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課題

容易に生体内でのエクソソームの産生を促進することができる、エクソソーム産生促進剤の提供。

解決手段

セラミドを有効成分とするエクソソーム産生促進剤、好ましくはセラミドを構成する脂肪酸炭素数が6〜26、特に好ましくは18である該エクソソーム産生促進剤。

効果

簡便に生体内でのエクソソームの産生を促進するエクソソーム産生促進剤を提供することができる。経口投与飲食品の形態で投与又は摂取できるので、患者への負担が少なく、容易に生体内でのエクソソーム産生を促進することができる。

概要

背景

現在、アルツハイマー病は、認知症の原因の半数以上を占める神経変性疾患であり、治療予防法確立が望まれている。これまでの研究で、アルツハイマー病の病態機序解明が進んでおり、アルツハイマー病の予防や進行抑制、改善のために、病態機序の中心となるアミロイドβタンパク質蓄積を抑制することが重要な点の一つであると考えられている。

アミロイドβタンパク質の蓄積を抑制する薬剤については、これまでに広く研究されている。例えば、特許文献1には、水溶性ペプチド金属錯体アレイを含むアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤が開示されている。また、例えば、特許文献2には、シソ抽出物を有効成分とする、アミロイドβタンパク質の凝集阻害組成物が開示されている。また、例えば、特許文献3には、N−アセチルノイラミン酸、N−アセチルマンノサミン、及びシアリルラクトースの少なくとも何れか一つを含有する、GNE遺伝子変異に起因するアミロイドβ凝集抑制剤が開示されている。

ところで、近年の研究から、脳内アミロイドβタンパク質の代謝やアルツハイマー病の発現・進行へのエクソソームの関与示唆されている。エクソソームは、細胞から分泌される脂質二重膜に囲まれた直径30〜200nmの膜小胞体であり、mRNA、miRNA等の核酸タンパク質等を内包し、細胞間コミュニケーションの担い手として機能している。

アミロイドβタンパク質は、エクソソームを介してミクログリアに移動し、その後に分解されると考えられている。例えば、非特許文献1では、神経細胞由来エクソソームが、アミロイドβ結合性糖脂質を高発現し、アミロイドβタンパク質を捕捉する能力をもつこと、脳内の貪食細胞ミクログリアと連携してアミロイドβタンパク質を除去する作用を有することが示唆されている。また、非特許文献2では、ニューロン由来エクソソームが、その表面でアミロイドβを捕捉し、ミクログリアへ輸送することで、アミロイドβタンパク質の分解効率を高めていることが示唆されている。また、例えば、非特許文献3では、エクソソームの分泌により、ミクログリアによるアミロイドβタンパク質の除去機能が促進されることが示唆されている。また、例えば、非特許文献4では、エクソソームが、脳内のアミロイドβの代謝に関与していることが示唆されている。

このように、エクソソームは、アミロイドβタンパク質の除去・蓄積抑制に関与することが知られている。従って、エクソソームの産生を促進することは、アミロイドβタンパク質の蓄積を抑制することができ、アルツハイマー病の予防・治療にも有効であると考えられる。

しかしながら、エクソソームの産生を促進し得る薬剤については、未だ十分な検討がなされていない。また、セラミドがエクソソームの産生を促進し得ることは、これまでに知られていない。

概要

容易に生体内でのエクソソームの産生を促進することができる、エクソソーム産生促進剤の提供。セラミドを有効成分とするエクソソーム産生促進剤、好ましくはセラミドを構成する脂肪酸炭素数が6〜26、特に好ましくは18である該エクソソーム産生促進剤。簡便に生体内でのエクソソームの産生を促進するエクソソーム産生促進剤を提供することができる。経口投与飲食品の形態で投与又は摂取できるので、患者への負担が少なく、容易に生体内でのエクソソーム産生を促進することができる。

