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図面 (8)

課題・解決手段

対象における、対象区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間(またはそれを含有する細胞)のクローンプロファイルを評価または提供する方法が開示される。

概要

背景

癌細胞ゲノム試験は、癌のより良好な理解の発展と、より効果的な処置アプローチの管理に対する著しい有望性を示す。ゲノム試験は、患者の癌細胞のゲノムの配列決定、およびそれらの細胞における何らかのゲノム変化の同定を含む。ゲノム変化には、とりわけ、例えば、突然変異塩基置換再編成欠失、挿入が含まれ得る。特定の患者の癌に見られる場合、これらのゲノム変化を理解することは、より良好な処置を開発することにも役立ち、ゲノム変化情報を用いて特定の癌変異体を処置するための最良のアプローチを特定することに役立ち得る。

概要

対象における、対象区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間(またはそれを含有する細胞)のクローンプロファイルを評価または提供する方法が開示される。A

目的

明細書中に記載の方法は、関心領域を評価するための、例えば試料中の関心領域のクローンプロファイルを評価するための、ベイトセットへの試料核酸ハイブリダイゼーションの使用を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

対象における、対象区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間(またはそれを含有する細胞)のクローンプロファイルを評価または提供する方法であって、(a)各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば固形腫瘍または血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバー、を含む核酸ライブラリを得て;(b)それぞれが前記対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本願ではライブラリキャッチと呼ばれることがある)を提供するために、前記ライブラリをベイトセットと接触させ;(c)例えば、前記対象区間の増幅配列を提供するために、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅してもよく;(d)前記対象区間の1回以上の出現の配列を得て、それによって前記対象区間のクローンプロファイルを提供または評価することを含む方法。

請求項2

段階(a)が前記対象からの核酸を断片化する、例えばせん断することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

段階(b)が、溶液ハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリを前記ベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項4

段階(b)が、表面ベースのハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリを前記ベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項5

段階(b)が、表面上の前記ベイトセット、例えば複数のベイトを含む基材上に配置されたベイトセットと前記ライブラリを接触させる段階を含む、請求項4に記載の方法。

請求項6

段階(c)が、前記メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存するかまたはそれを含む方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合するプライマーを用いて、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項7

段階(c)が、プライマー対を用いて前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含み、前記メンバー中の標的/対象核酸に前記プライマー対の少なくとも1つのメンバーが結合しない、請求項1に記載の方法。

請求項8

段階(c)が、前記メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しないか、またはそれを含まない方法によって前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅すること含む、請求項1に記載の方法。

請求項9

段階(c)が、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマー対を用いて前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項10

前記対象区間がサブゲノム区間を含む、請求項1に記載の方法。

請求項11

前記対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項1に記載の方法。

請求項12

サブゲノム区間および発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項13

前記対象区間での第1の対立遺伝子またはシグネチャー(例えば第1のVセグメント)の配列を比較値、例えば予め選択された値、例えば第2の対立遺伝子またはシグネチャー(例えば第2のVセグメント)の配列の関数である値と比較することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項14

(e)(i)前記対象区間での配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)、存在量または同一性、例えば配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子の相対的存在量、または前記対象区間での複数の配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または(ii)可変性、例えば、体細胞高頻度変異から生じる配列可変性、例えば連結部でのインデルの形成による、VD、DJもしくはVJ連結、またはCDR、例えば重鎖CDR3から生じる配列可変性、シグネチャーまたは対象区間内の配列可変性についての値であって、例えば、可変性についての値が、対象または試料中の前記対象区間について存在する異なる変異体の数の関数である、値を得ることをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項15

(i)が、前記対象区間での複数の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在量に対する、前記対象区間での第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在量についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項16

(i)が、第2の対象区間での第2の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在量に対する、前記対象区間での第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在量についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項17

(i)が、発現サブゲノム区間での、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば再編成、例えば転座の出現またはレベルについての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項18

対応するサブゲノム区間で、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば再編成、例えば転座の出現またはレベル、についての値を得ることをさらに含む、請求項17に記載の方法。

請求項19

(ii)が、対象区間で生じる異なる配列、対立遺伝子またはシグネチャーの数についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項20

(e)(i)を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項21

シグネチャーに対して(e)(i)を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項22

対立遺伝子に対して(e)(i)を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項23

(e)(ii)を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項24

第1の対象区間での、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えばVセグメント、またはVDJもしくはVJ再編成のクローンプロファイル;およびi)前記対象の表現型、例えば疾患状態;またはii)第2の対象区間での遺伝子型、例えば表1〜4もしくは表5A〜9またはMHC遺伝子、例えばMHCクラスIまたはMHCクラスII遺伝子から選択される遺伝子の遺伝子型を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項25

表現型が、感染因子、例えば、細菌、ウイルス原生動物または真菌による感染;疾患のステージ障害、例えば癌の遺伝子型の変化;障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性もしくは耐性における変化、例えば癌の場合、転移の発現;処置発現(treatmentdevelops)への反応性;疾患または障害の進行、再燃再発または持続;疾患に関連する薬剤への事前曝露抗原またはワクチンへの事前の曝露もしくは反応;対象からのプロテオミクスデータ;年齢性別;体重;病歴、例えば、疾患の既往歴もしくは以前の処置;または環境的もしくは職業的要因を含む、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記第2の対象区間での遺伝子型が、例えば表1〜4または表5A〜9からの遺伝子における、体細胞突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む、請求項24に記載の方法。

請求項27

段階(d)が:(i)前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得て、例えば、Vセグメントを含む対象区間の第1の出現および前記Vセグメントを含む区間の第2の出現の配列を得ることを含み、前記第1および第2の出現が、VD、DJまたはVJ連結部での多様性によって異なるか;または(ii)前記対象区間および第2の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば前記第1の対象区間が第1の遺伝子からの配列を含み、前記第2の対象区間が第2の遺伝子からの配列を含む、請求項1に記載の方法。

請求項28

段階(d)が、前記対象区間の複数の出現、例えば、VDJ配列を含む対象区間の複数の出現、例えば、特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含む対象区間の複数の出現、のそれぞれの配列を得ることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項29

前記対象区間の複数の出現の第1の出現がサブゲノム区間を含む、請求項28に記載の方法。

請求項30

前記対象区間の複数の出現の第2の出現がサブゲノム区間を含む、請求項27に記載の方法。

請求項31

前記対象区間の複数の出現の第1の出現が発現サブゲノム区間を含む、請求項27に記載の方法。

請求項32

前記対象区間の複数の出現の第2の出現が発現サブゲノム区間を含む、請求項31に記載の方法。

請求項33

前記対象区間の複数の出現の第1の出現が、サブゲノム区間、例えば再編成、例えば転座を含み;前記対象区間の複数の出現の第2の出現が、発現サブゲノム区間、例えばそのサブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含み、これが例えば、ゲノム、例えば体細胞ゲノムの再編成の発現の評価を可能にし、例えばゲノム再編成およびその発現の相対的存在量の評価を可能にする、請求項27に記載の方法。

請求項34

サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含む、請求項33に記載の方法。

請求項35

段階(d)が、前記対象区間および第2の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば、前記第1および第2の区間が、前記対象区間からの異なるゲノム配列、例えば第1の遺伝子からの配列および第2の遺伝子からの配列に対応する、請求項1に記載の方法。

請求項36

前記第1の対象区間がVDJセグメントの第1の組み合わせを含み、前記第2の対象区間がVDJセグメントの第2の組み合わせを含み、例えば前記第1の対象区間が第1のVセグメントを含み、前記の第2の対象区間が第2のVセグメントを含む、請求項35に記載の方法。

請求項37

前記の第1の対象区間が第1のサブゲノム区間を含み、前記の第2の対象区間が第2のサブゲノム区間を含む、請求項35に記載の方法。

請求項38

前記第1の対象区間が第1の発現サブゲノム区間を含み、前記第2の対象区間が第2の発現サブゲノム区間を含む、請求項35に記載の方法。

請求項39

前記第1の対象区間がサブゲノム区間を含み、前記第2の対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項35に記載の方法。

請求項40

評価することが、癌のクローンに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項41

評価することが、癌の第2のクローンに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項40に記載の方法。

請求項42

評価することが、例えば参照物に対する、例えば癌の前記第2のクローンの存在量に対する、前記癌の第1クローンの存在量についての値を提供することを含む、請求項41に記載の方法。

請求項43

遺伝子型を含む癌の第1のクローンおよび第2の遺伝子型を含む第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む、請求項42に記載の方法。

請求項44

第1の突然変異、例えば再編成を含む癌の第1のクローンおよび前記の突然変異を含まない第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む、請求項42に記載の方法。

請求項45

第1の突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む癌の第1のクローンおよび第2の突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む、請求項42に記載の方法。

請求項46

評価することが、第1のVセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項47

評価することが、第2のVセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項46に記載の方法。

請求項48

評価することが、前記第1のVセグメントおよび前記第2のVセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項46に記載の方法。

請求項49

評価することが、第1のDセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項50

評価することが、第2のDセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項49に記載の方法。

請求項51

評価することが、前記第1のDセグメントおよび前記第2のDセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項49に記載の方法。

請求項52

評価することが、第1のJセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項53

評価することが、第2のJセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項52に記載の方法。

請求項54

評価することが、前記第1のJセグメントおよび前記第2のJセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項52に記載の方法。

請求項55

評価することが、第1のVDJまたはVJの組み合わせに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項56

評価することが、第2のVDJまたはVJの組み合わせに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項55に記載の方法。

請求項57

評価することが、前記第1のVDJまたはVJの組み合わせおよび前記第2のVDJまたはVJの組み合わせの相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項55に記載の方法。

請求項58

評価することが、抗体軽鎖に対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項59

評価することが、抗体重鎖に対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項58に記載の方法。

請求項60

評価することが、抗体軽鎖および抗体重鎖の相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項58に記載の方法。

請求項61

評価することが、サブゲノム区間における配列、対立遺伝子またはシグネチャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項62

評価することが、発現サブゲノム区間における配列、対立遺伝子またはシグネチャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項61に記載の方法。

請求項63

評価することが、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての、相対的存在量に対する値を提供することを含む、請求項61に記載の方法。

請求項64

評価することが、対象区間中の遺伝子座、例えばV、DまたはJセグメントにおける高頻度変異に対する可変性を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項65

評価することが、例えば対象区間でVD、DJまたはVJ連結部にインデルを形成することによって、VD、DJまたはVJ連結部から生じる可変性を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項66

評価することが、サブゲノム区間中のCDR、例えば重鎖CDR3における可変性を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項67

評価することが、表10からの配列(または前記配列を含む細胞)に対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項68

(e)(i)についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項69

前記(e)(i)の値が、比較値、例えば予め選択された値、例えば第2の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子(例えば第2のVセグメント)の存在量の関数である値に対する、対象区間における配列、シグネチャーまたは対立遺伝子(例えば第1のVセグメント)の存在量についての値を含む、請求項68に記載の方法。

請求項70

前記(e)(i)の値が、比較値、例えば予め選択された値、例えば事象欠く配列、例えばある対象区間中の非突然変異または非再編成配列の存在量の関数である値に対する、前記対象区間における事象、例えば配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば突然変異または再編成の存在量についての値を含む、請求項68に記載の方法。

請求項71

前記(e)(i)の値が、対象区間でX個の固有の(すなわち互いに異なる)配列、シグネチャーまたは対立遺伝子のそれぞれについての相対的存在量の値を含む、請求項68に記載の方法。

請求項72

Xが、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100または200以上である、請求項71に記載の方法。

請求項73

Xが1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000または50,000,000以上である、請求項72に記載の方法。

請求項74

例えば、存在量の関数、例えば相対的存在量として、例えばヒストグラムとして、前記(e)(i)の値を表示することをさらに含む、請求項68に記載の方法。

請求項75

前記対象区間が、Igスーパーファミリー受容体、例えばT細胞受容体またはB細胞受容体からの配列を含む、請求項68に記載の方法。

請求項76

前記対象区間が、Vセグメント、DセグメントまたはJセグメントからの配列を含む、請求項68に記載の方法。

請求項77

前記対象区間が表10からの配列を含む、請求項68に記載の方法。

請求項78

セグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。

請求項79

複数のVセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。

請求項80

Jセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。

請求項81

複数のJセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。

請求項82

Dセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。

請求項83

複数のDセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。

請求項84

クラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。

請求項85

複数のクラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。

請求項86

(e)(i)および(e)(ii)を得ることを含む、請求項68に記載の方法。

請求項87

(e)(ii)についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。

請求項88

体細胞高頻度変異からの可変性についての値を得ることを含む、請求項87に記載の方法。

請求項89

例えば、VD、DJまたはVJ連結部でのインデルの形成によってVD、DJまたはVJ連結部から生じる可変性についての値を得ることを含む、請求項87に記載の方法。

請求項90

CDRの、例えば重鎖CDR3の、可変性から生じる可変性についての値を得ることを含む、請求項87に記載の方法。

請求項91

前記対象区間が表10からの配列を含む、請求項87に記載の方法。

請求項92

前記対象区間の複数の固有のコピーの配列、例えば、前記対象区間における複数の固有のシグネチャーを得ることを含む、請求項87に記載の方法。

請求項93

前記(e)(ii)における値が、前記対象区間に対する複数の、例えばX個のシグネチャーにおける配列多様性についての値を含む、請求項87に記載の方法。

請求項94

前記値が、前記対象区間における固有のシグネチャーの数を含む、請求項87に記載の方法。

請求項95

前記値が、前記対象区間における固有のシグネチャーの表示、記録または一覧を含む、請求項87に記載の方法。

請求項96

前記値が、例えば、前記対象区間の全コピーの関数としての固有のコピーの数の尺度を含む、請求項87に記載の方法。

請求項97

Xが、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400または500以上である、請求項87に記載の方法。

請求項98

Xが1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000または50,000,000以上である、請求項87に記載の方法。

請求項99

前記複数のシグネチャーが全て、単一のVDJまたはVJの組み合わせに対するものであり、例えば、選択されたVDJまたはVJの組み合わせにおける配列多様性についての値を提供する、請求項87に記載の方法。

請求項100

前記可変性が、セグメント連結、例えば、VD、DJまたはVJ連結部における多様性、例えば前記連結部における挿入または欠損からの可変性を含む、請求項87に記載の方法。

請求項101

前記可変性が、体細胞高頻度変異からの可変性を含む、請求項87に記載の方法。

請求項102

前記複数のシグネチャーのそれぞれが、異なるVDJまたはVJの組み合わせに対するものである、請求項87に記載の方法。

請求項103

前記可変性が、セグメント連結、例えば、VD、DJまたはVJ連結部における多様性、例えば前記連結部における挿入または欠損からの可変性を含む、請求項87に記載の方法。

請求項104

前記ライブラリが、B細胞、例えば、B細胞悪性腫瘍を含む対象、例えばマントル細胞癌を含む対象、から作製される、請求項87に記載の方法。

請求項105

前記対象区間が、B細胞受容体からの、V、DもしくはJセグメントまたはVDもしくはDJ連結部をコードする配列を含む、請求項87に記載の方法。

請求項106

可変性、例えば体細胞高頻度変異、の量を比較値と比較することをさらに含み、前記比較値との予め選択された関係、例えば前記比較値より大きいことが、疾患の、転帰、予後またはステージを示す、請求項87に記載の方法。

請求項107

前記ライブラリを単一のベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項108

前記ライブラリを複数のベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項109

前記対象区間での配列;前記対象区間でのシグネチャー;または前記対象区間での対立遺伝子を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと、前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項110

