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図面 (20)

課題

標的とする遺伝子の発現を調節することによって疾患を治療する、阻害性核酸の提供。

解決手段

ポリコーム抑制複合体2(PRC2)に結合するRNAであり、場合によっては特定のRNAに特異的に結合又は相補的であり、長さが5〜40塩基の間の、無菌組成物として製剤化される阻害性核酸。

概要

背景

哺乳類ゲノムのわずか1〜2%がタンパク質をコードするが、70〜90%が転写活性を持つことがトランスクリプトーム解析により示唆されている(Carninci et al., 2005; Kapranov et al., 2007; Mercer et al., 2009)。100ntから100kb超に至るまで、これらの転写物は機能が大部分不明であり、遺伝子内または遺伝子間起源とする可能性が有り、保存されており、発生上調節されている可能性が有る(Kapranov et al., 2007; Guttman et al., 2009)。最近の発見は、これらの転写物のサブセットエピジェネティックな調節に決定的な役割を担うことを示している。例えば、ヒトHOX−D遺伝子座の遺伝子は、連鎖していないHOX−C遺伝子座によって生成されるHOTAIR RNAによってトランスに調節され(Rinn et al., 2007)、X染色体不活化の間に、Tsix、RepAおよびXistのRNAはシスにてクロマチン修飾因子を標的として染色体全体のサイレンシングを制御する(Zhao et al., 2008)。興味深いことに、4つのRNAはすべて、ヒストンH3−リシン27のトリメチル化(H3−K27me3)を触媒する複合体であるポリコーム抑制複合体2(PRC2)に結合し、それを調節する(Schwartz and Pirrotta, 2008)。これらの所見は、長鎖非コードRNAがゲノムにおける特定の対立遺伝子またはユニークな位置にクロマチン修飾因子をターゲットするのに理想的であるという考えを裏付けている(Lee, 2009) (Lee, 2010)。

RNA介在性リクルートポリコームタンパク質にとって特に魅力的である。ホメオティック調節因子としてショウジョウバエで最初に特定されたのだが、ポリコームタンパク質はハエから哺乳類にわたって保存され、発生の多くの局面を制御する(Ringrose and Paro, 2004; Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006; Schuettengruber et al., 2007; Pietersen and van Lohuizen, 2008; Schwartz and Pirrotta, 2008)。哺乳類のPRC2は、4つのコアサブユニットであるEed、Suz12、RbAp48および触媒性Ezh2を含有する。ヒトでは、異常なPRC2の発現は癌および疾患に関連する(Sparmann and van Lohuizen, 2006; Bernardi and Pandolfi, 2007; Miremadi et al., 2007; Rajasekhar and Begemann, 2007; Simon and Lange, 2008)。健康におけるポリコームの役割の認識が増しているにもかかわらず、そのインビボでの調節はほとんど分かっていない。ハエでは、ポリコーム複合体は、ポリコーム応答エレメント(PRE)への結合に役立つZeste、Pipsqueak(PSQ)またはPhoのような配列特異的DNA結合因子を含有する(Ringrose and Paro, 2004; Schwartz and Pirrotta, 2008)。それに対して哺乳類のポリコーム複合体はそのようなサブユニットを含有するとは考えられていない。従って、PRE様のエレメント(Sing et al., 2009; Woo et al., 2010)およびJarid2が結合を促進する可能性が有るが、何千ものゲノムの位置へのリクルートのメカニズムはほとんど理解されないままである(Li et al.; Pasini et al.; Peng et al., 2009; Shen et al., 2009)。興味深いことに、幾つかのPRC2サブユニットは、潜在的なRNA結合モチーフ(Denisenko et al., 1998; Bernstein and Allis, 2005; Bernstein et al., 2006b)、すなわち、X不活化については、Tsix/RepA/Xist RNAとPRC2の間の仮定された機能的相互作用(Zhao et al., 2008)によって、そして、HOX調節については、HOTAIRとPRC2(Rinn et al., 2007)によって裏付けられる可能性を有する。最近の研究はまた、PRC2の調節因子の候補として50〜200ntの幾つかの短鎖RNAを特定した(Kanhere et al., 2010)。ポリコーム抑制複合体1(PRC1)の制御にもRNAが関与し得る(Yap et al., 2010)。

その遍在性にもかかわらず、多数の長鎖非コードRNAの構造および機能は大部分性状分析されていないままである。最近の研究は、いくつかの長鎖非コードRNAが、クロマチンリモデリングおよび腫瘍の抑制においてエピジェネティックな調節因子/RNA補因子としての機能を有することを示唆している。siRNAおよびshRNAを用いたノックダウン法はマイクロRNA(miRNA)および細胞質局在するメッセンジャーRNAmRNA)(4〜6)の機能解析において不可欠な要素となっているが、これらの方法は、場合によっては、核に局在する長鎖非コードRNAにとってあまり一貫して有効ではないと報告されている(Jepsen et al., Oligonucleotides, 14, 130-146 (2004))。