目的

現在、アルツハイマー病は、認知症の原因の半数以上を占める神経変性疾患であり、治療・予防法の確立が望まれている

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

セラミドを有効成分とするエクソソーム産生促進剤

請求項2

セラミドを構成する脂肪酸炭素数が、6〜26である、請求項1に記載のエクソソーム産生促進剤。

請求項3

セラミドを構成するスフィンゴイド部分の炭素数が、18である、請求項1又は2に記載のエクソソーム産生促進剤。

請求項4

エクソソーム産生促進飲食品である、請求項1〜3のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤。

請求項5

エクソソーム産生促進用医薬品である、請求項1〜3のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤。

請求項6

アルツハイマー病予防剤である、請求項1〜3のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤。

技術分野

0001

本発明は、エクソソームの産生を促進することができる薬剤に関する。

背景技術

0002

現在、アルツハイマー病は、認知症の原因の半数以上を占める神経変性疾患であり、治療予防法確立が望まれている。これまでの研究で、アルツハイマー病の病態機序解明が進んでおり、アルツハイマー病の予防や進行抑制、改善のために、病態機序の中心となるアミロイドβタンパク質蓄積を抑制することが重要な点の一つであると考えられている。

0003

アミロイドβタンパク質の蓄積を抑制する薬剤については、これまでに広く研究されている。例えば、特許文献1には、水溶性ペプチド金属錯体アレイを含むアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤が開示されている。また、例えば、特許文献2には、シソ抽出物を有効成分とする、アミロイドβタンパク質の凝集阻害組成物が開示されている。また、例えば、特許文献3には、N−アセチルノイラミン酸、N−アセチルマンノサミン、及びシアリルラクトースの少なくとも何れか一つを含有する、GNE遺伝子変異に起因するアミロイドβ凝集抑制剤が開示されている。

0004

ところで、近年の研究から、脳内アミロイドβタンパク質の代謝やアルツハイマー病の発現・進行へのエクソソームの関与示唆されている。エクソソームは、細胞から分泌される脂質二重膜に囲まれた直径30〜200nmの膜小胞体であり、mRNA、miRNA等の核酸タンパク質等を内包し、細胞間コミュニケーションの担い手として機能している。

0005

アミロイドβタンパク質は、エクソソームを介してミクログリアに移動し、その後に分解されると考えられている。例えば、非特許文献1では、神経細胞由来エクソソームが、アミロイドβ結合性糖脂質を高発現し、アミロイドβタンパク質を捕捉する能力をもつこと、脳内の貪食細胞ミクログリアと連携してアミロイドβタンパク質を除去する作用を有することが示唆されている。また、非特許文献2では、ニューロン由来エクソソームが、その表面でアミロイドβを捕捉し、ミクログリアへ輸送することで、アミロイドβタンパク質の分解効率を高めていることが示唆されている。また、例えば、非特許文献3では、エクソソームの分泌により、ミクログリアによるアミロイドβタンパク質の除去機能が促進されることが示唆されている。また、例えば、非特許文献4では、エクソソームが、脳内のアミロイドβの代謝に関与していることが示唆されている。

0006

このように、エクソソームは、アミロイドβタンパク質の除去・蓄積抑制に関与することが知られている。従って、エクソソームの産生を促進することは、アミロイドβタンパク質の蓄積を抑制することができ、アルツハイマー病の予防・治療にも有効であると考えられる。

0007

しかしながら、エクソソームの産生を促進し得る薬剤については、未だ十分な検討がなされていない。また、セラミドがエクソソームの産生を促進し得ることは、これまでに知られていない。

0008

特開2016−145175号公報
特開2016−124865号公報
特開2014−224132号公報

先行技術

0009

月刊「細胞」、ニューサイエンス発行、2016、48(1)、第44頁〜第47頁
Dementia Japan 30,Vol.30,No.3,358−367(2016)
Yuyama K et al., J Biol Chem., 289(35), 24488−98(2014)
Yuyama K et al., J Biol Chem., 287(14), 10977−89(2012)

発明が解決しようとする課題

0010

本発明は、前記現状に鑑みて、容易に生体内でのエクソソームの産生を促進することができる、エクソソーム産生促進剤を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0011

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、セラミドが、エクソソームの産生を促進し得ることを見出した。また、特にセラミドを構成する脂肪酸炭素数が6〜26である場合には、エクソソームの産生をより一層効果的に促進し得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。

0012

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項1.セラミドを有効成分とするエクソソーム産生促進剤。
項2. セラミドを構成する脂肪酸の炭素数が、6〜26である、項1に記載のエクソソーム産生促進剤。
項3. セラミドを構成するスフィンゴイド部分の炭素数が、18である、項1又は2に記載のエクソソーム産生促進剤。
項4. エクソソーム産生促進飲食品である、項1〜3のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤。
項5. エクソソーム産生促進用医薬品である、項1〜3のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤。

