む。さらに、リンカーエレメントは指示された配列で連結されている。Chem.2はその*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に接続されており、Chem.4はそのCH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)、又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステルの167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位に対応する位置においてCys残基の硫黄原子に連結されている。

0035

さらなる態様では、本発明は、FGF21タンパク質の誘導体であって、前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置にCys残基、及び成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合最大で30のアミノ酸改変を含み、前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合しているプロトラクターを含み、プロトラクターがChem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*であり、xは10〜18の範囲の整数であり、リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4
Chem2.:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem3.:*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*、及び
Chem4.:*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、mは1〜5の範囲の整数である、FGF21タンパク質の誘導体に関する。Chem.2、Chem.3及びChem.4はアミド結合を介して相互接続されており、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びそのCH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置においてCys残基のチオール基に接続されている。

0036

FGF21タンパク質及び類似体
自然界では、天然のFGF21タンパク質は、分泌のための28アミノ酸のシグナルペプチド一緒に合成される。残りの181アミノ酸からなる成熟FGF21ポリペプチドは、配列番号1として配列表に含まれている。

0037

本発明の誘導体のFGF21タンパク質は、時に、誘導体の「骨格」若しくは「タンパク質骨格」又は「FGF21類似体」と呼ばれることもある。

0038

本明細書で使用される用語「FGF21タンパク質」とは、ヒトFGF21(FGF21(1〜181))の類似体又は変異体のことであり、その配列は配列番号1として配列表に含まれる。配列番号1の配列を有するタンパク質は「天然」FGF21、「成熟」FGF21、及び/又は「成熟ヒト」FGF21と名付けられることもある。

0039

配列表では、配列番号1の成熟ヒトFGF21の最初のアミノ酸残基(ヒスチジン)は番号1と指定される。

0040

FGF21類似体の例は配列番号1のタンパク質であり、これはN終端メチオニンを有し、MetFGF21(配列番号2)とも名付けられる。N終端Metは、成熟ヒトFGF21が大腸菌(E.coli)で発現されるときに付加される。例えば、WO 2006/050247、表6を参照されたい。追加のN終端アミノ酸残基は、成熟ヒトFGF21(配列番号1)の1位のヒスチジンに先行しており、位置番号-1と指定される。配列番号2のMetFGF21の適切な命名法非限定的例は、MetFGF21、[Met]FGF21又は[-1M]FGF21である。

0041

MetFGF21は配列番号1の成熟ヒトFGF21に匹敵する生物活性を示し、実用的な理由から配列番号1の成熟ヒトFGF21に代わって基準化合物として使用されることが多い。MetFGF21のアミノ酸配列は配列番号2として配列表に含まれる。

0042

本明細書では、本発明のFGF21タンパク質は、i)変化しているアミノ酸残基に対応する成熟ヒトFGF21(1〜181)におけるアミノ酸残基(すなわち、成熟ヒトFGF21における対応する位置)の数に、及びii)実際の変化に言及することにより記述することができる。

0043

本発明の態様は、野生型アミノ酸残基がシステイン残基で置き換えられているアミノ酸置換を含むFGF21タンパク質(FGF21類似体)に関する。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位及び181位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位及び175位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の167位、170位、171位、172位、173位、174位、175位及び180位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。

0044

一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の169位、170位、173位、174位、175位、180位及び181位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位、174位、175位及び180位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位、174位、175位、180位及び181位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位、174位、175位及び180位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位、174位及び175位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位、174位、180位及び181位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位、174位及び180位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位及び174位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の180位及び181位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む。

0045

例えば、本発明のFGF21タンパク質は、FGF21(1〜181)(配列番号1)の180位に対応する位置に又はFGF21(1〜181)(配列番号1)の181位に対応する位置にCys残基を含むように定義される。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置にCys残基を含む。一実施形態では、FGF21タンパク質はFGF21(1〜181)(配列番号1)の180位に対応する位置にCys残基を含む。

0046

本発明のFGF21タンパク質のこれらのCys残基はそれぞれCys180及びCys181と名付けることができる。例えば、成熟ヒトFGF21(配列番号1)の181位に対応する位置にCys残基を有する本発明のFGF21タンパク質は、Cys181 FGF21と及び/又は181C FGF21と、代わりに[Cys181]FGF21と及び/又は[181C]FGF21と呼ばれてもよい。

0047

以下は、適切な類似体命名法の非限定的例である。

0048

Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21は成熟ヒトFGF21の類似体を示し、アラニンはN終端に付加されており(すなわち、成熟ヒトFGF21(配列番号1)の-1位に対応する位置のAla)、121位の天然に存在するアスパラギングルタミンで置き換えられており、168位の天然に存在するメチオニンはロイシンで置き換えられており、180位の天然に存在するアラニンはシステインで置き換えられている。

0049

以下はFGF21類似体の誘導体についての適切な命名法の非限定的例である。S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシへプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21は成熟ヒトFGF21(配列番号1)の類似体の誘導体を示しており、Ala[Gln121,Leu168,Cys180]は成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合のアミノ酸変化を示しており、数は成熟FGF21の対応する位置に言及しており、置換成分[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシへプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-は成熟ヒトFGF21(配列番号1)における180位に対応する位置でシステインの硫黄原子に共有結合している。

0050

本発明のFGF21タンパク質は、FGF21(配列番号1)と比べて追加のアミノ酸変化を有していることがあるが、最大30のアミノ酸変化に限定されている。これらの変化は成熟ヒトFGF21(1〜181)(配列番号1)と比較された場合でもあり、これらの変化は1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、伸長、及び/又は欠失を独立して表すことができる。

0051

特定の実施形態では、アミノ酸変化は、FGF21(配列番号1)の-1位、121位、及び168位のうちの1つ又は複数に対応する1つ又は複数の位置にある。

0052

一実施形態では、本発明のFGF21タンパク質は、システインアミノ酸置換に加えて-1Ala、121Gln及び168Leuを含む。

0053

実施形態では、本発明のFGF21タンパク質は、167Cys、170Cys、171Cys、172Cys、173Cys、174Cys、175Cys、180Cys及び181Cysのいずれかに加えて-1Ala、121Gln及び168Leuを含む。本発明の特定のFGF21タンパク質は、実験のセクションで開示される本発明の特定の誘導体にも組み込まれているが、配列表の配列番号8、10、12、14、15、16、17、18、19及び20である。

0054

別の特定の実施形態では、本発明のFGF21タンパク質は、180Cys又は181Cysのいずれかに加えて-1Ala、121Gln、及び168Leuを含む。

0055

本発明の特定のFGF21タンパク質は、実験のセクションで開示される本発明の特定の誘導体にも組み込まれているが、配列表の配列番号8及び配列番号10である。

0056

ある特定の変化を「含む」タンパク質は、成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比較された場合、さらに変化を含むことができる。

0057

上の例から明らかであるように、アミノ酸残基はそのフルネーム、その1文字コード、及び/又はその3文字コードにより識別することができる。これら3つの方法は完全に等価である。

0058

言い回し「に等価な位置」又は「対応する位置」は、成熟ヒトFGF21(配列番号1)を参照することにより変異体FGF21配列中の変化の部位を特徴付けるのに使用することができる。等価な若しくは対応する位置、並びに変化の数は、例えば、単純な手書き及び視認により容易に推定される、及び/又はNeedleman-Wunschアルゴリズムに基づいている「整列させる」等の、標準タンパク質若しくはペプチド整列プログラムを使用することができる。このアルゴリズムはNeedleman、S.B. and Wunsch、C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48巻:443〜453頁、及びthe align program by Myers and W. Miller in「Optimal Alignments in Linear Space」CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988)4巻:11〜17頁に記載されている。整列では、デフォルトスコアリングマトリックスBLOSUM62及びデフォルトアイデンティティマトリックスを使用することができ、ギャップにおける最初の残基についてのペナルティは-12に、又は好ましくは-10に、ギャップにおける追加の残基のペナルティは-2に、好ましくは-0.5に設定し得る。

0059

そのような整列の例は本明細書の下に挿入されており、そこでの配列番号1は成熟ヒトFGF21(配列番号1)であり、配列番号2は類似体Ala[121Q,168L,181C]FGF21(配列番号10)である。このように、計算された同一性は97.8%である。
# 1:FGF21
# 2:Ala[121Q,168L,181C]FGF21
#マトリックス:EBLOSUM62
#ギャップ_ペナルティ:10.0
# イクステンド_ペナルティ:0.5
# 長さ:182
# 同一性:178/182(97.8%)
#類似性:179/182(98.4%)
# ギャップ:1/182(0.5%)
#スコア:952.0

0060

さらなる実施形態では、FGF21タンパク質若しくは類似体又はFGF誘導体のFGF21骨格は、ヒトFGF21(配列番号1)と少なくとも85%同一性等の、少なくとも90%同一性等の、少なくとも92、93、94、95、96、97、98又は99%同一性等の、ヒトFGF21(配列番号1)と少なくとも80%同一性を有する。

0061

用語「タンパク質」とは、アミド(又はペプチド)結合により相互接続されている一連のアミノ酸を含む化合物のことである。

0062

本発明のタンパク質は、ペプチド結合により接続されている少なくとも151成分アミノ酸を含む。特定の実施形態では、タンパク質は少なくとも160、好ましくは少なくとも170、より好ましくは少なくとも180、さらにより好ましくは少なくとも181、又はもっとも好ましくは少なくとも182を含む。追加の特定の実施形態では、タンパク質は、181又は182アミノ酸a)で構成されている、又はb)からなる。

0063

またさらなる特定の実施形態では、タンパク質はペプチド結合により相互接続されたアミノ酸からなる。

0064

アミノ酸は、アミノ基及びカルボン酸基、並びに、任意選択で側鎖と呼ばれることが多い1つ又は複数の追加の基を含む化合物として定義し得る。アミン基は、例えば、一級又は二級アミノ基であってよい。

0065

アミノ酸残基は、ペプチド又はタンパク質に組み込まれるアミノ酸の基である。

0066

特定の実施形態では、本発明のタンパク質のアミノ酸はアルファアミノ酸であり、一級又は二級アミノ基の窒素原子アルファ炭素原子に結合している。

0067

別の特定の実施形態では、本発明のタンパク質のアミノ酸はコード化アミノ酸及び非コード化アミノ酸から選択される。

0068

一実施形態では、本発明のタンパク質のアミノ酸はすべてコード化アミノ酸である。

0069

コード化アミノ酸は、IUPAC(INTERNATIONALUNION OF PURE ANDAPPLIED CHEMISTRY;http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/参照)による推奨のセクション3AA-1の表1通りに定義することができ、そこでは20のコード化アミノ酸についての構造、慣用名、組織名、1及び3文字記号が与えられている。

0070

用語「非コード化アミノ酸」とは、他のすべてのアミノ酸のことである。非コード化アミノ酸の非限定的例は、D-アラニン及びD-ロイシン等のコード化アミノ酸のD-異性体である。

0071

以下では、光学異性体が述べられていないすべての特定のアミノ酸はL-異性体を意味すると理解されるべきであり(他の方法で明記されていなければ)、例えば、特定のアミノ酸グルタミンに言及する場合、これは他の方法で述べられていなければ、L-グルタミンを指すことが意図されている。一方、アミノ酸が実験式(brutto formulas)又は構造式等のより一般的な式により記載される場合、及び立体化学が示されていないとき、これらの式はすべての立体異性体網羅することが意図されている。

0072

当技術分野の一般慣行に従えば、本発明のFGF21タンパク質のN終端は左側に、C終端は右側に示される。

0073

FGF21誘導体
FGF21タンパク質又は類似体という文脈で本明細書で使用される用語「誘導体」とは、明確な数の置換基がタンパク質の1つ又は複数の特定のアミノ酸残基に共有結合されている化学的に改変されたFGF21タンパク質又は類似体を意味する。置換基は側鎖と呼びうる。

0074

特定の実施形態では、側鎖はアルブミン非共有会合を形成し、それにより血流との誘導体の循環を促進し、FGF21誘導体とアルブミンの会合はごくゆっくりと崩壊して活性医薬成分を放出するという事実のせいで、誘導体の作用時間を長引かせる効果も有することができる。