前記対象区間での第2の配列;前記対象区間での第2のシグネチャー;または前記対象区間での第2の対立遺伝子を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成する、第2のベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項111

複数の、例えば少なくともX個の固有のベイトセットと接触させる段階を含み、前記複数のベイトセットのそれぞれが、前記対象区間からの異なる配列;前記対象区間での異なるシグネチャー;または前記対象区間での異なる対立遺伝子を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成し、Xが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である、請求項1に記載の方法。

請求項112

前記対象区間での第1の配列および第2の配列;前記対象区間での第1のシグネチャーおよび第2のシグネチャー;または前記対象区間での第1の対立遺伝子および第2の対立遺伝子を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項113

前記対象区間からの少なくともX個の配列;前記対象区間での少なくともX個のシグネチャー;または前記対象区間での少なくともX個の対立遺伝子を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含み、Xが、独立に、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である、請求項1に記載の方法。

請求項114

前記対象もしくは試料中において対象区間で存在しない、第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーを、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項115

前記対象区間が表10からの配列を含む、請求項1に記載の方法。

請求項116

第1のV、DまたはJセグメントからの配列および第2のV、DまたはJセグメントからの配列を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項117

前記対象区間が、V、DまたはJセグメントの配列を含む、請求項1に記載の方法。

請求項118

Vセグメント(DまたはJセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項119

Dセグメント(VまたはJセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項120

Jセグメント(VまたはDセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項121

Vセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項122

Dセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項123

Jセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項124

VD、DJまたはVJ連結部にまたがる(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項125

再編成されたVDJまたはVJ配列にまたがる(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項126

核酸類似体、例えばロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)または二環式核酸(BNA)を含む(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項127

機能的であるために十分に長いが、親和性最適化に十分短い(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項128

前記対象区間がサブゲノム区間を含む、請求項1に記載の方法。

請求項129

前記対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項1に記載の方法。

請求項130

サブゲノム区間の配列を得ることおよび発現サブゲノム区間の配列を得ることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項131

サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項132

発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項133

サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することおよび発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項134

サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含み、例えば、前記シグネチャー、例えば再編成、例えば転座が、対応するサブゲノム区間に存在する、請求項1に記載の方法。

請求項135

サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含み、例えば、前記シグネチャー、例えば再編成、例えば転座が、対応するサブゲノム区間における存在量の関数である、請求項1に記載の方法。

請求項136

評価することが、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての相対的存在量に対する値を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項137

前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを含み;段階(a)、(b)および(c)のうちの1つが、前記対象区間の第1の出現に対して、および前記対象区間の第2の出現に対して個別に行われ、例えば段階(a)、(b)および(c)のうち1つが、前記第1の出現に対して第1の反応混合物中で、および前記第2の出現に対して第2の反応混合物中で行われる、請求項1に記載の方法。

請求項138

(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)が個別に行われる、請求項137に記載の方法。

請求項139

前記対象区間の複数の固有のコピーの第1のコピーがサブゲノム区間を含む、請求項137に記載の方法。

請求項140

前記対象区間の複数の固有のコピーの第2のコピーが、サブゲノム区間、例えば前記サブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含む、請求項137に記載の方法。

請求項141

前記複数のうち第1の出現がサブゲノム区間を含み、例えば前記サブゲノム区間が、VDJ配列、例えば、特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含み;前記複数のうち第2の出現が発現サブゲノム区間を含み、例えば前記発現サブゲノム区間が、VDJ配列、例えば特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含む、請求項137に記載の方法。

請求項142

前記対象区間の第1の出現が、発現サブゲノム区間を含む、請求項141に記載の方法。

請求項143

前記対象区間の第2の出現が、発現サブゲノム区間を含む、請求項142に記載の方法。

請求項144

前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを含み;段階(a)、(b)および(c)のうちの少なくとも1つが、前記対象区間の第1の出現に対して、および対象区間の第2の出現に対して同じ反応混合物中で行われる、請求項1に記載の方法。

請求項145

(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが同じ反応混合物中で行われる、請求項144に記載の方法。

請求項146

段階(b)において、前記対象区間の複数の出現の第1のコピーを第1のベイトセットと接触させ、段階(b)において、前記対象区間の複数の出現の第2のコピーを第2のベイトセット、例えば、前記第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる、請求項144に記載の方法。

請求項147

段階(b)において、前記対象区間の複数の固有のコピーの第1のコピーをベイトセットと接触させ;段階(b)において、前記対象区間の複数の固有のコピーの第2のコピーを同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが同じ(1つまたは複数の)ベイトを含む、請求項144に記載の方法。

請求項148

前記対象区間および第2の異なる対象区間(異なるとは、異なる染色体位置から、を意味する。)の配列を得ることを含み、(1つまたは複数の)段階(a)、(b)および(c)のうち1つが、前記第1の対象区間に対して第1の反応混合物、および前記第2の対象区間に対して第2の反応混合物中で行われる、請求項1に記載の方法。

請求項149

(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが個別に行われる、請求項148に記載の方法。

請求項150

前記対象区間がサブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。

請求項151

前記第2の異なる対象区間がサブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。

請求項152

前記第1の対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。

請求項153

前記第2の異なる対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。

請求項154

前記第1の対象区間がサブゲノム区間を含み、前記第2の異なる対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。

請求項155

前記対象区間および第2の異なる対象区間(異なるとは、異なる染色体位置から、を意味する。)の配列を得ることを含み、段階(a)、(b)および(c)のうち少なくとも1つが、前記第1の対象区間に対しておよび第2の対象区間に対して同じ反応混合物中で行われる、請求項1に記載の方法。

請求項156

(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが同じ反応混合物中で行われる、請求項155に記載の方法。

請求項157

段階(b)において、第1の対象区間を第1のベイトセットと接触させ;段階(b)において、第2の対象区間を第2のベイトセット、例えば、前記第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる、請求項155に記載の方法。

請求項158

段階(b)において、第1の対象区間をベイトセットと接触させ;段階(b)において、第2の対象区間を同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが(1つまたは複数の)同じベイトを含む、請求項155に記載の方法。

請求項159

段階(a)〜(d)を反復することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項160

予め選択された期間の経過;障害、例えば癌の遺伝子型における変化;障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性または耐性の変化、例えば癌の場合、転移の発現;処置発現への反応性欠如;疾患もしくは障害の進行、再燃、再発または持続性の後に、段階(a)〜(d)を反復することを含む、請求項159に記載の方法。

請求項161

前記ライブラリが染色体DNAから作製される、請求項1に記載の方法。

請求項162

前記ライブラリがRNA、例えばmRNAから作製される、請求項1に記載の方法。

請求項163

(a)染色体DNAから作製されたライブラリからのサブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;(b)RNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;および例えば対象区間の選択された配列、対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいことを含む、請求項1に記載の方法。

請求項164

(a)およびまたは(b)が、(i)前記対象区間での対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、相対的存在量、対立遺伝子または前記対象区間での複数の対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または(ii)前記対象区間でのシグネチャーの分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、相対的存在量、シグネチャー、または前記対象区間での複数のシグネチャーのそれぞれの相対的存在量についての値;または(iii)シグネチャーまたは対象区間内の可変性、例えば体細胞高頻度変異についての値を得ることを含む、請求項163に記載の方法。

請求項165

段階(a)が(i)を含み、段階(b)が(i)を含む;段階(a)が(i)を含み、段階(b)が(ii)を含む;段階(a)が(i)を含み、段階(b)が(iii)を含む;段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(i)を含む;段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(ii)を含む;段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(iii)を含む;段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(i)を含む;段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(ii)を含む;または段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(iii)を含む、請求項164に記載の方法。

請求項166

前記ライブラリが、疾患状態組織から、例えば癌細胞から作製される、請求項1に記載の方法。

請求項167

前記ライブラリが、固形腫瘍、例えば本願中に記載の固形腫瘍からの細胞から作製される、請求項1に記載の方法。

請求項168

前記ライブラリが、浸潤固形腫瘍、例えば本願中に記載の固形腫瘍を有する細胞、例えばB細胞またはT細胞から作製される、請求項1に記載の方法。

請求項169

前記ライブラリが、血液悪性腫瘍、例えば、本願中に記載の血液悪性腫瘍からの細胞から作製される、請求項1に記載の方法。

請求項170

前記ライブラリが無細胞DNAから作製される、請求項1に記載の方法。

請求項171

前記ライブラリが、非疾患状態の組織から作製される、請求項1に記載の方法。

請求項172

前記ライブラリが、末梢血骨髄腫瘍組織、腫瘍浸潤物リンパ球、B細胞、プレB細胞、成熟B細胞、T細胞または無細胞DNAから作製される、請求項1に記載の方法。

請求項173

前記ライブラリが、腫瘍浸潤細胞、例えば腫瘍浸潤B細胞、プレB細胞、成熟B細胞またはT細胞から作製される、請求項1に記載の方法。

請求項174

前記ライブラリが、末梢B細胞、プレB細胞、成熟B細胞またはT細胞、例えばCD4+またはCD8+、T細胞から作製される、請求項1に記載の方法。

請求項175

非疾患状態組織、例えば腫瘍を付随しない細胞、例えば非腫瘍細胞、または末梢血リンパ球に対するクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項176

疾患状態組織、例えば腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞、または非癌性障害に対するクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項177

前記ライブラリがT細胞から作製され、前記サブゲノム区間がT細胞受容体、例えばアルファベータまたはデルタガンマ、TCR鎖をコードする配列を含む、請求項1に記載の方法。

請求項178

(a)第1の細胞タイプからの、例えば、前記第1の細胞タイプから作製される、例えば、前記第1の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;(b)第2の細胞タイプからの、例えば、前記第2の細胞タイプから作製される、例えば、前記第2の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいことを含む、請求項1に記載の方法。

請求項179

(a)第1の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;(b)第2の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいことを含む、請求項1に記載の方法。

請求項180

(a)染色体DNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;(b)RNA、例えばmRNA、例えばcDNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいことを含む、請求項1に記載の方法。

請求項181

(a)第1の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;(b)第2の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいことを含む、請求項1に記載の方法。

請求項182

前記第1の期間が予め選択された事象の前であり、第2の期間が予め選択された事象の後であり、前記予め選択された事象が、感染、医学的または外科的手順、例えば移植を受けること、診断または処置、例えば第1選択の処置もしくは第二選択の処置の投与、再発または再燃または疾患を含み得る、請求項181に記載の方法。

請求項183

疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること;および疾患状態細胞からの前記対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項184

疾患状態細胞からの第1の対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること;および疾患状態細胞からの第2の異なる対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項185

前記対象が癌を有する、請求項1に記載の方法。

請求項186

前記対象が血液癌を有する、請求項1に記載の方法。

請求項187

前記対象が固形腫瘍を有する、請求項1に記載の方法。

請求項188

前記ライブラリがB細胞から作製され、前記対象がB細胞悪性腫瘍、例えばマントル細胞癌を有する、請求項1に記載の方法。

請求項189

前記対象が癌以外の障害を有する、請求項1に記載の方法。

請求項190

前記対象が、免疫障害、例えば自己免疫障害免疫不全、例えば遺伝性または後天性免疫不全、例えばAIDSまたはHIV感染を有する、請求項1に記載の方法。

請求項191

前記対象が、移植片レシピエント、例えば、骨髄レシピエント、実質臓器レシピエントまたは皮膚移植片レシピエントである、請求項1に記載の方法。

請求項192

前記対象が、感染または感染性疾患、例えば、ウイルス性細菌性、原生動物性または真菌性の感染もしくは疾患を有する、請求項15に記載の方法。

請求項193

前記対象区間が、クローン事象を代表する、ヌクレオチド位置または連結部または配列を含む、請求項1に記載の方法。

請求項194

前記対象区間が、T細胞クローンまたはB細胞クローンを代表する、ヌクレオチド位置または連結部または配列を含む、請求項1に記載の方法。

請求項195

段階(c)または前記方法が、メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存する方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合するプライマーを用いて、前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーまたは何れかのメンバーを増幅することを含まない、請求項1に記載の方法。

請求項196

段階(d)が、前記ライブラリからのメンバー(またはライブラリキャッチ)からの対象区間に対するリードを得て;複数のメンバーのそれぞれについて、前記対象区間内のヌクレオチド位置に対する前記リードからヌクレオチド値を割り当てることを含む、請求項1に記載の方法。

請求項197

前記複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の5’または3’末端アダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項198

前記複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の5’および3’末端にアダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項199

前記複数のメンバーの各メンバーが、5’から3’方向に、5’アダプター配列、対象配列(例えば、ゲノムまたは転写配列)および3’アダプターを含む、請求項1に記載の方法。

請求項200

前記複数のメンバーの各メンバーが、5’から3’方向に、5’アダプター配列、対象配列(例えば、ゲノムまたは転写配列)および3’アダプターを含み、前記アダプターのうち1つが、識別子、例えばバーコードとして機能し得る配列を含む、請求項1に記載の方法。

請求項201

前記複数のものの各メンバーが、前記アダプター配列に特異的なプライマーで増幅される、請求項1に記載の方法。

請求項202

前記複数のものの各メンバーが、前記5’アダプターに結合するプライマーまたは前記3’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。

請求項203

前記複数のものの各メンバーが、前記5’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。

請求項204

前記複数のものの各メンバーが、前記3’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。

請求項205

前記複数のものの各メンバーが、前記アダプター配列に特異的なプライマーおよび前記メンバーにおける標的/対象核酸に特異的なプライマーを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。

請求項206

段階(d)が、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;アライメント方法、例えば本願中に記載のアライメント方法によって前記リードをアライメントし;予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイジアン法または本願中に記載の方法を用いて、例えば突然変異を呼び出す)ことを含む、請求項1に記載の方法。

請求項207

第2の、例えば第2の対象区間、例えば表1〜4または表5A〜9から選択される、例えば本願中に記載の遺伝子からの配列を含む対象区間の配列を提供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項208

第2の、例えば第2の対象区間、例えばmiRNA、プロモーターまたは他の要素をコードする配列を含む対象区間の配列を提供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項209

免疫グロブリンまたはT細胞またはB細胞受容体遺伝子以外の遺伝子からのものである第2の対象区間の配列を提供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項210

例えば表1〜4または表5A〜9から選択される、第3の、または少なくともX個のさらなる対象区間の配列を提供することを含み、Xが4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500と等しい、請求項1に記載の方法。

請求項211

前記第3の、またはX個のさらなる対象区間が、免疫グロブリン、B細胞受容体またはT細胞受容体遺伝子以外の遺伝子からのものである、請求項1に記載の方法。

請求項212

Xが、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500以上である、請求項211に記載の方法。

請求項213

(a)第1の細胞タイプからの、例えば前記第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される第1の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される第2の対象区間の配列を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項214

(a)第1の細胞タイプからの、例えば前記第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される第1の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される、第2、第3または少なくともX個のさらなる対象区間の配列を提供すること(Xは、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。)を含む、請求項1に記載の方法。

請求項215

(a)第1の細胞タイプからの、例えば前記第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される、第1の、第2の、または少なくともX個のさらなる対象区間のクローンプロファイルを評価し(Xは、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。);(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば、表1〜9から選択される、(X+1)番目の対象区間の配列を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項216

(a)第1の細胞タイプからの、例えば前記第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、またはそれ以上)の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、またはそれ以上)の対象区間の配列を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項217

前記第1の細胞タイプまたは前記第1の細胞タイプから作製されたライブラリが、前記第2の細胞タイプまたは前記第2の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料と同じ試料から得られる、請求項216に記載の方法。