発明の効果

0013

本発明によれば、簡便に生体内でのエクソソームの産生を促進することができる、エクソソーム産生促進剤を提供することができる。また、本発明のエクソソーム産生促進剤は、経口投与、飲食品の形態で投与又は摂取できるので、非侵襲的患者への負担が少なく、容易に生体内でのエクソソーム産生を促進することができる。

図面の簡単な説明

0014

セラミド(Cer)、スフィンゴミエリンSM)、又はグルコシルセラミド(GluCer)を添加した場合の24時間後のエクソソーム粒子数を示すグラフである。
こんにゃくセラミド(kCer)、又はこんにゃくグルコシルセラミド(kGluCer)を、5μM、7.5μM、10μM添加した場合の24時間後のエクソソーム粒子数を示すグラフである。
こんにゃくセラミド(kCer)存在下、こんにゃくグルコシルセラミド(kGluCer)存在下、又はスフィンゴ脂質非存在下で産生されたエクソソームと、アミロイドβタンパク質(Aβ1−40)とをマウスミクログリア細胞に添加し、24時間培養後の培養上清中のアミロイドβタンパク質(Aβ1−40)濃度を測定した結果を示すグラフである。

0015

本発明は、セラミドを有効成分とするエクソソーム産生促進剤である。以下、本発明のエクソソーム産生促進剤について詳述する。

0016

セラミド
本発明のエクソソーム産生促進剤は、セラミドを有効成分として使用する。

0017

セラミドは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造を有する化合物である。本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分の構造については、特に限定されないが、セラミドを構成するスフィンゴイド部分の炭素数としては、18が挙げられる。

0018

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分の構造については、具体的には、例えば4−スフィンゲニンスフィンゴシン)、4−ヒドロキシスフィンガニンフィトスフィンゴシン)、4−ヒドロキシ−トランス−8−スフィンゲニン、4−ヒドロキシ−シス−8−スフィンゲニン、スフィンガニン、トランス−8−スフィンゲニン、シス−8−スフィンゲニン、トランス−4−スフィンゲニン、トランス−4,トランス−8−スフィンガジエニン、トランス−4,シス−8−スフィンガジエニン、シス4−シス8−スフィンガジエニン、シス4−トランス8−スフィンガジエニン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、トランス−4,シス−8−スフィンガジエニン、シス4−シス8−スフィンガジエニン、トランス4−トランス8−スフィンガジエニン、シス4−トランス8−スフィンガジエニン、4−ヒドロキシ−シス−8−スフィンゲニン、4−ヒドロシキ−トランス8−スフィンゲニンが挙げられる。

0019

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸の炭素数については、特に限定されないが、6〜26、好ましくは6〜24、より好ましくは6〜18が挙げられる。また、前記脂肪酸は、飽和脂肪酸炭素炭素二重結合及び/又は炭素−炭素三重結合を含む不飽和脂肪酸、並びにα−ヒドロキシ脂肪酸のいずれであってもよい。

0020

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸として、具体的には、ヘキサン酸(C6:0)、オクタン酸(C8:0)、デカン酸(C10:0)、ドデカン酸(C12:0)、テトラデカン酸(C14:0)、ヘキサデカン酸(C16:0)、オクタデカン酸(C18:0)、イコサン酸(C20:0)、ヘネイコサン酸(C21:0)、ドコサン酸(C22:0)、トリコサン酸(C23:0)、テトラドコサン酸(C24:0)、ペンタコサン酸(C25:0)、ヘキサドコサン酸(C26:0)、ヘプタコサン酸(C27:0)、オクタドコサン酸(28:0)、シス−9−オクタデセン酸(C18:1)等が挙げられる。なお、前記脂肪酸の括弧内に示す表記「CX:Y」において、CXは1分子当たりの炭素数を示し、Yは1分子当たりの不飽和結合の数を示し、例えば「C16:0」とは炭素数16且つ不飽和結合数が0の脂肪酸を表す。これらの脂肪酸の中でも、好ましくはオクタデカン酸、ドコサン酸、イコサン酸が挙げられる。

