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技術 診断及び治療のためのエクソソームにおけるmiRNAバイオジェネシス

出願人 ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システムベスイスラエルデアコネスメディカルセンター,インコーポレイテッド
発明者 ラグフカルリソニアメロ
出願日 2018年6月6日 (1年3ヶ月経過) 出願番号 2018-108450
公開日 2018年9月6日 (1年0ヶ月経過) 公開番号 2018-138057
状態 未査定
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 生物学的材料の調査,分析 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 部分サイクル データ保存デバイス スペクトルシグネチャ 相関グラフ 原子間力顕微鏡画像 誤差変動 立方体形 実験スペクトル
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図面 (20)

課題

診断及び治療のためのエクソソームにおけるmiRNAバイオジェネシスを提供すること。

解決手段

miRNA及びその前駆体を含むエクソソームの使用による癌の診断及び処置方法。例えば幾つかの態様において、癌は、対象から得た試料中のエクソソームのmiRNA量を決定することにより、又はエクソソームにおけるmiRNAプロセシングを検出することにより、診断又は評価されてもよい。癌細胞により分泌されたエクソソームは、非癌性エクソソームと比較して独特であり、該癌性エクソソームは、miRNA及び活性RNAプロセシングRISC複合体の独特のレパートリーを含む。そのようなカプセル化されたRNA−RISC複合体は、標的細胞において細胞非依存性のmiRNAバイオジェネシス及び高効率のmRNAサイレンシングに利用される可能性もある。

概要

背景

全ての細胞は、増殖因子サイトカインホルモンケモカイン膜結合タンパク質及び脂質などの多くの異なる経路により周囲環境コミュニケートしている。エクソソームは、そのようなコミュニケーションを媒介することが可能であり、長い距離にわたりこれを実行する(Mathivanan et al., 2010; Kahlert and Kalluri, 2013)。エクソソームを介したコミュニケーションは、増殖因子/サイトカイン/ケモカイン/ホルモンの安定性及び拡散に関連する限界を克服する可能性がある(Mathivanan et al., 2010)。エクソソームは、30〜140nmサイズのナノ小胞体であり、脂質二重層により保護されたタンパク質mRNA及びマイクロRNA(miRNA)を含む(Cocucci et al.,
2009; Simons and Raposo, 2009; Simpson et al., 2008; Thery et al., 2002)。近年行われた複数の研究により、エクソソームが癌細胞幹細胞免疫細胞及び神経細胞をはじめとする複数の細胞型により分泌されることが実証された(Simpson et al., 2008; Thery, 2001)。癌細胞が、正常細胞よりも多くのエクソソームを分泌することも、認められている(Taylor and Gercel−Taylor, 2011)。さらにエクソソームは、正常な対象に比較して癌患者循環において増加するが(Logozzi et al., 2009; Taylor and Gercel−Taylor, 2008)、機能的役割は依然として不明である。エクソソームが癌の進行及び転移において重要な役割を担う可能性が、近年のエビデンスから示唆される(Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Yang et al., 2011)。

エクソソームが細胞間のRNA及びmiRNAの輸送を媒介するという着想は、体内での細胞間コミュニケーションの複雑さをさらに増大させた。RNAiは、遺伝子の発現及び活性の制御に参画する生存細胞内の自然な生物学的プロセスである。細胞外miRNAは、最初、エクソソームの内部だけに含まれると考えられていた(Valadi et al., 2007)。それ以後、複数の報告で、アポトーシス小体(Zernecke
et al., 2009)、高比重及び低比重リポタンパク質(Vickers et al., 2011)(HDL/LDL)、マイクロ小胞体と称されるAGO2に関連する大きな細胞外小胞体(Arroyo et al., 2011; Li et al., 2012; Turchinovich et al., 2011)におけるmiRNAの存在が確認された。しかし近年の報告から、ヒト血清及び唾液中で検出された大部分のmiRNAが、主にエクソソーム中に豊富であることが示唆されている(Gallo et al., 2012)。エクソソーム中のmiRNAの存在は、細胞の遺伝子発現を離れた部位で調節する可能性を示している(Guescini et al., 2010; Valadi et al., 2007; Mittelbrunn et al., 2011; van Balkom et al., 2013)。miRNAは、mRNA翻訳の調節を介して、遺伝子の全組み合わせの発現を調和させ、生物体トランスクリプトームを形成する(Bartel, 2009)。

miRNAは、多くの異なる細胞型に由来するエクソソーム中に豊富に存在する(Valadi et al., 2007)。それらは、遺伝子発現を転写後に制御する、18〜24ヌクレオチド(nt)長の低分子非コード化RNAである。それらは、ドローシャ及びダイサーエンドヌクレアーゼの連続作用により合成され、mRNAをターゲットとするRISC(RNA誘導サイレンシング複合体)に取り込まれる(Bartel, 2009; Maniataki and Mourelatos, 2005)。ダイサーノックアウトマウスにおいては、miRNA生合成が不能であり、胚幹細胞増殖及び分化欠損により死に至る(Bernstein et al., 2003; Fukagawa et al., 2004)。

マイクロRNAは、配列特異的相互作用及びmiRNAが会合したRISC(ダイサー、TRBP及びAGO2タンパク質で構成)とターゲットmRNAとの対合により機能する(Bartel, 2009)。この作用は、結果として翻訳を阻害し、そして/又はmRNA不安定化誘起する(Filipowicz, 2005)。miRNA及びそのmRNAターゲットの相補性度合いが、mRNA不安定化/分解又は翻訳阻害のいずれかを介して、mRNAサイレンシングの工程を決定づける(Ambros, 2004; Bartel, 2009)。完全な相補性が、miRNAとターゲットmRNA配列の間に成立すれば、RISC複合体は、分離のために結合されたmRNAを切断するように作用する(Ambros, 2004; Bartel, 2009)。絶対的な相補性が成立しなければ、動物細胞内のmiRNAのほとんどの例と同様に、翻訳が阻害されて、遺伝子サイレンシングに至る(Ambros, 2004; Bartel, 2009)。

miRNAが機能的で、効率的miRNA媒介遺伝子サイレンシングを実現するためには、miRNAが、RLC(RISCローディングコンプレックス)タンパク質であるダイサー、TRBP及びAGO2と共に複合体化しなければならない。RLCのうち、ダイサー及びTRBPは、エクスポーティン−5を介して核から出現した後に前駆体miRNAをプロセシングしてmiRNAを生成し、AGO2と会合する必要がある。成熟miRNAと結合したAGO2は、最小のRISCを構成し、続いてダイサー及びTRBPから解離され得る(Chendrimada et al., 2005; Gregory
et al., 2005; Haase et al., 2005; MacRae et al., 2008; Maniataki and Mourelatos, 2005; Melo et al., 2009)。一本鎖miRNAが単独でRISCに組み込まれることは非常に少なく、それゆえ転写後調節のためにターゲットmRNAに効率的に誘導することはできない(Tang, 2005; Thomson et al., 2013)。

合成siRNA(二本鎖)は、ターゲットmRNAとの完璧な塩基対合を通してmRNA崩壊を誘起する(Ambros, 2004; Bartel, 2009)。そのようなsiRNAは、RISCタンパク質であるダイサー、TRBP及びAGO2に直接取り込まれる(Tang, 2005)。一本鎖miRNAは、RISCに組み込むことができず、それゆえ翻訳阻害又は分解のためにターゲットmRNAに誘導することができない(Tang, 2005)。
幾つかの報告により、エクソソーム中に含まれるmiRNAが標的細胞内での遺伝子発現に影響を及ぼし得ることが示唆されたが(Ismail et al., 2013;
Kogure et al., 2011; Kosaka et al., 2013; Narayanan et al., 2013; Pegtel et al., 2010; Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010)、これらのmiRNAが適切なmRNA認識及び効率的翻訳停止のためにpre−miRNAとしてRISCに組み込まれない場合、mRNAをサイレンシングする際にこれらmiRNAがどれほど効率的であるか、という疑問が依然として残る。成熟miRNA(一本鎖)は、標的細胞のRISCと会合できないが、エクソソームのpre−miRNAは、標的細胞のRISCタンパク質を組み入れることにより遺伝子サイレンシングをある程度は誘導し得る。それにもかかわらず、そのようなプロセスは、標的細胞のmiRNAバイオジェネシス経路に関与するタンパク質の潜在的飽和状態により、非常に非効率的で緩やかである。近年の報告から、HIV−1感染細胞細胞培養上清及びHIV患者血清のエクソソーム中のドローシャ及びダイサーの存在が示された(Narayanan et al., 2013)。加えて、別の研究で、後期エンドソーム/MVB(多小胞体)内のダイサー、TRBP及びAGO2の共画分(co−fractionation)が示された(Shen et al., 2013)。

概要

診断及び治療のためのエクソソームにおけるmiRNAバイオジェネシスを提供すること。miRNA及びその前駆体を含むエクソソームの使用による癌の診断及び処置方法。例えば幾つかの態様において、癌は、対象から得た試料中のエクソソームのmiRNA量を決定することにより、又はエクソソームにおけるmiRNAプロセシングを検出することにより、診断又は評価されてもよい。癌細胞により分泌されたエクソソームは、非癌性エクソソームと比較して独特であり、該癌性エクソソームは、miRNA及び活性RNAプロセシングRISC複合体の独特のレパートリーを含む。そのようなカプセル化されたRNA−RISC複合体は、標的細胞において細胞非依存性のmiRNAバイオジェネシス及び高効率のmRNAサイレンシングに利用される可能性もある。なし

目的

一実施形態において、本開示は、対象における癌バイオマーカ検出方法であって、(a)該対象から生物学的試料を得ること;(b)(i)該試料のエクソソーム画分中の表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)該試料のエクソソーム画分中のRISCタンパク質、又は(iv)該試料のエクソソーム画分中のmiRNAプロセシング活性(例えば、一次miRNA及び/又は前駆体miRNAプロセシング活性)、のいずれかのレベルを測定すること;並びに(c)前記miRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性の測定レベルに基づき、癌バイオマーカを有する又は有さない対象を同定すること、を含む該方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

本出願は、内容全体が参照により本明細書に取り込まれる、2013年3月15日出願の米国特許仮出願第61/791,301号の優先権の利益を主張するものである。

0002

本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号EB003472、EB006462、CA135444、CA125550、CA155370、CA151925、DK081576、及びDK055001、並びに米国国立科学財団により授与された助成金番号EFRI−1240410、CBET−0922876、及びCBET−1144025に下に、米国政府援助を受けてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。

0003

本発明は、一般に、分子生物学腫瘍学及び医薬品の分野に関する。より詳細には本発明は、特有エクソソーム量による癌の検出方法及び阻害性RNA療法を向上させる方法に関係する。

背景技術

0004

全ての細胞は、増殖因子サイトカインホルモンケモカイン膜結合タンパク質及び脂質などの多くの異なる経路により周囲環境コミュニケートしている。エクソソームは、そのようなコミュニケーションを媒介することが可能であり、長い距離にわたりこれを実行する(Mathivanan et al., 2010; Kahlert and Kalluri, 2013)。エクソソームを介したコミュニケーションは、増殖因子/サイトカイン/ケモカイン/ホルモンの安定性及び拡散に関連する限界を克服する可能性がある(Mathivanan et al., 2010)。エクソソームは、30〜140nmサイズのナノ小胞体であり、脂質二重層により保護されたタンパク質mRNA及びマイクロRNA(miRNA)を含む(Cocucci et al.,
2009; Simons and Raposo, 2009; Simpson et al., 2008; Thery et al., 2002)。近年行われた複数の研究により、エクソソームが癌細胞幹細胞免疫細胞及び神経細胞をはじめとする複数の細胞型により分泌されることが実証された(Simpson et al., 2008; Thery, 2001)。癌細胞が、正常細胞よりも多くのエクソソームを分泌することも、認められている(Taylor and Gercel−Taylor, 2011)。さらにエクソソームは、正常な対象に比較して癌患者循環において増加するが(Logozzi et al., 2009; Taylor and Gercel−Taylor, 2008)、機能的役割は依然として不明である。エクソソームが癌の進行及び転移において重要な役割を担う可能性が、近年のエビデンスから示唆される(Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Yang et al., 2011)。

0005

エクソソームが細胞間のRNA及びmiRNAの輸送を媒介するという着想は、体内での細胞間コミュニケーションの複雑さをさらに増大させた。RNAiは、遺伝子の発現及び活性の制御に参画する生存細胞内の自然な生物学的プロセスである。細胞外miRNAは、最初、エクソソームの内部だけに含まれると考えられていた(Valadi et al., 2007)。それ以後、複数の報告で、アポトーシス小体(Zernecke
et al., 2009)、高比重及び低比重リポタンパク質(Vickers et al., 2011)(HDL/LDL)、マイクロ小胞体と称されるAGO2に関連する大きな細胞外小胞体(Arroyo et al., 2011; Li et al., 2012; Turchinovich et al., 2011)におけるmiRNAの存在が確認された。しかし近年の報告から、ヒト血清及び唾液中で検出された大部分のmiRNAが、主にエクソソーム中に豊富であることが示唆されている(Gallo et al., 2012)。エクソソーム中のmiRNAの存在は、細胞の遺伝子発現を離れた部位で調節する可能性を示している(Guescini et al., 2010; Valadi et al., 2007; Mittelbrunn et al., 2011; van Balkom et al., 2013)。miRNAは、mRNA翻訳の調節を介して、遺伝子の全組み合わせの発現を調和させ、生物体トランスクリプトームを形成する(Bartel, 2009)。

0006

miRNAは、多くの異なる細胞型に由来するエクソソーム中に豊富に存在する(Valadi et al., 2007)。それらは、遺伝子発現を転写後に制御する、18〜24ヌクレオチド(nt)長の低分子非コード化RNAである。それらは、ドローシャ及びダイサーエンドヌクレアーゼの連続作用により合成され、mRNAをターゲットとするRISC(RNA誘導サイレンシング複合体)に取り込まれる(Bartel, 2009; Maniataki and Mourelatos, 2005)。ダイサーノックアウトマウスにおいては、miRNA生合成が不能であり、胚幹細胞増殖及び分化欠損により死に至る(Bernstein et al., 2003; Fukagawa et al., 2004)。

0007

マイクロRNAは、配列特異的相互作用及びmiRNAが会合したRISC(ダイサー、TRBP及びAGO2タンパク質で構成)とターゲットmRNAとの対合により機能する(Bartel, 2009)。この作用は、結果として翻訳を阻害し、そして/又はmRNA不安定化誘起する(Filipowicz, 2005)。miRNA及びそのmRNAターゲットの相補性度合いが、mRNA不安定化/分解又は翻訳阻害のいずれかを介して、mRNAサイレンシングの工程を決定づける(Ambros, 2004; Bartel, 2009)。完全な相補性が、miRNAとターゲットmRNA配列の間に成立すれば、RISC複合体は、分離のために結合されたmRNAを切断するように作用する(Ambros, 2004; Bartel, 2009)。絶対的な相補性が成立しなければ、動物細胞内のmiRNAのほとんどの例と同様に、翻訳が阻害されて、遺伝子サイレンシングに至る(Ambros, 2004; Bartel, 2009)。

0008

miRNAが機能的で、効率的miRNA媒介遺伝子サイレンシングを実現するためには、miRNAが、RLC(RISCローディングコンプレックス)タンパク質であるダイサー、TRBP及びAGO2と共に複合体化しなければならない。RLCのうち、ダイサー及びTRBPは、エクスポーティン−5を介して核から出現した後に前駆体miRNAをプロセシングしてmiRNAを生成し、AGO2と会合する必要がある。成熟miRNAと結合したAGO2は、最小のRISCを構成し、続いてダイサー及びTRBPから解離され得る(Chendrimada et al., 2005; Gregory
et al., 2005; Haase et al., 2005; MacRae et al., 2008; Maniataki and Mourelatos, 2005; Melo et al., 2009)。一本鎖miRNAが単独でRISCに組み込まれることは非常に少なく、それゆえ転写後調節のためにターゲットmRNAに効率的に誘導することはできない(Tang, 2005; Thomson et al., 2013)。

0009

合成siRNA(二本鎖)は、ターゲットmRNAとの完璧な塩基対合を通してmRNA崩壊を誘起する(Ambros, 2004; Bartel, 2009)。そのようなsiRNAは、RISCタンパク質であるダイサー、TRBP及びAGO2に直接取り込まれる(Tang, 2005)。一本鎖miRNAは、RISCに組み込むことができず、それゆえ翻訳阻害又は分解のためにターゲットmRNAに誘導することができない(Tang, 2005)。
幾つかの報告により、エクソソーム中に含まれるmiRNAが標的細胞内での遺伝子発現に影響を及ぼし得ることが示唆されたが(Ismail et al., 2013;
Kogure et al., 2011; Kosaka et al., 2013; Narayanan et al., 2013; Pegtel et al., 2010; Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010)、これらのmiRNAが適切なmRNA認識及び効率的翻訳停止のためにpre−miRNAとしてRISCに組み込まれない場合、mRNAをサイレンシングする際にこれらmiRNAがどれほど効率的であるか、という疑問が依然として残る。成熟miRNA(一本鎖)は、標的細胞のRISCと会合できないが、エクソソームのpre−miRNAは、標的細胞のRISCタンパク質を組み入れることにより遺伝子サイレンシングをある程度は誘導し得る。それにもかかわらず、そのようなプロセスは、標的細胞のmiRNAバイオジェネシス経路に関与するタンパク質の潜在的飽和状態により、非常に非効率的で緩やかである。近年の報告から、HIV−1感染細胞細胞培養上清及びHIV患者血清のエクソソーム中のドローシャ及びダイサーの存在が示された(Narayanan et al., 2013)。加えて、別の研究で、後期エンドソーム/MVB(多小胞体)内のダイサー、TRBP及びAGO2の共画分(co−fractionation)が示された(Shen et al., 2013)。

先行技術

0010

Mathivanan, S., Ji, H., and Simpson, R.J. (2010). Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of proteomics 73, 1907−1920.

課題を解決するための手段

0011

癌細胞により分泌されたエクソソームは、非癌性エクソソームと比較して独特であり、該癌性エクソソームは、miRNA及び活性RNAプロセシングRISC複合体の独特のレパートリーを含む。そのようなカプセル化されたRNA−RISC複合体は、標的細胞において細胞非依存性のmiRNAバイオジェネシス及び高効率のmRNAサイレンシングに利用される可能性もある。

0012

一実施形態において、本開示は、対象における癌バイオマーカの検出方法であって、(a)該対象から生物学的試料を得ること;(b)(i)該試料のエクソソーム画分中の表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)該試料のエクソソーム画分中のRISCタンパク質、又は(iv)該試料のエクソソーム画分中のmiRNAプロセシング活性(例えば、一次miRNA及び/又は前駆体miRNAプロセシング活性)、のいずれかのレベルを測定すること;並びに(c)前記miRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性の測定レベルに基づき、癌バイオマーカを有する又は有さない対象を同定すること、を含む該方法を提供する。幾つかの態様において、該方法は、前記miRNAの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10のレベルを測定することを含む。さらなる態様において、該方法は、AGO2、TRBP、又はダイサータンパク質のレベルを測定することを含む。

0013

幾つかの態様において、該生物学的試料は、本質的に細胞を含まない。例えば該試料は、10未満、9未満、8未満、7未満、6未満、5未満、4未満、3未満、2未満、又は1未満の細胞(複数可)を有し得る。一態様において、該生物学的試料は、細胞を含まない。特定の態様において、該生物学的試料は、リンパ唾液、尿又は血液(例えば、血漿)試料であってもよい。さらなる態様において、該方法は、試料のエクソソーム画分を精製すること、及び/又は試料のエクソソーム画分の生成を増加させること、をさらに含む。

0014

特定の態様において、該癌は、乳癌肺癌頭頸部癌前立腺癌食道癌気管癌、脳癌、肝臓癌膀胱癌胃癌膵臓癌卵巣癌子宮癌子宮頸癌精巣癌、結腸癌直腸癌又は皮膚癌である。特定の態様において、該癌は、乳癌である。一態様において、該対象は、過去に癌を処置されているか、又は過去に腫瘍外科的に摘出されている。

0015

幾つかの態様において、対象を癌バイオマーカを有する、又は有さないと同定することは、測定されたmiRNAレベル(複数可)、前駆体miRNAレベル、RISCレベル、又はmiRNAプロセシング活性を、癌のリスク相関させることをさらに含む。さらなる態様において、対象を癌バイオマーカを有する、又は有さないと同定することは、アルゴリズムを用いた、測定されたmiRNAレベル(複数可)、前駆体miRNAレベル、RISCレベル、又はmiRNAプロセシング活性の解析をさらに含む。幾つかの例において、分析は、コンピュータにより実施され得る。

0016

特定の態様において、該実施形態の方法は、(i)該試料及び参照試料のエクソソーム画分中の表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)該試料及び参照試料のエクソソーム画分中のRISCタンパク質、又は(iv)該試料及び参照試料のエクソソーム画分中のmiRNAプロセシング活性、のいずれかのレベルを測定すること、並びに(c)該対象の試料中の前記miRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISC又はmiRNAプロセシング活性のレベルを、参照試料中のmiRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISC、miRNAプロセシング活性のレベルに比較することにより、該対象を癌バイオマーカを有する又は有さないと同定すること、をさらに含む。

0017

幾つかの態様において、RISCタンパク質レベルを測定することは、ウェスタンブロットELISA、又は抗体アレイへの結合を実施することを含む。別の態様において、miRNAレベルを測定することは、プロセシングされたmiRNAレベルを測定することを含む。幾つかの例において、miRNAレベルを測定することは、RTPCRノーザンブロット又はアレイハイブリダイゼーションを実施することを含む。

0018

幾つかの態様において、該方法は、対象が癌バイオマーカを有するか、又は有さないかを報告することをさらに含む。報告することは、記載された報告書口頭での報告、又は電子的報告書を用意することを含み得る。例えば該報告書は、患者医者病院、又は保険会社提出され得る。

0019

さらなる実施形態において、本開示は、対象の処置方法であって、該実施形態により癌バイオマーカを有すると同定された対象を選択すること、及び該対象に抗癌治療を施すこと、を含む、該方法を提供する。例えば該方法は、(a)該対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(ii)RISCタンパク質、又は(iii)miRNAプロセシング活性、のいずれかのレベルを得ること;(b)前記miRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性のレベルに基づき、癌バイオマーカを有する対象を選択すること;及び(c)該選択された対象を抗癌治療で処置すること、を含み得る。特定の態様において、該抗癌治療は、化学療法放射線治療ホルモン療法標的治療免疫療法、又は外科的治療である。

0020

さらなる実施形態において、本開示は、診断手順のための対象の選択方法であって、(a)該対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNAレベル;(iii)RISCタンパク質、又は(iv)miRNAプロセシング活性、のいずれかのレベルを得ること;(b)前記mRNA(複数可)、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性のレベルに基づき、癌バイオマーカを有する対象を選択すること;及び(c)該対象において診断手順を実施すること、を含む、該方法を提供する。一態様において、該診断手順は、診断画像を含む。該画像は、生検X線、CT、MRI又はPET画像であってもよい。

0021

さらなる実施形態において、本開示は、コンピュータ可読コードを含む有体のコンピュータ可読媒体であって、該コンピュータに実行させる際に、(a)対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)RISCタンパク質、又は(iv)miRNAプロセシング活性、のいずれかのレベルに対応する情報を受け取ること、及び;(b)前記miRNA、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性の1つ以上の、参照レベルに比較した相対的レベルを決定すること、を含む操作をコンピュータに実施させ、参照レベルに比較したレベルの変化により該対象が癌バイオマーカを有することが示される、該有体のコンピュータ可読媒体を提供する。

0022

特定の態様において、該有体のコンピュータ可読媒体の操作は、癌を有さない対象のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)RISCタンパク質、又は(iv)miRNAプロセシング活性、の参照レベルに対応する情報を受け取ることをさらに含む。

0023

特定の態様において、該有体のコンピュータ可読媒体は、コンピュータに実行させる際に、miRNA、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性の相対レベルに対応する情報を、有体のデータ保存デバイスに送信すること、を含む1つ以上のさらなる操作をコンピュータに実施させる、コンピュータ可読コードをさらに含む。

0024

さらなる態様において、該参照レベルは、前記有体のコンピュータ可読媒体に保存される。一態様において、情報を受け取ることは、該対象から得た試料中の、miRNAのレベル、前駆体miRNAレベル、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性に対応する情報を、有体のデータ保存デバイスから受け取ることを含む。幾つかの態様において、情報を受け取ることは、対象から得た試料中の、前記miRNAの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のレベルに対応する情報を受け取ることをさらに含む。

0025

幾つかの態様において、該コンピュータ可読コードは、コンピュータに実行させる際に、(c)該患者の診断スコアを計算すること、をさらに含む操作をコンピュータに実施させ、該診断スコアは、該試料が癌を有する対象のものである可能性を示す。

0026

さらなる実施形態において、本開示は、対象における癌バイオマーカの検出方法であって、(a)該対象から生物学的試料を得ること;(b)表5に示されたmiRNA又はその前駆体miRNAから選択される、試料中の1つ以上のmiRNA(複数可)のレベルを測定すること;及び(c)前記miRNA(複数可)の測定レベルに基づき、癌バイオマーカを有する、又は有さない対象を同定すること、を含む、該方法を提供する。一態様において、該生物学的試料は、本質的に細胞を含まない。特定の態様において、該生物学的試料は、リンパ、唾液、尿又は血漿試料であってもよい。一態様において、該方法は、体液のエクソソーム画分を精製することをさらに含み得る。

0027

さらなる実施形態において、本開示は、細胞を、RISCタンパク質複合体と会合して提供される阻害性RNAと接触させることを含む、活性の阻害性RNAの送達方法を提供する。一態様において、該RISCタンパク質複合体は、TRBP、ダイサー及びAGO2を含む。幾つかの態様において、該阻害性RNAは、siRNA又はshRNAである。一態様において、該阻害性RNAは、ヒトmiRNAである。

0028

特定の態様において、該阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体は、脂質二重層を含むリポソームナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる。一態様において、該マイクロカプセルは、エクソソームである。

0029

幾つかの態様において、該方法は、細胞を、阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体でトランスフェクトすることをさらに含む。別の態様において、該方法は、阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体を対象に投与することをさらに含む。

0030

さらなる実施形態において、本開示は、RISCタンパク質複合体と会合した組換え又は合成阻害性RNAを含む組成物であって、前記複合体が、リポソーム、ナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる、該組成物を提供する。一態様において、RISCタンパク質複合体は、TRBP、ダイサー及びAGO2を含む。幾つかの態様において、該阻害性RNAは、siRNA又はshRNAである。幾つかの態様において、該阻害性RNAは、ヒトmiRNAである。特定の態様において、該複合体は、合成リポソーム、ナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる。一態様において、該マイクロカプセルは、エクソソームである。