請求項218

前記第1の細胞タイプまたは前記第1の細胞タイプから作製されたライブラリが、前記第2の細胞タイプまたは前記第2の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料とは異なる試料から得られる、請求項216に記載の方法。

請求項219

(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリ、例えば請求項1に記載のライブラリを得て;(b)それぞれが前記第2の(または続く)対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本願中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液または表面ハイブリダイゼーションの条件下で、前記ライブラリをベイトセットと接触させ;(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーを増幅し;(d)対象区間のそれぞれの配列を得ることによって、前記第2の(または続く)対象区間の配列を提供することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項220

段階(d)が、(d)(i)例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;(d)(ii)アライメント方法、例えば本願中に記載のアライメント方法によって前記リードをアライメントし;(d)(iii)予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチド値を割り当てる(例えばベイジアン法または本願中に記載の方法を用いて、例えば突然変異を呼び出す)ことを含む、請求項1に記載の方法。

請求項221

例えば、染色体腕の少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80もしくは90%または全てを含む、全腕または大きな再編成、例えば再編成、例えば転座、複製、挿入または欠失の出現について対象を評価する方法であって;(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリを得て;(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本願中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリをベイトセットと接触させ;(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーを増幅し;(d)全腕または大きな再編成の決定を可能にすることなどのために、染色体上に配置される複数の対象区間の配列を得ることを含む方法。

請求項222

前記大きな再編成が、例えば染色体の少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%もしくは50%、または染色体の腕(例えば長腕または短腕)の少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%に影響を及ぼす、請求項221に記載の方法。

請求項223

対象を評価する方法であって、(a)各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば血液癌試料からの複数の腫瘍メンバーを含む核酸ライブラリを得て;(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本願中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下で、前記ライブラリをベイトセットと接触させ;(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅し;(d)サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の配列を得て;それによって前記対象を評価することを含み;(i)前記方法が、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の両方を提供するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含み;(ii)前記方法が、サブゲノム区間を提供する第1のベイトセットおよび発現サブゲノム区間を提供する第2のベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含み;(iii)前記ライブラリがゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、前記方法が、発現サブゲノム区間を提供するためにベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;(iv)前記ライブラリがゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、前記方法が、発現サブゲノム区間を提供するために第2のベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;(v)前記方法が、第1の反応混合物において、第1の対象区間、例えばサブゲノム区間を提供するために、および第2の反応混合物において、例えば前記サブゲノム区間に対応する、第2の対象区間、例えば発現サブゲノム区間を提供するために、段階(a)、(b)および(c)のうち1つを実施することを含む、方法。

請求項224

(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが個別に行われる、請求項223に記載の方法。

請求項225

前記サブゲノム区間および発現サブゲノム区間が、独立して、表1〜4から選択される、請求項223に記載の方法。

請求項226

少なくともX個の対象区間の配列を提供することを含み、Xが、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500と等しいかまたはこれを超える、請求項223に記載の方法。

請求項227

前記サブゲノム区間および前記発現サブゲノム区間が、同じ対象区間に対応し、例えば、同じ遺伝子からの配列を含む、請求項223に記載の方法。

関連出願に対する相互参照

0001

本願は、2014年12月5日に出願された米国仮出願第62/088,457号の優先権を主張するものであり、前記出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0002

配列リスト
本願は、ASCII形式電子出願された配列リストを含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2015年12月3日に作成された前記ASCIIコピーは、F2036−7056WO_SL.txtという名称で、サイズは1,172バイトである。

技術分野

0003

本発明は、腫瘍試料からの核酸分析するための最適化された方法、例えば、最適化された核酸選択、リードアライメントおよび突然変異呼び出しを統合した方法に関する。

背景技術

0004

癌細胞ゲノム試験は、癌のより良好な理解の発展と、より効果的な処置アプローチの管理に対する著しい有望性を示す。ゲノム試験は、患者の癌細胞のゲノムの配列決定、およびそれらの細胞における何らかのゲノム変化の同定を含む。ゲノム変化には、とりわけ、例えば、突然変異、塩基置換再編成欠失、挿入が含まれ得る。特定の患者の癌に見られる場合、これらのゲノム変化を理解することは、より良好な処置を開発することにも役立ち、ゲノム変化情報を用いて特定の癌変異体を処置するための最良のアプローチを特定することに役立ち得る。

0005

明細書中に記載の方法は、関心領域を評価するための、例えば試料中の関心領域のクローンプロファイルを評価するための、ベイトセットへの試料核酸ハイブリダイゼーションの使用を提供する。例えば、本明細書中に記載の方法によって、体細胞変化、例えば、再編成または体細胞高頻度変異にさらされている遺伝子座の存在量または構造の分析が可能になる。本明細書中に記載の方法によって、選択配列、例えばVセグメント、または他の配列、例えば免疫グロブリン配列B細胞受容体(BCR)配列、またはT細胞受容体(TCR)配列の再編成および発現の評価が可能になる。本明細書中に記載の方法は、例えば選択されたシグネチャーまたはそれらを含有する細胞の相対的存在量を提供する、クローン分析を可能にする。典型的な非限定的な用途は、体細胞再編成抗体およびB細胞受容体またはT細胞受容体遺伝子におけるV、DまたJセグメントの使用を評価することである。本方法は、ゲノムレベル(例えば染色体DNAの分析)または転写レベル(例えばmRNAの分析)またはその両方で行い得る。一実施形態において、本方法は、第1の対象区間のクローンプロファイルおよび第2の予め選択された対象区間の配列、例えばVセグメントのクローンプロファイル、および別の遺伝子、例えば癌遺伝子における突然変異の出現または不在を提供する。一実施形態において、第1の細胞タイプにおける第1の対象区間のクローンプロファイルが提供される。別の実施形態において、第2の細胞タイプにおける第2の対象区間の配列が提供される。例えば、第1の細胞タイプは非悪性細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球(TIL)であり得、第2の細胞タイプは悪性細胞であり得る。第1の細胞タイプおよび第2の細胞タイプは、患者からの同じ試料、例えば腫瘍試料から得ることができる。したがって、本方法は、クローンプロファイルおよび体細胞突然変異、例えば、疾患、例えば癌に関連する体細胞突然変異の統合分析を提供する。

0006

したがって、一態様において、本発明は、対象における、対象区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間(またはそれを含有する細胞)のクローンプロファイルを評価または提供する方法であって、
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば固形腫瘍または血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)試料からの複数の腫瘍メンバー、を含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書ではライブラリキャッチと呼ばれることがある。)を提供するために、ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば、対象区間の増幅配列を提供するために、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅してもよく;
(d)対象区間の1回以上の出現の配列を得て、それによって対象区間のクローンプロファイルを提供または評価する
ことを含む方法を特徴とする。一実施形態において、段階(a)は、対象からの核酸を断片化する、例えばせん断することを含む。

0007

一実施形態において、段階(b)は、溶液ハイブリダイゼーションの条件下でライブラリをベイトセットと接触させることを含む。

0008

一実施形態において、段階(b)は、表面ベースのハイブリダイゼーションの条件下でライブラリをベイトセットと接触させることを含む。

0009

一実施形態において、段階(b)は、表面上のベイトセット、例えば複数のベイトを含む基材上に配置されたベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0010

一実施形態において、段階(c)は、メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存するかまたはそれを含む方法によって、例えば、メンバー中の標的/対象核酸に結合するプライマーを用いて、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含む。

0011

一実施形態において、段階(c)は、プライマー対を用いて複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含み、そのメンバーの標的/対象核酸にプライマー対の少なくとも一方のメンバーが結合しない。

0012

一実施形態において、段階(c)は、メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しないか、またはそれを含まない方法によって複数の選択メンバーの各メンバーを増幅すること含む。

0013

一実施形態において、段階(c)は、メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマー対を用いて複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含む。

0014

一実施形態において、対象区間はサブゲノム区間を含む。

0015

一実施形態において、対象区間は発現サブゲノム区間を含む。

0016

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む。

0017

一実施形態において、本方法は、対象区間での第1の対立遺伝子またはシグネチャー(例えば第1のVセグメント)の配列を、比較値、例えば予め選択された値、例えば第2の対立遺伝子またはシグネチャー(例えば第2のVセグメント)の配列の関数である値と比較することを含む。

0018

一実施形態において、本方法は、
(e)(i)対象区間での配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)、存在量または同一性、例えば配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子の相対的存在量、または対象区間での複数の配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または
(ii)可変性、例えば、体細胞高頻度変異から生じる配列可変性、例えば連結部でのインデルの形成による、VD、DJまたはVJ連結、またはCDR、例えば重鎖CDR3から生じる配列可変性、シグネチャーまたは対象区間内の配列可変性についての値であって、例えば、可変性についての値が、対象または試料中の対象区間について存在する異なる変異体の数の関数である値
を得ることをさらに含む。

0019

一実施形態において、(i)は、対象区間での第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在量に対する、対象区間での第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在量についての値を得ることを含む。一実施形態において、(i)は、第2の対象区間での第2の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在量に対する、対象区間での第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在量についての値を得ることを含む。

0020

一実施形態において、(i)は、対象区間での複数の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在量に対する、対象区間での第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在量についての値を得ることを含む。

0021

一実施形態において、(i)は、発現サブゲノム区間で、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば再編成、例えば転座の出現またはレベルについての値を得ることを含む。

0022

一実施形態において、本方法は、対応するサブゲノム区間での、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば再編成、例えば転座の出現またはレベルについての値を得ることをさらに含む。

0023

一実施形態において、(ii)は、対象区間で生じる、異なる配列、対立遺伝子またはシグネチャーの数についての値を得ることを含む。

0024

一実施形態において、本方法は、(e)(i)を得ることを含む。

0025

一実施形態において、本方法は、シグネチャーに対して(e)(i)を得ることを含む。

0026

一実施形態において、本方法は、対立遺伝子に対して(e)(i)を得ることを含む。

0027

一実施形態において、本方法は、(e)(ii)を得ることを含む。

0028

一実施形態において、本方法は、第1の対象区間での、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えばVセグメント、またはVDJもしくはVJ再編成のクローンプロファイル;および
i)対象の表現型、例えば疾患状態;または
ii)第2の対象区間での遺伝子型、例えば表1〜9から選択される遺伝子またはMHC遺伝子、例えばMHCクラスIまたはMHCクラスII遺伝子の遺伝子型、
を提供することを含む。

0029

一実施形態において、表現型は、
感染因子、例えば、細菌、ウイルス原生動物または真菌による感染;
疾患のステージ
障害、例えば癌の遺伝子型の変化;
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性もしくは耐性における変化、例えば癌の場合、転移の発現;
処置発現(treatment develops)への反応性
疾患または障害の進行、再燃再発または持続
疾患に関連する薬剤への事前曝露
抗原またはワクチンへの事前の曝露もしくは反応;
対象からのプロテオミクスデータ;
年齢
性別
体重;
病歴、例えば、疾患の既往歴もしくは以前の処置;または
環境的もしくは職業的要因
を含む。

0030

一実施形態において、第2の対象区間での遺伝子型は、例えば表1〜9からの遺伝子における、体細胞突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む。

0031

一実施形態において、段階(d)は:
(i)対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得て、例えば、Vセグメントを含む対象区間の第1の出現およびVセグメントを含む区間の第2の出現の配列を得ることを含み、この第1および第2の出現は、VD、DJまたはVJ連結部での多様性によって異なるか;または
(ii)第1の対象区間および第2の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば第1の対象区間は第1の遺伝子からの配列を含み、第2の対象区間は第2の遺伝子からの配列を含む。

0032

一実施形態において、段階(d)は、対象区間の複数の出現、例えば、VDJ配列を含む対象区間の複数の出現、例えば、特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含む対象区間の複数の出現、のそれぞれの配列を得ることを含む。

0033

一実施形態において、対象区間の複数の出現の第1の出現は、サブゲノム区間を含む。

0034

一実施形態において、対象区間の複数の出現の第2の出現は、サブゲノム区間を含む。

0035

一実施形態において、対象区間の複数の出現の第1の出現は、発現サブゲノム区間を含む。

0036

一実施形態において、対象区間の複数の出現の第2の出現は、発現サブゲノム区間を含む。

0037

一実施形態において、対象区間の複数の出現の第1の出現は、サブゲノム区間、例えば再編成、例えば転座を含み;対象区間の複数の出現の第2の出現は、発現サブゲノム区間、例えばサブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含み、これは例えば、ゲノムの、例えば体細胞ゲノムの再編成の発現の評価を可能にし、例えばゲノム再編成およびその発現の相対的存在量の評価を可能にする。

0038

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含む。

0039

一実施形態において、段階(d)は、第1の対象区間および第2の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば、第1および第2の区間は、対象区間からの異なるゲノム配列、例えば第1の遺伝子からの配列および第2の遺伝子からの配列に対応する。

0040

一実施形態において、第1の対象区間はVDJセグメントの第1の組み合わせを含み、第2の対象区間はVDJセグメントの第2の組み合わせを含み、例えば第1の対象区間は第1のVセグメントを含み、第2の対象区間は第2のVセグメントを含む。

0041

一実施形態において、第1の対象区間は第1のサブゲノム区間を含み、第2の対象区間は第2のサブゲノム区間を含む。

0042

一実施形態において、第1の対象区間は第1の発現サブゲノム区間を含み、第2の対象区間は第2の発現サブゲノム区間を含む。

0043

一実施形態において、第1の対象区間はサブゲノム区間を含み、第2の対象区間は発現サブゲノム区間を含む。

0044

一実施形態において、評価することは、癌の第1のクローンに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0045

一実施形態において、評価することは、癌の第2のクローンに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0046

一実施形態において、評価することは、例えば参照物に対する、例えば、癌の第2のクローンの存在量に対する、癌の第1クローンの存在量についての値を提供することを含む。

0047

一実施形態において、本方法は、遺伝子型を含む癌の第1のクローンおよび第2の遺伝子型を含む第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む。

0048

一実施形態において、本方法は、第1の突然変異、例えば再編成を含む癌の第1のクローンおよび突然変異を含まない第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む。

0049

一実施形態において、本方法は、第1の突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む癌の第1のクローンおよび第2の突然変異、例えば再編成、例えば転位を含む第2のものを含まない第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む。

0050

一実施形態において、評価することは、第1のVセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0051

一実施形態において、評価することは、第2のVセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0052

一実施形態において、評価することは、第1のVセグメントおよび第2のVセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む。

0053

一実施形態において、評価することは、第1のDセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0054

一実施形態において、評価することは、第2のDセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0055

一実施形態において、評価することは、第1のDセグメントおよび第2のDセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む。

0056

一実施形態において、評価することは、第1のJセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0057

一実施形態において、評価することは、第2のJセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0058

一実施形態において、評価することは、第1のJセグメントおよび第2のJセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む。

0059

一実施形態において、評価することは、第1のVDJまたはVJの組み合わせに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0060

一実施形態において、評価することは、第2のVDJまたはVJの組み合わせに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0061

一実施形態において、評価することは、第1のVDJまたはVJの組み合わせおよび第2のVDJまたはVJの組み合わせの相対的存在量についての値を提供することを含む。

0062

一実施形態において、評価することは、抗体軽鎖に対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0063

一実施形態において、評価することは、抗体重鎖に対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0064

一実施形態において、評価することは、抗体軽鎖および抗体重鎖の相対的存在量の値を提供することを含む。

0065

一実施形態において、評価することは、サブゲノム区間における配列、対立遺伝子またはシグネチャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0066

一実施形態において、評価することは、発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0067

一実施形態において、評価することは、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーに対する、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての相対的存在量についての値を提供することを含む。

