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技術 インターロイキン15タンパク複合体およびそれらの用途

出願人 ジエンスヘンルイメデイシンカンパニーリミテッドシャンハイヘンルイファーマスーティカルカンパニーリミテッド
発明者 チュ、シアンドンイエ、シンフ、チーユエツェイ、ドンビンタオ、ウェイカンジャン、リアンシャンスン、ピアオヤン
出願日 2015年11月17日 (5年0ヶ月経過) 出願番号 2017-531745
公開日 2018年1月11日 (2年10ヶ月経過) 公開番号 2018-500316
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物、その培養処理 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 ペプチド又は蛋白質 医薬品製剤 微生物による化合物の製造 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬
主要キーワード 安全窓 マッチングエラー コロイド相 初期構造 具体的条件 分子生成物 ラベル部分 ミスペアリング
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図面 (11)

課題・解決手段

本願においてインターロイキン15(IL-15)タンパク複合体を提供する。IL-15タンパク複合体は、可溶性融合タンパク(I)および(II)から成り、該可溶性融合タンパク(I)はIL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり、該可溶性融合タンパク(II)はIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントである。Cysに変異した融合タンパク(I)または(II)上の1以上のアミノ酸部位があり、融合タンパク(II)または(I)上のアミノ酸部位から変異した対応するCysと対になって、ジスルフィド結合を形成する。IL-15タンパク複合体は、腫瘍治療に使用することができる。

概要

背景

1994年にGrabsteinらによって発見されたインターロイキン15(IL-15)は、約12-14kDのサイトカインであり、T細胞B細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞の増殖を促進するなどの生物における正常な免疫応答関与する。IL-15は、サイトカインの小さな4本のα-へリックスバンドルファミリー一員である。IL-15は、そのレセプターと結合することにより生物活性を発揮する。IL-15レセプターは、3つのレセプターサブユニット:IL-15レセプターα(IL-15Rα)、IL-2レセプターβ(IL-2Rβ、IL-15RβまたはCD122としても知られる)およびγc(CD132としても知られる)から成る。IL-15Rαは、IL-15と結合することができて、結合後のIL-15の生物学的機能に必須であるSushiドメインを含んでいる。

近年、IL-15とそのレセプターIL-15Rαにより形成された複合体はIL-15の生物活性を著しく高めることができることが見いだされた。研究では、IL-15と可溶性IL-15Rαレセプターにより形成された複合体は、メモリーCD8陽性T細胞およびNT/NKT細胞増殖刺激においてIL-15単独より著しく優れていることを示した。IL-15/IL-15Rαは、抗原によって刺激されるメモリーCD8陽性T細胞などの、高CD122細胞の増殖を著しく増幅する。IL-15/IL-15Rα複合体は、メモリーCD8陽性T細胞の増殖刺激やそれらの生存の維持においてIL-15単独より10倍以上強く、メカニズムはtran presentationに関連している。

IL-15は、腫瘍免疫療法の分野で最も有望なものの1つであるため、NIHは、まず腫瘍領域におけるIL-15治療調査を始め、第I相臨床試験に上げることを試みた。しかしながら、IL-15は分子量が小さく、in vivoの半減期が短く、反復投与量のコントロールが難しいという欠点があり、全身性の免疫副作用を引き起こすことがある。in vivoの半減期を増加させて、in vivoでのIL-15の生物活性を促進または高めることができるアプローチを見つける緊急の必要がある。IL-15免疫療法に関連する研究を行っている多くの国内および外国の企業や研究機関があり、例えば、抗微生物感染治療のためのIL-15-hIgG4Fcホモ二量体タンパク質に関する特許文献1(Shanghai Haixin Biotechnology Co., Ltd.);本発明のIL-15とIL-15Rα複合体分子の間のジスルフィド結合の導入は、分子の安定性と生物活性を増加させるとともに、一方で製造工程を簡単にすることができる。

概要

本願においてインターロイキン15(IL-15)タンパク複合体を提供する。IL-15タンパク複合体は、可溶性融合タンパク(I)および(II)から成り、該可溶性融合タンパク(I)はIL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり、該可溶性融合タンパク(II)はIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントである。Cysに変異した融合タンパク(I)または(II)上の1以上のアミノ酸部位があり、融合タンパク(II)または(I)上のアミノ酸部位から変異した対応するCysと対になって、ジスルフィド結合を形成する。IL-15タンパク複合体は、腫瘍治療に使用することができる。なし

目的

本発明は、遺伝子工学の方法でデザインし、調製した、延長したin vivo半減期、増加したin vitro活性および著しい抗腫瘍活性を有するタンパク質分子を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

溶性融合タンパク(I)が、IL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり;可溶性融合タンパク(II)が、IL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり;該可溶性融合タンパク(I)または可溶性融合タンパク(II)が1以上のアミノ酸変異由来するCysを有し、ジスルフィド結合が可溶性融合タンパク(II)と可溶性融合タンパク(I)に存在する対応するCysの対形成により形成される、可溶性融合タンパク(I)および可溶性融合タンパク(II)から成るIL-15タンパク複合体

請求項2

可溶性融合タンパク(I)および/または可溶性融合タンパク(II)がFcフラグメントまたはその変異体共有結合している、請求項1に記載のIL-15タンパク複合体。

請求項3

アミノ酸Cys変異がIL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメント上のL45, Q48, V49, L52, E53, C88またはE89で、好ましくはL52, E53またはE89で、より好ましくはL52で生じる、請求項1〜2のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体。

請求項4

可溶性融合タンパク(I)の配列が配列番号2である、請求項1に記載のIL-15タンパク複合体。

請求項5

アミノ酸Cys変異がIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメント上のK34, L42, A37, G38またはS40で生じ、好ましくはA37, G38またはS40で、より好ましくはS40で生じる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体。

請求項6

可溶性融合タンパク(II)がIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントおよびFcフラグメントの組換えによって構成される;好ましくはIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントがFcフラグメントのN末端に結合する;より好ましくは、Fcフラグメントは配列番号9に示される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体。

請求項7

可溶性融合タンパク(II)の配列が、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から成る群から、好ましくは配列番号5または配列番号6から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体。

請求項8

可溶性融合タンパク(I)および可溶性融合タンパク(II)の下記の組み合わせ:から選択される、請求項1に記載のIL-15タンパク複合体。

請求項9

請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体をコードする、核酸

請求項10

請求項9に記載の核酸を含む、DNAベクター

請求項11

請求項10に記載のDNAベクターを含む、宿主細胞

請求項12

方法が:請求項11に記載の宿主細胞を請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体を発現するのに十分な条件下で培養し;IL-15タンパク複合体を発現させて精製することを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体の製造方法。

請求項13

請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、および薬学的に許容される賦形剤希釈剤または担体を含有する、医薬組成物

請求項14

生物材料の処理に使用するための請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、または請求項13に記載の医薬組成物の治療有効量。

請求項15

IL-15介在性疾患または障害の治療のための薬物の製造における、請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、または請求項13に記載の医薬組成物の使用。

請求項16

疾患または障害が、感染症、癌、血液疾患炎症性疾患および自己免疫疾患から成る群から選択され;癌は、好ましくはメラノーマ結腸直腸癌皮膚癌リンパ腫腎細胞癌肝臓癌肺癌胃癌および乳癌から成る群から選択され;感染症は、好ましくは痘瘡ウイルス感染症、HIV感染症細菌感染症真菌感染症およびHBV感染症から成る群から選択され;血液疾患は、好ましくは貧血症急性骨髄性白血病骨髄異形成症候群およびT細胞顆粒リンパ球白血病から成る群から選択され;自己免疫疾患は、好ましくは多発性硬化症乾癬関節リウマチ胃炎および粘膜炎から成る群から選択される、請求項15に記載の使用。

