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技術 エピテアフラガリン類を利用したレプチン分泌促進剤

出願人 株式会社ダイセル公立大学法人大阪
発明者 向井克之松山彰収赤川貢
出願日 2017年2月24日 (4年0ヶ月経過) 出願番号 2017-033554
公開日 2018年9月6日 (2年5ヶ月経過) 公開番号 2018-138530
状態 未査定
技術分野 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード アッサムチャ キムタオル OD基 カラム抽出 胃粘膜上皮細胞 遮光条件下 ドリップ抽出 テアフラビン類
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2018年9月6日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (3)

課題

生体内でのレプチン分泌を促進することができるレプチン分泌促進剤の提供。

解決手段

エピテアフラガリン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤。

概要

背景

近年、脂質や糖質の過剰摂取や運動不足等による、肥満の増加が大きな社会問題となっている。肥満は、体内脂肪が過剰に蓄積された状態であり、糖尿病心臓病脳梗塞高血圧等の生活習慣病を引き起こす原因の一つとされる。そのため、肥満を予防・改善することは、これらの生活習慣病の予防・改善にもつながる。

これまでの研究により、抗肥満効果がある成分としていくつか知られている。例えば、エピガロカテキンエピガロカテキンガレート等のカテキン類や、カテキン類が酸化重合した橙赤色のテアフラビン類を含む茶ポリフェノールは、脂肪の合成を抑制し、抗肥満効果があることが報告されている(非特許文献1〜4)。例えば、非特許文献5には、テアフラビン類の紅茶ポリフェノールが、脂質や糖の消化、吸収及び摂取を阻害したり、脂質代謝を促進したり、肥満の病理プロセスを妨害したりことが開示されている。

ところで、レプチンは、脂肪細胞分泌するホルモンであり、主に視床下部受容体を介して摂食抑制やエネルギー消費亢進をもたらし、その作用が不十分であると、肥満症を引き起こすと考えられている。そのため、レプチンの産生・分泌を調整することにより、肥満の予防・改善を期待することができる。

レプチンの産生又は分泌を調整する成分としては、これまでに種々知られている。例えば、特許文献1には、カプサンチンを有効成分とするレプチン産生促進剤が開示されている。また、例えば、特許文献2には、ガンマリノレン酸(γ−リノレン酸)を有効成分として含有するレプチン分泌促進剤が開示されている。

しかしながら、エピテアフラガリン類とレプチンの産生・分泌との関連については、これまで十分には検討されていない。また、エピテアフラガリン類と抗肥満作用について知られていない。

概要

生体内でのレプチンの分泌を促進することができるレプチン分泌促進剤の提供。エピテアフラガリン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤。なし

目的

本発明は、このような技術背景に鑑みて、簡便に、生体内でのレプチンの分泌を促進することができるレプチン分泌促進剤を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

請求項2

エピテアフラガリン類の含有量が0.5質量%超30質量%以下である、請求項1に記載のレプチン分泌促進剤。

請求項3

におけるレプチン分泌促進に使用される、請求項1又は2に記載のレプチン分泌促進剤。

請求項4

レプチン分泌促進用飲食品である、請求項1〜3のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。

請求項5

レプチン分泌促進用医薬品である、請求項1〜3のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。

請求項6

エピテアフラガリン類を有効成分とする抗肥満剤

技術分野

0001

本発明は、レプチン分泌を促進することができる薬剤に関する。

背景技術

0002

近年、脂質や糖質の過剰摂取や運動不足等による、肥満の増加が大きな社会問題となっている。肥満は、体内脂肪が過剰に蓄積された状態であり、糖尿病心臓病脳梗塞高血圧等の生活習慣病を引き起こす原因の一つとされる。そのため、肥満を予防・改善することは、これらの生活習慣病の予防・改善にもつながる。