0068

一実施形態において、評価することは、対象区間中の遺伝子座、例えばV、D、またはJセグメントにおける高頻度変異に対する可変性を提供することを含む。

0069

一実施形態において、評価することは、例えば対象区間において連結部でインデルを形成することによって、VD、DJまたはVJ連結部から生じる可変性を提供することを含む。

0070

一実施形態において、評価することは、対象区間においてCDR、例えば重鎖CDR3における可変性を提供することを含む。

0071

一実施形態において、評価することは、表10からの配列(またはその配列を含む細胞)に対するクローンプロファイルを提供することを含む。

0072

一実施形態において、本方法は、(e)(i)についての値を得ることを含む。

0073

一実施形態において、(e)(i)の値は、比較値、例えば予め選択された値、例えば第2の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子(例えば第2のVセグメント)の存在量の関数である値に対する、対象区間における配列、シグネチャーまたは対立遺伝子(例えば第1のVセグメント)の存在量についての値を含む。

0074

一実施形態において、(e)(i)の値は、比較値、例えば予め選択された値、例えば事象欠く配列、例えば対象区間中の非突然変異または非再編成配列の存在量の関数である値に対する、対象区間における事象、例えば配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば突然変異または再編成の存在量についての値を含む。

0075

一実施形態において、(e)(i)の値は、対象区間でX個の固有の(すなわち互いに異なる)配列、シグネチャーまたは対立遺伝子のそれぞれについての相対的存在量の値を含む。

0076

一実施形態において、Xは、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100または200以上である。

0077

一実施形態において、Xは、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000または50,000,000以上である。

0078

一実施形態において、本方法は、例えば、存在量の関数、例えば相対的存在量として、例えばヒストグラムとして、(e)(i)の値を表示することをさらに含む。

0079

一実施形態において、対象区間は、Igスーパーファミリー受容体、例えばT細胞受容体またはB細胞受容体からの配列を含む。

0080

一実施形態において、対象区間は、Vセグメント、DセグメントまたはJセグメントからの配列を含む。

0081

一実施形態において、対象区間は、表10からの配列を含む。

0082

一実施形態において、本方法は、Vセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。

0083

一実施形態において、本方法は、複数の、Vセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。

0084

一実施形態において、本方法は、Jセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。

0085

一実施形態において、本方法は、複数の、Jセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。

0086

一実施形態において、本方法は、Dセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。

0087

一実施形態において、本方法は、複数の、Dセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。

0088

一実施形態において、本方法は、クラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。

0089

一実施形態において、本方法は、複数の、クラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。

0090

一実施形態において、本方法は、(e)(i)および(e)(ii)を得ることを含む。

0091

一実施形態において、本方法は、(e)(ii)についての値を得ることを含む。

0092

一実施形態において、本方法は、体細胞高頻度変異からの可変性についての値を得ることを含む。

0093

一実施形態において、本方法は、例えば、連結部でのインデルの形成によってVD、DJまたはVJ連結部から生じる可変性についての値を得ることを含む。

0094

一実施形態において、本方法は、CDR、例えば重鎖CDR3可変性から生じる可変性についての値を得ることを含む。

0095

一実施形態において、対象区間は、表10からの配列を含む。

0096

一実施形態において、本方法は、対象区間の複数の固有のコピー、例えば、対象区間での複数の固有のシグネチャー、の配列を得ることを含む。

0097

一実施形態において、(e)(ii)における値は、対象区間に対する複数の、例えばX個のシグネチャーにおける配列多様性についての値を含む。

0098

一実施形態において、値は、対象区間での固有のシグネチャーの数を含む。

0099

一実施形態において、値は、対象区間での固有のシグネチャーの表示、記録または一覧を含む。

0100

一実施形態において、値は、例えば、対象区間の総コピーの関数としての固有のコピーの数の尺度を含む。

0101

一実施形態において、Xは、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400または500以上である。

0102

一実施形態において、Xは、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000または50,000,000以上である。

0103

一実施形態において、複数のシグネチャーは全て、単一のVDJまたはVJの組み合わせに対するものであり、例えば、選択されたVDJまたはVJの組み合わせにおける配列多様性についての値を提供する。

0104

一実施形態において、可変性は、セグメント連結、例えば、VD、DJまたはVJ連結部での多様性、例えば連結部での挿入または欠失からの可変性を含む。

0105

一実施形態において、可変性は、体細胞高頻度変異からの可変性を含む。

0106

一実施形態において、複数のシグネチャーのそれぞれは、異なるVDJまたはVJの組み合わせに対するものである。

0107

一実施形態において、可変性は、セグメント連結部、例えば、VD、DJまたはVJ連結部での多様性、例えば連結部での挿入または欠失からの可変性を含む。

0108

一実施形態において、ライブラリは、例えば、B細胞悪性腫瘍を含む対象、例えばマントル細胞癌を含む対象からのB細胞から作製される。

0109

一実施形態において、対象区間は、B細胞受容体からの、V、DもしくはJセグメントまたはVDもしくはDJ連結部をコードする配列を含む。

0110

一実施形態において、本方法は、可変性、例えば体細胞高頻度変異、の量を比較値と比較することをさらに含み、比較値との予め選択された関係、例えば比較値より大きいことは、疾患の、転帰、予後またはステージを示す。

0111

一実施形態において、本方法は、ライブラリを単一のベイトセットと接触させることを含む。

0112

一実施形態において、本方法は、ライブラリを複数のベイトセットと接触させることを含む。

0113

一実施形態において、本方法は、
対象区間での配列;
対象区間でのシグネチャー;または
対象区間での対立遺伝子
捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0114

一実施形態において、本方法は、
対象区間での第2の配列;
対象区間での第2のシグネチャー;または
対象区間での第2の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成する第2のベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0115

一実施形態において、本方法は、複数の、例えば少なくともX個の固有のベイトセットと接触させることを含み、複数のベイトセットのそれぞれは、
対象区間からの異なる配列;
対象区間での異なるシグネチャー;または
対象区間での異なる対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはこれとハイブリッド形成し、
Xは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である。

0116

一実施形態において、本方法は、
対象区間での第1の配列および第2の配列;
対象区間での第1のシグネチャーおよび第2のシグネチャー;または
対象区間での第1の対立遺伝子および第2の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む。

0117

一実施形態において、本方法は、
対象区間からの少なくともX個の配列;
対象区間での少なくともX個のシグネチャー;または
対象区間での少なくともX個の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含み、
Xは、独立に、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である。

0118

一実施形態において、本方法は、対象もしくは試料における対象区間で存在しない、第1の配列、対立遺伝子もしくはシグネチャーを捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む。

0119

一実施形態において、対象区間は、表10からの配列を含む。

0120

一実施形態において、本方法は、第1のV、DもしくはJセグメントからの配列および第2のV、DもしくはJセグメントからの配列を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む。

0121

一実施形態において、対象区間は、V、DまたはJセグメントの配列を含む。

0122

一実施形態において、本方法は、Vセグメント(DまたはJセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0123

一実施形態において、本方法は、Dセグメント(VまたはJセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0124

一実施形態において、本方法は、Jセグメント(VまたはDセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0125

一実施形態において、本方法は、Vセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0126

一実施形態において、本方法は、Dセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0127

一実施形態において、本方法は、Jセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0128

一実施形態において、本方法は、VD、DJまたはVJ連結部にまたがる(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0129

一実施形態において、本方法は、再編成されたVDJまたはVJ配列にまたがる(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0130

一実施形態において、本方法は、核酸類似体、例えばロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)または二環式核酸(BNA)を含む(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0131

一実施形態において、本方法は、機能的であるために十分に長いが、親和性最適化に十分短い(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットとライブラリを接触させることを含む。

0132

一実施形態において、対象区間はサブゲノム区間を含む。

0133

一実施形態において、対象区間は発現サブゲノム区間を含む。

0134

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間の配列を得ることおよび発現サブゲノム区間の配列を得ることを含む。

0135

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む。

0136

一実施形態において、本方法は、発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む。

0137

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することおよび発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む。

0138

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含み、例えば、シグネチャー、例えば再編成、例えば転座が対応するサブゲノム区間に存在する。

0139

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含み、例えば、シグネチャー、例えば再編成、例えば転座は、対応するサブゲノム区間における存在量の関数である。

0140

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての相対的存在量についての値を提供することを含む評価することを含む。

0141

一実施形態において、本方法は、対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを含み;
段階(a)、(b)および(c)のうちの1つが、対象区間の第1の出現および対象区間の第2の出現に対して個別に行われ、例えば段階(a)、(b)および(c)のうち1つが、第1の出現に対して第1の反応混合物中で、および第2の出現に対して第2の反応混合物中で行われる。

0142

一実施形態において、(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または(a)、(b)および(c)は個別に行われる。

0143

一実施形態において、対象区間の複数の固有のコピーの第1のコピーは、サブゲノム区間を含む。

0144

一実施形態において、対象区間の複数の固有のコピーの第2のコピーは、サブゲノム区間、例えばサブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含む。

0145

一実施形態において、複数のうち第1の出現はサブゲノム区間を含み、例えばこのサブゲノム区間は、VDJ配列、例えば、特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含み;
複数のうち第2の出現は発現サブゲノム区間を含み、例えばこの発現サブゲノム区間は、VDJ配列、例えば特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含む。

0146

一実施形態において、対象区間の第1の出現は、発現サブゲノム区間を含む。

0147

一実施形態において、対象区間の第2の出現は、発現サブゲノム区間を含む。

0148

一実施形態において、本方法は、対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを含み;
段階(a)、(b)および(c)のうちの少なくとも1つが、対象区間の第1の出現に対しておよび対象区間の第2の出現に対して同じ反応混合物中で行われる。

0149

一実施形態において、(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが同じ反応混合物中で行われる。

0150

一実施形態において、
段階(b)において、対象区間の複数の出現の第1のコピーを第1のベイトセットと接触させ、
段階(b)において、対象区間の第2の出現を第2のベイトセット、例えば、第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる。

0151

一実施形態において、段階(b)において、対象区間の複数の固有のコピーの第1のコピーをベイトセットと接触させ;段階(b)において、対象区間の複数の固有のコピーの第2のコピーを同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが同じ(1つまたは複数の)ベイトを含む。

0152

一実施形態において、本方法は、対象区間および第2の異なる対象区間(異なるとは、異なる染色体位置から、を意味する。)の配列を得ることを含み、段階(a)、(b)および(c)のうち1つは、第1の対象区間のために第1の反応混合物において、および第2の対象区間のために第2の反応混合物中で行われる。

0153

一実施形態において、(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが個別に行われる。

0154

一実施形態において、対象区間はサブゲノム区間を含む。

0155

一実施形態において、第2の異なる対象区間はサブゲノム区間を含む。

0156

一実施形態において、第1の対象区間は発現サブゲノム区間を含む。

0157

一実施形態において、第2の異なる対象区間は発現サブゲノム区間を含む。

0158

一実施形態において、第1の対象区間はサブゲノム区間を含み、第2の異なる対象区間は発現サブゲノム区間を含む。

0159

一実施形態において、本方法は、対象区間および第2の異なる対象区間(異なるとは、異なる染色体位置から、を意味する。)の配列を得ることを含み、段階(a)、(b)および(c)のうち少なくとも1つは、第1の対象区間のためにおよび第2の対象区間のために同じ反応混合物中で行われる。

0160

一実施形態において、(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが同じ反応混合物中で行われる。

0161

一実施形態において、段階(b)において、第1の対象区間を第1のベイトセットと接触させ;段階(b)において、第2の対象区間を第2のベイトセット、例えば、第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる。

0162

一実施形態において、段階(b)において、第1の対象区間をベイトセットと接触させ;段階(b)において、第2の対象区間を同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが同じ(1つまたは複数の)ベイトを含む。

0163

一実施形態において、本方法は、段階(a)〜(d)を反復すること段階を含む。

0164

一実施形態において、本方法は、次の1つ以上の後に、段階(a)〜(d)を反復することを含む:
予め選択された期間の経過;
障害、例えば癌の遺伝子型変化;
障害の発現における変化、例えば癌の場合は、処置に対する攻撃性または耐性における変化、例えば癌の場合は、転移の発現;
処置発現(treatment develops)への反応性欠如;または
疾患もしくは障害の進行、再燃、再発または持続性

0165

一実施形態において、ライブラリは染色体DNAから作製される。

0166

一実施形態において、ライブラリは、RNA、例えばmRNAから作製される。

0167

一実施形態において、本方法は:
(a)染色体DNAから作製されたライブラリからのサブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)RNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の選択配列、対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。

0168

一実施形態において、段階(a)およびまたは(b)は、
(i)対象区間での対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、対象区間での、相対的存在量、対立遺伝子または複数の対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または
(ii)対象区間でのシグネチャーの分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、対象区間での、相対的存在量、シグネチャー、または複数のシグネチャーのそれぞれの相対的存在量についての値;または
(iii)シグネチャーまたは対象区間内の可変性、例えば体細胞高頻度変異についての値
を得ることを含む。

0169

一実施形態において、
段階(a)は(i)を含み、段階(b)は(i)を含むか;
段階(a)は(i)を含み、段階(b)は(ii)を含むか;
段階(a)は(i)を含み、段階(b)は(iii)を含むか;
段階(a)は(ii)を含み、段階(b)は(i)を含むか;
段階(a)は(ii)を含み、段階(b)は(ii)を含むか;
段階(a)は(ii)を含み、段階(b)は(iii)を含むか;
段階(a)は(iii)を含み、段階(b)は(i)を含むか;
段階(a)は(iii)を含み、段階(b)は(ii)を含むか;または
段階(a)は(iii)を含み、段階(b)は(iii)を含む。

0170

一実施形態において、ライブラリは、疾患状態組織から、例えば癌細胞から作製される。

0171

一実施形態において、ライブラリは、固形腫瘍、例えば本明細書中に記載の固形腫瘍からの細胞から作製される。

0172

一実施形態において、ライブラリは、浸潤固形腫瘍、例えば本明細書中に記載の固形腫瘍を有する細胞、例えばB細胞またはT細胞から作製される。

0173

一実施形態において、ライブラリは、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)、例えば、本明細書中に記載の血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)からの細胞から作製される。

0174

一実施形態において、ライブラリは無細胞DNAから作製される。

0175

一実施形態において、ライブラリは、非疾患状態の組織から作製される。

0176

一実施形態において、ライブラリは、末梢血骨髄腫瘍組織、腫瘍浸潤細胞、リンパ球、B細胞、プレB細胞、成熟B細胞、T細胞または無細胞DNAから作製される。

0177

一実施形態において、ライブラリは、腫瘍浸潤細胞、例えば腫瘍浸潤B細胞、プレB細胞、成熟B細胞またはT細胞から作製される。

0178

一実施形態において、ライブラリは、末梢B細胞、プレB細胞、成熟B細胞またはT細胞、例えばCD4+もしくはCD8+、T細胞から作製される。

0179

一実施形態において、本方法は、非疾患状態組織、例えば腫瘍を付随しない細胞、例えば非腫瘍細胞、または末梢血リンパ球に対するクローンプロファイルを評価することを含む。

0180

一実施形態において、本方法は、疾患状態組織、例えば腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞に対する、または非癌性障害に対するクローンプロファイルを評価することを含む。

0181

一実施形態において、ライブラリはT細胞から作製され、サブゲノム区間はT細胞受容体、例えばアルファベータまたはデルタガンマ、TCR鎖をコードする配列を含む。

0182

一実施形態において、本方法は、
(a)第1の細胞タイプからの、例えば、第1の細胞タイプから作製された、例えば、第1の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の細胞タイプからの、例えば、第2の細胞タイプから作製された、例えば、第2の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。