0021

セラミドは、植物由来動物由来のいずれであってもよいが、安全性がより一層高い点で、植物由来が好ましい。

0022

本発明で使用されるセラミドの由来植物としては、具体的には、アーモンドアオサアオノリアカザ、アカシアアカネアカブドウアカマツ松ヤニ琥珀コーパルを含む。以下マツ類については同じ)、アガリクスアキノノゲシアケビアサガオアザレアアジサイアシタバアズキアスパラガスアセロラアセンヤクアニスアボガド、アマクサアマチャアマチャヅル、アマナツ、アマリリスアルテアアルニカアロエアンジェリカアンズアンコール、アンソッコウ、イグサイザヨイバライチイイチジクイチョウ、イヨカン、イランイラン、ウイキョウウーロン茶ウコンウスベニアオイウツボグサウドウメウラジロガシ温州ミカンエイジツ、エシャロットエゾウコギエニシダエノキタケエルダーフラワーエンドウ、オーキッドオウゴンカン、オオバコオオヒレアザミオオムギオケラオスマンサスオトギリソウオドリコソウ、オニドコロ、オリーブオレガノ、オレンジオレンジピールを含む)、カーネーションカカオカキカキドオシカクテルフルーツ、カッコンカシワカタクリカボチャカミツレカムカム、カモミールカラスウリ、カラマツカラマンリンカリンガルシニアカルダモンカワバンカン、カンペイキイチゴキウイキキョウキャベツケールを含む)、キャラウェイキュウリ、キヨミキンカンギンナングァバクコクズクチナシクミンクランベリークルミグレープフルーツ、クレメンタインクローブクロマツ、クロマメ、クロレラケツメイシゲンノショウココケモモコショウコスモスゴボウコムギ小麦胚芽を含む)、ゴマコマツナ、コメ(米糠を含む)、コリアンダーコンニャクコンニャク芋)(こんにゃくトビ粉を含む)、コンブサーモンベリー、サイプレスザクロサツマ芋、サトサトウキビサトウダイコンサフラン、ザボンサンザシサンショウシイタケシクラメン、シソ、シメジジャガ芋、シャクヤクジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカスイトピースイートスプリングスギナスターアニススターアップルスダチステビアスモモセージサルビア)、セトカ、ゼニアオイセミノール、セロリセンキュウセンブリソバソラマメダイコンダイズ(おからを含む)、ダイダイタイムタケノコタマネギタモギタケタラゴンタロイモタンカンタンゴールタンジン、タンゼロ、タンポポチコリツキミソウ、ツクシツバキツボクサツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキディル、デコポンテンジクアオイ(ゼラニウム)、トウガ、トウガラシトウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシドクダミトコントチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツミ、ナツミカンナツメグナンテンニガウリニガヨモギニラニンジンニンニクネギノコギリソウ、ノコギリヤシノビル、バーベナ、パームパイナップルハイビスカスハコベ、バジルパセリ、ハダカムギ、ハッサクハッカハトムギバナナバナババニラパプリカハマメリスハルカ、ハルミ、ハレヒメ、バンペイユ、ビートピーマンヒガンバナヒシヒジキピスチオヒソップヤナギハッカ)、ヒナギクヒナゲシヒノキヒバ、ヒマシヒマワリ、ヒメノツキ、ヒュガナツ、ビワファレノプシスフェネグリークフキノトウ、ブラックベリープラムブルーベリービルベリーを含む)、プルーン、ブンタン、ヘチマベニバナ、ベニマドンナ、ベラドンナベルガモットホウセンカホウレンソウホオズキボダイジュ、ボタン、ホップホホバポンカン、マイタケマオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マーコットマタタビマリーゴールド、マリヒメ、マンゴーミツバ、ミネオラ、ミモザ、ミョウガミルラムラサキメースメリッサメリロートメロン、メン(綿実油粕を含む)、モヤシヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギユーカリユキノシタユズユリヨクイニン、ヨメナ(アスター)、ヨモギ、ライムライムギライラックラズベリーラッカセイラッキョウリンゴアップルファイバーを含む)、リンドウレイコウ、レイシレタスレモンレンゲソウレンコンローズヒップローズマリーローリエワケギワサビセイヨウワサビを含む)等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、コンニャク、マイタケ、タモギタケ、柑橘類(例えば、温州ミカン、アマナツ、イヨカン、オレンジ、カラマンダリン、キヨミ、ナツミカン、タンゴール、ハッサク、ヒュウガナツ、ブンタン等);更に好ましくはコンニャクが挙げられる。

0023

本発明で使用されるセラミドの由来動物としては、具体的には、ウニヒトデタコイカなどの棘皮動物軟体動物組織のすべてまたは一部、ウマウシなど哺乳動物脳組織および皮膚組織、さらにはヒト、ウシ、ヤギなど哺乳動物の乳およびその発酵物などの加工品などが挙げられる。