0003

これまでの研究により、抗肥満効果がある成分としていくつか知られている。例えば、エピガロカテキンエピガロカテキンガレート等のカテキン類や、カテキン類が酸化重合した橙赤色のテアフラビン類を含む茶ポリフェノールは、脂肪の合成を抑制し、抗肥満効果があることが報告されている(非特許文献1〜4)。例えば、非特許文献5には、テアフラビン類の紅茶ポリフェノールが、脂質や糖の消化、吸収及び摂取を阻害したり、脂質代謝を促進したり、肥満の病理プロセスを妨害したりことが開示されている。

0004

ところで、レプチンは、脂肪細胞が分泌するホルモンであり、主に視床下部受容体を介して摂食抑制やエネルギー消費亢進をもたらし、その作用が不十分であると、肥満症を引き起こすと考えられている。そのため、レプチンの産生・分泌を調整することにより、肥満の予防・改善を期待することができる。

0005

レプチンの産生又は分泌を調整する成分としては、これまでに種々知られている。例えば、特許文献1には、カプサンチンを有効成分とするレプチン産生促進剤が開示されている。また、例えば、特許文献2には、ガンマリノレン酸(γ−リノレン酸)を有効成分として含有するレプチン分泌促進剤が開示されている。

0006

しかしながら、エピテアフラガリン類とレプチンの産生・分泌との関連については、これまで十分には検討されていない。また、エピテアフラガリン類と抗肥満作用について知られていない。

0007

特開2011−51912号公報
特開2015−205846号公報

先行技術

0008

Jen−Kun Linら、Mol. Nutr. Food Res., 2006, vol.50, pp211−217
Navamayooran Thavanesan, British Journal of Nutrition, (2011), 106, 1297−1309
Tia M.Rainsら、Journal of Nutritional Biochemistry,22(2011)1−7
Takuji Suzukiら、Molecules,2016,21,1305
Haibo Panら、Molecules, 2016, 21, 1659

発明が解決しようとする課題

0009

本発明は、このような技術背景に鑑みて、簡便に、生体内でのレプチンの分泌を促進することができるレプチン分泌促進剤を提供することを課題とする。また、新たな抗肥満剤を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0010

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、エピテアフラガリン類が、レプチンの分泌を促進しうることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。

0011

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項1.エピテアフラガリン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤。
項2. エピテアフラガリン類の含有量が0.5質量%超30質量%以下である、項1に記載のレプチン分泌促進剤。
項3.におけるレプチンの分泌促進に使用される、項1又は2に記載のレプチン分泌促進剤。
項4. レプチン分泌促進用飲食品である、項1〜3のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項5. レプチン分泌促進用医薬品である、項1〜3のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項6. エピテアフラガリン類を有効成分とする抗肥満剤。

発明の効果

0012

本発明によれば、簡便に生体内でのレプチンの分泌を促進することができる、レプチン分泌促進剤を提供することができる。本発明のレプチン分泌促進剤は、経口投与、飲食品の形態で投与又は摂取できるので、非侵襲的患者への負担が少なく、容易に生体内でのレプチン分泌を促進することができる。

図面の簡単な説明

0013

実験例1の実験結果を表すグラフである。
実験例2の実験結果を表すグラフである。
実験例3の実験結果を表すグラフである。

0014

本発明は、エピテアフラガリン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤である。以下、本発明のレプチン分泌促進剤について詳述する。

0015

1.レプチン分泌促進剤
本発明のレプチン分泌促進剤は、エピテアフラガリン類を有効成分とすることを特徴とする。

0016

エピテアフラガリン類
本発明において、エピテアフラガリン類とは、下記の化学式(1)で表される化合物及び当該化合物と同じ骨格を有する類縁体である。本発明においてエピテアフラガリン類としては、具体的には、下記の化学式(1)で表されるエピテアフラガリン、下記の化学式(2)で表されるエピテアフラガリン3−O−ガレートが挙げられる。本発明におけるエピテアフラガリン類としては、これらの化合物のうち1種を含むものであってもよいし、2種を含むものであってもよい。

0017

0018

本発明におけるエピテアフラガリン類としては、特に制限はなく、化学合成したものであってもよいし、等の天然物由来の材料から抽出や精製等したもの又はそれらの酵素反応物であってもよい。また、エピテアフラガリン類は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。