請求項17

IL-15タンパク複合体または医薬組成物が、小分子阻害剤または抗体薬物と組み合わせて投与され;該小分子阻害剤は、好ましくは標的化学療法剤または放射線治療剤から選択され;抗体薬物は、好ましくはモノクローナル抗体から選択され、より好ましくは抗CD20、抗PD1、抗PDL1、抗Her2、抗EGFRおよび抗c-MET抗体から選択される、請求項15または16に記載の使用。

請求項18

細胞免疫療法が特にDC,CIK, DC-CIK, ECIK, NK, CAS-T, BiAb-T, TCR-TおよびCAR-Tの腫瘍免疫療法である、細胞免疫療法のための薬物の製造における、請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、または請求項13に記載の医薬組成物の使用。

請求項19

疾患または障害が、感染症、癌、血液疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患から成る群から選択され;癌は、好ましくはメラノーマ、結腸直腸癌、皮膚癌、リンパ腫、腎細胞癌、肝臓癌、肺癌、胃癌および乳癌から成る群から選択され;感染症は、好ましくは痘瘡ウイルス感染症、HIV感染症、細菌感染症、真菌感染症およびHBV感染症から成る群から選択され;血液疾患は、好ましくは貧血症、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群およびT細胞大顆粒リンパ球性白血病から成る群から選択され;自己免疫疾患は、好ましくは多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、胃炎および粘膜炎から成る群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、または請求項13に記載の医薬組成物の治療上の有効量を必要とする患者に投与することを含む、IL-15介在性疾患または障害を治療または予防する方法。

請求項20

小分子阻害剤が、好ましくは標的化学療法剤または放射線治療剤、より好ましくはアルキル化剤から選択され;抗体薬物は、好ましくはモノクローナル抗体から選択され、より好ましくは抗CD20、抗PD1、抗PDL1、抗Her2、抗EGFRおよび抗c-MET抗体から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、または請求項13に記載の医薬組成物の治療上の有効量を小分子阻害剤または抗体薬物と組み合わせて必要とする患者に投与することを含む、疾患を治療または予防するための併用療法の方法。

技術分野

0001

本発明は、IL-15タンパク複合体およびそれらの用途に関し、さらに可溶性のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体、および治療剤としての、特に癌と自己免疫疾患の治療剤としてのその用途に関する。

背景技術

0002

1994年にGrabsteinらによって発見されたインターロイキン15(IL-15)は、約12-14kDのサイトカインであり、T細胞B細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞の増殖を促進するなどの生物における正常な免疫応答関与する。IL-15は、サイトカインの小さな4本のα-へリックスバンドルファミリー一員である。IL-15は、そのレセプターと結合することにより生物活性を発揮する。IL-15レセプターは、3つのレセプターサブユニット:IL-15レセプターα(IL-15Rα)、IL-2レセプターβ(IL-2Rβ、IL-15RβまたはCD122としても知られる)およびγc(CD132としても知られる)から成る。IL-15Rαは、IL-15と結合することができて、結合後のIL-15の生物学的機能に必須であるSushiドメインを含んでいる。

0003

近年、IL-15とそのレセプターIL-15Rαにより形成された複合体はIL-15の生物活性を著しく高めることができることが見いだされた。研究では、IL-15と可溶性IL-15Rαレセプターにより形成された複合体は、メモリーCD8陽性T細胞およびNT/NKT細胞増殖刺激においてIL-15単独より著しく優れていることを示した。IL-15/IL-15Rαは、抗原によって刺激されるメモリーCD8陽性T細胞などの、高CD122細胞の増殖を著しく増幅する。IL-15/IL-15Rα複合体は、メモリーCD8陽性T細胞の増殖刺激やそれらの生存の維持においてIL-15単独より10倍以上強く、メカニズムはtran presentationに関連している。

0004

IL-15は、腫瘍免疫療法の分野で最も有望なものの1つであるため、NIHは、まず腫瘍領域におけるIL-15治療調査を始め、第I相臨床試験に上げることを試みた。しかしながら、IL-15は分子量が小さく、in vivoの半減期が短く、反復投与量のコントロールが難しいという欠点があり、全身性の免疫副作用を引き起こすことがある。in vivoの半減期を増加させて、in vivoでのIL-15の生物活性を促進または高めることができるアプローチを見つける緊急の必要がある。IL-15免疫療法に関連する研究を行っている多くの国内および外国の企業や研究機関があり、例えば、抗微生物感染治療のためのIL-15-hIgG4Fcホモ二量体タンパク質に関する特許文献1(Shanghai Haixin Biotechnology Co., Ltd.);本発明のIL-15とIL-15Rα複合体分子の間のジスルフィド結合の導入は、分子の安定性と生物活性を増加させるとともに、一方で製造工程を簡単にすることができる。

先行技術

0005

CN100334112C

発明が解決しようとする課題

0006

本発明は、遺伝子工学の方法でデザインし、調製した、延長したin vivo半減期、増加したin vitro活性および著しい抗腫瘍活性を有するタンパク質分子を提供する。

課題を解決するための手段

0007

本発明は、可溶性融合タンパク(I)および可溶性融合タンパク(II)を含むIL-15タンパク複合体を提供し;
該可溶性融合タンパク(I)はIL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり;該可溶性融合タンパク(II)はIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり;
該可溶性融合タンパク(I)および/または可溶性融合タンパク(II)は1以上のアミノ酸変異から生成したCysを有し、ジスルフィド結合は可溶性融合タンパク(II)と可溶性融合タンパク(I)に存在する対応したCysの対形成により形成される。

0008

本発明の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該可溶性融合タンパク(I)および/または可溶性融合タンパク(II)はFcフラグメントまたはその変異体共有結合的に結合している。

0009

本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該可溶性融合タンパク(II)はFcフラグメントまたはその変異体に共有結合的に結合している。

0010

本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該アミノ酸Cys変異はIL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメントで起こる。
本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該アミノ酸Cys変異部位はIL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメント上のL45, Q48, V49, L52, E53, C88またはE89で、好ましくはL52, E53またはE89で、より好ましくはL52で生じる。

0011

本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、可溶性融合タンパク(I)の配列は、配列番号2である。

0012

本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該アミノ酸Cys変異部位はIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントで起こる。

0013

本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該アミノ酸Cys変異部位はIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントのK34, L42, A37, G38またはS40で、好ましくはA37, G38またはS40で、より好ましくはS40で生じる。

0014

本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該可溶性融合タンパク(II)はIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントとFcフラグメントの組換えによって構成される;好ましくはIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントはFcフラグメントのN末端に結合する;より好ましくは、Fcフラグメントは配列番号9に示される。

0015

本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該可溶性融合タンパク(II)の配列は配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から成る群から、好ましくは配列番号5または配列番号6から選択される。

0016

本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体は、可溶性融合タンパク(I)と可溶性融合タンパク(II)の次の組み合わせから選択される:

0017

本発明は、また上述のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体をコードする核酸に関する。

0018

本発明は、また上述の核酸を含むDNAベクターに関する。

0019

本発明は、また上述のDNAベクターを含む宿主細胞に関する。

0020

本発明は、また上述のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体の製造方法に関し、該方法は本発明の宿主細胞を上述のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体の発現に十分な条件下で培養し;IL-15/IL-15Rαタンパク複合体を発現させて精製することを含む。

0021

本発明は、また本発明のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体、および薬学的に許容される賦形剤希釈剤または担体を含有する医薬組成物に関する。