0031

先に詳述された実施形態の特定の態様は、表5に示されたものから選択される、試料のエクソソーム画分中の1つ以上のmiRNA(複数可)(又はmiRNA前駆体)のレベルを測定することに関する。例えば方法は、mmu−miR−709、hsa−miR−1308、mmu−miR−615−3p、hsa−miR−1260b、mmu−miR−1937a、mmu−mir−321−A、hsa−miR−615−3p、hsa−miR−1979、mmu−miR−1937b、hsa−mir−373、mmu−miR−1937c、hsa−miR−1273d−P、mmu−miR−720、mmu−miR−1274a、hsa−mir−565−A、mmu−miR−1931、hsa−miR−1246、hsa−mir−594−P、hsa−mir−321−A、mmu−miR−2145−1−P、hsa−mir−639−P、hsa−miR−720、hsa−miR−1280、mmu−miR−3473、hsa−miR−1260、hsa−miR−1281、mmu−miR−1224−P、mmu−miR−690、hsa−miR−375−P、hsa−miR−4301、mmu−miR−700、mmu−miR−125b−5p、mmu−miR−1191−P、hsa−miR−1274a、hsa−miR−3197、mmu−miR−1935、hsa−miR−1975−P、hsa−miR−4324、hsa−miR−886−3p、hsa−miR−1274b、mmu−miR−1957、hsa−miR−933、hsa−mir−675、hsa−miR−595、mmu−miR−2137、hsa−mir−572−P、mmu−miR−1195、hsa−miR−4294−P、mmu−mir−1899−P、mmu−miR−689−P、hsa−miR−199b−3p、hsa−miR−3117−P、mmu−mir−321−P、mmu−miR−1961−P、hsa−mir−10a、mmu−miR−669d−P、mmu−miR−1937b−2−P、hsa−miR−3125−P、mmu−miR−1934−P、hsa−miR−574−3p、hsa−miR−718、mmu−miR−1198、mmu−miR−2182−P、hsa−miR−1273、mmu−miR−2133−P、hsa−miR−92b*、hsa−miR−1290、hsa−miR−448、mmu−miR−689、mmu−miR−449a、mmu−miR−1937b−4−P、hsa−miR−4286、mmu−miR−1947、mmu−miR−342−3p、hsa−miR−1303−P、mmu−miR−2132、hsa−miR−4321−P、hsa−miR−4256−P、hsa−miR−4311、mmu−miR−130a、mmu−miR−1939、hsa−miR−1268−P、mmu−miR−31、mmu−miR−99b、mmu−miR−2141、hsa−miR−1202−P、mmu−miR−466b−3p、mmu−miR−2133、hsa−miR−1268、hsa−miR−466、mmu−miR−494、hsa−miR−1289、hsa−miR−320b、hsa−miR−4254、hsa−mir−7−3−P、hsa−miR−923、hsa−miR−764、mmu−miR−291a−3p、mmu−miR−883b−3p、hsa−mir−594−A、mmu−miR−1948−P、hsa−miR−206、hsa−mir−565−P、mmu−miR−467e*、hsa−miR−1826、mmu−miR−467a*、mmu−miR−1983、hsa−miR−324−5p、mmu−let−7c、mmu−miR−1965、hsa−mir−632−P、hsa−miR−181a*MM2GT/AC、hsa−miR−1265、hsa−miR−323b−5p、hsa−mir−1914、hsa−mir−1910、hsa−miR−21、hsa−miR−431*、hsa−miR−3135−P、mmu−miR−187−P、mmu−miR−126−3p、mmu−miR−669a−P、hsa−miR−367、mmu−mir−320−P、hsa−miR−181a*MM1G/C、mmu−miR−484−P、mmu−miR−467c−P、hsa−miR−3154、mmu−miR−466d−3p、hsa−miR−3162−P、mmu−miR−201、mmu−miR−1946a、hsa−miR−937、hsa−miR−3147、hsa−mir−596−P、hsa−miR−3148、hsa−miR−1304、hsa−miR−222MM2GG/AC、mmu−miR−125a−5p、hsa−miR−1272−P、hsa−miR−638、hsa−mir−320、hsa−miR−545*、hsa−mir−1908−P、hsa−let−7d−v2−P、mmu−mir−30d−P、hsa−miR−4297、mmu−miR−182、hsa−miR−3166−P、hsa−miR−494、mmu−miR−669o−P、hsa−miR−566、mmu−miR−1188、mmu−miR−2134−AP、hsa−miR−4259−P、mmu−miR−152、mmu−miR−2134、hsa−miR−3193−AP、hsa−miR−125b、hsa−miR−3124−P、hsa−miR−10b、hsa−miR−455−5p、mmu−miR−144、hsa−miR−130a、hsa−miR−1285、hsa−miR−516b*、hsa−miR−27a、hsa−miR−138−1*、mmu−miR−471、hsa−miR−4298−P、hsa−miR−301b、hsa−mir−147−P、hsa−miR−362−5p、mmu−mir−471−P、mmu−miR−466a−3p、hsa−miR−561、hsa−miR−486−5p、mmu−miR−2861、hsa−miR−587、mmu−miR−375、hsa−mir−329−2−P、mmu−miR−2861−P、hsa−miR−144*、hsa−miR−1255a−P、hsa−mir−519a−2−P、hsa−miR−34c−5p、mmu−miR−466e−3p、mmu−miR−743b−5p、mmu−mir−350−P、mmu−miR−181d、hsa−miR−376a*、hsa−miR−1308−P、mmu−miR−467g、mmu−miR−1946a−P、hsa−miR−147−P、hsa−miR−923−P、mmu−miR−465c−5p、hsa−miR−891a、hsa−miR−28−5p、hsa−miR−4292、mmu−miR−677−P、hsa−miR−4257、hsa−miR−4326、hsa−miR−17*MM2GG/AA、hsa−miR−939−P、mmu−miR−2182、hsa−miR−220c−P、hsa−miR−3132−P、hsa−miR−532−5p、mmu−miR−1947−P、mmu−miR−29a、hsa−miR−3162、hsa−miR−375MM1C/G、hsa−miR−768−3p、mmu−miR−182−P、mmu−miR−205−P、hsa−miR−505、hsa−miR−3146−P、mmu−miR−721、mmu−miR−376c、hsa−miR−1179−P、mmu−miR−1970、hsa−miR−3133−P、hsa−miR−200c、hsa−miR−220a、mmu−miR−100、hsa−miR−1255b、hsa−miR−222MM1G/A、hsa−miR−885−3p、hsa−miR−517b、hsa−miR−200a、hsa−miR−3141、mmu−miR−669h−3p、hsa−miR−1301、hsa−miR−877、hsa−mir−941−2、hsa−mir−487b−P、hsa−miR−4302、hsa−miR−99b、hsa−miR−1253、hsa−let−7a*、hsa−miR−34aMM2CT/TC、hsa−miR−3181−P、hsa−miR−3200、hsa−miR−3129−P、hsa−miR−93*、hsa−miR−548q−P、mmu−miR−466g、mmu−miR−155、hsa−miR−2278−P、hsa−miR−3065−5p、hsa−miR−633、hsa−miR−4265、mmu−miR−2135−P、hsa−miR−190、mmu−miR−669f、hsa−miR−1323、hsa−miR−588、mmu−miR−183*、hsa−mir−941−4、hsa−mir−1913、hsa−miR−2116*、hsa−miR−1178、mmu−miR−196a、mmu−miR−574−3p、hsa−miR−346、mmu−miR−1199、mmu−miR−681、hsa−miR−4292−P、hsa−miR−522、hsa−mir−611−P、hsa−miR−3171、hsa−miR−635、hsa−miR−1197−P、hsa−miR−604、mmu−let−7a*、hsa−miR−335、mmu−miR−466c−3p、mmu−miR−466i、hsa−miR−1297、mmu−miR−338−5p、hsa−mir−526a−2−P、hsa−miR−181aMM2GC/AG、hsa−miR−18、hsa−miR−924−P、mmu−miR−190−P、hsa−miR−345、mmu−miR−711、hsa−miR−3116−2−P、hsa−miR−99a、mmu−miR−26a、hsa−miR−1248−P、mmu−miR−721−P、mmu−miR−801−P、hsa−miR−1826−P、hsa−miR−1236、hsa−miR−339−5p、mmu−miR−804、mmu−miR−467d*、mmu−miR−1191、hsa−miR−148a、hsa−miR−141、mmu−miR−1937a−P、mmu−miR−696及びhsa−miR−302a(即ち、表5に列挙されたもの)からなる群から選択される1つ以上のmiRNAのレベルを測定することを含み得る。

0032

本明細書本文で用いられる「a」又は「an」は、1つ以上を意味し得る。本明細書の請求項(複数可)で用いられる、言語「含んでいる」と共同で用いられる場合の「a」又は「an」は、1つ、又は1つを超えることを意味し得る。

0033

特許請求の範囲内の用語「又は」の使用は、代替物のみを指すこと、又はその代替物が互いに排他的であることが明確に示されていない限り、「及び/又は」を意味するために用いられているが、本開示は、代替物のみ、及び「及び/又は」を指す定義を支持する。本明細書で用いられる「別の」は、少なくとも1つの第二又はそれを超えるものを意味し得る。

0034

本出願を通して、用語「約」は、値が、デバイスに関する固有誤差変動、値を測定するために用いられる方法、又は被験対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いられている。

0035

本発明の他の目的、特色及び利点は、以下の詳細な説明から明白となろう。しかし、詳細な説明から本発明の主旨及び範囲内で様々な変動及び改良が当業者に明白となるため、詳細な説明及び具体的な実施例が、本発明の好ましい実施形態を示すが例示に過ぎないことは、理解されなければならない。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
対象における癌バイオマーカのインビトロ検出方法であって、
(a)前記対象から生物学的試料を得ること;
(b)(i)前記試料のエクソソーム画分中のRISCタンパク質;
(ii)前駆体miRNA;
(iii)前記試料のエクソソーム画分中の表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);及び/又は
(iv)前記試料のエクソソーム画分中の一次miRNA若しくは前駆体miRNAプロセシング活性、
のレベルを測定すること;並びに
(c)前記miRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性の測定レベルに基づき、癌バイオマーカを有する又は有さない前記対象を同定すること、
を含む前記方法。
(項目2)
前記試料が、本質的に細胞を含まない、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記試料が、リンパ、唾液、尿又は血漿試料である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記試料のエクソソーム画分を精製すること、又は前記試料のエクソソーム画分の生成を増加させること、をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記癌が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌又は皮膚癌である、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記癌が、乳癌である、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記miRNAの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9.10のレベルを測定することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
ダイサー、AGO2、又はTRBPのレベルを測定することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前駆体miRNAのレベルを測定することが、表5のmiRNA(複数可)の1つの前駆体のレベルを測定することを含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記対象が、過去に癌を処置されている、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記対象が、過去に腫瘍を外科的に摘出されている、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記対象を癌バイオマーカを有する又は有さないと同定することが、前記測定されたmiRNAレベル(複数可)、前駆体miRNAレベル、RISCレベル、又はmiRNAプロセシング活性を、癌のリスクと相関させることをさらに含む、項目1に記載の方法。(項目13)
前記対象を癌バイオマーカを有する又は有さないと同定することが、アルゴリズムを用いた、前記測定されたmiRNAレベル(複数可)、前駆体miRNAレベル、RISCレベル、又はmiRNAプロセシング活性の解析をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記分析が、コンピュータにより実施される、項目13に記載の方法。
(項目15)
b)(i)前記試料及び参照試料のエクソソーム画分中のRISCタンパク質;
(ii)前記試料及び参照試料のエクソソーム画分中の前駆体miRNA;
(iii)前記試料及び参照試料のエクソソーム画分中の表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);並びに/又は
(iv)前記試料及び参照試料のエクソソーム画分中のmiRNAプロセシング活性、のレベルを測定すること;並びに
(c)前記対象の前記試料中のRISC、前駆体miRNA、miRNA(複数可)、又はmiRNAプロセシング活性のレベルを、前記参照試料中のmiRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISC又はmiRNAプロセシング活性のレベルに比較することにより、前記対象を癌バイオマーカを有する又は有さないと同定すること、
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
RISCタンパク質レベルを測定することが、ウェスタンブロット、ELISA、又は抗体アレイへの結合を実施することを含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
miRNAレベルを測定することが、プロセシングされたmiRNAレベルを測定することを含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
miRNAレベルを測定することが、RT−PCR、ノーザンブロット又はアレイハイブリダイゼーションを実施することを含む、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記対象が癌バイオマーカを有するか、又は有さないかを報告することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
報告することが、記載された報告書又は電子的報告書を用意すること含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記報告書を患者、医者、病院、又は保険会社に提出することをさらに含む、項目19に記載の方法。
(項目22)
対象の処置方法であって、
項目1に記載の癌バイオマーカを有すると同定された対象を選択すること;及び
前記対象に抗癌治療を施すこと、
を含む、前記方法。
(項目23)
前記抗癌治療が、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、標的治療、免疫療法、又は外科的治療である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記抗癌治療が、脳をターゲットとする、項目22に記載の方法。
(項目25)
対象の処置方法であって、
(a)前記対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNAレベル;(iii)RISCタンパク質;又は(iv)miRNAプロセシング活性、のレベルを得ること;
(b)前記mRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性のレベルに基づき、癌バイオマーカを有する対象を選択すること;及び
(c)前記選択された対象を抗癌治療で処置すること、
を含む、前記方法。
(項目26)
前記抗癌治療が、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、標的治療、免疫療法、又は外科的治療である、項目25に記載の方法。
(項目27)
診断手順のための対象の選択方法であって、
(a)前記対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)RISCタンパク質、又は(iv)miRNAプロセシング活性、のレベルを得ること;
(b)前記mRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性のレベルに基づき、癌バイオマーカを有する対象を選択すること;及び
(c)前記対象において前記選択された通り、診断手順を実施すること、
を含む、前記方法。
(項目28)
前記診断手順が、診断画像を含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記画像が、X線、CT、MRI又はPET画像である、項目28に記載の方法。
(項目30)
コンピュータ可読コードを含む有体のコンピュータ可読媒体であって、コンピュータに実行させる際に、
a)対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)RISCタンパク質;又は(iv)miRNAプロセシング活性、のレベルに対応する情報を受け取ること、及び;
b)前記miRNA又はRISCタンパク質の1つ以上の、参照レベルに比較した相対的レベルを決定すること、
を含む操作を前記コンピュータに実施させ、参照レベルに比較したレベルの変化により前記対象が癌バイオマーカを有することが示される、
前記有体のコンピュータ可読媒体。
(項目31)
癌を有さない対象のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)RISCタンパク質、又は(iv)miRNAプロセシング活性、の参照レベルに対応する情報を受け取ることをさらに含む、項目30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
(項目32)
前記参照レベルが保存される、項目30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
(項目33)
前記情報を受け取ることが、対象から得た試料中の、miRNA、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性のレベルに対応する情報を、有体のデータ保存デバイスから受け取ることを含む、項目30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
(項目34)
コンピュータに実行させる際に、miRNA、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性の相対レベルに対応する情報を、有体のデータ保存デバイスに送信すること、を含む1つ以上のさらなる操作を前記コンピュータに実施させる、コンピュータ可読コードをさらに含む、項目30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。(項目35)
前記情報を受け取ることが、対象から得た試料中の、前記miRNAの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のレベルに対応する情報を受け取ることをさらに含む、項目30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
(項目36)
前記コンピュータ可読コードが、コンピュータに実行させる際に、c)前記患者の診断スコアを計算すること、をさらに含む操作を前記コンピュータに実施させ、前記診断スコアが、前記試料が癌を有する対象のものである可能性を示す、項目30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
(項目37)
対象における癌バイオマーカのインビトロ検出方法であって、
(a)前記対象から生物学的試料を得ること;
(b)表5に示された前記miRNAから選択される、前記試料中の1つ以上のmiRNA(複数可)のレベルを測定すること;及び
(c)前記miRNA(複数可)の前記測定レベルに基づき、癌バイオマーカを有する、又は有さない前記対象を同定すること、を含む、前記方法。
(項目38)
前記試料が、本質的に細胞を含まない、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記試料が、体液のエクソソーム画分である、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記試料が、リンパ、唾液、尿又は血漿試料である、項目37に記載の方法。
(項目41)
細胞を、RISCタンパク質複合体と会合して提供される阻害性RNAと接触させることを含む、活性の阻害性RNAのインビトロ送達方法。
(項目42)
前記RISCタンパク質複合体が、TRBP、ダイサー及びAGO2を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記阻害性RNAが、siRNA又はshRNAである、項目41に記載の方法。
(項目44)
前記阻害性RNAが、ヒトmiRNAである、項目41に記載の方法。
(項目45)
前記阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体が、脂質二重層を含むリポソーム、ナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる、項目41に記載の方法。
(項目46)
前記マイクロカプセルが、エクソソームである、項目46に記載の方法。
(項目47)
細胞を接触させることが、細胞を、前記阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体でトランスフェクトすることを含む、項目41に記載の方法。
(項目48)
前記阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体を対象に投与することをさらに含む、項目41に記載の方法。
(項目49)
RISCタンパク質複合体と会合した組換え又は合成阻害性RNAを含む組成物であって、前記複合体が、リポソーム、ナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる、前記組成物。
(項目50)
前記RISCタンパク質複合体が、TRBP、ダイサー及びAGO2を含む、項目49に記載の組成物。
(項目51)
前記阻害性RNAが、siRNA又はshRNAである、項目49に記載の組成物。
(項目52)
前記阻害性RNAが、ヒトmiRNAである、項目49に記載の組成物。
(項目53)
前記複合体が、合成リポソーム、ナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる、項目49に記載の組成物。
(項目54)
前記マイクロカプセルが、エクソソームである、項目49に記載の組成物。

0036

以下の図面は、本明細書の一部を形成しており、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。特許又は出願ファイルは、色を付した図面を少なくとも1つ含む。カラー図面(複数可)を含むこの特許又は特許出願発行物コピーは、必要な時に、必要な料金を支払えば、当局により提供されよう。本発明は、これらの1つ以上の図面を、本明細書に示された特定の実施形態の詳細な説明と併せて参照することで、より理解されるであろう。