概要

標的とする遺伝子の発現を調節することによって疾患を治療する、阻害性核酸の提供。ポリコーム抑制複合体2(PRC2)に結合するRNAであり、場合によっては特定のRNAに特異的に結合又は相補的であり、長さが5〜40塩基の間の、無菌組成物として製剤化される阻害性核酸。なし

目的

本発明は、細胞核リボ核酸(nRNA)のプールに相補的である複数の有効なcDNAを調製する方法を提供する

効果

実績

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請求項1

疾患の治療で使用するための阻害性核酸であって、ポリコーム抑制複合体2(PRC2)に結合するRNA、所望により、配列番号17040のRNA、または表1〜8のいずれかのRNA、または配列番号1〜193,049のいずれかのRNAに特異的に結合し、またはそれに対して相補的であり、治療には前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが関与し、長さが5〜40塩基の間であり、無菌組成物として製剤化される前記阻害性核酸。

請求項2

ポリコーム抑制複合体2(PRC2)に結合することが分っているRNAに特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸の製造方法であって、PRC2に結合するRNA配列、所望により、配列番号17040のRNA、または表1〜8のいずれかのRNA、または配列番号1〜193,049のいずれかのRNAに特異的に結合する、長さが5〜40塩基の間の、所望により一本鎖の阻害性核酸を設計および/または合成する工程を含む、前記製造方法。

請求項3

前記製造方法が、前記阻害性核酸を設計および/または合成する前に、PRC2に結合するRNAを特定することをさらに含む、請求項2に記載の製造方法。

請求項4

PRC2に結合するRNAを特定することを含む工程によって前記RNAが特定されている、請求項2に記載の製造方法。

請求項5

前記の設計および/または合成された阻害性核酸の配列が、PRC2に結合する前記RNAの配列またはその一部に基づき、前記一部の長さが15〜100の連続した塩基対である、請求項2に記載の製造方法。

請求項6

前記の設計および/または合成された阻害性核酸の配列が、PRC2に結合する前記RNAの配列に対して相補的である、またはその一部に対して相補的である核酸配列に基づき、前記一部の長さが5〜40の連続した塩基対である、請求項2に記載の製造方法。

請求項7

前記阻害性核酸が、疾患の治療に使用するための医薬組成物または医薬品の製造に使用するためのものであり、所望により、治療には、PRC2に結合する前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが関与する、請求項2〜6のいずれか一項に記載の製造方法。

請求項8

配列番号1〜193,049のいずれか1つのRNA配列に特異的に結合するまたはそれに対して相補的であり、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが可能である阻害性核酸を含む無菌組成物。

請求項9

疾患の治療のために使用するための阻害性核酸であって、前記阻害性核酸が、配列番号1〜193,049のいずれか1つのRNA配列に特異的に結合するまたはそれに対して相補的であり、治療には、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが関与する、前記阻害性核酸。

請求項10

配列番号1〜193,049のいずれか1つのRNA配列に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸を、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節するのに有効な量で哺乳類投与することを含む、遺伝子発現を調節する方法。

請求項11

疾患の治療に使用される阻害性核酸であって、配列番号1〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に特異的に結合するまたはそれに対して相補的であり、治療には、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが関与する、前記阻害性核酸。

請求項12

疾患の治療に使用するための阻害性核酸であって、配列番号1〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に対応するヒトRNA配列に特異的に結合するまたはそれに対して相補的であり、前記ヒトRNA配列が、(a)マウスのゲノムからヒトのゲノムへと高度に保存された領域をマッピングすることもしくはシンテニー位置をマウスのゲノムからヒトのゲノムへマッピングすること、例えば、マウス対ヒトLiftOver解析によって入手可能であり、または(b)前記マウスRNA配列に対して少なくとも15塩基にわたって少なくとも90%同一であり、治療には、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが関与する、前記阻害性核酸。

請求項13

前記ヒトRNA配列が、配列番号12,604〜21,582または191,089〜193,049のいずれか1つである、請求項12に記載の阻害性核酸。

請求項14

配列番号1〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸を、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節するのに有効な量で哺乳類に投与することを含む、遺伝子発現を調節する方法。