0075

側鎖は本明細書ではプロトラクターと呼ばれる部分を含む。

0076

プロトラクターは、タンパク質への側鎖の結合点と比較して、側鎖の遠隔末端に、又は近傍にあってよい。

0077

またさらなる特定の実施形態では、側鎖はプロトラクターとタンパク質へのその結合点の間にある部分を含み、その部分はリンカーと呼び得る。リンカーは1つ又は複数のリンカーエレメントからなることができる。

0078

特定の実施形態では、側鎖及び/又はプロトラクターは親油性であり、及び/又は生理的pH(7.4)で負に荷電している。

0079

側鎖はアルキル化によりFGF21タンパク質のシステイン残基に共有結合することができる。

0080

好ましい実施形態では、側鎖は、チオエーテル結合とも呼ばれる共有チオール炭素結合(この過程はCysアルキル化と呼ばれる)の形成下、システイン残基のチオール基と反応するハロアセトアミド基として合成され、これで活性化される。このように、チオール基は誘導体には存在せず、側鎖は硫黄原子を通じて連結される。誘導体との関係でチオール基に言及される場合、チオール基はCysアルキル化に先立つシステインのチオール基の一部である硫黄原子として理解されなければならない。

0081

別の実施形態では、側鎖は、共有チオール炭素結合の形成下、システイン残基のチオール基と反応するマレイミド基で活性化される。

0082

本目的のため、用語プロトラクター及びリンカーはこれらの分子の未反応並びに反応形態を含むことができる。一方の形態又は他の形態を意味しているのかどうかは、その用語が使用されている文脈から明らかである。

0083

一態様では、それぞれのプロトラクターは、式Chem.1:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
[式中、xは10〜18の範囲の整数である]
のプロトラクターを含む、又はからなる。

0084

代わりの実施形態では、プロトラクターChem.1は、Chem.1A、Chem.1B及びChem.1C
Chem.1A:HOOC-(CH2)x-CO-*
[式中、xは8〜18の範囲の整数であり]、
Chem.1B:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)x-CO-*
[式中、xは8〜18の範囲の整数であり]、及び
Chem.1C:HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
[式中、xは8〜18の範囲の整数である]
により定義されるプロトラクターの群から選択される。

0085

xにより定義される炭素鎖の長さは異なるChem.1構造体ごとに8〜18まで変化することがあり、下記のように、プロトラクターエレメントの異なるタイプではもっと短い又はもっと長いバージョンが好ましいこともある。

0086

1Aの特定の実施形態では、*-(CH2)x-*とは、xが14〜18等の又は14〜16等の、10〜18の範囲の整数である直鎖アルキレンのことである。

0087

1Aの別の特定の実施形態では、*-(CH2)x-*とは、xが16である直鎖アルキレンのことである。このプロトラクターはC18二価酸、すなわち、18炭素原子を有する脂肪ジカルボン酸と手短に呼ぶことができる。x=16の場合、このリンカーエレメントの構造はChem.1a:
Chem.1a:HOOC-(CH2)16-CO-*
に対応する。

0088

一実施形態では、プロトラクターはChem.1Bである。1Bの実施形態では、*-(CH2)x-*とは、xが8〜14の範囲の整数である直鎖アルキレンのことである。特定の実施形態では、x=9の場合、このリンカーエレメントの構造はChem.1b:
Chem.1b:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)9-CO-*
に対応する。

0089

一実施形態では、プロトラクターはChem.1Cである。1Cの実施形態では、*-(CH2)x-*とは、xが12〜18又は14〜18等の10〜18の範囲の整数である直鎖アルキレンのことである。1Cの特定の実施形態では、x=15の場合、このリンカーエレメントの構造はChem.1c:
Chem.1c:HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
に対応する。

0090

命名法は当技術分野では通常通りであり、例えば、上の式では、*-CO-*とはカルボニル(*-C(=O)-*)のことである。例えば、本明細書のどの式(R-CO-*)でも(Rはそれぞれの式により定義される通りである)、R-CO-*とはR-C(=O)-*のことである。ベンゼンとは、Chem.1BにおいてC1及びC4でそれぞれO-(CH2)x-*及び-COOHにより置き換えられている環状構造のことである。HO-S(=O)2はスルホン酸を記述する。

0091

本発明の誘導体のリンカーは、リンカーエレメント、Chem.2、Chem.3及びChem.4のうちの少なくとも1つを含む。エレメントChem.2とChem.3は両方とも-NH-及びCO-末端を保持しており、このため、これらのエレメントがアミド結合により互いに及びプロトラクター又はChem.4の-CO-又は-NH-のどちらかに連結されることが可能である。

0092

Chem.4は、Chem.2又はChem.3とアミド結合を形成することができる-NH-末端及び-NH-CO-CH2末端を有しており、これは未反応形態では、FGF21類似体のシステインのチオール基と反応することができるハロアセトアミドである。

0093

本発明の誘導体のリンカーは、リンカーエレメント、Chem.2、Chem.3及びChem.4のうちの少なくとも1つを含み、
Chem.2は
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*、
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*、及び
*-NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO-*
から選択され、mは1〜5の範囲の整数として独立して選択され、
Chem.3は、*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*であり、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.4は
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*及び
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
から選択され、mは1〜5の範囲の整数として独立して選択される。

0094

一実施形態では、Chem.2は*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*であり、mは1、2又は3である。一実施形態では、mは2又は3である。

0095

mが2である実施形態では、リンカーエレメントChem.2は、*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*であるChem.2aと呼ばれることもある。リンカーエレメント*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*は手短に、gGlu、ガンマGlu、又はγ-Gluと呼ばれることもある。gGluでは、別のリンカーエレメントへの接続のために使用されるのはアミノ酸グルタミン酸のガンマカルボキシ基である。一特定の実施形態では、(それぞれの)gGluリンカーエレメントはL型である。

0096

一実施形態では、Chem.2は*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*であり、mは1、2又は3である。一実施形態では、mは2又は3である。リンカーエレメント*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*はスルホン酸誘導体であり、カルボキシ基は別のリンカーエレメントへの接続のために使用される。一実施形態では、mは3であり、リンカーエレメントChem.2はChem.2b:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*と呼ばれることもある。

0097

一実施形態では、Chem.2は*-NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO-*であり、mは1、2又は3である。一実施形態では、mは2又は3である。したがって、Chem.2構造では、シクロヘキサン環はC1及びC4においてそれぞれNH-CH2及びCOで置き換えられる。

0098

一実施形態では、mは1であり、リンカーエレメントChem2はChem.2c:*-NH-CH2-シクロヘキサン-CO-*と呼ばれることもある。このリンカーエレメントはさらにTrxと呼ばれることもある。

0099

Chem.3のリンカーエレメントでは、「k」及び「n」は両方とも1と5の間を変動することができる。k=n=1の場合、このリンカーエレメントの構造はChem.3a:に対応する。

0100

一実施形態では、Chem.3はChem.3a:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*である。Chem.3aのリンカーエレメントは、そのジラジカルであるので、短くAdo(8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)と呼ばれることもある。

0101

Chem.4のリンカーエレメントでは、「m」は1と5の間を変動することができる。一実施形態では、Chem.4は*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*であり、mは1、2、3又は4である。一実施形態では、mは2又は3である。

0102

一実施形態では、Chem.4が*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*でありm=2の場合、このリンカーエレメントの構造はChem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*に対応する。

0103

一実施形態では、Chem.4は*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*であり、mは1、2、3又は4である。一実施形態では、mは2又は3である。一実施形態では、mは4又は5である。

0104

Chem.4が*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*でありm=4の場合、このリンカーエレメントの構造はChem.4b:*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*に対応する。

0105

本発明の誘導体のリンカーはこれら3つの異なる種類のリンカーエレメントのうちの1つ又は複数を含むことができ、それぞれの個々のリンカーエレメントのうちの1つ又は複数も含むことができる。一実施形態では、リンカーは1つのChem.4エレメントのみを含む。一実施形態では、リンカーは、Chem2及びChem.3のそれぞれのうちの1つ又は複数並びに1つのChem.4エレメントのみを含む。

0106

非限定的例として、リンカーは、アミド結合を介して相互接続され、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びそのCO-*末端でFGF21タンパク質の180位又は181位のどちらかにおいてCys残基の硫黄原子に接続されている、1つのChem.2エレメント、2つのChem.3aエレメント、及び1つのChem4エレメントからなることができる。したがって、Chem.4エレメントはChem.2/Chem.3エレメントの-CO-*末端をFGF21システイン類似体の硫黄原子に連結させる。

0107

さらなる例では、リンカーは、アミド結合を介して、指示された配列で相互接続されている2つのChem.2aエレメント等の2つのChem.2エレメント、2つのChem.3aエレメント、及び1つのChem.4エレメントからなることができる。Chem.2エレメントはそこの*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に接続されており、Chem.4はそのCH2-*末端でFGF21タンパク質のCys残基の硫黄原子に接続されている。

0108

一実施形態では、リンカーは、FGF21タンパク質の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位においてCysのチオール基に接続されている。さらなる実施形態では、リンカーは180位又は181位においてCysの硫黄原子に接続されている。

0109

言うまでもなく、よい順番のためだけに、語句「指示された配列で」とは、最初に言及されるリンカーエレメント(ここではChem.2)の*-NH末端がプロトラクターのCO-*末端に接続され、最後に言及されるリンカーエレメント(ここでは、Chem.4)のCO-*末端がFGF21タンパク質の問題のCys残基のチオール基に接続されていることを意味する。

0110

一実施形態では、本発明の誘導体は
a.化合物13〜24
b.化合物35〜41及び/又は
c.化合物43〜56
からなる群から選択される。

0111

さらなる実施形態では、誘導体は化合物13〜24から選択される。

0112

一実施形態では、誘導体は化合物13〜18から選択される。一実施形態では、誘導体は化合物20〜24から選択される。

0113

一実施形態では、誘導体は化合物35〜41から選択される。

0114

一実施形態では、誘導体は化合物43〜56から選択される。一実施形態では、誘導体は化合物43〜44及び46〜54から選択される。一実施形態では、誘導体は化合物44、47及び50〜54から選択される。

0115

Chem.4の代わりに、マレイミド誘導リンカーエレメントを使用することが可能であり、p及びqは1と5の間を変動することができる。

0116

0117

p=q=2の場合、このリンカーエレメントの構造はN-(2-アミノエチル)-3-(-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)プロパンアミドに対応する。

0118

0119

本発明の誘導体は、同じ分子式及び結合原子の配列を有するが、空間におけるその原子の三次元配向のみが異なっている異なる立体異性の形態で存在することができる。本発明の例示された誘導体の立体異性は実験のセクションで、標準命名法を使用してその名称並びに構造で示されている。他の方法で記述されていなければ、本発明は主張される誘導体のすべての立体異性の形態に関する。

0120

機能的特性
本発明のFGF21誘導体は生物学的に活性である。例えば、本発明のFGF21誘導体は非常に強力であり、その上又は代わりに、FGF受容体に非常に良く結合する。その上、又は代わりに、本発明のFGF21誘導体は遅延性の薬物動態プロファイルを有する。例えば、本発明のFGF21誘導体は、マウス及び/又はミニブタに静脈内投与された場合非常に長い消失半減期を有する。優れた効力と長い半減期の特定の組合せは高度に望ましいことがある。

0121

その上、又は代わりに、成熟ヒトFGF21の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位及び181位のうちの1つに対応する位置に本発明の側鎖を含むFGF21誘導体が高度な効力を有することは驚きである。

0122

第1の態様に従えば、FGF21誘導体はFGF21活性を有する。例えば、本発明のFGF21誘導体はヒトFGF受容体に対して驚くほど優れた効力を有する。

0123

第1の特定の実施形態では、効力及び/又は活性とはin vitro効力、すなわち、機能的FGF受容体アッセイにおける性能、さらに詳細には、ヒトFGF受容体を活性化する能力のことである。