図面の簡単な説明

0037

エクソソームの特徴づけオンコソームは、ノルモソームに比較して発癌性miRNAが豊富である。(A)オンコソームの透過型電子顕微鏡写真上左写真及び下左写真及び挿入ズーム写真;点線ズームエリアを示す)。下右画像は、抗CD9抗体及び透過型電子顕微鏡測定を利用した免疫金標識により作製した。金粒子を、黒色の点として示している。グラフは、112のTEM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(B)乳癌細胞から得たエクソソームの原子間力顕微鏡画像。中央のグラフは、カバースリップ内の粒子の分散をエクソソームのサイズ範囲と共に示している。右のグラフは、26のAFM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(C)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株(左のブロット、最初のパネル);マウス癌細胞株67NR及び4T1(中央のブロット、最初のパネル);ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231(右のブロット、最初のパネル)から採取されたエクソソームにおいて抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);エクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(D)エクソソームマーカである、0.4μmビーズに結合したMDA−MB231由来エクソソームのTSG101、CD9、フロチリン−1、及びCD63抗体を用いたフローサイトメトリー分析。(E)光散乱分光法(LSS)でのエクソソームのサイズ選別。該システム較正は、24nm及び100nmの公称直径を有するガラスマイクロスフェア、並びに119nm、175nm、356nm及び457nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアのリン酸緩衝生理食塩水PBS)懸濁液からのシグナルを利用して実施した。実験スペクトル及び得られたフィットを、100nmの名目直径を有するガラスマイクロスフェア及び356nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアに関して左のグラフに示している。右のグラフは、癌性エクソソームのPBS懸濁液のサイズ測定を表す。挿入図は、細胞及び細胞片による本発明者らのエクソソーム調製物の潜在的コンタミネーションを排除するために10μmまで拡大してた同グラフを示している。(F)NanoSightを用いたエクソソームのサイズ分布。左のグラフは、溶液中の粒子のサイズ分布を表しており、平均サイズ105nmを示し、より大きなサイズのピークが示されていない。右のグラフは、NanoSightによる溶液中の粒子のサイズ及び濃度による分布を表す。図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ − オンコソームは、ノルモソームに比較して発癌性miRNAが豊富である。(A)オンコソームの透過型電子顕微鏡写真(上左写真及び下左写真及び挿入ズーム写真;点線はズームエリアを示す)。下右画像は、抗CD9抗体及び透過型電子顕微鏡測定を利用した免疫金標識により作製した。金粒子を、黒色の点として示している。グラフは、112のTEM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(B)乳癌細胞から得たエクソソームの原子間力顕微鏡画像。中央のグラフは、カバースリップ内の粒子の分散をエクソソームのサイズ範囲と共に示している。右のグラフは、26のAFM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(C)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株(左のブロット、最初のパネル);マウス癌細胞株67NR及び4T1(中央のブロット、最初のパネル);ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231(右のブロット、最初のパネル)から採取されたエクソソームにおいて抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);エクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(D)エクソソームマーカである、0.4μmビーズに結合したMDA−MB231由来エクソソームのTSG101、CD9、フロチリン−1、及びCD63抗体を用いたフローサイトメトリー分析。(E)光散乱分光法(LSS)でのエクソソームのサイズ選別。該システムの較正は、24nm及び100nmの公称直径を有するガラスマイクロスフェア、並びに119nm、175nm、356nm及び457nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)懸濁液からのシグナルを利用して実施した。実験スペクトル及び得られたフィットを、100nmの名目直径を有するガラスマイクロスフェア及び356nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアに関して左のグラフに示している。右のグラフは、癌性エクソソームのPBS懸濁液のサイズ測定を表す。挿入図は、細胞及び細胞片による本発明者らのエクソソーム調製物の潜在的コンタミネーションを排除するために10μmまで拡大してた同グラフを示している。(F)NanoSightを用いたエクソソームのサイズ分布。左のグラフは、溶液中の粒子のサイズ分布を表しており、平均サイズ105nmを示し、より大きなサイズのピークが示されていない。右のグラフは、NanoSightによる溶液中の粒子のサイズ及び濃度による分布を表す。図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ − オンコソームは、ノルモソームに比較して発癌性miRNAが豊富である。(A)オンコソームの透過型電子顕微鏡写真(上左写真及び下左写真及び挿入ズーム写真;点線はズームエリアを示す)。下右画像は、抗CD9抗体及び透過型電子顕微鏡測定を利用した免疫金標識により作製した。金粒子を、黒色の点として示している。グラフは、112のTEM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(B)乳癌細胞から得たエクソソームの原子間力顕微鏡画像。中央のグラフは、カバースリップ内の粒子の分散をエクソソームのサイズ範囲と共に示している。右のグラフは、26のAFM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(C)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株(左のブロット、最初のパネル);マウス癌細胞株67NR及び4T1(中央のブロット、最初のパネル);ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231(右のブロット、最初のパネル)から採取されたエクソソームにおいて抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);エクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(D)エクソソームマーカである、0.4μmビーズに結合したMDA−MB231由来エクソソームのTSG101、CD9、フロチリン−1、及びCD63抗体を用いたフローサイトメトリー分析。(E)光散乱分光法(LSS)でのエクソソームのサイズ選別。該システムの較正は、24nm及び100nmの公称直径を有するガラスマイクロスフェア、並びに119nm、175nm、356nm及び457nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)懸濁液からのシグナルを利用して実施した。実験スペクトル及び得られたフィットを、100nmの名目直径を有するガラスマイクロスフェア及び356nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアに関して左のグラフに示している。右のグラフは、癌性エクソソームのPBS懸濁液のサイズ測定を表す。挿入図は、細胞及び細胞片による本発明者らのエクソソーム調製物の潜在的コンタミネーションを排除するために10μmまで拡大してた同グラフを示している。(F)NanoSightを用いたエクソソームのサイズ分布。左のグラフは、溶液中の粒子のサイズ分布を表しており、平均サイズ105nmを示し、より大きなサイズのピークが示されていない。右のグラフは、NanoSightによる溶液中の粒子のサイズ及び濃度による分布を表す。図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ − オンコソームは、ノルモソームに比較して発癌性miRNAが豊富である。(A)オンコソームの透過型電子顕微鏡写真(上左写真及び下左写真及び挿入ズーム写真;点線はズームエリアを示す)。下右画像は、抗CD9抗体及び透過型電子顕微鏡測定を利用した免疫金標識により作製した。金粒子を、黒色の点として示している。グラフは、112のTEM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(B)乳癌細胞から得たエクソソームの原子間力顕微鏡画像。中央のグラフは、カバースリップ内の粒子の分散をエクソソームのサイズ範囲と共に示している。右のグラフは、26のAFM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(C)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株(左のブロット、最初のパネル);マウス癌細胞株67NR及び4T1(中央のブロット、最初のパネル);ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231(右のブロット、最初のパネル)から採取されたエクソソームにおいて抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);エクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(D)エクソソームマーカである、0.4μmビーズに結合したMDA−MB231由来エクソソームのTSG101、CD9、フロチリン−1、及びCD63抗体を用いたフローサイトメトリー分析。(E)光散乱分光法(LSS)でのエクソソームのサイズ選別。該システムの較正は、24nm及び100nmの公称直径を有するガラスマイクロスフェア、並びに119nm、175nm、356nm及び457nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)懸濁液からのシグナルを利用して実施した。実験スペクトル及び得られたフィットを、100nmの名目直径を有するガラスマイクロスフェア及び356nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアに関して左のグラフに示している。右のグラフは、癌性エクソソームのPBS懸濁液のサイズ測定を表す。挿入図は、細胞及び細胞片による本発明者らのエクソソーム調製物の潜在的コンタミネーションを排除するために10μmまで拡大してた同グラフを示している。(F)NanoSightを用いたエクソソームのサイズ分布。左のグラフは、溶液中の粒子のサイズ分布を表しており、平均サイズ105nmを示し、より大きなサイズのピークが示されていない。右のグラフは、NanoSightによる溶液中の粒子のサイズ及び濃度による分布を表す。図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ − オンコソームは、ノルモソームに比較して発癌性miRNAが豊富である。(A)オンコソームの透過型電子顕微鏡写真(上左写真及び下左写真及び挿入ズーム写真;点線はズームエリアを示す)。下右画像は、抗CD9抗体及び透過型電子顕微鏡測定を利用した免疫金標識により作製した。金粒子を、黒色の点として示している。グラフは、112のTEM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(B)乳癌細胞から得たエクソソームの原子間力顕微鏡画像。中央のグラフは、カバースリップ内の粒子の分散をエクソソームのサイズ範囲と共に示している。右のグラフは、26のAFM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(C)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株(左のブロット、最初のパネル);マウス癌細胞株67NR及び4T1(中央のブロット、最初のパネル);ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231(右のブロット、最初のパネル)から採取されたエクソソームにおいて抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);エクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(D)エクソソームマーカである、0.4μmビーズに結合したMDA−MB231由来エクソソームのTSG101、CD9、フロチリン−1、及びCD63抗体を用いたフローサイトメトリー分析。(E)光散乱分光法(LSS)でのエクソソームのサイズ選別。該システムの較正は、24nm及び100nmの公称直径を有するガラスマイクロスフェア、並びに119nm、175nm、356nm及び457nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)懸濁液からのシグナルを利用して実施した。実験スペクトル及び得られたフィットを、100nmの名目直径を有するガラスマイクロスフェア及び356nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアに関して左のグラフに示している。右のグラフは、癌性エクソソームのPBS懸濁液のサイズ測定を表す。挿入図は、細胞及び細胞片による本発明者らのエクソソーム調製物の潜在的コンタミネーションを排除するために10μmまで拡大してた同グラフを示している。(F)NanoSightを用いたエクソソームのサイズ分布。左のグラフは、溶液中の粒子のサイズ分布を表しており、平均サイズ105nmを示し、より大きなサイズのピークが示されていない。右のグラフは、NanoSightによる溶液中の粒子のサイズ及び濃度による分布を表す。図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ − オンコソームは、ノルモソームに比較して発癌性miRNAが豊富である。(A)オンコソームの透過型電子顕微鏡写真(上左写真及び下左写真及び挿入ズーム写真;点線はズームエリアを示す)。下右画像は、抗CD9抗体及び透過型電子顕微鏡測定を利用した免疫金標識により作製した。金粒子を、黒色の点として示している。グラフは、112のTEM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(B)乳癌細胞から得たエクソソームの原子間力顕微鏡画像。中央のグラフは、カバースリップ内の粒子の分散をエクソソームのサイズ範囲と共に示している。右のグラフは、26のAFM写真から分析されたエクソソーム調製物の平均サイズを表す。(C)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株(左のブロット、最初のパネル);マウス癌細胞株67NR及び4T1(中央のブロット、最初のパネル);ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231(右のブロット、最初のパネル)から採取されたエクソソームにおいて抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);エクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(D)エクソソームマーカである、0.4μmビーズに結合したMDA−MB231由来エクソソームのTSG101、CD9、フロチリン−1、及びCD63抗体を用いたフローサイトメトリー分析。(E)光散乱分光法(LSS)でのエクソソームのサイズ選別。該システムの較正は、24nm及び100nmの公称直径を有するガラスマイクロスフェア、並びに119nm、175nm、356nm及び457nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)懸濁液からのシグナルを利用して実施した。実験スペクトル及び得られたフィットを、100nmの名目直径を有するガラスマイクロスフェア及び356nmの名目直径を有するポリスチレンマイクロスフェアに関して左のグラフに示している。右のグラフは、癌性エクソソームのPBS懸濁液のサイズ測定を表す。挿入図は、細胞及び細胞片による本発明者らのエクソソーム調製物の潜在的コンタミネーションを排除するために10μmまで拡大してた同グラフを示している。(F)NanoSightを用いたエクソソームのサイズ分布。左のグラフは、溶液中の粒子のサイズ分布を表しており、平均サイズ105nmを示し、より大きなサイズのピークが示されていない。右のグラフは、NanoSightによる溶液中の粒子のサイズ及び濃度による分布を表す。図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
オンコソームがmiRNAを豊富に含むようになっている。(A)MDA−MB231エクソソーム及びMCF10Aエクソソーム中の発現されたmiRNAの相関グラフ。(B)72hの無細胞培養の後、ノルモソームとオンコソームの間で差次的に発現されたmiRNAの6種(miR−10a、miR−10b、miR−21、miR−27a、miR−155、及びmiR−373)を利用した細胞中のmiRNAと各エクソソームの間の相関グラフ。(C)ノルモソーム及びオンコソームをDMEM培地再懸濁させて、24及び72hの無細胞培養物に保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、72h後に採取されたエクソソーム中の腫瘍サプレッサ(TS)及び発癌性(ONC)miRNAの倍率変化の平均を、24h後に採取されたものに比較して表している。(D)24及び72hの無細胞培養後のノルモソーム、培養していないオンコソーム、並びに24h、72h及び96hの無細胞培養後のオンコソームから得られたmiRNA−10及びmiR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージソフトウエアを用いて、定量を実施した。(E)72hの無細胞培養後の、MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞中の15種の定量されたmiRNAと、それらの各エクソソームの間の相関プロット。オンコソームは、ノルモソームと比較して(左グラフ)、起源細胞(中央及び右グラフ)との低い相関値を示している。(F)1秒(s)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示、並びにノルモソーム及びオンコソームのエクソソームRNA量のゲル画像
オンコソームがmiRNAを豊富に含むようになっている。(A)MDA−MB231エクソソーム及びMCF10Aエクソソーム中の発現されたmiRNAの相関グラフ。(B)72hの無細胞培養の後、ノルモソームとオンコソームの間で差次的に発現されたmiRNAの6種(miR−10a、miR−10b、miR−21、miR−27a、miR−155、及びmiR−373)を利用した細胞中のmiRNAと各エクソソームの間の相関グラフ。(C)ノルモソーム及びオンコソームをDMEM培地に再懸濁させて、24及び72hの無細胞培養物に保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、72h後に採取されたエクソソーム中の腫瘍サプレッサ(TS)及び発癌性(ONC)miRNAの倍率変化の平均を、24h後に採取されたものに比較して表している。(D)24及び72hの無細胞培養後のノルモソーム、培養していないオンコソーム、並びに24h、72h及び96hの無細胞培養後のオンコソームから得られたmiRNA−10及びmiR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(E)72hの無細胞培養後の、MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞中の15種の定量されたmiRNAと、それらの各エクソソームの間の相関プロット。オンコソームは、ノルモソームと比較して(左グラフ)、起源細胞(中央及び右グラフ)との低い相関値を示している。(F)1秒(s)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示、並びにノルモソーム及びオンコソームのエクソソームRNA量のゲル画像。
オンコソームがmiRNAを豊富に含むようになっている。(A)MDA−MB231エクソソーム及びMCF10Aエクソソーム中の発現されたmiRNAの相関グラフ。(B)72hの無細胞培養の後、ノルモソームとオンコソームの間で差次的に発現されたmiRNAの6種(miR−10a、miR−10b、miR−21、miR−27a、miR−155、及びmiR−373)を利用した細胞中のmiRNAと各エクソソームの間の相関グラフ。(C)ノルモソーム及びオンコソームをDMEM培地に再懸濁させて、24及び72hの無細胞培養物に保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、72h後に採取されたエクソソーム中の腫瘍サプレッサ(TS)及び発癌性(ONC)miRNAの倍率変化の平均を、24h後に採取されたものに比較して表している。(D)24及び72hの無細胞培養後のノルモソーム、培養していないオンコソーム、並びに24h、72h及び96hの無細胞培養後のオンコソームから得られたmiRNA−10及びmiR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(E)72hの無細胞培養後の、MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞中の15種の定量されたmiRNAと、それらの各エクソソームの間の相関プロット。オンコソームは、ノルモソームと比較して(左グラフ)、起源細胞(中央及び右グラフ)との低い相関値を示している。(F)1秒(s)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示、並びにノルモソーム及びオンコソームのエクソソームRNA量のゲル画像。
オンコソームがmiRNAを豊富に含むようになっている。(A)MDA−MB231エクソソーム及びMCF10Aエクソソーム中の発現されたmiRNAの相関グラフ。(B)72hの無細胞培養の後、ノルモソームとオンコソームの間で差次的に発現されたmiRNAの6種(miR−10a、miR−10b、miR−21、miR−27a、miR−155、及びmiR−373)を利用した細胞中のmiRNAと各エクソソームの間の相関グラフ。(C)ノルモソーム及びオンコソームをDMEM培地に再懸濁させて、24及び72hの無細胞培養物に保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、72h後に採取されたエクソソーム中の腫瘍サプレッサ(TS)及び発癌性(ONC)miRNAの倍率変化の平均を、24h後に採取されたものに比較して表している。(D)24及び72hの無細胞培養後のノルモソーム、培養していないオンコソーム、並びに24h、72h及び96hの無細胞培養後のオンコソームから得られたmiRNA−10及びmiR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(E)72hの無細胞培養後の、MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞中の15種の定量されたmiRNAと、それらの各エクソソームの間の相関プロット。オンコソームは、ノルモソームと比較して(左グラフ)、起源細胞(中央及び右グラフ)との低い相関値を示している。(F)1秒(s)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示、並びにノルモソーム及びオンコソームのエクソソームRNA量のゲル画像。
オンコソームがmiRNAを豊富に含むようになっている。(A)MDA−MB231エクソソーム及びMCF10Aエクソソーム中の発現されたmiRNAの相関グラフ。(B)72hの無細胞培養の後、ノルモソームとオンコソームの間で差次的に発現されたmiRNAの6種(miR−10a、miR−10b、miR−21、miR−27a、miR−155、及びmiR−373)を利用した細胞中のmiRNAと各エクソソームの間の相関グラフ。(C)ノルモソーム及びオンコソームをDMEM培地に再懸濁させて、24及び72hの無細胞培養物に保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、72h後に採取されたエクソソーム中の腫瘍サプレッサ(TS)及び発癌性(ONC)miRNAの倍率変化の平均を、24h後に採取されたものに比較して表している。(D)24及び72hの無細胞培養後のノルモソーム、培養していないオンコソーム、並びに24h、72h及び96hの無細胞培養後のオンコソームから得られたmiRNA−10及びmiR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(E)72hの無細胞培養後の、MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞中の15種の定量されたmiRNAと、それらの各エクソソームの間の相関プロット。オンコソームは、ノルモソームと比較して(左グラフ)、起源細胞(中央及び右グラフ)との低い相関値を示している。(F)1秒(s)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示、並びにノルモソーム及びオンコソームのエクソソームRNA量のゲル画像。
オンコソームがmiRNAを豊富に含むようになっている。(A)MDA−MB231エクソソーム及びMCF10Aエクソソーム中の発現されたmiRNAの相関グラフ。(B)72hの無細胞培養の後、ノルモソームとオンコソームの間で差次的に発現されたmiRNAの6種(miR−10a、miR−10b、miR−21、miR−27a、miR−155、及びmiR−373)を利用した細胞中のmiRNAと各エクソソームの間の相関グラフ。(C)ノルモソーム及びオンコソームをDMEM培地に再懸濁させて、24及び72hの無細胞培養物に保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、72h後に採取されたエクソソーム中の腫瘍サプレッサ(TS)及び発癌性(ONC)miRNAの倍率変化の平均を、24h後に採取されたものに比較して表している。(D)24及び72hの無細胞培養後のノルモソーム、培養していないオンコソーム、並びに24h、72h及び96hの無細胞培養後のオンコソームから得られたmiRNA−10及びmiR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(E)72hの無細胞培養後の、MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞中の15種の定量されたmiRNAと、それらの各エクソソームの間の相関プロット。オンコソームは、ノルモソームと比較して(左グラフ)、起源細胞(中央及び右グラフ)との低い相関値を示している。(F)1秒(s)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示、並びにノルモソーム及びオンコソームのエクソソームRNA量のゲル画像。
エクソソームはpre−miRNAを含む。(A)試験された成熟miRNAに対応する15種のpre−miRNAを、MCF10A及びMDA−MB231エクソソームのqPCRを用いて定量した。存在量を反映するために、各pre−miRNAのΔCt値逆数をプロットしており、値は±s.d.として表している。(B)オンコソーム及びノルモソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、72hの無細胞培養後のMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養と比較して示しており、±s.d.として表している。(C)24h及び72hの無細胞培養後のMCF10A、並びに0h、24h、72h、及び96hの無細胞培養によるMDA−MB231オンコソームを用いたpre−iR−10b及びpre−miR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(D)上のグラフ:オンコソーム(MDA−MB231)の発癌性pre−miRNA(左グラフ)及び発癌性miRNA(右グラフ)を、24h及び72hの無細胞培養条件後に定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNA(左グラフ)及びmiRNA(右グラフ)のΔCt値の逆数をプロットしており、指数関数的傾向が認められた。示されたデータは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。下のグラフ:オンコソーム(MDA−MB231)のpre−miRNA(左グラフ)及び成熟miRNA(右グラフ)を、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96hの無細胞培養条件後に定量した。異なる時点での各pre−miRNA(左グラフ)及びmiRNA(右グラフ)のΔCt値の逆数をプロットしており、指数関数的傾向が認められた。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3回の独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。(E)オンコソーム及びノルモソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に0h、24h、72h及び96h保持した。エクソソームを異なる時点で抽出して、pre−miRNAをqPCRにより定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。
エクソソームはpre−miRNAを含む。(A)試験された成熟miRNAに対応する15種のpre−miRNAを、MCF10A及びMDA−MB231エクソソームのqPCRを用いて定量した。存在量を反映するために、各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットしており、値は±s.d.として表している。(B)オンコソーム及びノルモソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、72hの無細胞培養後のMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養と比較して示しており、±s.d.として表している。(C)24h及び72hの無細胞培養後のMCF10A、並びに0h、24h、72h、及び96hの無細胞培養によるMDA−MB231オンコソームを用いたpre−iR−10b及びpre−miR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(D)上のグラフ:オンコソーム(MDA−MB231)の発癌性pre−miRNA(左グラフ)及び発癌性miRNA(右グラフ)を、24h及び72hの無細胞培養条件後に定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNA(左グラフ)及びmiRNA(右グラフ)のΔCt値の逆数をプロットしており、指数関数的傾向が認められた。示されたデータは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。下のグラフ:オンコソーム(MDA−MB231)のpre−miRNA(左グラフ)及び成熟miRNA(右グラフ)を、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96hの無細胞培養条件後に定量した。異なる時点での各pre−miRNA(左グラフ)及びmiRNA(右グラフ)のΔCt値の逆数をプロットしており、指数関数的傾向が認められた。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3回の独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。(E)オンコソーム及びノルモソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に0h、24h、72h及び96h保持した。エクソソームを異なる時点で抽出して、pre−miRNAをqPCRにより定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。
エクソソームはpre−miRNAを含む。(A)試験された成熟miRNAに対応する15種のpre−miRNAを、MCF10A及びMDA−MB231エクソソームのqPCRを用いて定量した。存在量を反映するために、各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットしており、値は±s.d.として表している。(B)オンコソーム及びノルモソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、72hの無細胞培養後のMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養と比較して示しており、±s.d.として表している。(C)24h及び72hの無細胞培養後のMCF10A、並びに0h、24h、72h、及び96hの無細胞培養によるMDA−MB231オンコソームを用いたpre−iR−10b及びpre−miR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(D)上のグラフ:オンコソーム(MDA−MB231)の発癌性pre−miRNA(左グラフ)及び発癌性miRNA(右グラフ)を、24h及び72hの無細胞培養条件後に定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNA(左グラフ)及びmiRNA(右グラフ)のΔCt値の逆数をプロットしており、指数関数的傾向が認められた。示されたデータは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。下のグラフ:オンコソーム(MDA−MB231)のpre−miRNA(左グラフ)及び成熟miRNA(右グラフ)を、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96hの無細胞培養条件後に定量した。異なる時点での各pre−miRNA(左グラフ)及びmiRNA(右グラフ)のΔCt値の逆数をプロットしており、指数関数的傾向が認められた。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3回の独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。(E)オンコソーム及びノルモソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に0h、24h、72h及び96h保持した。エクソソームを異なる時点で抽出して、pre−miRNAをqPCRにより定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。
エクソソームはpre−miRNAを含む。(A)試験された成熟miRNAに対応する15種のpre−miRNAを、MCF10A及びMDA−MB231エクソソームのqPCRを用いて定量した。存在量を反映するために、各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットしており、値は±s.d.として表している。(B)オンコソーム及びノルモソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、72hの無細胞培養後のMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養と比較して示しており、±s.d.として表している。(C)24h及び72hの無細胞培養後のMCF10A、並びに0h、24h、72h、及び96hの無細胞培養によるMDA−MB231オンコソームを用いたpre−iR−10b及びpre−miR−21のノーザンブロット。tRNAMetを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(D)上のグラフ:オンコソーム(MDA−MB231)の発癌性pre−miRNA(左グラフ)及び発癌性miRNA(右グラフ)を、24h及び72hの無細胞培養条件後に定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNA(左グラフ)及びmiRNA(右グラフ)のΔCt値の逆数をプロットしており、指数関数的傾向が認められた。示されたデータは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。下のグラフ:オンコソーム(MDA−MB231)のpre−miRNA(左グラフ)及び成熟miRNA(右グラフ)を、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96hの無細胞培養条件後に定量した。異なる時点での各pre−miRNA(左グラフ)及びmiRNA(右グラフ)のΔCt値の逆数をプロットしており、指数関数的傾向が認められた。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3回の独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。(E)オンコソーム及びノルモソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に0h、24h、72h及び96h保持した。エクソソームを異なる時点で抽出して、pre−miRNAをqPCRにより定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。
オンコソームはRLCを含む。(A)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株;マウス癌細胞株67NR及び4T1;ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231から採取されたエクソソームにおける抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次にエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);及び余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK)であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(B)オンコソーム(MDA−MB231)において抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。右上の画像は、抽出物の新しい独立した画像からデジタル方式でズームしたものである。陰性対照は、IgGを指す。金粒子を黒色のドットとして表しており、下の画像では黒色の矢印により示されている。グラフは、左側の上2つの画像の定量を表す。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされた細胞から採取されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。CD9免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認し、負荷対照とした(下パネル)。(D)カルシウムイオノフォアA23187で処置されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上パネル)。未処置細胞から抽出されたエクソソームを対照として用いた。CD9免疫ブロット(したパネル)を対照として用いて、エクソソーム分泌の増加を示した。(E)MCF10A及びMDA−MB231親細胞、並びにshスクランブル及びshダイサー・プラスミドでトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上ブロット)。CD9免疫ブロットを用いてエクソソームの存在を示し、負荷対照とした(下ブロット)。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。(F)MDAMB231shダイサー細胞由来のオンコソーム中の抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。金粒子は、黒色のドットとして示されている。右のグラフは、EM写真の金粒子の定量を示す。(G)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗AGO2抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(H)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)を、エクソソームマーカとして用いた。(I)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチンを、負荷対照として用いた(下パネル)。(J)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソーム中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。(K)siAGO2でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中のAGO2mRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較のための相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(L)MCF10A及びMDA−MB231親細胞又はsi対照若しくはsiAGO2でトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(M)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(N)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。
オンコソームはRLCを含む。(A)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株;マウス癌細胞株67NR及び4T1;ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231から採取されたエクソソームにおける抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次にエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);及び余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK)であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(B)オンコソーム(MDA−MB231)において抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。右上の画像は、抽出物の新しい独立した画像からデジタル方式でズームしたものである。陰性対照は、IgGを指す。金粒子を黒色のドットとして表しており、下の画像では黒色の矢印により示されている。グラフは、左側の上2つの画像の定量を表す。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされた細胞から採取されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。CD9免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認し、負荷対照とした(下パネル)。(D)カルシウムイオノフォアA23187で処置されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上パネル)。未処置細胞から抽出されたエクソソームを対照として用いた。CD9免疫ブロット(したパネル)を対照として用いて、エクソソーム分泌の増加を示した。(E)MCF10A及びMDA−MB231親細胞、並びにshスクランブル及びshダイサー・プラスミドでトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上ブロット)。CD9免疫ブロットを用いてエクソソームの存在を示し、負荷対照とした(下ブロット)。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。(F)MDAMB231shダイサー細胞由来のオンコソーム中の抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。金粒子は、黒色のドットとして示されている。右のグラフは、EM写真の金粒子の定量を示す。(G)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗AGO2抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(H)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)を、エクソソームマーカとして用いた。(I)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチンを、負荷対照として用いた(下パネル)。(J)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソーム中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。(K)siAGO2でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中のAGO2 mRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較のための相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(L)MCF10A及びMDA−MB231親細胞又はsi対照若しくはsiAGO2でトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(M)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(N)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。
オンコソームはRLCを含む。(A)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株;マウス癌細胞株67NR及び4T1;ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231から採取されたエクソソームにおける抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次にエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);及び余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK)であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(B)オンコソーム(MDA−MB231)において抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。右上の画像は、抽出物の新しい独立した画像からデジタル方式でズームしたものである。陰性対照は、IgGを指す。金粒子を黒色のドットとして表しており、下の画像では黒色の矢印により示されている。グラフは、左側の上2つの画像の定量を表す。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされた細胞から採取されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。CD9免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認し、負荷対照とした(下パネル)。(D)カルシウムイオノフォアA23187で処置されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上パネル)。未処置細胞から抽出されたエクソソームを対照として用いた。CD9免疫ブロット(したパネル)を対照として用いて、エクソソーム分泌の増加を示した。(E)MCF10A及びMDA−MB231親細胞、並びにshスクランブル及びshダイサー・プラスミドでトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上ブロット)。CD9免疫ブロットを用いてエクソソームの存在を示し、負荷対照とした(下ブロット)。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。(F)MDAMB231shダイサー細胞由来のオンコソーム中の抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。金粒子は、黒色のドットとして示されている。右のグラフは、EM写真の金粒子の定量を示す。(G)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗AGO2抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(H)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)を、エクソソームマーカとして用いた。(I)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチンを、負荷対照として用いた(下パネル)。(J)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソーム中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。(K)siAGO2でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中のAGO2 mRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較のための相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(L)MCF10A及びMDA−MB231親細胞又はsi対照若しくはsiAGO2でトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(M)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(N)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。
オンコソームはRLCを含む。(A)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株;マウス癌細胞株67NR及び4T1;ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231から採取されたエクソソームにおける抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次にエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);及び余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK)であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(B)オンコソーム(MDA−MB231)において抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。右上の画像は、抽出物の新しい独立した画像からデジタル方式でズームしたものである。陰性対照は、IgGを指す。金粒子を黒色のドットとして表しており、下の画像では黒色の矢印により示されている。グラフは、左側の上2つの画像の定量を表す。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされた細胞から採取されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。CD9免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認し、負荷対照とした(下パネル)。(D)カルシウムイオノフォアA23187で処置されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上パネル)。未処置細胞から抽出されたエクソソームを対照として用いた。CD9免疫ブロット(したパネル)を対照として用いて、エクソソーム分泌の増加を示した。(E)MCF10A及びMDA−MB231親細胞、並びにshスクランブル及びshダイサー・プラスミドでトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上ブロット)。CD9免疫ブロットを用いてエクソソームの存在を示し、負荷対照とした(下ブロット)。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。(F)MDAMB231shダイサー細胞由来のオンコソーム中の抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。金粒子は、黒色のドットとして示されている。右のグラフは、EM写真の金粒子の定量を示す。(G)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗AGO2抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(H)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)を、エクソソームマーカとして用いた。(I)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチンを、負荷対照として用いた(下パネル)。(J)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソーム中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。(K)siAGO2でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中のAGO2 mRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較のための相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(L)MCF10A及びMDA−MB231親細胞又はsi対照若しくはsiAGO2でトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(M)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(N)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。
オンコソームはRLCを含む。(A)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株;マウス癌細胞株67NR及び4T1;ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231から採取されたエクソソームにおける抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次にエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);及び余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK)であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(B)オンコソーム(MDA−MB231)において抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。右上の画像は、抽出物の新しい独立した画像からデジタル方式でズームしたものである。陰性対照は、IgGを指す。金粒子を黒色のドットとして表しており、下の画像では黒色の矢印により示されている。グラフは、左側の上2つの画像の定量を表す。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされた細胞から採取されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。CD9免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認し、負荷対照とした(下パネル)。(D)カルシウムイオノフォアA23187で処置されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上パネル)。未処置細胞から抽出されたエクソソームを対照として用いた。CD9免疫ブロット(したパネル)を対照として用いて、エクソソーム分泌の増加を示した。(E)MCF10A及びMDA−MB231親細胞、並びにshスクランブル及びshダイサー・プラスミドでトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上ブロット)。CD9免疫ブロットを用いてエクソソームの存在を示し、負荷対照とした(下ブロット)。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。(F)MDAMB231shダイサー細胞由来のオンコソーム中の抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。金粒子は、黒色のドットとして示されている。右のグラフは、EM写真の金粒子の定量を示す。(G)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗AGO2抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(H)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)を、エクソソームマーカとして用いた。(I)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチンを、負荷対照として用いた(下パネル)。(J)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソーム中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。(K)siAGO2でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中のAGO2 mRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較のための相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(L)MCF10A及びMDA−MB231親細胞又はsi対照若しくはsiAGO2でトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(M)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(N)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。
オンコソームはRLCを含む。(A)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株;マウス癌細胞株67NR及び4T1;ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231から採取されたエクソソームにおける抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次にエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);及び余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK)であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(B)オンコソーム(MDA−MB231)において抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。右上の画像は、抽出物の新しい独立した画像からデジタル方式でズームしたものである。陰性対照は、IgGを指す。金粒子を黒色のドットとして表しており、下の画像では黒色の矢印により示されている。グラフは、左側の上2つの画像の定量を表す。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされた細胞から採取されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。CD9免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認し、負荷対照とした(下パネル)。(D)カルシウムイオノフォアA23187で処置されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上パネル)。未処置細胞から抽出されたエクソソームを対照として用いた。CD9免疫ブロット(したパネル)を対照として用いて、エクソソーム分泌の増加を示した。(E)MCF10A及びMDA−MB231親細胞、並びにshスクランブル及びshダイサー・プラスミドでトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上ブロット)。CD9免疫ブロットを用いてエクソソームの存在を示し、負荷対照とした(下ブロット)。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。(F)MDAMB231shダイサー細胞由来のオンコソーム中の抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。金粒子は、黒色のドットとして示されている。右のグラフは、EM写真の金粒子の定量を示す。(G)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗AGO2抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(H)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)を、エクソソームマーカとして用いた。(I)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチンを、負荷対照として用いた(下パネル)。(J)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソーム中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。(K)siAGO2でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中のAGO2 mRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較のための相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(L)MCF10A及びMDA−MB231親細胞又はsi対照若しくはsiAGO2でトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(M)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(N)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。
オンコソームはRLCを含む。(A)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株;マウス癌細胞株67NR及び4T1;ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231から採取されたエクソソームにおける抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次にエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);及び余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK)であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(B)オンコソーム(MDA−MB231)において抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。右上の画像は、抽出物の新しい独立した画像からデジタル方式でズームしたものである。陰性対照は、IgGを指す。金粒子を黒色のドットとして表しており、下の画像では黒色の矢印により示されている。グラフは、左側の上2つの画像の定量を表す。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされた細胞から採取されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。CD9免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認し、負荷対照とした(下パネル)。(D)カルシウムイオノフォアA23187で処置されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上パネル)。未処置細胞から抽出されたエクソソームを対照として用いた。CD9免疫ブロット(したパネル)を対照として用いて、エクソソーム分泌の増加を示した。(E)MCF10A及びMDA−MB231親細胞、並びにshスクランブル及びshダイサー・プラスミドでトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上ブロット)。CD9免疫ブロットを用いてエクソソームの存在を示し、負荷対照とした(下ブロット)。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。(F)MDAMB231shダイサー細胞由来のオンコソーム中の抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。金粒子は、黒色のドットとして示されている。右のグラフは、EM写真の金粒子の定量を示す。(G)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗AGO2抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(H)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)を、エクソソームマーカとして用いた。(I)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチンを、負荷対照として用いた(下パネル)。(J)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソーム中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。(K)siAGO2でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中のAGO2 mRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較のための相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(L)MCF10A及びMDA−MB231親細胞又はsi対照若しくはsiAGO2でトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(M)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(N)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。
