技術 酵素活性促進剤の製造方法及び酵素活性促進剤の含有物

0001

本発明は、所定の酵素に対して活性促進効果を有する酵素活性促進剤の製造方法及びその酵素活性促進剤の含有物に関する。

0002

小腸内で作用する消化酵素であるトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、リパーゼは、膵臓で生産されて膵液に分泌され、さらに膵液が小腸内に分泌されることにより、食物中のタンパク質や脂肪の消化に寄与している。

0003

これらの酵素は、活性部位に活性発現に必須のセリン残基を持つ加水分解酵素（ヒドロラーゼ）であり、セリン酵素と総称される一群の加水分解酵素に分類される（非特許文献１）。食物から摂取されたタンパク質は、胃でペプシンにより加水分解を受けて断片化され、小腸に送られる。これらの断片化タンパク質は、小腸でタンパク質加水分解酵素であるトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼにより加水分解され、低分子性ペプチドやアミノ酸が生成される。これら生成物は、小腸壁から吸収され、生命活動に利用される。上記のタンパク質加水分解酵素は、小腸でのタンパク質の消化・吸収、及び生命活動の維持に重要な役割を果たしている。

0004

これらの酵素は、よく研究されたものであり、構造と機能に関し詳細な知見が蓄積されている。これらの酵素は、タンパク質ポリペプチド鎖内部のペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼに分類される。これらの酵素は構造や反応機構において類似性が高く、分子質量約２５ｋＤａの単純タンパク質である。それぞれが加水分解するペプチド結合の化学的性質、すなわち基質特異性に差異が見られる。

0005

トリプシン（酵素番号ＥＣ３．４．２１．４）は、基質であるタンパク質のアミノ酸配列内部にある塩基性アミノ酸（リジンやアルギニン）残基のカルボニル側ペプチド結合を切断する。キモトリプシン（ＥＣ３．４．２１．１）は、タンパク質の芳香族性アミノ酸（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンなど）残基のカルボニル側ペプチド結合を切断する。また、エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３６）は電荷の無い非芳香族性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなど）残基のカルボニル側ペプチド結合を切断する。

0006

トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼは、高いアミノ酸配列（一次構造）の相同性を示し、その結果、立体構造（三次構造）も高い相同性を示す。キモトリプシンの基質結合部位には深い疎水性ポケットがあり、ここに基質の芳香族性アミノ酸の側鎖が結合する。トリプシンでは、この疎水性ポケットの底にアスパラギン酸残基が位置しており、このアスパラギン酸側鎖の負電荷と相互作用する形で、基質のリジンやアルギニンの側鎖の正電荷が結合する。エラスターゼでは、キモトリプシンで見られるような疎水性ポケット内部に突起が配置されており、これが障害となるため、芳香環は結合できず、むしろ比較的小さい疎水性鎖を持つアミノ酸側鎖が結合する。（非特許文献２−４）。エラスターゼは、生体内ではエラスチンの分解に関与しており、小腸内で作用する膵臓由来エラスターゼとは別に、白血球由来エラスターゼが良く知られており、両エラスターゼは相同性が高い。

0007

トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼは、ペプチド結合（アミド結合）を加水分解するプロテアーゼ（ペプチダーゼ）活性とは別に、脂肪酸エステルのエステル結合を加水分解するエステラーゼ活性や酸アミドを加水分解するアミダーゼ活性も有している。この性質を利用して、これらの酵素の酵素化学的解析や反応速度論的解析は、タンパク質基質の代わりに、加水分解に伴い特殊な分光学的変化や蛍光変化が現れるエステル性やアミド性の合成基質を用いて行うことが多い（非特許文献５）。

0008

リパーゼは、グリセロールエステルを加水分解して、脂肪酸を遊離するエステラーゼ活性を持つ加水分解酵素の総称である。リパーゼというとき、通常トリアシルグリセロールリパーゼ（酵素番号ＥＣ３．１．１３）を指すが、リポタンパク質リパーゼ、ホルモン感受性リパーゼなどのリパーゼを含めて、これらは高い構造類似性を持っている（非特許文献６）。

0009

また、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼとリパーゼは、タンパク質構造や反応機構において高い類似性を持っており、共通の祖先から進化したものとみなすことができる。これらは、触媒反応に最適なｐＨが７−８付近であり、また酵素の活性中心には酵素活性に必須な求核性のセリン残基を構成要件としており、その点でセリン酵素と呼ばれる。とくに、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼは、活性に必須のセリン残基を持つ一群のプロテアーゼ（セリンプロテアーゼ）の代表的な酵素である。さらに、これらの酵素の活性部位には、基本的に、活性セリン残基の求核性を強化するためのヒスチジン残基と遷移状態を安定化するためのアスパラギン酸残基が配置されており、これら３残基（セリン−ヒスチジン−アスパラギン酸残基）を触媒トライアドと呼んでいる（非特許文献７、８）。

0010

これらの酵素はそれぞれ、ヒトを含む哺乳動物間において高い相同性を示しており、ヒト酵素のモデル酵素として、あるいは代替酵素として、ウシやブタなどの酵素が広く研究され、利用されてきた（非特許文献５、９、１０）。キモトリプシンとエラスターゼは、トリプシンと高い類縁性にあり、トリプシン類縁酵素と考えてもよい。小腸内では、これらの酵素の基質特異性の違いにより、ほとんどすべてのペプチド結合が切断されることになる（非特許文献１１）。腸内細菌の酵素の支援も得て、タンパク質は低分子ペプチドやアミノ酸にまで分解され、小腸壁から吸収され血液中に取り込まれる。

0011

トリプシンは産業上有用な酵素としても知られており、医薬品や食品加工の分野で広く応用されている（非特許文献１２、１３）。例えば、トリプシンと抗生物質を併用した抗炎症、抗菌、各種創傷面に有効な医薬品としての製品情報が記載されている（非特許文献１４）。この創傷面の清浄化と同様の原理でトリプシンは、細胞培養時に接着細胞を培養容器から剥離する目的にも利用されている。また、各種の原料タンパク質を加工することによって得られる機能性食品、化粧品、医薬部外品などへの素材提供を目的としたペプチドの製造に、トリプシンを利用する方法が記述されている（特許文献１−３）。トリプシンは、基質加水分解におけるペプチド結合に対する高い選択性から、ペプチド断片化を行うための有用な道具として、生化学や生物工学の研究において多用されている（非特許文献２）。

0012

生体内には、血液凝固や血栓溶解、補体活性化、免疫反応、受精、がん転移などに作用することが知られている種々のセリンプロテアーゼがある。具体的には、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、アクロシン、マトリプターゼなどがあり、これらは基質特異性、反応機構、構造や化学的性質に高い類似性があるため、トリプシン様酵素あるいはトリプシン類縁酵素と呼ばれる（非特許文献２、６、９、１５）。
これらは、トリプシンと高い構造類似性を有するとともに、トリプシンに比較すると狭い基質選択性（高い基質特異性）を持つ。具体的に言うと、トリプシンは、ペプチド鎖にアルギニン（Ａｒｇ）残基やリジン（Ｌｙｓ）残基があれば、その前後に存在するアミノ酸配列に大きく影響されること無く、そのカルボニル基側のペプチド結合（Ａｒｇ−Ｘ、Ｌｙｓ−Ｘ）を加水分解する（ここでＸはタンパク質を構成するどんなアミノ酸残基でも良い、ただしプロリンはイミノ酸であり除外される）。しかし、上記のトリプシン類縁酵素は、アルギニン残基やリジン残基に加えて、これらのアミノ基側やカルボニル基側の複数残基の配列をも認識するのであり、トリプシンに比較して、アルギニン残基やリジン残基のカルボニル基側のペプチド結合を加水分解するための選択性が制限されている。