請求項15

配列番号1〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に対応するヒトRNA配列に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸を、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節するのに有効な量で哺乳類に投与することを含み、前記ヒトRNA配列が、(a)マウスのゲノムからヒトのゲノムへと高度に保存された領域をマッピングすることもしくはシンテニー位置をマウスのゲノムからヒトのゲノムへマッピングすること、例えば、マウス対ヒトLiftOver解析によって入手可能であり、または(b)前記マウスRNA配列に対して少なくとも15塩基にわたって少なくとも90%同一である、遺伝子発現を調節する方法。

請求項16

前記ヒトRNA配列が、配列番号12,604〜21,582または191,089〜193,049のいずれか1つである、請求項15に記載の方法。

請求項17

無菌組成物であって、配列番号124,437〜190,716もしくは190,934〜191,086もしくは191,087のいずれかのヒトRNA配列、または配列番号21,583〜124,436もしくは190,717〜190,933もしくは191,088のいずれかのマウスRNA配列に特異的に結合し、またはそれに対して相補的であり、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが可能である阻害性核酸を含む無菌組成物。

請求項18

疾患の治療に使用するための阻害性核酸であって、配列番号124,437〜190,716もしくは190,934〜191,086もしくは191,087のいずれかのヒトRNA配列、または配列番号21,583〜124,436もしくは190,717〜190,933もしくは191,088のいずれかのマウスRNA配列に特異的に結合し、またはそれに対して相補的であり、治療には、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが関与する、前記阻害性核酸。

請求項19

配列番号124,437〜190,716もしくは190,934〜191,086もしくは191,087のいずれかのマウスRNA配列、または配列番号21,583〜124,436もしくは190,717〜190,933もしくは191,088のいずれかのマウスRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節するのに有効な量で哺乳類に投与することを含む、遺伝子発現を調節する方法。

請求項20

所望により、疾患の治療に使用するための、長さが約5〜50塩基の阻害性核酸であって、配列番号1〜21,582または191,089〜193,049のRNAのいずれかの断片に特異的に結合し、またはそれに対して相補的であり、前記断片は長さが約500塩基または約100塩基であり、前記RNA断片が、配列番号124,437〜190,716または190,934〜191,086または191,087または配列番号21,583〜124,436または190,717〜190,933または191,088のいずれかの範囲内にある少なくとも5つの連続する塩基のストレッチ重複し、そして、それを含み、治療には、前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが関与する、前記阻害性核酸。

請求項21

前記RNAが標的とする遺伝子の発現を調節するのに有効な量で請求項20に記載の阻害性核酸を哺乳類に投与することを含む、遺伝子発現を調節する方法。

請求項22

前記の調節とは遺伝子発現を上方調節することであり、所望により、前記RNAが標的とする遺伝子が、表8に示される遺伝子の群から選択され、前記RNA配列が、表8に示されるような前記遺伝子を標的とするRNAの配列番号から選択される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項23

配列番号1〜9,836または12,053〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を含む無菌組成物。

請求項24

配列番号1〜9,836または12,053〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に対応するヒトRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を含む無菌組成物。

請求項25

(a)前記ヒトRNA配列が、マウスのゲノムからヒトのゲノムへと高度に保存された領域をマッピングすることもしくはシンテニー位置をマウスのゲノムからヒトのゲノムへマッピングすること、例えば、マウス対ヒトLiftOver解析によって入手可能であり、または(b)前記ヒトRNA配列が、前記マウスRNA配列に対して少なくとも15塩基にわたって少なくとも90%同一である、請求項24に記載の無菌組成物。

請求項26

前記ヒトRNA配列が、配列番号12,604〜19,236または21,195〜21,582または191,089〜192,885または192,980〜193,049のいずれか1つである、請求項24に記載の無菌組成物。

請求項27

非経口投与用である、上記請求項のいずれか1項に記載の無菌組成物。

請求項28

前記阻害性核酸が前記RNAによって標的とされる遺伝子の発現を上方調節することができる、上記請求項のいずれか1項に記載の無菌組成物。

請求項29

腫瘍抑制因子の発現を上昇させる方法で使用するための、腫瘍増殖阻害もしくは抑制する方法で使用するための、または癌を治療する方法で使用するための組成物であって、腫瘍抑制因子の発現を上昇させる方法で使用するための、腫瘍増殖を阻害もしくは抑制する方法で使用するための、または癌を治療する方法で使用するための、配列番号1〜49または12,268〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を含む前記組成物。

請求項30

腫瘍抑制因子の発現を上昇させる方法で使用するための、腫瘍増殖を阻害もしくは抑制する方法で使用するための、または癌を治療する方法で使用するための組成物であって、配列番号1〜49または12,268〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に対してオルソログであるヒトRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を含む前記組成物。