オンコソームはRLCを含む。(A)非腫瘍原性マウス(NMuMG)及びヒト(MCF10A)細胞株;マウス癌細胞株67NR及び4T1;ヒト癌細胞株MCF7及びMDA−MB231から採取されたエクソソームにおける抗ダイサー抗体を利用した免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次にエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);及び余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK)であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(B)オンコソーム(MDA−MB231)において抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。右上の画像は、抽出物の新しい独立した画像からデジタル方式でズームしたものである。陰性対照は、IgGを指す。金粒子を黒色のドットとして表しており、下の画像では黒色の矢印により示されている。グラフは、左側の上2つの画像の定量を表す。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされた細胞から採取されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソーム中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。CD9免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認し、負荷対照とした(下パネル)。(D)カルシウムイオノフォアA23187で処置されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上パネル)。未処置細胞から抽出されたエクソソームを対照として用いた。CD9免疫ブロット(したパネル)を対照として用いて、エクソソーム分泌の増加を示した。(E)MCF10A及びMDA−MB231親細胞、並びにshスクランブル及びshダイサー・プラスミドでトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のダイサーの免疫ブロット(上ブロット)。CD9免疫ブロットを用いてエクソソームの存在を示し、負荷対照とした(下ブロット)。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。(F)MDAMB231shダイサー細胞由来のオンコソーム中の抗ダイサー抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡写真。金粒子は、黒色のドットとして示されている。右のグラフは、EM写真の金粒子の定量を示す。(G)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗AGO2抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)の免疫ブロットを用いて、エクソソームの存在を確認した。(H)オンコソーム(MCF7及びMDA−MB231)及びノルモソーム(MCF10A)から採取されたエクソソーム中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット。用いられた対照は、エクソソームの溶解と、次のエクソソームタンパク質の分解を誘導するために、トリトンXに続いてプロテオキナーゼKで処置されたエクソソーム(トリトン+PK);余分のエクソソームタンパク質を分解するためにプロテイナーゼKで処置されたエクソソーム(PK);及びエクソソームを採取するための超遠心分離後の上清(上清)、であった。TSG101(二列目)及びCD9(三列目)を、エクソソームマーカとして用いた。(I)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチンを、負荷対照として用いた(下パネル)。(J)GFP−AGO2プラスミドでトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソーム中の抗GFP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。(K)siAGO2でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中のAGO2 mRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較のための相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(L)MCF10A及びMDA−MB231親細胞又はsi対照若しくはsiAGO2でトランスフェクトされた細胞から抽出されたエクソソーム中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。TSG101(中央パネル)及びCD9(下パネル)を、エクソソームマーカ及び負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(M)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(N)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、±s.d.として表している。(B)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を示し、±s.d.として表している。(C)MDA−MB231細胞のエクソソーム中で電気穿孔された重鎖(HC)及び軽鎖(LC)一次ダイサー抗体と、一次アクチン抗体を検出するための抗ウサギ及び抗マウス二次抗体と、を用いた免疫ブロット。MDA−MB231細胞由来の抗体を含まずに電気穿孔されたエクソソームを、陰性対照として用いた。プロテアーゼK処置を電気穿孔後に実施して、エクソソーム中に含まれない抗体の消耗を確認した。(D)オンコソーム(MDA−MB231)は、2本ずつ(下グラフ)又は4本ずつ(上グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性pre−miRNA(上グラフ)、又は15種のpre−miRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(E)オンコソーム(MDA−MB231)を4本ずつ(上グラフ)又は2本ずつ(下グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性miRNA(上グラフ)、又は15種のmiRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、±s.d.として表している。(B)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を示し、±s.d.として表している。(C)MDA−MB231細胞のエクソソーム中で電気穿孔された重鎖(HC)及び軽鎖(LC)一次ダイサー抗体と、一次アクチン抗体を検出するための抗ウサギ及び抗マウス二次抗体と、を用いた免疫ブロット。MDA−MB231細胞由来の抗体を含まずに電気穿孔されたエクソソームを、陰性対照として用いた。プロテアーゼK処置を電気穿孔後に実施して、エクソソーム中に含まれない抗体の消耗を確認した。(D)オンコソーム(MDA−MB231)は、2本ずつ(下グラフ)又は4本ずつ(上グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性pre−miRNA(上グラフ)、又は15種のpre−miRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(E)オンコソーム(MDA−MB231)を4本ずつ(上グラフ)又は2本ずつ(下グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性miRNA(上グラフ)、又は15種のmiRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、±s.d.として表している。(B)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を示し、±s.d.として表している。(C)MDA−MB231細胞のエクソソーム中で電気穿孔された重鎖(HC)及び軽鎖(LC)一次ダイサー抗体と、一次アクチン抗体を検出するための抗ウサギ及び抗マウス二次抗体と、を用いた免疫ブロット。MDA−MB231細胞由来の抗体を含まずに電気穿孔されたエクソソームを、陰性対照として用いた。プロテアーゼK処置を電気穿孔後に実施して、エクソソーム中に含まれない抗体の消耗を確認した。(D)オンコソーム(MDA−MB231)は、2本ずつ(下グラフ)又は4本ずつ(上グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性pre−miRNA(上グラフ)、又は15種のpre−miRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(E)オンコソーム(MDA−MB231)を4本ずつ(上グラフ)又は2本ずつ(下グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性miRNA(上グラフ)、又は15種のmiRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、±s.d.として表している。(B)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を示し、±s.d.として表している。(C)MDA−MB231細胞のエクソソーム中で電気穿孔された重鎖(HC)及び軽鎖(LC)一次ダイサー抗体と、一次アクチン抗体を検出するための抗ウサギ及び抗マウス二次抗体と、を用いた免疫ブロット。MDA−MB231細胞由来の抗体を含まずに電気穿孔されたエクソソームを、陰性対照として用いた。プロテアーゼK処置を電気穿孔後に実施して、エクソソーム中に含まれない抗体の消耗を確認した。(D)オンコソーム(MDA−MB231)は、2本ずつ(下グラフ)又は4本ずつ(上グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性pre−miRNA(上グラフ)、又は15種のpre−miRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(E)オンコソーム(MDA−MB231)を4本ずつ(上グラフ)又は2本ずつ(下グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性miRNA(上グラフ)、又は15種のmiRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、±s.d.として表している。(B)エクソソームを、MCF10A、MCF10A shスクランブル、MCF10A shダイサー細胞(上グラフ)、MDA−MB231、MDA−MB231 shスクランブル及びMDA−MB231 shダイサー細胞(下グラフ)から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養の後の異なるエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を示し、±s.d.として表している。(C)MDA−MB231細胞のエクソソーム中で電気穿孔された重鎖(HC)及び軽鎖(LC)一次ダイサー抗体と、一次アクチン抗体を検出するための抗ウサギ及び抗マウス二次抗体と、を用いた免疫ブロット。MDA−MB231細胞由来の抗体を含まずに電気穿孔されたエクソソームを、陰性対照として用いた。プロテアーゼK処置を電気穿孔後に実施して、エクソソーム中に含まれない抗体の消耗を確認した。(D)オンコソーム(MDA−MB231)は、2本ずつ(下グラフ)又は4本ずつ(上グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性pre−miRNA(上グラフ)、又は15種のpre−miRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(E)オンコソーム(MDA−MB231)を4本ずつ(上グラフ)又は2本ずつ(下グラフ)採取した。試料を抗ダイサー抗体、抗アクチン抗体、又は抗TRBP抗体と共に電気穿孔した。試料+対照を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、6種の発癌性miRNA(上グラフ)、又は15種のmiRNA(下グラフ)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNA(下のグラフにおいて、TS=腫瘍サプレッサ;ONC=発癌性)の平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)MDA−MB231細胞のエクソソームを採取して、ゲルダナマイシンと共に電気穿孔した。試料を無細胞培養条件で24及び72h放置し、その後、エクソソームを抽出して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの倍率変化を表し、±s.d.として表している。(B)合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1を、MCF10A(MCF10A電気泳動)、MCF10Ashダイサー(MCF10Ashダイサー電気泳動)、MDAMB231(MDA−MB231電気泳動)及びMDA−MB231shダイサー(MDAMB231shダイサー電気泳動)細胞から採取されたエクソソーム中で電気穿孔した。72h無細胞培養条件後に、エクソソームを採取した。72h電気穿孔及び培養の前後に、pre−miRNA−10b、−21及びcel−1をqPCRにより定量した。プロットの各バーは、電気穿孔の0h後に比較した電気穿孔の72h後のpre−miRNA−10b、−21及びcel−1の倍率変化を示しており、±s.d.として表している。pre−miRNAの非存在下で電気穿孔されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソームを、対象として用いて、ベースレベルを強調した。(C)合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1を、MCF10A(MCF10A電気泳動)、MCF10Ashダイサー(MCF10Ashダイサー電気泳動)、MDAMB231(MDA−MB231電気泳動)及びMDA−MB231shダイサー(MDAMB231shダイサー電気泳動)細胞から採取されたエクソソーム中に電気穿孔した。無細胞培養条件で72h後に、エクソソームを採取した。72hの電気穿孔及び培養の前後に、MiR−10b、−21及びcel−1をqPCRにより定量した。プロットの各バーは、電気穿孔の0h後(上グラフ)又は24h後(下グラフ)に比較した、電気穿孔の72h後のmiR−10b、−21及びcel−1の倍率変化を示しており、±s.d.として表している。pre−miRNAの非存在下で電気穿孔されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソームを、所定のベースレベルへの対照として用いた。(D)検出プローブを用いずダイシングアッセイ(dicing assay)から得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチン内部標識された合成pre−miR−10bを、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサークローン1及びクローン2から得たエクソソーム(それぞれMDA231shダイサー 1 exos及びMDA231shダイサー 2 exos)、MDA−MB231shダイサー細胞、並びにダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos + ダイサーAB)であった。(E)検出プローブを用いずダイシングアッセイから得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−miR−21を、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサークローン1及びクローン2から得たエクソソーム(それぞれMDA231shダイサー 1 Exos及びMDA231shダイサー 2 Exos)、MDA−MB231shダイサー細胞、並びにダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos +ダイサーAB)であった。(F)検出プローブを用いずダイシングアッセイから得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−cel−miR−1を、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサーエクソソーム(MDA231shダイサー exos)、及びダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos +ダイサーAB)であった。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)MDA−MB231細胞のエクソソームを採取して、ゲルダナマイシンと共に電気穿孔した。試料を無細胞培養条件で24及び72h放置し、その後、エクソソームを抽出して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの倍率変化を表し、±s.d.として表している。(B)合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1を、MCF10A(MCF10A電気泳動)、MCF10Ashダイサー(MCF10Ashダイサー電気泳動)、MDAMB231(MDA−MB231電気泳動)及びMDA−MB231shダイサー(MDAMB231shダイサー電気泳動)細胞から採取されたエクソソーム中で電気穿孔した。72h無細胞培養条件後に、エクソソームを採取した。72h電気穿孔及び培養の前後に、pre−miRNA−10b、−21及びcel−1をqPCRにより定量した。プロットの各バーは、電気穿孔の0h後に比較した電気穿孔の72h後のpre−miRNA−10b、−21及びcel−1の倍率変化を示しており、±s.d.として表している。pre−miRNAの非存在下で電気穿孔されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソームを、対象として用いて、ベースレベルを強調した。(C)合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1を、MCF10A(MCF10A電気泳動)、MCF10Ashダイサー(MCF10Ashダイサー電気泳動)、MDAMB231(MDA−MB231電気泳動)及びMDA−MB231shダイサー(MDAMB231shダイサー電気泳動)細胞から採取されたエクソソーム中に電気穿孔した。無細胞培養条件で72h後に、エクソソームを採取した。72hの電気穿孔及び培養の前後に、MiR−10b、−21及びcel−1をqPCRにより定量した。プロットの各バーは、電気穿孔の0h後(上グラフ)又は24h後(下グラフ)に比較した、電気穿孔の72h後のmiR−10b、−21及びcel−1の倍率変化を示しており、±s.d.として表している。pre−miRNAの非存在下で電気穿孔されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソームを、所定のベースレベルへの対照として用いた。(D)検出プローブを用いずダイシングアッセイ(dicing assay)から得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−miR−10bを、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサークローン1及びクローン2から得たエクソソーム(それぞれMDA231shダイサー 1 exos及びMDA231shダイサー 2 exos)、MDA−MB231shダイサー細胞、並びにダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos + ダイサーAB)であった。(E)検出プローブを用いずダイシングアッセイから得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−miR−21を、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサークローン1及びクローン2から得たエクソソーム(それぞれMDA231shダイサー 1 Exos及びMDA231shダイサー 2 Exos)、MDA−MB231shダイサー細胞、並びにダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos +ダイサーAB)であった。(F)検出プローブを用いずダイシングアッセイから得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−cel−miR−1を、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサーエクソソーム(MDA231shダイサー exos)、及びダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos +ダイサーAB)であった。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)MDA−MB231細胞のエクソソームを採取して、ゲルダナマイシンと共に電気穿孔した。試料を無細胞培養条件で24及び72h放置し、その後、エクソソームを抽出して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの倍率変化を表し、±s.d.として表している。(B)合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1を、MCF10A(MCF10A電気泳動)、MCF10Ashダイサー(MCF10Ashダイサー電気泳動)、MDAMB231(MDA−MB231電気泳動)及びMDA−MB231shダイサー(MDAMB231shダイサー電気泳動)細胞から採取されたエクソソーム中で電気穿孔した。72h無細胞培養条件後に、エクソソームを採取した。72h電気穿孔及び培養の前後に、pre−miRNA−10b、−21及びcel−1をqPCRにより定量した。プロットの各バーは、電気穿孔の0h後に比較した電気穿孔の72h後のpre−miRNA−10b、−21及びcel−1の倍率変化を示しており、±s.d.として表している。pre−miRNAの非存在下で電気穿孔されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソームを、対象として用いて、ベースレベルを強調した。(C)合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1を、MCF10A(MCF10A電気泳動)、MCF10Ashダイサー(MCF10Ashダイサー電気泳動)、MDAMB231(MDA−MB231電気泳動)及びMDA−MB231shダイサー(MDAMB231shダイサー電気泳動)細胞から採取されたエクソソーム中に電気穿孔した。無細胞培養条件で72h後に、エクソソームを採取した。72hの電気穿孔及び培養の前後に、MiR−10b、−21及びcel−1をqPCRにより定量した。プロットの各バーは、電気穿孔の0h後(上グラフ)又は24h後(下グラフ)に比較した、電気穿孔の72h後のmiR−10b、−21及びcel−1の倍率変化を示しており、±s.d.として表している。pre−miRNAの非存在下で電気穿孔されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソームを、所定のベースレベルへの対照として用いた。(D)検出プローブを用いずダイシングアッセイ(dicing assay)から得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−miR−10bを、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサークローン1及びクローン2から得たエクソソーム(それぞれMDA231shダイサー 1 exos及びMDA231shダイサー 2 exos)、MDA−MB231shダイサー細胞、並びにダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos + ダイサーAB)であった。(E)検出プローブを用いずダイシングアッセイから得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−miR−21を、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサークローン1及びクローン2から得たエクソソーム(それぞれMDA231shダイサー 1 Exos及びMDA231shダイサー 2 Exos)、MDA−MB231shダイサー細胞、並びにダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos +ダイサーAB)であった。(F)検出プローブを用いずダイシングアッセイから得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−cel−miR−1を、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサーエクソソーム(MDA231shダイサー exos)、及びダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos +ダイサーAB)であった。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
オンコソームは、pre−miRNAをプロセシングして成熟miRNAを生成する。(A)MDA−MB231細胞のエクソソームを採取して、ゲルダナマイシンと共に電気穿孔した。試料を無細胞培養条件で24及び72h放置し、その後、エクソソームを抽出して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの倍率変化を表し、±s.d.として表している。(B)合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1を、MCF10A(MCF10A電気泳動)、MCF10Ashダイサー(MCF10Ashダイサー電気泳動)、MDAMB231(MDA−MB231電気泳動)及びMDA−MB231shダイサー(MDAMB231shダイサー電気泳動)細胞から採取されたエクソソーム中で電気穿孔した。72h無細胞培養条件後に、エクソソームを採取した。72h電気穿孔及び培養の前後に、pre−miRNA−10b、−21及びcel−1をqPCRにより定量した。プロットの各バーは、電気穿孔の0h後に比較した電気穿孔の72h後のpre−miRNA−10b、−21及びcel−1の倍率変化を示しており、±s.d.として表している。pre−miRNAの非存在下で電気穿孔されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソームを、対象として用いて、ベースレベルを強調した。(C)合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1を、MCF10A(MCF10A電気泳動)、MCF10Ashダイサー(MCF10Ashダイサー電気泳動)、MDAMB231(MDA−MB231電気泳動)及びMDA−MB231shダイサー(MDAMB231shダイサー電気泳動)細胞から採取されたエクソソーム中に電気穿孔した。無細胞培養条件で72h後に、エクソソームを採取した。72hの電気穿孔及び培養の前後に、MiR−10b、−21及びcel−1をqPCRにより定量した。プロットの各バーは、電気穿孔の0h後(上グラフ)又は24h後(下グラフ)に比較した、電気穿孔の72h後のmiR−10b、−21及びcel−1の倍率変化を示しており、±s.d.として表している。pre−miRNAの非存在下で電気穿孔されたMCF10A及びMDA−MB231エクソソームを、所定のベースレベルへの対照として用いた。(D)検出プローブを用いずダイシングアッセイ(dicing assay)から得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−miR−10bを、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサークローン1及びクローン2から得たエクソソーム(それぞれMDA231shダイサー 1 exos及びMDA231shダイサー 2 exos)、MDA−MB231shダイサー細胞、並びにダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos + ダイサーAB)であった。(E)検出プローブを用いずダイシングアッセイから得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−miR−21を、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサークローン1及びクローン2から得たエクソソーム(それぞれMDA231shダイサー 1 Exos及びMDA231shダイサー 2 Exos)、MDA−MB231shダイサー細胞、並びにダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos +ダイサーAB)であった。(F)検出プローブを用いずダイシングアッセイから得た試料を用いたノーザンブロット。異なるエクソソームタンパク質抽出物、及びビオチンで内部標識された合成pre−cel−miR−1を、ダイシングアッセイに用いた。用いられた試料は、MCF10A、MCF10Ashダイサー、MDAMB231エクソソーム(MDA231 Exos)、MDA−MB231shダイサーエクソソーム(MDA231shダイサー exos)、及びダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA231 exos +ダイサーAB)であった。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
オンコソームは、ダイサー依存的にレシピエント細胞におけるトランスクリプトーム改変及び腫瘍形成を誘導する。(A)抗PTEN抗体と、無細胞培養後にMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(B)抗HOXD10抗体と、無細胞培養条件後にMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(C)3’UTR−PTEN−WT、3’UTRPTEN−Mut、3’UTR−HOXD10−WT及び3’UTR−HOXD10−Mutで一過性トランスフェクトされ、MDA−MB231細胞から得られたオンコソームで処置されたMCF10A細胞中のルシフェラーゼレポータ活性を示すグラフ。(D)抗PTEN抗体(上パネル)及び抗HOXD10抗体(中パネル)、並びに無細胞培養条件後にダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(E)抗Smad4抗体(上パネル)、MCF10A細胞のタンパク質抽出物、並びに抗miR−182−5pを有するMDA−MB231エクソソーム及び無細胞培養時間を含まないMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(F)MCF10A細胞、無細胞培養時間を含まずにMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A + MDA231 exos)、無細胞培養時間を含みMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231exos培養物)、及び無細胞培養時間を含みダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231exos ダイサーAB)の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率であり、±s.d.として表している。* p=0.0027。(G)コロニー形成アッセイにより、8日のMCF10A細胞培養、無細胞培養時間を含まずにMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A + MDA231 exos)、無細胞培養時間を含みMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos培養物)、及び無細胞培養時間を含みダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos ダイサーAB)の後に、培養プレート中でMTT試薬で標識されたコロニーの形成を示している。(H)上グラフ:MCF10A細胞、MDA−MB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos培養物)、ダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos ダイサーAB)、及びのアクチン抗体と共に電気穿孔されたMDAMB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exosアクチンAB)を、無胸腺ヌードマウス乳房脂肪体同所性に注射した。グラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。*p=0.005。下グラフ:MCF10A細胞、MDA−MB231細胞及びオンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MDA−MB231)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。グラフは、時間に対する腫瘍体積を示している。
オンコソームは、ダイサー依存的にレシピエント細胞におけるトランスクリプトーム改変及び腫瘍形成を誘導する。(A)抗PTEN抗体と、無細胞培養後にMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(B)抗HOXD10抗体と、無細胞培養条件後にMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(C)3’UTR−PTEN−WT、3’UTRPTEN−Mut、3’UTR−HOXD10−WT及び3’UTR−HOXD10−Mutで一過性トランスフェクトされ、MDA−MB231細胞から得られたオンコソームで処置されたMCF10A細胞中のルシフェラーゼレポータ活性を示すグラフ。(D)抗PTEN抗体(上パネル)及び抗HOXD10抗体(中パネル)、並びに無細胞培養条件後にダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(E)抗Smad4抗体(上パネル)、MCF10A細胞のタンパク質抽出物、並びに抗miR−182−5pを有するMDA−MB231エクソソーム及び無細胞培養時間を含まないMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(F)MCF10A細胞、無細胞培養時間を含まずにMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A + MDA231 exos)、無細胞培養時間を含みMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231exos培養物)、及び無細胞培養時間を含みダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231exos ダイサーAB)の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率であり、±s.d.として表している。* p=0.0027。(G)コロニー形成アッセイにより、8日のMCF10A細胞培養、無細胞培養時間を含まずにMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A + MDA231 exos)、無細胞培養時間を含みMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos培養物)、及び無細胞培養時間を含みダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos ダイサーAB)の後に、培養プレート中でMTT試薬で標識されたコロニーの形成を示している。(H)上グラフ:MCF10A細胞、MDA−MB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos培養物)、ダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos ダイサーAB)、及びのアクチン抗体と共に電気穿孔されたMDAMB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exosアクチンAB)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。グラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。*p=0.005。下グラフ:MCF10A細胞、MDA−MB231細胞及びオンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MDA−MB231)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。グラフは、時間に対する腫瘍体積を示している。
オンコソームは、ダイサー依存的にレシピエント細胞におけるトランスクリプトーム改変及び腫瘍形成を誘導する。(A)抗PTEN抗体と、無細胞培養後にMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(B)抗HOXD10抗体と、無細胞培養条件後にMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(C)3’UTR−PTEN−WT、3’UTRPTEN−Mut、3’UTR−HOXD10−WT及び3’UTR−HOXD10−Mutで一過性トランスフェクトされ、MDA−MB231細胞から得られたオンコソームで処置されたMCF10A細胞中のルシフェラーゼレポータ活性を示すグラフ。(D)抗PTEN抗体(上パネル)及び抗HOXD10抗体(中パネル)、並びに無細胞培養条件後にダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(E)抗Smad4抗体(上パネル)、MCF10A細胞のタンパク質抽出物、並びに抗miR−182−5pを有するMDA−MB231エクソソーム及び無細胞培養時間を含まないMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(F)MCF10A細胞、無細胞培養時間を含まずにMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A + MDA231 exos)、無細胞培養時間を含みMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231exos培養物)、及び無細胞培養時間を含みダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231exos ダイサーAB)の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率であり、±s.d.として表している。* p=0.0027。(G)コロニー形成アッセイにより、8日のMCF10A細胞培養、無細胞培養時間を含まずにMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A + MDA231 exos)、無細胞培養時間を含みMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos培養物)、及び無細胞培養時間を含みダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos ダイサーAB)の後に、培養プレート中でMTT試薬で標識されたコロニーの形成を示している。(H)上グラフ:MCF10A細胞、MDA−MB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos培養物)、ダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos ダイサーAB)、及びのアクチン抗体と共に電気穿孔されたMDAMB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exosアクチンAB)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。グラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。*p=0.005。下グラフ:MCF10A細胞、MDA−MB231細胞及びオンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MDA−MB231)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。グラフは、時間に対する腫瘍体積を示している。
オンコソームは、ダイサー依存的にレシピエント細胞におけるトランスクリプトーム改変及び腫瘍形成を誘導する。(A)抗PTEN抗体と、無細胞培養後にMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(B)抗HOXD10抗体と、無細胞培養条件後にMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(C)3’UTR−PTEN−WT、3’UTRPTEN−Mut、3’UTR−HOXD10−WT及び3’UTR−HOXD10−Mutで一過性トランスフェクトされ、MDA−MB231細胞から得られたオンコソームで処置されたMCF10A細胞中のルシフェラーゼレポータ活性を示すグラフ。(D)抗PTEN抗体(上パネル)及び抗HOXD10抗体(中パネル)、並びに無細胞培養条件後にダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(E)抗Smad4抗体(上パネル)、MCF10A細胞のタンパク質抽出物、並びに抗miR−182−5pを有するMDA−MB231エクソソーム及び無細胞培養時間を含まないMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(F)MCF10A細胞、無細胞培養時間を含まずにMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A + MDA231 exos)、無細胞培養時間を含みMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231exos培養物)、及び無細胞培養時間を含みダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231exos ダイサーAB)の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率であり、±s.d.として表している。* p=0.0027。(G)コロニー形成アッセイにより、8日のMCF10A細胞培養、無細胞培養時間を含まずにMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A + MDA231 exos)、無細胞培養時間を含みMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos培養物)、及び無細胞培養時間を含みダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos ダイサーAB)の後に、培養プレート中でMTT試薬で標識されたコロニーの形成を示している。(H)上グラフ:MCF10A細胞、MDA−MB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos培養物)、ダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exos ダイサーAB)、及びのアクチン抗体と共に電気穿孔されたMDAMB231オンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MCF10A細胞 + MDA231 exosアクチンAB)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。グラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。*p=0.005。下グラフ:MCF10A細胞、MDA−MB231細胞及びオンコソームに暴露されたMCF10A細胞(MDA−MB231)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。グラフは、時間に対する腫瘍体積を示している。
乳癌患者の血清は、ダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングする。(A)ヒト及びマウスのダイサーを認識する抗ダイサー抗体と、ヒト腫瘍異種移植されたマウスから採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット(図18Aに示す)。OVA1−5は、ヒト卵巣異種移植片を表し;END1−3は、ヒト子宮内膜異種移植片を表し;BRST1及び2は、ヒト乳癌異種移植片を表す。4T1エクソソーム及び細胞を、ネズミダイサーの対照として用いた。hsa−ダイサーは、ヒトダイサー分子量を表し、mmu−ダイサーは、ネズミダイサー分子量を表す。負荷対照としての膜のクーマシー染色については図18Dを参照されたい。(B)8名の健常ドナー(左グラフ)及び11名の乳癌患者(右グラフ)の血清から抽出されたエクソソームのサイズ分布を示すNanoSight粒子トラッキング分析。サイズをより上手く示すために、試料の濃度を標準化した。(C)乳癌患者の血清から採取されたエクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)NanoSight粒子トラッキング分析により評価された8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の血清から得たエクソソームの濃度。* p=0.012。(E)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNAの平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(F)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのドットプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの平均倍率変化を表す。パネルE及びFは両者とも、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(G)MCF10A細胞、健常なドナーのエクソソームと混合されたMCF10A細胞(H1−8)及び乳癌患者のエクソソームと混合されたMCF10A細胞(BC1−11)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。用いられたエクソソームの数は体重あたりで計算されており、血清から回収された初期濃度を反映している。腫瘍を形成しなかった試料は、グラフのX軸と重なって見える。このグラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。(H)抗ダイサー抗体と、5名の健常個体(C46、C45、C44、C43及びC41)及び4名の転移性乳癌(Met219、Met354、Met299及びMet356)から採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用い、負荷対照としてCD9ブロットを用いた免疫ブロット。(I)HDF及びオンコソーム(MDA−MB231)で処置されたHDFの倍加時間。* p=0.0114。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。
乳癌患者の血清は、ダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングする。(A)ヒト及びマウスのダイサーを認識する抗ダイサー抗体と、ヒト腫瘍で異種移植されたマウスから採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット(図18Aに示す)。OVA1−5は、ヒト卵巣異種移植片を表し;END1−3は、ヒト子宮内膜異種移植片を表し;BRST1及び2は、ヒト乳癌異種移植片を表す。4T1エクソソーム及び細胞を、ネズミダイサーの対照として用いた。hsa−ダイサーは、ヒトダイサー分子量を表し、mmu−ダイサーは、ネズミダイサー分子量を表す。負荷対照としての膜のクーマシー染色については図18Dを参照されたい。(B)8名の健常ドナー(左グラフ)及び11名の乳癌患者(右グラフ)の血清から抽出されたエクソソームのサイズ分布を示すNanoSight粒子トラッキング分析。サイズをより上手く示すために、試料の濃度を標準化した。(C)乳癌患者の血清から採取されたエクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)NanoSight粒子トラッキング分析により評価された8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の血清から得たエクソソームの濃度。* p=0.012。(E)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNAの平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(F)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのドットプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの平均倍率変化を表す。パネルE及びFは両者とも、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(G)MCF10A細胞、健常なドナーのエクソソームと混合されたMCF10A細胞(H1−8)及び乳癌患者のエクソソームと混合されたMCF10A細胞(BC1−11)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。用いられたエクソソームの数は体重あたりで計算されており、血清から回収された初期濃度を反映している。腫瘍を形成しなかった試料は、グラフのX軸と重なって見える。このグラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。(H)抗ダイサー抗体と、5名の健常個体(C46、C45、C44、C43及びC41)及び4名の転移性乳癌(Met219、Met354、Met299及びMet356)から採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用い、負荷対照としてCD9ブロットを用いた免疫ブロット。(I)HDF及びオンコソーム(MDA−MB231)で処置されたHDFの倍加時間。* p=0.0114。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。
乳癌患者の血清は、ダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングする。(A)ヒト及びマウスのダイサーを認識する抗ダイサー抗体と、ヒト腫瘍で異種移植されたマウスから採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット(図18Aに示す)。OVA1−5は、ヒト卵巣異種移植片を表し;END1−3は、ヒト子宮内膜異種移植片を表し;BRST1及び2は、ヒト乳癌異種移植片を表す。4T1エクソソーム及び細胞を、ネズミダイサーの対照として用いた。hsa−ダイサーは、ヒトダイサー分子量を表し、mmu−ダイサーは、ネズミダイサー分子量を表す。負荷対照としての膜のクーマシー染色については図18Dを参照されたい。(B)8名の健常ドナー(左グラフ)及び11名の乳癌患者(右グラフ)の血清から抽出されたエクソソームのサイズ分布を示すNanoSight粒子トラッキング分析。サイズをより上手く示すために、試料の濃度を標準化した。(C)乳癌患者の血清から採取されたエクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)NanoSight粒子トラッキング分析により評価された8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の血清から得たエクソソームの濃度。* p=0.012。(E)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNAの平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(F)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのドットプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの平均倍率変化を表す。パネルE及びFは両者とも、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(G)MCF10A細胞、健常なドナーのエクソソームと混合されたMCF10A細胞(H1−8)及び乳癌患者のエクソソームと混合されたMCF10A細胞(BC1−11)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。用いられたエクソソームの数は体重あたりで計算されており、血清から回収された初期濃度を反映している。腫瘍を形成しなかった試料は、グラフのX軸と重なって見える。このグラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。(H)抗ダイサー抗体と、5名の健常個体(C46、C45、C44、C43及びC41)及び4名の転移性乳癌(Met219、Met354、Met299及びMet356)から採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用い、負荷対照としてCD9ブロットを用いた免疫ブロット。(I)HDF及びオンコソーム(MDA−MB231)で処置されたHDFの倍加時間。* p=0.0114。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。
乳癌患者の血清は、ダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングする。(A)ヒト及びマウスのダイサーを認識する抗ダイサー抗体と、ヒト腫瘍で異種移植されたマウスから採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット(図18Aに示す)。OVA1−5は、ヒト卵巣異種移植片を表し;END1−3は、ヒト子宮内膜異種移植片を表し;BRST1及び2は、ヒト乳癌異種移植片を表す。4T1エクソソーム及び細胞を、ネズミダイサーの対照として用いた。hsa−ダイサーは、ヒトダイサー分子量を表し、mmu−ダイサーは、ネズミダイサー分子量を表す。負荷対照としての膜のクーマシー染色については図18Dを参照されたい。(B)8名の健常ドナー(左グラフ)及び11名の乳癌患者(右グラフ)の血清から抽出されたエクソソームのサイズ分布を示すNanoSight粒子トラッキング分析。サイズをより上手く示すために、試料の濃度を標準化した。(C)乳癌患者の血清から採取されたエクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)NanoSight粒子トラッキング分析により評価された8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の血清から得たエクソソームの濃度。* p=0.012。(E)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNAの平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(F)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのドットプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの平均倍率変化を表す。パネルE及びFは両者とも、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(G)MCF10A細胞、健常なドナーのエクソソームと混合されたMCF10A細胞(H1−8)及び乳癌患者のエクソソームと混合されたMCF10A細胞(BC1−11)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。用いられたエクソソームの数は体重あたりで計算されており、血清から回収された初期濃度を反映している。腫瘍を形成しなかった試料は、グラフのX軸と重なって見える。このグラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。(H)抗ダイサー抗体と、5名の健常個体(C46、C45、C44、C43及びC41)及び4名の転移性乳癌(Met219、Met354、Met299及びMet356)から採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用い、負荷対照としてCD9ブロットを用いた免疫ブロット。(I)HDF及びオンコソーム(MDA−MB231)で処置されたHDFの倍加時間。* p=0.0114。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。
乳癌患者の血清は、ダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングする。(A)ヒト及びマウスのダイサーを認識する抗ダイサー抗体と、ヒト腫瘍で異種移植されたマウスから採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット(図18Aに示す)。OVA1−5は、ヒト卵巣異種移植片を表し;END1−3は、ヒト子宮内膜異種移植片を表し;BRST1及び2は、ヒト乳癌異種移植片を表す。4T1エクソソーム及び細胞を、ネズミダイサーの対照として用いた。hsa−ダイサーは、ヒトダイサー分子量を表し、mmu−ダイサーは、ネズミダイサー分子量を表す。負荷対照としての膜のクーマシー染色については図18Dを参照されたい。(B)8名の健常ドナー(左グラフ)及び11名の乳癌患者(右グラフ)の血清から抽出されたエクソソームのサイズ分布を示すNanoSight粒子トラッキング分析。サイズをより上手く示すために、試料の濃度を標準化した。(C)乳癌患者の血清から採取されたエクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)NanoSight粒子トラッキング分析により評価された8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の血清から得たエクソソームの濃度。* p=0.012。(E)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNAの平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(F)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのドットプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの平均倍率変化を表す。パネルE及びFは両者とも、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(G)MCF10A細胞、健常なドナーのエクソソームと混合されたMCF10A細胞(H1−8)及び乳癌患者のエクソソームと混合されたMCF10A細胞(BC1−11)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。用いられたエクソソームの数は体重あたりで計算されており、血清から回収された初期濃度を反映している。腫瘍を形成しなかった試料は、グラフのX軸と重なって見える。このグラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。(H)抗ダイサー抗体と、5名の健常個体(C46、C45、C44、C43及びC41)及び4名の転移性乳癌(Met219、Met354、Met299及びMet356)から採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用い、負荷対照としてCD9ブロットを用いた免疫ブロット。(I)HDF及びオンコソーム(MDA−MB231)で処置されたHDFの倍加時間。* p=0.0114。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。
乳癌患者の血清は、ダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングする。(A)ヒト及びマウスのダイサーを認識する抗ダイサー抗体と、ヒト腫瘍で異種移植されたマウスから採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット(図18Aに示す)。OVA1−5は、ヒト卵巣異種移植片を表し;END1−3は、ヒト子宮内膜異種移植片を表し;BRST1及び2は、ヒト乳癌異種移植片を表す。4T1エクソソーム及び細胞を、ネズミダイサーの対照として用いた。hsa−ダイサーは、ヒトダイサー分子量を表し、mmu−ダイサーは、ネズミダイサー分子量を表す。負荷対照としての膜のクーマシー染色については図18Dを参照されたい。(B)8名の健常ドナー(左グラフ)及び11名の乳癌患者(右グラフ)の血清から抽出されたエクソソームのサイズ分布を示すNanoSight粒子トラッキング分析。サイズをより上手く示すために、試料の濃度を標準化した。(C)乳癌患者の血清から採取されたエクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)NanoSight粒子トラッキング分析により評価された8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の血清から得たエクソソームの濃度。* p=0.012。(E)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNAの平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(F)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのドットプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの平均倍率変化を表す。パネルE及びFは両者とも、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(G)MCF10A細胞、健常なドナーのエクソソームと混合されたMCF10A細胞(H1−8)及び乳癌患者のエクソソームと混合されたMCF10A細胞(BC1−11)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。用いられたエクソソームの数は体重あたりで計算されており、血清から回収された初期濃度を反映している。腫瘍を形成しなかった試料は、グラフのX軸と重なって見える。このグラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。(H)抗ダイサー抗体と、5名の健常個体(C46、C45、C44、C43及びC41)及び4名の転移性乳癌(Met219、Met354、Met299及びMet356)から採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用い、負荷対照としてCD9ブロットを用いた免疫ブロット。(I)HDF及びオンコソーム(MDA−MB231)で処置されたHDFの倍加時間。* p=0.0114。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。
乳癌患者の血清は、ダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングする。(A)ヒト及びマウスのダイサーを認識する抗ダイサー抗体と、ヒト腫瘍で異種移植されたマウスから採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット(図18Aに示す)。OVA1−5は、ヒト卵巣異種移植片を表し;END1−3は、ヒト子宮内膜異種移植片を表し;BRST1及び2は、ヒト乳癌異種移植片を表す。4T1エクソソーム及び細胞を、ネズミダイサーの対照として用いた。hsa−ダイサーは、ヒトダイサー分子量を表し、mmu−ダイサーは、ネズミダイサー分子量を表す。負荷対照としての膜のクーマシー染色については図18Dを参照されたい。(B)8名の健常ドナー(左グラフ)及び11名の乳癌患者(右グラフ)の血清から抽出されたエクソソームのサイズ分布を示すNanoSight粒子トラッキング分析。サイズをより上手く示すために、試料の濃度を標準化した。(C)乳癌患者の血清から採取されたエクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)NanoSight粒子トラッキング分析により評価された8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の血清から得たエクソソームの濃度。* p=0.012。(E)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じpre−miRNAに比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のpre−miRNAの平均倍率変化を表し、±s.d.として表している。(F)エクソソームを、8名の健常ドナー及び11名の乳癌患者の採血間もない血清から採取した。抽出された試料を、無細胞培養条件で24及び72h、放置した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、6種のmiRNAをqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中の24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAに比較して定量した。グラフのドットプロットは、24hエクソソームに比較した72hエクソソーム中のmiRNAの平均倍率変化を表す。パネルE及びFは両者とも、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(G)MCF10A細胞、健常なドナーのエクソソームと混合されたMCF10A細胞(H1−8)及び乳癌患者のエクソソームと混合されたMCF10A細胞(BC1−11)を、無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所性に注射した。用いられたエクソソームの数は体重あたりで計算されており、血清から回収された初期濃度を反映している。腫瘍を形成しなかった試料は、グラフのX軸と重なって見える。このグラフは、時間に対する腫瘍体積を示しており、±s.d.として表している。(H)抗ダイサー抗体と、5名の健常個体(C46、C45、C44、C43及びC41)及び4名の転移性乳癌(Met219、Met354、Met299及びMet356)から採取された血清エクソソームから得たタンパク質抽出物と、を用い、負荷対照としてCD9ブロットを用いた免疫ブロット。(I)HDF及びオンコソーム(MDA−MB231)で処置されたHDFの倍加時間。* p=0.0114。イメージJソフトウエアを利用して、免疫ブロットの定量を実施した。
ダイサーは多小胞体内に存在し、細胞質CD43はダイサーをエクソソーム中に動員する。(A)ダイサー抗体(IP ダイサー)又はIgGで免疫沈降されたMDA−MB231細胞のタンパク質抽出物中のCD43の免疫ブロット(上パネルの、それぞれ右及び中央レーン)。ダイサー単独での免疫ブロットを、対照として用いた(下パネル)。(B)MDA−MB231由来エクソソーム及びMDA−MB231 siCD43由来エクソソームのタンパク質抽出物中のダイサーの免疫ブロット。CD9免疫ブロットを負荷対照として用いた。イメージJソフトウエアを利用して、定量を実施した。
エクソソームの特徴づけ。(A)遠心分離管の底のPKH26染色エクソソームの写真。挿入写真は、エクソソームのデジタルズーム画像を表す。(B)LSSスペクトルを回収するために用いられた実験系の略図。(C)MCF10A、NMuMG、MDA−MB231及び4T1細胞の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率。(D)MDA−MB231及び4T1細胞のヨウ化プロピジウム(PI)及びアネキシンVについてのフローサイトメトリー分析。エトポシドで処置されたMDA−MB231細胞を、アポトーシスの陽性対照として用いた。(E)陽性対照としてMDA−MB231細胞を用い、エクソソームの負荷対照としてTSG101を用いた、エクソソーム中のチトクロムCの免疫ブロット分析。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ。(A)遠心分離管の底のPKH26染色エクソソームの写真。挿入写真は、エクソソームのデジタルズーム画像を表す。(B)LSSスペクトルを回収するために用いられた実験系の略図。(C)MCF10A、NMuMG、MDA−MB231及び4T1細胞の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率。(D)MDA−MB231及び4T1細胞のヨウ化プロピジウム(PI)及びアネキシンVについてのフローサイトメトリー分析。エトポシドで処置されたMDA−MB231細胞を、アポトーシスの陽性対照として用いた。(E)陽性対照としてMDA−MB231細胞を用い、エクソソームの負荷対照としてTSG101を用いた、エクソソーム中のチトクロムCの免疫ブロット分析。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ。(A)遠心分離管の底のPKH26染色エクソソームの写真。挿入写真は、エクソソームのデジタルズーム画像を表す。(B)LSSスペクトルを回収するために用いられた実験系の略図。(C)MCF10A、NMuMG、MDA−MB231及び4T1細胞の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率。(D)MDA−MB231及び4T1細胞のヨウ化プロピジウム(PI)及びアネキシンVについてのフローサイトメトリー分析。エトポシドで処置されたMDA−MB231細胞を、アポトーシスの陽性対照として用いた。(E)陽性対照としてMDA−MB231細胞を用い、エクソソームの負荷対照としてTSG101を用いた、エクソソーム中のチトクロムCの免疫ブロット分析。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ。(A)遠心分離管の底のPKH26染色エクソソームの写真。挿入写真は、エクソソームのデジタルズーム画像を表す。(B)LSSスペクトルを回収するために用いられた実験系の略図。(C)MCF10A、NMuMG、MDA−MB231及び4T1細胞の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率。(D)MDA−MB231及び4T1細胞のヨウ化プロピジウム(PI)及びアネキシンVについてのフローサイトメトリー分析。エトポシドで処置されたMDA−MB231細胞を、アポトーシスの陽性対照として用いた。(E)陽性対照としてMDA−MB231細胞を用い、エクソソームの負荷対照としてTSG101を用いた、エクソソーム中のチトクロムCの免疫ブロット分析。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームの特徴づけ。(A)遠心分離管の底のPKH26染色エクソソームの写真。挿入写真は、エクソソームのデジタルズーム画像を表す。(B)LSSスペクトルを回収するために用いられた実験系の略図。(C)MCF10A、NMuMG、MDA−MB231及び4T1細胞の5日培養時のMTTアッセイにより測定された細胞生存率。(D)MDA−MB231及び4T1細胞のヨウ化プロピジウム(PI)及びアネキシンVについてのフローサイトメトリー分析。エトポシドで処置されたMDA−MB231細胞を、アポトーシスの陽性対照として用いた。(E)陽性対照としてMDA−MB231細胞を用い、エクソソームの負荷対照としてTSG101を用いた、エクソソーム中のチトクロムCの免疫ブロット分析。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。