0013

トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼと類似の基質特異性を持つセリンプロテアーゼが、植物や微生物からも見出されている。とくに微生物由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンやズブチロペプチダーゼはキモトリプシンに類似の基質特異性を示し、タンパク質の限定加水分解や食品加工などにも応用されている（非特許文献１６）。

0014

リパーゼに関しても、膵臓由来のリパーゼに加えて、微生物由来のリパーゼが広く開発されており、これらは食品加工、とくに食品フレーバーの製造、脂肪酸の合成、油脂の改変、脂肪酸エステル合成などに応用されている（非特許文献８、１７）。

0015

トリプシン活性に負の影響を与える因子として、トリプシン阻害剤が知られている。代表的なものには、ウシ膵臓より単離されたアプロチニンや、大豆より単離されたクニッツ型トリプシン阻害剤及びボウマン−バーク型トリプシン阻害剤などがある。アプロチニンは急性膵炎などの治療薬として用いられる。トリプシン阻害剤は多くの豆類や穀類など植物種子で知られており、消化不良の原因物質にもなっている（特許文献４）。これらは、タンパク質であるにも拘らず、トリプシンで加水分解されないばかりか、その酵素活性を阻害するという機能を発揮するものであり、トリプシンをはじめとするセリンプロテアーゼの反応機構や基質認識の解析に広く利用されてきた。
多くの天然物由来や人工的に合成された低分子性のプロテアーゼ阻害剤（アンチパイン、ロイペプチン、キモスタチン、エラスチナールなど）が報告されており、かつ市販もされている（非特許文献１８、１９）。これらは、研究用試薬として酵素機能の調節に利用されている。
一方、トリプシン活性に対して正の影響を与える因子として、カルシウムイオンによりトリプシンの構造が安定化されることが知られている。

0016

ミミズは環形動物門貧毛綱に分類される紐状の生物であり、主に土壌中に生息して有機物を摂食し、消化吸収と排泄を通じて、土壌中の有機物を分解する役割を担っている。この点で、ミミズは土壌の耕起を促すとともに、植物が利用可能な有機物を土壌中にもたらしており、農業に必須の存在である。ミミズは食物連鎖の下層に位置し、自然界では、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類などの幅広い生物によって捕食される。また、魚やニワトリのエサとしても利用されてきたし、人類においても各地で食用の記録がある。東洋では解熱、鎮痛、利尿、血流促進などの目的で漢方薬としても長く利用されてきた。このようにミミズには安全性に足る十分な食経験があり、ミミズ乾燥粉末を用いた健康食品も生産されている（特許文献５、６）。

0017

これまでに、ミミズの体腔液や破砕液、及びこれらから製造されたミミズ乾燥粉末から、ウロキナーゼ様のプロテアーゼ活性や組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）様のプロテアーゼ等などのプロテアーゼ活性（非特許文献２０、２１）、アミラーゼ活性（非特許文献２２）、セルラーゼ活性（非特許文献２３）、リパーゼ活性（非特許文献２４）などの酵素活性が見出されている。さらに、ミミズ破砕液のアセトン沈殿画分からエラスターゼ阻害活性、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害活性及びチロシナーゼ阻害活性（非特許文献２５）、ミミズ乾燥粉末抽出液の１０ｋＤａ未満の低分子画分からジペプチジルペプチダーゼ阻害活性（特許文献７）、同じく５ｋＤａ以下の低分子画分からアンジオテンシン変換酵素阻害活性（特許文献８）が報告されている。また、ラット海馬ニューロンの培養細胞において、細胞培養を行う培地にミミズ粉末抽出物を加えると、タウタンパク質の細胞内発現量を増加させることが報告されている（特許文献９）。しかしながら、これまでにミミズ成分において、ヒトをはじめとする動物の消化酵素例えばトリプシン、キモトリプシン、リパーゼ、アミラーゼなどの活性に対する阻害あるいは活性化などの効果は報告されていない。

0018

特開２００３−２６７８０５号公報
特開２００４−２４４３６９号公報
特開２００７−５５９３８号公報
特開２０１２−７２１４１号公報
特許第５５４８９３１号公報
特開２０１５−４８３５３号公報
特許第５９０１０９２号公報
特開２０１５−１６８６３１号公報
特開２０１６−８８８７７号公報

0019

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0020

上記の現状のもと、本発明の主たる課題は、所定の酵素に対して活性促進効果を有する酵素活性促進剤、とりわけトリプシン、キモトリプシン、リパーゼ、及びこれらの酵素の類縁酵素類から選択される少なくとも１つの酵素に対して活性促進効果を有する酵素活性促進剤の製造方法及び酵素活性促進剤の含有物を提供する点にあり、さらに、用途を考慮すれば、食経験が豊富で安全性の高い天然物由来の原料を用いた酵素活性促進剤の製造方法及び酵素活性促進剤の含有物を提供する点にある。

0021

本発明者らは鋭意研究を重ね、上記課題を解決する方法を見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明の第１特徴構成は、所定の酵素に対して活性促進効果を有する酵素活性促進剤の製造方法であって、
ミミズ抽出液を得る抽出工程と、
そのミミズ抽出液に由来する分子質量３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分を得る分画工程と、を実行して、当該ミミズ抽出液画分から前記酵素活性促進剤を得る点にある。

0022

即ち、本発明は、ミミズ乾燥粉末に水を加えるなどしてミミズ抽出液を得る抽出工程と、そのミミズ抽出液に由来する分子質量３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分（以下において、簡便のため、本画分を「３ｋＤａ未満画分」と呼ぶ場合がある。）を得る分画工程と、を実行して得られるミミズ抽出液画分から、酵素とりわけ動物の消化酵素であるトリプシン、キモトリプシン及びリパーゼの活性促進効果を有する酵素活性促進剤を得ることができる。

0023

本発明の第２特徴構成は、前記所定の酵素がトリプシン、キモトリプシン、リパーゼ、及びこれらの酵素の類縁酵素類から選択される少なくとも１つである点にある。

0024

本構成によれば、ミミズ乾燥粉末は食経験も豊富であり、安全性の高い天然由来原料であることから、小腸でのトリプシン活性、キモトリプシン活性、及びリパーゼ活性を促進するための消化助剤としての応用、トリプシン、キモトリプシン、リパーゼを用いる食品加工時における活性増強剤としての応用、ペプチドやエステル、脂質などの合成や製造における活性増強剤としての応用など、医薬品、機能性食品、添加剤としての応用が期待できる。原料となるミミズは容易に養殖できることから、生産性の上でも利点がある。

0025

本発明の第３特徴構成は、前記分画工程により得たミミズ抽出液画分の粉末を５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で溶解して、前記酵素活性促進剤を得る点にある。