0183

一実施形態において、本方法は、
(a)第1の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。

0184

一実施形態において、本方法は:
(a)染色体DNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)RNA、例えばmRNA、例えばcDNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。

0185

一実施形態において、本方法は、
(a)第1の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。

0186

一実施形態において、この第1の期間は予め選択された事象の前であり、第2の期間は予め選択された事象の後であり、この予め選択された事象は、感染、医学的または外科的手順、例えば移植診断、処置、例えば第1選択の処置もしくは第2選択の処置を受けること、再発または再燃または疾患を含み得る。

0187

一実施形態において、本方法は、
疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること;および
疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること
を含む。

0188

一実施形態において、本方法は、
疾患状態細胞からの第1の対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること;および
疾患状態細胞からの第2の異なる対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること
を含む。

0189

一実施形態において、対象は癌を有する。別の実施形態において、対象は、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)を有する。さらに別の実施形態において、対象は固形腫瘍を有する。

0190

一実施形態において、ライブラリはB細胞から作製され、対象はB細胞悪性腫瘍、例えばマントル細胞癌を有する。

0191

一実施形態において、対象は癌以外の障害を有する。

0192

一実施形態において、対象は、免疫障害、例えば自己免疫障害免疫不全、例えば遺伝性もしくは後天性免疫不全、例えばAIDSまたはHIV感染を有する。

0193

一実施形態において、対象は、移植片レシピエント、例えば、骨髄レシピエント、実質臓器レシピエントまたは皮膚移植片レシピエントである。

0194

一実施形態において、対象は、感染または感染性疾患、例えば、ウイルス性細菌性、原生動物性または真菌性の感染もしくは疾患を有する。

0195

一実施形態において、対象区間は、クローン事象を代表する、ヌクレオチド位置または連結部または配列を含む。

0196

一実施形態において、対象区間は、T細胞クローンまたはB細胞クローンを代表する、ヌクレオチド位置または連結部または配列を含む。

0197

一実施形態において、段階(c)または本方法は、メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存する方法によって、例えば、メンバー中の標的/対象核酸に結合するプライマーを用いて、複数のものの各メンバーを増幅することによって、複数のものの各メンバーまたは何れかのメンバーを増幅することを含まない。

0198

一実施形態において、段階(d)は、
前記ライブラリからのメンバー(またはライブラリキャッチ)からの対象区間に対するリードを得て;
複数のメンバーのそれぞれについて、対象区間内のヌクレオチド位置に対するリードからヌクレオチド値を割り当てること
を含む。

0199

一実施形態において、本方法は、複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の5’または3’末端アダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む。

0200

一実施形態において、本方法は、複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の5’および3’末端にアダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む。

0201

一実施形態において、前記の複数のメンバーの各メンバーは、5’から3’方向に、5’アダプター配列、対象配列(例えばゲノム配列または転写配列)および3’アダプターを含む。

0202

一実施形態において、前記の複数のメンバーの各メンバーは、5’から3’方向に、5’アダプター配列、対象配列(例えばゲノム配列または転写配列)および3’アダプターを含み、このアダプターのうち1つは、識別子、例えばバーコードとして機能し得る配列を含む。

0203

一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、アダプター配列に特異的なプライマーを用いて増幅される。

0204

一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、5’アダプターに結合するプライマーまたは3’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される。

0205

一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、5’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される。

0206

一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、3’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される。

0207

一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、アダプター配列に特異的なプライマーおよびメンバーにおける標的/対象核酸に特異的なプライマーを用いて増幅される。

0208

一実施形態において、段階(d)は、
例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;
アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記のリードからヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて突然変異を呼び出す)ことを含む。

0209

対象区間に対するクローンプロファイルを提供するための本明細書中に記載の方法は、他の情報を提供する方法で増強され得る。一実施形態において、本方法は、例えば、体細胞再編成または体細胞高頻度変異を受けない遺伝子、例えば、免疫グロブリン遺伝子以外およびT細胞受容体遺伝子以外の遺伝子に対してクローンプロファイルが提供されるもの以外の遺伝子に対する対象区間の配列を提供し得る。これらの配列は、関心のある核酸を回収するための溶液ハイブリダイゼーションおよびベイトの使用によって提供され得る。

0210

一実施形態において、本方法は、第2の、例えば第2の対象区間、例えば表1〜9から選択される本明細書中に記載の遺伝子からの配列を含む対象区間の配列を提供することをさらに含む。

0211

一実施形態において、本方法は、第2の、例えば第2の対象区間、例えばmiRNA、プロモーターまたは他の要素をコードする配列を含む対象区間の配列を提供することをさらに含む。

0212

一実施形態において、本方法は、免疫グロブリンまたはT細胞またはB細胞受容体遺伝子以外の遺伝子からのものである第2の対象区間の配列を提供することをさらに含む。一実施形態において、本方法は、例えば表1〜9から選択される、第3の、または少なくともX個のさらなる対象区間の配列を提供すること(Xは4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500と等しい。)を含む。

0213

一実施形態において、第3の、またはX個のさらなる対象区間は、免疫グロブリン、B細胞受容体またはT細胞受容体遺伝子以外の遺伝子由来である。

0214

一実施形態において、Xは、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500以上である。

0215

一実施形態において、本方法は、
(a)第1の細胞タイプからの、例えば第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される第1の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される第2の対象区間の配列を提供すること
を含む。

0216

一実施形態において、本方法は、
(a)第1の細胞タイプからの、例えば第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される第1の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される、第2、第3または少なくともX個のさらなる対象区間の配列を提供すること(Xは、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。)
を含む。

0217

一実施形態において、本方法は、
(a)第1の細胞タイプからの、例えば第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される、第1の、第2の、または少なくともX個のさらなる対象区間のクローンプロファイルを評価すること(Xは、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。);および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば、表1〜9から選択される、(X+1)番目の対象区間の配列を提供すること
を含む。

0218

一実施形態において、本方法は、
(a)第1の細胞タイプからの、例えば第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、またはそれ以上)の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500以上)の対象区間の配列を提供すること
を含む。

0219

一実施形態において、第1の細胞タイプまたは第1の細胞タイプから作製されたライブラリは、第2の細胞タイプまたは第2の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料と同じ試料から得られる。例えば、試料は、非癌細胞(または非悪性細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球)および癌細胞(または悪性細胞)の両方を含有し得る。

0220

一実施形態において、第1の細胞タイプまたは第1の細胞タイプから作製されたライブラリは、第2の細胞タイプまたは第2の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料とは異なる試料から得られる。例えば、第1の細胞タイプ、または第1の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料は、非癌細胞(または非悪性細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球)を含有し得、本質的に癌細胞(または悪性細胞)不含であり;第2の細胞タイプまたは第2の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料は、癌細胞(または悪性細胞)を含有し得、本質的に非癌細胞(または非悪性細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球)不含である。

0221

一実施形態において、第1の細胞タイプおよび第2の細胞タイプは、同時に得られる。別の実施形態において、第1の細胞タイプは、例えば、第2の細胞タイプが得られる前、少なくとも1日、2日、3日、1週間、2週間、3週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月または6カ月前に得られる。また別の実施形態において、第1の細胞タイプは、例えば、第2の細胞タイプが得られた後、少なくとも1日、2日、3日、1週間、2週間、3週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月または6カ月後に得られる。

0222

一実施形態において、本方法は、第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)を試料、例えば腫瘍試料から単離することをさらに含む。別の実施形態において、本方法は、第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞を試料、例えば腫瘍試料から単離することをさらに含む。また別の実施形態において、本方法は、第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)を単離し;第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞を、試料、例えば腫瘍試料から単離することをさらに含む。

0223

一実施形態において、本方法は、第1の細胞タイプ(例えば非癌細胞または非悪性細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球)、第2の細胞タイプ(例えば癌細胞または悪性細胞)または両方を試料、例えば腫瘍試料から単離することなく行われ、例えばライブラリが作製される。

0224

一実施形態において、本方法は、
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリ、例えば本明細書中に記載のライブラリを得て;
(b)それぞれが第2の(または続く)対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液または表面ハイブリダイゼーションの条件下で、このライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えばメンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数のものの各メンバーを増幅することによって、複数のものの各メンバーを増幅し;
(d)対象区間のそれぞれの配列を得ること
によって、第2の(または続く)対象区間の配列を提供することを含む。

0225

一実施形態において、段階(d)は、
(d)(i)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;
(d)(ii)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記リードをアライメントし;
(d)(iii)予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記のリードからヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて突然変異を呼び出す)
ことを含む。

0226

別の態様において、本発明は、例えば、染色体腕の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%もしくは90%または全てを含む、全腕または大きな再編成、例えば再編成、例えば転座、複製、挿入または欠失の発生について対象を評価する方法であって;
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下でライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えばメンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数のものの各メンバーを増幅することによって、複数のものの各メンバーを増幅し;
(d)全腕または大きな再編成の判定を可能にすることなどのために染色体上に配置される複数の対象区間の配列を得る
ことを含む方法を特色とする。

0227

本明細書中で使用される場合、「大きな再編成」とは、例えば染色体の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%もしくは70%または染色体の腕(例えば長腕または短腕)の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%に影響を及ぼす再編成を指す。

0228

また別の態様において、本発明は対象を評価する方法であって、
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば血液癌試料からの複数の腫瘍メンバーを含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下でライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えばメンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅し;
(d)サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の配列を得て
それによって対象を評価すること
を含む方法を特徴とし;
(i)本方法は、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の両方を提供するベイトセットとライブラリを接触させることを含み;
(ii)本方法は、サブゲノム区間を提供する第1のベイトセットおよび発現サブゲノム区間を提供する第2のベイトセットとライブラリを接触させることを含み;
(iii)ライブラリはゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、本方法が、発現サブゲノム区間を提供するためにベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;
(iv)ライブラリはゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、本方法は、発現サブゲノム区間を提供するために第2のベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;または
(v)本方法は、第1の対象区間、例えばサブゲノム区間を提供するために第1の反応混合物において、および例えばサブゲノム区間に対応する、第2の対象区間、例えば発現サブゲノム区間を提供するために第2の反応混合物において、段階(a)、(b)および(c)のうち1つを実施することを含む。

0229

一実施形態において、(1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが個別に行われる。

0230

一実施形態において、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間は、独立して、表1〜4から選択される。

0231

一実施形態において、本方法は、Xが、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500と等しいかまたはこれを超える、少なくともX個の対象区間の配列を提供することを含む。

0232

一実施形態において、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間は、同じ対象区間に対応し、例えば、同じ遺伝子からの(1つまたは複数の)配列を含む。

0233

一態様において、本発明は、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)からの腫瘍試料を分析する方法を特徴とする。本方法は、
(a)複数の標的メンバー、例えば腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを試料、例えば腫瘍試料から得て;
(b)選択メンバー(本明細書中では「ライブラリキャッチ」と呼ばれることがある。)を提供するために、1つまたは複数のライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させてもよく;
(c)例えば配列決定法によって、例えば次世代配列決定法で、ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからの対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードを得て;
(d)前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての、例えば複数の対象区間(例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間または両方)のそれぞれ、例えば複数の遺伝子のそれぞれ、における予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えば、突然変異呼び出し、例えばBayeisan法によるもの)、
それによって前記の試料を分析することを含み:ここで、
(i)X個のヌクレオチド位置のそれぞれを、段階(b)、(c)、(d)または(e)のうち1つまたは組み合わせについて固有の条件のセット下で分析してもよい(ここで、固有とは、他のX−1個の条件のセットとは異なることを意味し、Xは少なくとも2、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000である。)。例えば、第1の条件のセット、例えば本明細書中に記載の条件のセットは、例えば第1のサブゲノム区間または遺伝子における第1のヌクレオチド位置に対して使用され、第2の条件のセット、例えば本明細書中に記載の第2の条件のセットは、第2のヌクレオチド位置に対して、例えば第2のサブゲノム区間または遺伝子において使用され;
(ii)そのヌクレオチド位置で起こり得る予め選択された改変、例えば突然変異の特徴、例えば本明細書中に記載の特徴に反応するX個のヌクレオチド位置のそれぞれについて、ヌクレオチド位置を固有の条件セット下で分析する(ここで、固有とは、他のX−1個の条件のセットとは異なることを意味し、Xは少なくとも(at lest)2、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000である。)。例えば、第1の対象区間(サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)におけるヌクレオチド位置で生じ得る予め選択された変化、例えば突然変異の特徴、例えば本明細書中に記載の特徴に応答して、ヌクレオチド位置を第1の条件のセット下で分析し、第2の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)におけるヌクレオチド位置で生じ得る予め選択された変化、例えば突然変異の特徴、例えば本明細書中に記載の特徴に応答して、ヌクレオチド位置を第2の条件のセット下で分析する;
(iii)前記の方法が、少なくとも2、5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)、例えば遺伝子におけるヌクレオチド位置に対する95、98または99%感度または特異性を可能にする条件下で、試料、例えば保存腫瘍試料において行われる;または
(iv)本方法は、
a)約500X以上の配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち5%を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること;
b)約200X以上、例えば、約200X〜約500Xの配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち10%を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること;
c)約10〜100X配列決定デプスを提供するために、例えば、a)異なる薬物を患者が代謝する能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)一塩基多型(SNP)またはb)患者を固有に同定するために使用され得るゲノムSNP(例えばフィンガープリント)から選択される1つ以上の対象区間(例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方、例えばエクソン)を配列決定するために、第3の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること;
d)約5〜50X配列決定デプスを提供するために、例えば構造的限界点、例えばゲノム転座またはインデルを検出するために、第4の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること
例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために5〜50Xの配列対スパニングデプスを必要とする。このようなベイトセットは、例えば、転座/インデルが起こり易い癌遺伝子を検出するために使用し得る;または
e)約0.1〜300X配列決定デプスを提供するために、例えばコピー数の変化を検出するために、第5の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること
のうち1つ以上または全てを含む。一実施形態において、配列決定デプスは、コピー数の変化を検出するために約0.1〜10Xの配列決定デプスの範囲である。他の実施形態において、配列決定デプスは、ゲノムDNAのコピー数の増加/減少またはヘテロ接合性喪失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するために、約100〜300Xの範囲である。

0234

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーおよび発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られるライブラリを得ることを含む。

0235

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第1のライブラリを得ることおよび、発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第2のライブラリを得ることを含む。

0236

一実施形態において、サブゲノム区間および発現区間の両方を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために、ベイトセットが使用される。

0237

一実施形態において、第1のベイトセットは、サブゲノム区間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用され、第2のベイトセットは、発現サブゲノム区間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用される。

0238

代表的な第1および第2の条件セットは、
第1のベイトセットが第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現区間)に対して使用され、第2のベイトセットが第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対して使用され;
第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードに第1のアライメント方法が適用され、第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードに第2のアライメント方法が適用され;
第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)のヌクレオチド位置に第1の突然変異呼び出し法が適用され、第2の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)のヌクレオチド位置に第2の突然変異呼び出し方法が適用されること
を含む。

0239

一実施形態において、
第1のベイト条件のセット、第1のアライメント方法および第1の突然変異呼び出し方法で第1のヌクレオチド位置を分析し;
前記の第1のベイト条件のセット、第2のアライメント方法および前記の第1の突然変異呼び出し方法で第2のヌクレオチド位置を分析し;
前記の第1のベイト条件のセット、前記の第1のアライメント方法および第2の突然変異呼び出し方法で第3のヌクレオチド位置を分析し、
他の2つの条件と比較したとき、それぞれが固有の条件下で分析された3個のヌクレオチド位置を提供する。