0019

本発明におけるエピテアフラガリン類としては、茶カテキン類の酵素反応物であってもよい。例えば、茶カテキン類を没食子酸の存在下でポリフェノールオキシダーゼで酸化させることによりエピテアフラガリン類を得ることができる。具体的には、例えば、エピガロカテキンをエピテアフラガリンに変換することができ、エピガロカテキンガレートをエピテアフラガリン3−O−ガレートに変換することができる。ポリフェノールオキシダーゼとしては、エピガロカテキンをエピテアフラガリンに変換することができ、エピガロカテキンガレートをエピテアフラガリン3−O−ガレートに変換することができる酵素であれば特に制限されないが、具体的には、例えば、ラッカーゼチロシナーゼ等が挙げられる。

0020

茶カテキン類は、茶抽出物であってもよい。茶としては、緑茶発酵茶が挙げられる。緑茶としては、Camellia属、例えば、C.sinensis(チャノキ)、C.assamica(アッサムチャ)及びそれらの雑種から選択される茶葉から製茶された緑茶、又は緑茶を発酵したウーロン茶紅茶の茶葉が挙げられる。茶抽出物は、茶(茶葉)から熱水エタノール等の水溶性有機溶媒、又は水溶性有機溶媒と水との混合物を用いて、ニーダー抽出、カラム抽出ドリップ抽出等の公知の抽出手段により得ることができる。得られた茶抽出物は必要に応じて、公知の方法により濃縮又は精製を行ってもよい。

0021

本発明のレプチン分泌促進剤におけるエピテアフラガリン類の含有量としては、特に限定されず、用途、剤型投与形態等に応じて適宜調整することができるが、一般に0.5質量%超30質量%以下、好ましくは1〜30質量%、より好ましくは3〜30質量%、更に好ましくは5〜30質量%が挙げられる。

0022

加成
本発明のレプチン分泌促進剤は、前述したエピテアフラガリン類以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のレプチン分泌促進剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類ロウ類炭化水素類脂肪酸類高級アルコール類、エステル類植物抽出エキス類、水溶性高分子界面活性剤金属石鹸アルコール多価アルコールpH調整剤酸化防止剤紫外線吸収剤防腐剤香料粉体増粘剤色素キレート剤等が挙げられる。これらの添加成分は、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のレプチン分泌促進剤の剤型等に応じて適宜設定される。

0023

剤型・製剤形態・用途
本発明のレプチン分泌促進剤の剤型については、特に限定されず、固体状半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、レプチン分泌促進剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。

0024

本発明のレプチン分泌促進剤の投与方法としては、特に限定されず、適用する疾患の種類に応じて適宜選択すればよく、全身投与であっても、局所投与であってもよい。具体的には、経口、経血管内(動脈内又は静脈内)、経皮経腸、経経鼻投与等が挙げられる。経血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。なかでも、投与が容易な点で、経口投与が好ましい。

0025

本発明のレプチン分泌促進剤の製剤形態については、特に限定されず、投与方法に適した製剤形態に適宜設定することができ、例えば、錠剤カプセル剤顆粒剤散剤シロップ剤注射剤点滴剤坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができる。例えば、本発明のレプチン分泌促進剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、飲食品及び内服用医薬品が挙げられる。また、本発明の分泌促進剤は液体に溶解した形態が好ましい。

0026

本発明のレプチン分泌促進剤を飲食品の製剤形態にする場合、本発明のレプチン分泌促進剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品栄養補助食品機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的にはカプセル剤(ソフトカプセル剤ハードカプセル剤)、錠剤、顆粒剤、粉剤ゼリー剤リポソーム製剤等のサプリメント;栄養ドリンク果汁飲料炭酸飲料乳酸飲料等の飲料;団子アイスシャーベットグミキャンディー等の嗜好品;等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくは飲料、サプリメント、より好ましくは飲料、カプセル剤、更に好ましくは飲料、ソフトカプセル剤、特に好ましくは飲料が挙げられる。