0124

in vitro効力は、例えば、ヒトFGF受容体(FGFR1c、FGFR2c又はFGFR3c)及びBKLを発現しているホールセルを用いるアッセイにおいて決定することができる。例えば、ヒトFGF受容体の応答はヒトベータクロトー(BKL)を過剰発現しているHEK(ヒト胚性腎細胞)を使用して測定することができる。HEK293細胞は、FGFR1c及びFGFR3cを含むいくつかのFGF受容体を内因的に発現する。これらの細胞は、共受容体BKLをトランスフェクトされるまで、FGF21に無応答性である。FGF受容体/BKL複合体を活性化すると、MAPK/ERKシグナル伝達経路が活性化され、ERKがリン酸化される。所定の時点でのリン酸化ERK(pERK)のレベルはFGF21の濃度が増すに従って増加する。そのようなアッセイの1つの非限定的例は実施例6に記載されている。

0125

in vitro効力は、マウス3T3-L1脂肪細胞を用いるアッセイにおいて決定することもできる。例えば、FGF21類似体及び誘導体は、グルコースの脂肪細胞内への取込みを増加させるその能力について試験することが可能である。分化した3T3-L1脂肪細胞はFGFR1c及びBKLを内因的に発現する。3T3-L1細胞は、分化により共受容体BKLが発現されるので、分化が終わるまではFGF21に無応答性である。FGFR1c受容体/BKL複合体の活性化によりグルコース輸送体1(GLUT1)の発現が増加し、したがって、FGF21類似体により脂肪細胞内に取り込まれるグルコースの量が用量応答性様式で増加することになる。

0126

EC50値は薬物の効力の尺度として一般に使用されている。EC50値とは、用量応答曲線を参照することにより、ベースラインと最大の間の中間で応答を誘導する問題の化合物の濃度のことである。通俗的に言えば、EC50は最大効果の50%が観察される濃度を表す。本発明の誘導体のin vitro効力は上記の通りに決定することができ、問題の誘導体のEC50を決定することができる。EC50値が低くなるに従って、効力はよくなる。

0127

非限定的例として、本発明のFGF21誘導体は、0%HSAで60nM未満、好ましくは20nM未満、又はさらに好ましくは10nM未満(例えば、実施例6に記載される通りに決定される)のEC50に対応するヒトベータクロトーを過剰発現しているHEK293細胞を使用して測定される効力を有する。

0128

非限定的例として、本発明のFGF21誘導体は、60nM未満、好ましくは20nM未満、又はさらに好ましくは10nM未満(例えば、実施例7に記載される通りに決定される)のEC50に対応する3T3-L1脂肪細胞でのグルコース取込みを使用して測定される効力を有する。

0129

非限定的例として、本発明のFGF21誘導体は、少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%、又はさらに好ましくは少なくとも90%(例えば、実施例7に記載される通りに決定される)の3T3-L1脂肪細胞でのグルコース取込みを使用して測定される有効性Emaxを有する。

0130

非限定的例として、本発明のFGF21誘導体は、60nM未満、好ましくは20nM未満、又はさらに好ましくは10nM未満(例えば、実施例7に記載される通りに決定される)のEC50に対応する3T3-L1脂肪細胞でのグルコース取込みを使用して測定される効力及び少なくとも80%、又はさらに好ましくは少なくとも90%(例えば、実施例7に記載される通りに決定される)の3T3-L1脂肪細胞でのグルコース取込みを使用して測定される有効性Emaxを有する。

0131

第2の特定の実施形態では、効力及び/又は活性とはin vivo効力のことである。本発明のタンパク質及び誘導体はin vivoで強力であり、これはいかなる適切な動物モデルにおいても、並びに臨床試験において当技術分野で公知の通りに決定することができる。

0132

痩せたマウスにおいてFGF21により体重減少が誘導されると、肥満マウスにおいて効果があることが予測されており、したがって、痩せたマウスは優れたスクリーニングモデルと見なされることは以前に示されている。痩せたC57BLマウスは適切な動物モデルの一例であり、体重低下効果はin vivoでそのようなマウスにおいて判定することができる(例えば、実施例9に記載されている通りに決定される)。

0133

第2の態様に従えば、本発明の誘導体は遅延性である。遅延はin vitroで推定する、及び/又は薬物動態in vivo研究から判定することができる。血清アルブミンの存在下でin vitro効力、EC50値が増加すれば、血清アルブミンへの親和性を示しており、これは、動物モデルにおける検査物質の遅延された薬物動態プロファイルを予測する方法となる。遅延は、例えば、マウス又はミニブタへの静脈内投与後に、例えば、消失半減期(t1/2)として決定することができる。

0134

非限定的例として、本発明の誘導体は、マウスへの静脈内投与後、少なくとも1時間、より好ましくは少なくとも3時間、又はもっとも好ましくは少なくとも10時間(例えば、実施例8に記載されている通りに決定される)の消失半減期を有する。

0135

別の非限定的例として、本発明の誘導体は、ミニブタへの静脈内投与後、少なくとも2時間、より好ましくは少なくとも10時間、さらにより好ましくは少なくとも20時間、又はもっとも好ましくは少なくとも50時間(例えば、実施例8に記載されている通りに決定される)の消失半減期を有する。

0136

第3の態様に従えば、本発明の誘導体は遅延性であり、同時に非常に優れた効力を有する。優れた効力/結合と長い半減期の特定の組合せは高度に望ましいことがある。

0137

第4の態様に従えば、本発明の誘導体は優れた生物物理学的特性を有する。これらの特性には、物理的安定性及び/又は可溶性が含まれるがこれらに限定されない。これらの及び他の生物物理学的特性はタンパク質化学の技術分野で公知の標準法を使用して測定することができる。特定の実施形態では、これらの特性は成熟ヒトFGF21と比べた場合改善されている。

0138

本発明の誘導体の追加の特定の実施形態は、実験のセクションの前で「特定の実施形態」と見出しの付いたセクションに記載されている。

0139

FGF21化合物の産生及び精製
タンパク質、例えば、FGF21の産生は当技術分野では周知である。FGF21類似体は、その分子をコードするDNA配列を含有しFGF21類似体の発現を可能にする条件下、適切な栄養培地において、FGF21類似体を発現することができる宿主細胞を培養することを含む方法により産生することができる。FGF21及びその類似体の産生では、いくつかの組換え方法を使用することができる。例えば、大腸菌(Escherichia coli)及び酵母(Saccharomyces cerevisiae)等の微生物においてFGF21を産生するのに使用することができる方法の例は、例えば、WO12010553に開示されている。

0140

本発明のいくつかの誘導体を調製する方法の特定の例は実験部に含まれている。手短に言えば、FGF21類似体はアルキル化によりシステイン残基で誘導体化される。したがって、ハロアセトアミドを用いて調製される側鎖等のチオール反応性側鎖はFGF21類似体と反応させることができる。FGF類似体はシステインのチオール基を保護するシスタミンを用いて調製することができる。そうであれば、類似体は、例えば、類似体をチオール反応性側鎖と反応させる前にホスフィン等の還元剤を用いて還元させる。

0141

本発明のFGF21類似体及び誘導体は、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換アフィニティー疎水性クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動法(例えば、予備等電点電気泳動(IEF)、吸収率較差溶解度(differential solubility)(例えば、硫酸アンモニウム沈殿法)、又は抽出(例えば、Protein Purification、J.-C. Janson and Lars Ryden, editors、VCH Publishers、New York、1989年参照)を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の種々の手法により精製することができる。

0142

投与の様式
用語「処置」とは、他の方法で示されていない又は文脈が明らかに矛盾していなければ、参照疾患、障害、又は状態の予防と最小化の両方を含むことが意味されている(すなわち、「処置」とは、本発明のFGF21誘導体又は本発明のFGF21誘導体を含む組成物の予防的と治療的投与の両方のことである)。

0143

投与の経路は、本発明の化合物を、非経口、例えば、皮下、筋肉内又は静脈内等の身体の所望の又は適切な場所に効果的に輸送するいかなる経路でもよい。代わりに、本発明の化合物は、経口により、に、直腸に、経皮的に、頬側に、下に、又は経鼻的に投与されることが可能である。

0144

医薬組成物
本発明の誘導体又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステルを含む医薬組成物、及び薬学的に許容される賦形剤は当技術分野で公知の通りに調製することができる。

0145

用語「賦形剤」とは広く、活性な治療成分以外の任意の成分のことである。賦形剤は、作用を示さない物質不活性物質、及び/又は医薬的に活性ではない物質でもよい。

0146

賦形剤は、例えば、担体溶媒希釈剤錠剤補助として、並びに/又は活性物質の投与、及び/若しくは吸収を改善するため種々の目的を果たすことができる。

0147

薬学的に活性な成分の種々の賦形剤と一緒の製剤化は当技術分野では公知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版(1995)、及び後続する任意の版)を参照されたい。

0148

本発明のFGF21化合物を含む注射可能な組成物は、必要に応じて成分を溶解し混合して所望の最終製品を与えることを含む製薬業界の従来技法を使用して調製することが可能である。したがって、一手法に従えば、本発明のFGF21化合物は、沈殿を最小限に抑える又は回避するように、適切な緩衝液に適切なpHで溶解させる。注射可能な組成物は、例えば、無菌濾過により無菌にされる。抗菌剤を組成物に添加してもよい。

0149

組成物は安定化製剤であってよい。用語「安定化製剤」とは、物理的及び/又は化学的安定性、好ましくは両方の安定性が増加している製剤のことである。一般に、製剤は、有効期限に達するまで使用及び保存中(推奨される使用及び保存条件に従って)は安定でなければならない。

0150

用語「物理的安定性」とは、共有結合を変化させることがなく、したがって、熱機械的ストレスへの曝露、及び/又は不安定化させる界面及び表面(疎水性表面等の)との相互作用の結果として生物学的に不活性な及び/又は不溶性凝集体及び/又は原線維(fibrillates)を形成するタンパク質の傾向のない物理的状態及びこの変化のことである。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、様々な期間異なる温度で機械的/物理的ストレス(例えば、撹拌)に曝露された後の目視検査により及び/又は濁度測定により及び/又は濃度測定により評価することができる。代わりに、物理的安定性は、例えば、チオフラビンT又は「疎水性パッチプローブ等のタンパク質の立体構造状態の分光学剤(spectroscopic agent)又はプローブを使用して評価することができる。

0151

用語「化学的安定性」とは、無傷のタンパク質と比べて減少した生物学的効力、及び/又は増加した免疫原性効果を潜在的に有する化学的分解産物を形成するタンパク質構造内の共有結合の化学的(特に、共有結合の)変化のことである。化学的安定性は、例えば、SEC-HPLC、RP-HPLC、LCMS、及び/又はペプチドマッピングにより、異なる環境条件への曝露後の様々な時点での化学的分解産物の量を測定することにより評価することが可能である。

0152

一態様では、本発明は物理的安定性が改善されたFGF21誘導体を提供する。一態様では、本発明は化学的安定性が改善されたFGF21誘導体を提供する。

0153

併用処置
本発明に従ったFGF21誘導体を用いた処置は、例えば、糖尿病剤抗肥満剤食欲調節剤(appetite regulating agents)、降圧剤、糖尿病から生じる又はこれと関連する合併症の処置及び/又は予防のための薬剤並びに肥満から生じる又はこれと関連する合併症及び障害の処置及び/又は予防のための薬剤から選択される1つ又は複数の追加の薬学的に活性な物質と組み合わせてもよい。