0026

本構成によれば、分子質量３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分を得る分画工程により、３ｋＤａ以上の高分子質量画分を取り除くことができる。得られた分子質量３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分に凍結乾燥処理等の濃縮操作を行うことにより、ミミズ抽出液画分に含まれる酵素活性促進効果を有する酵素活性促進剤としての粉末を高濃度で得ることができる。ミミズ抽出液画分の粉末は保存性及び加工性の点でも優位である。さらに、これらの分子質量３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分の粉末を５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で用いることで、酵素活性促進剤によるトリプシン及びキモトリプシン活性促進効果の最大値の半分以上の効果を十分に得ることができ、またリパーゼ活性についても十分な促進効果を得ることができる。

0027

本発明の第４特徴構成は、前記分画工程により得たミミズ抽出液画分、又はそのミミズ抽出液画分の粉末を５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度に溶解した画分に、加熱処理、凍結融解処理、酸処理、及び有機溶媒処理から選択される少なくとも１つを実行して、前記酵素活性促進剤を得る点にある。

0028

本構成によれば、上記加熱処理を行うことにより、熱に弱い成分を変性させ、遠心分離等で容易に取り除くことができる。加えて熱による殺菌効果も期待できる。また、上記凍結融解処理を行うことにより、低温に弱い成分を変性させ除去することができる。また、上記酸処理を行うことにより、酸に弱い成分を変性させ除去することができる。また、上記有機溶媒処理を行うことにより、有機層に移行する成分及び界面に移行する成分を除去することができる。そしてこのような処理を単独、又は複数組み合わせて実行することにより、より純度の高い酵素活性促進剤を得ることができる。

0029

本発明により、食経験が豊富で安全性の高い天然物由来の、酵素活性促進剤、その製造方法、及びその含有物を提供することができる。

0030

実施例１で得たミミズ抽出液画分の乾燥粉末を蒸留水に再溶解して得られた溶液の紫外・可視吸収スペクトルを示すグラフ図
トリプシン活性に対するミミズ抽出液画分の乾燥粉末の添加効果を示すグラフ図
ミミズ抽出液画分の乾燥粉末によるトリプシン活性の促進効果におけるミミズ抽出液画分の濃度依存性を示すグラフ図
トリプシン活性に対する基質濃度の効果を示すグラフ図
トリプシンの酵素反応速度の基質濃度依存性を示すグラフ図
トリプシンの酵素反応速度の基質濃度依存性に関する両逆数プロットを示すグラフ（ａ）及び表（ｂ）を示す図
トリプシンの酵素反応速度の基質濃度依存性に関するヘインズ−ウールフプロットを示すグラフ（ａ）及び表（ｂ）を示す図
キモトリプシン活性に対するミミズ抽出液画分の乾燥粉末の添加効果を示すグラフ図
ミミズ抽出液画分の乾燥粉末によるキモトリプシン活性の促進効果におけるミミズ抽出液画分の濃度依存性を示すグラフ図
ミミズ抽出液画分の乾燥粉末によるリパーゼ活性の促進効果におけるミミズ抽出液画分の濃度依存性を示すグラフ図

0031

本発明の実施形態を、以下、実施例を加えて、詳細に説明する。
本発明に係る、所定の酵素に対して活性促進効果を有する酵素活性促進剤は、原料となるミミズを破砕して得られた破砕液を用いて調製したミミズ乾燥粉末に、水を加えてミミズ抽出液を得る抽出工程と、その抽出工程で得られたミミズ抽出液を限外濾過して分子質量３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分を得る分画工程とを実行することで得られる。分子質量３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分を得る分画工程は、限外濾過に限らず、遠心分離、ゲル濾過等公知の分画法を用いても良い。この分子質量３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分を主成分とする酵素活性促進剤は、後述する実施例において、トリプシン活性、キモトリプシン活性、及びリパーゼ活性を促進する効果を持つことが確認できた。

0032

本発明に係る酵素活性促進剤の製造方法では、上記分画工程後の３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分に凍結乾燥処理工程を実行して、凍結乾燥粉末としてもよい。本工程によりミミズ抽出液画分を濃縮することができ、高濃度の酵素活性促進剤を得ることができる。また凍結乾燥粉末とすることで、保存性や加工性を高めることができる。さらにこの凍結乾燥粉末を５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で溶解することにより、トリプシン及びキモトリプシン活性促進効果の最大値の半分以上の効果を得ることができる。またリパーゼ活性についても十分な促進効果を得ることができる。凍結乾燥粉末を溶解する溶媒には、蒸留水のほか、トリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液などの公知の緩衝液を用いることができる。

0033

本発明に係る酵素活性促進剤の製造方法では、上記分子質量分画工程後の３ｋＤａ未満のミミズ抽出液画分、又はその画分に凍結乾燥処理を実行して濃縮して得た凍結乾燥粉末を５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度に再溶解した画分に、加熱処理、凍結融解処理、酸処理、及び有機溶媒処理から選択される少なくとも１つの処理を実行することができる。加熱処理に関しては、常圧下、１００℃までの温度で処理することができる。凍結融解処理に関しては、−８０℃までの温度（極低温冷凍庫）及び−１９６℃（液体窒素温度）で処理することができる。酸処理に関してはｐＨ２までの酸を用いて処理することができる。有機溶媒処理に関しては、ヘキサンなどの、水層と有機層に分層することができる有機溶媒を用いることができる。
これらの処理は複数組み合わせて実行してもよく、また、処理後の溶液に遠心分離や濾過などの一般的な分離操作を行うことができ、固形物を除去することでより純度の高い酵素活性促進剤を得ることができる。

0034

本発明に係る酵素活性促進剤は、これを含有する含有物とすることで、酵素、とりわけトリプシン活性、キモトリプシン活性、及びリパーゼ活性を促進する目的の医薬品、飲食品、添加物などとして用いることができる。

0035

〈ミミズ乾燥粉末の調製方法〉
本発明の実施例において用いたミミズ乾燥粉末の調製は、特許文献６の方法に準じて以下のように行った。
植物性繊維質材を養殖用床材として養殖したシマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｅｔｉｄａ）を動力土ふるい機（Ｂ型、笹川農機製、新潟県燕市）を用いてメッシュ孔径４ｍｍのふるい（ホームセンターで売っている一般的なもの）でふるいにかけ、大まかに繊維質材をふるい落とした。このミミズを明所に一定時間置き、ミミズの防衛特性により消化管内内容物を吐出させて除去する操作を繰り返すことで、原料となるミミズ生体を得た。
ミミズ生体３０ｋｇを水流式異物除去装置（ＭＡＳＴＥＲ分太郎ＭＴ−５００、東洋スクリーン工業製、奈良県生駒郡）を用いて洗浄した後、さらにメッシュ孔径３ｍｍのふるい（ホームセンターで売っている一般的なもの）の上で水洗した。このミミズ生体を５％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム水溶液に１時間浸漬し、体腔液を吐出させた後、再びメッシュ孔径３ｍｍのふるい上で水洗した。
ミミズ生体を破砕機（Ｍ−２２、なんつね製、大阪府藤井寺市）により破砕した後、プラスチックバッグに約２ｋｇずつ充填してシーラーで密封した。このミミズ破砕液を、静水圧式高圧処理装置（ＳＨＰ−１００−５０Ａ、シナダ製、新潟県長岡市）を用いて、１００ＭＰａ、６０℃で１６時間高圧処理した後、ローラーポンプ（ＲＰ−ＬＶＳ、古江サイエンス製、東京都新宿区）及び円筒型超遠心分離機（ＡＳＭ１６０ＡＰ、巴工業製、東京都品川区）を用いて、１７，０００ｒｐｍで連続的に遠心分離した。
得られた遠心上清を、真空凍結乾燥機（ＴＦ２０−８０ＴＮＮＮ、宝製作所製、東京都板橋区）を用いて凍結乾燥処理した後、パワーミル（ＹＣ−ＰＭ−３、ＹＥＮＣＨＥＮ ＭＡＣＨＩＮＥＲＹ製、台湾、桃園市亀山区）で粉末状に破砕した。この粉末を８０℃で６時間乾燥させて得られたものを最終的なミミズ乾燥粉末とした。このときの回収量は４．０４ｋｇであったことから、出発のミミズ生体重量３０ｋｇに対するミミズ乾燥粉末の収率は１３．５％であった。