0027

本発明のレプチン分泌促進剤を内服用医薬品の製剤形態にする場合、本発明のレプチン分泌促進剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、ドリンク剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤)、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用の医薬品の中でも、好ましくは有効成分が液体に溶解した形態が挙げられ、より好ましくはドリンク剤、ソフトカプセル剤、シロップ剤、更に好ましくはドリンク剤が挙げられる。

0028

本発明のレプチン分泌促進剤が飲食品又は内服用医薬品の製剤形態である場合、有効成分であるエピテアフラガリン類としては、レプチンの分泌が促進される限り特に制限されず、製剤形態に応じて適宜設定すればよいが、例えば、0.5質量%超30質量%以下が挙げられ、好ましくは1〜30質量%、より好ましくは3〜30質量%、より好ましくは5〜30質量%が挙げられる。

0029

本発明のレプチン分泌促進剤は、レプチンの分泌促進に基づいて、症状が軽減又は改善させる疾患に対して適用することができる。例えば、レプチンは、主に視床下部の受容体を介して摂食抑制やエネルギー消費亢進をもたらすので、レプチンの分泌を促進すると、過剰摂食や消費エネルギー不足で起こる肥満を予防又は治療することができると考えられる。そのため、本発明のレプチン分泌促進剤は、肥満の予防又は治療用途に適用することができる。

0030

レプチンは、食欲抑制体重減少(肥満抑制)、血液中脂質量の減少、酸素消費量活動性増進血糖値インスリン分泌の低下、脂肪組織重量肝臓重量の減少、動脈血栓の防止、高血圧の低下、胆石の防止等の作用を有する。そのため、本発明のレプチン分泌促進剤は、それらの作用が促進されることで症状が軽減又は改善される疾患に対して適用することができる。それらの作用が促進されることにより症状が軽減又は改善される疾患としては、前記の肥満以外に、例えば、高血圧症、糖尿病、高脂血症、脳卒中、心筋梗塞、脳梗塞、脂肪肝変形性膝関節症胆石症、脂肪委縮症等が挙げられる。

0031

本発明のレプチン分泌促進剤は、脂肪組織が分泌するレプチンの分泌を促進するのであれば、特に制限されないが、なかでも胃におけるレプチンの分泌促進に使用されるのが好ましい。

0032

本発明のレプチン分泌促進剤の摂取量については、特に制限されず、製品形態、用法等に応じて適宜設定するとよい。

0033

以上のように、エピテアフラガリン類を含む本発明のレプチン分泌促進剤は、体内でのレプチンの分泌を促進することができる。本発明のレプチン分泌促進剤は、レプチンの分泌を促進することにより、症状が改善させる疾患の治療又は予防用途に使用することができる。具体的には、本発明のレプチン分泌促進剤は、肥満、高血圧、糖尿病、高脂血症、脳卒中、心筋梗塞、脳梗塞、脂肪肝、変形性膝関節症、胆石症、脂肪委縮症等の予防又は治療用途に使用することができる。

0034

2.抗肥満剤
本発明の抗肥満剤は、エピテアフラガリン類を有効成分とすることを特徴とする。エピテアフラガリン類は、「1.レプチン分泌促進剤」の欄に記載のように、レプチンの分泌を促進することができる。そのため、本発明の抗肥満剤は、優れた抗肥満作用を有する。
有効成分であるエピテアフラガリン類、本発明の抗肥満剤に適用可能なその他の成分、製剤形態、投与形態、用法については、「1.レプチン分泌促進剤」の欄の記載と同様のものが挙げられる。