0155

医薬適応症
本発明は医薬として使用するための本発明の誘導体にも関する。

0156

特定の実施形態では、本発明の誘導体は以下の医学的処置のために使用することができる:
(i)高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害1型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、MODY(若年発症成人型糖尿病)、妊娠糖尿病等のあらゆる形態の糖尿病の予防及び/若しくは処置、並びに/又はHbA1Cの減少のため、
(ii)2型糖尿病の進行等の糖尿病の進行を遅延する若しくは予防する、耐糖能障害(IGT)のインスリン要求性2型糖尿病への進行を遅延する、インスリン抵抗性を遅延する若しくは予防する、及び/又はインスリン非要求性2型糖尿病のインスリン要求性2型糖尿病への進行を遅延する、
(iii)β細胞アポトーシスを減少させる、β細胞機能及び/若しくはβ細胞量を増加させる等のβ細胞機能を改善するため、並びに/又はβ細胞に対するグルコース感受性回復させるため、
(iv)例えば、食物摂取を減らす、エネルギー消費を増やす、体重を減らす、食欲を抑える、満腹を誘うことにより、肥満等の摂食障害の予防及び/又は処置;過度の摂食障害、神経性過食症、及び/又は抗精神病薬若しくはステロイドの投与により誘発される肥満を処置する又は予防する;並びに/或いは変形性関節症及び/又は尿失禁等の肥満の併存疾患の予防及び/又は処置、
(v)腎症等の糖尿病合併症の予防及び/又は処置、
(vi)脂質異常症の予防及び/又は処置、全血清脂質を下げる等の脂質パラメータを改善する;HDLを増やす;小、高密度LDL(small, dense LDL)を下げる;VLDLを下げる;トリグリセリドを下げる;コレステロールを下げる;ヒトにおけるリポタンパク質a(Lp(a))の血漿レベルを下げる;in vitro及び/又はin vivoでアポリポタンパク質a(apo(a))の生成を阻害する;
(vii)シンドロームX、アテローム性動脈硬化症心筋梗塞冠動脈心疾患再灌流障害、脳卒中、脳虚血初期心疾患若しくは初期心血管疾患、左室肥大冠動脈疾患高血圧本態性高血圧急性高血圧緊急症、心筋症心不全運動不耐性急性及び/若しくは慢性心不全不整脈(arrhythmia)、不整脈(cardiac dysrhythmia)、失神(syncopy)、狭心症心臓バイパス及び/若しくはステント再閉塞間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症)、拡張機能障害、並びに/又は収縮機能不全等の心血管疾患の予防及び/若しくは処置;並びに/又は収縮期血圧の低下等血圧の低下;
(viii)脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の予防及び/又は処置;並びに/或いは
(ix)重症疾患患者、重症疾患多発ニューロパチー(CIPNP)患者、及び/又は潜在的CIPNP患者の処置等の重症疾患の予防及び/又は処置;重症疾患若しくはCIPNPの発症の予防;患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防、処置及び/又は治癒;患者が入院中に菌血症敗血症、及び/又は敗血症性ショックに罹る可能性の予防又は減少。

0157

特定の実施形態では、適応症は(i)〜(vii)からなる群から選択される。別の特定の実施形態では、適応症は(i)、(iv)、(vi)及び/又は(vii)からなる群から選択される。適応症:2型糖尿病、及び/又は肥満は特に好ましい。一実施形態では、本発明の化合物は2型糖尿病の処置を目的とする。一実施形態では、本発明の化合物は肥満の処置を目的とする。

0158

特定の実施形態
以下は本発明の特定の実施形態である。
1.FGF21タンパク質の誘導体であって、
前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位に対応する位置にCys残基を含み、
前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合したプロトラクターを含み、
プロトラクターが
Chem.1A:HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)x-CO-*及び
Chem.1C:HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
の群から選択され
xは8〜18の範囲の整数であり、
リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、
Chem.2が
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*、
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*及び
*-NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO-*
から選択され、
mは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.3が*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*であり、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.4が
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*及び
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
から選択され、
mは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.2、Chem.3、及びChem.4がアミド結合を介して相互接続されており、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びそのCH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位若しくは181位に対応する位置においてCys残基の硫黄原子に接続されているFGF21タンパク質の誘導体、又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステル。
2.前記タンパク質が170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位又は181位にCys残基を含む、実施形態1に従った誘導体。
3.前記タンパク質が170位、173位、174位、175位、180位又は181位にCys残基を含む、実施形態1に従った誘導体。
4.Chem.2が
Chem.2a:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem.2b:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*及び
Chem.2c:*-NH-CH2-シクロヘキサン-CO-*
の群から選択される、先行する実施形態のいずれかに従った誘導体。
5.Chem.4が
Chem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*、
Chem.4b:*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*
から選択される、実施形態1に従った誘導体。
6.FGF21タンパク質の誘導体であって、前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置にCys残基、及び成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合最大で30のアミノ酸改変を含み、
前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合しているプロトラクターを含み、
プロトラクターが
Chem.1A:HOOC-(CH2)x-CO-*
[式中、xは10〜18の範囲の整数であり]、
Chem.1B:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)x
[式中、xは8〜18の範囲の整数であり]、及び
Chem.1C:HO-S(=O)2-(CH2)x
[式中、xは10〜18の範囲の整数である]
の群から選択され、
リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4:
Chem.2:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem.3:*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*、及び
Chem.4:*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、mは1〜5の範囲の整数であり、
並びに
Chem.2、Chem.3及びChem.4がアミド結合を介して相互接続されており、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びその-CH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置においてCys残基の硫黄原子に接続されているFGF21タンパク質の誘導体、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
7.Chem.1が
Chem.1a:HOOC-(CH2)16-CO-*、
Chem.1b:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)9-CO-*及び
Chem.1c:HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
の群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
8.FGF21タンパク質の誘導体であって、
前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置にCys残基を含み、前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合したプロトラクターを含み、
プロトラクターが
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
であり、xは10〜18の範囲の整数であり、及び
リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4:
Chem.2:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem.3:*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*、及び
Chem.4:*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、mは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.2、Chem.3及びChem.4がアミド結合を介して相互接続されており、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びそのCH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置においてCys残基の硫黄原子に接続されているFGF21タンパク質の誘導体、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
9.FGF21タンパク質の誘導体であって、
前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置にCys残基、及び成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合最大で30のアミノ酸改変を含み、
前記誘導体がリンカーを介して前記Cys残基に結合しているプロトラクターを含み、
プロトラクターが
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
であり、xは10〜18の範囲の整数であり、
リンカーがChem.2、Chem.3及びChem.4:
Chem.2:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem.3:*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*、及び
Chem.4:*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
のそれぞれのうちの少なくとも1つを含み、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数であり、mは1〜5の範囲の整数であり、
Chem.2、Chem.3及びChem.4がアミド結合を介して相互接続されており、指示された配列で、その*-NH末端でプロトラクターのCO-*末端に、及びそのCH2-*末端で成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位又は181位に対応する位置においてCys残基のチオール基に接続されているFGF21タンパク質の誘導体、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
10.前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の180位に対応する位置にCys残基を含む、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
11.前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合、25等の、20等の、15等の、10等の、8等の、最大で5等の最大で30のアミノ酸改変を有する、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
12.前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合、4又は5のアミノ酸改変を有する、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
13.前記タンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)と比べた場合、4のアミノ酸改変を有する、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
14.前記FGFタンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)と85%等の、90%等の、95%等の少なくとも80%同一性を有する、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
15.前記FGFタンパク質が成熟ヒトFGF21(配列番号1)と97%等の、98%等の、99%等の少なくとも96%同一性を有する、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
16.アミノ酸変化が成熟ヒトFGF21(配列番号1)の121位、168位、180位、又は181位のうちの1つ又は複数に対応する位置のうちの1つ又は複数にある、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
17.アミノ酸変化のうちの1つが成熟ヒトFGF21(配列番号1)のN終端に対応する位置のAla残基の付加である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
18.タンパク質が前記タンパク質のN終端末端にAlaを含む、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
19.タンパク質が121Qを含む、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
20.タンパク質が168Lを含む、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
21.タンパク質が配列番号8又は10のアミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
22.タンパク質が配列番号8、10、12、15、16、17、18、19又は20のアミノ酸配列を有する、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
23.Chem.1が1A又は1Cでありxは12〜18の範囲の整数である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
24.Chem.1が1A又は1Cでありxは14〜16の範囲の整数である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
25.Chem.1が1Bでありxは8〜12の範囲の整数である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
26.xは16である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
27.kは1〜2の範囲の整数である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
28.kは1である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
29.nは1〜2の範囲の整数である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
30.nは1である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
31.Chem.4のmは1〜5の範囲の整数である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
32.Chem.4のmは2である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
33.プロトラクターがChem.1a:HOOC-(CH2)16-CO-*を含む、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
34.プロトラクターがChem.1a:HOOC-(CH2)14-CO-*からなる、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
35.リンカーがChem.3a:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*を含む、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
36.リンカーがChem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*を含む、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
37.リンカーが少なくとも1つのChem.2エレメント、2つのChem.3エレメント、及び1つのChem.4エレメントからなる、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
38.リンカーが1つのChem.2エレメント、2つのChem.3エレメント、及び1つのChem.4エレメントからなる、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
39.リンカーが2つのChem.2エレメント、2つのChem.3エレメント、及び1つのChem.4エレメントからなる、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
40.リンカーが1つのChem.2エレメント、2つのChem.3aエレメント、及び1つのChem.4aエレメントからなる、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
41.誘導体が、
S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物13)

0159

0160

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物14)

0161

0162

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物15)

0163

0164

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物16)

0165

0166

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物17)

0167

0168

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21(化合物18)

0169

0170

;S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物19)

0171

0172

;S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物20)

0173

0174

;S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物21)

0175

0176

;S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物22)

0177

0178

;S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物23)

0179

0180

;S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Met[Cys181]FGF21(化合物24)

0181

0182

のうちの1つである、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
42.誘導体が、
S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物13)

0183

0184

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物14)

0185

0186

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物15)

0187

0188

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物16)

0189

0190

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物17)

0191

0192

;S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイル-アミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21(化合物18)

0193

0194

のうちの1つである、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
43.誘導体が化合物13〜24及び43から56の群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
44.誘導体が化合物35〜41の群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
45.誘導体が化合物13〜24、35〜41及び43から56の群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
46.誘導体が化合物13である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
47.誘導体が化合物14である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
48.誘導体が化合物15である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。誘導体が化合物16である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
49.誘導体が化合物17である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
50.誘導体が化合物18である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
51.誘導体が化合物19である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
52.誘導体が化合物20である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
53.誘導体が化合物21である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
54.誘導体が化合物22である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
55.誘導体が化合物23である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
56.誘導体が化合物24である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
57.誘導体が化合物35である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
58.誘導体が化合物36である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
59.誘導体が化合物37である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
60.誘導体が化合物38である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
61.誘導体が化合物39である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
62.誘導体が化合物40である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
63.誘導体が化合物41である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
64.誘導体が化合物43である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
65.誘導体が化合物44である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
66.誘導体が化合物45である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
67.誘導体が化合物46である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
68.誘導体が化合物47である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
69.誘導体が化合物48である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
70.誘導体が化合物49である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
71.誘導体が化合物50である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
72.誘導体が化合物51である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
73.誘導体が化合物53である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
74.誘導体が化合物54である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
75.誘導体が化合物55である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
76.誘導体が化合物56である、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
77.誘導体がFGF21活性を有する、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
78.誘導体がFGF受容体を活性化することができる、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
79.ミニブタへの静脈内投与後の消失半減期(t1/2)が成熟ヒトFGF21の消失半減期(t1/2)より少なくとも20倍高い、先行する実施形態のいずれか1つに従った誘導体。
80.医薬として使用するための実施形態1〜79のいずれか1つに従った誘導体。
81.肥満、摂食障害、心血管疾患、糖尿病合併症等のあらゆる形態の糖尿病及び関連疾患のいずれか1つの処置及び/若しくは予防のための、並びに/又はβ細胞機能を改善することで、脂質パラメータを改善するための、並びに/又は糖尿病進行を遅延する若しくは予防するための、並びに/又は脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の処置及び/若しくは予防のための方法における使用のための、実施形態1〜79のいずれか1つに従った誘導体。
82.肥満、摂食障害、心血管疾患、糖尿病合併症等のあらゆる形態の糖尿病及び関連疾患の処置及び/若しくは予防のための、並びに/又はβ細胞機能を改善することで、脂質パラメータを改善するための、並びに/又は糖尿病進行を遅延する若しくは予防するための、並びに/又は脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の処置及び/若しくは予防のための医薬の製造における実施形態1〜79のいずれか1つに従った誘導体の使用。
83.実施形態1〜79のいずれかに従った誘導体の薬学的に活性な量を投与することによる、肥満、摂食障害、心血管疾患、糖尿病合併症等のあらゆる形態の糖尿病及び関連疾患を処置する若しくは予防するための、並びに/又はβ細胞機能を改善することで、脂質パラメータを改善するための、並びに/又は糖尿病進行を遅延する若しくは予防するための、並びに/又は脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の処置及び/若しくは予防のための方法。
84.FGF21(1〜181)(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位及び181位のうちの1つに対応する位置におけるシステイン残基による野生型アミノ酸のアミノ酸置換を含むFGF21タンパク質。
85.FGF21タンパク質がFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位、174位、180位及び181位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む、実施形態83に従ったFGF21タンパク質。
86.FGF21タンパク質がFGF21(1〜181)(配列番号1)の170位、173位及び174位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む、実施形態83に従ったFGF21タンパク質。
87.FGF21タンパク質がFGF21(1〜181)(配列番号1)の180位及び181位のうちの1つに対応する位置にCys残基を含む、実施形態83に従ったFGF21タンパク質。
88.FGF21タンパク質が変異体Cys残基に加えて、-1Ala、121Gln及び/又は168Leuを含む、実施形態83に従ったFGF21タンパク質。
89.FGF21タンパク質がFGF21(1〜181)(配列番号1)の167位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、180位及び181位のうちの1つのシステインに加えて、-1Ala、121Gln及び/又は168Leuを含む、実施形態83に従ったFGF21タンパク質。