0036

［実施例１］
上記調製工程において得られたミミズ乾燥粉末５ｇをビーカーに量り取り、蒸留水を加えて５０ｍＬとし、１０％（ｗ／ｖ）懸濁液を得た。懸濁液はスターラーを用いて１０分間撹拌した後、１６，１００ｘｇで１０分間遠心分離を行い、沈殿物を除去した。この上清をミミズ抽出液とした。
次にこのミミズ抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ２０（３ｋＤａ ＭＷＣＯ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、英国リトル・チャルフォント）を用いて限外濾過し、分子質量３ｋＤａ未満の低分子画分であるミミズ抽出液画分の濾液（以下、「３ｋＤａ未満濾液」と呼ぶ。）を得た。この３ｋＤａ未満濾液を、さらに凍結乾燥機（ＦＤＵ−１２００、東京理化器械ＥＹＥＬＡ製、東京都文京区）を用いて凍結乾燥粉末（以下、「３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末」と呼ぶ。）とした。このとき、２４ｍＬの３ｋＤａ未満濾液から、１．６５ｇの３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を得た。従って、出発のミミズ乾燥粉末５ｇからの３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の収率は３３％であった。すなわち、出発のミミズ生体重量３０ｋｇから、１．３３ｋｇの３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が得られたことから、このときの収率は４．４％であった。

0037

図１に、実施例１で得られた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を蒸留水に０．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう再溶解して得られた溶液の、紫外・可視吸収スペクトルを示す。尚、測定は分光光度計（ＵＶｍｉｎｉ−１２４０、島津製作所、京都）と超ミクロブラックセル（Ｐ／Ｎ２００−６６５７８−１１、島津ジーエルシー、東京）を用いて、光路長１ｃｍ、室温条件下で行った。

0038

３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の溶液の性状は、無色透明である。図１のスペクトルには、２４０−３５０ｎｍの波長域において、２５３ｎｍ付近に吸収の極大、２４０ｎｍ付近に極小を持つ単一のピークからなる吸収スペクトルを示す。３５０ｎｍ以上の長波長域には吸収が見られないことから、本物質は可視部域に吸収を持たない。一方、２４０ｎｍ以下の短波長域には各種の共有結合や振動・伸縮などに基因する大きい吸収がある。２４０−３５０ｎｍには、２５３ｎｍの極大とは別に２７０−２７５ｎｍ付近に肩（ショルダー）が見られる。本スペクトルには、一般的なタンパク質やペプチドに観測される特徴的な２７０−２８０ｎｍの吸収が見られないことから、実施例１で得られた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の主成分はトリプトファンやチロシンを含有するようなタンパク質やペプチドでは無いと考えられる。吸収スペクトルの特徴から、本物質には、（トリプトファン及びチロシンを主成分としない）アミノ酸とくにフェニルアラニンやヒスチジン、及びこれらを含むペプチド、ヌクレオチドやヌクレオシドなどの核酸関連物質、糖質、脂質及びテルペン、フラボノイド、コレステロール類など、及びこれらの複合体である可能性がある。

0039

〈トリプシン活性測定試験〉
トリプシン活性及びトリプシン様プロテアーゼ活性は、合成基質アルファ−Ｎ−ベンゾイル−Ｄ，Ｌ−アルギニン−パラ−ニトロアニリド（Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｄ，Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、以下「ＢＡＰＮＡ」と略称する。）の加水分解活性により評価することができる（非特許文献１５）。本法はトリプシンによりＢＡＰＮＡをアルファ−Ｎ−ベンゾイル−Ｄ，Ｌ−アルギニン（α−Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｄ，Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、以下「ＢＡ」と略称する。）とパラ−ニトロアニリン（ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ、以下「ＰＮＡ」と略称する。）へと分解し、単位時間当たりに生じるＰＮＡの量を波長４０５ｎｍの吸光度の増加を測定することで求め、その増加速度からトリプシン活性を評価するものである。

0040

はじめに、予め３７℃に保温した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液７５μＬと蒸留水１５μＬを９６ウェルマイクロプレートに加え、これに１ｍＭのＨＣｌに溶解した３０μｇ／ｍＬのウシ膵臓由来トリプシン（品番Ｔ１４２６、ＳＩＧＭＡ製、ロット番号：ＳＬＢＧ６４５２Ｖ）１０μＬを混合し、３７℃で５分間保持した。次いでこの混合液に、蒸留水に溶解し予め３７℃に保温した１ｍｇ／ｍＬのＢＡＰＮＡ（品番Ｂ４８７５、ＳＩＧＭＡ製、ロット番号ＢＣＢＮ０１３９Ｖ、米国ミズーリ−州セントルイス）５０μＬを加えることで反応を開始し、マイクロプレートリーダー（ｘＭａｒｋ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、３７℃における４０５ｎｍの吸光度を１分ごとに１５分間にわたり測定した。一方で対照実験として、トリプシン含有１ｍＭ ＨＣｌの代わりに、トリプシンを含有しない１ｍＭ ＨＣｌを加えた混合液についても同様に測定を行い、これをブランクとした。トリプシンを加えたときの測定値からブランク値を差し引いたうえで、測定時間ごとの４０５ｎｍの吸光度（Ａ４０５）が直線的に増加することを確認し、その直線の傾きより１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡ４０５／ｍｉｎ）を求めた。使用したマイクロプレートの光路長は反応液量１５０μＬで０．４５８ｃｍであり、また、生成物ＰＮＡの４０５ｎｍにおけるモル吸光係数（ε４０５）は１０，２００Ｍ−１ｃｍ−１であり（非特許文献２６）、これらの値とΔＡ４０５／ｍｉｎとから、１分間当たりに生成したＰＮＡ量を算出し、これを反応速度（すなわち酵素活性、単位はＭ／ｍｉｎ）とした。このとき、３ｋＤａ未満濾液を含まない条件下でのトリプシン活性は６．２×１０−６Ｍ／ｍｉｎであった。

0041

３ｋＤａ未満濾液のトリプシン活性促進効果は、以下の方法で測定した。３ｋＤａ未満濾液の試料液は、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に、２０、１０、５、２、１ｍｇ／ｍＬになるように溶解することにより調製した。３７℃で保温した各濃度の試料溶液７５μＬを用いて、上記と同様に、蒸留水１５μＬと１ｍＭのＨＣｌに溶解した３０μｇ／ｍＬのトリプシン１０μＬとを混合し、３７℃で５分間保温した。この混合液に、蒸留水に溶解し予め３７℃に保温した１ｍｇ／ｍＬのＢＡＰＮＡを５０μＬ加えることで反応を開始し、マイクロプレートリーダーを用いて、３７℃における４０５ｎｍの吸光度（Ａ４０５）を１分ごとに１５分間にわたって測定した。上記の方法で図２に示した測定結果を解析した。