請求項31

腫瘍抑制因子の発現を上昇させることを、それを必要とする哺乳類において行う方法であって、前記腫瘍抑制因子の発現を上昇させるのに有効な量の、配列番号1〜49または12,268〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を前記哺乳類に投与することを含む前記方法。

請求項32

腫瘍抑制因子の発現を上昇させることを、それを必要とする哺乳類において行う方法であって、前記腫瘍抑制因子の発現を上昇させるのに有効な量の、配列番号1〜49または12,268〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に対応するヒトRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を前記哺乳類に投与することを含む前記方法。

請求項33

腫瘍の増殖を阻害するまたは抑制することを、それを必要とする哺乳類において行う方法であって、腫瘍の増殖を抑制するまたは阻害するのに有効な量の、配列番号1〜49または12,268〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を前記哺乳類に投与することを含む前記方法。

請求項34

腫瘍の増殖を阻害するまたは抑制することを、それを必要とする哺乳類において行う方法であって、腫瘍の増殖を抑制するまたは阻害するのに有効な量の、配列番号1〜49または12,268〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に対応するヒトRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を前記哺乳類に投与することを含む前記方法。

請求項35

癌の哺乳類を治療する方法であって、治療上有効な量の、配列番号1〜49または12,268〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を前記哺乳類に投与することを含む前記方法。

請求項36

癌の哺乳類を治療する方法であって、治療上有効な量の、配列番号1〜49または12,268〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列に対応するヒトRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を前記哺乳類に投与することを含む前記方法。

請求項37

(a)前記ヒトRNA配列が、マウスのゲノムからヒトのゲノムへと高度に保存された領域をマッピングすることもしくはシンテニー位置をマウスのゲノムからヒトのゲノムへマッピングすること、例えば、マウス対ヒトLiftOver解析によって入手可能であり、または(b)前記ヒトRNA配列が、前記マウスRNA配列に対して少なくとも15塩基にわたって少なくとも90%同一である、請求項29〜36のいずれか一項に記載の組成物または方法。

請求項38

前記ヒトRNA配列が、配列番号12,604〜12,632または21,338〜21,582または192,874〜192,885または193,007〜193,049から成る群から選択される、請求項29〜36のいずれか1項に記載の組成物または方法。

請求項39

幹細胞、所望により胚性幹細胞および所望によりiPS細胞分化を高める方法であって、配列番号9,837〜10,960のいずれか1つのマウスRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸に前記細胞を接触させることを含む前記方法。

請求項40

幹細胞、所望により胚性幹細胞および所望によりiPS細胞の分化を高める方法であって、配列番号9,837〜10,960のいずれか1つのマウスRNA配列に対応するヒトRNA配列に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸に前記細胞を接触させることを含む前記方法。

請求項41

(a)前記ヒトRNA配列が、マウスのゲノムからヒトのゲノムへと高度に保存された領域をマッピングすることもしくはシンテニー位置をマウスのゲノムからヒトのゲノムへマッピングすること、例えば、マウス対ヒトLiftOver解析によって入手可能であり、または(b)前記ヒトRNA配列が、前記マウスRNA配列に対して少なくとも15塩基にわたって少なくとも90%同一である、請求項40に記載の方法。

請求項42

前記の対応するヒトRNA配列が配列番号19,237〜20,324または192,886〜192,906のいずれか1つである、請求項40に記載の方法。

請求項43

所望により、前記幹細胞を特定の細胞種、所望により、神経、ニューロンドーパミン作動性ニューロン筋肉、皮膚、心臓腎臓肝臓神経内分泌網膜網膜色素上皮膵臓のαおよびβ細胞造血系細胞軟骨細胞骨細胞血液細胞、T細胞、B細胞マクロファージ赤血球、または血小板に分化させるために生体外で行われる、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。

請求項44

前記阻害性核酸の長さが5〜40塩基(所望により、長さが12〜30、12〜28、または12〜25塩基)である、請求項1〜43のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項45

前記阻害性核酸の長さが10〜50塩基である、請求項1〜44のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項46

前記阻害性核酸が、前記RNA配列の少なくとも10塩基に対して少なくとも90%相補的である塩基配列を含む、請求項1〜45のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項47

前記阻害性核酸が、前記RNA配列の、例えば、少なくとも5〜30、10〜30、15〜30、20〜30、25〜30または5〜40、10〜40、15〜40、20〜40、25〜40、または30〜40塩基に対して少なくとも80%または90%相補的である塩基配列を含む、請求項1〜46のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項48

前記阻害性核酸が、前記RNA配列の10、15、20、25または30塩基にわたる相補性塩基対形成において3つまでのミスマッチ(例えば、1までまたは2つまでのミスマッチ)を有する塩基配列を含む、請求項1〜47のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項49

