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課題

TRPA1を活性化し、腸閉塞便秘の予防又は改善に有用なTRPA1活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤を提供する。

解決手段

ロズマリン酸ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPA1活性化剤。

概要

背景

TRPA1(Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1)は、一過性受容器電位(TRP)イオンチャネルスーパーファミリーに属する非選択性陽イオンチャネルであり、侵害受容ニューロンにおいて低温受容器(17℃)として見出された(非特許文献1)。その後、TRPA1は、マスタードオイルやそれに含まれるアリルイソチオシアネートAITC)、シナモンガーリックメチルサリチレートオイゲノールアルコール類等に反応する化学受容体であること、更には低温と機械刺激化学刺激応答する痛み受容体であることが報告されている(非特許文献2、3、4及び5)。

腸閉塞は、イレウス(ileus)とも呼ばれ、腸管内容の肛門側への移動が障害される病態を指す。腸管が閉塞すると、閉塞部位の口側はガス腸液により拡張し、静脈還流が障害される。その結果、腸管壁が浮腫を起こし、腸管腔へ水やナトリウム漏出し、さらに腸管内圧が上昇し、動脈血流の障害も起こり、腸管の壊死穿孔を引き起こす。症状としては、腸管の運動消失すなわち麻痺することで、腹部膨満感や悪心嘔吐腹痛排便排ガス途絶などが起こる。
腸閉塞を有する患者は、口から食物も薬物も摂取することはできず、静脈から水分を与えられ、鼻腔吸引チューブを用いて胃の減圧術が与えられる。斯かる治療法不快感、不便さから、より負担の少ない方法が必要とされている。

TRPA1は、腸クロム親和性細胞(enterochromaffin cells)において、豊富発現していることが知られているが、最近、術後イレウス(POI)に有用であるとされている大建中湯が、小腸上皮細胞におけるTRPA1の刺激を介して腸の血流を増加させることが報告されている。そして、POIモデルマウスにおいて、TRPA1のアゴニストであるAITC等が小腸通過を改善すること、TRPA1欠損マウスにおいては、小腸における周期的な蠕動運動が抑制されることが見出され、TRPA1刺激は、胃腸運動障害を改善することに対して有用であることが示唆されている(非特許文献6)。
したがって、TRPA1を活性化することにより、腸閉塞を予防又は改善することが期待される。

便秘便秘症)は、下部消化管に生じる自律神経機能障害、腸管における水分の過吸収、腸粘液分泌低下、運動障害、消化器心身症(例えば過敏性腸症候群)、排便反射機能の低下等によって、排出が困難または稀な状態をいい、狭窄腫瘤等の物理的な通過障害に起因する器質性便秘と、腸管運動機能や直腸肛門部排出機能低下等に起因する機能性便秘分類される。
ロペラミド投与した痙攣性便秘モデルマウス、及びクロニジンを投与した弛緩性便秘モデルマウスに対して、TRPA1のアゴニストであるASP7663を経口投与すると、結腸運動性が向上した。この現象は、TRPA1のアンタゴニストであるHC−030031を先に経口投与することで消失することから、TRPA1刺激は、痙攣性便秘及び弛緩性便秘に対して有用であることが示唆されている(非特許文献7)。
したがって、TRPA1を活性化することにより、便秘を予防又は改善することが期待される。

シソ科植物に多く含有されているタンニン一種であるロズマリン酸は、筋萎縮性側索硬化症ALS)の発症や進行を抑制する作用があること(特許文献1)、インスリン分泌促進作用があること(特許文献2)、花粉症改善作用があること(非特許文献8)等が報告されている。
また、ロズマリン酸の代謝産物としてヒト尿中に排出されるジメチルロズマリン酸は、シクロオキシゲナーゼ2の誘導抑制活性を有し、抗炎症作用があることが報告されている(特許文献3)。
しかし、ロズマリン酸やジメチルロズマリン酸がTRPA1を活性化することや、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用であることは全く知られていない。

概要

TRPA1を活性化し、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用なTRPA1活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤を提供する。ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPA1活性化剤。なし

目的

本発明は、TRPA1を活性化し、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用なTRPA1活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