0240

一実施形態において、本条件は
第1のベイトセットが第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対して使用され、第2のベイトセットが第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対して使用される;
第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードに第1のアライメント方法が適用され、第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードに第2のアライメント方法が適用される;または
第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)のヌクレオチド位置に第1の突然変異呼び出し方法が適用され、第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)のヌクレオチド位置に第2の突然変異呼び出し方法が適用されること
を含む。

0241

代表的な特徴としては、
(i)変化が位置する遺伝子または遺伝子のタイプ、例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制因子、予め選択されたまたは変異体または変異体のタイプ、例えば突然変異を特徴とする、または予め選択された頻度の突然変異を特徴とする遺伝子または遺伝子のタイプ、または本明細書中に記載の他の遺伝子もしくは遺伝子のタイプ;
(ii)変化のタイプ、例えば、置換、挿入、欠失または転座;
(iii)変化について分析している試料のタイプ、例えば、FFPE試料血液試料または骨髄穿刺試料;
(iv)評価している変化のヌクレオチドの位置にあるかまたはその付近にある配列、例えば、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するミスアライメントについての予想される傾向に影響を与え得る配列、例えばヌクレオテッド(nucleodited)位置にあるかまたはその付近にある反復配列の存在;
(v)例えば予め選択されたタイプの腫瘍における、変化、例えば突然変異を示す選択された型の腫瘍における突然変異を示すリードを観察する事前(例えば文献)期待値
(vi)塩基呼び出しエラーのみによる変化を示すリードを観察する確率;または
(vii)変化を検出するために所望される予め選択された配列決定のデプス
が挙げられる。

0242

一実施形態において、特徴は、配列決定されているヌクレオチドの同一性以外のものであり、例えば、この特徴は、配列がAまたはTであるか否かではない。

0243

一実施形態において、段階(b)が存在する。一実施形態において、段階(b)は存在しない。

0244

一実施形態において、少なくともX個の遺伝子からのサブゲノム区間、例えば、表1〜4からの少なくともX個の遺伝子を異なる条件下で分析し、Xは、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500に等しいかまたはこれを超える。

0245

一実施形態において、本方法は、次のうち1つ以上を含む:
(i)本方法、例えば上記方法の段階(b)は、本明細書中に記載のベイトセット、例えば、「ベイト」という見出しの下で記載されるようなベイトセットの使用を含むか;
(ii)本方法、例えば上記方法の段階(c)は、対象区間のセットまたは群(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対して、または本明細書中に記載の遺伝子のセットもしくは群からリードを得ることを含むか;
(iii)本方法、例えば上記方法の段階(d)は、本明細書中に記載の複数のアライメント方法、例えば「アライメント」という見出しの下で記載される方法の使用を含むか;
(iv)本方法、例えば上記方法の段階(e)は、本明細書中に記載の、ヌクレオチド値を予め選択されたヌクレオチド位置に割り当てるための複数の方法、例えば「突然変異呼び出し」の見出しの下で、または「臨床癌検体の次世代配列決定からの、体細胞ゲノム変化の高感度検出のためのベイジアン法」の題名のセクションに記載の方法の使用を含むか;または
(v)本方法は、本明細書中に記載の対象区間、例えば「遺伝子選択」という題名のセクションで本明細書中に記載のような、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方のセットにヌクレオチド値を割り当てること
を含む。

0246

一実施形態において、本方法は、(i)および(ii)〜(v)のうち1、2、3個または全てを含む。

0247

一実施形態において、本方法は、(ii)および、(i)および(iii)〜(v)のうち1、2、3個または全てを含む。

0248

一実施形態において、本方法は、(iii)および、(i)、(ii)、(iv)および(v)のうち1、2、3個または全てを含む。

0249

一実施形態において、本方法は、(iv)および、(i)〜(iii)および(v)のうち1、2、3個または全てを含む。

0250

一実施形態において、本方法は、(v)および、(i)〜(iv)のうち1、2、3個または全てを含む。

0251

アライメント
本明細書中で開示される方法は、配列決定方法、特に多数の多様な遺伝子における多数の多様な遺伝的事象の大規模並行配列決定に依存する方法、例えば本明細書中に記載の癌からの腫瘍試料を分析する方法において、性能を最適化するための複数の個別に調整されたアライメント方法またはアルゴリズムの使用を統合し得る。実施形態において、リードを分析するために、異なる遺伝子における多数の変異体のそれぞれに対して個別にカスタマイズまたは調整される複数のアライメント方法を使用する。実施形態において、調整は、配列決定されている遺伝子(または他のサブゲノムイナーバル(inerval))(のうち1つ以上)の機能、試料中の腫瘍タイプ、配列決定されている変異体または試料もしくは対象の特徴であり得る。配列決定しようとする多数の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対して個々に調整されるアライメント条件の選択または使用は、速度、感度および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較的多数の多様な対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対するリードのアライメントが最適化される場合に特に有効である。

0252

したがって、一態様において、本発明は、試料、例えば、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)からの腫瘍試料、を分析する方法を特徴とする。本方法は、
(a)試料からの複数メンバー、例えば腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを得て;
(b)例えば選択メンバー(本明細書中では「ライブラリキャッチ」と呼ばれることがある。)を提供するために、1つまたは複数のライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって、予め選択された配列に対して1つまたは複数のライブラリを濃縮してもよく;
(c)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバー、例えばライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間、例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間に対するリードを得て;
(d)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えばベイジアン法により、例えば突然変異を呼び出すこと)、
それによって前記の腫瘍試料を分析することを含み、
X個の固有の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれからのリードを、固有のアライメント方法でアライメントしてもよく、ここで、固有の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)は、他のX−1個の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方)とは異なることを意味し、固有のアライメント方法は、他のX−1個のアライメント方法とは異なることを意味し、Xは少なくとも2である。

0253

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーおよび発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られるライブラリを得ることを含む。

0254

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第1のライブラリを得ることおよび、発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第2のライブラリを得ることを含む。

0255

一実施形態において、サブゲノム区間および発現区間の両方を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために、ベイトセットが使用される。

0256

一実施形態において、第1のベイトセットは、サブゲノム区間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用され、第2のベイトセットは、発現サブゲノム区間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用される。

0257

一実施形態において、段階(b)が存在する。一実施形態において、段階(b)は存在しない。

0258

一実施形態において、Xは少なくとも3、4、5、10、15、20、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1,000である。

0259

一実施形態において、少なくともX個の遺伝子、例えば表1〜4からの少なくともX個の遺伝子からの対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)が、固有のアライメント方法でアライメントされ、Xは、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500と等しいかまたはそれを超える。

0260

一実施形態において、方法(例えば、上に列挙した方法の要素(d))は、リードを分析、例えばアライメントするためのアライメント方法を選択または使用することを含み、
前記のアライメント方法は、
(i)腫瘍タイプ、例えば前記の試料中の腫瘍タイプ;
(ii)配列決定されている前記の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)が位置する遺伝子または遺伝子のタイプ、例えば、予め選択されたまたは変異体もしくは変異体のタイプ、例えば突然変異、または予め選択された頻度の突然変異を特徴とする、遺伝子または遺伝子のタイプ;
(iii)分析されている部位(例えばヌクレオチド位置);
(iv)評価されている対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)内の変異体のタイプ、例えば置換;
(v)試料のタイプ、例えば、FFPE試料、血液試料または骨髄穿刺試料;および
(vi)評価されている前記のサブゲノム区間にあるかまたはその付近にある配列、例えば前記の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するミスアライメントについての予想される傾向、例えば、前記の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)にあるかまたはその付近にある反復配列の存在
のうち1つ以上または全ての関数であるか、それに対応して選択されるかまたはそれに対して最適化される。

0261

本明細書中の他の箇所で述べるように、方法は、比較的多数の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対するリードのアライメントが最適化される場合に特に有効である。したがって、一実施形態において、少なくともX個の固有のアライメント方法が、少なくともX個の固有のサブゲノム区間に対するリードを分析するために使用され、ここで固有とは他のX−1個とは異なることを意味し、Xは、2、3、4、5、10、15、20、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000と等しいかまたはそれを超える。

0262

一実施形態において、表1〜4からの少なくともX個の遺伝子からの対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)を分析し、Xは、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500と等しいかまたはそれを超える。

0263

一実施形態において、少なくとも3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400または500個の異なる遺伝子のそれぞれにおいて対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に固有のアライメント方法が適用される。

0264

一実施形態において、少なくとも20、40、60、80、100、120、140、160または180、200、300、400または500個の遺伝子、例えば表1〜4からの遺伝子におけるヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる。一実施形態において、分析した前記の遺伝子の、少なくとも10、20、30、40または50%のそれぞれにおいて、対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に固有のアライメント方法が適用される。

0265

本明細書で開示される方法は、煩雑なリード、例えば、再配列を有するリードの迅速かつ効率的なアライメントを可能にする。したがって、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードが、再編成、例えばインデルを伴うヌクレオチド位置を含む実施形態において、本方法は、適切に調整され、
予め選択される再編成とアライメントするために予め選択される再編成参照配列を、リードとのアライメントのために選択すること(この実施形態において、参照配列はゲノム再編成と同一ではない。);
前記の予め選択された再編成参照配列とリードを比較する、例えばアライメントすること;
を含むアライメント方法を使用することを含み得る。

0266

実施形態において、煩雑なリードをアライメントするために他の方法が使用される。これらの方法は、比較的多数の多様なサブゲノム区間に対するリードのアライメントが最適化される場合に特に有効である。一例として、腫瘍試料を分析する方法は、
第1のパラメータのセット(例えば、第1のマッピングアルゴリズム、または第1の参照配列を用いて)の下でリードの比較、例えばアライメント比較を行い、前記のリードが第1の所定のアライメント基準を満たすか(例えば、このリードを前記の第1の参照配列と、例えば予め選択されたミスマッチ数未満で、アライメントし得るか)否かを判定し;
前記のリードが第1の所定のアライメント基準に合致しない場合、第2のパラメータのセット(例えば、第2のマッピングアルゴリズム、または第2の参照配列を用いて)の下で第2のアライメント比較を行い;
前記のリードが前記の第2の所定の基準と合致するか(例えば、予め選択されたミスマッチ数未満で前記の第2の参照配列とリードをアライメントし得るか)否かを判定してもよい
ことを含み得、
ここで前記の第2のパラメータのセットは、パラメータのセット、例えば前記の第2の参照配列の使用を含み、これは、前記の第1のパラメータのセットと比較して、予め選択された変異体、例えば再編成、例えば挿入、欠失または転座に対するリードとのアライメントの可能性が高くなる。

0267

これらおよび他のアライメント方法は、本明細書中の他の箇所、例えば、「アライメント」というセクションでより詳細に論じる。そのモジュールの要素は、腫瘍を分析する方法に含められ得る。実施形態において、「アライメント」という題名のセクションからのアライメント方法は、「突然変異呼び出し」という題名のセクションからの突然変異呼び出し方法および/または「ベイト」という題名のセクションからのベイトセットと組み合わせられる。この方法は、「遺伝子選択」という題名のセクションからの対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のセットに適用し得る。

0268

突然変異呼び出し
本明細書中で開示される方法は、配列決定方法、特に、例えば腫瘍試料からの、例えば本明細書中に記載の癌からの、多数の多様な遺伝子における多数の多様な遺伝的事象の大規模並行配列決定に依存する方法において性能を最適化するために、カスタマイズされているかまたは調整されている突然変異呼び出しパラメータの使用を統合し得る。この方法の実施形態において、多数の予め選択された対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれに対する突然変異呼び出しは、個別にカスタマイズされるか、または微調整される。カスタマイズ化または調整は、本明細書中に記載の因子の1つ以上、例えば、試料中の癌のタイプ、配列決定しようとする対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)が位置する遺伝子、または配列決定しようとする変異体に基づき得る。配列決定しようとする多数の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対して微調整されるアライメント条件のこの選択または使用は、速度、感度および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較的多数の多様な対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対するリードのアライメントが最適化される場合に特に有効である。

0269

したがって、一態様において、本発明は、試料、例えば、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)からの腫瘍試料、を分析する方法を特徴とする。本方法は、
(a)試料からの複数メンバー、例えば試料、例えば腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを得て;
(b)選択されたメンバー、例えばライブラリキャッチを提供するために、例えばライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって、予め選択された配列に対して1つまたは複数のライブラリを濃縮してもよく;
(c)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードを得て;
(d)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えばベイジアン法または本明細書中に記載の呼び出し方法によって、例えば突然変異を呼び出し)、それにより前記の腫瘍試料を分析すること
を含む。

0270

ここで
固有の呼び出し方法によって、X個の固有の対象区間(サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれにおいヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当ててもよく、ここで固有の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)は、他のX−1個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)とは異なることを意味し、固有の呼び出し方法は、他のX−1個の呼び出し方法とは異なることを意味し、Xは少なくとも2である。呼び出し方法は異なり得、それによって、例えば異なるベイジアン事前値(prior value)に依存することにより、固有であり得る。

0271

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーおよび発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られるライブラリを得ることを含む。

0272

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第1のライブラリを得ることおよび、発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第2のライブラリを得ることを含む。

0273

一実施形態において、サブゲノム区間および発現区間の両方を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために、ベイトセットが使用される。

0274

一実施形態において、第1のベイトセットは、サブゲノム区間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用され、第2のベイトセットは、発現サブゲノム区間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用される。

0275

一実施形態において、段階(b)が存在する。一実施形態において、段階(b)は存在しない。

0276

一実施形態において、前記のヌクレオチド値を割り当てることは、タイプの腫瘍における前記の予め選択されたヌクレオチド位置で、予め選択された変異体、例えば突然変異を示すリードを観察する先行(例えば文献)期待値であるかまたはそれに相当する値の関数である。

0277

一実施形態において、本方法は、少なくとも10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)を含み、ここで各割り当ては、タイプの腫瘍における前記の予め選択されたヌクレオチド位置で、予め選択された変異体、例えば突然変異を示すリードを観察する先行(例えば文献)期待値であるかまたはそれに相当する固有の(他の割り当てについての値とは対照的)値の関数である。

0278

一実施形態において、前記のヌクレオチド値を割り当てることは、変異体がある頻度(例えば、1%、5%または10%など)で試料中に存在する場合、および/または変異体が存在しない(例えば、塩基呼び出しエラーのみに起因してリードで観察される)場合、前記の予め選択されたヌクレオチド位置で前記の予め選択された変異体を示すリードを観察する確率を表す一連の値の関数である。

0279

一実施形態において、方法(例えば、上記で列挙される方法の段階(e))は、突然変異呼び出し方法を含む。本明細書中に記載の突然変異呼び出し方法は、次のことを含み得る:
前記X個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれにおける予め選択されたヌクレオチド位置に対して、
(i)タイプXの腫瘍中の前記の予め選択されたヌクレオチド位置に、予め選択された変異体、例えば突然変異を示すリードを観察する先行(例えば文献)期待値であるかまたはそれを表す第1の値;および
(ii)変異体がある頻度(例えば、1%、5%、10%など)で試料中に存在する場合、および/または変異体が存在しない(例えば、塩基呼び出しエラーのみに起因してリードで観察される)場合、前記の予め選択されたヌクレオチド位置で前記の予め選択された変異体を示すリードを観察する確率を表す第2の値のセット
を得ること、
前記の値に応答して、第1の値を使用して第2のセット中の値の間で比較を、例えば本明細書中に記載のベイジアン法によって、推測する(例えば、突然変異の存在の事後確率を計算する)ことにより、前記の予め選択されたヌクレオチド位置のそれぞれに対する前記のリードからのヌクレオチド値を割り当て(例えば突然変異を呼び出し)、それによって前記の試料を分析すること。