0195

略字の一覧
AcOD:重水素化アセトン
Ado:8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
BSPP:ビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩
DCM:ジクロロメタン
DMSO:ジメチルスルホキシド
DPBS:ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
EDAC:(3-ジメチルアミノプロピル)エチルカルボジイミド
ELSD:蒸発光散乱検出器
Fmoc:9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Fc:断片、結晶性
GLP-1:グルカゴン様ペプチド-1
gGlu:ガンマグルタミン酸
GLUT1:グルコース輸送体1
HATU:2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
IgG4:免疫グロブリンG4
IBMX:3-イソブチル-1-メチルキサンチン
IPTG:イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
Mtt:4-メチルトリチル
NMR:核磁気共鳴
OtBu:tert-ブチルエステル
PBS:リン酸緩衝食塩水
RF:遅滞係数
Rt:保持時間
RT:室温
tBu:t-ブチル
TCTU:O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N',-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸
TFA:トリフルオロ酢酸
Tris:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン又は2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオール
Trx:トラネキサム酸
UPLC:ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー
ZOSu:N-(ベンジルオキシカルボニルオキシ)スクシンイミド

0196

材料及び方法
検出及び特徴付けの一般的方法
LCMS方法1
試料はおおよそ0.2mg/mlまで希釈し、LCMSシステムに、例えば、3〜5μl注入する。LCMS機器はUPLCシステム及び質量分析計からなる。類似体は脱塩され、おそらく逆相カラム(例えば、C4、C8、C18カラム又はプレカラム)で分離され、0.02〜0.05% TFA(トリフルオロ酢酸)中のアセトニトリルの直線勾配を使用して解析される。機器は較正するべきであり、可能であればロックマススプレー(lock mass spray)の使用により較正するべきである。主クロマトグラフピーク上のMSスペクトルが作成され、インタクト質量(intact mass)はデコンボリューションアルゴリズム(deconvolution algorithm)を使用して再構築される。
LCMS機器設定(Synapt)の例:
陽イオンモード
3000Vキャピラリーポテンシャル
30Vコーン電圧
110℃ソース温度、
250℃デソルベーション温度(desolvation temperature)
25L/時のコーンガス流速(N2)
m/zレンジ200〜3000
コンボリュート質量(Deconvoluted mass)は与えられている

0197

LCMS方法2
システム:Agilent1290インフィニティシリーズUPLCカラム:Aeris WIDEPORE 3.6μXB-C18 2、1×50mm検出器:Agilent Technologies社 LC/MSD TOF6230(G6230A) 検出器設定イオン化法:Agilent Jet Streamソーススキャニングレンジ:m/z 最小 100、m/z 最大 3200リニアリフレクターモードポジティブモード
条件:直線勾配:5%から95%B勾配実行時間:10分0〜8分5〜95%B、8〜9分95%B、9〜9.5分95〜5%B 9.5〜10分5%B流速:0.40ml/分 固定カラム温度:40℃
溶離液A:99.90% H2O、0.02% TFA溶媒B:99.90% CH3CN、0.02% TFA溶媒C:NA
結果仕様及び確認:見出される質量はm<4000の化合物では化合物のm/z((m+z)/z)又はMasshunter WorkstationソフトウェアバージョンB.05.00 Build 5.0.519.13 SP1(Agilent社)を使用する逆重畳積分(deconvolution)の結果としての質量(平均)である。
計算された質量は所望の化合物の平均分子量である。計算されたm/zは所望の化合物の分子量(m+z)/zである。

0198

LCMS方法3
システム:Agilent1290インフィニティシリーズUPLCカラム:PhenomenexAeris widepore 3、6μ C4 50×2、1mm検出器:Agilent Technologies社 LC/MSD TOF6230(G6230A)
検出器設定イオン化法:Agilent Jet Streamソーススキャニングレンジ:m/z 最小 100、m/z 最大 3200リニアリフレクターモードポジティブモード
条件:ステップ勾配:5%から90%B勾配実行時間:10分:0〜1分5〜20%B、1〜7分 20〜90%B、7〜8分90%B、8〜8.5分90〜5%B 8.5〜10分5%B流速:0.40ml/分 固定カラム温度:40℃
溶離液A:99.90% H2O、0.02% TFA溶媒B:99.90% CH3CN、0.02% TFA溶媒C:NA
結果仕様及び確認:見出される質量はm<4000の化合物では化合物のm/z((m+z)/z)又はMasshunter WorkstationソフトウェアバージョンB.05.00 Build 5.0.519.13 SP1(Agilent社)を使用する逆重畳積分の結果としての質量(平均)である。
計算された質量は所望の化合物の平均分子量である。計算されたm/zは所望の化合物の分子量(m+z)/zである。

0199

LCMS方法4
システム:Waters自浄作用システム
カラム:Kinetex C18 4.6mm×50mm
検出器:UV:PDA、ELSD、MS Micromass Quatro micro
検出器設定:イオン化法:ES+、スキャニングレンジ100〜1000、コーン30V、キャピラリー300kV、スキャン時間1.3秒;PDA:210〜400nm;ELSD:ネブライザーヒーター-クーラー70%、ドリフトチューブ57.0℃
条件:直線勾配アセトニトリル/水 20対80から100対0+0.1%FA、勾配実行時間:4.0分、全実行時間:6.0分、流速:1.1ml/分、カラム温度23℃

0200

本発明の化合物の調製
(実施例1)
ヒト成熟FGF21のクローニング及び発現
ヒトFGF21のDNA及びアミノ酸配列は、例えば、Nishimuraら、in Biochim. Biophys. Acta 1492巻(1号):203〜206頁(2000)により開示されている。その配列は、公開データベースからそれぞれ受託番号EMBL:AB021975及びUNIPROT:Q9NSA1でも入手可能である。

0201

成熟ヒトFGF21タンパク質は大腸菌において、シグナルペプチドはないが、付加されたN終端メチオニンがある細胞内タンパク質としてクローニングされ発現された。さらに詳細には、成熟ヒトFGF21(MetがN終端に付加されている)をコードする遺伝子配列は大腸菌発現のためにコドン最適化され、ベクターpET11cのNdeIとBamHI部位の間にクローニングされた。これによりFGF21遺伝子はファージT7プロモーターの制御下に置かれた。発現構築物は大腸菌BL21(DE3)に形質転換された。単一コロニーが選択され、LB+Amp100μg/mLにおいて0.5のCD450まで増殖された。発現は0.3mMのIPTGを用いて37℃で4時間誘導された。細胞の粗抽出物はFGF21発現の解析のために超音波処理により作られた。クーマシー染色SDS-PAGEにより、FGF21の発現が成功したことが示され、FGF21は主にペレット画分で同定された。このようにして発現されたMetFGF21の計算された分子量は19.5kDであるが、MetFGF21はゲル上では25kDタンパク質として移動し、これはおそらくプロリン含有量が大きいためタンパク質の動きが遅くなるせいであろう。

0202

本出願では、MetFGF21は基準化合物として使用される。FGF21が大腸菌発現系を使用して産生される場合、メチオニンがFGF21のN終端に導入される。しかし、これはその生物活性に影響を及ぼすとは考えられておらず、したがって、FGF21とMetFGF21の両方が基準化合物として一般的に使用される。

0203

(実施例2)
FGF21類似体のクローニング及び発現
table 1(表1、2)(実施例3)の類似体についての発現構築物は実施例1に記載されるFGF21成熟発現構築物への変異誘発により作成された。Stratagene社製複数部位変異誘発キットを使用した。実施例1に記載されるのと同じ発現条件も適用した。クーマシーブルー染色SDS-PAGEにより、類似体の発現が成功したことが示された。大腸菌酵素によるMetの切断のせいでN終端アミノ酸残基としてAlaを有するFGF21類似体の発現を可能にするジペプチドMet-Ala N終端からFGF21配列を含む類似体が発現された。

0204

(実施例3)
成熟FGF21及びFGF21類似体の精製
実施例1〜2に記載される成熟FGF21及びFGF21類似体を精製するために、以下の方法又は類似の技法を使用した:
大腸菌細胞ペレットを10mMのリン酸カリウムpH6.0に再懸濁し、800バーの下でホモジナイザーにより2度破壊した。封入体遠心分離(10,000×g、30分間)によりペレット化し、50mMのトリスpH8.0に再可溶化し、任意選択で2Mの尿素及び/又は5mMのシステアミンを添加し、そのスラリーを4℃で一晩撹拌した。カラムにアプライする前に、スラリーは10,000×gで30分間再び遠心分離した。上澄みは陰イオン交換クロマトグラフィー(Q Sepharose Fast Flow resin、GE Healthcare社)上にアプライし、50〜250mM NaClを用いて溶出させた。0.4Mの硫酸アンモニウムを溶出プールに添加し、次にこれを、20mMのトリスpH8.0、0.4Mの硫酸アンモニウム中で平衡化されたPhenylFFカラム(GE Healthcare社)にアプライした。カラムは20mMのトリスpH8.0、1.5Mの塩化ナトリウム洗浄し、その後10%トリス-クロライド緩衝液(20mMのトリスpH8.0、1.5Mの塩化ナトリウム)を用いて溶出した。30Qカラムはさらなる純度ポリッシング(purity polishing)のために使用することが可能である。最終生成物はSDS-PAGE又は他の関連技法により解析された。化合物3及び5〜10では、導入されたシステインのシステアミン保護は薬理試験中は保持された。

0205

FGF21類似体は上記の通りに調製された。LCMSにより決定された(LCMS方法1を使用して)インタクト質量は化合物について示す。

0206

0207

0208

(実施例4)
FGF21類似体の誘導体化のための試薬の調製
誘導体化の代表的試薬の調製は実施例4.1に与えられている。実施例4.2〜4.4の試薬は実施例4.1に提供される方法により調製される。実施例4.5〜4.17の試薬は下に記載される類似の方法により調製された。