オンコソームは、ノルモソームに比較してmiRNAが豊富である。(A)ヒト乳房MCF10A(非腫瘍原性)及びMDA−MB231(乳癌)細胞株の、ヌクレオチド(nt)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示(グラフ)、並びにRNA量のゲル画像(右の画像)。(B)4T1、MCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。グラフは、それぞれ24及び72hの無細胞培養後のノルモソームと比較した、24及び72hの無細胞培養後のオンコソーム中の各miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(C)15種の成熟miRNA(表4参照)を、MCF10A(左グラフ)、MDA−MB231(中央グラフ)及び4T1(右グラフ)細胞並びにそれらの各エクソソーム中でqPCRにより定量した。エクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、細胞中の同じmiRNAと比較して定量した。TS:腫瘍サプレッサmiRNA;ONC:発癌性miRNA。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(D)MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。データは、図2Cの倍率変化平均グラフの詳細なグラフに対応する。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(E)72hの無細胞培養後のMCF7及び67NR細胞中と、それらの各エクソソーム中との間の、15種の定量されたmiRNAの相関プロット。
オンコソームは、ノルモソームに比較してmiRNAが豊富である。(A)ヒト乳房MCF10A(非腫瘍原性)及びMDA−MB231(乳癌)細胞株の、ヌクレオチド(nt)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示(グラフ)、並びにRNA量のゲル画像(右の画像)。(B)4T1、MCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。グラフは、それぞれ24及び72hの無細胞培養後のノルモソームと比較した、24及び72hの無細胞培養後のオンコソーム中の各miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(C)15種の成熟miRNA(表4参照)を、MCF10A(左グラフ)、MDA−MB231(中央グラフ)及び4T1(右グラフ)細胞並びにそれらの各エクソソーム中でqPCRにより定量した。エクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、細胞中の同じmiRNAと比較して定量した。TS:腫瘍サプレッサmiRNA;ONC:発癌性miRNA。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(D)MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。データは、図2Cの倍率変化平均グラフの詳細なグラフに対応する。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(E)72hの無細胞培養後のMCF7及び67NR細胞中と、それらの各エクソソーム中との間の、15種の定量されたmiRNAの相関プロット。
オンコソームは、ノルモソームに比較してmiRNAが豊富である。(A)ヒト乳房MCF10A(非腫瘍原性)及びMDA−MB231(乳癌)細胞株の、ヌクレオチド(nt)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示(グラフ)、並びにRNA量のゲル画像(右の画像)。(B)4T1、MCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。グラフは、それぞれ24及び72hの無細胞培養後のノルモソームと比較した、24及び72hの無細胞培養後のオンコソーム中の各miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(C)15種の成熟miRNA(表4参照)を、MCF10A(左グラフ)、MDA−MB231(中央グラフ)及び4T1(右グラフ)細胞並びにそれらの各エクソソーム中でqPCRにより定量した。エクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、細胞中の同じmiRNAと比較して定量した。TS:腫瘍サプレッサmiRNA;ONC:発癌性miRNA。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(D)MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。データは、図2Cの倍率変化平均グラフの詳細なグラフに対応する。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(E)72hの無細胞培養後のMCF7及び67NR細胞中と、それらの各エクソソーム中との間の、15種の定量されたmiRNAの相関プロット。
オンコソームは、ノルモソームに比較してmiRNAが豊富である。(A)ヒト乳房MCF10A(非腫瘍原性)及びMDA−MB231(乳癌)細胞株の、ヌクレオチド(nt)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示(グラフ)、並びにRNA量のゲル画像(右の画像)。(B)4T1、MCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。グラフは、それぞれ24及び72hの無細胞培養後のノルモソームと比較した、24及び72hの無細胞培養後のオンコソーム中の各miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(C)15種の成熟miRNA(表4参照)を、MCF10A(左グラフ)、MDA−MB231(中央グラフ)及び4T1(右グラフ)細胞並びにそれらの各エクソソーム中でqPCRにより定量した。エクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、細胞中の同じmiRNAと比較して定量した。TS:腫瘍サプレッサmiRNA;ONC:発癌性miRNA。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(D)MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。データは、図2Cの倍率変化平均グラフの詳細なグラフに対応する。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(E)72hの無細胞培養後のMCF7及び67NR細胞中と、それらの各エクソソーム中との間の、15種の定量されたmiRNAの相関プロット。
オンコソームは、ノルモソームに比較してmiRNAが豊富である。(A)ヒト乳房MCF10A(非腫瘍原性)及びMDA−MB231(乳癌)細胞株の、ヌクレオチド(nt)あたりの蛍光単位(FU)で示されたバイオアナライザーグラフ表示(グラフ)、並びにRNA量のゲル画像(右の画像)。(B)4T1、MCF10A及びMDA−MB231細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを採取して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。グラフは、それぞれ24及び72hの無細胞培養後のノルモソームと比較した、24及び72hの無細胞培養後のオンコソーム中の各miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(C)15種の成熟miRNA(表4参照)を、MCF10A(左グラフ)、MDA−MB231(中央グラフ)及び4T1(右グラフ)細胞並びにそれらの各エクソソーム中でqPCRにより定量した。エクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、細胞中の同じmiRNAと比較して定量した。TS:腫瘍サプレッサmiRNA;ONC:発癌性miRNA。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして示している。(D)MCF10A、MDA−MB231及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、24hの無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。データは、図2Cの倍率変化平均グラフの詳細なグラフに対応する。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(E)72hの無細胞培養後のMCF7及び67NR細胞中と、それらの各エクソソーム中との間の、15種の定量されたmiRNAの相関プロット。
エクソソームは、pre−miRNAを含む。(A)これまで定量された成熟miRNAに対応する15種のpre−miRNA(表4参照)を、NMuMG及び4T1エクソソーム中でqPCRにより定量した。存在量を反映するために、各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、s.d.として表している。(B)NMuMG及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24hの無細胞培養後のと比較した、72hの無細胞培養後のNMuMG及び4T1エクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(C)対照細胞への倍率変化として比較した、2つの一過性トランスフェクトされたsiRNA標的化XPO5を含むMDA−MB231細胞のXPO5 mRNA発現。(D)MDA−MB231細胞をXPO5 siRNA構築物でトランスフェクトして、miR−21発現をトランスフェクトの12h後の複数の時点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96h)で評価した。長時間遠心分離の影響を示すための比較として、XPO5 siRNA構築物でトランスフェクトされたMDA−MB231細胞を、4℃で3時間遠心分離して、培地に戻した。MiR−21発現を、遠心分離後の複数の時点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96h)で評価した。pre−miR21からmiR−21へのプロセシングは、遠心分離された細胞では遅延している(緑のバー)。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(E)NMuMG及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に0h、24h、72h及び96h保持した。エクソソームを異なる時点で抽出して、pre−miRNAをqPCRにより定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
エクソソームは、pre−miRNAを含む。(A)これまで定量された成熟miRNAに対応する15種のpre−miRNA(表4参照)を、NMuMG及び4T1エクソソーム中でqPCRにより定量した。存在量を反映するために、各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、s.d.として表している。(B)NMuMG及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24hの無細胞培養後のと比較した、72hの無細胞培養後のNMuMG及び4T1エクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(C)対照細胞への倍率変化として比較した、2つの一過性トランスフェクトされたsiRNA標的化XPO5を含むMDA−MB231細胞のXPO5 mRNA発現。(D)MDA−MB231細胞をXPO5 siRNA構築物でトランスフェクトして、miR−21発現をトランスフェクトの12h後の複数の時点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96h)で評価した。長時間遠心分離の影響を示すための比較として、XPO5 siRNA構築物でトランスフェクトされたMDA−MB231細胞を、4℃で3時間遠心分離して、培地に戻した。MiR−21発現を、遠心分離後の複数の時点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96h)で評価した。pre−miR21からmiR−21へのプロセシングは、遠心分離された細胞では遅延している(緑のバー)。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(E)NMuMG及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に0h、24h、72h及び96h保持した。エクソソームを異なる時点で抽出して、pre−miRNAをqPCRにより定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
エクソソームは、pre−miRNAを含む。(A)これまで定量された成熟miRNAに対応する15種のpre−miRNA(表4参照)を、NMuMG及び4T1エクソソーム中でqPCRにより定量した。存在量を反映するために、各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、s.d.として表している。(B)NMuMG及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24hの無細胞培養後のと比較した、72hの無細胞培養後のNMuMG及び4T1エクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(C)対照細胞への倍率変化として比較した、2つの一過性トランスフェクトされたsiRNA標的化XPO5を含むMDA−MB231細胞のXPO5 mRNA発現。(D)MDA−MB231細胞をXPO5 siRNA構築物でトランスフェクトして、miR−21発現をトランスフェクトの12h後の複数の時点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96h)で評価した。長時間遠心分離の影響を示すための比較として、XPO5 siRNA構築物でトランスフェクトされたMDA−MB231細胞を、4℃で3時間遠心分離して、培地に戻した。MiR−21発現を、遠心分離後の複数の時点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h及び96h)で評価した。pre−miR21からmiR−21へのプロセシングは、遠心分離された細胞では遅延している(緑のバー)。この図に示されたデータは、それぞれが三重測定で行われた独立した実験3回の結果であり、±s.d.として表している。(E)NMuMG及び4T1細胞から採取されたエクソソームをDMEM培地に再懸濁して、無細胞培養条件に0h、24h、72h及び96h保持した。エクソソームを異なる時点で抽出して、pre−miRNAをqPCRにより定量した。存在量を反映するために、異なる時点での各pre−miRNAのΔCt値の逆数をプロットした。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
オンコソームはダイサーを含む。(A)MCF10A細胞由来エクソソーム中の抗ダイサー抗体(右写真)及び陰性対照(左写真)を用いた免疫金標識により得られた透過型電子顕微鏡写真。MDA−MB231エクソソームの陽性免疫金標識に関して図4Bと比較されたい。(B)抗GFP抗体 MDA−MB231由来エクソソームを用いた免疫金標識により得られた透過型電子顕微鏡写真。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。(D)それぞれMCF10A、MCF10Ashスクランブル、並びにMCF10Ashダイサークローン1及び2(MCF10Ashダイサークローン1及びMCF10Ashダイサークローン2)細胞において抗ダイサー抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。(E)それぞれMDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、並びにMDA−MB231shダイサークローン1及び2(MDA−MB231shダイサークローン1及びMDA−MB231shダイサークローン2)細胞において抗ダイサー抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。イメージJソフトウエアを用いて、免疫ブロットの定量を実施した。(F)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(G)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(H)A549(ヒト肺癌)、SW480(ヒト結腸癌)、HeLa(ヒト子宮頸癌)及び4T07(ネズミ乳癌)細胞株からのオンコソーム中のダイサーの免疫ブロット。TSG101免疫ブロットを用いて、エクソソーム及び負荷の存在を確認した(下ブロット)。
オンコソームはダイサーを含む。(A)MCF10A細胞由来エクソソーム中の抗ダイサー抗体(右写真)及び陰性対照(左写真)を用いた免疫金標識により得られた透過型電子顕微鏡写真。MDA−MB231エクソソームの陽性免疫金標識に関して図4Bと比較されたい。(B)抗GFP抗体 MDA−MB231由来エクソソームを用いた免疫金標識により得られた透過型電子顕微鏡写真。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。(D)それぞれMCF10A、MCF10Ashスクランブル、並びにMCF10Ashダイサークローン1及び2(MCF10Ashダイサークローン1及びMCF10Ashダイサークローン2)細胞において抗ダイサー抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。(E)それぞれMDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、並びにMDA−MB231shダイサークローン1及び2(MDA−MB231shダイサークローン1及びMDA−MB231shダイサークローン2)細胞において抗ダイサー抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。イメージJソフトウエアを用いて、免疫ブロットの定量を実施した。(F)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(G)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(H)A549(ヒト肺癌)、SW480(ヒト結腸癌)、HeLa(ヒト子宮頸癌)及び4T07(ネズミ乳癌)細胞株からのオンコソーム中のダイサーの免疫ブロット。TSG101免疫ブロットを用いて、エクソソーム及び負荷の存在を確認した(下ブロット)。
オンコソームはダイサーを含む。(A)MCF10A細胞由来エクソソーム中の抗ダイサー抗体(右写真)及び陰性対照(左写真)を用いた免疫金標識により得られた透過型電子顕微鏡写真。MDA−MB231エクソソームの陽性免疫金標識に関して図4Bと比較されたい。(B)抗GFP抗体 MDA−MB231由来エクソソームを用いた免疫金標識により得られた透過型電子顕微鏡写真。(C)エンプティベクター(pCMV−Tag4B;それぞれ最初及び三番目のレーン)及びFlag−ダイサーベクター(二番目及び四番目のレーン)でトランスフェクトされたMCF10A及びMDA−MB231細胞中の抗Flag抗体(上パネル)を用いた免疫ブロット。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。(D)それぞれMCF10A、MCF10Ashスクランブル、並びにMCF10Ashダイサークローン1及び2(MCF10Ashダイサークローン1及びMCF10Ashダイサークローン2)細胞において抗ダイサー抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。(E)それぞれMDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、並びにMDA−MB231shダイサークローン1及び2(MDA−MB231shダイサークローン1及びMDA−MB231shダイサークローン2)細胞において抗ダイサー抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。β−アクチン免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下パネル)。イメージJソフトウエアを用いて、免疫ブロットの定量を実施した。(F)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中のAGO2抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプットの5%を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(G)ダイサー抗体又はIgGで免疫沈降されたMCF10A及びMDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームタンパク質中の抗TRBP抗体を用いた免疫ブロット(上パネル)。MDA−MB231細胞から抽出されたエクソソームのライセートインプット(5%)を、対照として用いた。ダイサーの免疫ブロットを、免疫沈降の対照として用いた(下パネル)。(H)A549(ヒト肺癌)、SW480(ヒト結腸癌)、HeLa(ヒト子宮頸癌)及び4T07(ネズミ乳癌)細胞株からのオンコソーム中のダイサーの免疫ブロット。TSG101免疫ブロットを用いて、エクソソーム及び負荷の存在を確認した(下ブロット)。
エクソソームにおけるダイサーの検出。(A)4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞中の抗ダイサー抗体と、並びに4T1(4T1 exos)及び4T1shダイサー(4T1shダイサー exos)細胞から採取されたエクソソームと、を用いた免疫ブロット(上ブロット)。GADPH免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下ブロット)。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(B)エクソソームを、4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養後の異なるエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(C)エクソソームを、4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養後の異なるエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(D)エクソソームを、MDA−MB231細胞から2本ずつ採取した。試料の一方を抗ダイサー抗体と共に電気穿孔した。両方の試料を無細胞条件で24及び72h、放置した。24h及び72h後に、エクソソームを再度抽出し、15種のpre−miRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中での24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した、72hエクソソーム中のpre−miRNAの倍率変化を表しており、図5Dに表されたグラフの詳細な分析である。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(E)エクソソームを、MDA−MB231細胞から2本ずつ採取した。試料の一方を抗ダイサー抗体と共に電気穿孔した。両方の試料を無細胞条件で24及び72h、放置した。24h及び72h後に、エクソソームを再度抽出し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中での24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した、72hエクソソーム中のmiRNAの倍率変化を表しており、図5Eに表されたグラフの詳細な分析である。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(F)MDA−MB231エクソソーム(MDA−MB231 exos)と比較した、ダイサーと共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA−MB231 exos ダイサーAB)中のダウンレギュレートされたmiRNAの分類(発癌性、腫瘍サプレッサ、及び癌に関して未確定)のグラフ表示。マイクロRNAを、文献に基づき各分類に帰属させた。この図に表されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームにおけるダイサーの検出。(A)4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞中の抗ダイサー抗体と、並びに4T1(4T1 exos)及び4T1shダイサー(4T1shダイサー exos)細胞から採取されたエクソソームと、を用いた免疫ブロット(上ブロット)。GADPH免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下ブロット)。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(B)エクソソームを、4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養後の異なるエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(C)エクソソームを、4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養後の異なるエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(D)エクソソームを、MDA−MB231細胞から2本ずつ採取した。試料の一方を抗ダイサー抗体と共に電気穿孔した。両方の試料を無細胞条件で24及び72h、放置した。24h及び72h後に、エクソソームを再度抽出し、15種のpre−miRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中での24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した、72hエクソソーム中のpre−miRNAの倍率変化を表しており、図5Dに表されたグラフの詳細な分析である。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(E)エクソソームを、MDA−MB231細胞から2本ずつ採取した。試料の一方を抗ダイサー抗体と共に電気穿孔した。両方の試料を無細胞条件で24及び72h、放置した。24h及び72h後に、エクソソームを再度抽出し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中での24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した、72hエクソソーム中のmiRNAの倍率変化を表しており、図5Eに表されたグラフの詳細な分析である。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(F)MDA−MB231エクソソーム(MDA−MB231 exos)と比較した、ダイサーと共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA−MB231 exos ダイサーAB)中のダウンレギュレートされたmiRNAの分類(発癌性、腫瘍サプレッサ、及び癌に関して未確定)のグラフ表示。マイクロRNAを、文献に基づき各分類に帰属させた。この図に表されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームにおけるダイサーの検出。(A)4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞中の抗ダイサー抗体と、並びに4T1(4T1 exos)及び4T1shダイサー(4T1shダイサー exos)細胞から採取されたエクソソームと、を用いた免疫ブロット(上ブロット)。GADPH免疫ブロットを、負荷対照として用いた(下ブロット)。イメージJソフトウエアを用いて、定量を実施した。(B)エクソソームを、4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のpre−miRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養後の異なるエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(C)エクソソームを、4T1、4T1shスクランブル及び4T1shダイサー細胞から採取して、無細胞条件下に24及び72h保持した。24及び72h後に、エクソソームを再度抽出して、15種のmiRNAをqPCRにより定量した。グラフは、24h無細胞培養に比較した、72h無細胞培養後の異なるエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を示している。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(D)エクソソームを、MDA−MB231細胞から2本ずつ採取した。試料の一方を抗ダイサー抗体と共に電気穿孔した。両方の試料を無細胞条件で24及び72h、放置した。24h及び72h後に、エクソソームを再度抽出し、15種のpre−miRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各pre−miRNAの倍率変化を、各試料中での24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した、72hエクソソーム中のpre−miRNAの倍率変化を表しており、図5Dに表されたグラフの詳細な分析である。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(E)エクソソームを、MDA−MB231細胞から2本ずつ採取した。試料の一方を抗ダイサー抗体と共に電気穿孔した。両方の試料を無細胞条件で24及び72h、放置した。24h及び72h後に、エクソソームを再度抽出し、15種のmiRNA(表4参照)をqPCRにより定量した。72hの無細胞培養後のエクソソーム中の各miRNAの倍率変化を、各試料中での24h無細胞培養後のエクソソーム中の同じmiRNAと比較して定量した。グラフのプロットは、24hエクソソームに比較した、72hエクソソーム中のmiRNAの倍率変化を表しており、図5Eに表されたグラフの詳細な分析である。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(F)MDA−MB231エクソソーム(MDA−MB231 exos)と比較した、ダイサーと共に電気穿孔されたMDA−MB231エクソソーム(MDA−MB231 exos ダイサーAB)中のダウンレギュレートされたmiRNAの分類(発癌性、腫瘍サプレッサ、及び癌に関して未確定)のグラフ表示。マイクロRNAを、文献に基づき各分類に帰属させた。この図に表されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームにおけるダイサー検出。(A)エクソソームを、MCF10、MCF10Ashダイサー、MDA−MB231及びMDA−MB231shダイサー細胞から採取して、合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1と共に電気穿孔した。各pre−miRNAを、電気穿孔されたエクソソーム中でqPCRにより定量して、電気穿孔緩衝液のみを用いて電気穿孔されたエクソソームと比較した倍率変化として表した。(B)ビオチンで内部標識されたpre−miR−21、−10b及びcel−1のドットブロット。(C)pre−miR−10b、−21及びcel−1でトランスフェクトされたMCF10A細胞のmiR−10b、−21及びcel−1の発現分析。各バーは、非トランスフェクト細胞と比較した、トランスフェクト細胞の倍率変化を表している。この図に表されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
エクソソームにおけるダイサー検出。(A)エクソソームを、MCF10、MCF10Ashダイサー、MDA−MB231及びMDA−MB231shダイサー細胞から採取して、合成pre−miRNA−10b、−21及びcel−1と共に電気穿孔した。各pre−miRNAを、電気穿孔されたエクソソーム中でqPCRにより定量して、電気穿孔緩衝液のみを用いて電気穿孔されたエクソソームと比較した倍率変化として表した。(B)ビオチンで内部標識されたpre−miR−21、−10b及びcel−1のドットブロット。(C)pre−miR−10b、−21及びcel−1でトランスフェクトされたMCF10A細胞のmiR−10b、−21及びcel−1の発現分析。各バーは、非トランスフェクト細胞と比較した、トランスフェクト細胞の倍率変化を表している。この図に表されたデータは、それぞれが三重測定で行われた3つの独立した実験の結果であり、±s.d.として表している。
ダイサーは多小胞体内に存在し、細胞質CD43はダイサーをエクソソームに動員する。(A)グラフは、イメージJソフトウエアを利用して定量された共焦点画像における共局在化の割合を表す。(B)Hrs及びTSG101には2つの異なるsiRNAを用い、BiG2には2つの異なるshクローンを用いた、ダウンレギュレーション後のHrs、TSG101及びBiG2 mRNA発現。非トランスフェクト細胞及びshスクランブルトランスフェクト細胞を、対照として用いた。(C)MCF10A、MCF10AsiHrs、MDA−MB231及びMDA−MB231siHrs(左グラフ)、MCF10shスクランブル、MCF10AshBiG2、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231shBiG2(中央グラフ)、並びにMCF10AsiTSG101及びMDA−MB231siTSG101(右グラフ)から抽出されたエクソソームのブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量。親非トランスフェクト細胞を、倍率変化分析での相対的対照として用いた。データは細胞数により標準化されており、SDとして表された3回の生物学的反復実験の結果である。(D)MCF10A、MCF10AsiTSG101(siTSG101)、MCF10AsiHrs(siHrs)及びMCF10AshBiG2(shBiG2)細胞のエクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(上ブロット);MDA−MB231、MDA−MB231siTSG101(siTSG101)、MDA−MB231siHrs(siHrs)及び MDA−MB231shBiG2(shBiG2)細胞の エクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(下ブロット)(E)Hrs、TSG101及びBiG2ダウンレギュレート細胞中のエクソソーム数のダウンレギュレートを示したMDA−MB231、MDA−MB−231siTSG101、−siHrs及びshBiG2由来エクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析、並びにそのエクソソームで予測されるサイズ分布。(F)MCF10A、MCF10Ashスクランブル、MCF10AsiHrs、MCF10AshBiG2、MCF10AsiTSG101、MDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231siHrs、MDA−MB231shBiG2、MDA−MB231siTSG101、4T1、4T1siHrs、4T1shBiG2及び4T1siTSG101細胞中のダイサーのmRNA発現。親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(G)抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1癌細胞のタンパク質抽出物中のダイサー(上ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(上ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1細胞のタンパク質抽出物中のポリユビキチン(下ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(下ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。(H)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のCD43のmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(I)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のダイサーのmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
ダイサーは多小胞体内に存在し、細胞質CD43はダイサーをエクソソームに動員する。(A)グラフは、イメージJソフトウエアを利用して定量された共焦点画像における共局在化の割合を表す。(B)Hrs及びTSG101には2つの異なるsiRNAを用い、BiG2には2つの異なるshクローンを用いた、ダウンレギュレーション後のHrs、TSG101及びBiG2 mRNA発現。非トランスフェクト細胞及びshスクランブルトランスフェクト細胞を、対照として用いた。(C)MCF10A、MCF10AsiHrs、MDA−MB231及びMDA−MB231siHrs(左グラフ)、MCF10shスクランブル、MCF10AshBiG2、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231shBiG2(中央グラフ)、並びにMCF10AsiTSG101及びMDA−MB231siTSG101(右グラフ)から抽出されたエクソソームのブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量。親非トランスフェクト細胞を、倍率変化分析での相対的対照として用いた。データは細胞数により標準化されており、SDとして表された3回の生物学的反復実験の結果である。(D)MCF10A、MCF10AsiTSG101(siTSG101)、MCF10AsiHrs(siHrs)及びMCF10AshBiG2(shBiG2)細胞のエクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(上ブロット);MDA−MB231、MDA−MB231siTSG101(siTSG101)、MDA−MB231siHrs(siHrs)及び MDA−MB231shBiG2(shBiG2)細胞の エクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(下ブロット)(E)Hrs、TSG101及びBiG2ダウンレギュレート細胞中のエクソソーム数のダウンレギュレートを示したMDA−MB231、MDA−MB−231siTSG101、−siHrs及びshBiG2由来エクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析、並びにそのエクソソームで予測されるサイズ分布。(F)MCF10A、MCF10Ashスクランブル、MCF10AsiHrs、MCF10AshBiG2、MCF10AsiTSG101、MDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231siHrs、MDA−MB231shBiG2、MDA−MB231siTSG101、4T1、4T1siHrs、4T1shBiG2及び4T1siTSG101細胞中のダイサーのmRNA発現。親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(G)抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1癌細胞のタンパク質抽出物中のダイサー(上ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(上ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1細胞のタンパク質抽出物中のポリユビキチン(下ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(下ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。(H)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のCD43のmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(I)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のダイサーのmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
ダイサーは多小胞体内に存在し、細胞質CD43はダイサーをエクソソームに動員する。(A)グラフは、イメージJソフトウエアを利用して定量された共焦点画像における共局在化の割合を表す。(B)Hrs及びTSG101には2つの異なるsiRNAを用い、BiG2には2つの異なるshクローンを用いた、ダウンレギュレーション後のHrs、TSG101及びBiG2 mRNA発現。非トランスフェクト細胞及びshスクランブルトランスフェクト細胞を、対照として用いた。(C)MCF10A、MCF10AsiHrs、MDA−MB231及びMDA−MB231siHrs(左グラフ)、MCF10shスクランブル、MCF10AshBiG2、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231shBiG2(中央グラフ)、並びにMCF10AsiTSG101及びMDA−MB231siTSG101(右グラフ)から抽出されたエクソソームのブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量。親非トランスフェクト細胞を、倍率変化分析での相対的対照として用いた。データは細胞数により標準化されており、SDとして表された3回の生物学的反復実験の結果である。(D)MCF10A、MCF10AsiTSG101(siTSG101)、MCF10AsiHrs(siHrs)及びMCF10AshBiG2(shBiG2)細胞のエクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(上ブロット);MDA−MB231、MDA−MB231siTSG101(siTSG101)、MDA−MB231siHrs(siHrs)及び MDA−MB231shBiG2(shBiG2)細胞の エクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(下ブロット)(E)Hrs、TSG101及びBiG2ダウンレギュレート細胞中のエクソソーム数のダウンレギュレートを示したMDA−MB231、MDA−MB−231siTSG101、−siHrs及びshBiG2由来エクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析、並びにそのエクソソームで予測されるサイズ分布。(F)MCF10A、MCF10Ashスクランブル、MCF10AsiHrs、MCF10AshBiG2、MCF10AsiTSG101、MDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231siHrs、MDA−MB231shBiG2、MDA−MB231siTSG101、4T1、4T1siHrs、4T1shBiG2及び4T1siTSG101細胞中のダイサーのmRNA発現。親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(G)抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1癌細胞のタンパク質抽出物中のダイサー(上ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(上ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1細胞のタンパク質抽出物中のポリユビキチン(下ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(下ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。(H)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のCD43のmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(I)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のダイサーのmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
ダイサーは多小胞体内に存在し、細胞質CD43はダイサーをエクソソームに動員する。(A)グラフは、イメージJソフトウエアを利用して定量された共焦点画像における共局在化の割合を表す。(B)Hrs及びTSG101には2つの異なるsiRNAを用い、BiG2には2つの異なるshクローンを用いた、ダウンレギュレーション後のHrs、TSG101及びBiG2 mRNA発現。非トランスフェクト細胞及びshスクランブルトランスフェクト細胞を、対照として用いた。(C)MCF10A、MCF10AsiHrs、MDA−MB231及びMDA−MB231siHrs(左グラフ)、MCF10shスクランブル、MCF10AshBiG2、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231shBiG2(中央グラフ)、並びにMCF10AsiTSG101及びMDA−MB231siTSG101(右グラフ)から抽出されたエクソソームのブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量。親非トランスフェクト細胞を、倍率変化分析での相対的対照として用いた。データは細胞数により標準化されており、SDとして表された3回の生物学的反復実験の結果である。(D)MCF10A、MCF10AsiTSG101(siTSG101)、MCF10AsiHrs(siHrs)及びMCF10AshBiG2(shBiG2)細胞のエクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(上ブロット);MDA−MB231、MDA−MB231siTSG101(siTSG101)、MDA−MB231siHrs(siHrs)及び MDA−MB231shBiG2(shBiG2)細胞の エクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(下ブロット)(E)Hrs、TSG101及びBiG2ダウンレギュレート細胞中のエクソソーム数のダウンレギュレートを示したMDA−MB231、MDA−MB−231siTSG101、−siHrs及びshBiG2由来エクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析、並びにそのエクソソームで予測されるサイズ分布。(F)MCF10A、MCF10Ashスクランブル、MCF10AsiHrs、MCF10AshBiG2、MCF10AsiTSG101、MDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231siHrs、MDA−MB231shBiG2、MDA−MB231siTSG101、4T1、4T1siHrs、4T1shBiG2及び4T1siTSG101細胞中のダイサーのmRNA発現。親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(G)抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1癌細胞のタンパク質抽出物中のダイサー(上ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(上ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1細胞のタンパク質抽出物中のポリユビキチン(下ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(下ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。(H)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のCD43のmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(I)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のダイサーのmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
ダイサーは多小胞体内に存在し、細胞質CD43はダイサーをエクソソームに動員する。(A)グラフは、イメージJソフトウエアを利用して定量された共焦点画像における共局在化の割合を表す。(B)Hrs及びTSG101には2つの異なるsiRNAを用い、BiG2には2つの異なるshクローンを用いた、ダウンレギュレーション後のHrs、TSG101及びBiG2 mRNA発現。非トランスフェクト細胞及びshスクランブルトランスフェクト細胞を、対照として用いた。(C)MCF10A、MCF10AsiHrs、MDA−MB231及びMDA−MB231siHrs(左グラフ)、MCF10shスクランブル、MCF10AshBiG2、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231shBiG2(中央グラフ)、並びにMCF10AsiTSG101及びMDA−MB231siTSG101(右グラフ)から抽出されたエクソソームのブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量。親非トランスフェクト細胞を、倍率変化分析での相対的対照として用いた。データは細胞数により標準化されており、SDとして表された3回の生物学的反復実験の結果である。(D)MCF10A、MCF10AsiTSG101(siTSG101)、MCF10AsiHrs(siHrs)及びMCF10AshBiG2(shBiG2)細胞のエクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(上ブロット);MDA−MB231、MDA−MB231siTSG101(siTSG101)、MDA−MB231siHrs(siHrs)及び MDA−MB231shBiG2(shBiG2)細胞の エクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(下ブロット)(E)Hrs、TSG101及びBiG2ダウンレギュレート細胞中のエクソソーム数のダウンレギュレートを示したMDA−MB231、MDA−MB−231siTSG101、−siHrs及びshBiG2由来エクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析、並びにそのエクソソームで予測されるサイズ分布。(F)MCF10A、MCF10Ashスクランブル、MCF10AsiHrs、MCF10AshBiG2、MCF10AsiTSG101、MDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231siHrs、MDA−MB231shBiG2、MDA−MB231siTSG101、4T1、4T1siHrs、4T1shBiG2及び4T1siTSG101細胞中のダイサーのmRNA発現。親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(G)抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1癌細胞のタンパク質抽出物中のダイサー(上ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(上ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1細胞のタンパク質抽出物中のポリユビキチン(下ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(下ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。(H)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のCD43のmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(I)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のダイサーのmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
ダイサーは多小胞体内に存在し、細胞質CD43はダイサーをエクソソームに動員する。(A)グラフは、イメージJソフトウエアを利用して定量された共焦点画像における共局在化の割合を表す。(B)Hrs及びTSG101には2つの異なるsiRNAを用い、BiG2には2つの異なるshクローンを用いた、ダウンレギュレーション後のHrs、TSG101及びBiG2 mRNA発現。非トランスフェクト細胞及びshスクランブルトランスフェクト細胞を、対照として用いた。(C)MCF10A、MCF10AsiHrs、MDA−MB231及びMDA−MB231siHrs(左グラフ)、MCF10shスクランブル、MCF10AshBiG2、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231shBiG2(中央グラフ)、並びにMCF10AsiTSG101及びMDA−MB231siTSG101(右グラフ)から抽出されたエクソソームのブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量。親非トランスフェクト細胞を、倍率変化分析での相対的対照として用いた。データは細胞数により標準化されており、SDとして表された3回の生物学的反復実験の結果である。(D)MCF10A、MCF10AsiTSG101(siTSG101)、MCF10AsiHrs(siHrs)及びMCF10AshBiG2(shBiG2)細胞のエクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(上ブロット);MDA−MB231、MDA−MB231siTSG101(siTSG101)、MDA−MB231siHrs(siHrs)及び MDA−MB231shBiG2(shBiG2)細胞の エクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(下ブロット)(E)Hrs、TSG101及びBiG2ダウンレギュレート細胞中のエクソソーム数のダウンレギュレートを示したMDA−MB231、MDA−MB−231siTSG101、−siHrs及びshBiG2由来エクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析、並びにそのエクソソームで予測されるサイズ分布。(F)MCF10A、MCF10Ashスクランブル、MCF10AsiHrs、MCF10AshBiG2、MCF10AsiTSG101、MDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231siHrs、MDA−MB231shBiG2、MDA−MB231siTSG101、4T1、4T1siHrs、4T1shBiG2及び4T1siTSG101細胞中のダイサーのmRNA発現。親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(G)抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1癌細胞のタンパク質抽出物中のダイサー(上ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(上ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1細胞のタンパク質抽出物中のポリユビキチン(下ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(下ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。(H)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のCD43のmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(I)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のダイサーのmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
ダイサーは多小胞体内に存在し、細胞質CD43はダイサーをエクソソームに動員する。(A)グラフは、イメージJソフトウエアを利用して定量された共焦点画像における共局在化の割合を表す。(B)Hrs及びTSG101には2つの異なるsiRNAを用い、BiG2には2つの異なるshクローンを用いた、ダウンレギュレーション後のHrs、TSG101及びBiG2 mRNA発現。非トランスフェクト細胞及びshスクランブルトランスフェクト細胞を、対照として用いた。(C)MCF10A、MCF10AsiHrs、MDA−MB231及びMDA−MB231siHrs(左グラフ)、MCF10shスクランブル、MCF10AshBiG2、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231shBiG2(中央グラフ)、並びにMCF10AsiTSG101及びMDA−MB231siTSG101(右グラフ)から抽出されたエクソソームのブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量。親非トランスフェクト細胞を、倍率変化分析での相対的対照として用いた。データは細胞数により標準化されており、SDとして表された3回の生物学的反復実験の結果である。(D)MCF10A、MCF10AsiTSG101(siTSG101)、MCF10AsiHrs(siHrs)及びMCF10AshBiG2(shBiG2)細胞のエクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(上ブロット);MDA−MB231、MDA−MB231siTSG101(siTSG101)、MDA−MB231siHrs(siHrs)及び MDA−MB231shBiG2(shBiG2)細胞の エクソソームタンパク質抽出物中のCD9の免疫ブロット(下ブロット)(E)Hrs、TSG101及びBiG2ダウンレギュレート細胞中のエクソソーム数のダウンレギュレートを示したMDA−MB231、MDA−MB−231siTSG101、−siHrs及びshBiG2由来エクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析、並びにそのエクソソームで予測されるサイズ分布。(F)MCF10A、MCF10Ashスクランブル、MCF10AsiHrs、MCF10AshBiG2、MCF10AsiTSG101、MDA−MB231、MDA−MB231shスクランブル、MDA−MB231siHrs、MDA−MB231shBiG2、MDA−MB231siTSG101、4T1、4T1siHrs、4T1shBiG2及び4T1siTSG101細胞中のダイサーのmRNA発現。親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(G)抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1癌細胞のタンパク質抽出物中のダイサー(上ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(上ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。抗ダイサー抗体で免疫沈降されたMDA−MB231及び4T1細胞のタンパク質抽出物中のポリユビキチン(下ブロット、2つの左レーン)と、免疫沈降に用いられたタンパク質ライセートに対応するインプットの5%(下ブロット、2つの右レーン)の免疫ブロット。(H)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のCD43のmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。(I)MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA−MB231及びMDA−MB231siCD43細胞中のダイサーのmRNA発現。MCF10A及びMDA−MB231親細胞を、倍率変化比較での相対的対照として用いた。データは、3回の生物学的反復実験の結果であり、SDとして表している。
オンコソームは、ダイサー依存的に、収容細胞のトランスクリプトーム改変及び腫瘍形成を誘導する。(A)MDA−MB231 CD63−GFP細胞由来のエクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析。黒色線は、エクソソーム集団全体の測定を表し、緑色線は、488nmレーザビームを備えたNanoSightを用いてCD63−GFPで標識されたエクソソーム集団を示す。薄灰色及び薄緑色は、各測定のエラーバーを表す。(B)抗PTEN抗体と、抽出されて間もないMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24hの間処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(C)抗HOXD10抗体と、抽出されて間もないMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(D)MCF10A細胞をXPO5に関してsiRNAでトランスフェクトして、pre−miRNAの流れを核から細胞質にダウンレギュレートした。MCF10AsiXPO5細胞、並びにダイサー抗体を含む、及び含まないMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10AsiXPO5細胞中で、時間経過に伴う(6h、12h、24h、36h及び48h)miR−15レベルを測定することにより、pre−miR15のプロセシングを評価した。有意な変動は示されなかった。(E)miR182−5p発現を、時間経過に伴い(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72及び96h)、MDA−MB231由来エクソソーム中でモニタリングした。エラーバーは、0hと比較した、各時点の倍率変化を表している。有意差は認められなかった。(F)グラフは、図7Gのコロニー数定量を示している。*p=0.0006.(G)抗ダイサー抗体と、無細胞培養後にダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。α−チューブリンを負荷対照として用いた。
オンコソームは、ダイサー依存的に、収容細胞のトランスクリプトーム改変及び腫瘍形成を誘導する。(A)MDA−MB231 CD63−GFP細胞由来のエクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析。黒色線は、エクソソーム集団全体の測定を表し、緑色線は、488nmレーザビームを備えたNanoSightを用いてCD63−GFPで標識されたエクソソーム集団を示す。薄灰色及び薄緑色は、各測定のエラーバーを表す。(B)抗PTEN抗体と、抽出されて間もないMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24hの間処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(C)抗HOXD10抗体と、抽出されて間もないMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(D)MCF10A細胞をXPO5に関してsiRNAでトランスフェクトして、pre−miRNAの流れを核から細胞質にダウンレギュレートした。MCF10AsiXPO5細胞、並びにダイサー抗体を含む、及び含まないMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10AsiXPO5細胞中で、時間経過に伴う(6h、12h、24h、36h及び48h)miR−15レベルを測定することにより、pre−miR15のプロセシングを評価した。有意な変動は示されなかった。(E)miR182−5p発現を、時間経過に伴い(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72及び96h)、MDA−MB231由来エクソソーム中でモニタリングした。エラーバーは、0hと比較した、各時点の倍率変化を表している。有意差は認められなかった。(F)グラフは、図7Gのコロニー数定量を示している。*p=0.0006.(G)抗ダイサー抗体と、無細胞培養後にダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。α−チューブリンを負荷対照として用いた。
オンコソームは、ダイサー依存的に、収容細胞のトランスクリプトーム改変及び腫瘍形成を誘導する。(A)MDA−MB231 CD63−GFP細胞由来のエクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析。黒色線は、エクソソーム集団全体の測定を表し、緑色線は、488nmレーザビームを備えたNanoSightを用いてCD63−GFPで標識されたエクソソーム集団を示す。薄灰色及び薄緑色は、各測定のエラーバーを表す。(B)抗PTEN抗体と、抽出されて間もないMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24hの間処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(C)抗HOXD10抗体と、抽出されて間もないMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(D)MCF10A細胞をXPO5に関してsiRNAでトランスフェクトして、pre−miRNAの流れを核から細胞質にダウンレギュレートした。MCF10AsiXPO5細胞、並びにダイサー抗体を含む、及び含まないMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10AsiXPO5細胞中で、時間経過に伴う(6h、12h、24h、36h及び48h)miR−15レベルを測定することにより、pre−miR15のプロセシングを評価した。有意な変動は示されなかった。(E)miR182−5p発現を、時間経過に伴い(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72及び96h)、MDA−MB231由来エクソソーム中でモニタリングした。エラーバーは、0hと比較した、各時点の倍率変化を表している。有意差は認められなかった。(F)グラフは、図7Gのコロニー数定量を示している。*p=0.0006.(G)抗ダイサー抗体と、無細胞培養後にダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。α−チューブリンを負荷対照として用いた。
オンコソームは、ダイサー依存的に、収容細胞のトランスクリプトーム改変及び腫瘍形成を誘導する。(A)MDA−MB231 CD63−GFP細胞由来のエクソソームのNanoSight粒子トラッキング分析。黒色線は、エクソソーム集団全体の測定を表し、緑色線は、488nmレーザビームを備えたNanoSightを用いてCD63−GFPで標識されたエクソソーム集団を示す。薄灰色及び薄緑色は、各測定のエラーバーを表す。(B)抗PTEN抗体と、抽出されて間もないMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24hの間処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(C)抗HOXD10抗体と、抽出されて間もないMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。β−アクチンを負荷対照として用いた。(D)MCF10A細胞をXPO5に関してsiRNAでトランスフェクトして、pre−miRNAの流れを核から細胞質にダウンレギュレートした。MCF10AsiXPO5細胞、並びにダイサー抗体を含む、及び含まないMDA−MB231エクソソームで処置されたMCF10AsiXPO5細胞中で、時間経過に伴う(6h、12h、24h、36h及び48h)miR−15レベルを測定することにより、pre−miR15のプロセシングを評価した。有意な変動は示されなかった。(E)miR182−5p発現を、時間経過に伴い(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72及び96h)、MDA−MB231由来エクソソーム中でモニタリングした。エラーバーは、0hと比較した、各時点の倍率変化を表している。有意差は認められなかった。(F)グラフは、図7Gのコロニー数定量を示している。*p=0.0006.(G)抗ダイサー抗体と、無細胞培養後にダイサー抗体と共に電気穿孔されたMDA−MB231オンコソームで0、30min、1h、12h及び24h、処置されたMCF10A細胞のタンパク質抽出物と、を用いた免疫ブロット。α−チューブリンを負荷対照として用いた。
乳癌患者のエクソソームはダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングして、異なる臓器の細胞に侵入する。(A)ヌードマウスの採取間もない原発性ヒト卵巣腫瘍子宮内膜腫瘍及び乳房腫瘍フラグメント由来の同所性異種移植片の代表的写真。(B)卵巣癌、子宮内膜癌及び乳癌の同所性異種移植片のヘマトキシリンエオジンHE)染色。(C)同所性腫瘍異種移植片を有するマウスから採取された血清エクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)図8Aに示された免疫ブロットの膜のクーマシー染色。
乳癌患者のエクソソームはダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングして、異なる臓器の細胞に侵入する。(A)ヌードマウスの採取間もない原発性ヒト卵巣腫瘍、子宮内膜腫瘍及び乳房腫瘍のフラグメント由来の同所性異種移植片の代表的写真。(B)卵巣癌、子宮内膜癌及び乳癌の同所性異種移植片のヘマトキシリン−エオジン(HE)染色。(C)同所性腫瘍異種移植片を有するマウスから採取された血清エクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)図8Aに示された免疫ブロットの膜のクーマシー染色。
乳癌患者のエクソソームはダイサーを含み、pre−miRNAをプロセシングして、異なる臓器の細胞に侵入する。(A)ヌードマウスの採取間もない原発性ヒト卵巣腫瘍、子宮内膜腫瘍及び乳房腫瘍のフラグメント由来の同所性異種移植片の代表的写真。(B)卵巣癌、子宮内膜癌及び乳癌の同所性異種移植片のヘマトキシリン−エオジン(HE)染色。(C)同所性腫瘍異種移植片を有するマウスから採取された血清エクソソームの透過型電子顕微鏡写真。(D)図8Aに示された免疫ブロットの膜のクーマシー染色。