ロズマリン酸ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPA1活性化剤

請求項2

ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善剤

請求項3

ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善剤。

請求項4

ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPA1活性化用食品

請求項5

ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善用食品

請求項6

ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善用食品。

技術分野

0001

本発明は、TRPA1活性化剤腸閉塞の予防又は改善剤便秘の予防又は改善剤に関する。

背景技術

0002

TRPA1(Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1)は、一過性受容器電位(TRP)イオンチャネルスーパーファミリーに属する非選択性陽イオンチャネルであり、侵害受容ニューロンにおいて低温受容器(17℃)として見出された(非特許文献1)。その後、TRPA1は、マスタードオイルやそれに含まれるアリルイソチオシアネートAITC)、シナモンガーリックメチルサリチレートオイゲノールアルコール類等に反応する化学受容体であること、更には低温と機械刺激化学刺激応答する痛み受容体であることが報告されている(非特許文献2、3、4及び5)。

0003

腸閉塞は、イレウス(ileus)とも呼ばれ、腸管内容の肛門側への移動が障害される病態を指す。腸管が閉塞すると、閉塞部位の口側はガス腸液により拡張し、静脈還流が障害される。その結果、腸管壁が浮腫を起こし、腸管腔へ水やナトリウム漏出し、さらに腸管内圧が上昇し、動脈血流の障害も起こり、腸管の壊死穿孔を引き起こす。症状としては、腸管の運動消失すなわち麻痺することで、腹部膨満感や悪心嘔吐腹痛排便排ガス途絶などが起こる。
腸閉塞を有する患者は、口から食物も薬物も摂取することはできず、静脈から水分を与えられ、鼻腔吸引チューブを用いて胃の減圧術が与えられる。斯かる治療法不快感、不便さから、より負担の少ない方法が必要とされている。

0004

TRPA1は、腸クロム親和性細胞(enterochromaffin cells)において、豊富発現していることが知られているが、最近、術後イレウス(POI)に有用であるとされている大建中湯が、小腸上皮細胞におけるTRPA1の刺激を介して腸の血流を増加させることが報告されている。そして、POIモデルマウスにおいて、TRPA1のアゴニストであるAITC等が小腸通過を改善すること、TRPA1欠損マウスにおいては、小腸における周期的な蠕動運動が抑制されることが見出され、TRPA1刺激は、胃腸運動障害を改善することに対して有用であることが示唆されている(非特許文献6)。
したがって、TRPA1を活性化することにより、腸閉塞を予防又は改善することが期待される。

0005

便秘(便秘症)は、下部消化管に生じる自律神経機能障害、腸管における水分の過吸収、腸粘液分泌低下、運動障害、消化器心身症(例えば過敏性腸症候群)、排便反射機能の低下等によって、排出が困難または稀な状態をいい、狭窄腫瘤等の物理的な通過障害に起因する器質性便秘と、腸管運動機能や直腸肛門部排出機能低下等に起因する機能性便秘分類される。
ロペラミド投与した痙攣性便秘モデルマウス、及びクロニジンを投与した弛緩性便秘モデルマウスに対して、TRPA1のアゴニストであるASP7663を経口投与すると、結腸運動性が向上した。この現象は、TRPA1のアンタゴニストであるHC−030031を先に経口投与することで消失することから、TRPA1刺激は、痙攣性便秘及び弛緩性便秘に対して有用であることが示唆されている(非特許文献7)。
したがって、TRPA1を活性化することにより、便秘を予防又は改善することが期待される。

0006

シソ科植物に多く含有されているタンニン一種であるロズマリン酸は、筋萎縮性側索硬化症ALS)の発症や進行を抑制する作用があること(特許文献1)、インスリン分泌促進作用があること(特許文献2)、花粉症改善作用があること(非特許文献8)等が報告されている。
また、ロズマリン酸の代謝産物としてヒト尿中に排出されるジメチルロズマリン酸は、シクロオキシゲナーゼ2の誘導抑制活性を有し、抗炎症作用があることが報告されている(特許文献3)。
しかし、ロズマリン酸やジメチルロズマリン酸がTRPA1を活性化することや、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用であることは全く知られていない。