前記阻害性核酸が、前記RNA配列の少なくとも10塩基に対して少なくとも80%相補的である塩基配列を含む、請求項1〜48のいずれか1項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項50

前記阻害性核酸が、前記RNA配列の15塩基にわたって3つまでのミスマッチを有する塩基配列を含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項51

前記阻害性核酸が一本鎖である、請求項1〜50のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項52

前記阻害性核酸が二本鎖である、請求項1〜51のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項53

前記阻害性核酸が、修飾型糖部分、修飾型ヌクレオシド間結合修飾型ヌクレオチドおよび/またはそれらの組み合わせを含む1つ以上の修飾を含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項54

前記阻害性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、LNA分子PNA分子リボザイムまたはsiRNAである、請求項1〜53のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項55

前記阻害性核酸が、二本鎖であり、一方または双方の末端オーバーハング(所望により、2〜6塩基の長さ)を含む、請求項1〜54のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項56

前記阻害性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列EGSオリゴヌクレオチドsiRNA化合物マイクロRNA(miRNA)、低分子一本鎖RNA(stRNA)、および一本鎖または二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物から成る群から選択される、請求項1〜55のいずれか一項に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項57

前記RNAi化合物が、低分子干渉RNA(siRNA)、または低分子ヘアピンRNA(shRNA)、低分子RNA誘導性遺伝子活性化(RNAa)および低分子活性化RNA(saRNA)から成る群から選択される、請求項56に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項58

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスRNAアンチセンスDNAキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る群から選択される、請求項54または56に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項59

前記修飾型ヌクレオシド間結合が、アルキルホスホネートホスホロチオエートホスホジチオエート、アルキルホスホノチオエートホスホルアミデートカルバメートカルボネートリン酸三エステルアセトアミデートカルボキシメチルエステルまたはそれらの組み合わせの少なくとも1つを含む、請求項53に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項60

前記修飾型糖部分が、2’−O−メトキシエチル修飾型糖部分、2’−メトキシ修飾型糖部分、2’−O−アルキル修飾型糖部分、または二環式糖部分を含む、請求項53に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項61

2’−OMe、2’−F、LNA、PNA、FANA、ENAまたはモルホリノ修飾を含む、請求項53に記載の阻害性核酸、製造方法、組成物または方法。

請求項62

配列番号1〜12,603のいずれか1つのマウスRNA配列またはPRC2結合活性を保持する長さが少なくとも20塩基のその断片である単離された核酸を含む無菌組成物。

請求項63

配列番号12,604〜21,582または191,089〜193,049のいずれか1つのヒトRNA配列またはPRC2結合活性を保持する長さが少なくとも20塩基のその断片である単離された核酸を含む無菌組成物。

請求項64

癌遺伝子の発現を低下させる方法で使用するためのRNAであって、配列番号12,053〜12,267のいずれか1つのマウスRNA配列、または配列番号21,195〜21,337もしくは192,980〜193,006のいずれか1つのヌクレオ塩基配列を所望により有する、対応するヒトRNA配列、またはPRC2結合活性を保持する長さが少なくとも20塩基のその断片を含む前記RNA。

請求項65

細胞における癌遺伝子の発現を低下させる方法であって、配列番号12,053〜12,267のいずれか1つのマウスRNA配列、または配列番号21,195〜21,337もしくは192,980〜193,006のいずれか1つのヌクレオ塩基配列を所望により有する、対応するヒトRNA配列、またはPRC2結合活性を保持する長さが少なくとも20塩基のその断片に前記細胞を接触させることを含む前記方法。

請求項66

幹細胞、所望により胚性幹細胞および所望によりiPS細胞の多能性を高める方法で使用するためのRNAであって、配列番号9,837〜10,960のいずれか1つのマウスRNA配列、または配列番号19,237〜20,324または192,886〜192,906のいずれか1つのヌクレオ塩基配列を所望により有する、対応するヒトRNA配列、またはPRC2結合活性を保持する長さが少なくとも20塩基のその断片を含む前記RNA。

請求項67

幹細胞、所望により胚性幹細胞および所望によりiPS細胞の多能性を高める方法であって、配列番号9,837〜10,960のいずれか1つのマウスRNA配列、または配列番号19,237〜20,324または192,886〜192,906のいずれか1つのヌクレオ塩基配列を所望により有する、対応するヒトRNA配列、またはPRC2結合活性を保持する長さが少なくとも20塩基のその断片に前記細胞を接触させることを含む前記方法。