0209

(実施例4.1)
15-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸の調製

0210

0211

固相合成プロトコル:
ジクロロメタン(500mL)中N-(ベンジルオキシカルボニルオキシ)スクシンイミド(ZOSu、100g、401mmol)の溶液を2時間かけて、ジクロロメタン(750mL)中エチレンジアミン(1、189mL、2.81mol)の溶液に滴下添加した。30分後、懸濁液を濾過し固体はジクロロメタンで洗浄した。濾液蒸発乾固させ、残渣はトルエン(1.00L)及び水(0.50L)で希釈した。得られた混合物は濾過し、濾液は分離され2相を得た。水性相生成物を含有し、したがって、生成物をジクロロメタン(2×250mL)を用いて抽出した。有機相はすべて組み合わせ、無水硫酸ナトリウム脱水し、濾過し真空中で濃縮した。残渣はトルエン(750mL)で希釈し2Mの塩酸水溶液(500mL)及び1Mの塩酸水溶液(100mL)で抽出した。酸性水性相は組み合わせて水(90mL)中水酸化ナトリウム(60.0g、1.50mol)の溶液で塩基性に変化させた。得られた混合物はジクロロメタン(4×200mL)で抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し真空中で濃縮し、ヘキサン(200mL)で希釈した。エーテル(100mL、400mmol)中4Mの塩化水素溶液を溶液に添加し、得られた懸濁液は真空中で濃縮し、ヘキサン(1.00L)で希釈した。沈殿した固体は濾過し、ヘキサンで洗浄し、真空乾燥させて、白い粉末として(2-アミノエチル)-カルバミン酸ベンジルエステルハイドロクロライドを得た。
収量:62.62g(68%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール4対1):0.25(遊離塩基)

0212

0213

2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.7mmol/g(3、40.1g、68.1mmol)を乾燥ジクロロメタン(250mL)中で20分間膨潤させておいた。乾燥ジクロロメタン(50mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-Ado-OH、17.5g、45.4mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(30.1mL、173mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物は5時間振盪させた。樹脂は濾過しメタノール/ジクロロメタン混合物(4対1、250mL、2×5分)中N,N-ジイソプロピルエチルアミン(15.8mL、90.8mmol)の溶液で処理した。次に、樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(2×250mL)、ジクロロメタン(2×250mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)で洗浄した。Fmoc基はジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×250mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)、2-プロパノール(2×250mL))及びジクロロメタン(300mL、2×250mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(140mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-Ado-OH、26.3g、68.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、24.2g、68.1mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(21.4mL、123mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×250mL)、ジクロロメタン(2×250mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(250mL)で洗浄した。Fmoc基はジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×250mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)、2-プロパノール(2×250mL)及びジクロロメタン(300mL、2×250mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(140mL)中(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu-OtBu、29.0g、68.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、24.2g、68.1mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(21.4mL、123mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×250mL)、ジクロロメタン(2×250mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(250mL)で洗浄した。Fmoc基はジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×250mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)、2-プロパノール(2×250mL)及びジクロロメタン(300mL、2×250mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド/ジクロロメタン混合物(4対1、200mL)中16-(tert-ブトキシ)-16-オキソヘキサデカン酸(23.3g、68.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、24.2g、68.1mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(21.4mL、123mmol)の溶液を樹脂に添加した。樹脂は1時間振盪させ、濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)、ジクロロメタン(2×250mL)、メタノール(2×250mL)及びジクロロメタン(350、6×250mL)で洗浄した。生成物は2,2,2-トリフルオロエタノール(250mL)で18時間処理することにより樹脂から切り離した。樹脂は濾別し、ジクロロメタン(2×250mL)、2-プロパノール/ジクロロメタン混合物(1対1、2×250mL)、2-プロパノール(250mL)及びジクロロメタン(3×250mL)で洗浄した。溶液は組み合わせ;溶媒は蒸発させ粗生成物フラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040〜0.060mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール1対0から9対1)により精製した。純粋な(S)-22-(tert-ブトキシカルボニル)-41,41-ジメチル-10,19,24,39-テトラオキソ-3,6,12,15,40-ペンタオキサ-9,18,23-トリアザドテトラコンタン酸(triazadotetracontanoic acid)は真空乾燥させ黄淡色の濃い黄色の油状物として得た。
収量:30.88g(83%)
RF:(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 4対1):0.30

0214

0215

2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU、11.4g、30.1mmol)及びトリエチルアミン(8.77mL、62.9mmol)を続いて、乾燥ジクロロメタン(110mL)中(S)-22-(tert-ブトキシカルボニル)-41,41-ジメチル-10,19,24,39-テトラオキソ-3,6,12,15,40-ペンタオキサ-9,18,23-トリアザドテトラコンタン酸(22.4g、27.4mmol)の溶液に添加した。トリエチルアミン(5.72mL、41.0mmol)を乾燥ジクロロメタン(165mL)中(2-アミノ-エチル)-カルバミン酸ベンジルエステルハイドロクロライド(6.94g、30.1mmol)の懸濁液に添加し、得られた混合物を上記溶液に添加した。混合物は室温で一晩撹拌し、次に、蒸発乾固させた。残渣は酢酸エチル(500mL)に再溶解させ;1Mの塩酸水溶液(2×200mL)、炭酸ナトリウムの5%水溶液(2×200mL、非常にゆっくりした相分離)、1Mの塩酸水溶液(8×200mL)及びブラインで洗浄し;無水硫酸ナトリウムで脱水し真空中で蒸発乾固させた。残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040〜0.060mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール95対5)により精製し黄淡色の濃い油状物として15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-1-tert-ブトキシカルボニル-プロピルカルバモイル]-ペンタデカン酸 tert-ブチルエステルを得た。
収量:23.84g(88%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 9対1):0.35

0216

0217

パラジウム炭素(10%、1.27g、1.20mmol)をメタノール(350mL)中上記化合物(23.8g、24.0mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を常圧で4時間水素化した。触媒は濾別し、濾液は蒸発乾固させた。残渣はメタノールの残渣を取り除くために、ジクロロメタンから数回蒸発させ、真空乾燥させて濃い無色の油状物としてtert-ブチル(S)-1-アミノ-25-(tert-ブトキシカルボニル)-4,13,22,27-テトラオキソ-6,9,15,18-テトラオキサ-3,12,21,26-テトラアザドテトラコンタン-42-オアート(oate)を得た。
収量:20.50g(99%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 9対1):0.05

0218

0219

N,N-ジイソプロピルエチルアミン(4.98mL、28.6mmol)をアルゴン下-30℃で乾燥ジクロロメタン(290mL)中上記アミン(6、20.5g、23.8mmol)の溶液に添加した。臭化ブロモアセチル(2.48mL、28.6mmol)を滴下添加し、得られた溶液は-30℃でさらに3時間撹拌した。冷却浴を取り除き、混合物は室温で1時間撹拌し、その後溶媒は真空中で取り除いた。残渣は、酢酸エチル(450ml)に再溶解し、5%のクエン酸水溶液(300mL)で洗浄した。相は1時間以内に分離した。有機層は水(300mL)で洗浄し、得られた乳濁液は一晩分離させておき3つの相を得た。澄んだ水性層は取り除き、残留する2つの相は臭化カリウム飽和水溶液(100mL)を添加して振盪させた。相は一晩分離させておき、次に、水性相は取り除いて有機相は無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒は真空中で取り除き、残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040〜0.060mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール95対5)により精製し、無色の固体としてtert-ブチル(S)-1-ブロモ-28-(tert-ブトキシカルボニル)-2,7,16,25,30-ペンタオキソ-9,12,18,21-テトラオキサ-3,6,15,24,29-ペンタアザペンタテトラコンタン-45-オアートを得た。
収量:19.46g(83%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 9対1):0.25

0220

0221

上記化合物(19.5g、19.8mmol)をトリフルオロ酢酸(120mL)に溶解させ、得られた溶液は室温で1.5時間撹拌した。トリフルオロ酢酸を真空中で取り除き、残渣はジクロロメタン(6×200mL)から蒸発させた。ジエチルエーテル(200mL)を油性残渣に添加し、混合物を一晩撹拌して懸濁液を得た。固体生成物を濾過し、ジエチルエーテル及びヘキサンで洗浄し、真空乾燥させて白色の粉末として表題の生成物の15-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸を得た。
収量:16.74g(97%)

0222

0223

(実施例4.2)
11-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ウンデカン酸の調製

0224

0225

11-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ウンデカン酸は、実施例4.1に記載されるのと同じ方法により調製し、濃い橙色の油状物が生じた。

0226

0227

(実施例4.3)
13-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}トリデカノン酸の調製

0228

0229

13-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}トリデカノン酸は、実施例4.1に記載されるのと同じ方法により調製し、濃い黄色の油状物が生じた。

0230

0231

(実施例4.4)
19-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカノン酸の調製

0232

0233

19-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカノン酸は、実施例4.1に記載されるのと同じ方法により調製し、ベージュ色の粉末が生じた。

0234

0235

(実施例4.5)
18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸の調製

0236

0237

溶液相合成プロトコル:
工程1:ベンジル18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アミノエチルアミノ)-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-ベンジルオキシカルボニル-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸
DCM(80ml)中エチレンジアミン(8.5ml ml)及びトリエチルアミン(5.2ml)の0℃の溶液にDCM(320ml)中、WO10029159に記載されている通りに調製されたベンジル18-[[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸(26g)の溶液を75分かけて滴下添加した。2時間撹拌後、沈殿物は濾別した。濾液に水(200ml)及びイソプロパノール(50ml)を添加した。混合物は抽出した。有機層はMgSO4を使用して乾燥させた。MgSO4は濾過により取り除き、濾液は真空乾燥させて表題の化合物20.07g(81%)を得た。LCMS:理論質量:956.2;実測値m/z、z=1:957.0

0238

工程2:ベンジル18-[[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-
[(2-クロロアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸
クロロ酢酸(0.19g)をDCM(15ml)に溶解させた。N-ヒドロキシスクシンイミド(0.22g)及びEDAC HCl(0.42g)を添加した。2.5時間撹拌後、DCM(5ml)中ベンジル18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アミノエチルアミノ)-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-ベンジルオキシカルボニル-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸(1.5g)を添加した。室温で一晩撹拌後、混合物は1MのHCl(2×20ml)及び水/ブライン2対1(30ml)で抽出した。有機層は乾燥させ(MgSO4)、濾過し真空中で濃縮して、澄んだ油状物1.37g(84%)を得た。
LCMS:理論質量:1032.7;実測値m/z、z=1:1033.1

0239

工程3:18-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸
アセトン(140ml)中ベンジル18-[[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸(10.5g)の溶液に窒素通気後10% PD/C(1.0g)を添加した。6時間の水素化後、混合物は濾過前に40〜50℃まで加熱した。冷たい濾液中の沈殿物は単離しアセトンで洗浄して乾燥させ、表題の化合物7.42g(85%)を得た。

0240

工程4:8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸
アセトン(60ml)中18-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸の懸濁液に臭化ナトリウム(5eq、1.21g)を添加した。混合物は室温、暗所で撹拌した。2時間後さらに臭化ナトリウム(10eq、2.41g)を添加した。2日後さらに臭化ナトリウム(5eq、1.21g)を添加した。5日後混合物を濃縮した。半分の残渣にDCM(30ml)、10%アスコルビン酸(20ml)及び水30mlを添加した。その乳濁液にイソプロパノール(50ml)及び水(30ml)を添加した。有機相は分離し、10%アスコルビン酸(20ml)及びイソプロパノール(10ml)の混合液を用いて2度洗浄した。有機層は乾燥させ(MgSO4)、濾過し濃縮して固体油状物を得、この油はアセトン中で結晶化させ濾過によって単離し、出発材料混入した表題の化合物を得た。0.80g(72%)
LCMS:理論質量:896.9;実測値m/z、z=1:898.9(M+1)

0241

(実施例4.6)
12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]カルバモイル]シクロヘキシル]メチルアミノ]-12-オキソ-ドデカン酸の調製