0022

本発明は、また治療上の有効量の本発明のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体、または本発明の医薬組成物を哺乳動物投与することを含む、哺乳動物における免疫応答を刺激または抑制する方法に関する。

0023

本発明は、またIL-15介在性疾患または障害の治療のための薬物の製造における本発明のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体、または本発明の医薬組成物の使用に関し;該疾患は感染症、癌、血液疾患および自己免疫疾患から成る群から選択される。癌は、メラノーマ結腸直腸癌皮膚癌リンパ腫腎細胞癌固形腫瘍肝臓癌肺癌胃癌、および乳癌から成る群から選択される;感染症は、痘瘡ウイルス感染症、HIV感染症細菌感染症真菌感染症、およびHBV感染症から成る群から選択される;血液疾患は、貧血症急性骨髄性白血病骨髄異形成症候群、およびT細胞大顆粒リンパ球白血病から成る群から選択される;自己免疫疾患は、多発性硬化症乾癬関節リウマチ炎症性疾患胃炎および粘膜炎から成る群から選択される。IL-15/IL-15Rαタンパク複合体または医薬組成物は、単独で、または他の薬物と組み合わせて使用することができる。他の薬物は、小分子阻害剤または抗体薬物である。小分子阻害剤は、好ましくは標的化学療法剤または放射線治療薬、より好ましくはアルキル化剤から選択される;抗体薬物は、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくは抗CD20、抗PD1、抗PDL1、抗Her2、抗EGFR、抗c-MET抗体から選択される。

0024

本発明は、また、限定されないが、化学療法放射線治療外科治療等の疾患を治療または予防する方法に関する。疾患関連抗原は該疾患で発現する。該方法は、患者に上述のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体または上述の医薬組成物を投与し;疾患関連抗原を発現する細胞と免疫細胞を活性化させるのに十分なIL-15Rαを発現する免疫細胞の間で、特異的に結合する複合体を形成して;免疫細胞を介して;疾患関連抗原を発現するこれらの細胞を死滅させることを含む。疾患関連抗原を発現する細胞は、好ましくは腫瘍細胞またはウイルス感染細胞である。免疫細胞は、好ましくはT細胞、LAK細胞またはNK細胞である。疾患は、感染症、癌、血液疾患および自己免疫疾患から成る群から選択される。癌は、好ましくはメラノーマ、結腸直腸癌、皮膚癌、リンパ腫、腎細胞癌、固形腫瘍、肝臓癌、肺癌、胃癌、および乳癌から成る群から選択される。感染症は、痘瘡ウイルス感染症、HIV感染症、細菌感染症、真菌感染症およびHBV感染症から成る群から選択される。血液疾患は、貧血症、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、およびT細胞大顆粒リンパ球性白血病から成る群から選択される。自己免疫疾患は、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、炎症性疾患、胃炎および粘膜炎から成る群から選択される。

0025

本発明は、また、患者に上述のIL-15/IL-15Rαタンパク複合体または上述の医薬組成物を、小分子阻害剤または抗体薬物などの他の薬物と組み合わせて投与することを含む、疾患を治療または予防するための併用療法の方法に関する。小分子阻害剤は、好ましくは標的化学療法剤または放射線治療剤、より好ましくはアルキル化剤から選択される;抗体薬物は、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくは抗CD20、抗PD1、抗PDL1、抗Her2、抗EGFR、および抗c-MET抗体から選択される。

0026

本開示をより良く理解するために、一定の技術および科学用語を以下に具体的に定義する。この文書の何処かで特に定義されていなければ、本明細書の全ての他の技術および科学用語は本開示の属する技術分野における当業者に一般的に理解されている意味を有する。

0027

用語
本明細書において、アミノ酸の1文字コードおよび3文字コードは、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558に記載されているとおりである。

0028

本発明において、本発明の「タンパク複合体」または「複合タンパク質」は、2つの異なる単量体タンパク質の結合によって生成したタンパク質をいう。

0029

本発明において、タンパク複合体を構成する単量体タンパク質(即ち、可溶性融合タンパク(I)、可溶性融合タンパク(II)))は、融合タンパク質であっても、非融合タンパク質であってもよい。

0030

本発明において、「融合タンパク質」とは、遺伝子組換え法、化学的方法または他の適切な方法を用いることにより2以上の遺伝子のコード領域を結合し;そして理想的な制御配列のコントロールの下で組換え遺伝子を発現することにより得られるタンパク質生成物をいう。本発明のいくつかの実施態様において、可溶性融合タンパク(I)は、発現するIL-15またはその変異体の、Fcフラグメントなどの生物活性ポリペプチドとの融合または非融合により得られた単量体タンパク質である;そして、可溶性融合タンパク(II))は、発現するIL-15Rαまたはその変異体の、Fcフラグメントなどの生物活性ポリペプチドとの融合または非融合により得られた単量体タンパク質である。本発明の融合タンパク質において、2以上の遺伝子のコード領域は、1つまたは複数の位置においてペプチドリンカーをコードする配列により融合させることができる。ペプチドリンカーは、また本発明の融合タンパク質を作成するために用いることもできる。

0031

本明細書において、「IL-15」または「機能性フラグメント」は、ヒトまたは非ヒト哺乳類のIL-15または非哺乳類のIL-15などのいずれのIL-15(インターロイキン15)またはその変異体であってもよい。非ヒト哺乳類の例としては、ブタウサギサルチンパンジーマウスなどが挙げられる;非哺乳類としては、ニワトリなどが挙げられる。好ましくは、ヒトIL-15およびその機能性フラグメントである。ヒトインターロイキン15成熟分子(配列番号1)は、Database UniProtKB, Accession Number P40933, 49-162aaに見出される。用語「IL-15機能性フラグメント」とは、IL-15の生物学的機能または他の特性に変わった効果を有する、1以上のアミノ酸の置換、付加または削除により得られた変異体をいう。そのようなアミノ酸の変更は、IL-15と、そのレセプターIL-15RαまたはIL-15Rβの間の相互作用を増加または減少させることができる;または免疫細胞の増殖刺激におけるその活性などのIL-15の生物活性を増加または減少させる;またはそのようなアミノ酸変異はIL-15とそのレセプターの間の共有結合を作り、または共有結合をより安定にする。例えば、IL-15(L52C)、即ち、52位で、ロイシンLは、システインCと置換され(配列番号2)、そしてこの部位に対応するIL-15Rαの特定のアミノ酸がCに置換されて、それとジスルフィド結合を形成した。

0032

本明細書において、「IL-15Rα」または「機能性フラグメント」は、ヒトまたは非ヒト哺乳類のIL-15Rαまたは非哺乳類のIL-15Rαなどのどの種からの、いずれのIL-15Rαまたはその機能性フラグメントであってもよい。非ヒト哺乳類の例としては、ブタ、ウサギ、サル、チンパンジー、マウスなどが挙げられる;非哺乳類としては、ニワトリなどが挙げられる。好ましくはヒトIL-15Rα、より好ましくはIL-15Rα ECD(配列番号3)(Database UniProtKB, Accession Number Q13261, 31-205aa参照)と呼ばれるヒトインターロイキン‐15レセプターαの細胞外ドメイン部分である。用語「IL-15Rα機能性フラグメント」は、好ましくはIL-15Rαの細胞外ドメインフラグメントの短縮形、即ち、IL-15Rα-sushi +(配列番号4)などのヒトインターロイキン15レセプターα活性を持つ、1以上のアミノ酸の置換、挿入または削除によって得られたsushiドメインを含む分子である。