請求項68

クロマチン修飾因子を結合するlncRNAに対して相補的であり、それに特異的に結合するLNA分子。

請求項69

前記クロマチン修飾因子がポリコーム抑制複合体2である、請求項68に記載のLNA分子。

請求項70

長鎖非コードRNA(lncRNA)のその同族結合配列への結合を減らす方法であって、前記lncRNAに対して相補的であり、それに特異的に結合するロックド核酸(LNA)に前記lncRNAを接触させることを含む、前記方法。

請求項71

高分子遺伝子間非コードRNA(lincRNA)、プロモーター関連低分子RNA(PASR)、内在性アンチセンスRNA、またはクロマチン修飾因子、例えば、ポリコーム複合体、例えば、ポリコーム抑制複合体2に結合するRNAであるlncRNAに対して相補的であり、それに特異的に結合するLNA分子。

技術分野

0001

連邦支援の研究または開発
本発明は国立衛生研究所によって授与された助成金番号RO1−GM−090278のもとで政府の支援によって為された。政府は本発明に特定の権利を有する。

0002

関連出願
本出願は、それぞれ参照によってその全体が本明細書に組込まれる2010年11月12日に出願された米国仮特許出願第61/412,862号、2010年12月20日に出願された同第61/425,174号および2011年7月28日に出願された同第61/512,754号の優先権を主張する。

0003

技術分野
本発明は、遺伝子発現を調節する長鎖非コードRNA(lncRNA)、およびそれを使用してまたはそれらに結合する阻害性核酸を使用して遺伝子発現を調節する方法に関する。

背景技術

0004

哺乳類ゲノムのわずか1〜2%がタンパク質をコードするが、70〜90%が転写活性を持つことがトランスクリプトーム解析により示唆されている(Carninci et al., 2005; Kapranov et al., 2007; Mercer et al., 2009)。100ntから100kb超に至るまで、これらの転写物は機能が大部分不明であり、遺伝子内または遺伝子間起源とする可能性が有り、保存されており、発生上調節されている可能性が有る(Kapranov et al., 2007; Guttman et al., 2009)。最近の発見は、これらの転写物のサブセットエピジェネティックな調節に決定的な役割を担うことを示している。例えば、ヒトHOX−D遺伝子座の遺伝子は、連鎖していないHOX−C遺伝子座によって生成されるHOTAIR RNAによってトランスに調節され(Rinn et al., 2007)、X染色体不活化の間に、Tsix、RepAおよびXistのRNAはシスにてクロマチン修飾因子を標的として染色体全体のサイレンシングを制御する(Zhao et al., 2008)。興味深いことに、4つのRNAはすべて、ヒストンH3−リシン27のトリメチル化(H3−K27me3)を触媒する複合体であるポリコーム抑制複合体2(PRC2)に結合し、それを調節する(Schwartz and Pirrotta, 2008)。これらの所見は、長鎖非コードRNAがゲノムにおける特定の対立遺伝子またはユニークな位置にクロマチン修飾因子をターゲットするのに理想的であるという考えを裏付けている(Lee, 2009) (Lee, 2010)。

0005

RNA介在性リクルートポリコームタンパク質にとって特に魅力的である。ホメオティック調節因子としてショウジョウバエで最初に特定されたのだが、ポリコームタンパク質はハエから哺乳類にわたって保存され、発生の多くの局面を制御する(Ringrose and Paro, 2004; Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006; Schuettengruber et al., 2007; Pietersen and van Lohuizen, 2008; Schwartz and Pirrotta, 2008)。哺乳類のPRC2は、4つのコアサブユニットであるEed、Suz12、RbAp48および触媒性Ezh2を含有する。ヒトでは、異常なPRC2の発現は癌および疾患に関連する(Sparmann and van Lohuizen, 2006; Bernardi and Pandolfi, 2007; Miremadi et al., 2007; Rajasekhar and Begemann, 2007; Simon and Lange, 2008)。健康におけるポリコームの役割の認識が増しているにもかかわらず、そのインビボでの調節はほとんど分かっていない。ハエでは、ポリコーム複合体は、ポリコーム応答エレメント(PRE)への結合に役立つZeste、Pipsqueak(PSQ)またはPhoのような配列特異的DNA結合因子を含有する(Ringrose and Paro, 2004; Schwartz and Pirrotta, 2008)。それに対して哺乳類のポリコーム複合体はそのようなサブユニットを含有するとは考えられていない。従って、PRE様のエレメント(Sing et al., 2009; Woo et al., 2010)およびJarid2が結合を促進する可能性が有るが、何千ものゲノムの位置へのリクルートのメカニズムはほとんど理解されないままである(Li et al.; Pasini et al.; Peng et al., 2009; Shen et al., 2009)。興味深いことに、幾つかのPRC2サブユニットは、潜在的なRNA結合モチーフ(Denisenko et al., 1998; Bernstein and Allis, 2005; Bernstein et al., 2006b)、すなわち、X不活化については、Tsix/RepA/Xist RNAとPRC2の間の仮定された機能的相互作用(Zhao et al., 2008)によって、そして、HOX調節については、HOTAIRとPRC2(Rinn et al., 2007)によって裏付けられる可能性を有する。最近の研究はまた、PRC2の調節因子の候補として50〜200ntの幾つかの短鎖RNAを特定した(Kanhere et al., 2010)。ポリコーム抑制複合体1(PRC1)の制御にもRNAが関与し得る(Yap et al., 2010)。