0280

一実施形態において、本方法は、次のうち1つ以上または全てを含む:
(i)少なくとも10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、各割り当てが、(他の割り当てとは対照的に)固有の第1および/または第2の値に基づくもの;
(ii)割り当ての少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400または500が、例えば予め選択された腫瘍タイプにおける細胞の、5、10または20%未満で予め選択された変異体が存在する確率の関数である第1の値を用いて行われる、(i)の方法の割り当て;
(iii)少なくともX個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、このそれぞれが、予め選択されたタイプの腫瘍、例えば前記の試料の腫瘍タイプ中に存在する(他のX−1個の割り当てとは対照的に)固有の確率を有する予め選択された変異体と関連し、X個の割り当てのそれぞれが、(他のX−1個の割り当てとは対照的に)固有の第1および/または第2の値に基づくものであってもよい(X=2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400または500);
(iv)第1および第2のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、前記の第1のヌクレオチド位置で第1の予め選択された変異体が予め選択されたタイプの腫瘍(例えば前記の試料の腫瘍タイプ)中に存在する可能性が、前記の第2のヌクレオチド位置に第2の予め選択された変異体が存在する可能性よりも少なくとも2、5、10、20、30または40倍大きく、各割り当てが、(他の割り当てとは対照的に)固有の第1の値および/または第2の値に基づいていてもよいもの;
(v)複数の予め選択されたヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、前記の複数のものが、次の確率範囲のうち1つ以上、例えば少なくとも3、4、5、6、7または全てに入る変異体に対する割り当てを含むこと:
0.01以下;
0.01より大きく0.02以下;
0.02より大きく0.03以下;
0.03より大きく0.04以下;
0.04より大きく0.05以下;
0.05より大きく0.1以下;
0.1より大きく0.2以下;
0.2より大きく0.5以下;
0.5より大きく1.0以下;
1.0より大きく2.0以下;
2.0より大きく5.0以下;
5.0より大きく10.0以下;
10.0より大きく20.0以下;
20.0より大きく50.0以下;および
50より大きく100.0%以下;
ここで確率範囲は、予め選択されたヌクレオチド位置での予め選択された変異体が予め選択されたタイプの腫瘍(例えば前記の試料の腫瘍タイプ)において存在する確率または、予め選択されたヌクレオチド位置での予め選択された変異体が腫瘍試料中の細胞、腫瘍試料からのライブラリまたは予め選択されたタイプ(例えば前記の試料の腫瘍タイプ)に対するそのライブラリからのライブラリキャッチの列挙される%で腫瘍中に存在する確率の範囲であり;
ここで、各割り当ては、固有の第1および/または第2の値に基づいてもよい(例えば、列挙される確率範囲での他の割り当てと対照的に固有であるかまたは、他の挙げられる確率範囲の1つ以上または全てに対する第1のおよび/または第2の値とは対照的に固有である。)。

0281

(vi)前記の試料中のDNAの50、40、25、20、15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.3、0.2または0.1%未満で存在する予め選択された変異体をそれぞれが独立に有する、少なくとも1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって;各割り当てが、(他の割り当てとは対照的に)固有の第1および/または第2の値に基づいてもよいこと;
(vii)第1および第2のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、前記の試料のDNA中の第1の位置での予め選択された変異体の可能性が、前記の試料のDNA中の前記の第2のヌクレオチド位置での予め選択された変異体の可能性よりも少なくとも2、5、10、20、30または40倍大きく、各割り当てが、(他の割り当てとは対照的に)固有の第1の値および/または第2の値に基づいてもよいこと;
(viii)次のもののうち1つ以上または全てにおいてヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと):
(1)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の1%未満で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(2)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の1〜2%で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(3)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の2%超から3%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(4)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の3%超から4%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(5)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の4%超から5%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(6)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の5%超から10%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(7)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の10%超から20%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(8)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の20%超から40%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(9)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の40%超から50%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;または
(10)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の50%超から100%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;ここで、各割り当てが、固有の第1および/または第2の値に基づくものであってもよい(例えば、列挙される確率範囲での他の割り当てと対照的に固有であるか(例えば1%未満の(i)における範囲)または、他の挙げられている範囲の1つ以上または全てにおける判定に対する第1および/または第2の値とは対照的に固有である。);または
(ix)他のX−1個のヌクレオチド位置での予め選択された変異体に対する可能性と比較した場合に固有である(前記の試料のDNA中に予め選択された変異体が存在する)可能性をそれぞれが独立に有するX個のヌクレオチド位置のそれぞれでヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、ここでXが、1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000以上であり、各割り当てが、(他の割り当てと対照的に)固有の第1および/または第2の値に基づくもの。

0282

この方法の実施形態において、リードを評価し、リードからヌクレオチド位置についての値、例えばある遺伝子中の特定の位置での突然変異の呼び出し、を選択するために、「閾値」を使用する。この方法の実施形態において、多数の予め選択された対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれに対する閾値は、カスタマイズされるか、または微調整される。カスタマイズまたは調整は、本明細書中に記載の因子の1つ以上、例えば、試料中の癌のタイプ、配列決定しようとする対象区間(サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)が位置する遺伝子または配列決定しようとする変異体に基づき得る。これは、配列決定しようとする多数の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれに対して微調整される呼び出しを提供する。本方法は、比較的多数の多様なサブゲノム区間を分析する場合に特に有効である。

0283

したがって、別の実施形態において、腫瘍を分析する方法は、次の突然変異呼び出し方法:
前記のX個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれについて閾値を得ることであって、前記の得られたX個の閾値のそれぞれが、他のX−1個の閾値と比較して固有であり、それによりX個の固有の閾値を提供すること;
前記のX個の対象区間(例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれに対して、予め選択されたヌクレオチド位置における予め選択されたヌクレオチド値を有するリードの数の関数である実測値をその固有の閾値と比較し、それによって前記のX個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれにその固有の閾値を適用すること;および
前記の比較の結果に応じて、予め選択されたヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当ててもよいことを含み、
ここでXは2以上である。

0284

一実施形態において、本方法は、それぞれが独立に、0.5、0.4、0.25、0.15、0.10、0.05、0.04、0.03、0.02または0.01未満である確率の関数である第1の値を有する少なくとも2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個の予め選択されたヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てることを含む。

0285

一実施形態において、本方法は、他のX−1個の第1の値と比較して固有である第1の値をそれぞれが独立に有する少なくともX個のヌクレオチド位置のそれぞれにヌクレオチド値を割り当てることを含み、前記のX個の第1の値のそれぞれは、0.5、0.4、0.25、0.15、0.10、0.05、0.04、0.03、0.02または0.01未満である確率の関数であり、
Xは、1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000以上である。

0286

一実施形態において、少なくとも20、40、60、80、100、120、140、160または180、200、300、400または500個の遺伝子、例えば表1〜4からの遺伝子におけるヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる。一実施形態において、固有の第1および/または第2の値は、分析した前記の遺伝子の、少なくとも10、20、30、40または50%それぞれにおいて、対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に適用される。

0287

本方法の実施形態は、例えば次の実施形態から分かるように、比較的多数の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対する閾値が最適化される場合に適用され得る。

0288

一実施形態において、固有の閾値は、少なくとも3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個の異なる遺伝子のそれぞれにおいて対象区間、例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間、に適用される。

0289

一実施形態において、少なくとも20、40、60、80、100、120、140、160または180、200、300、400または500個の遺伝子、例えば表1〜4からの遺伝子におけるヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる。一実施形態において、分析された前記の遺伝子の少なくとも10、20、30、40または50%のそれぞれにおいて、サブゲノム区間に対して固有の閾値が適用される。

0290

一実施形態において、表1〜4からの少なくとも5、10、20、30または40個の遺伝子におけるヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる。一実施形態において、分析された少なくとも10、20、30、40または50%の前記の遺伝子のそれぞれにおいて、対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間)に固有の閾値が適用される。

0291

これらおよび他の突然変異呼び出し方法は、本明細書中の他の箇所、例えば、「突然変異」という題名のセクションでより詳細に論じる。そのモジュールの要素は、腫瘍を分析する方法に含められ得る。実施形態において、「突然変異呼び出し」という題名のセクションからのアライメント方法は、「アライメント」という題名のセクションからのアライメント方法および/または「ベイト」という題名のセクションからのベイトセットと組み合わせられる。本方法は、「遺伝子選択」という題名のセクションからの対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のセットに適用され得る。

0292

ベイト
本明細書中に記載の方法は、配列決定しようとする標的核酸の選択のためのベイト、例えば溶液ハイブリダイゼーションでの使用のためのベイトの適切な選択による、1名以上の対象からの、試料、例えば腫瘍試料、例えば本明細書中に記載の癌からの多数の遺伝子および遺伝子産物の最適化配列決定を提供する。予め選択された選択効率を有するベイトセットに従って、様々な対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)またはそのクラスに対する選択効率を適合させる。このセクションで使用される場合、「選択効率」とは、(1つまたは複数の)標的対象区間(例えば、(1つまたは複数の)サブゲノム区間、(1つまたは複数の)発現サブゲノム区間またはその両方)に従って調節されるような配列カバレッジのレベルまたはデプスを指す。

0293

したがって、方法(例えば、上記で列挙される方法の段階(b))は、選択されたメンバー(例えばライブラリキャッチ)を提供するためにライブラリを複数のベイトと接触させることを含む。

0294

したがって、一態様において、本発明は、試料、例えば、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)からの腫瘍試料、を分析する方法を特徴とする。本方法は、
(a)試料からの複数のメンバー(例えば標的メンバー)、例えば腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを得て;
(b)選択メンバー(例えばライブラリキャッチ)を提供するために、1つまたは複数のライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させ;
(c)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間、例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方に対するリードを得て;
(d)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えばベイジアン法または本明細書中に記載の方法により、例えば突然変異を呼び出し)、それにより前記の腫瘍試料を分析することを含み、 本方法は、複数の、例えば少なくとも2、3、4または5個のベイトまたはベイトセットとライブラリを接触させることを含んでいてもよく、前記の複数の各ベイトまたはベイトセットは、(複数における他のベイトと対照的に)固有の、予め選択された選択に対する効率を有する。例えば、各固有のベイトまたはベイトセットは、配列決定の固有のデプスを提供する。本明細書で使用される場合、「ベイトセット」という用語は、1つのベイトまたは複数のベイト分子をまとめて指す。

0295

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーおよび発現ゲノム区間に対応するメンバーが得られるライブラリを得ることを含む。

0296

一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第1のライブラリを得ることおよび、発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第2のライブラリを得ることを含む。

0297

一実施形態において、サブゲノム区間および発現区間の両方を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために、ベイトセットが使用される。

0298

一実施形態において、第1のベイトセットは、サブゲノム区間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用され、第2のベイトセットは、発現サブゲノム区間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用される。

0299

一実施形態において、複数のものにおける第1のベイトセットの選択効率は、複数のものにおける第2のベイトセットの効率と少なくとも2倍異なる。一実施形態において、第1および第2のベイトセットは、少なくとも2倍異なる配列決定のデプスを提供する。

0300

一実施形態において、本方法は、次のベイトセットのうち1つまたは複数をライブラリと接触させることを含む:
a)約500X以上の配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち5%を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、サブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット;
b)約200X以上、例えば、約200X〜約500Xの配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち10%を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、サブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット;
c)約10〜100X配列決定デプスを提供するために、例えば、a)異なる薬物を患者が代謝する能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)一塩基多型(SNP)またはb)患者を固有に同定するために使用され得るゲノムSNP(例えばフィンガープリント)から選択される1つ以上のサブゲノム区間(例えばエクソン)を配列決定するためにサブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット;
d)約5〜50X配列決定デプスを提供するために、例えば構造限界点、例えばゲノム転座またはインデルなどを検出するために、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む十分なメンバーを選択するベイトセット。例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために5〜50Xの配列対スパニングデプスを必要とする。このようなベイトセットは、例えば、転座/インデルが起こり易い癌遺伝子を検出するために使用し得るか;または
e)約0.1〜300X配列決定デプスを提供するために、例えばコピー数の変化を検出するために、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む十分なメンバー選択するベイトセット。一実施形態において、配列決定デプスは、コピー数の変化を検出するために約0.1〜10Xの配列決定デプスの範囲である。他の実施形態において、配列決定デプスは、ゲノムDNAのコピー数の増加/減少またはヘテロ接合性喪失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するために、約100〜300Xの範囲である。このようなベイトセットは、例えば、増幅/欠失が起こり易い癌遺伝子を検出するために使用され得る。

0301

本明細書で使用される場合の配列決定デプスのレベル(例えば、配列決定デプスのX倍レベル)は、重複リード、例えばPCR重複リードの検出および除去後のリード(例えば固有のリード)のカバレッジのレベルを指す。

0302

一実施形態において、ベイトセットは、1つ以上の再編成、例えば、ゲノム再編成を含有するイントロンを含有する対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を選択する。このような実施形態において、ベイトセットは、選択効率を高めるために反復配列が遮蔽されるように設計される。再編成が既知連結配列を有する実施形態において、選択効率を高めるために、連結配列に対して相補的なベイトセットを設計し得る。

0303

実施形態において、本方法は、それぞれが異なるベイト設計ストラテジーを有する2つ以上の異なる標的カテゴリを捕捉するように設計されたベイトの使用を含む。実施形態において、本明細書中で開示されるハイブリッド捕捉方法および組成物は、標的配列の定められたサブセット(例えば、標的メンバー)を捕捉し、そのサブセットの外側のカバレッジを最小限にしながら、標的配列の均質なカバレッジを提供する。一実施形態において、標的配列は、ゲノムDNAからのエクソン全体またはその選択されたサブセットを含む。別の実施形態において、標的配列は、大きな染色体領域、例えば染色体アーム全体を含む。本明細書に開示される方法および組成物は、複雑な標的核酸配列(例えば核酸ライブラリ)に対する異なるデプスおよびカバレッジのパターンを達成するための異なるベイトセットを提供する。

0304

一実施形態において、本方法は、1つまたは複数の核酸ライブラリの選択されたメンバー(例えばライブラリキャッチ)を提供することを含む。本方法は、
複数のメンバー、例えば、標的核酸メンバー(例えば、複数の腫瘍メンバー、参照メンバーおよび/またはPGxメンバーを含む。)を含む1つまたは複数のライブラリ(例えば1つまたは複数の核酸ライブラリ)を提供し;
複数のベイト/メンバーハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成するために、複数のベイト(例えばオリゴヌクレオチドベイト)と1つまたは複数のライブラリを、例えば溶液ベースの反応において接触させ;
例えば前記のハイブリダイゼーション混合物を、前記の複数のベイト/メンバーハイブリッドの分離を可能にする結合実体と接触させることによって前記のハイブリダイゼーション混合物から複数のベイト/メンバーハイブリッドを分離し、
それによってライブラリキャッチ(例えば、1つまたは複数のライブラリからの核酸分子の、選択されたまたは濃縮されたサブグループ)を提供すること
を含み、
この複数のベイトは、次のうち2つ以上を含んでいてもよい:
a)低頻度、例えば約5%以下で出現する(すなわち、試料からの細胞のうち5%がそれらのゲノムにおいて変化を保有する。)変化(例えば1つ以上の突然変異)に対する高レベルの感度を可能にするために最大デプスのカバレッジが必要とされる、高レベルの標的(例えば、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む1つ以上の腫瘍メンバー、このような遺伝子、エクソンまたは塩基)を選択する第1のベイトセット。一実施形態において、第1のベイトセットは、約500X以上の配列決定デプスを必要とする変化(例えば点突然変異)を含む腫瘍メンバーを選択する(例えば、それに相補的である。)。