0024

セラミドは、前述する由来植物又は動物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、セラミドは、スフィンゴ糖脂質酵素処理物として得られたものであってもよい。また、セラミドは商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。

0025

スフィンゴ糖脂質の酵素処理物としては、前述の由来植物の抽出液、その濃縮液、又は前記濃縮液を精製処理した精製物の酵素処理物などが挙げられる。

0026

スフィンゴ糖脂質は、グルコシルセラミド又はラクトシルセラミド等の、セラミドの第1級アルコール性ヒドロキシ基に糖が結合した糖脂質である。スフィンゴ糖脂質としては、前述したセラミドが得られるのであれば、特に限定されず、セラミドに、グルコースガラクトース、又は糖鎖等、いずれの糖が結合したものであってもよい。スフィンゴ糖脂質は、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、スフィンゴ糖脂質は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。

0027

スフィンゴ糖脂質の酵素処理に使用する酵素としては、スフィンゴ糖脂質の糖鎖−セラミド間の結合を加水分解する酵素であれば特に限定されず、例えば、エンドグリコセラミダーゼ(EGCase)が挙げられる。

0028

EGCaseは、等電点及び分子量が異なる3つの分子種(EGCase I、EGCase II、及びEGCase III)が知られており、分子種に応じて基質特異性が異なることが知られている。使用するEGCaseの分子種は、基質となるスフィンゴ糖脂質の構造に応じて適宜設定すればよい。例えば、スフィンゴ糖脂質として、セレブロシド、特にコンニャク由来のスフィンゴ糖脂質の場合であれば、EGCase Iが好適に使用される。酵素処理の条件は、所望の酵素反応が行われるよう適宜選択するとよい。

0029

前記抽出液の濃縮方法としては、エバポレーターのような減圧濃縮装置を用いた公知の濃縮方法が挙げられる。また精製方法としては、アルカリ処理溶媒分画シリカゲルクトマトグラフィーなどの公知の精製方法が挙げられる。

0030

酵素処理後、酵素処理物そのままを用いてもよいし、酵素処理物を固液分離した残渣、固液分離した残渣を乾燥させたもの、反応物そのままを乾燥させたもの等を用いてもよい。また、酵素処理物を固液分離し、更に水を添加した後、再度固液分離することにより酵素処理物を洗浄して不純物を除去したものでもよい。

0031

本発明のエクソソーム産生促進剤において、セラミドは、1種の構造又は由来のものを単独して使用してもよく、2種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。

0032

本発明のエクソソーム産生促進剤において「セラミドを有効成分とする」とは、エクソソームの産生を促進させる標的細胞に対してセラミドを作用させることを指しており、前記セラミド自体を有効成分として使用することに止まらず、摂取又は投与されて代謝、分解、再合成等を経た後に生体内でセラミドを生成させることによりエクソソームの産生を促進する成分も有効成分として使用できる。例えば、植物由来のセラミドは、ほとんどがグルコシド化された形態で存在するが、グルコシド化されたセラミドの経口摂取であれば、代謝、分解、再合成を経て生体内でセラミドが生成し、標的細胞に対してセラミドを作用させることができるため、本発明のエクソソーム産生促進剤において有効成分として使用できる。具体的には、グルコシド化されたセラミドは、経口摂取すると、小腸で加水分解によりグルコースが遊離し、更にスフィンゴイドと脂肪酸に分解されることがあるが、血中に入るまでにスフィンゴイドと脂肪酸が結合してセラミドに再合成され、当該セラミドが標的細胞に対してエクソソームの産生を促進させることができる。

0033

本発明のエクソソーム産生促進剤におけるセラミドの含有量としては、生体内でエクソソームの産生を促進できる有効量であることを限度として特に限定されず、用途、剤型投与形態等に応じて適宜調整することができる。

0034

その他の添加成
本発明のエクソソーム産生促進剤は、前述したセラミド以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のエクソソーム産生促進剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類ロウ類炭化水素類脂肪酸類高級アルコール類、エステル類植物抽出エキス類、水溶性高分子界面活性剤金属石鹸アルコール多価アルコールpH調整剤酸化防止剤紫外線吸収剤防腐剤香料粉体増粘剤色素キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のエクソソーム産生促進剤の剤型等に応じて適宜設定される。