0006

その遍在性にもかかわらず、多数の長鎖非コードRNAの構造および機能は大部分性状分析されていないままである。最近の研究は、いくつかの長鎖非コードRNAが、クロマチンリモデリングおよび腫瘍の抑制においてエピジェネティックな調節因子/RNA補因子としての機能を有することを示唆している。siRNAおよびshRNAを用いたノックダウン法はマイクロRNA(miRNA)および細胞質局在するメッセンジャーRNAmRNA)(4〜6)の機能解析において不可欠な要素となっているが、これらの方法は、場合によっては、核に局在する長鎖非コードRNAにとってあまり一貫して有効ではないと報告されている(Jepsen et al., Oligonucleotides, 14, 130-146 (2004))。

発明が解決しようとする課題

0007

本明細書で「RNA免疫沈降RIP)‐シークエンシング」と呼ばれる方法を用いて胚性幹細胞にてポリコーム抑制複合体2(PRC2)が相互作用する9,000超のRNAのゲノム全体のプール(本明細書では「PRC2トランスクリプトーム」と呼ぶ)を特定した。トランスクリプトームには、アンチセンス転写物、遺伝子間転写物およびプロモーター関連転写物、ならびに多数の注釈が付けられていないRNAが含まれる。インプリント領域癌遺伝子および腫瘍抑制因子遺伝子座および幹細胞関連の二価ドメインの中で多数の転写物が生じる。いくつかはEzh2サブユニットを介した直接的なRNA/タンパク質の相互作用の証拠が提供される。これらのPRC2と相互作用するRNAに特異的に結合する阻害性オリゴヌクレオチドが、おそらくPRC2関連抑制を阻害することによって、様々な別々の、独立した例で遺伝子発現を上手く増加させることができるという証拠が提供される。Gtl2 RNAは交互にインプリントされたDlk1コーディング遺伝子にPRC2を指し向けるPRC2補因子として特定された。従って、ポリコームタンパク質は、RNAのゲノム全体のファミリーと相互作用し、そのうちのいくつかはヒトの疾患の生体マーカーおよび治療標的として使用され得る。

課題を解決するための手段

0008

1つの態様において、本発明は、細胞核リボ核酸(nRNA)のプールに相補的である複数の有効なcDNAを調製する方法を提供する。その方法は、細胞核性リボ核酸を含む試料、例えば、核の溶解物を含む、例えば、核タンパク質に結合するnRNAを含む試料を提供すること;細胞核性リボ核酸に結合することが知られている、または疑われている核タンパク質と特異的に結合する作用因子、例えば、抗体と試料を、その作用因子とそのタンパク質の間で複合体を形成するのに十分な条件下で接触させること;その複合体を単離すること;cDNAの最初の集団を提供するためにnRNAに相補的であるDNAを合成すること;必要に応じてストランド特異的なプライマーを用いてPCR増幅を行うこと;長さが少なくとも約20ヌクレオチド(nt)の、例えば、長さが少なくとも25、50、75、100、150、200または250ntである精製したcDNAの集団を得るために、cDNAの最初の集団を精製すること;精製したcDNAの集団の少なくとも一部または実質的にすべての配列を決定すること;基準ゲノムに対してリードを並べ、アラインしたもののみを保持すること;例えば、(1)候補転写物が、100万リード当たりキロベース当たりのリード(RPKM)単位で最小リード密度を有する(例えば、所望の閾値を上回る)、および(2)候補転写物が、好適な対照ライブラリー(例えば、IgGプルダウンライブラリーまたはタンパク質−ヌルプルダウンライブラリー)と比較して野生型ライブラリーにて濃縮される;という2つの基準に基づいて信頼の高いcDNA配列を選択すること;それによって複数のcDNAを調製することを含む。