0033

用語「Fcフラグメント」とは、ヒト免疫グロブリン鎖の定常部、特に抗原結合活性を持たないC末端または免疫グロブリン重鎖定常部の部分を言い、抗体分子エフェクター分子または細胞の間の相互作用の部位である。例えば、免疫グロブリンFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域と組み合わせて、重鎖CH1, CH2, CH3およびCH4の2以上のドメインを含んでいてもよい。重鎖定常部のアミノ酸配列によると、免疫グロブリンは、異なるカテゴリー、主に免疫グロブリン:IgA,IgD,IgE,IgGおよびIgMの5つのクラスに分類できる。これらの幾つかは、さらにサブタイプアイソタイプ)、例えば、IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4;IgA-1, IgA-2および異なるゲノタイプに分類できる。

0034

「Fcフラグメント」は、好ましくは少なくとも1つの免疫グロブリンのヒンジ領域、およびIgGのCH2とCH3領域を含む。より好ましくはCH2ドメイン、CH3ドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域を含み、ヒンジ領の最初のアミノ酸は変動してもよい。

0035

本発明における用語「リンカーペプチドリンカー)」は、正確なタンパク質フォールディングおよび安定性を確実ならしめるために、IL-15またはIL-15RαをFc変異体と結合するために用いるペプチドである。本発明の「リンカーペプチド」は、好ましくは(GGGGS) nであり、ここでnは0, 1, 2, 3, 4, 5またはそれ以上、好ましくはnは2-4である。もしリンカーペプチドの配列が短すぎる場合、2つのタンパク質の高度な折り畳み構造が影響されて、お互いに干渉される;もしリンカーペプチドの配列が長すぎる場合、免疫原性の問題が関係し、リンカーペプチドの配列自身が新しい抗原になる。

0036

本明細書において、「タンパク複合体」は、好ましくは同時発現した遺伝子の産物であり、例えば大腸菌などの原核細胞で同時発現したもの;または293およびCHOなどの真核細胞で同時発現したものである。

0037

本明細書において、「同時発現」とは、複数の遺伝子が細胞中一緒に発現して、同時にそれらの産物を産生することをいう。これらの遺伝子は、同時に存在し、そして別個にまたは共通してコントロールして発現させることができる。本発明において、2つの遺伝子は、好ましくは真核細胞で同時発現させる。遺伝子の同時発現によって得られた産物は、効率的にそして容易に複合体を生成することにつながる。

0038

「投与」または「処理」は、動物、ヒト、試験被験者、細胞、組織器官、または生物流体などの生物材料に適用されるが、外来性医薬品、治療剤、診断薬、または組成物の動物、ヒト、被験者、細胞、組織、器官、または生物流体などの生物材料との接触をいう。「投与」または「処理」は、例えば、治療、薬物動態診断、研究、および試験の方法をいうこともできる。細胞の処理は、試薬を細胞と接触させることも、試薬を流体と接触させることも包含し、ここで該流体は細胞と接触している。「投与」または「処理」は、また、試薬、診断、結合化合物での、または他の細胞での、例えば細胞のin vitroおよびex vivo処理も意味する。「処理」は、ヒト、動物、または被験者に適用するとき、研究や診断応用に対する治療処理、予防または防止処置をいう。「処理」は、ヒト、動物、または被験者、または細胞、組織、または器官に適用するとき、IL-15アゴニストまたはIL-15アンタゴニストをヒトまたは動物、被験者、細胞、組織、生理学コンパートメント、または生理的流体と接触させることを包含する。「細胞の処理」は、IL-15アゴニストまたはIL-15アンタゴニストが、例えば流体相またはコロイド相中でIL-15レセプターと接触する状況を含み、またアゴニストまたはアンタゴニストが細胞またはレセプターと接触しない場合も包含する。

0039

「処理」は、本発明のIL-15タンパク複合体またはそれを含有する組成物などの内用または外用治療剤を「免疫」または「癌」から選択される1以上の疾患または症状を患う患者に投与することを意味する。該治療剤は、これらの疾患や症状に治療効果を有することが知られている。一般的に、治療剤は、これらの疾患や症状の退縮を引き起こすことによるか、あるいは臨床的に測定できる程度にそのような疾患や症状の進行を阻害することにより、治療される患者や個体群の1以上の疾患や症状を軽減するのに効果的な量で投与される。特定の疾患や症状を緩和するのに効果的な治療剤の量(「治療有効量」とも云う)は、患者の疾患の状態、年齢、および体重、患者における望ましい応答を引き出す薬物の能力などの幾つかのファクターにより変わる。

0040

免疫疾患」または「免疫障害」は、例えば病理学的炎症、炎症性疾患、および自己免疫疾患または障害が挙げられる。「免疫疾患」は、また感染症、持続性感染、および癌、腫瘍および血管新生などの増殖性疾患をいう。「癌性疾患」としては、例えば癌、癌細胞、腫瘍、血管新生、および前癌病変、例、異形成が挙げられる。

0041

本明細書において、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」とは、例えば米国特許番号4,683,195号に記載されている増幅方法または技術をいう。一般に、目的領域末端からの配列情報または目的領域を超える配列情報が、オリゴヌクレオチドプライマーがデザインできるように、入手できる必要がある。これらのプライマーは、配列が増幅されるテンプレートと反対のストランドと同一または類似である。

0042

「任意の」または「任意に」は、続いて記載した出来事や状況が必ずしも生じなくてもよいことを意味し、その記載は出来事や状況が生じても、生じなくてもよい事例を含んでいる。例えば、「任意に1‐3の抗体重鎖可変領域を含む」は、抗体重鎖可変領域が存在しても、必ずしも存在しなくてもよいことを意味する。もし存在する場合、1,2または3である。

0043

「医薬組成物」とは、他の化学成分と共に1以上の本発明の化合物またはそれらの生理学的/薬学的に許容される塩またはプロドラッグ、ならびに生理学的/薬学的に許容される担体や賦形剤などの更なる成分を含む混合物をいう。医薬組成物は、生物への投与を促進し、活性成分の吸収を容易にし、それにより生物活性を発揮させることを目的にする。

0044

組換えDNAでの宿主細胞の形質転換は、当業者に良く知られた慣用の技術で行ってもよい。得られた形質転換細胞は、慣用の方法を用いることにより培養して、本発明の遺伝子によりコードされたポリペプチドを発現する。培地は、用いる宿主細胞に基づいて種々の慣用の培地から選択できる。宿主細胞は適切な条件下で増殖する。

図面の簡単な説明

0045

IL-15とレセプターα, β, γの結晶複合体の構造を示す図である。
IL-15とIL-15Rα(レセプターα)の界面での残基を示す図である。
IL-15とIL-15Rα上に位置する変異体候補残基の相対的位置を示す図である。
IL-15上のL52CとIL-15Rα上のS40Cの間で生成したジスルフィド結合のモデル図である。
本発明における同時発現した分子生成物1-9上のHisタグの検出のためのウエスタン解析を示す。
本発明における同時発現した分子生成物1-18上のFc部分の検出のためのウエスタン解析を示す。
本発明のタンパク複合体1, 2, 3, 4の構造図を示す図である。
マウスの転移性腫瘍についての本発明のタンパク複合体の効果を示す図であり、図の"*"はp<0.05, vsPBSを表す。
マウスの相対的肺重量(肺重量/体重)についてのタンパク複合体の効果を示す図である。
マウスの体重についてのタンパク複合体の効果を示す図である。
ラットにおけるタンパク複合体3の半減期を示す図である。