0242

0243

固相合成プロトコル:
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.8mmol/g(1、11.9g、21.4mmol)を乾燥ジクロロメタン(80mL)中で20分間膨潤させておいた。乾燥ジクロロメタン(70mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、5.50g、14.3mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(9.44mL、54.2mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を4時間振盪した。樹脂は濾過し、メタノール/ジクロロメタン混合物(4対1、2×5分、2×57mL)中N,N-ジイソプロピルエチルアミン(4.97mL、28.5mmol)の溶液で処理した。次に、樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)、ジクロロメタン(2×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(100mL、2×80mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、11.0g、28.5mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、10.1g、28.5mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(9.93mL、57.0mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を2時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)、ジクロロメタン(2×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(100mL、2×80mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)中(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、9.11g、21.4mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、7.60g、21.4mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.71mL、38.5mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)、ジクロロメタン(2×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(100mL、2×80mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)中4-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸(Fmoc-Trx-OH、9.11g、21.4mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、7.60g、21.4mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.71mL、38.5mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)、ジクロロメタン(2×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(100mL、2×80mL)で洗浄した。ジクロロメタン/N,N-ジメチルホルムアミド混合物(4対1、80mL)中ドデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(C12(OtBu)-OH、6.13g、21.4mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、7.61g、21.4mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.71mL、38.5mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1.5時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(6×80mL)、ジクロロメタン(4×80mL)、メタノール(4×80mL)及びジクロロメタン(7×80mL)で洗浄した。生成物は2,2,2-トリフルオロエタノール(80mL)で18時間処理することにより樹脂から切り離した。樹脂は濾別し、ジクロロメタン(4×80mL)、ジクロロメタン/2-プロパノール混合物(1対1、4×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(6×80mL)で洗浄した。溶液は組み合わせ、溶媒は蒸発させ、粗生成物はカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040-0.063mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール1対0〜9対1)により精製した。純生成物(2)は真空乾燥させ油状物として得た。
収量:5.40g(42%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 9対1):0.30

0244

0245

2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU、2.46g、6.48mmol)及びトリエチルアミン(1.89mL、13.6mmol)をその後に乾燥ジクロロメタン(23mL)中上記由来の油状物(2、5.31g、5.89mmol)の溶液に添加した。トリエチルアミン(1.36mL、9.72mmol)を乾燥ジクロロメタン(35mL)中(2-アミノ-エチル)-カルバミン酸ベンジルエステルハイドロクロライド(3、1.49g、6.48mmol)の懸濁液に添加し、得られた混合物は上記溶液に添加した。混合物は室温で一晩撹拌し、次に、混合物は蒸発乾固させた。残渣は酢酸エチル(70ml)に再溶解し;1Mの塩酸水溶液(1×70mL)、炭酸ナトリウムの5%水溶液(2×70mL)、1Mの塩酸水溶液(4×70mL)及びブライン(70mL)で洗浄し;無水硫酸ナトリウムで脱水し蒸発させた。残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040-0.063mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール95対5から92対8)により精製し濃い黄色の油状物を得た。
収量:2.81g(44%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 9対1):0.25

0246

0247

パラジウム炭素(10%、0.15g、0.13mmol)をメタノール(43mL)中上記化合物(2.81g、2.60mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を常圧で2.5時間水素化した。触媒は濾別し、濾液は蒸発乾固した。残渣はトルエンで4回同時蒸着させ真空乾燥させて化合物5を得た。
収量:2.01g(81%)

0248

0249

N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.40mL、2.28mmol)を乾燥ジクロロメタン(30mL)中上記アミン(5、1.79g、1.90mmol)の溶液にアルゴン下-30℃で添加した。臭化ブロモアセチル(0.20mL、2.28mmol)を滴下添加し、得られた溶液は-30℃で3時間撹拌した。冷却浴を取り除き、混合物は室温でさらに1時間撹拌し、その後蒸発乾固した。残渣は、酢酸エチル(50ml)に再溶解し、5%のクエン酸水溶液(3×50mL、非常にゆっくりした相分離)、1Mの塩酸水溶液(4×50mL)及びブライン(50mL)で洗浄した。有機層は無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過して蒸発させた。残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040-0.063mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール95対5から93対7)により精製し黄色の油状物を得た。
収量:1.63g(80%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 95対5):0.25

0250

0251

上記化合物(1.53g、1.44mmol)はトリフルオロ酢酸(25mL)に溶解させ1.5時間滞留させておいた。トリフルオロ酢酸は真空中で取り除き、残渣はトルエンで3回及びジクロロメタンで10回同時蒸着させ、黄色い油性個体を得た。
収量:810mg(59%)

0252

0253

(実施例4.7)
16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]カルバモイル]シクロヘキシル]メチルアミノ]-16-オキソ-ヘキサデカン酸の調製

0254

0255

固相合成プロトコル:
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.8mmol/g(1、11.9g、21.4mmol)を乾燥ジクロロメタン(80mL)中で20分間膨潤させておいた。乾燥ジクロロメタン(70mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、5.50g、14.3mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(9.44mL、54.2mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を4時間振盪した。樹脂は濾過し、メタノール/ジクロロメタン混合物(4対1、2×5分、2×57mL)中N,N-ジイソプロピルエチルアミン(4.97mL、28.5mmol)の溶液で処理した。次に、樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)、ジクロロメタン(2×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(100mL、2×80mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、11.0g、28.5mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、10.1g、28.5mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(9.93mL、57.0mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を2時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)、ジクロロメタン(2×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(100mL、2×80mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)中(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、9.11g、21.4mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、7.60g、21.4mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.71mL、38.5mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)、ジクロロメタン(2×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(100mL、2×80mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)中Fmoc-トラネキサム酸(Fmoc-Trx-OH、9.11g、21.4mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、7.60g、21.4mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.71mL、38.5mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)、ジクロロメタン(2×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(100mL、2×80mL)で洗浄した。ジクロロメタン/N,N-ジメチルホルムアミド混合物(4対1、80mL)中ヘキサデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(C16(OtBu)-OH、7.33g、21.4mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、7.61g、21.4mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.71mL、38.5mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1.5時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(6×80mL)、ジクロロメタン(4×80mL)、メタノール(4×80mL)及びジクロロメタン(7×80mL)で洗浄した。生成物は2,2,2-トリフルオロエタノール(80mL)で18時間処理することにより樹脂から切り離した。樹脂は濾別し、ジクロロメタン(4×80mL)、ジクロロメタン/2-プロパノール混合物(1対1、4×80mL)、2-プロパノール(2×80mL)及びジクロロメタン(6×80mL)で洗浄した。溶液は組み合わせ、溶媒は蒸発させ、粗生成物はカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040-0.063mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール1対0〜9対1)により精製した。中間体(2)は真空乾燥し、油状物として得た。
収量:8.20g(80%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 9対1):0.20

0256

0257

2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU、3.55g、9.34mmol)及びトリエチルアミン(2.72mL、19.5mmol)をその後に乾燥ジクロロメタン(34mL)中中間体(2)(8.13g、8.49mmol)の溶液に添加した。トリエチルアミン(1.78mL、12.7mmol)を乾燥ジクロロメタン(51mL)中(2-アミノ-エチル)-カルバミン酸ベンジルエステルハイドロクロライド(2.15g、9.34mmol)の懸濁液に添加し、得られた混合物は上記溶液に添加した。混合物は室温で一晩撹拌し、次に、混合物は蒸発乾固した。残渣は酢酸エチル(150ml)に再溶解し;1Mの塩酸水溶液(1×100mL)、炭酸ナトリウムの5%水溶液(2×100mL)、1Mの塩酸水溶液(4×100mL)及びブラインで洗浄し;無水硫酸ナトリウムで脱水し蒸発させた。残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040-0.063mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール95対5から92対8)により精製し濃い黄色の油状物として化合物4を得た。
収量:5.59g(58%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 9対1):0.20

0258

0259

パラジウム炭素(10%、0.27g、0.24mmol)をメタノール(85mL)中上記化合物(4、5.59g、4.93mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を常圧で2.5時間水素化した。触媒は濾別し、濾液は蒸発乾固した。残渣はトルエンで4回同時蒸着させ真空乾燥させて化合物5を得た。
収量:3.45g(70%)

0260

0261

N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.73mL、4.14mmol)を乾燥ジクロロメタン(55mL)中上記アミン(5、3.45g、3.45mmol)の溶液にアルゴン下-30℃で添加した。臭化ブロモアセチル(0.36mL、4.14mmol)を滴下添加し、得られた溶液は-30℃で3時間撹拌した。冷却浴を取り除き、混合物は室温でさらに1時間撹拌し、その後蒸発乾固した。残渣は、酢酸エチル(100ml)に再溶解し、5%のクエン酸水溶液(3×100mL、非常にゆっくりした相分離)、1Mの塩酸水溶液(4×100mL)及びブラインで洗浄した。有機層は無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過して蒸発させた。残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040-0.063mm;溶離液:ジクロロメタン/メタノール95対5から93対7)により精製し黄色の油状物として化合物6を得た。
収量:1.63g(44%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール 95対5):0.15

0262

0263

上記化合物(6、1.63g、1.53mmol)はトリフルオロ酢酸(25mL)に溶解させ1.5時間滞留させておいた。トリフルオロ酢酸は真空中で取り除き、残渣はトルエンで3回同時蒸着させた。ジエチルエーテル(120mL)を油性残渣に添加し、混合物を1時間撹拌した。次に、沈殿物は濾別し、残渣は真空乾燥させて白い粉末を得た。
収量:1.55g(90%)

0264

0265

(実施例4.8)
18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]カルバモイル]シクロヘキシル]メチルアミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸の調製

0266

0267

合成プロトコル:
Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.26mmol/g(1、11.7g、3.05mmol)をジクロロメタン(100mL)中で45分間膨潤させておいた。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×90mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、2.35g、6.09mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、2.17g、6.09mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.12L、12.2mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×90mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、2.35g、6.09mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、2.17g、6.09mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.12L、12.2mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1.5時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄して中間体1を得た。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×90mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、1.94g、4.57mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、1.62g、4.57mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.43mL、8.23mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1.5時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×90mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中4-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸(Fmoc-Trx-OH、1.73g、4.57mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、1.62g、4.57mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.43mL、8.23mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄して中間体2を得た。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×50mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×50mL)、2-プロパノール(3×50mL)及びジクロロメタン(3×30mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド混合物(50mL)中オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(C18(OtBu)-OH、0.85g、2.28mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、0.81g、2.28mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.72mL、4.11mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1.5時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×50mL)、ジクロロメタン(3×50mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×50mL)で洗浄した。Mtt基はジクロロメタン中80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールでの処理する(2×10分、2×30分、4×50mL)ことにより取り除いた。樹脂はジクロロメタン(6×50mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(50mL)中ブロモ酢酸(4.24g、30.5mmol)及びN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、4.01mL、25.9mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を45分間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(5×50mL)及びジクロロメタン(10×50mL)で洗浄した。生成物はトリフルオロ酢酸(50mL)で1時間処理することにより樹脂から切り離した。樹脂は濾別し、トリフルオロ酢酸(1×25mL)及びジクロロメタン(2×30mL)で洗浄した。溶液は組み合わせ、溶媒は蒸発乾固し、濃い色の油状物として化合物を得た。
収量:2.18g(64%)

0268

0269

(実施例4.9)
16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]カルバモイル]シクロヘキシル]メチルアミノ]-16-オキソ-ヘキサデカン酸の調製

0270

0271

合成手順は実施例4.8に類似していた。ただし、中間体2に続く合成工程では、ヘキサデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(C16(OtBu)-OH)をオクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(C18(OtBu)-OH)の代わりに使用した。生成物は濃い茶色の油状物として得られた。
収量:2.05mg(62%)

0272

0273

(実施例4.10)
4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]スルホニルアミノ]-10-オキソ-デコキシ(decoxy)]安息香酸の調製

0274

0275

合成手順は実施例4.8に類似していた。ただし、中間体1に続く合成工程では、先ず3-カルボキシプロパンスルホンアミド、続いて10-(4-tert-ブトキシカルボニルフェノキシ)デカン酸を標準Fmoc保護/脱保護合成手順を使用して樹脂に結合させた。実施例4.8に例示されているそれに続く合成工程、切断及びワークアップ(work-up)により白い固体が得られた。
LC-MS m/z:998.54(M1+)
UPLC5:方法09_B4_1、Rt=8.3004分(pH2.3);98%純度

0276

(実施例4.11)
4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-10-オキソ-デコキシ]安息香酸の調製

0277

0278

合成手順は実施例4.8に類似していた。ただし、中間体1に続く合成工程では、先ず(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu)、続いて10-(4-tert-ブトキシカルボニルフェノキシ)デカン酸を標準Fmoc保護/脱保護合成手順を使用して樹脂に結合させた。実施例4.8に例示されているそれに続く合成工程、切断及びワークアップにより白い固体が得られた。
LC-MS m/z:978,55(M1+).
UPLC5:方法09_B4_1、Rt=7.573分(pH2.3);99%純度