0035

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。

0036

実験例1
細胞処理方法
48ウェル細胞培養プレートに、正常ラット胃粘膜上皮細胞株RGM1細胞(理化学研究所バイオリソースセンター)を10%FBSDMEM/Ham’s F12培地(以下、「培地」と表記する。)で培養し、細胞が80〜90%コンフルエントになったところで、培地をFBS−free DMEM/Ham’s F12培地(以下、「無血清培地」と表記する。)に交換し、一晩培養した。一晩培養後に無血清培地を除去し、さらに200μLの無血清培地を添加した。
エピテアフラガリン類と無血清培地を混合して、エピテアフラガリン類の濃度が10μMの混合溶液を調製した。培養プレート中の培地をアスピレーターで除去し、速やかに前記混合溶液200μLを培養プレートに添加し、30分間CO2インキュベーター内(37℃)で培養した。また、前記混合溶液200μLを、細胞を播種していない培養プレートに添加し、30分間、CO2インキュベーター内(37℃)でインキュベートした。培地を180μLエッペン回収し、200×gで3分間遠心分離を行い、上清サンプルとした。なお、回収後はエッペンを上で保管した。
エピテアフラガリン類としては、エピテアフラガリン(ETFG)、エピテアフラガリン3−O−ガレート(ETFGg)を使用した。

0037

上記で処理したRGM1細胞について、下記に示すELISA法により、レプチンの分泌量を測定した。

0038

<ELISA法>
測定の前日に、100μg/mLのCapture antibodyをPBSで100倍希釈し、ELISAプレート(3801−096、IWAKI)の各ウェルに100μL加えた。そして、プレートラップ梱包して4℃、遮光条件下で一晩インキュベートした。溶液を除去し、Wash bufferを各ウェル300μLずつ添加して洗浄を行った(4回)。最後の洗浄が終わったら、キムタオル商品名、日本製紙クレシア株式会社)にELISAプレートを軽く叩きつけて液をよく切った。各ウェルにBlock bufferを300μL加え4℃で少なくとも1時間インキュベートし、洗浄を4回行い、液をよく切った。サンプルとレプチンスタンダード(leptinを無血清培地で0から2.0ng/mLとなるように希釈)を各ウェルに100μL加え、4℃で少なくとも2時間インキュベートした。洗浄を4回行い、液をよく切った。100μg/mLのDetection antibodyをDiluentで100倍希釈し、各ウェルに100μL加え、4℃で少なくとも2時間インキュベートした。洗浄を4回行い、液をよく切った。11mLのDiluentにAvidin−HRPを5.5μL(1:2,000)加え希釈し、各ウェルに100μL加え4℃で30分インキュベートした。洗浄を4回行い、液をよく切った。そして、ELISAOD基質TMBキット発色試薬基質溶液を等量ずつ混合し、各ウェルに100μL添加し観察した。十分発色したら各ウェルに反応停止薬として1MのH2SO4を50μL添加し、450nmの吸光度を、マイクロプレートリーダーサンライズリモート、TECAN社製)を使用して測定した。

0039

なお、上記で使用した試薬は、具体的には下記のとおりである。
Capture antibody、Detection antibody、Leptin、Avidin−HRP(Leptin, MurineELISADevelopment Kit (900−K76)(Peprotech))
発色試薬、基質溶液(ELISA POD基質TMBキット(Popular)(ナカライテスク))
Wash buffer (0.05%Tween−20 inPBS)
Globulin free bovine serum albumin (globulin freeBSA)(EIARIAgrade)(ナカライテスク)
Block buffer (1% globulin free BSA in PBS)
Diluent (0.05%Tween−20, 0.1%globulin free BSA in PBS)
DMEM/Ham’s F 12培地(ナカライテスク)
ペニシリンストレプトマイシン混合溶液(ペニシリン 10,000 u/mL、ストレプトマイシン 10,000μg/mL含有) (ナカライテスク)
Fetal bovine serum (FBS) (Sigma−Aldrich)

0040

結果を図1に示す。図1は、エピテアフラガリン(ETFG)、エピテアフラガリン3−O−ガレート(ETFGg)をそれぞれ10μMの濃度で細胞を30分間処理した場合の細胞のレプチン分泌量を示す。図1から、ETFG、ETFGgを添加した場合、RGM細胞においてレプチンの分泌が認められた。