0046

発明の詳細な説明
以下に、実施例を参照して本発明を更に説明する;しかしながら、本発明の範囲は、それらに限定されない。
本発明の実施例において、具体的条件が記載されていない場合、試験は、通常、慣用条件下、または原料または製品製造者が提案する条件下で行う。Sambrook et al., Molecμlar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecμlar Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY参照。試薬の供給源が具体的に与えられていない場合、試薬は、市販で入手できる慣用試薬である。

0047

変異体の選定と検証
IL-15は、癌とウイルス性疾患治療の有望なサイトカインである。それは、IL-15Rα(IL-15レセプターα)によってT細胞とNK細胞の表面に位置するIL-15レセプターβ/γに例示され、それにより活性化T細胞の増殖が刺激される。従って、IL-15とIL-15レセプターαの結合能を増加させることは、さまざまなリンパ細胞の機能を著しく高め、免疫療法にとって非常に重要である。

0048

IL-15とレセプターα, β, γ(PDB ID: 4GS7)の結晶複合体構造から、3つのレセプターは、IL-15にそれぞれ3つの異なる方向で結合していることがわかる(図1)。それ故、IL-15とレセプターαの間の界面に存在する残基が修飾されたとき、IL-15のレセプターβおよびγへの結合は影響を受けない。

0049

本発明者らは、初期構造(この構造におけるレセプターαの結晶構造は4GS7におけるものより僅かに長い)としてIL-15とレセプターαの共結晶構造(PDB ID: 2Z3Q)を選択した。IL-15とレセプターα界面に位置する残基は、構造から要約された(表1)。カットオフ値は、反対の分子から6Åにセットした(図2)。

0050

0051

ジスルフィドスキャンは、Simμlation software MOEのDisμlfide Scanを用いてIL-15とレセプターαの間の界面で行った。スキャンの基本原則は、残基の下記組み合わせ(表2)および候補変異残基の相対的位置(図3)を得るために、ジスルフィド結合長の範囲内で、それぞれ、IL-15およびレセプターαに位置する残基の組み合わせを探すことである。

0052

変異組合せの選択は、以下の原則に従って行った。1.マッチングエラーを避け、次いでオリジナルの分子内ジスルフィド結合のミスペアリングを避けるために、分子内ジスルフィド結合の近くの残基は選択しない。2.タンパク質の後の変異の3次元構造に影響しない残基を選択するようにする。3.構造全体の後の変異に対するエネルギーの影響を最小にする残基を選択する。

0053

上記要件1を満たすために、複合体の結晶構造から、IL-15の構造について、分子内ジスルフィド結合は、それぞれC35とC85の間、およびC42とC88の間で形成されたことがわかる。従って、IL-15上の候補残基として、それぞれE87とE89、C88の上流と下流の可能性は除外でき、そして候補残基として対応するレセプターα上のP67とK34の可能性を排除できる。さらに、レセプターαのA37残基とIL-15のC88残基により形成されたジスルフィド結合の可能性を排除する必要がある。レセプターαの構造に関し、C29とC63はジスルフィド結合を形成する。ペアの近くでは候補残基は見つからなかった。

0054

上記要件2を満たすために、結晶化複合体を分析した。まず、L45, Q48, V49, L52およびE53は、全てIL-15構造のαへリックスに位置している。さらに、L45, Q48およびV49は、全てαへリックス中央に位置している。もしこれらの残基がCysに変異すると、ジスルフィド結合の形成により生じた側鎖の歪みが原αへリックスのっ構造に影響し、次いでタンパク構造全体に影響する可能性がある。それ故、IL-15上のL52とE53残基が好ましいと考えられた。第2に、IL-15レセプターαの構造に関し、L42はβフォールドに位置し、A37, G38およびS40は、全てループに位置している。それ故、IL-15レセプターαに存在するA37, G38およびS40が、好ましいと考えられた。2つの構造を考慮して、IL-15からのL52とIL-15レセプターαからのS40が、Cysへの変異に好ましいと考えられ、最終的に、分子間ジスルフィド結合の形成に導いた。

0055

上記要件3を満たすために、アラニンスキャンを、Discovery Studio Computational Softwareを用いて全ての上記残基について行った。変異において計算したエネルギー変化の結果(表3)は、IL-15に存在するL52Aは構造安定性に最小限に影響し、そしてIL-15レセプターαに存在するS40Aは構造安定性に最小限に影響したことを示している。従って、上記の結果から、IL-15からのL52およびIL-15レセプターαからのS40がCysへの変異、そして最終的に分子間ジスルフィド結合(図4)の好ましい候補と考えることができる。

0056

要約すると、全部で8ペアの変異残基がデザインされた。これらの中で、IL-15からのL52およびIL-15レセプターαからのS40がCysへの変異、そして最終的にジスルフィド結合の形成に好ましいと考えられる。

0057

上記8ペアの変異残基に基づいて、分子を細胞発現検証のためにデザインした。2つの形態がある。1つはCys変異を持つIL-15 Rαと同時発現したCys変異を持つIL-15-Fc融合分子であり(組合せ10-18)、もう一方はCys変異を持つIL-15Rα-Fc融合分子と同時発現したCys変異を持つIL-15-6hisである(組合せ1-9)。同時発現から得られた細胞上澄部はウエスタン解析に付した。同時発現生成物の組合せ1-9のHisラベル部分抗マウスHis(一次抗体、abcam、ab14923)およびヤギ抗マウスHRP(二次抗体、Jackson、115-035-062)で検出できる;そして同時発現生成物の組合せ1-18のFc部分はヤギ抗ヒトFc-HRP (Jackson, 109-035-098)で検出された。具体的な同時発現組合せを表4に示す。

0058

ウエスタン解析は、Fc融合IL-15およびIL-15 Rαを組み合わせることによる同時発現はミスマッチになって、正しいペアの目的生成物の量を減少させやすいことを示した。しかしながら、Fcとの融合後、Fc融合IL-15 RαとIL-15をペアリングすると正しい組み合わせの単一分子が得られる。中でも、同時発現組合せ5,6および7の発現レベルはより高く、生成物は高度に均一で、バンドのサイズは期待されたものと一致した(図5-6)。結果はシミュレーションからの予測とよく一致した。コンピュータのシミュレーションと細胞により発現された生成物の特性の両方の結果を考慮すると、IL15のアミノ酸Cys変異部位は、L45, Q48, V49, L52, E53, C88またはE89で、好ましくはL52, E53またはE89で、より好ましくはL52で選択された。IL-15 Rαのアミノ酸Cys変異部位は、K34, L42, A37, G38またはS40で、好ましくはA37, G38またはS40で、より好ましくは S40で選択された。最も好ましいのは、IL-15 RαのS40Cと組み合わせたIL-15 の変異L52Cである。さらに、IL-15タンパク複合体の安定性はジスルフィド結合の2以上のペアを選択するか、またはIL-15とIL-15 Rαの間の他の非システイン変異を導入することにより改善できる。

0059

関連ベクターの作成
材料:
真核生物発現ベクターpcDNA3.1 (+)(Life technologies, Cat. No. V790-20);IL-15(DNA配列1)、IL-15 Rα ECD、IL15Rα-sushi+(73)およびIgG1FcDNAフラグメント遺伝子合成会社(GENEWIZ, Inc., Suzhou)により合成された。
プライマーは遺伝子合成会社(GENEWIZ, Inc., Suzhou)により合成された。