0042

尚、図２では、縦軸にトリプシン活性の生成物（パラ−ニトロアニリン、ＰＮＡ）の４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）、横軸に酵素反応時間をプロットし、酵素反応の経時変化を示した。図中の凡例の数字は反応液に加えた、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の反応液中での濃度（すなわち終濃度）（単位：ｍｇ／ｍＬ）を示す。また、ＥＢは酵素を加えない酵素ブランク、ＤＢは酵素及び３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えないダブルブランクを示す。
反応液に酵素が含まれないとき（図２の「＋」）、生成物の生成は全く観測されない。一方、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が含まれていないとき（図２の「○」）、トリプシンによる基質の加水分解が起こり、生成物量は経時的にほぼ直線的な増加を示す。反応時間ゼロにおけるＡ４０５の単位時間における増分が、酵素活性すなわち酵素反応速度（ｖ）である。酵素反応液に３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えることにより、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の濃度依存的に酵素活性が促進されることが示された。３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含まないとき、トリプシンによって１分間当たりに生成したＰＮＡ量、すなわち反応速度は６．２×１０−６Ｍ／ｍｉｎであった。

0043

さらに、この値を相対値１として、各試料溶液を用いたときのトリプシン活性の相対値を示した（図３参照）。尚、各測定は３回ずつ繰り返して行った。
尚、図３は、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末によるトリプシン活性の促進効果における３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の濃度依存性を示す。図３では、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を、ゼロないし１０ｍｇ／ｍＬの種々の終濃度になるように反応液に添加したときのトリプシン促進効果を、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の終濃度がゼロのときの酵素活性を１として、相対値で示した。

0044

図３より、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を反応系に加えると、その濃度に依存してトリプシン活性が促進されることがわかる。終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えた場合でもトリプシン活性は１．４倍以上促進され、終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えた場合にはトリプシン活性は１．７倍以上促進された。一方で、上記の測定において、トリプシンを含まず、終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含む条件の反応液では、ＢＡＰＮＡ分解活性は観察されなかった（図２のＥＢ「＋」を参照）。これらの結果から、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末には、濃度依存的にトリプシン活性を促進する成分が含まれていること、さらに当該成分はトリプシン様活性を全く有さないことが示された。

0045

また、図３より、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の濃度とトリプシン活性の促進効果のプロットは飽和曲線を示し、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末によるトリプシン活性の最大活性化倍率は１．８倍であり、最大活性化倍率の半分の効果を与える３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の終濃度をＥＣ５０と定義すると、ＥＣ５０は０．４ｍｇ／ｍＬと見積もられた。よって、本試験で行ったように終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含む反応条件では、十分にＥＣ５０を上回るトリプシン促進効果がもたらされること、さらに終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含む反応条件では最大活性化倍率の９０％以上のトリプシン促進効果がもたらされることが示された。

0046

［比較試験例１］
上記実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの試料溶液を調製した。予め３７℃に保温した各試料溶液７５μＬと蒸留水１５μＬを９６ウェルマイクロプレートに加え、これに蒸留水に溶解し予め３７℃に保温した１ｍｇ／ｍＬのＢＡＰＮＡを５０μＬ加え、３７℃で５分間保持した。この混合液に、１ｍＭのＨＣｌに溶解した３０μｇ／ｍＬのトリプシン１０μＬを加えることで反応を開始し、マイクロプレートリーダーを用いて、３７℃における４０５ｎｍの吸光度を１分ごとに１５分間にわたり測定した。

0047

上記の方法で結果を解析し、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含まないときのトリプシン活性によって１分間当たりに生成したパラ−ニトロアニリン（ＰＮＡ）量を求めたところ、７．８×１０−６Ｍ／ｍｉｎであった。このように酵素添加により反応を開始した場合、上述の基質添加により反応を開始した場合に比べてトリプシン活性が高くなったが、これは基質を添加することにより反応を開始する場合、トリプシンを反応液に加えてから基質を添加して反応を開始するまでの５分間の保持により、トリプシンの自己消化が起こり、その結果、活性が低下することに起因すると考えられる。

0048

しかし、反応液に終濃度が１ｍｇ／ｍＬあるいは１０ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えて酵素を添加することにより反応を開始した場合、トリプシン活性、すなわち１分間当たりに生成したＰＮＡ量は、それぞれ１．３倍（１．０×１０−５Ｍ／ｍｉｎ）及び１．５倍（１．２×１０−５Ｍ／ｍｉｎ）に増加した。また、本比較試験例の、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含まない反応液において酵素添加により反応開始した場合の活性（７．８×１０−６Ｍ／ｍｉｎ）に比較して、上述の基質添加により反応開始した場合、反応液に終濃度が１−１０ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含むとき、より高い活性（８．９×１０−６Ｍ／ｍｉｎから１．１×１０−５Ｍ／ｍｉｎ）が得られた。即ち、トリプシン活性は５分間の保持により自己消化が起こり、活性が低下するが、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を添加すると自己消化が起こる前のトリプシン活性よりも促進された。以上の結果から、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末には、単純にトリプシンの自己消化を防ぎ安定化に寄与するのみならず、濃度依存的にトリプシン活性をより高度に促進する成分が含まれていることが示された。

0049

［比較試験例２］
上記実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの試料溶液を調製した。また、合成基質ＢＡＰＮＡを、２、１．５、１．２５、１、０．７５、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水に溶解し、各濃度の基質溶液を調製した。予め３７℃に保温した各試料溶液７５μＬと蒸留水１５μＬを９６ウェルマイクロプレートに加え、これに予め３７℃に保温した各濃度のＢＡＰＮＡを５０μＬ加えて、３７℃で５分間保温した。この混合液に、１ｍＭのＨＣｌに溶解した３０μｇ／ｍＬのトリプシン１０μＬを加えることで反応を開始し、マイクロプレートリーダーを用いて、３７℃における４０５ｎｍの吸光度を１分ごとに１５分間にわたり測定した。尚、基質溶液の代わりに蒸留水を加えた基質ブランク、試料溶液を加えない３ｋＤａ未満濾液ブランクについても、それぞれ測定を行った。一連の測定は全部で３回行った。一例として終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含む反応条件での測定結果を図４示した。基質濃度の増大につれて、酵素活性が増大することが示された。

0050

尚、図４は、トリプシン活性に対する基質濃度の効果を示す。即ち、図４では、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように含む条件において、反応液に加える基質濃度を終濃度でゼロないし０．６７ｍｇ／ｍＬにわたって変化させたときのトリプシン活性測定の経時変化を示す。横軸は反応時間、縦軸は４０５ｎｍの吸光度を表す。凡例の数字は反応液に加えた基質の終濃度を示す。基質濃度の増大につれて、酵素活性が増大することが示された。