0038

癌の進行は、腫瘍中の効果的な細胞間コミュニケーションに依存する。エクソソームは、全ての細胞型により分泌されるナノ小胞体であり、タンパク質及び核酸を含む。癌細胞により分泌されたエクソソームは、特異的にRNA誘導サイレンシング複合体(RISC;ダイサー/TRBP/AGO2)と会合したマイクロRNA(miRNA)を含み、前駆体マイクロRNA(pre−miRNA)を成熟miRNAにプロセシングする細胞自律性能力を有する。ネイキッドmiRNAの代わりにRISC会合miRNAが存在することで、標的細胞内でのmRNAの高効率的で急速なサイレンシングが可能になり、それらのトランスクリプトームを効果的に改変する。癌細胞中のRISCタンパク質は、特にCD43依存的に多小胞体(MVB)に誘導され、次にエクソソームに誘導される。エクソソームの、RISCに組み込まれたmiRNAが、非腫瘍原性上皮細胞刺激して、発癌性経路の特異的誘導を介して腫瘍を形成し、間質線維芽細胞を活性化する。本研究は、正常細胞をさらに支配して癌の発生及び進行に参画する発癌性「フィールド効果(field effect)」を導入する際の、癌性エクソソームの可能な役割を解明する。その上、miRNAバイオジェネシスは、エクソソーム中で細胞依存的に起こり得て、無数の疾患のための効率的なmiRNA媒介標的治療を操作するための新たなチャンス提示する。