0060

方法:
1.フラグメント連結
IL-15Rα-ECD-Fcフラグメント:オーバーラップPCRを用いて、IL-15Rα-ECD、リンカーペプチドおよびFc(DNA配列2)の順で3つのDNAフラグメントを結合することによりIL-15Rα-ECD-Fcフラグメントを形成した。
Fc-IL-15Rα-ECDフラグメント:オーバーラップPCRを用いて、Fc、リンカーペプチドおよびIL-15Rα-ECD(DNA配列3)の順で3つのDNAフラグメントを結合することによりFc-IL-15Rα-ECDフラグメントを形成した。
IL-15Rα-sushi+-Fcフラグメント:オーバーラップPCRを用いて、IL-15Rα-sushi+、リンカーペプチドおよびFc(DNA配列4)の順で3つのDNAフラグメントを結合することによりIL-15Rα-sushi+-Fcフラグメントを形成した。
Fc-IL-15Rα-sushi+フラグメント:オーバーラップPCRを用いて、Fc、リンカーペプチドおよびIL-15Rα shushi+(DNA配列5)の順で3つのDNAフラグメントを結合することによりFc-IL-15Rα-sushi+フラグメントを形成した。
Cys変異を含む遺伝子フラグメントは、点変異により得た、たとえば:
IL-15 (L52C):52位上で、LはCに変異した(DNA配列6)
IL15Rα-ECD (S40C)-Fc:40位上で、SはCに変異した(DNA配列7)
Fc-IL-15Rα ECD (S40C)フラグメント:(DNA配列8)
IL-15Rα-shushi+ (S40C)-Fcフラグメント:(DNA配列9)
Fc-IL-15Rα-shushi+ (S40C) フラグメント:(DNA配列10)

0061

2.制限部位シグナルペプチド配列の導入
制限エンドヌクレアーゼKpnI部位、Kozak配列およびシグナルペプチド配列は、PCRにより遺伝子フラグメントの5'-末端に導入した。KpnI部位と遺伝子フラグメントの配列を以下に示す:
ggtaccttgtgcccgggcgccaccATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGC(下線の配列は。KpnI制限部位、イタリックの配列はシグナルペプチドである);終止コドンTGAおよびNotI制限酵素部位は、それぞれ3つのフラグメントの3'-末端に導入した。

0062

3.発現ベクターの作成
上記遺伝子フラグメントは、KpnIおよびNotI制限酵素部位によりベクターpcDNA3.1 (+)に挿入してpcDNA3.1-IL-15、pcDNA3.1-IL-15Rα-ECD-Fc、pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-EC、pcDNA3.1-IL-15Rα-shushi+-Fc、pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-sushi+などの発現ベクターを作成した。対応する発現プラスミドが得られた。

0063

4.遺伝子の部位特異的変異
KODkit (TOYOBO Cat.KOD-201)を、2.5μL 10 × KODバッファー、2.5μL 2mM dNTPs、1μLプライマー1 (10μM)、1μLプライマー2 (10μM)、0.5μL KOD plus、1μL 25mM MgSO4および16μL ddH2Oを含む25μL 系(system)で部位特異的変異に使用した。合成方法は次の通りである:94°C 2分間, 94°C 30秒間, 55°C 30秒間, 68°C 11分間, 25サイクルの増幅後,PCR増幅は次の更なる68°C 11分で終了した。PCR生成物は、1μLのDpnI(NEB Cat. R0176L)で5時間消化し、次いでDH5aコンピテント細胞中にトランスフォームした。その後、クローン配列決定のためにピックアップして望みのプラスミドpcDNA3.1-IL-15(L52C), pcDNA3.1-IL-15Rα-ECD(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-ECD(S40C), pcDNA3.1-IL-15Rα-shushi+(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-sushi+(S40C)および他の変異体遺伝子を得た。本発明の実施例に関与するタンパク複合体1は、DNA配列6および7を含む発現ベクターを発現することにより得られた。本発明の実施例に関与するタンパク複合体3は、DNA配列6および9を含む発現ベクターを発現することにより得られた。本発明の実施例に関与するタンパク複合体4は、DNA配列6および10を含む発現ベクターを発現することにより得られた。本発明の実施例に関与するタンパク複合体2は、DNA配列6および8を含む発現ベクターを発現することにより得られた。

0064

発現プラスミドのヌクレオチド配列の構成
以下の配列をベクター作成に用いた。単一の横線はシグナルペプチドDNA配列を表し、破線はペプチドリンカーDNA配列を表し、そして二重の横線は変異DNA配列を表す。
IL-15 (DNA配列1, 配列番号10):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCAACTGGGTGAATGTAATTAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCGAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGCGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCTTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA

0065

IL-15Rα-ECD-Fc (DNA配列2, 配列番号11):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA

0066

Fc-IL-15Rα-ECD (DNA配列3, 配列番号12):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTTGA

0067

IL-15Rα-shushi+ (73)-Fc (DNA配列4, 配列番号13):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGAC

0068

Fc-IL-15Rα-shushi+ (73) (DNA配列5, 配列番号14):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCTGA

0069

IL-15(L52C) (DNA配列6, 配列番号15):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCAACTGGGTGAATGTAATTAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCGAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCATGTGAGTCCGGCGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCTTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA

0070

IL-15Rα-ECD (S40C)-Fc (DNA 配列7, 配列番号16):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA

0071

Fc-IL-15Rα-ECD (S40C) (DNA配列8, 配列番号17):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTTGA

0072

IL-15Rα-shushi+ (73) (S40C)-Fc (DNA配列9, 配列番号18):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGAC

0073

Fc-IL-15Rα-shushi+ (73)(S40C) (DNA配列10, 配列番号19):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCTGA

0074

Fc fragment:IgG1-Fc DNA (DNA配列11, 配列番号20):
GAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAG

0075

IL-15タンパク複合体の特徴
本発明で提供するIL-15タンパク複合体は、可溶性融合タンパク(I)および可溶性融合タンパク(II)から成り;該可溶性融合タンパク(I)は生物活性ポリペプチドまたはその機能性フラグメントに共有的に結合したIL-15ポリペプチドを含む;可溶性融合タンパク(II)は生物活性ポリペプチドまたはその機能性フラグメントに共有的に結合したIL-15Rαポリペプチドを含む;該可溶性融合タンパク(I)または可溶性融合タンパク(II)は、1以上のアミノ酸変異部位に由来するCysを有し、ジスルフィド結合は可溶性融合タンパク(II)および可溶性融合タンパク(I)に存在する対応するCysのペアリング(対形成)により形成される。

0076

本発明において、明白な抗腫瘍活性および延長したin vivo半減期を持つ安定なタンパク複合体は、遺伝子工学の方法で作成した。そして複合体分子は、IL-15のFc融合タンパク質分子またはその誘導体およびIL-15Rαまたはその誘導体を含んでいる。

0077

融合タンパク質分子は、次の特徴を有する:
1)融合タンパク質は2つの主要な分子成分を含み、その1つはIL-15生物活性を有する分子であり、他方はIL-15Rαまたはその機能性フラグメントを有するFc融合分子である;
2)IL-15生物活性を有する分子成分は、野生型IL-15またはIL-15機能性変異体に基づいて1以上のアミノ酸部位でシステイン変異を有し、これらのシステイン変異部位は、IL-15Rαまたはその機能性フラグメント上の対応するシステイン変異部位と対になってジスルフィド結合を形成する;
3)IL-15Rαまたは機能性フラグメントを有するFc融合分子成分は、IL-15Rαの完全な細胞外ドメインフラグメントまたはsushiドメインの短縮形を含むIL-15Rα機能性フラグメントに基づいて1以上のアミノ酸部位でシステイン変異を有している。これらのシステインは、IL-15またはその機能性変異体上の対応するシステイン変異部位と対になってジスルフィド結合を形成する;
4)融合タンパク質は、2つのプラスミドで単一の細胞株同時導入または作成することによって安定に発現させることができ、単一分子が慣用の分離方法によって得られる。