0051

本結果は上記の方法で解析した。トリプシン活性によって１分間当たりに生成したＰＮＡ量を各条件について求めたうえで、横軸に基質濃度（［Ｓ］）、縦軸に反応速度（ｖ）を取ったミカエリスプロットを作成し、図５に示す。
尚、図５では、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を、含まない、あるいは終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬになるように含む条件において、反応液に加える基質濃度を変化させたときのトリプシン活性を解析し、横軸に基質濃度（［Ｓ］）、縦軸に反応速度（ｖ）をプロットした（ミカエリス プロット）。凡例の数字は反応液に加えた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の終濃度を示す。反応速度の単位（Ｍ／ｍｉｎ）は、酵素反応生成物の生成速度の単位（Ａ４０５／ｍｉｎ）から、生成物の分子吸光係数を用いて算出した。いずれの濃度の３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が含まれる場合も、ミカエリス−メンテン型の飽和曲線が示された。

0052

いずれの濃度の３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が含まれる場合も、ミカエリス−メンテン型の飽和曲線が示された。図５より、各プロットは飽和曲線を示しており、終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えた場合、反応の最大速度が増大していることが読み取れる。ここでさらに、横軸に基質濃度の逆数を、縦軸に反応速度の逆数を取ったラインウィーバー−バークプロット、及び横軸に基質濃度を、縦軸に基質濃度を反応速度で除した値を取ったヘインズ−ウールフ プロットを作成した。それぞれのプロットから最小二乗法による近似直線を得て、これよりミカエリス定数Ｋｍ（Ｍ）、最大速度Ｖｍａｘ（Ｍ／ｓ）、分子活性ｋｃａｔ（１／ｓ）、及びｋｃａｔ／Ｋｍ（１／（Ｍｓ））の各種酵素反応速度論パラメータを求めた。図６には、ラインウィーバー−バークプロットプロット及び当該プロットより求めたパラメータを、図７には、ヘインズ−ウールフ プロット及び当該プロットより求めたパラメータをそれぞれ示した。

0053

即ち、図６は、トリプシンの酵素反応速度（ｖ）の基質濃度［Ｓ］依存性に関する両逆数プロット（ラインウィーバー−バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ）プロット）を示す。図６では、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を、含まない、あるいは終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬになるように含む条件において、反応液に加える基質濃度を変化させたときのトリプシン活性測定の結果を解析し、横軸に基質濃度の逆数（１／［Ｓ］）、縦軸に反応速度の逆数（１／ｖ）をプロットした（ラインウィーバー−バーク プロット）。また、図６の下に、本プロットより求めた酵素反応速度論パラメータを示す。基質濃度及び反応速度の単位は図５に同じである。ここで、Ｋｍは、表示された終濃度で３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が反応液に存在するときのミカエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ）定数であり、Ｖｍａｘは、同じく表示された終濃度で３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が反応液に存在するときの最大速度であり、ｋｃａｔは、同じく表示された終濃度で３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が反応液に存在するときの分子活性（ターンオーバー数）であり、ｋｃａｔ／Ｖｍａｘは同じく表示された終濃度で３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が反応液に存在するときの特異性定数である。３種類の反応液において、Ｋｍはほとんど変化しないが、Ｖｍａｘとｋｃａｔは、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の終濃度の増大につれて増大した。

0054

また、図７は、トリプシンの酵素反応速度（ｖ）の基質濃度［Ｓ］依存性に関するヘインズ−ウールフ（Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ）プロットを示す。図７では、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を、含まない、あるいは終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬになるように含む条件において、反応液に加える基質濃度（［Ｓ］）を変化させたときのトリプシン活性測定の結果を解析し、横軸に基質濃度（［Ｓ］）、縦軸に基質濃度を反応速度で除した数値（［Ｓ］／ｖ）をプロットした（ヘインズ−ウールフ プロット）。また、図７の下に本プロットより求めた酵素反応速度論パラメータを示す。本プロットより求めた酵素反応速度論パラメータ、基質濃度及び反応速度の単位は図５及び図６に同じである。

0055

図６及び図７に示したパラメータより、終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えた場合、トリプシンの基質との親和性の指標であるミカエリス定数はほぼ変化しないか、あるいはわずかに大きくなった。一方で最大速度は加えた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末濃度に応じて増大し、酵素１分子が１秒間当たりに触媒する反応の回転数を示す分子活性も増大した。即ち以上の結果より、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末に含まれるトリプシン促進剤は、トリプシンとＢＡＰＮＡ基質の結合の親和性を高めることによるのでは無く、トリプシンが単位時間あたりに触媒する反応の回転数を高めることにより、トリプシン活性を促進する効果を発揮することが示された。

0056

〈キモトリプシン活性測定試験〉
キモトリプシン活性は、上述のトリプシン活性測定試験の内容を一部変更して測定した。即ち、合成基質Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−チロシン−パラ−ニトロアニリド（Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、以下「ＢＴＰＮＡ」と略称する。）をキモトリプシンにより生成物Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−チロシン（Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ、以下「ＢＴ」と略称する。）とパラ−ニトロアニリン（ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ、ＰＮＡ）へと加水分解し、単位時間当たりに生じるＰＮＡの量を波長４０５ｎｍの吸光度の増加を測定することで求め、その増加速度からキモトリプシン活性を評価した。

0057

予め３７℃に保温した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液７５μＬと蒸留水４０μＬを９６ウェルマイクロプレートに加え、これに１ｍＭのＨＣｌに溶解した１５０μｇ／ｍＬのウシ膵臓由来キモトリプシン（品番Ｃ４１２９、ＳＩＧＭＡ製，ロット番号：ＳＬＢＧ２８２１Ｖ）１０μＬを混合し、３７℃で５分間保温した。この混合液に、３０％ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下「ＤＭＳＯ」と略称する。）に溶解し予め３７℃に保温した０．３６ｍｇ／ｍＬのＢＴＰＮＡ（品番Ｂ６７６０、ＳＩＧＭＡ製、ロット番号：ＢＣＢＮ１７４９Ｖ）２５μＬを加えることで反応を開始し、マイクロプレートリーダーを用いて３７℃における４０５ｎｍの吸光度を１分ごとに１５分間にわたり測定した。一方で対照実験として、キモトリプシン含有１ｍＭ ＨＣｌの代わりに、キモトリプシンを含有しない１ｍＭ ＨＣｌを加えた混合液についても同様に測定を行い、これをブランクとした。キモトリプシンを加えたときの測定値からブランク値を差し引いたうえで、測定時間ごとのＡ４０５が直線的に増加することを確認し、その直線の傾きよりΔＡ４０５／ｍｉｎを求めた。この値と、使用したマイクロプレートの光路長（反応液量１５０μＬで０．４５８ｃｍ）、及び生成物ＰＮＡのε４０５（１０，２００Ｍ−１ｃｍ−１）とから、１分間当たりに生成したＰＮＡ量を算出し、これを反応速度（すなわち酵素活性、単位はＭ／ｍｉｎ）とした。このとき、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含まない条件下でのキモトリプシン活性は２．７×１０−６Ｍ／ｍｉｎであった。