0007

特開2009−256282号公報
特開2005−139136号公報
特開2005−272362号公報

先行技術

0008

Story et al. 2003, Cell 112, 819-829
Kwan et al. 2006, Neuron 50, 277-289
日本薬理学雑誌、第124巻、第219頁−第227頁、2004年、社団法人 日本薬理学会発行
Fijita et al. 2010, IFSCC Congress 2010
Komatsu et al. 2012, Eur J Physio 463, 549-559
K. Tsuchiya et al. Neurogastroenterology & Motility (2016)DOI: 10.1111/nmo.12877
Kojima et al. 2014, European Journal of Pharmacology 723, 288-293
Osakabeet al., Biofactors. 2004 21,127-31

発明が解決しようとする課題

0009

本発明は、TRPA1を活性化し、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用なTRPA1活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤を提供することに関する。

課題を解決するための手段

0010

本発明者等は、TRPA1を活性化する素材について鋭意検討を行った結果、ロズマリン酸のヒト代謝産物であるジメチルロズマリン酸が、TRPA1を活性化する作用を有し、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用であることを見出した。

0011

すなわち、本発明は、以下の1)〜6)に係るものである。
1)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPA1活性化剤。
2)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善剤。
3)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善剤。
4)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPA1活性化用食品
5)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善用食品
6)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善用食品。

発明の効果

0012

本発明のTRPA1活性化剤は、TRPA1を効果的に活性化することができ、TRPA1チャネルの活性が低下することによって生じる疾患、例えば腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用である。

0013

本発明において「TRPA1」とは、「Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1」を意味する。TRPA1は、ヒトにおいてTRPA1遺伝子によってコードされているタンパク質である。

0014

本発明の「ロズマリン酸」はシソ科植物に多く含有されているタンニンの一種であり、下記式(A)で示される。本発明の「ジメチルロズマリン酸」は、当該ロズマリン酸のヒト代謝産物であり(前記特許文献3)、下記式(B)で示される、3,3’−ジメチルロズマリン酸を意味する。

0015

0016

本発明において、ロズマリン酸は、市販品であってもよいし、常法に基づき化学合成すること(SYNTHESIS, 755-762 (1996)、Can. J. Chem., 75, 1783-1794 (1997))、或いはロズマリン酸を含有するシソ科植物等の植物体又は培養細胞から抽出・精製することにより取得することができる(特開昭62−32889号公報)。
ジメチルロズマリン酸は、後記製造例に示すとおり、例えば下記の反応スキームに従って合成することができる。

0017

0018

本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸には、光学異性体が存在する。本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸は、これらのいずれかの光学異性体であっても、光学異性体の混合物であってもよい。本発明ではR体又は光学異性体混合物が好ましい。

0019

本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸は、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物とすることができる。このような塩の好ましい例としては、ナトリウム塩カリウム塩カルシウム塩のようなアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、あるいは酸付加塩などが挙げられる。溶媒和物の好ましい例としては、水和物、アルコール和物あるいはアセトン和物などが挙げられる。

0020

後記実施例で示すように、ロズマリン酸の代謝産物であるジメチルロズマリン酸は、TRPA1を活性化する。すなわち、TRPA1遺伝子導入により、TRPA1が機能的に発現している形質転換細胞(TRPA1発現細胞)とジメチルロズマリン酸とを接触させた場合、細胞内の陽イオン量の流入を増大するという、TRPA1を活性化する作用を有する。
したがって、ジメチルロズマリン酸、その前駆体であるロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物(以下、「本発明の化合物」とも称する)は、TRPA1活性化剤となり、TRPA1活性化のため、或いはTRPA1活性化剤を製造するために使用できる。