0035

剤型・製剤形態・用途
本発明のエクソソーム産生促進剤の剤型については、特に限定されず、固体状半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、エクソソーム産生促進剤の種類、用途、投与方法などに応じて適宜設定すればよい。

0036

本発明のエクソソーム産生促進剤の投与方法としては、特に限定されず、適用する疾患の種類に応じて適宜選択すればよく、全身投与であっても、局所投与であってもよい。具体的には、経口、経血管内(動脈内又は静脈内)、経皮経腸、経鼻腔内投与等が挙げられる。経血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。なかでも、投与が容易であり、且つエクソソーム産生促進効果を効果的に奏させるという観点から、経口投与、経血管内投与、鼻腔内投与が好ましい。

0037

本発明のエクソソーム産生促進剤の製剤形態については、特に限定されず、投与方法に適した製剤形態に適宜設定することができ、例えば、錠剤カプセル剤顆粒剤散剤シロップ剤注射剤点滴剤坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができる。例えば、本発明のエクソソーム産生促進剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に限定されないが、具体的には、飲食品及び内服用医薬品が挙げられる。

0038

本発明のエクソソーム産生促進剤を飲食品の製剤形態にする場合、本発明のエクソソーム産生促進剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品栄養補助食品機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に限定されないが、具体的にはカプセル剤(ソフトカプセル剤ハードカプセル剤)、錠剤、顆粒剤、粉剤ゼリー剤リポソーム製剤等のサプリメント;栄養ドリンク果汁飲料炭酸飲料乳酸飲料等の飲料;団子アイスシャーベットグミキャンディー等の嗜好品;等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくは飲料、サプリメント、より好ましくは飲料、カプセル剤が挙げられる。

0039

本発明のエクソソーム産生促進剤を内服用医薬品の製剤形態にする場合、本発明のエクソソーム産生促進剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、ドリンク剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤)、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用の医薬品の中でも、好ましくはカプセル剤、ドリンク剤が挙げられる。

0040

本発明のエクソソーム産生促進剤が飲食品又は内服用医薬品の製剤形態である場合、有効成分であるセラミドの含有量としては、エクソソームの産生が促進される有効量である限り特に限定されず、製剤形態に応じて適宜設定すればよいが、例えば、1〜20質量%等が挙げられ、好ましくは3〜10質量%、より好ましくは6〜8質量%が挙げられる。

0041

本発明のエクソソーム産生促進剤は、エクソソームの産生促進に基づいて、症状が軽減又は改善させる疾患に対して適用することができる。例えば、エクソソームは、アルツハイマー病の発症原因の一つであるアミロイドβタンパク質の蓄積を抑制することができるので、エクソソームの産生を促進すると、アルツハイマー病の発症を抑制したり、症状を軽減したりすることができると考えられる。つまり、本発明のエクソソーム産生促進剤は、アルツハイマー病の発症を抑制したり、症状を軽減したりすることができる。このように本発明のエクソソーム産生促進剤は、アルツハイマー病予防剤としても好適に適用することができる。

0042

また、エクソソームの産生を促進することによって症状が改善され得る他の疾患としては、例えば、パーキンソン病前頭側頭変性症ポリグルタミン病などの神経変性疾患等が挙げられる。

0043

本発明のエクソソーム産生促進剤の適用量としては、特に限定されず、製剤形態、用途、投与対象、期待される効果等に応じて適宜設定するとよい。例えば、本発明のエクソソーム産生促進剤を経口摂取する場合、摂取量としては、セラミド換算量成人日当たり0.6〜10mg、好ましくは0.6〜1.2mgが挙げられる。本発明のエクソソーム産生促進剤は、一日あたりの量が前述の範囲となるように、1回又は数回に分けて投与してもよい。

0044

以上のように、セラミドを含む本発明のエクソソーム産生促進剤は、エクソソームの産生を促進することができる。本発明のエクソソーム産生促進剤は、エクソソームの産生を促進することにより、症状が改善させる疾患の治療又は予防用途に使用することができる。具体的には、例えば、本発明のエクソソーム産生促進剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型変性症、ポリグルタミン病などの神経変性疾患等の予防又は治療用途に使用することができる。