0039

I.癌由来エクソソーム
腫瘍は、癌細胞及び間質成分を含む(Tse and Kalluri, 2011)。腫瘍細胞周囲組織とのコミュニケーションもまた癌の全身拡大の速度及び強度を決定づけることが、近年のエビデンスから示唆される(Luga et al., 2012)。原発性腫瘍が、癌細胞分泌因子を介して、その後に転移を起こす続発性腫瘍部位養成及び準備する可能性が、幾つかの試験から示唆された(Hood et al., 2011; Peinado et al., 2012)。可溶性増殖因子、グルコース代謝産物、ケモカイン、酵素マイクロ粒子、マイクロ小胞体、エクソソーム及び遊離核酸をはじめとする、複数のそのような仲介物質が同定された(Guermonprez et al., 2002; Luga et al., 2012; Peinado
et al., 2012; Simons and Raposo, 2009; Thery and Casas, 2002)。

0040

近年は、エクソソーム及びエクソソームと癌との関連性に関する多数の発行物が見られる(Yang and Robbins, 2011)。癌細胞が正常細胞と比較して、多数のエクソソームを分泌することが、ほとんどの研究で示されている(Yang and Robbins, 2011)。低酸素の癌細胞は、正常酸素の癌細胞よりも多くのエクソソームを放出する(King et al., 2012)。癌由来エクソソームは、miRNAをはじめとするタンパク質及び核酸の特異的含有量運搬すると推測される(Valadi et al., 2007)。そのような研究は、刺激的であったが、タンパク質及びmiRNAが、少なからぬ機能的変化を至る所にある標的細胞に導入し得る方法を説明するには至っていない。ほとんどの研究が、エクソソーム中の成熟miRNAを同定したが、その機能は大部分が未知である。その上、一本鎖miRNAは、ターゲットmRNAのサイレンシングにおいては効果が非常に低く、RISC組み込みを利用せずにmRNA認識を促進する。RLCのタンパク質がそのpre−miRNAを認識して、それを22ヌクレオチドのRNA二本鎖にプロセシングする。AGO2は、次の遺伝子サイレンシングのための一本の鎖を選択し、他の鎖は多くの場合、分解される。その全体的反応は自然発生的であり、その3種のタンパク質及び組み込まれたpre−miRNAを越える任意の因子を必要としない(Maniataki and Mourelatos, 2005)。miRNAを完全に機能的にするために、その反応は、そのpre−miRNAをRLCに組み込むプロセシング、並びにAGOを介したmRNA認識及びサイレンシングを必要とする。

0041

本明細書において、癌細胞(オンコソーム)及び対照細胞(ノルモソーム)から得たエクソソームのmiRNAプロファイル探査して、エクソソームmiRNAの機能的能力を、遺伝子サイレンシングの実現及び標的細胞トランスクリプトーム改変を実現することにおいて評価した。オンコソームは、pre−miRNAからmiRNAへのプロセシング能力を有する機能的複合体として、ダイサー、TRBP及びAGO2を特異的に含む。pre−miRNAは、全てのエクソソームに存在するが、RLCの存在によりオンコソーム中のみでプロセシングされる。興味深いこととして、オンコソームでは発癌性pre−miRNA/miRNAの蓄積が好適となり、これが、一般には発癌性miRNA/pre−miRNAが豊富である癌細胞のpre−miRNA量の単なる反映となった可能性がある(Bartels and Tsongalis, 2009; Nicoloso et al., 2009)。

0042

これまでの報告は、エクソソーム中のmiRNAの存在を示唆し、機能に関して推測した(Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010)。miRNAがmRNAターゲットの適切なサイレンシングのための理論的濃度で存在する必要があるならば、循環内のエクソソームは、標的トランスクリプトームを抑制するのに十分な濃度の成熟miRNAを提供することは考えにくい。レシピエント細胞内でのmiRNAバイオジェネシスは、細胞内に既に存在するプロセシングに利用可能なpre−miRNAの総量により律速されるだけでなく必要とされる酵素が律速的量であるため、レシピエント細胞中のエクソソームから生成されたpre−miRNAのプロセシングは起こりそうにない事象である。つまり、プロセシングはpre−miRNAがレシピエント細胞に移動する場合に起こり、各成熟miRNAではないため、プロセシング経路を通ることなく転写後に遺伝子発現の直接改変するにはレシピエント細胞に成熟miRNAを侵入させることがより効率的である。エクソソーム中の特異的miRNAバイオジェネシスは、癌細胞についてのこの難問を解決する。オンコソームはRISC会合型である成熟miRNAのサブセットが非常に豊富になり、標的細胞の表現型を形成する際に重要な生物学的枠割を担う可能性がある。

0043

その上、癌細胞は、癌細胞に増殖的及び生存的利点を提供し、臨床段階の進行、転移及び予後不良に関連するmiR−21及びmiR−155などの発癌能力を有するmiRNAを過剰発現する(Yan et al., 2008)。これらのmiRNAが癌患者の循環において過剰発現されることも、これまでに報告されている(Mao et al., 2013)。細胞内でのmiRNAの合成は酵素反応であり、それゆえ細胞質に存在するダイサーなどの鍵を握る酵素の量に依存する。ダイサーは、乳癌細胞及び乳房腫瘍においてダウンレギュレートされることが記載されている(Grelier et al., 2009; Martello et al., 2010)。それゆえこれらの癌細胞が合成し得るmiRNA量は、限られている。エクソソーム生成は連続工程であるため、癌細胞は特異的pre−miRNAをRLCタンパク質と共に詰め込むことでエクソソーム中の成熟miRNAを高濃度にし、同時に元の細胞内でこれらのmiRNAのアップレギュレーションを維持すると推定される。オンコソームはRISC会合型の成熟miRNAが非常に豊富であり、標的細胞の表現型を形成する上で重要な生物学的枠割を担う可能性がある。同時に本来の細胞は、有利な発癌性miRNAの過剰発現を維持するが、レシピエント細胞は、エクソソームを通したpre−miRNAの侵入で過飽和となったバイオジェネシス経路を見ることはない。

0044

本研究は、癌性エクソソームがmiRNAのサブセットを豊富に含むようになるRISC依存性メカニズムを明らかにしている。エクソソームmiRNAの任意の減少は、ダイサー抑制による低レベルのmiRNAの単なる反映の可能性があるため、癌細胞中のダイサーに対抗するsiRNA/shRNAの使用は、エクソソーム中のmiRNA量を探査するための実現可能な選択肢にはならなかった。それゆえ中和する抗体をエクソソームに直接送達する電気穿孔法を開発した。この方法は、エクソソーム中のダイサー活性を効率的に阻害してpre−miRNAのプロセシングを防止する働きがあった。

0045

特定のmiRNAは、特異的腫瘍をアップレギュレートするが(Volinia et
al., 2006)、ヒトの癌においては、miRNAの全体的な減少が起こることも報告されている(Kumar et al., 2007; Lu et al., 2005; Melo et al., 2011; Melo et al., 2010; Melo et al., 2009; Ozen et al., 2008)。ダイサーは、癌細胞で抑制されることが記載されているが、腫瘍の成長を維持するのに低レベルで十分である(Kumar et al., 2009)。miR−103/107を介した部分的なダイサーダウンレギュレーションは、細胞増殖に影響を及ぼすことなく癌細胞の侵襲性を増強する(Martello et al., 2010)。ダイサーの完全な喪失は、細胞生存にとって有害である(Fukagawa et al., 2004)。一方で低レベルのダイサーは、及び卵巣癌患者生存率低下に関連する(Karube et al., 2005; Merritt et al., 2008)。同様にダイサーのヘテロ接合性喪失は、乳癌患者の転移に相関する(Martello et al., 2010)。mRNAレベルは不変であるため、乳癌におけるダイサーのダウンレギュレーションは、転写後にも起こる(Grelier et al., 2009; Wiesen and Tomasi, 2009)。癌細胞においてダイサー画分は、CD43依存的にエンドソーム/MVBを標的化される。最終的にダイサーは、エクソソームを通して分泌される。エクソソームのバイオジェネシス経路の成分であるHrs、BiG2及びTSG101のダウンレギュレーションは、ダイサータンパク質の細胞内局在化に劇的な変化をもたらす。癌細胞におけるダイサーレベル抑制の1つの考えられる説明は、エクソソームを介した能動輸送を原因とする可能性がある。エクソソーム分泌経路が閉鎖されると、癌細胞がダイサータンパク質増加を感知して、mRNA発現をダウンレギュレートする。加えて癌細胞は、成熟miRNAの生成を援助し得なくなると、ダイサータンパク質を核内コンパートメントに運搬する。これに関連して、高悪性度の癌細胞におけるダイサーアップレギュレーションは。癌細胞を低悪性度にする(Park et al., 2011)。

0046

CD43は、白血球中優勢に存在する膜貫通型タンパク質である。一部の癌細胞では、切断されたCD43が、細胞質及び核内で観察される(Shelley at al.
2012)。CD43は、特定の膜タンパク質をエクソソームに標的化させ得ることが、これまでに示されている(Shen et al., 2011a)。同所性乳癌のマウスモデルにおけるCD43の抑制は、腫瘍量を76%減少させる(Shelley et al., 2012)。臨床試験により、CD43発現が乳癌患者の生存率低下に相関することが示唆されている(de Laurentiis et al., 2011)。この報告から、CD43がオンコソーム内へのダイサー誘導に機能的に関与することが確認される。

0047

近年の研究で、黒色腫由来エクソソームが転移において役割を担い、線維芽細胞由来のエクソソームが乳癌細胞の遊走において役割を担うことが示されている(Luga et
al., 2012; Peinado et al., 2012)。癌細胞由来のエクソソームは、mRNA及び血管形成促進性タンパク質の移動に関連した腫瘍化促進的役割を有する(Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Skog et al., 2008)。癌細胞由来のエクソソームは、EGFRvIIIなどの発癌遺伝子水平移動にも寄与する可能性がある(Skog et al., 2008)。オンコソームは、RISC会合miRNAを介して標的細胞内で重要なトランスクリプトーム改変を媒介する。無数の生物学的工程が、標的細胞において影響を受け、増殖を誘導し、非腫瘍原性細胞腫瘍形成細胞に変換する。それにもかかわらず、レシピエント細胞に及ぼすオンコソームの潜在的インビボ作用は、複数の他の環境パラメータ及びアクセスに対する障害物質(accessibility barriers)に依存する。

0048

オンコソームは、間質線維芽細胞も活性化して、筋線維芽細胞の表現型を獲得する。一例として、それぞれオンコソーム由来のmiR−21及びmiR−10bを介した腫瘍サプレッサPTEN及びHOXD10をサイレンシングするオンコソームの能力が例証された(Ma et al., 2007; Maehama, 2007)。これらの結果から、悪性腫瘍に達する癌細胞により採用されるコミュニケーションの複雑な性質が強調される。これらのデータは、癌細胞がエクソソームを利用し、周囲の正常細胞を操作して癌進行を促進し、反応性間質を動員する可能性を例証している。

0049

多くの研究で、線維芽細胞及び正常な上皮細胞も、明らかな突然変異を起こさずに腫瘍サプレッサのダウンレギュレーション及び発癌遺伝子の活性化を呈することが示された。総括すると、本研究は、隣接する正常細胞をさらに支配して癌の発生及び進行に参画する発癌性「フィールド効果」を導入する際に癌性エクソソームが担う可能な役割を解明している。オンコソームは、発癌性経路の活性化を介して非腫瘍原性細胞を腫瘍形成細胞に変換することが可能である。加えてオンコソームは、反応性間質の活性化の生成にも参画し得る。これは、定義された遺伝子突然変異を必要とせずに起こる可能性があり、突然変異した癌細胞が微細環境及び巨大環境からの支援を動員するアジェンダを拡大する方法の複雑さを説明している。

0050

II.バイオマーカの検出
当該技術分野で周知の様々な技術により、バイオマーカ又は遺伝子の発現を測定することができる。バイオマーカのメッセンジャーRNA(mRNA)のレベルを定量することを利用して、バイオマーカの発現を測定してもよい。あるいはバイオマーカのタンパク質生成物レベルを定量することを利用して、バイオマーカの発現を測定してもよい。以下に議論する方法に関連するさらなる情報は、Ausubel et al. (2003)又はSambrook et al. (1989)に見出すことができる。パラメータを操作して該当するmRNA又はタンパク質の検出を最適化し得ることは、当業者に公知であろう。

0051

幾つかの実施形態において、前記の発現情報を得ることは、RNAの定量、例えばcDNAマイクロアレイ、定量RT−PCR、インサイシュハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、又はヌクレアーゼプロテクションを含んでいてもよい。前記の発現情報を得ることは、タンパク質の定量を含んでいてもよく、例えばタンパク質定量には、免疫組織化学,ELISA、放射免疫アッセイRIA)、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ化学発光アッセイ生物発光アッセイゲル電気泳動法、ウェスタンブロット分析、質量分析法、又はタンパク質マイクロアレイがある。

0052

核酸マイクロアレイを利用して、複数のバイオマーカの差次的発現を定量してもよい。例えばアフィメトリックスジーンチップ(Affymetrix GeneChip)(登録商標)技術(カリフォルニアサンタクララ)又はインサイト社(カリフォルニア州フリーモント)のマイクロアレイシステムを使用することなど、市販の装置を使用して、製造業者プロトコルに従い、マイクロアレイ分析を実施してもよい。例えば一本鎖核酸(例えば、cDNA又はオリゴヌクレオチド)を、マイクロチップ基板上に配置又は配列させてもよい。配列されたシークエンスを、その後、該当する細胞の特異的核酸ブローブハイブリダイズさせる。該当する細胞から抽出されたRNAの逆転写により蛍光標識されたデオキシヌクレオチドを取り込むことにより、蛍光標識されたcDNAプローブを生成させてもよい。あるいはRNAをインビトロ転写により増幅させてもよく、ビオチンなどのマーカで標識させてもよい。標識されたプローブを、その後、高ストリンジェント条件下で、マイクロチップ上に固定された核酸にハイブリダイズする。ストリンジェント洗浄で非特異的に結合したプローブを除去した後、共焦点レーザ顕微鏡測定、又は別の検出方法、例えばCCDカメラにおより、チップをスキャンする。ハイブリダイゼーションファイルの蛍光強度の生データは、ロバストマルチチップアベレージ(RMA)アルゴリズムで前処理して、発現値を作成する。

0053

定量リアルタイムPCR(qRT−PCR)を用いて、複数のバイオマーカの差次的発現を測定することもできる。qRT−PCRでは、RNAテンプレートは一般に、cDNAに逆転写され、その後、PCR反応により増幅される。PCR産物の量は、リアルタイムでサイクルごとにたどるため、mRNAの初期濃度を決定することができる。PCR産物の量を測定するために、二本鎖DNAに結合するSYBRグリーンなどの蛍光色素の存在下で反応を実施させてもよい。反応は、増幅されるDNAに特異的な蛍光レポータプローブを用いて実施してもよい。

0054

蛍光レポータプローブの非限定的例には、タックマン(TaqMan)(登録商標)プローブ(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)。カリフォルニア州フォスターシティ所在)がある。クエンチャーがPCR延長サイクルの間に除去されると、蛍光レポータプローブが蛍光を発する。マルチプレックスqRT−PCRは、それぞれが異なる発蛍光団を含む複数の遺伝子特異的レポータプローブを用いることにより実施することができる。蛍光値は、各サイクルの間に記録され、増幅反応でその時点まで増幅された生成物の量を表す。誤差を最小限に抑えて任意の試料間変動を低減するために、参照標準を利用してqRT−PCRを実施してもよい。理想的な参照標準は、異なる組織でも一定の値で表され、実験的処理による影響を受けない。適切な参照標準としては、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)及びβ−アクチン用のmRNAが挙げられるが、これらに限定されない。元の試料のmRNAレベル又は各バイオマーカの発現の倍率変化を、当該技術分野で周知の計算を利用して決定してもよい。

0055

免疫組織化学的染色を利用して、複数のバイオマーカの差次的発現を測定してもよい。この方法は、タンパク質と特異的抗体との相互作用により組織切片の細胞におけるタンパク質局在化を可能にする。このために、組織をホルマリン又は他の適切な固定剤で固定して、ワックス又はプラスチック包埋し、ミクロトームを用いて薄切片(約0.1mm〜数mm厚)に切り出すことができる。あるいは組織を凍結し、クリオスタットを用いて薄切片に切り出してもよい。組織切片を固体表面に配列させ、それに固定してもよい(即ち、組織マイクロアレイ)。組織切片を、該当する抗原に対する一次抗体と共にインキュベートして、洗浄し、非結合抗体を除去する。一次抗体を検出システムに結合させるか、又は一次抗体を、検出システムに結合した二次抗体で検出してもよい。検出システムは、発蛍光団であってもよく、又は基質を比色、蛍光、若しくは化学発光生成物に変換し得る西ワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼなどの酵素であってもよい。染色された組織切片は一般に、顕微鏡下でスキャンされる。癌対象から得た組織試料は、異成分からなる、即ち一部の細胞が正常で他の細胞が癌性であり得るため、組織における陽性染色細胞の割合を決定してもよい。この測定を、染色強度の測定と一緒に利用して、バイオマーカの発現値を作成してもよい。

0056

酵素免疫測定法、即ちELISAを利用して、複数のバイオマーカの差次的発現を測定してもよい。ELISAアッセイには多数の変法がある。全てが、固体表面、一般にはマイクロタイタープレートでの抗原又は抗体の固定化に基づいている。本来のELISA法は、該当するバイオマーカタンパク質を含む試料を調製すること、マイクロタイターウェルを該試料でコーティングすること、各ウェルを特異的抗原を認識する一次抗体と共にインキュベートすること、非結合抗体を洗い流すこと、その後、抗体−抗原複合体を検出すること、を含む。抗体−抗原複合体は、直接検出してもよい。このために、一次抗体を、検出可能な生成物を生成する酵素などの検出システムにコンジュゲートする。抗体−抗原複合体を、間接的に検出してもよい。このためには一次抗体は、先に記載された検出システムにコンジュゲートされた二次抗体により検出される。マイクロタイタープレートをその後、スキャンし、当該技術分野で公知の手段を利用して、強度の生データを発現値に変換することができる。

0057

抗体マイクロアレイを利用して、複数のバイオマーカの差次的発現を測定してもよい。このためには、複数の抗体を配列させて、マイクロアレイ又はバイオチップの表面に共有結合させる。該当するバイオマーカタンパク質を含むタンパク質抽出物は、一般に、蛍光色素又はビオチンで標識されている。標識されたバイオマーカタンパク質を、抗体マイクロアレイと共にインキュベートする。洗浄して非結合タンパク質を除去した後、マイクロアレイをスキャンする。蛍光強度の生データを、当該技術分野で公知の手段を利用して、発現値に変換することができる。

0058

ルミネックス・マルチプレキシング・マイクロスフェア(Luminex multiplexing microspheres)を利用して、複数のバイオマーカの差次的発現を測定してもよい。これらの微視的ポリスチレンビーズは、内部が蛍光色素でカラーコードされているため、各ビーズは特有のスペクトルシグネチャを有する(そのうち最大100存在する)。同じシグネチャを有するビーズを、該当するターゲット(即ち、それぞれバイオマーカmRNA又はタンパク質)に結合する特異的オリゴヌクレオチド又は特異的抗体でタグ付けする。その一方でターゲットは、蛍光レポータでタグ付けされている。こうして、一方はビーズから、他方はターゲット上のレポータ分子から、という2種の色素源が存在する。その後ビーズは、ターゲットを含む試料と共にインキュベートされ、そのうち最大100種が、1つのウェルで検出され得る。小さなサイズ/表面積のビーズ及びターゲットへのビーズの三次元暴露により、結合反応の間にほぼ溶液相の反応速度が得られる。捕捉されたターゲットは、アッセイの間に捕捉された各ビーズを同定する内部色素及び任意のレポータ色素をレーザ励起するフローサイトメトリーに基づく高度の流体工学により検出される。当該技術分野で公知の手段を用いて、取得ファイルからのデータを発現値に変換することができる。

0059

インサイチュハイブリダイゼーションを利用して、複数のバイオマーカの差次的発現を測定してもよい。この方法は、組織切片の細胞において該当するmRNAの局在化を可能にする。この方法では、組織を凍結するか、又は固定して包埋し、その後、薄切片に切り出して、固体表面に配列及び付着させる。組織切片を、該当するmRNAとハイブリダイズする、標識されたアンチセンスプローブと共にインキュベートする。ハイブリダイゼーション及び洗浄ステップは、一般に、高ストリンジェント条件下で実施される。プローブは、別のタンパク質又は抗体により検出され得る発蛍光団又は低分子タグ(ビオチン又はジゴキシゲニンなど)で標識してもよく、それにより標識されたハイブリッドを顕微鏡下で検出及び視覚化してもよい。各アンチセンスプローブが識別可能な標識を有する場合には、複数のmRNAを同時に検出することができる。ハイブリッドされた組織アレイは、一般に、顕微鏡下でスキャンされる。癌対象から得た組織試料は、異成分からなる、即ち一部の細胞が正常で他の細胞が癌性であり得るため、組織における陽性染色細胞の割合を決定してもよい。この測定を、染色強度の測定と一緒に利用して、各バイオマーカの発現値を作成してもよい。

0060

さらなる実施形態において、マーカレベルを、対照のマーカレベルと比較してもよく、その場合の対照が、特定の転移腫瘍を有する、若しくは特定の転移腫瘍を有さない、又はそれらの両方であると決定された1名以上の患者から採取された1つ以上の腫瘍試料を含んでいてもよい。

0061

対照は、患者の個別のデータと同時に(例えば、同じハイブリダイゼーション実験で)得られたデータを含んでいてもよく、又は保存された値若しくは値の組み合わせであってもよく、例えばコンピュータ若しくはコンピュータ可読媒体に保存されていてもよい。後者が利用される場合、初期又は追跡調査試料から得られた選択されたマーカ(複数可)に関する新しい患者データを、さらなる対照実験を必要とせずに同じマーカ(複数可)の保存データと比較することができる。

0062

III.定義
本明細書で用いられる「生物学的試料を得ること」又は「血液試料を得ること」は、例えば直接的又は間接的のいずれかで、生物学的試料又は血液試料を受け取ることを指す。例えば幾つかの実施液体において、血液試料又は末梢血単核細胞(PBMC)を含む試料などの生物学的試料は、生物学的試料を分析する実験室又は場所で、又はその付近で対象から直接得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、第三団体により引き出され、又は採取され、その後、例えば分析用の別の物体又は場所に輸送されてもよい。別の実施形態において、試料は、ポイントオブケア試験を利用して、同じ場所で採取し、テストしてもよい。これらの実施形態において、前記採取は、例えば患者から、実験室から、診療所から、郵便物から、裁判所から、又は郵便局から、などにより試料を受け取ることを指す。幾つかのさらなる態様において、該方法は、対象に、保険者担当医師薬剤師薬剤給付管理者、又は決定が該当し得る任意の人に、決定を報告することをさらに含み得る。

0063

「対象」又は「患者」は、治療又は診断テストが望ましい任意の単一対象を意味する。この場合、対象又は患者は、一般にヒトを指す。臨床試験に関与し、疾患の任意臨床兆候を示さない任意の対象、又は疫学研究に関与する対象、又は対照として用いられる対象もまた、対象として含まれるものとする。

0064

本明細書で用いられる「発現増加」は、適切な対照(例えば、非癌性組織又は細胞試料、参照標準)に比較して癌試料での発現レベルが上昇又は増加していて、遺伝子発現レベルの上昇又は増加が統計学的に有意であること(p<0.05)を指す。対照に比較した癌試料での遺伝子発現の増加が統計学的に有意であるかどうかは、適切なt検定(例えば、一標本t検定、二標本t検定、ウェルチのt検定)又は当業者に公知の他の統計学的検定を用いて決定することができる。癌において過剰発現される遺伝子は、例えば癌で過剰発現されることが公知である、又はこれまでに決定されている遺伝子であってもよい。

0065

本明細書で用いられる「発現減少」は、適切な対照(例えば、非癌性組織又は細胞試料、参照標準)に比較して癌試料での発現レベルが低下又は減少していて、遺伝子発現レベルの低下又は減少が統計学的に有意であること(p<0.05)を指す。幾つかの実施形態において、遺伝子発現レベルの低下又は減少は、遺伝子発現の完全な欠如又は発現レベルゼロであってもよい。対照に比較した癌試料での遺伝子発現の減少が統計学的に有意であるかどうかは、適切なt検定(例えば、一標本t検定、二標本t検定、ウェルチのt検定)又は当業者に公知の他の統計学的検定を用いて決定することができる。癌において過小発現される遺伝子は、例えば癌で過小発現されることが公知である、又は過去に決定されている遺伝子であってもよい。

0066

本明細書で用いられる用語「抗原結合フラグメント」は、広義に用いられており、具体的にはモノクローナル抗体ポリクローナル抗体、少なくとも2つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体フラグメントを含む。

0067

本明細書で用いられる用語「プライマー」は、テンプレート依存性工程において新生核酸の合成を刺激することが可能な任意の核酸を包含することを意味する。プライマーは、10〜20及び/又は30塩基対の長さのオリゴヌクレオチドであってもよいが、より長いシークエンスを用いることができる。プライマーは、二本鎖及び/又は一本鎖形態で提供されてもよいが、一本鎖形態が好ましい。

0068

IV.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例で開示された技術が本発明の実践において十分に機能するために本発明者により発見された技術を表し、つまり実践に好ましい様式を構成すると判断され得ることは、当業者に認識されるはずである。しかし当業者は、本開示に照らせば、多くの変更を開示された特定の実施形態に施すことができ、それでも尚、本発明の主旨及び範囲を逸脱することなく類似又は同様の結果を得ることができることを認識するはずである。

0069

実施例1−実験の手順
エクソソームの単離及び精製。エクソソームを過去に記載された分画遠心法により精製した(Thery et al., 2006; Luga et al., 2012)。手短に言えば、24h培養された細胞から得た上清を、800g及び2000gの連続遠心分離ステップに供して、培養瓶内で0.2μmフィルターを用いて上清をろ過した。エクソソームを、SW40Tiスイングバケットロータベックマン)内で100,000gで2時間、ペレット化した。上清を廃棄して、1時間の洗浄ステップのためにPBSを添加した。ペレットをエクソソームについて分析した。RNA抽出用のエクソソームは、トリゾール500μlに再懸濁させ、タンパク質抽出用のエクソソームは、溶解緩衝液(8M尿素/2.5%SDS、5μg/mlロイペプチン、1μg/mlペプスタチン及び1mMフッ化フェニルメチルスルホニル)250μlに再懸濁させ、処置用のエクソソームは、PBSに再懸濁させた。凍結させた血清試料上で解凍し、500μlをPBS 12mLに添加して、前述と同じ手順に従った。遠心分離により精製されたエクソソームを、RNase含水に溶解された500g/mLプロテイナーゼK(シグマアルドリッチ)で処置し(37℃、60分間)、その後、該プロテアーゼを熱失活させて(60℃、10分間)、2g/mLプロテアーゼ不含RNaseA(シグマ−アルドリッチ)と共にインキュベートして(37℃、15分間)、10倍濃縮されたRNase阻害剤アンビオン)を添加した。エクソソーム処置については、エクソソームを2本ずつ精製し、一方のペレットをタンパク質精製に用いた。

0070

エクソソームのフローサイトメトリー分析。エクソソーム調製物(5〜10μg)を4μm径アルデヒド硫酸ラテックスビーズインターフェイシャルダイナミクスオレゴン州ポートランド所在)5μlと共にインキュベートし、2%BSAを含むPBS400μl中に再懸濁させた。エクソソームでコーティングしたビーズ(20μl)を以下の抗体:抗CD63(サンタクルズ)、抗CD9(アブカム)、抗TSG101(アブカム)、抗フロチリン−1(サンタクルズ)と共に4℃で30分間インキュベートし、次いで必要であれば、FITC−コンジュゲート二次抗体と共にインキュベートして、FACSキャリバーフローサイトメータ(BDバイオサイエンシズ)で分析した。

0071

エクソソームの電気泳動。総タンパク濃度100μg(ブラッドフォードアッセイにより測定)のエクソソームと、ダイサー抗体5μg(ポリクローナルSC−30226、サンタクルズ、カリフォルニア州所在)、アクチン抗体5μg、又はpre−miRNA−21、−10b及びcel1 10μgを、400μLの電気泳動緩衝液(1.15mMリン酸カリウムpH7.2、25mM塩化カリウム、21%オプティプレップ)中に混合し、ジーンパルサー・エックスクセル・エレクトロポレーションシステム(バイオラッド)を用いて4mmキュベット中で過去に記載された通り(Alvarez−Erviti
et al., 2011)電気泳動した。電気泳動の後、エクソソームを、適宜、プロテアーゼK及び/又はRNaseで処置した。