0305

b)a)における高レベルの標的よりも高い頻度、例えば約10%の頻度で(すなわち、試料からの細胞のうち10%がそれらのゲノムにおいて変化を保有する。)出現する変化(例えば1つ以上の突然変異)に対する高レベルの感度を可能にするために高いカバレッジが必要とされる、中程度のレベルの標的(例えば、遺伝子、エクソンまたは塩基など、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む1つ以上の腫瘍メンバー)を選択する第2のベイトセット。一実施形態において、第2のベイトセットは、約200X以上の配列決定デプスを必要とする変化(例えば点突然変異)を含む腫瘍メンバーを選択する(例えばそれと相補的である。)。

0306

c)高レベルの感度を可能にするために、例えばヘテロ接合性の対立遺伝子を検出するために、低−中程度のカバレッジが必要とされる、低レベルの標的(例えば、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む1つ以上のPGxメンバー、例えば遺伝子、エクソンまたは塩基など)を選択する第3のベイトセット。例えば、ヘテロ接合性の対立遺伝子の検出は、高い検出信頼性を確保するために10〜100Xの配列決定デプスを必要とする。一実施形態において、第3のベイトセットは、a)患者が様々な薬物を代謝する能力を説明し得る薬理ゲノミクス(PGx)一塩基多型(SNP)またはb)患者を固有に同定するために使用され得るゲノムSNP(例えばフィンガープリント)から選択される1つ以上の対象区間(例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方、例えばエクソン)を選択し;
d)例えば、ゲノム転座またはインデルなどの構造的限界点を検出するために、低中程度のカバレッジが必要とされる第1のイントロン標的(例えば、イントロン配列を含むメンバー)を選択する第4のベイトセット。例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために5〜50Xの配列対スパニングデプスを必要とする。前記の第4のベイトセットは、例えば、転座/インデル傾向のある癌遺伝子を検出するために使用し得;または
e)コピー数の変化を検出する能力を向上させるために低密度のカバレッジが必要とされる第2のイントロン標的(例えばイントロンメンバー)を選択する第5のベイトセット。例えば、いくつかの末端エクソンの1コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために0.1〜300Xのカバレッジを必要とする。一実施形態において、カバレッジのデプスは、コピー数の変化を検出するために約0.1〜10Xの範囲である。他の実施形態において、カバレッジのデプスは、ゲノムDNAのコピー数の増加/減少またはヘテロ接合性喪失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するために、約100〜300Xの範囲である。前記の第5のベイトセットは、例えば、増幅/欠失が起こり易い癌遺伝子を検出するために使用され得る。

0307

前述のベイトセットのうち2、3、4またはそれを超えるものの何らかの組み合わせを使用し得、例えば、第1および第2のベイトセット;第1および第3のベイトセット;第1および第4のベイトセット;第1および第5のベイトセット;第2および第3のベイトセット;第2および第4のベイトセット;第2および第5のベイトセット;第3および第4のベイトセット;第3および第5のベイトセット;第4および第5のベイトセット;第1、第2および第3のベイトセット;第1、第2および第4のベイトセット;第1、第2および第5のベイトセット;第1、第2、第3、第4のベイトセット;第1、第2、第3、第4および第5のベイトセットの組み合わせなどである。

0308

一実施形態において、第1、第2、第3、第4または第5のベイトセットのそれぞれは、選択(例えば捕捉)のための予め選択された効率を有する。一実施形態において、選択効率についての値は、a)〜e)による全5個のベイトのうち少なくとも2、3、4個について同じである。他の実施形態において、選択効率についての値は、a)〜e)による全5個のベイトのうち少なくとも2、3、4個について異なる。

0309

いくつかの実施形態において、少なくとも2、3、4または5個全てのベイトセットが、異なる予め選択された効率値を有する。例えば、選択効率についての値は、次のうち1つ以上(one of more)から選択される:
(i)第1の予め選択された効率は、少なくとも約500X以上の配列決定デプスである第1の選択効率についての値を有する(例えば、第2、第3、第4または第5の予め選択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する。(例えば、第2の選択効率についての値よりも約2〜3倍大きく;第3の選択効率についての値よりも約5〜6倍大きく;第4の選択効率についての値よりも約10倍大きく;第5の選択効率についての値よりも約50〜5000倍大きい。);
(ii)第2の予め選択された効率は、少なくとも約200X以上の配列決定デプスである第2の選択効率についての値を有し、例えば、第3、第4または第5の予め選択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する。(例えば、第3の選択効率についての値よりも約2倍大きく;第4の選択効率についての値よりも約4倍大きく;第5の選択効率についての値よりも約20〜2000倍大きい。);
(iii)第3の予め選択された効率は、少なくとも約100X以上の配列決定デプスである第3の選択効率についての値を有し、例えば、第4または第5の予め選択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する(例えば、第4の選択効率についての値よりも約2倍大きく;第5の選択効率についての値よりも約10〜1000倍大きい。);
(iv)第4の予め選択された効率は、少なくとも約50X以上の配列決定デプスである第4の選択効率についての値を有し、例えば、第5の予め選択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する(例えば、第5の選択効率についての値よりも約50〜500倍大きい。);または
(v)第5の予め選択された効率は、少なくとも約10X〜0.1X配列決定デプスである第5の選択効率についての値を有する。

0310

ある一定の実施形態において、選択効率についての値は、異なるベイトセットの差次的な表示、ベイトサブセットの差次的な重複(differential overlap)、異なるベイトパラメータ、異なるベイトセットの混合および/または異なるタイプのベイトセットの使用のうち1つ以上により改変される。例えば、選択効率の変動(例えば、各ベイトセット/標的カテゴリの相対的配列カバレッジ)は、次のうち1つ以上を変更することによって調整し得る:
(i)異なるベイトセットの差次的な表示−相対的な標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、より多くの/より少ないコピー数に含まれ得る;
(ii)ベイトセットの差次的な重複(differential overlap)−相対的な標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、近隣ベイト間のより長いかまたはより短い重複を含み得る;
(iii)差次的ベイトパラメータ−捕捉効率を低下させ、相対的な標的カバレッジのデプスを低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、配列修飾/長さがより短いことを含み得る;
(iv)異なるベイトセットの混合−相対標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、異なる標的セットを捕捉するように設計されるベイトセットを異なるモル比率で混合し得る;
(v)異なるタイプのオリゴヌクレオチドベイトセットの使用−ある一定の実施形態において、ベイトセットは次のものを含み得る:
(a)1つ以上の化学的に(例えば非酵素的に)合成された(例えば個別に合成された)ベイト、
(b)アレイにおいて合成された1つ以上のベイト、
(c)1つ以上の酵素的に調製された、例えばインビトロで転写されたベイト;
(d)(a)、(b)および/または(c)の何らかの組み合わせ、
(e)1つ以上のDNAオリゴヌクレオチド(例えば天然または非天然のDNAオリゴヌクレオチド)、
(f)1つ以上のRNAオリゴヌクレオチド(例えば天然または非天然のRNAオリゴヌクレオチド)、
(g)(e)および(f)の組み合わせ、または
(h)上記の何れかの組み合わせ。

0311

異なるオリゴヌクレオチドの組み合わせは、様々な比、例えば、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:50;1:100、1:1000などから選択される比率で混合され得る。一実施形態において、化学合成されたベイトとアレイ生成ベイトとの比率は、1:5、1:10または1:20から選択される。DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドは、天然または非天然であり得る。ある一定の実施形態において、ベイトは、例えば融解温度を上昇させるために1つ以上の非天然ヌクレオチドを含む。代表的な非天然オリゴヌクレオチドとしては、修飾DNAまたはRNAヌクレオチドが挙げられる。代表的な修飾ヌクレオチド(例えば修飾RNAまたはDNAヌクレオチド)としては、ロックド核酸(LNA)(LNAヌクレオチドリボース部分が2’酸素および4’炭素を連結する余分な架橋で修飾される。);ペプチド核酸(PNA)、例えば、ペプチド結合によって連結された繰り返しN−(2−アミノエチル)−グリシン単位から構成されるPNA;低GC領域を捕捉するように修飾されたDNAまたはRNAオリゴヌクレオチド;二環式核酸(BNA);架橋オリゴヌクレオチド;修飾5−メチルデオキシシチジン;および2,6−ジアミノプリンが挙げられるが限定されない。他の修飾DNAおよびRNAヌクレオチドは当技術分野で公知である。

0312

ある一定の実施形態において、標的配列(例えば標的メンバー)の実質的に均一または均質なカバレッジが得られる。例えば、各ベイトセット/標的カテゴリ内で、ベイトパラメータを修飾することによって、例えば次のうち1つ以上によって、カバレッジの均一性を最適化し得る:
(i)同じカテゴリ中の他の標的に対して過小/過剰にカバーされる標的(例えば標的メンバー)のカバレッジを拡大/縮小させるために、ベイト表示または重複を増加/減少させることを使用し得る;
(ii)低カバレッジのために、標的配列(例えば高GC含量配列)を捕捉することが困難である場合、例えば隣接配列(例えばGCリッチ度がより低い隣接配列)をカバーするようにベイトセットで標的化される領域を拡大する;
(iii)ベイトの二次構造を減少させ、その選択効率を高めるために、ベイト配列の修飾をなし得る;
(iv)同じカテゴリ内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション速度を等しくするために、ベイトの長さの変更を使用し得る。(長さが様々なベイトを作製することによって)直接、または(一貫した長さのベイトを作製し、ベイト末端を任意の配列で置き換えることによって)間接的にベイト長を変更し得る;
(v)同じ標的領域(すなわちフォワードおよびリバース鎖)に対して異なる向きのベイトを修飾することで、結合効率が異なり得る。各標的に対して最適のカバレッジを提供する何れかの方向性を有するベイトセットを選択し得る;
(vi)各ベイト上に存在する結合実体、例えば捕捉タグ(例えばビオチン)の量を変更することは、その結合効率に影響を及ぼし得る。相対標的カバレッジを拡大/縮小させるために、特定の標的を標的とするベイトのタグレベルを増加/減少させることを使用し得る;
(vii)標的への結合親和性に影響を及ぼし、相対標的カバレッジを拡大/縮小させるために、異なるベイトに対して使用されるヌクレオチドのタイプを変更し得る;または
(viii)高GC含量に対して低いまたは通常のGC含量の領域間での融解ハイブリダイゼーション速度を等しくするために、修飾オリゴヌクレオチドベイトを用いること、例えばより安定な塩基対形成を有することを使用し得る。

0313

例えば、異なるタイプのオリゴヌクレオチドベイトセットを使用し得る。

0314

一実施形態において、選択効率についての値は、予め選択された標的領域を包含するために異なるタイプのベイトオリゴヌクレオチドを使用することによって修正される。例えば、大きな標的領域(例えば1〜2MBの全標的領域)をカバーするために、第1のベイトセット(例えば10,000〜50,000のRNAまたはDNAベイトを含むアレイに基づくベイトセット)を使用し得る。予め選択された標的領域(例えば、標的領域の関心のある全域、例えば250kb以下の選択されたサブゲノム区間)をカバーするために、第2のベイトセット(例えば5,000個未満のベイトを含む個別に合成されたRNAまたはDNAベイトセット)および/またはより高い二次構造、例えばより高いGC含量の領域を第1のベイトセットに添加し得る。関心のある選択対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)は、本明細書中に記載の遺伝子もしくは遺伝子産物のうち1つ以上またはその断片に対応し得る。第2のベイトセットは、所望のベイト重複に応じて、約1〜5,000、2〜5,000、3〜5,000、10〜5,000、100〜5,000、500〜5,000、100〜5,000、1,000〜5,000、2,000〜5,000個のベイトを含み得る。他の実施形態において、第2のベイトセットは、第1のベイトセットに添加される選択オリゴベイト(例えば、400、200、100、50、40、30、20、10、5、4、3、2または1個未満のベイト)を含み得る。第2のベイトセットは、個々のオリゴベイトのあらゆる比率で混合され得る。例えば、第2のベイトセットは、1:1の等モル比として存在する個々のベイトを含み得る。あるいは、第2のベイトセットは、例えば、ある一定の標的(例えば、ある一定の標的は、他の標的と比較して5〜10Xの第2のベイトを有し得る。)の捕捉を最適化するために、異なる比率(例えば、1:5、1:10、1:20)で存在する個々のベイトを含み得る。

0315

他の実施形態において、ベイトの当モル混合を使用した場合に観察される異なる配列捕捉効率に関連してベイトの相対的存在量または結合実体の密度(例えばハプテンまたは親和性タグ密度)を調整し、次いで内部水平化した群2に対して、全体的なベイト混合物に差次的過剰量の内部水平化した群1を導入することにより、群内(例えば、第1、第2または第3の複数のベイト)で個々のベイトの効率を等しくすることによって、選択効率が調整される。

0316

一実施形態において、本方法は、腫瘍メンバー、例えば、腫瘍細胞からの対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む核酸分子を選択するベイトセット(本明細書で「腫瘍ベイトセット」とも呼ばれる。)を含む複数のベイトセットの使用を含む。腫瘍メンバーは、腫瘍細胞中に存在する何らかのヌクレオチド配列、例えば腫瘍または癌細胞中に存在する本明細書中に記載のような突然変異型野生型、PGx、参照またはイントロンヌクレオチド配列であり得る。一実施形態において、腫瘍メンバーは、低頻度で出現する変化(例えば1つ以上の突然変異)を含み、例えば、腫瘍試料からの細胞の約5%以下がそれらのゲノムにおいて変化を有する。他の実施形態において、腫瘍メンバーは、腫瘍試料からの細胞の約10%の頻度で出現する変化(例えば1つ以上の突然変異)を含む。他の実施形態において、腫瘍メンバーは、PGx遺伝子または遺伝子産物からのサブゲノム区間、イントロン配列、例えば、本明細書中に記載のようなイントロン配列、腫瘍細胞中に存在する参照配列を含む。

0317

別の態様において、本発明は、本明細書中に記載のベイトセット、本明細書中に記載の個々のベイトセットの組み合わせ、例えば本明細書中に記載の組み合わせを特徴とする。(1つまたは複数の)ベイトセットは、説明書標準物質緩衝液または酵素または他の試薬を含んでいてもよいキットの一部であり得る。

0318

遺伝子選択
分析のための予め選択された対象区間、例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方、例えば遺伝子および他の領域のセットまたは群に対するサブゲノム区間の群またはセットが本明細書中で記載される。

0319

したがって、一実施形態において、方法は、得られた核酸試料からの少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個、またはそれ以上の、表1〜4から選択される、遺伝子または遺伝子産物からの対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を例えば次世代配列決定法によって配列決定し、それにより、例えば本明細書中に記載の癌からの腫瘍試料を分析することを含む。

0320

したがって、一態様において、本発明は、試料、例えば、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)からの腫瘍試料、を分析する方法を特徴とする。本方法は、
(a)試料からの複数メンバー、例えば、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)からの腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを得て;
(b)選択メンバー(例えばライブラリキャッチ)を提供するために、例えば1つまたは複数のライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって、予め選択した配列に対して1つまたは複数のライブラリを濃縮してもよく;
(c)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードを得て;
(d)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えばベイジアン法または本明細書中に記載の方法により、突然変異を呼び出し)、それにより前記の腫瘍試料を分析することを含み、
本方法は、試料からの少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個、またはそれ以上の、表1〜4から選択される、遺伝子または遺伝子産物からの対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を例えば次世代配列決定法によって配列決定することを含んでいてもよい。

0321

一実施形態において、段階(b)が存在する。一実施形態において、段階(b)は存在しない。

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