0021

前述のとおり、術後イレウスのモデルマウスにおいて、TRPA1のアゴニストが小腸通過を改善し、TRPA1欠損マウスにおいては、小腸における周期的な蠕動運動が抑制されることから、TRPA1刺激は、胃腸の運動障害を改善することに対して有用であると考えられている(前記非特許文献6)。
また、ロペラミドを投与した痙攣性便秘モデルマウス、及びクロニジンを投与した弛緩性便秘モデルマウスに対して、TRPA1のアゴニストであるASP7663を経口投与すると、結腸の運動性が向上した。この現象は、TRPA1のアンタゴニストであるHC−030031を先に経口投与することで消失することから、TRPA1刺激は、痙攣性便秘及び弛緩性便秘に対して有用であると考えられている(前記非特許文献7)。
したがって、TRPA1活性化剤は、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤として、腸閉塞や便秘の予防又は改善のために使用することができると考えられる。

0022

本発明において、「TRPA1の活性化」とは、受容体であるTRPA1を活性化することを指す。具体的には、TRPA1が本来的に有する作用、例えばイオン流束の調節能(例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオンナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など)、膜電位の調節能(例えば、電流発生能など)を活性化することを意味する。

0023

本発明において、「腸閉塞」とは、腸管内容の肛門側への移動が障害される病態を指す。腸閉塞は、腸がじれたり、腸管内部に腫瘍などができたりして塞がれてしまう機械性腸閉塞と、神経の異常や炎症などの影響で腸の蠕動運動がなくなり、内容物が腸内に停滞する機能性腸閉塞に分類されるが、本発明においてはその何れでも良い。
本発明において、「便秘」とは、便の排出が困難または稀な状態をいい、狭窄や腫瘤等の物理的な通過障害に起因する器質性便秘と、腸管運動機能や直腸肛門部の排出機能低下等に起因する機能性便秘に分類されるが、本発明においてはその何れでも良い。

0024

本発明において、TRPA1活性化のため、腸閉塞や便秘の予防又は改善のための「使用」は、ヒトを含む動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。

0025

なお、本明細書において「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。また、「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。

0026

本発明のTRPA1活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤は、ヒトを含む動物に摂取又は投与した場合に、TRPA1活性化効果、腸閉塞の予防又は改善効果、便秘の予防又は改善効果を発揮する医薬品、医薬部外品サプリメント又は食品となり、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤となり得る。
また、本発明の食品には、一般飲食品のほか、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。

0027

本発明の化合物を含む上記医薬品(医薬部外品を含む)は、任意の投与形態で投与され得るが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体医薬用無毒性担体と混合して、慣用医薬品製剤の形態で投与することができる。

0028

このような製剤としては、例えば、錠剤顆粒剤散剤カプセル剤等の固形剤溶液剤、懸濁剤乳剤等の液剤凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。また、必要に応じて、安定化剤湿潤剤乳化剤結合剤等張化剤賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。

0029

また、本発明の化合物を配合した上記食品の形態は、清涼飲料水茶系飲料コーヒー飲料果汁飲料炭酸飲料ゼリーウエハースビスケットパン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態(錠剤、カプセル剤、トローチ剤等の固形製剤)の栄養補給用組成物が挙げられる。なかでも、錠剤が好ましく、チュアブル錠がより好ましい。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の化合物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤酸化防止剤保湿剤増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。

0030

上記の医薬品(医薬部外品を含む)や食品中の本発明の化合物の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.1質量%以上、更に好ましくは1質量%以上であり、また、好ましくは95質量%以下、より好ましくは90質量%以下、更に好ましくは70質量%以下である。また、好ましくは0.01〜95質量%、より好ましくは0.1〜90質量%、更に好ましくは1〜70質量%である。

0031

本発明の化合物を医薬品や食品として、或いは医薬品や食品に配合して使用する場合のヒトへの投与量は、対象者の状態、体重、性別年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人1人当たりの1日の投与量は、通常、ジメチルロズマリン酸又はロズマリン酸として、好ましくは0.01mg以上、より好ましくは1mg以上、更に好ましくは100mg以上であり、また、好ましくは80000mg以下、より好ましくは15000mg以下、更に好ましくは5000mg以下である。また、好ましくは0.01〜80000mg、より好ましくは1〜15000mg、更に好ましくは100〜5000mgである。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、1日1回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。