0279

(実施例4.12)
20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-20-オキソ-イコサン酸の調製

0280

0281

合成手順は実施例4.8に類似していた。ただし、中間体1に続く合成工程では、先ず(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu)を樹脂に2回結合させ、その後、20-tert-ブトキシ-20-オキソ-イコサン酸(C20(OtBu)-OH)を標準Fmoc保護/脱保護合成手順を使用して樹脂に結合させた。実施例4.8に例示されているそれに続く合成工程、切断及びワークアップにより白い固体が得られた。
LC-MS m/z:1141.2(M+H)+

0282

(実施例4.13)
20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-20-オキソ-イコサン酸の調製

0283

0284

合成手順は実施例4.8に類似していた。ただし、中間体1に続く合成工程では、先ず(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu)を樹脂に結合させ、その後、20-tert-ブトキシ-20-オキソ-イコサン酸(C20(OtBu)-OH)を標準Fmoc保護/脱保護合成手順を使用して樹脂に結合させた。実施例4.8に例示されているそれに続く合成工程、切断及びワークアップにより白い固体が得られた。
LC-MS m/z:1012.0(M+H)+

0285

(実施例4.14)
(2S,25S)-2-(4-(2-ブロムアセトアミド)ブチル)-4,13,22-トリオキソ-25-(15-スルホペンタデカンアミド)-6,9,15,18-テトラオキサ-3,12,21-トリアザヘキサコサン二酸の調製

0286

0287

合成プロトコル:
Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.26mmol/g(1、36.7g、9.55mmol)をジクロロメタン(200mL)中で45分間膨潤させておいた。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×150mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、7.36g、19.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、6.79g、19.1mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.66mL、38.2mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×150mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、7.36g、19.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、6.79g、19.1mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.66mL、38.2mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(150mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×150mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、6.10g、14.3mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、5.09g、14.3mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(4.49mL、25.8mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(150mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×150mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)で洗浄した。樹脂は3つの部分に分離させ、ジメチルスルホキシド(80mL)中ナトリウム16-スルホ-ヘキサデカン酸(3、2.28g、6.37mmol)、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP、3.31g、6.37mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.22mL、12.8mmol)の溶液を上記の樹脂の一種に添加し混合物を2時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド対水混合物(3対1、3×80mL)、N,N-ジメチルホルムアミド(3×80mL)、ジクロロメタン(3×80mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×80mL)で洗浄した。Mtt基はジクロロメタン中80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理する(3×10分、2×30分、5×80mL)ことにより取り除いた。樹脂はジクロロメタン(6×80mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)中ブロモ酢酸(6.64g、47.8mmol)及びN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、5.26mL、34.0mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を45分間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(4×80mL)及びジクロロメタン(10×80mL)で洗浄した。生成物はトリフルオロ酢酸(100mL)で1時間処理することにより樹脂から切り離した。樹脂は濾別し、トリフルオロ酢酸(1×40mL)及びジクロロメタン(3×50mL)で洗浄した。溶液は組み合わせ、溶媒は蒸発乾固し、濃い茶色の油状物を得た。油状物は水対アセトニトリル混合物(4対1、25mL)に溶解させ、溶液はH+形態(50〜100メッシュ;溶離液:水)中Dowex 50WX4のカラム(7×10cm)を通過させた。酸性pHの画分は組み合わせて凍結乾燥し白い粉末を得た。
収量:2.17g(68%)

0288

0289

(実施例4.15)
12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-12-オキソ-ドデカン酸の調製

0290

0291

合成プロトコル:
Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.26mmol/g(1、36.7g、9.55mmol)をジクロロメタン(200mL)中で45分間膨潤させておいた。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×150mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、7.36g、19.1mmol)、O-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、6.79g、19.1mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.66mL、38.2mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×150mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、7.36g、19.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、6.79g、19.1mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.66mL、38.2mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(150mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×150mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、6.10g、14.3mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、5.09g、14.3mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(4.49mL、25.8mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(150mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×150mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)で洗浄した。樹脂は3つの部分に分離させ、N,N-ジメチルホルムアミド(70mL)中(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸 1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、2.03g、4.78mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、1.70g、4.78mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.50mL、8.60mmol)の溶液を上記の樹脂(2)の一種に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×70mL)、ジクロロメタン(2×70mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(70mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×30分、2×70mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×70mL)、2-プロパノール(2×70mL)及びジクロロメタン(2×70mL)で洗浄した。ジクロロメタン/N,N-ジメチルホルムアミド混合物(4対1、70mL)中ドデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(C12(OtBu)-OH、1.37g、4.78mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、1.70g、4.78mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.50mL、8.60mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1.5時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×150mL)、ジクロロメタン(3×150mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×150mL)で洗浄した。Mtt基はジクロロメタン中80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理する(3×10分、2×30分、4×70mL)ことにより取り除いた。樹脂はジクロロメタン(6×70mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(90mL)中ブロモ酢酸(6.60g、47.8mmol)及びN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、5.30mL、34.0mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を30分間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(4×70mL)及びジクロロメタン(10×70mL)で洗浄した。生成物はトリフルオロ酢酸(100mL)で1時間処理することにより樹脂から切り離した。樹脂は濾別し、トリフルオロ酢酸(1×40mL)及びジクロロメタン(2×40mL)で洗浄した。溶液は組み合わせ、溶媒は蒸発乾固し、濃い茶色の油状物を得た。
収量:2.94mg(90%)

0292

0293

(実施例4.16)
12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-12-オキソ-ドデカン酸の調製

0294

0295

合成手順は実施例4.8と同じであった。ただし、中間体1に続く合成工程では、先ず(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu)を、続いて12-tert-ブトキシ-12-オキソ-ドデカン酸を標準Fmoc保護/脱保護合成手順を使用して樹脂に結合させた。実施例4.8に例示されているそれに続く合成工程、切断及びワークアップにより濃い茶色の油状物としての化合物を得た。
収率:97%

0296

0297

(実施例4.17)
20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-ブロモアセチル)アミノ]-1-カルボキシ-ペンチル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]カルバモイル]シクロヘキシル]メチルアミノ]-20-オキソ-イコサン酸の調製

0298

0299

合成プロトコル:
Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.26mmol/g(1、11.2g、2.90mmol)をジクロロメタン(100mL)中で45分間膨潤させておいた。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×100mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、2.23g、5.80mmol)、O-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、2.06g、5.80mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.02mL、11.6mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×100mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、2.23g、5.80mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、2.06g、5.80mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.02mL、11.6mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1.5時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×100mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、1.85g、4.35mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、1.55g、4.35mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.36mL、7.82mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を1.5時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×100mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL))及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中4-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸(Fmoc-Trx-OH、1.65g、4.35mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、1.55g、4.35mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.36mL、7.82mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を2時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄した。Fmoc基はN,N-ジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理する(1×5分、1×10分、1×30分、3×100mL)ことにより取り除いた。樹脂はN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、2-プロパノール(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中イコサン二酸モノ-tert-ブチルエステル(C20(OtBu)-OH、1.73g、4.35mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸(TCTU、1.55g、4.35mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.36mL、7.82mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を2時間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)、ジクロロメタン(3×90mL)、N,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)及びジクロロメタン(3×90mL)で洗浄した。Mtt基はジクロロメタン中80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理する(2×10分、2×30分、4×100mL)ことにより取り除いた。樹脂はジクロロメタン(6×90mL)及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×90mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中ブロモ酢酸(8.06g、58.0mmol)及びN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、7.60mL、49.3mmol)の溶液を樹脂に添加し混合物を40分間振盪した。樹脂は濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(5×90mL)及びジクロロメタン(12×90mL)で洗浄した。生成物はトリフルオロ酢酸(100mL)で1時間処理することにより樹脂から切り離した。樹脂は濾別し、トリフルオロ酢酸(1×50mL)及びジクロロメタン(7×70mL)で洗浄した。溶液は組み合わせ、溶媒は蒸発乾固し、濃い茶色の油状物を得た。
収量:3.28g(98%)

0300

0301

LC-MS m/z:1151.3(M+H)+

0302

(実施例5)
FGF21誘導体の調製
代表的なFGF21誘導体の調製は実施例5.1(化合物21)に与えられている。実施例5.2〜5.14のFGF21誘導体(化合物11〜20及び22〜14)は実施例5.1に提供される方法により調製される。実施例5.15〜5.37のFGF21誘導体は実施例5.1に提供される又はこの下に記載される方法により調製される。

0303

(実施例5.1)
化合物21
S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

0304

0305

この化合物は配列番号10のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。

0306

化合物21は以下の通りに調製した:
実施例1〜3に一般的に記載されている通りに調製される配列番号10のS{ベータ-181}-2-アミノエチルスルファニル-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21類似体の181位のCys残基は実施例4.1において調製される試薬を用いて181C位のCys残基のチオール基において改変された。

0307

0308

トリス及びNaCl緩衝液(1.35mg/ml)中のシステアミン保護Ala[Gln121, Leu168,Cys181]FGF21(70mg、0.0036mmol)にトリス水溶液を添加してpHを8.0に調整した。水に溶解させたBSPP(ビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩、12mg)を添加し室温で4時間穏やかに撹拌させた。エタノール(0.5ml)中15-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸(19mg、0.022mmol)を添加した。一晩穏やかに撹拌した後、ミリQ水(150ml)を添加して伝導率を2.5mS/cmまで下げた。混合物は、A緩衝液:20mMトリス、pH8.0;B緩衝液:20mMトリス、500mM NaCl、pH8.0、フロー6ml及び60CV上0〜80%Bの勾配を使用するMonoQ 10/100GLカラム上陰イオン交換を使用して精製した。収量:37mg、51%
LCMS方法2:
理論質量:20279.9;実測値:20280.4

0309

(実施例5.2)
化合物11
S{ベータ-178}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys178]FGF21

0310

0311

この化合物は、実施例4.1の試薬15-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号6のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法2:
理論質量:20279.9;実測値:20280.2

0312

(実施例5.3)
化合物12
S{ベータ-179}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys179]FGF21

0313

0314

この化合物は、実施例4.1の試薬15-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)-エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号7のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法3
理論質量:202203.8;実測値:20204.2

0315

(実施例5.4)
化合物13
S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

0316

0317

この化合物は、実施例4.2の試薬11-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)-エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}ウンデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号8のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法2
理論質量:20239.8;実測値:20240.1

0318

(実施例5.5)
化合物14
S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

0319

0320

この化合物は、実施例4.3の試薬13-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}トリデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号8のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法3:
理論質量:20267.8;実測値:20268.1

0321

(実施例5.6)
化合物15
S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

0322

0323

この化合物は、実施例4.1の試薬15-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号8のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法2:
理論質量:20295.9;実測値:20296.2

0324

(実施例5.7)
化合物16
S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

0325

0326

この化合物は、実施例4.5の試薬17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号8のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法3
理論質量:20323.9;実測値:20324.5

0327

(実施例5.8)
化合物17
S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

0328

0329

この化合物は、実施例4.4の試薬19-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号8のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法3
理論質量:20352.0;実測値:20352.0

0330

(実施例5.9)
化合物18
S{ベータ-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21

0331

0332

この化合物は、実施例4.5の試薬17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)-エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号9のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法2:
理論質量:20236.8;実測値:20237.0

0333

(実施例5.10)
化合物19
S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

0334

0335

この化合物は、実施例4.2の試薬11-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ウンデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号1のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法2:
理論質量:20223.8;実測値:20224.4

0336

(実施例5.11)
化合物20
S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

0337

0338

この化合物は、実施例4.3の試薬13-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチル-カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}トリデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号10のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
LCMS方法2:
理論質量:20251.8;実測値:20252.2

0339

(実施例5.12)
化合物22
S{ベータ-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

0340

0341

この化合物は、実施例4.5の試薬17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸を使用して実施例5.1下に記載される方法により調製された、配列番号10のFGF21類似体(実施例3参照)の誘導体である。
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理論質量:20307.9;実測値:20308.6

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