0058

３ｋＤａ未満濾液のキモトリプシン活性促進効果は上記と同様に測定した。３ｋＤａ未満濾液試料液は、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に、８０、４０、２０、１０、５、２、１ｍｇ／ｍＬになるように溶解することにより調製した。３７℃で保温した各濃度の試料溶液７５μＬを、蒸留水４０μＬと１ｍＭのＨＣｌに溶解した１５０μｇ／ｍＬのキモトリプシン１０μＬと混合し、３７℃で５分間保温した。この混合液に、３０％ＤＭＳＯに溶解し予め３７℃に保温した０．３６ｍｇ／ｍＬのＢＴＰＮＡを２５μＬ加えることで反応を開始し、マイクロプレートリーダーを用いて、３７℃におけるＡ４０５を１分ごとに１５分間にわたって測定した（図８参照）。尚、図８では、縦軸にトリプシン活性の生成物（パラ−ニトロアニリン、ＰＮＡ）の４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）、横軸に酵素反応時間をプロットし、酵素反応の経時変化を示した。図８中の凡例の数字は反応液に加えた、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の反応液中での濃度（すなわち終濃度）（単位：ｍｇ／ｍＬ）を示す。また、ＥＢは酵素を加えない酵素ブランク、ＤＢは酵素及び３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えないダブルブランクを示す。反応液に酵素が含まれないとき（図８の「＋」）、生成物の生成は全く観測されない。一方、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が含まれていないとき（図８の「○」）、トリプシンによる基質の加水分解が起こり、生成物量は経時的にほぼ直線的な増加を示す。反応時間ゼロにおけるＡ４０５の単位時間における増分が、酵素活性すなわち酵素反応速度（ｖ）である。酵素反応液に３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えることにより、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の濃度依存的に酵素活性が促進されることが示された。
図８により、酵素反応液に３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えることにより、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の濃度依存的に酵素活性が促進されることが示された。測定結果を解析したところ、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含まないとき、キモトリプシンによって１分間当たりに生成したＰＮＡ量、すなわち反応速度は２．７×１０−６Ｍ／ｍｉｎであった。

0059

さらに、この値を相対値１として、各試料溶液を用いたときのキモトリプシン活性を相対的に示した（図９参照）。尚、各測定は３回ずつ繰り返して行った。
尚、図９は、３ｋＤａ未満濾液によるキモトリプシン活性の促進効果における３ｋＤａ未満濾液の濃度依存性を示す。図９では、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を、ゼロないし４０ｍｇ／ｍＬの種々の終濃度になるように反応液に添加したときのキモトリプシン促進効果を、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の終濃度がゼロのときの酵素活性を１として、相対値で示した。

0060

図９において、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末をゼロないし４０ｍｇ／ｍＬの種々の終濃度になるように反応液に添加したとき、その濃度に依存してキモトリプシン活性が促進されることがわかる。キモトリプシン活性は、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の終濃度がゼロのときの酵素活性を１として、相対値で示した。終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えた場合、キモトリプシン活性は１．４倍以上促進された。一方で、上記の測定において、キモトリプシンを含まず、終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含む条件の反応液では、ＢＴＰＮＡ分解活性は観察されなかった（図８のＥＢ「＋」を参照）。これらの結果から、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末には、濃度依存的にキモトリプシン活性を促進する成分が含まれていること、さらに当該成分はキモトリプシン様活性を全く有さないことが示された。

0061

また、図９のプロットは飽和曲線を示し、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末によるキモトリプシン活性の最大活性化倍率は約１．７倍、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末のＥＣ５０はおよそ４ｍｇ／ｍＬであると見積もられた。よって、本試験で行ったように終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含む反応条件では、十分にＥＣ５０を上回るキモトリプシン活性の促進効果を得ることが示された。

0062

〈リパーゼ活性測定試験〉
リパーゼ活性はリパーゼキットＳ（品番４９８７−１１６−８８０２１−３、ＤＳファーマバイオメディカル製、大阪府吹田市）を用いて測定した。製造者の説明によれば、本キットは基質液、発色液、エステラーゼ阻害液、反応停止液から構成されており、測定原理は基質である三酪酸ジメルカプロール（「ＢＡＬＢ」と略称する。）をリパーゼにより酪酸とジメルカプロール（「ＢＡＬ」と略称する。）へと分解し、生じたＢＡＬを発色剤である５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（「ＤＴＮＢ」と略称する。）と反応させて黄色の５−チオ−２−ニトロ安息香酸アニオン（「ＴＮＢ」と略称する。）を生成させ、４１２ｎｍの吸光度を測定することでリパーゼ活性を評価するというものである。エステラーゼ阻害液の成分はフェニルメチルスルホニルフルオリド（「ＰＭＳＦ」と略称する。）であり、リパーゼ以外のエステラーゼを阻害する。また反応液には濁りがあるが、停止液を加えることで反応を停止すると同時に反応液を清澄にする。

0063

予め３０℃に保温した蒸留水５６．５μＬと、先に混合して３０℃に保温したキットの発色原液６．２５μＬ、緩衝液６．２５μＬ、エステラーゼ阻害液１．５μＬを９６ウェルマイクロプレートに加え、これに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液に溶解した５μｇ／ｍＬのブタ膵臓由来リパーゼ（品番Ｌ３１２６、ＳＩＧＭＡ製、ロット番号：ＳＬＢＬ２１４３Ｖ）３μＬを混合し、３０℃で５分間保持した。この混合液に、予め３０℃に保温したキットの基質液６．５μＬを加えることで反応を開始し、３０℃で１０分間反応を行った。この反応液に停止液１２０μＬを加えることで反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーを用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。一方で対照実験として、混合液に基質液を加えずに３０℃で１０分間保持し、停止液１２０μＬを加えた後に基質液６．５μＬを加えた対照試験液についても４１２ｎｍの吸光度を測定した。反応液の吸光度から対照試験液の吸光度を差し引いた値を、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えないときのリパーゼ活性とした。

0064

３ｋＤａ未満濾液のリパーゼ活性促進効果は以下の方法で測定した。３ｋＤａ未満濾液試料液は、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を蒸留水に２０、１０、５、２、１ｍｇ／ｍＬになるように溶解することにより調製した。３０℃で保温した各濃度の試料溶液４０μＬと蒸留水１６．５μＬ、先に混合して３０℃に保温したキットの発色原液６．２５μＬ、緩衝液６．２５μＬ、エステラーゼ阻害液１．５μＬを９６ウェルマイクロプレートに加えた。これに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に溶解した５μｇ／ｍＬのブタすい臓由来リパーゼ３μＬを混合し、３０℃で５分間保持した。この混合液に、予め３０℃に保温したキットの基質液６．５μＬを加えることで反応を開始し、３０℃で１０分間反応を行った。この反応液に停止液１２０μＬを加えることで反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーを用いて４１２ｎｍの吸光度を測定した。一方で対照実験として、混合液に基質液を加えずに３０℃で１０分間保持し、停止液１２０μＬを加えた後に基質液６．５μＬを加えた対照試験液についても４１２ｎｍの吸光度を測定した。反応液の吸光度から対照試験液の吸光度を差し引いた値をそれぞれ、各濃度の３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えたときのリパーゼ活性とした。尚、各測定は３回ずつ繰り返して行った。