0032

投与又は摂取対象としては、TRPA1の活性化、腸閉塞又は便秘の予防又は改善を必要とする若しくは希望するヒトを含む動物であれば特に限定されないが、腸管の運動が消失すなわち麻痺することで、腹部膨満感や悪心、嘔吐、腹痛、排便・排ガスの途絶などの症状を有するヒト、便秘症のヒトへの投与又は摂取が有効である。

0033

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
<1>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPA1活性化剤。
<2>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善剤。
<3>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善剤。
<4>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPA1活性化用食品。
<5>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善用食品。
<6>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善用食品。

0034

<7>TRPA1活性化剤を製造するためのロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。
<8>腸閉塞の予防又は改善剤を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。
<9>便秘の予防又は改善剤を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。
<10>TRPA1活性化用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。
<11>腸閉塞の予防又は改善用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。
<12>便秘の予防又は改善用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。

0035

<13>TRPA1活性化に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上。
<14>腸閉塞の予防又は改善に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上。
<15>便秘の予防又は改善に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上。

0036

<16>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するTRPA1活性化方法
<17>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する腸閉塞の予防又は改善方法
<18>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する便秘の予防又は改善方法。

0037

<19><1>及び<7>のTRPA1活性化剤、<2>及び<8>の腸閉塞の予防又は改善剤、<3>及び<9>の便秘の予防又は改善剤、<4>及び<10>のTRPA1活性化用食品、<5>及び<11>の腸閉塞の予防又は改善用食品、<6>及び<12>の便秘の予防又は改善用食品における、前記有効成分の含有量は、総量中好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.1質量%以上、更に好ましくは1質量%以上であり、また、好ましくは95質量%以下、より好ましくは90質量%以下、更に好ましくは70質量%以下である。また、好ましくは0.01〜95質量%、より好ましくは0.1〜90質量%、更に好ましくは1〜70質量%である。

0038

<20><16>〜<18>において、成人1人当たりの1日の投与量は、ロズマリン酸又はジメチルロズマリン酸として、好ましくは0.01mg以上、より好ましくは1mg以上、更に好ましくは100mg以上であり、また、好ましくは80000mg以下、より好ましくは15000mg以下、更に好ましくは5000mg以下である。また、好ましくは0.01〜80000mg、より好ましくは1〜15000mg、更に好ましくは100〜5000mgである。

0039

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
製造例ジメチルロズマリン酸の合成
(1)試薬
3−(3−メトキシ−4−ヒドロキシフェニル乳酸ナトリウム(1)(ラセミ混合物)は東京化成より、フェルラ酸(3)は和光純薬工業より、それぞれ購入して使用した。

0040

(2)α−ヒドロキシ−3−メトキシ−4−(2−プロピレニロキシベンゼンプロパン酸2−プロピレニルエステル(2)の合成

0041

0042

3−(3−メトキシ−4−ヒドロキシフェニル)乳酸ナトリウム(1)(500mg、2.14mmol)および炭酸カリウム(885mg、6.41mmol)を50mLナスフラスコにとり、アルゴン置換した後、超脱水アセトン7.1mLを加え、分散させた。その後、臭化アリル(2.77mL、32.0mmol)を加え、N2置換後reflux条件下に20時間撹拌した。
反応終了後、ろ過、ろ過残渣を塩化メチレン(25mL)で洗浄し、ろ液洗浄液を併せ、減圧濃縮を行った。これに塩化メチレン 20mLとH2O 20mLを加え、分層後、塩化メチレン層回収した。水層は、さらに塩化メチレン 5mLで3回抽出し、回収した。回収した塩化メチレン層を併せて、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した(988.2mg)。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物(2)の精製品513mg(無色、油状、収率82%)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。

0043

<シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件>
カラム: Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム:INJECT COLUMN S [YAMAZEN]
溶離液ヘキサン/酢酸エチル= 95 / 5 (4min) 95 / 5 (11min) 74 / 26 (14min) 74 / 26
流速:20mL / min、分取時間:29min、分取容量:12mL / 本、48本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.(fr.43-53)を減圧濃縮、乾燥。