0045

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。

0046

[スフィンゴ脂質の準備・調製]
以下の実験例1〜3において使用したスフィンゴ脂質は、以下の通り準備又は調製した。

0047

動物性セラミド(Cer)として、C6セラミド(d18:1/6:0、N−ヘキサノイル−D−エリスロ−スフィンゴシン)、C18セラミド(d18:1/18:0、N−ステアロイル−D−エリスロ−スフィンゴシン)、C24セラミド(d18:1/24:0、N−リグセロイル−D−エリスロ−スフィンゴシン)、スフィンゴミエリン(SM)として、Avanti Polar Lipids社のC6スフィンゴミエリン(d18:1/6:0、N−hexanoyl−D−erythro−sphingosylphosphorylcholine)、C18スフィンゴミエリン(d18:1/18:0、N−stearoyl−D−erythro−sphingosylphosphorylcholine)、及びC24スフィンゴミエリン(d18:1/24:0、N−lignoceroyl−D−erythro−sphingosylphosphorylcholine)を使用した。これらの動物性セラミドは、いずれも、Avanti Polar Lipids社製の精製脂質である。

0048

スフィンゴミエリン(SM)として、Avanti Polar Lipids社のC6スフィンゴミエリン(d18:1/6:0、N−hexanoyl−D−erythro−sphingosylphosphorylcholine)、C18スフィンゴミエリン(d18:1/18:0、N−stearoyl−D−erythro−sphingosylphosphorylcholine)、及びC24スフィンゴミエリン(d18:1/24:0、N−lignoceroyl−D−erythro−sphingosylphosphorylcholine)を使用した。これらのスフィンゴミエリンは、いずれも、Avanti Polar Lipids社製の精製脂質である。

0049

グルコシルセラミドとして、C18グルコシルセラミド(d18:1/18:0、D−glucosyl−β−1,1’−N−stearoyl−D−erythro−sphingosine)を使用した。当該グルコシルセラミドは、Avanti Polar Lipids社製の精製脂質である。

0050

こんにゃく由来グルコシルセラミド(kGluCer)として、精製脂質(NS170302 Glucosylceramide,from Konjac,純度≧99%(TLC))を使用した。当該こんにゃく由来グルコシルセラミドは、株式会社長良サイエンス製である。

0051

こんにゃく由来セラミド(kCer)は、前記のこんにゃく由来グルコシルセラミドに、Rhodococcus erythropolis由来エンドグリコシダーゼ(EGCase I)を用いて加水分解を行って、グルコースを遊離させ、精製して得たものを使用した。

0052

なお、前記スフィンゴ脂質に関する表記「dw:x/y:z」において、「d」は、1分子当たりのセラミドのスフィンゴイド部分の水酸基の数が2であることを示し、「w:x」は、1分子当たりのセラミドのスフィンゴイド部分の炭素数wと不飽和結合の数xを示し、「y:z」は、脂肪酸部分の炭素数yと不飽和結合の数zを示す。

0053

[実験例1]
1.実験方法
(1)培養細胞へのスフィンゴ脂質処理と培養上清からのエクソソーム回収
培養細胞として、ヒト神経芽細胞腫由来SH−SY5Y細胞を使用した。細胞を、培地(50%Ham’s F12/50%E−MEM)とともに6ウェルプレートに2.5×105cells/wellとなるよう播種し、37℃で24時間培養した後に、前記の動物性セラミド(Cer)、スフィンゴミエリン(SM)、又はグルコシルセラミド(GluCer)のスフィンゴ脂質をそれぞれ各ウェルに添加した。スフィンゴ脂質は、3%ウシ血清アルブミンBSA)を含む血清不含培地(50%Ham’s F12/50%E−MEM)に懸濁し、ウェル中での濃度が10μMとなるように添加した。スフィンゴ脂質の添加量が0μMの場合をコントロールとした。
スフィンゴ脂質を添加して24時間経過後に培養上清(2mL/well)を回収し、その中のエクソソームを回収した。エクソソームの回収には遠心法を用いた。具体的には、回収した培養上清について、2,000g 10分、10,000g 30分、100,000g 70分の段階的な遠心を行い、沈渣としてエクソソームを回収した。

0054

(2)エクソソーム粒子数測定
遠心法で回収したエクソソームを、HEES/KClバッファーに懸濁した後、ナノパーティクルアナライザーqNano(Izon社)で粒子数を測定した。測定値は、BCA法で算出した由来細胞のタンパク質量(mg)当たりの粒子数として表示した。粒子数は、測定を6回行って得られた各値の平均値である。また、得られた値について、One−wayANOVA法による有意差検定(***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05)を行った。