0078

本発明の実施例で用いたIL-15は、ヒトインターロイキン15成熟分子(配列番号1)またはその変異体をいう。本発明の実施例で用いたIL-15Rα ECDは、ヒトインターロイキン15レセプターα細胞外ドメインフラグメント(配列番号3)をいう。その変異体は、好ましくはIL-15Rα-sushi +(配列番号4)などの、その短縮バージョンである。本発明の実施例で用いたFcフラグメント部分は、ヒト抗体IgG1, IgG2, IgG3,またはIgG4のFcフラグメント、またはその変異体、好ましくはヒトIgG1のFcフラグメント、より好ましくは配列番号9である。

0079

本発明において、IL-15Rαまたはその誘導体は、リンカーペプチドを介してFcフラグメントまたはFc変異体に融合して可溶性融合タンパク(II)を形成するが、各タンパク質成分の結合の順序は限定されない。リンカーペプチドは、一般に技術分野で用いられるソフトリンカーでもよい。好ましくは(GGGGS)nであり、ここでnは1~10、好ましくは1~5、もっとも好ましくは2である。IL-15のIL-15Rαへの結合に加えて、可溶性融合タンパク(II)および可溶性融合タンパク(I)は、また、システイン変異部位の対形成で生成したジスルフィド結合を介して結合することができる。分子の安定性は、後者により増加する。

0080

関連するタンパク質配列は、次の通りである:
IL-15 (配列番号1):(ヒトインターロイキン15アミノ酸配列、また対照IL-15配列)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

0081

IL-15(L52C) (配列番号2):(52位に変異L52Cを持つヒトインターロイキン15アミノ酸配列)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISCESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

0082

IL-15Rα-ECD (配列番号3):(ヒトインターロイキン15レセプターαの細胞外ドメインのアミノ酸配列)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT

0083

IL-15Rα-sushi+ (配列番号4):(73のアミノ酸を含有するヒトインターロイキン15レセプターフラグメントの切断型)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQR

0084

IL-15Rα-ECD (S40C)-Fc (配列番号5):(S40C変異部位を含む、Fcに融合したIL-15Rα細胞外ドメインの融合ポリペプチド)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

0085

Fc-IL-15Rα-ECD (S40C) (配列番号6):(S40C変異を含む、IL15Rα細胞外領域に融合したFcの融合ポリペプチド)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT

0086

IL-15Rα-Sushi+(S40C)-Fc (配列番号7):(リンカーを介してFcに融合したsushiドメインを含むヒトインターロイキン15レセプターαの切断型、ここでsushi+はS40C変異を含み、sushi+はN-末端に位置している)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

0087

Fc-IL-15Rα-sushi+(S40C)(配列番号8): (リンカーを介してFcに融合したsushiドメインを含むヒトインターロイキン15レセプターの切断型、ここでsushi+はS40C変異を含み、sushi+はC-末端に位置している)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQR

0088

Fcフラグメント,IgG1-Fc (タンパク質) (配列番号9)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

0089

実験において、試験分子は、次のように番号を付けた:タンパク複合体1,2,3、および4、ここで、タンパク複合体1は配列番号2と配列番号5の同時発現により得た。タンパク複合体2は配列番号2と配列番号6の同時発現により得た。タンパク複合体3は配列番号2と配列番号7の同時発現により得た。タンパク複合体4は配列番号2と配列番号8の同時発現により得た。模式図を図7に示した。複合体分子の安定性は、システイン変異部位の対形成によりジスルフィド結合の生成を増やすことにより増加した。
タンパク複合体のリストは、次の通りである:

0090

IL-15タンパク複合体の取得
1.タンパク質の発現
IL-15/IL-15Rαタンパク質を、FreeStyle 293細胞(GIBCO, Cat#R79007)を用いることにより一時的にトランスフェクトして発現させた。FreeStyle 293細胞は、1%の最終濃度でΜltra LowIgGウシ胎児血清(μltra low immunoglobμlins FBS, GIBCO, Cat # 16250078)を補充したFreeStyle 293発現培地(GIBCO, Cat#12338018)中で浮遊培養した。IL-15/IL-15Rα発現プラスミドおよびトランスフェクション試薬PEI(Polysciences, Cat#239662)を準備し、IL-15とIL-15Rαの2つのプラスミドを1:1~9:1の範囲の比率で、プラスミドの全量は100ug/100ml細胞、プラスミドのPEIに対する比率は質量で1:2 で同時導入した。トランスフェクションの日の細胞密度は1×106/mlであった。1LのFreeStyle 293細胞を調製してトランスフェクトした。50mlのOpti-MEM(GIBCO, Cat # 11058021)培地をプラスミドと混合し、5分間静置して、ろ過した。更に50mlのOpti-MEM培地をPEIと混合し、5分間静置して、ろ過した。プラスミドは、PEIと混合して、15分間静置した。プラスミドとPEIの混合物をゆっくりと細胞に加え、振とう培養器中、130rpm、37°C、8% CO2で培養した。5日後、上清はタンパク質精製のために遠心分離収集した。

0091

2.タンパク質の精製
IL-15融合タンパクのアフィニティークロマトグラフィー
上清は、高速遠心分離後に細胞培養液から収集し、GE のProtein Aカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーに付した。クロマトグラフィーで用いた平衡化バッファーは1×PBS(pH7.4)であった。細胞上清をロードして結合させた後、PBSでUVがベースラインに戻るまで洗浄し、次いで目的タンパク質溶出バッファー酸性度、pH2.5-5)で溶出した。pHをTrisで中性に調整して、目的タンパク質を保存した。

0092

IL-15融合タンパクのイオン交換クロマトグラフィー
アフィニティークロマトグラフィーで得られた生成物のpHを、pIよりも1-2 pH単位低く又は高くなるように調節した。次いで、サンプルは適切に希釈して、サンプルの伝導率を5ms/cm以下にコントロールした。対応するpH条件下でNaCl-グラジエント溶出を、カチオン交換またはアニオン交換などの技術分野で慣用のイオン交換カラムクロマトグラフィー法を用いることにより、リン酸緩衝液酢酸緩衝液等のpHに対応する適切な緩衝液を用いて行った。異なる吸収ピークに対応する目的タンパク質をSDS-PAGEを用いて集め、保存した。

実施例

0093

IL-15融合タンパクのサイズ排除クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーで得られた生成物を限外ろ過濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーにロードして、目的の生成物を高純度で得るために、GE Superdex200 gelなどを用いて可能性のあるポリマーや他の成分を除去した。得られたタンパク質の純度はSDS-PAGEとSEC-HPLCにより検出できる。タンパク質の濃度は、UV分光光度法により測定した。

0094

in vitro PBMC増殖アッセイ
新鮮なPBMC(ヒト末梢血単核球、Shanghai Blood Center)を10%FBSを含むRPMI1640培地(Thermo Fisher Chemical Products Co., Ltd (Beijing), Cat No. SH30809.01B)中で培養し、遠心分離して、5×105細胞/mlの細胞密度に再懸濁した。90μlを96穴プレートの各ウェルに添加した。サンプルは、PBSで異なる濃度に一定の倍数で希釈した。10μlを96穴プレートの各ウェルに加えて、37°C、5% CO2で48時間インキュベーター中で培養した。その後、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay kitでの細胞増殖の検出のために50μlを採取した。

0095

表5はin vitro PBMC増殖アッセイにおける本発明のタンパク複合体1および3対コントロールIL-15の活性の検出結果を示し、本出願のタンパク複合体1および3が、コントロールIL-15に比べてPBMCの増殖活性を著しく改善したことを示している。この試験において、タンパク複合体1によって刺激された活性は約5倍増加したが、タンパク複合体3によって刺激された活性は約66倍改善された。