0072

光散乱分光法(LSS)。LSSスペクトルを、図10Bに記載された実験システムを利用して回収した。フィアニウムSC−450−2広帯域スーパーコンティニウムレーザを、白色光源として用いた。スーパーコンティニウムレーザの光を、長焦点レンズにより試料に集光させた。エクソソーム又はマイクロスフェアのいずれかの懸濁液からなる試料を、特注立方体形水晶サンプルホールダに入れた。バックグランドシグナルを、エクソソーム又はマイクロスフェアを含まない溶媒試料から回収した。エクソソーム又はマイクロスフェアにより入射光に対して90°で散乱された光を、他の長焦点レンズで回収して、高効率性アンドール・テクノロジー・イクソンDV885EMCCD(Andor Technology iXon DV885 EMCCD)検出器に連結されたプリンストンインスツルメンツアクトン2300iイメージングスペクトログラフ(Princiton Instrument Acton 2300i imaging spectrograph)に送信した。検出は、470〜870nm波長範囲で実施した。検出器をコンピュータで制御して、データを送信、保存及び処理した。

0073

システムを較正し、波長よりも小さい場合がある粒子サイズの正確な検出能力確立するために、名目直径24nm〜100nmのガラスマイクロスフェア及び名目直径119nm、175nm、356nm及び457nmのポリスチレンマイクロスフェアのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)懸濁液からのシグナルを測定した。過去に開発された最小二乗法による最小化法(Fang et al., 2003)を利用して、ミー理論から予測されたスペクトルをデータにフィットさせた。実験でのスペクトル及び得られたフィットを、名目直径100nmのガラスマイクロスフェア及び名目直径356nmのポリスチレンマイクロスフェアについて、図1Eに示す。ここでは、波長の四乗を掛けレイリー散乱から得られた偏差を、LSSスペクトルの非レイリー挙動を強調するために示している。マイクロスフェアに関してLSSで得られたサイズ分布を製造業者が提供した仕様書と比較することにより、LSS法正確度が10nmと推定されることが結論づけられた。再建されたサイズ分布がマイクロスフェア及び溶媒の反射率に対して無感応であることも推定された。ここでは、小分子の光散乱がそれらのサイズの六乗に比例することから、50nmよりも小さな粒子を、より大きな粒子の存在下で検出するには、実験システムの信号雑音比を実質的に上昇させる必要があることが指摘されなければならない。

0074

その後、エクソソームのPBS懸濁液を用いたLSS実験を実施した。エクソソームの実験的LSSスペクトル及び対応するミーフィットを、図1Bに示す。再建されたスペクトルのフィットは、優れている。上述の再建技術を利用して(Fang et al. 2003; Itzkan et al. 2007; Fang et al. 2007)、104nmをピークとするエクソソームのサイズ分布が見出された(図1Rの右グラフ及び挿入図)。この抽出されたサイズ分布を、類似のエクソソーム試料のTEM写真により実施された形態計測法(図1A)と比較した。TEM写真での粒子数は、統計学的に意義のある分布をプロットするのに十分多くないため、50nmよりも大きな平均粒子サイズは、TEM写真から計算して、95nmであることが見出された。つまり、LSSで再建されたサイズ分布とエクソソームのTEM写真で実施された形態測定法は、全てのデータで一致している。

0075

N−Rh−PE処置。細胞を氷冷1×ハンクス緩衝液(インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド所在)で希釈された8μM N−Rh−PE(アバンティ・ポーラリピッドアラバマ州アラバスター所在)と共に氷上で1時間インキュベートすることにより、N−Rh−PEで標識した。その後、細胞を氷冷ハンクス緩衝液で3回洗浄した後、それらをDMEM培地で平板培養した。N−Rh−PE細胞を、標識のおよそ24h後に共焦点撮像に用いた。

0076

免疫金標識及び電子顕微鏡測定。最適な濃度の固定された標本を、300メッシュカーボン/ホルムバールコーティンググリッド滴下して、最低でも1分間、ホルムバールに吸収させた。免疫金染色では、グリッドをブロック/易透過ステップ用のブロッキング緩衝液中に1時間入れた。グリッドは、すすがずに直ちに適切に希釈された一次抗体に4℃で一夜入れた(ポリクローナル抗ダイサー1:10 SC−30226、サンタクルズ;モノクローナル抗CD9 1:10、アブカム)。対照として、一部のグリッドを一次抗体に暴露しなかった。翌日、グリッドの全てをPBSですすぎ、その後、10nm金粒子(オーリオン、ペンシルニアハットフィールド所在)を付着させた適切な二次抗体の液滴に室温で2時間浮遊させた。グリッドをPBSですすぎ、0.1Mリン酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒド中に15分間入れた。PBS及び蒸留水ですすいだ後、グリッドを乾燥させ、酢酸ウラニル対比染色させた。試料をテクナイ・バイオ・ツイン透過型電子顕微鏡(FEI、オレゴン州ヒルズボロ所在)で観察して、AMTCCDカメラ(アドバンスト・マイクロスコピー・テクニックマサチューセッツダンバース所在)で撮像した

0077

タンパク質ブロット及び抗体。内因性の遺伝子応答をモニタリングするために、細胞はRIPA緩衝液に採取し、エクソソームは8M尿素/2.5%SDS、5μg/mlロイペシン、1μg/mlペプスタチン及び1mMフッ化フェニルメチルスルホニル緩衝液に採取した。タンパク質をブラッドフォード定量法によりアクリルアミドゲルにロードし、湿式電気泳動転写によりPVDF膜イモビロンP)に転写した。同位性異種移植片モデルから採取された血清エクソソームのタンパク質試料では、15cm高の4%アクリルアミドゲルを用いて、ヒト及びマウスダイサーのバンドを分解した。概して、ブロットをPBS/0.05%ツイーン中の5%脱脂粉乳を用いて室温で1時間ブロックし、以下の一次抗体と共に4℃で一夜インキュベートした:1:500抗ダイサー(SC−30226)、サンタクルズ;1:1000抗ユビキチニル化タンパク質、クローンFK2ミリポア;1:500抗Flag M2−ペルオキシダーゼクローンM2、シグマ;1:500抗CD43 ab9088、アブカム;1:500抗PTEN、ab32199、アブカム;1:300抗CD9 ab92726、アブカム;1:500抗GADPH ab9483、アブカム;1:250抗TRBP ab72110、アブカム;1:300抗TSG101 ab83、アブカム;1:400抗AGO2 ab32381、アブカム;1:4000抗β−アクチンペルオキシダーゼ クローンAC−15、シグマ;1:500抗GFPab6556、アブカム;1:500抗HOXD10 ab76897、アブカム。二次抗体を室温で1時間インキュベートした。抗体インキュベーション後の洗浄を、1×PBS0.05%ツイーン20と共にオービタルシェーカで10分間隔で4回実施した。ブロットを、ピアース化学発光試薬を用いて発光させた。

0078

リアルタイムPCR分析。トリゾール(インビトロジェン)での総RNA精製に続いて、MultiScribeリバーストランスクリプターゼ(アプライド・バイオシステムズ)及びオリゴd(T)プライマーを用いて、DNase処置されたRNAを、後方に転写した。mRNAのリアルタイムPCRを、SYBR・グリーン・マスターミックス(アプライド・バイオシステムズ)及び対照としてのβ−アクチンを用いて、ABIPRISM7300HTシークエンス・ディテクション・システム・インスツルメントで実施した。プライマーを表1に列挙する。

0079

pre−miRNAを、150ngのDNaseで処置されたRNA及びSuperScript IIIプラチナワンステップ・RT−qPCRキット(インビトロジェン)を用いて定量した(Schmittgen et al., 2004)。プライマーを表1に列挙する。

0080

miRNA発現分析では、RNA 10ngを、特異的miRNAプライマーを含むTaqManマイクロRNAリバーストランスクリプションキット試薬と混合して、製造業者の使用説明書(アプライド・バイオシステムズ)に従って逆転写した。反応混合物を16℃で30分間、42℃で30分間、及び85℃で5分間インキュベートした。リアルタイムPCRを、試験されている各miRNA用の市販のアッセイオンデマンド(アプライド・バイオシステムズ)を利用し、ABIPRISM7300HTシークエンス・ディテクション・システム・インスツルメント(アプライド・バイオシステムズ)を用いて実施した。miRNAの発現を、RNA量及びインテグリティ内部対照として働く18SrRNA(TaqManプレデベロップド・アッセイ・リージェント;アプライド・バイオシステムズ)の発現に標準化させた。各測定は、三重測定で実施した。閾値サイクル(Ct)、つまり増幅されたターゲットの量が一定の閾値に達した部分サイクル数(fractional cycle number)を決定して、過去に報告された通り(Livak and Schmittgen, 2001)、2−ΔCt式を用いて発現を測定した。

0081

ノーザンブロット。成熟miRNAに対する逆相補鎖の3’ Bio[TEG]DNAオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ノーザンブロットを実施した(表2参照)。尿素/アクリルアミド15%ゲルを用いて、エクソソームRNA(DNase処置)40μgを1×RNAローディングダイと共に95℃で2分間、その後、氷上で2分間ロードした。マイクロRNAマーカを、製造業者(N2102、ニューイングランド・バイオラブズ)の使用説明書に従って使用した。TBE 1Xを使用して、電気泳動を4℃で3時間実施した。ワットマンブロッティングペーパー及びBrightStar−Plus正電化ナイロンメンブレン(アンビオン)を用い、TBE 0.5Xと共に、転写を4℃で2時間実施した。UVトランスルミネータを用いて、RNAを膜に20分間架橋させた。アンビオンのULTRAhyb(登録商標)−Oligoハイブリダーゼーション溶液(アンビオン)中、42℃で1時間回転させることにより、膜をプレイハイブリダイズした。プローブを氷上で解凍して、95℃で5分間インキュベートした後にハイブリダイゼーション緩衝液1mLあたりに、150ngを添加し、その後、膜を42℃で一晩回転させた。以下の洗浄を実施した:2XSSPE/0.5%SDS − 15分間を2回;0.2SSPE/0.5%SDS − 30分間を2回、及び2X SSPE − 5分間。これらの初期洗浄ステップの後、さらに洗浄し、その後、ブロットをBrightStar BioDetectキットを用い、製造業者(アンビオン)の使用説明書に従って発光させた。ブロットを2つの積層フィルムに一夜暴露した。ブロットを上手く剥離させて、さらに2回再プローブした。

0082

細胞培養、プラスミド、pre−miRNA及びsiRNA。MCF10A、MCF7、MDA−MB231、A549、SW480及びHeLaヒト細胞株と、NMuMG、67NR及び4T1マウス乳房細胞株を、DMEM10%FBS中で培養した(細胞は全て、アメリカン・タイプ・カルチャーコレクションATCCから得られた)。siRNA用のリポフェクタミン2000試薬(インビトロジェン)を用いて、トランスフェクションを実施した。合成pre−miRNAトランスフェクションでは、RNA iFect(キアゲン)を、全ての細胞株で用いた。siRNAのシークエンスを表3に列挙する。

0083

プラスミド。p−CMV−Tag4B−ダイサー(Melo et al., 2009);オリジーンのp−CMV6−CD63−GFP(RG217238);アドジーンのGFP−hAGO2(プラスミド11590);オリジーンのpGFP−shBiG2(TG314697);オリジーンのpGFP−shダイサー(TG304991);合成pre−miR−10b、−21及びcel−1は、アンビオンから購入した;3’UTR−WTPTEN、3’UTR−ミュータント−PTEN(Dr.Joshua Mendellの実験室)、3’UTR−WTHOXD10及び3’UTR−ミュータント−HOXD10(Dr.Robert Weinbergの実験室)は、アドジーンから購入した。

0084

免疫細胞化学及び共焦点顕微鏡測定。カバースリップが挿入された12ウェルプレートに、細胞をほぼコンフルエント播種して、一夜培養した。翌日、細胞を低温PBS1Xで洗浄し、4%PFA/PBSを用いて室温で20分間固定した。スライドにPBS 0.5%トリトンX−100を室温で10分間浸透させ、BSA5%により室温で1時間ブロックし、PBST(PBS、0.1%トリトン) 2%BSA中の一次抗体:1:100抗ダイサー(SC−30226)、サンタクルズ;1:500抗Flag、シグマ;
1:50抗CD43 ab9088(アブカム);1:100抗TSG101 ab83(アブカム);1:500抗GFPab6556(アブカム);1:100抗LAPM−1 ab25630(アブカム);1:100抗Hrs ab56468(アブカム);1:100抗BiG2 ab75001(アブカム);1:500抗ビオチンab66233(アブカム)と共に4℃で一夜インキュベートした。二次抗体のヤギ抗ウサギAlexa543又はヤギ抗マウスAlexa−488を室温で1時間インキュベートし、PBST 2%BSAで1:200に希釈した。DAPIを用いて核を染色した。エクソソームの分析では、採取されたエクソソームをトリトンX−0.05%と共に室温で15分間、次に5%BSAと共に室温で1時間インキュベートした。最初の一次抗体(抗CD9、1:50)を100μl PBST中、4℃で一夜インキュベートし、二次抗体である抗Flag(1:50)を翌日に添加し、室温で1時間インキュベートした。二次抗体を連続して添加し、同じく室温で1時間インキュベートした。エクソソームを、4%PFAが入った12ウェルプレート中のカバースリップ上部で45分間平板培養し、低温PBSで洗浄した。同一設定を維持するためにリサイクルツールを利用して、ツァイスLSM510アップライトコンフォーカル・システムで画像を得た。エクソソームの凝集により、共焦点顕微鏡で可視となる200nmを超える構造が得られた。データ解析では、少なくとも2つの独立した実験から得られたプールから画像を選択した。図は、代表的な視野を示す。

0085

インビトロダイシングアッセイ。エクソソームタンパク質抽出物(10μg)を、3mM MgCl2、30mM NaCl及び100mM Hepes、pH 7.5の存在下、3pmolのpre−miR−10b、−21及びcel−1ビオチンで内部標識されたヘアピンと共に37℃でインキュベートした。各反応物の最終容量は、10μlであった。ホルムアミドゲルローディング緩衝液10μlの添加により、反応を停止させた。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用してRNAを分解し、BrightStar BioDetectキットを用い、製造業者(アンビオン)の使用説明書に従って発光させた。

0086

細胞生存率及びコロニー形成アッセイ。細胞を96ウェルプレートに播種して、採取されたエクソソームを100μg/mLの濃度で1日目に添加した。細胞生存率を、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイにより決定した。コロニー形成実験では、細胞を12ウェルプレートに播種して、エクソソームを100μg/mLの濃度で培養の1日目及び5日目に添加した。8日後に、コロニーを固定して、MTT試薬で染色した。

0087

イルミナ・ヒト−HT12mRNA発現アレイ。RNAをイルミナヒト−HT12 mRNA発現アレイ中でハイブリダイズした。Rパッケージ「limma」により提示されたneqcルーチンを利用して、データを標準化した(Shi et al., 2010)。遺伝子存在量を、1遺伝子あたりのプローブ数中央値により決定した。遺伝子(列)及び試料(行)のユークリット距離の算術平均により、クラスタリングを実施する。

0088

miRNA発現アレイ。特注のmiRNAアレイを、9に記載された通り使用した。アレイは、1833のヒトマイクロRNAプローブ、1084のマウスマイクロRNAプローブ、及びその他の78の非コード化RNAプローブを含む。プローブは、二重にプリントした。各プローブに関連するGeneBankアクセションIDが含まれる。バイオインフォマティック分析を、R(バージョン2.14.2)(r−project.orgのワールドワイドウェブより)及びバイオコンダクター(bioconductor.org/のワールドワイドウェブより)を用いて実施した。各プローブの生データの強度は、バックグランド中央値を差し引いたピクセル強度の中央値特性である。オフセット1を設定することで、データを対数変換した後、負の値が確実に存在しなくなる。データをクォンタイル標準化した後、log2変換した。同じmiRNAを測定するプローブからのシグナルを平均した。LIMMAライブラリーの機能を利用して、解析を実施した。made4ライブラリーのヒートプロット関数を利用して、ヒートマップを作成した。テクニカルレプリケートを実施すると、ヒートマップは、反復測定から得られた平均発現値を表した。

0089

卵巣腫瘍、子宮内膜腫瘍及び乳房腫瘍の同所性異種移植片。4〜6週齢の雌無胸腺nu/nuマウス(ハーラン)を、個別換気ケージにおいて12時間の明暗周期で21〜23℃及び湿度40〜60%で飼育した。マウスは自由に放射線照射飼料及び滅菌水に接近することができた。全ての動物プロトコルを、スペイン施設内動物管理使用委員会(Spanish Institutional Animal Care and Use Committees)が再審査及び承認した。

0090

原発性腫瘍標本を、Hospital Universitari de Bellvitge (L’Hospitalet de Llobregat,スペイン、バルセロナ所在)から入手した。治験審査委員会が、試験を認可した。記入されたインフォームドコンセントを、患者から回収した。摘出された5つの代表的なヒト上皮性卵巣腫瘍(EOC):漿液性、類内膜明細胞腫瘍及び粘液性腫瘍から得た非壊死性組織片(約2〜3mm3)を選択して、10%FBS及びペニシリンストレプトマイシンを補充したDMEM(バイオウィタカー)中、室温で平板培養した。イソフルランで誘導された麻酔の下、動物を側部開腹術に供し、卵巣を露出させて、プロリーン7.0縫合糸で腫瘍片を卵巣表面に固定した。さらに、ヒト乳房腫瘍及び子宮内膜腫瘍の切片を、それぞれ乳房脂肪体及び子宮内膜壁に移植した

0091

同所性移植腫瘍を成長させて、殺処分の際に血液2mlを心臓穿刺により麻酔下のマウスから得た。試料を14,000rpmで遠心分離して、−80℃で凍結した。

0092

免疫沈降。細胞及びエクソソームを採取し、PBSで洗浄して、それぞれ遠心分離又は超遠心分離して、ペレットを採取した。氷冷RIPA緩衝液又は8M尿素/SDS緩衝液を、それぞれ細胞及びエクソソームに添加した。懸濁液を細胞では4℃で15分間、エクソソームでは4℃で2時間、穏やかに振とうした。ライセートを予め冷却された遠心分離機において14,000gで15分間遠心分離して、ペレットを廃棄した。プロテインA又はGアガロースセファロースビーズを、PBSで2回洗浄し、PBSを含む50%スラリー復元した。ビーズ/スラリーミックス(100μl)を細胞ライセート1mL及びエクソソームライセート500μlに添加して、4℃で10分間インキュベートした。14,000×gで4℃で10分間遠心分離することによりビーズを除去して、ペレットを廃棄した。ダイサー抗体(細胞5μg及びエクソソーム10μg)を細胞ライセート500μl又はエクソソームライセート250μl(1μg/μl細胞、10μg/μlエクソソーム)に添加して、オービタルシェーカにより4℃で一夜インキュベートした。プロテインA又はGアガロース/セファロースビーズズラリー 100μlを添加して、4℃で一夜放置した。遠心分離後、上清を廃棄して、ビーズを、細胞なら氷冷RIPA緩衝液で、又はエクソソームなら尿素/SDS緩衝液で、3回洗浄した。アガロース/セファロースビーズを5分間煮沸して、免疫複合体をビーズから解離させた。ビーズを遠心分離により回収して、タンパク質のブロットを上清で実施した。

0093

Ca2+イオノフォアA23187の存在下での培養条件。細胞(8×107細胞)を、DMEM中に5×105細胞/mlで播種した。細胞を処置するために、A23187(最終濃度200nM、カルビオケム、カリフォルニア州ラホヤ所在)を4時間後に培養物に添加した。処置又は非処置細胞の培地を回収して、エクソソームを採取した。

0094

ヌードマウスの細胞の同所性注射。過去に記載された通り(Welch, 1997)、MCF10A非腫瘍原性乳房上皮細胞、MDA−MB231−由来エクソソームに暴露されたMCF10A非腫瘍性乳房上皮細胞、及びMDA−MB231乳癌細胞(PBS
0.2ml中の1×105細胞)を、3週齢雌無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体内に注射することにより、同所性腫瘍の成長を測定した。腫瘍の長さ及び幅をキャリパーで測定することにより、腫瘍の成長をモニタリングして、過去に記載された通り(Welch,
1997)平均腫瘍直径として報告した。動物は全て、腫瘍細胞注射後21日目に、安楽死された。

0095

統計処理。エラーバーは、生物学的反復実験の間のS.D.を示す。各実験の技術的及び生物学的三重測定を実施した。統計学的有意性は、スチューデント検定により計算した。

0096

実施例2 − 結果
エクソソームの単離及び同定。癌細胞(MDA−MB231トリプルネガティブヒト転移性乳癌、MCF7ヒト乳房腺癌、67NRマウス非転移性乳癌及び4T1マウス転移性乳癌)から得たエクソソーム、及び対照細胞(MCF10A非腫瘍原性ヒト上皮性乳房及びNMuMG非腫瘍原性マウス上皮性乳房)を、確立された超遠心分離法を利用して単離した(図10A)(Luga et al., 2012; Thery et al., 2006)。採取されたエクソソームは、透過型電子顕微鏡測定(TEM)及び原子間力顕微鏡測定(AFM)により分析した。40〜140nmサイズの粒子を、同定した(図1A〜B)(Thery et al., 2002)。さらに、2種のエクソソームマーカ:TSG101及びCD9を検出することにより、エクソソームの同一性を確認した(図1C)(Ostrowski et al., 2010)。単離されたエクソソームは、免疫金標識電子顕微鏡測定により分析すると、CD9マーカに関しても陽性であった(図1A)。ラテックスビーズに結合されたエクソソームもフローサイトメトリーにより分析して、一般に用いられるエクソソームマーカであるテトラスパニンCD9、CD63、TSG101及びフロチリン1の表面発現を示した(図1D)。さらに、光散乱分光法(LSS)(Fang et al., 2007; Itzkan et al., 2007; Bang and Setabutr, 2010; Benitez−vieyra et al., 2009; Khairkar et al.,
2010; Min et al., 2010)を用いて、単利された試料が直径104nmをピークとする狭いサイズ分布を呈することを示した(FIG.1E、右パネル)。LSSシステムは、異なる直径のガラスマイクロスフェアを内部対照として用いることにより、エクソソーム抽出物中の全ての粒子サイズの正確な検出を可能にした。LSSはまた、これらの単離物中のマイクロ小胞体及び細菌又は細胞破片の潜在的混入を排除した(図1E、右グラフの挿入図参照)。さらに、そしてLSSデータと一致して、NanoSightナノ粒子トラッキング分析から、直径105±1.0nmをピークとするサイズ分布の粒子が明らかとなり(図1F)、ろ過されない場合に溶液中に存在する異なるサイズ範囲の潜在的混入物の存在がさらに排除された(図1F、右グラフ)。アポトーシス小体又はランダムな細胞破片が単離物に混入する可能性を排除するために、比色細胞生存率アッセイ(MTT)、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)アッセイ、アネキシンV及びヨウ化プロピジニルのフローサイトメトリー分析、並びにエクソソームのチトクロムC免疫ブロット(図10C〜E)を利用して、エクソソーム抽出前の細胞生存率を示した。癌細胞から単離されたエクソソームは、過去に定義された通り(Lee et al., 2011)、集合的にオンコソームと称される。対照細胞から単離されたエクソソームは、集合的にノルモソームと称される。

0097

オンコソームは、ノルモソームに比較して発癌性miRNAが特異的に豊富に存在する。オンコソーム及びノルモソームの全体的なmiRNA量を調査した。エクソソームから単離されたRNAのマイクロフルイディクス分析から、ノルモソームに比較した場合の、オンコソームの低分子RNA量増加が明らかとなった(図2F)。さらに、ノルモソーム(MCF10A由来)のmiRNAレベルとオンコソーム(MDA−MB−231由来)のmiRNAレベルの間に低い相関が観察され、R2値は0.35であった(図2A)。全体的miRNAアレイ分析から、ノルモソームと比較して、オンコソーム中でmiRNA量が豊富であることが示された。この分析では、ノルモソームと比較した場合のオンコソームの非常に異なるmiRNAプロファイルも明らかとなった。miRNAアレイデータは、オンコソームとノルモソームの間の305の差次的に発現されるmiRNA(表5)と共に、ノルモソームと比較した場合のオンコソーム中のmiRNA量の全体的な増加を示した。癌細胞は、非腫瘍原性細胞と比較して、総低分子RNAの全体量の減少を示したため、オンコソーム中でmiRNAが豊富であったことは、癌細胞中のmiRNA増加の単なる反映ではなかった(図11A)。それゆえエクソソーム中のmiRNAの蓄積は、特異的で、標的化されていると思われる。

0098

癌細胞中と、オンコソームとノルモソーム間にあるmiRNAアレイの差次的発現が見出されたこれらの細胞由来のエクソソームの15種のmiRNAの発現を、さらに評価した(表4及び5)。癌進行において示唆されてきたこれらの採取物から得られた6種のmiRNA(発癌性miRNA:miR−10a、miR−10b、miR−21、miR−27a、miR−155及びmiR−373)及び9種のmiRNAは、腫瘍抑制機能を有することが報告されており(腫瘍サプレッサmiRNA:let7a、miR15b、miR26a、miR31、miR125a、miR125b、miR200a、miR200c、miR335)、細胞、及びそれらの細胞由来のエクソソーム中で発現される(図11B〜C、及び表4)。エクソソーム中のmiRNAの半減期を決定するために、無細胞系を開発して、単離されたエクソソーム中のmiRNAを試験した。細胞を含まない精製されたエクソソームを培地に入れ、37℃で24h又は72hのいずれかの時間、インキュベートした。インキュベーション時間の後、エクソソームをmiRNA量について分析して、それらの起源の細胞と比較した。24hに比較して72hでは、細胞に比較してオンコソーム中でこれらのmiRNAの相関値の減少が存在したが(R2=0.60対R2=0.43)、ノルモソームとMCF10A細胞(ノルモソームを得るために用いられた細胞)の間には、高い相関が維持された(R2=0.98対R2=0.98)(図2B)。6種の分析された発癌性miRNAの顕著なアップレギュレーションが、24h培養のオンコソームに比較し、排他的に72h培養のオンコソームで観察され、MDA−MB231及び4T1由来オンコソームはの平均倍率変化はそれぞれ17.6及び13.2であったことから、時間に伴うオンコソーム中miRNA量の特異的増加が裏づけられた(図2C中央及び下グラフ、並びに図11D右、上及び下グラフ)。オンコソームを24h又は72hのいずれかで培養した場合に、腫瘍抑制miRNAについて、有意でない差が認められた(図2C及び図11D)。ノルモソームは、培養時間とは無関係に、miRNA量の任意の差を示さなかった(図2C及び図11D)。15種のmiRNA全ての存在が、72h培養のノルモソームとそれが得られた細胞とで同一であり、相関係数は0.93であった(図2E左)。MDA−MB231及び4T1エクソソームの相関係数は有意に低く(それぞれr2=0.56及び0.42)、時間に伴うオンコソーム中miRNAレベルの特異的変化が裏づけられた(図2E中央及び右)。さらに、オンコソームをMCF7(r2=0.76)、MDA−MB231(r2=0.56)、67NR(r2=0.64)及び4T1(r2=0.42)と比較すると、細胞株の悪性度上昇に伴い相関レベルが低下する(図2E及び図11E)。それゆえ、ノルモソームのmiRNA量は、全ての時間で起源細胞を反映したが、オンコソームは、細胞に非依存的に時間に伴いmiRNA量が変化した。

0099

MDA−MB231及び4T1オンコソームのmiRNA量をMCF10A及びNMuMG細胞のノルモソームのそれと比較すると、24h培養されたオンコソーム中で発癌性miRNAが豊富であることが観察され、平均倍率変化がそれぞれ2.7及び2.0であった(図11B)。72hの時点では、それぞれMCF10A及びNMuMG由来ノルモソームに比較して、MDA−MB231及び4T1由来オンコソーム中の発癌性miRNAで、30及び18.2の平均倍率変化が検出された(図11B)。ノーザンブロットで、オンコソーム中で排他的に発癌性miR−10b及びmiR−21のアップレギュレーションが確認され、miRNAアレイ及びqPCR分析の両方が裏づけられた(図2D)。

0100

オンコソームは、pre−miRNA及びコアRLCタンパク質を含む。単離されて間もないオンコソームの無細胞培養ではmiRNAの増加が得られ、エクソソームの活性バイオジェネシスが示唆された。さらにマイクロフルイディクス分析からも、より大きなRNA分子の存在が示唆された(図2F)。それゆえノルモソーム及びオンコソーム調製物中のpre−miRNAの潜在的存在を模索した。単離後24h又は72hのエクソソームの無細胞培養を実施して、可能性のある任意の余分なエクソソームRNAを消耗するためにRNAse処置に供した。これに続いて、エクソソーム中のpre−miRNAを検出した。分析されたpre−miRNAは、過去に評価された15種の成熟miRNA(表4)に対応するものであった。

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