0065

３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えないときのリパーゼ活性を相対値１として、３ｋＤａ未満濾液の凍結乾燥粉末をゼロないし１０ｍｇ／ｍＬの種々の終濃度になるように反応液に添加したときのリパーゼ活性を相対値で表した結果を示した（図１０参照）。
尚、図１０は、３ｋＤａ未満濾液によるリパーゼ活性の促進効果における３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の濃度依存性を示す。図１０では、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末をゼロないし１０ｍｇ／ｍＬの種々の終濃度になるように反応液に添加したときのリパーゼ促進効果を、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末の終濃度がゼロのときの酵素活性を１として、相対値で示した。
図１０に示すように、終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上になるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えるとリパーゼ活性はおよそ１．４倍に活性化された。一方で、上記の測定において、リパーゼを含まず、終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含む条件の反応液では、リパーゼ活性は観察されなかった。これらの結果から、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末には、リパーゼ活性を促進する成分が含まれていること、さらに当該成分はリパーゼ様活性を全く有さないことが示された。

0066

次に、実施例１で得られた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末にさらに各種処理工程を加えた実施例について説明する。

0067

［実施例２］
実施例１で得られた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。この溶液をアルミブロック恒温槽（ＤＴＵ−１ＢＮ、タイテック製、東京）を用いて１００℃、１０分間あるいは３０分間加熱処理を行った。室温まで冷ましたこれらの溶液を以後、「加熱処理溶液」（実施例２）とする。

0068

［実施例３］
実施例１で得られた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。この溶液を−８０℃の超低温フリーザー（ＭＤＦ−Ｕ３８４、三洋電気製、大阪府守口市）を用いて凍結処理し、一晩保持した後、容器を水道水につけて融解した。以下、この溶液を「凍結融解処理溶液」（実施例３）と呼ぶ。

0069

［実施例４］
実施例１で得られた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を１０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ２．０）に溶解し、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。この溶液を室温で３時間保持した後、１ＭのＮａＯＨを加えて中和し、さらに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液と蒸留水を加えて、最終的に３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した状態の溶液を調製した。以下、この溶液を「酸処理溶液」（実施例４）と呼ぶ。

0070

［実施例５］
実施例１で得られた３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。この溶液をガラスバイアルに入れ、等量のヘキサン（試薬特級、ノルマルヘキサン９７％含有、ナカライテスク製、京都市）を加えて蓋をし、ボルテックスミキサーを用いて５分間激しく撹拌した。３０分間静置して十分に分層させた後、ヘキサン層を取り除き、水層を慎重に回収した（１回抽出）。また、ヘキサン層を取り除いた後、等量のヘキサンを新たに加え、再度撹拌と分層を行った水層も別途調製した（２回抽出）。以下、これらの水層の溶液を「ヘキサン抽出溶液」（実施例５）と呼ぶ。尚、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含まない１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に対して、等量のヘキサンを加え、同様の抽出操作を行ったものも調製し、これをコントロールとした。

0071

上記実施例２−５で得られた各試料溶液を用いてトリプシン活性測定試験を行った。予め３７℃で保温した各試料溶液７５μＬと蒸留水１５μＬ、１ｍＭのＨＣｌに溶解した３０μｇ／ｍＬのトリプシン１０μＬとを混合し、３７℃で５分間保持した。この混合液に、蒸留水に溶解し予め３７℃に保温した１ｍｇ／ｍＬのＢＡＰＮＡを５０μＬ加えることで反応を開始し、マイクロプレートリーダーを用いて、３７℃における４０５ｎｍの吸光度（Ａ４０５）を１分ごとに１５分間にわたって測定した。結果を解析し、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を含まないときのトリプシン活性を相対活性１として、各試料溶液を用いたときのトリプシン活性を相対的に示した（表１参照）。尚、比較のために図３に示した終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えた溶液（以下「未処理溶液」と呼ぶ。）のトリプシン活性も表１に合わせて示した。

0072

0073

まず、実施例２の加熱処理溶液に関して詳しく説明する。１００℃で１０分間及び３０分間加熱処理した加熱処理溶液を用いた場合、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えないときに比較して、それぞれ１．６倍及び１．７倍にトリプシン活性を促進した。これは未処理の未処理溶液を用いたときと同等の効果であったことから、トリプシン促進効果を示す成分は実施例２の加熱処理に対して高い安定性及び耐熱性を持つことが示された。また、このことから３ｋＤａ未満濾液に対して加熱処理を行うことで、熱に弱い成分を変性させて除去する効果や、加熱殺菌効果が期待できる。

0074

次に、実施例３の凍結融解処理溶液に関して、−８０℃で凍結し、一晩保持した後に融解した凍結融解処理溶液を用いた場合でも、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えない場合と比較してトリプシン活性を１．６倍に促進した。この結果からトリプシン促進効果を示す成分は凍結融解処理に対して安定性及び耐凍結融解性があることが示された。また、このことから、低温に弱い成分を変性させて除去する効果や、微生物の増殖を防ぎ長期保存できる可能性が期待できる。

0075

さらに実施例４の酸処理溶液に関して、ｐＨ２で３時間保持した後に中和した酸処理溶液を用いた場合でも、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えない場合と比較してトリプシン活性を１．６倍に促進した。この結果は、トリプシン促進効果を示す成分が実施例４の酸処理に対して安定性及び耐酸性を持つことを示している。また、このことから酸に弱い成分を変性させて除去する効果や酸による殺菌効果が期待できる。加えて経口摂取した際、胃酸に耐えて小腸へ到達しトリプシンを促進する可能性も期待できる。

0076

また、実施例５のヘキサン抽出溶液に関して、ヘキサンを３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末に加えて撹拌、分層する抽出操作を１回、あるいは２回行った後のヘキサン抽出溶液を用いた場合でも、３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末を加えない場合と比較してトリプシン活性を１．６倍に促進した。一方で、同様の抽出操作を行った１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を用いたコントロールでは、抽出操作を行っていないコントロールと差が見られなかった。これらの結果は、トリプシン促進効果を示す成分がヘキサンに対して安定であり、かつヘキサン層や界面へ移行せず水層に保持される、親水性の高い物質であることを示唆する。加えて、抽出操作により、有機層に移行する成分及び界面に移行する成分を除去する効果が期待できる。ヘキサンは生体物質に対して適用される最も高い非極性と高い疎水性を持つ有機溶媒であり、通常これより非極性及び疎水性が高い溶媒が用いられることは無い。従って、上記のように、当該の３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末が、ヘキサン中でトリプシン促進活性を減弱させたり消失したりすることが無かったことから、ヘキサン以外の有機溶媒中でも、十分な安定性と耐有機溶媒性を有するものと判断できる。

0077

以上の結果より、実施例１で得た３ｋＤａ未満濾液凍結乾燥粉末に対して加熱処理、凍結融解処理、酸処理、有機溶媒処理を単独、又は複数組み合わせて実行することにより、より純度の高いトリプシン活性促進効果を持つ酵素活性促進剤を得ることができると考えられる。
このようにして得られたミミズ乾燥粉末由来の酵素活性促進剤は、医薬品、機能性食品、添加剤などへ用いることが可能である。

0078

［別の実施形態］
（１）上記実施形態では、原料となるミミズにシマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｅｔｉｄａ）を用いたが、医薬品、健康食品用途で使用される他種のミミズを用いてもよい。

0079

（２）上記実施形態では、ミミズの破砕液に静水圧式高圧処理を行い、遠心分離にかけた上清を凍結乾燥して調製したミミズ乾燥粉末を用いたが、別の方法で調製されたミミズ乾燥粉末を用いてもよい。

0080

（３）上記実施形態における酵素活性促進剤の製造方法に含まれる各工程の処理条件については適宜変更が可能である。