0096

in vitro Mo7e細胞増殖アッセイ
1.主要材料
Mo7e(ヒト巨核球白血病細胞株)は、Peking Union Medical Collegeから購入した;
IL-15はNovoprotein, Cat No. C016から購入し、IL-15類縁体は自社製造で得た;
細胞計数Kit-8 (CCK-8)は、WST, Cat No. EX660から購入した;
GM-CSFは、NOVOProtein, Cat No. CC79から購入した。

0097

2.方法
1)Mo7eを改良RPMI-1640培地(2.05mM L-グルタミン, 10% FBSおよび15ng/mlGM-CSF含有)中、37°C (5% CO2)でインキュベーター中で培養した;
2)良い状態のMo7e細胞を室温、150 × gで5分間遠心分離した。上清は廃棄した;
3)細胞ペレットはGM-CSFフリー培地で2回洗浄し、次いで計数した;
4)細胞濃度を調整し、細胞数2×104 /ウェルおよび容量90μl (GM-CSF-free)で96穴プレートに蒔き、培養用細胞インキュベーター中に置いた;
5)IL-15とその類縁体は、PBSで4倍希釈し、10μl/ウェルを、96穴プレートでの細胞インキュベーション2時間後、細胞培養系に添加した。各濃度は3重に繰り返し、ブランクウェル(PBSのみ添加)はコントロールとして用いた;
6)細胞プレートはインキュベーター中で3日間培養した;
7)全ての試験ウェルに10μlのCCK-8を加え、インキュベーター中で3時間培養した;
8)450nm (OD450)での吸光度を測定した。

0098

表6はin vitro Mo7e細胞増殖アッセイにおけるタンパク複合体1-4のコントロールIL-15に対する比較を示し、タンパク複合体1-4はコントロールIL-15に比べて増殖活性が著しく改善されており、複合体3と4により刺激された増殖活性はタンパク複合体1と2により刺激されたものより著しく高かったことを示している。

0099

マウス肺転移モデル
1.動物試験方法
32匹のC57BL/6マウス(SPF, Shanghai Super B&K Laboratory Animal Corp. Ltd.)を、4群、各群8マウスに分けた。1.5×105のB16F10細胞を尾静脈経由でマウスに静脈内注射した(Cell Resource Center, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, TCM36)。PBS、2μgのIL-15および5μgまたは15μgのタンパク複合体3を1日目にマウスに腹腔内注射した。2-3日毎に1回、体重を量り、14日目に各群から1匹のマウスを殺し、肺転移を観察した。全てのマウスは、16日目に屠殺した。全てのマウスの肺を取り出し、重量を量って、黒色の肺の塊を観察して、写真を撮り、次いで肺をホルマリンで固定して、黒色の塊の数をカウントした。

0100

2.結果
PBS群におけるマウスの肺は、多数の転移性黒色腫成長していることを示した(73±43)。IL-15群の肺は、多数の黒色腫の塊(65±29)、PBS群の約 90%を示した。タンパク複合体3 - 5μg群の肺は、黒色腫の塊の部分的な転移(30±16)、PBS群の約41%を示した。タンパク複合体3 -15μg群の肺は、黒色腫の塊の部分的な転移(24±13)、PBS群の約33%を示した。
B16F10マウスモデルにおいて、タンパク複合体3の効力は、図8に見られるように、IL-15のものより著しく優れていた。
PBS群における相対的肺重量は、図9に見られるように、タンパク複合体3群のものより著しく高かった。
投与中に各群で体重の著しい減少は観察されなかったが、図10に見られるように、投与量が著しい毒性を持たないことを示唆している。
他の投与群を用いた他のB16F10マウスモデル試験において、タンパク複合体3の投与量を0.5ug/マウスに減らした時、我々は、著しい抗腫瘍活性を観察したが、一方で最大耐用量が30ug/マウスのとき、明らかな異常症状は観察されなかった。
要約すると、タンパク複合体3は、マウスの肺におけるB16F10細胞の転移を阻害することができ、用量依存性の効果を有していて、良い安全窓を有している。

0101

マウス皮下腫瘍モデル
1.動物試験方法
1.1マウスは、5日間実験室の環境に順化させた。
1.2腫瘍細胞の移植
C57BL/6マウス(SPF, Shanghai Xi Puer Bei Kai Experimental Animal Co., Ltd.)は、B16F10細胞(5×106/マウス)を用いて右肋骨の皮下に接種した。腫瘍は7日間成長させた。腫瘍の容積が160±40 mm3になった時、動物を4群、各群7マウスにランダムに分けた(d0)。
1.3投与量と方法
各群に第1日と第5日に1回、計2回、PBS、またはIL-15(2μg)、またはタンパク複合体3(5μg)、またはタンパク複合体3(15μg)を用いて試験薬物腹腔内に注射した。マウスは2日毎に腫瘍容積と体重を測定し、データを記録した。
1.4統計
Excel統計ソフトウェア平均値はavgとして計算する;SDはSTDEVとして計算する;SEMはSTDEV/SQRTとして計算する;異なる群間P値はTTESTとして計算する。
腫瘍容積(V)は、V=1/2×Llength×Lshort2:として計算する。
相対的容積(RTV)=VT/V0
腫瘍阻害率(%)= (CRTV-TRTV)/CRTV (%)
V0およびVTは、それぞれ試験の始めと試験の終わりの腫瘍容積を表す。CRTVおよびTRTVは、それぞれブランクコントロール群(PBS)および試験の終わりでの試験群の相対的腫瘍容積を表す。

0102

2.結果
移植したB16F10細胞腫瘍は非常に急速に成長したため、試験は9日目にストップした。B16F10腫瘍に対するIL-15タンパク質の成長阻害効果は、表1に示した。それぞれ1日目と5日目の1回投与の後、IL-15は9日目に移植したB16F10細胞腫瘍の成長を阻害しなかった。しかしながら、タンパク複合体3-5μg群およびタンパク複合体3-15μg群における阻害率は、それぞれ30%および73%であり、タンパク複合体3-15μg群は腫瘍の成長を著しく阻害することができた。

0103

結論として、タンパク複合体3は、本研究におけるB16F10異種移植片の成長阻害に効果を有し、明らかな用量依存性効果を有している。表7参照。



**: p<0.01、対PBS

0104

タンパク複合体の代謝半減期の測定
1.動物試験方法
SDラット(n=2、Sipur-Bikai Experimental Animal Co., Ltd.により供給)に、終夜絶食後、投与量188μg/kgおよび容量5mlで腹腔内注射により投与した。0.2ml血液サンプルを、ラットの後眼窩神経叢を通じて投与前および投与後、0.5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 11h, 24h, 48h, 72hおよび96hに採取した。血液サンプルはチューブに集めて、30分間 4°Cでチューブに保ち、次いで10分間3500 rpmで遠心分離して、血清を単離した。-80oCで保存した。ラットは、投与2時間後にを与えた。

0105

2.結果
ラット血清におけるタンパク複合体3は、抗IL-15抗体でコーティングしたELISAプレート捕捉した。抗ヒトIgGFc抗体を濃度曲線を検出するために用いた。ラットにおけるタンパク複合体3の測定したin vivo半減期は、約13.7hであった(図10)。IL-15のin vivo半減期は、1hより少ないことが報告されており(J Immunol 2006; 177:6072-6080)、これはタンパク複合体3が著しく延長したin vivo半減期を有することを示している。

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