0055

2.実験結果
結果を図1に示す。図1から、セラミドを添加した場合、スフィンゴミエリン又はグルコシルセラミドを添加した場合と比べて、神経細胞株におけるエクソソーム粒子数がコントロールに対して有意に増加することが認められ、セラミドがエクソソームの産生を促進し得ることが確認された。また、セラミドのなかでも、C6セラミド、C18セラミドを添加した場合に、エクソソームの産生がより一層促進されることが確認された。

0056

[実験例2]
1.実験方法
スフィンゴ脂質として、前記コンニャク由来グルコシルセラミド(kGluCer)又はコンニャク由来セラミド(kCer)を使用し、0μM(コントロール)を、5μM、7.5μM、又は10μMの濃度となるようにそれぞれ細胞に添加したこと以外は、前記実験例1と同条件で試験を行い、エクソソーム粒子数を測定した。

0057

2.実験結果
結果を図2に示す。図2から、コンニャク由来グルコシドセラミド(kGluCer)を5〜10μM添加した場合は、コントロールに対してエクソソーム粒子数の増大は認められなかったが、コンニャク由来セラミド(kCer)を5〜10μM添加した場合、コントロールに対してエクソソーム粒子数の増大が認められた。また、コンニャク由来セラミドの添加量に応じて、エクソソーム粒子数が有意に増大することが認められた。これらの結果から、コンニャク由来セラミドは、エクソソームの産生を促進し得ることが確認された。また、セラミドの濃度の増加に伴い、エクソソームの粒子数が増加することが確認された。

0058

[実験例3]
1.実験方法
(1)培養細胞へのスフィンゴ脂質処理と培養上清からのエクソソーム回収
培養細胞として、ヒト神経芽細胞腫由来SH−SY5Y細胞を使用した。細胞を、培地(50%Ham’s F12/50%E−MEM)とともに6ウェルプレートに2.5×105cells/wellとなるよう播種し、37℃で24時間培養した後に、前記コンニャク由来グルコシルセラミド(kGluCer)又はコンニャク由来セラミド(kCer)のスフィンゴ脂質をそれぞれ各ウェルに添加した。スフィンゴ脂質は、3%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む血清不含培地(50%Ham’s F12/50%E−MEM)に懸濁し、添加量が10μMとなるように添加した。スフィンゴ脂質の添加量が0μMの場合についても同様の操作を行った。
スフィンゴ脂質を添加して24時間経過後に培養上清(2mL/well)を回収し、その中のエクソソームを回収した。エクソソームの回収には遠心法を用いた。具体的には、回収した培養上清について、2,000g 10分、10,000g 30分、100,000g 70分の段階的な遠心を行い、沈渣としてエクソソームを回収した。

0059

(2)ミクログリア細胞へのSH−SY5Y細胞由来エクソソームとアミロイドβタンパク質の添加、及び培養液中アミロイドβタンパク質の濃度測定
培養細胞として、マウスミクログリア細胞株BV−2細胞を使用した。培地(RPMI1640)とともに6ウェルプレートに2.5×105cells/wellとなるよう播種し、37℃で24時間培養した後に、前記で得られたSH−SY5Y細胞由来エクソソーム全量(培養上清2mLから回収されたエクソソームの全量)と、最終濃度10μMとなる量のアミロイドβタンパク質(Aβ1−40)を各ウェルに添加した。なお、SH−SY5Y細胞由来エクソソームとアミロイドβタンパク質は、血清不含培地(RPMI 1640)に懸濁又は溶解させて添加した。また、コントロールとして、SH−SY5Y細胞由来エクソソームを添加せずにアミロイドβタンパク質(Aβ1−40)のみを添加した場合についても、同様の操作を行った。
SH−SY5Y細胞由来エクソソームとアミロイドβタンパク質を添加して24時間経過後に培養上清を回収し、培養上清中のアミロイドβタンパク質(Aβ1−40)の濃度をELISA法によって測定した。

実施例

0060

2.実験結果
結果を図3に示す。コンニャク由来グルコシドセラミド存在下で産生されたエクソソームを添加した場合には、スフィンゴ脂質非存在下で産生されたエクソソームを添加した場合に比べて、アミロイドβタンパク質の濃度が約20%も低下していた。即ち、本結果から、コンニャク由来グルコシドセラミドによって生産亢進されたエクソソームであっても、アミロイドβタンパク質との結合能、ミクログリア細胞への反応性を有しており、エクソソームの産生量の増大によりアミロイドβタンパク質の分解能が向上することが確認された。

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