0044

(3)3−メトキシ−4−(2−プロピレニロキシ)フェニル—2−プロピレン酸(4)の合成

0045

0046

フェルラ酸(3)(500mg、2.58mmol)に、超脱水エタノール17mLを加え、溶解させた。その後、臭化アリル(267μL、3.09mmol)および炭酸カリウム(427mg、3.09mmol)を順次加え、N2置換後reflux条件下に5.5時間撹拌した。TLCにより反応進行を確認しつつ、室温まで放冷し、水酸化カリウム(434mg、7.74mmol)を加え、さらに16時間撹拌した。
反応終了後、減圧濃縮し、再度H2O 25mLに溶解後、2N塩酸および濃塩酸を添加して、pH=0とした。これを酢酸エチル(25mL)で5回抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、減圧濃縮した(687.5mg)。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物(4)の精製品221.4mg(無色、油状、収率37%)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。

0047

<シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件>
カラム: Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム:INJECT COLUMN M [YAMAZEN]
溶離液:
1%酢酸inヘキサン/ 1%酢酸 in酢酸エチル= 100 / 0 (4min) 100 / 0 (11min) 84 / 16 (24min) 84 / 16 (0min) 80 / 20 (7min) 80 / 20
流速:20mL / min、分取時間:46min、分取容量:12mL / 本、77本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.(fr.48-75)を減圧濃縮、乾燥。

0048

(4)α−[[3−[3−メトキシ−4−(2−プロピレニロキシ)フェニル]−1−オキソ−2−プロピレニル]オキシ]-3−メトキシ−4−(2−プロピレニロキシ)ベンゼンプロパン酸2−プロピレニルエステル(5)の合成

0049

0050

化合物(2)(100mg、0.34mmol)に、塩化メチレン1.7mLを加え、溶解させた。その後、化合物(4)(104mg、0.44mmol)およびジメチルアミノピリジン(6.3mg、0.051mmol)を順次加え、−20℃に冷却した後、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(88.2mg、0.43mmol)を加えた。N2置換後室温で24時間撹拌した後、析出した尿素をろ過除去、酢酸エチル洗浄し、減圧濃縮した(288.5mg)。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物(5)の精製品151.8mg(白色、ワックス状)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。

0051

<シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件>
カラム: Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム:INJECT COLUMN S [YAMAZEN]
溶離液:
ヘキサン/酢酸エチル= 87 / 13 (4min) 87 / 13 (11min) 66 / 34 (14min) 66 / 34
流速:20mL / min、分取時間:29min、分取容量:12mL / 本、48本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.(fr.34-36)を減圧濃縮、乾燥。

0052

(5)3,3’−ジメチルロズマリン酸(B)の合成

0053

0054

化合物(5)(87.3mg、0.172mmol)をN2雰囲気下のグローブボックス中で50mLナスフラスコに採り、超脱水テトラヒドロフラン8.6mLおよびテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)錯体(Pd(PPh3)4)(19.8mg、17.2μmol)、モルホリン(450μL、5.15mmol)を順次加えた。反応混合物は、N2雰囲気下、室温で18時間撹拌した。
反応終了後、減圧濃縮した後、1N塩酸20mLで酸性化し、これを酢酸エチル(20mL)で3回抽出した。酢酸エチル層は併せて、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した(117.0mg)。これを、分取TLCにて精製し、標題化合物(B)の精製品61.4mg(白色、粉末状、収率92%)を得た。分取TLCの条件は、以下の通り。
なお以下の実施例では、合成したジメチルロズマリン酸をジメチルスルホキサイドDMSO)で適宜希釈して評価に供した。
<分取TLCの条件>
TLC:PLC Silica gel 60 F254 (1mm, 20x20cm, #1.13895.0001) [Merck]
展開溶媒クロロホルム/アセトン/ 88%ギ酸= 75 / 16.5 / 8.5 200mL
脱離液:クロロホルム / アセトン / 88%ギ酸 = 75 / 16.5 / 8.5 15mL

0055

0056

実施例1 TRPA1活性化作用の評価
(1)ヒトTRPA1遺伝子発現ベクターの作製
ヒト十二指腸由来細胞株(Hutu−80細胞、American Type Culture Collectionより購入)から抽出したtotalRNAを逆転写して得られたcDNA鋳型にして、公開されているヒトTRPA1遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応PCR)を行った。