0041

実験例2
CytotoxicityLDHAssay Kit−WST(株式会社同仁化学研究所)を使用し、そのプロトコルに従って、エピテアフラガリン類による細胞の膜傷害膜透過性)を評価した。細胞として、前記RGM1細胞を使用した。培地として、前記DMEM/Ham’s F12培地(ナカライテスク)を使用した。具体的には、上記キットのプロトコルに従って、細胞数の最適化を行い、細胞膜傷害試験を行った。

0042

細胞膜傷害試験は、具体的には、下記のとおりに行った。すなわち、平底96ウェル細胞培養プレートに、正常ラット胃粘膜上皮細胞株RGM1細胞(理化学研究所バイオリソースセンター)を10%FBSDMEM/Ham’s F12培地(以下、「培地」と表記する。)で培養し、細胞が80〜90%コンフルエントになったところで、培地をFBS−free DMEM/Ham’s F−12培地(以下、「無血清培地」と表記する。)に交換し、一晩培養した。一晩培養後に無血清培地を除去し、さらに100μLの無血清培地を添加した。無血清培地で0、5、10又は25μMの濃度に調整したエピテアフラガリン類溶液100μLを前記細胞懸濁液に添加し、37℃で60分間、CO2インキュベーション内でインキュベーションした。次いで、高コントロールウェルに無血清培地90μLとLysis Buffer 10μLを加え、37℃、30分間CO2インキュベーター内でインキュベーションした。各ウェルにWorking Solution 100μL加え、遮光下、室温で30分間呈色反応を行った。そして、全てのウェルにStop Solution 50μLを加え、プレートリーダーを用いて490nmの吸光度を測定した。上記キットのプロトコルに従って、エピテアフラガリン類と各コントロールの吸光度からバックグランドコントロールの吸光度を引いた値を用いて細胞傷害性(%)を算出した(3重測定の平均値)。Lysis Bufferを添加した高コントロールウェルの値を100%とした。

0043

結果を図2に示す。図2は、エピテアフラガリン類の濃度の違いによる細胞傷害率を示すグラフである。図2から、エピテアフラガリン類は細胞傷害性が低く、5〜25μMの濃度範囲では、Vehicle(DMSO)処理と比較して同等またはそれ以下の細胞傷害性であった。図2よりエピテアフラガリン類が刺激するRGM1細胞からのレプチンの分泌は、細胞膜傷害に起因しないことが確認された。

0044

実験例3
Cell Count ReagentSF(ナカライテスク)のキットを使用して、そのプロトコルに従って、エピテアフラガリン類による細胞毒性を評価した。細胞として、前記RGM1細胞を使用した。培地として、前記DMEM/Ham’s F12培地(ナカライテスク)を使用した。具体的には、上記キットのプロトコルに従って、細胞増殖アッセイを行い、細胞毒性試験を行った。

0045

細胞毒性試験は、具体的には、下記のとおりに行った。すなわち、対数増殖期にある細胞を5000cell/wellの濃度になるよう計数し、平底96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに100μLずつ播いた。これをCO2インキュベーター内で24時間前培養した。次いで、0、5、10又は25μMの濃度となるようFBS−freeDMEM/Ham’s F−12培地で調整したエピテアフラガリン類を各ウェルに10μLずつ添加し、CO2インキュベーターで1時間培養した。培地を10%FBS DMEM/Ham’s F12培地に交換後にCO2インキュベーター内で24時間前培養した。そして、上記キットの試薬を各ウェルに10μLずつ添加し、CO2インキュベーター内で1〜4時間呈色反応を行った後、マイクロプレートリーダー(製品名サンライズリモート、TECAN社製)を用い、450nmの吸光度を測定し、細胞生存率(%)を測定した(5重測定の平均値)。得られたデータについて、Dunnett検定を行った。

実施例

0046

結果を図3に示す。図3は、エピテアフラガリン類の濃度の違いによる細胞生存率(%)を示すグラフである。図3から、いずれのエピテアフラガリン類についても、5〜25μMの濃度範囲において有意な細胞毒性は認められなかった。

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