0057

<プライマーセット>
フォワードプライマー;5’-CACCATGAAGCGCAGCCTGAGGAAGATGTG-3’(配列番号1)
リバースプライマー;5’-GAGGAGCTAAGGCTCAAGATGGTGTG -3’ (配列番号2)
<PCR条件>
a)PCR溶液組成
cDNA(Template) 15μL
5x PrimeStar GXL Buffer 10μL
dNTPs mixture(2.5mM) 4μL
PrimeStar GXL DNA Polymerase(タカラバイオ) 1μL
Forward Primer(10μM) 1μL
Reverse Primer(10μM) 1μL
Water 18μL
b)温度とサイクル条件
95℃ 2min

98℃ 10sec 33 cycles
70℃ 2min

0058

得られたPCR産物をHigh PurePCRProduct Purification Kit(商品名、ロッシュ社製)用いて精製した。精製したPCR産物と、pcDNA3.1 Directional TOPO Expression Kit(商品名、インビトロジェン社製)を用いて、ヒトTRPA1遺伝子発現用ベクターを作製した。

0059

(2)ヒトTRPA1発現細胞の作製
10%牛胎児血清を含むDMEM/F12培地(インビトロジェン社製)を用いて、ヒト子宮頸癌由来細胞株(HeLa細胞、American Type Culture Collectionより購入)の培養を行った。HeLa細胞をT−75細胞培養用フラスコに5×105cells/Flaskで播種した。培養3日後、前記(1)で作製したヒトTRPA1遺伝子発現用ベクター(8μg)をTransIT−HeLaMONSTERTransfection Kit(Mirus社製)を用いて細胞にトランスフェクションし、1日培養した。
Detachin(Genlantis社製)で細胞をはがし、96well Optical bottom plate(Nunc社製)に10%牛胎児血清を含むDMEM/F12培地で1.5×104cells/90μL/wellの細胞密度で播き、さらに1日培養した。

0060

(3)細胞内カルシウムイオン流入活性の測定
細胞内カルシウムイオン流入活性の測定は、Calcium Kit II− fluo 4(商品名、DOJINDO)を用いて行った。Fluo4−AMを含有したLoading bufferを前記(2)で作製したヒトTRPA1発現細胞に90μL/well添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、37℃で蛍光プレートリーダーFDSS3000(商品名、浜松ホトクス社製)を用いて蛍光強度励起波長:488nm、蛍光波長:524nm)を2秒毎に測定した。測定開始30秒後に検体として前記製造例で調製したジメチルロズマリン酸溶液を測定キットの希釈bufferで希釈し、その希釈溶液を20μL/well添加し、300秒まで2秒毎に蛍光強度変化を測定した。また、TRPA1活性化の陽性対照として、TRPA1の作動薬であるAllyl isothiocyanate(AITC)を終濃度1μMで添加した。
検体のTRPA1活性は、検体溶液添加前の蛍光強度(F0)と、検体添加後の蛍光強度の極大値(Fmax)との比率として算出した。

0061

検体を添加した場合のカルシウムイオン流入率を、溶媒添加時と比較しDunnett’s testを用いて検定した。ジメチルロズマリン酸(MeRA)を添加した場合の結果を表2に示す。

0062

実施例

0063

表2より、陽性対照であるAITC(TRPA1の作動薬)と同様、ジメチルロズマリン酸はカルシウムイオン流入を有意に増加させた。
以上の結果から、ジメチルロズマリン酸を適用することにより、TRPA1活性が有意に活性化される。これは、ジメチルロズマリン酸が、TRPA1活性の活性化に有効であることを示している。さらに、TRPA1活性を活性化する作用を有するジメチルロズマリン酸は、腸閉塞又は便秘の予防又は改善に有効であることを示している。
なお、前述のとおり、ジメチルロズマリン酸は、ロズマリン酸の体内代謝産物であることから、前駆体であるロズマリン酸もTRPA1活性の活性化、腸閉塞又は便秘の予防又は改善に有効であると考えられる。

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