0009

細胞核性リボ核酸に結合することが分っているまたは疑われる核タンパク質の一部の例には、Ezh2(Zhao et al., Science. 2008 Oct 31;322(5902):750-6; Khalil et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jul 14;106(28):11667-72. Epub 2009 Jul 1);G9a(Nagano et al., Science. 2008 Dec 12;322(5908):1717-20. Epub 2008 Nov 6);およびCbx7(Yap et al., Mol Cell. 2010 Jun 11 ; 38(5) :662-74.)が挙げられる。

0010

いくつかの実施形態において、本発明は、細胞核性リボ核酸(nRNA)のプールに相補的である複数の検証されたcDNAを調製する方法を含む。その方法は、細胞核性リボ核酸を含む試料、例えば、核の溶解物を含む試料、例えば、核タンパク質に結合するnRNAを含む試料を提供すること;細胞核性リボ核酸と結合することが知られている、または疑われている核タンパク質、例えば、Ezh2、G9aまたはCbx7に特異的に結合する作用因子、例えば、抗体と試料を、例えば、nRNAがタンパク質に結合したままでいるような、その作用因子とそのタンパク質の間で複合体を形成するのに十分な条件下で接触させること;複合体を単離すること;cDNAの最初の集団を提供するためにnRNAに相補的であるDNAを合成すること;所望により、ストランド特異的なプライマーを用いてcDNAのPCR増幅を行うこと;長さが少なくとも約20ヌクレオチド(nt)の、例えば、長さが少なくとも25、50、100、150または200ntである精製したcDNAの集団を得るために、cDNAの最初の集団を精製すること;精製したcDNAの集団の少なくとも一部または実質的にすべての配列決定を行うこと;信頼性の高い配列を基準ゲノムと比較し、基準ゲノムの配列に対して高い程度の同一性、例えば、少なくとも95%、98%または99%の同一性を有する、または10、5、2または1より少ないミスマッチを有する配列を選択すること;および(i)所望の閾値を超える100万リード当たりのキロベース当たりのリード(RPKM)を有し、(ii)対照ライブラリー(タンパク質−ヌルライブラリーまたは並行して行われるIgGプルダウンから作製されるライブラリー)と比較して、濃縮されるcDNAを選択すること;それによってcDNAのライブラリーを調製することを含む。

0011

いくつかの実施形態において、本方法を用いて対象タンパク質に関連するトランスクリプトームに対応するライブラリーを調製する。
いくつかの実施形態において、作用因子は抗体であり、複合体を単離することは複合体を免疫沈降させることを含む。いくつかの実施形態において、ストランド特異的なアダプターを用いてcDNAを合成する。
いくつかの実施形態において、前記方法はさらにcDNAの実質的にすべてを配列決定することを含む。
別の態様において、本発明は、請求項1〜4の方法によって調製される細胞核性リボ核酸(nRNA)のプールに相補的であるcDNAのライブラリーを特徴とする。いくつかの実施形態において、cDNAのそれぞれは、基材(例えば、マイクロアレイ)上の個々にアドレス指定可能なビーズまたは領域に連結される。

0012

別の態様において、本発明は、ポリコーム抑制複合体2(PRC2)に結合するRNA、例えば、配列番号1〜193,049に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸を特徴とする。本発明の理論に束縛されるものではないが、これらの阻害性核酸は、特定の染色体座位へのPRC2のリクルートを妨害することによってPRC2の結合および機能を妨害することができる。例えば、本明細書のデータは、lncRNAを特異的に結合するように設計された阻害性核酸の単回投与がlncRNAだけでなく、lncRNAに結合するPRC2も結合クロマチンから安定して移動させることができることを示す。移動の後、完全に補完的なPRC2は24時間まで回復しない。本明細書で提供されるデータはまた、PRC2の推定上のlncRNA結合部位は、保存された一次配列モチーフを示さず、他のlncRNAとのPRC2の相互作用を一般的に破壊することなく、単一のlncRNAとのPRC2の相互作用を妨害する特定の阻害性核酸の設計を可能にする。さらに、本明細書で提供されるデータはまた、lncRNAはシス方式でPRC2をリクルートすることができ、そのlncRNAが転写される特定の染色体座位にてまたはその近傍にて遺伝子発現を抑制し、したがって、PRC2の機能を阻害し、特定の標的遺伝子の発現を上昇させる阻害性核酸を設計するのを可能にすることを裏付けている。

0013

いくつかの実施形態において、その発現がPRC2結合RNAによって調節される遺伝子を意味する、「PRC2結合RNAが標的とする遺伝子」(例えば、以下の表1〜8で述べるようなインタークティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)の発現を調節する方法に使用するために阻害性核酸が提供される。「PRC2結合RNA」または「PRC2と結合するRNA」という用語は「PRC2関連RNA」および「PRC2相互作用RNA」と互換的に使用され、PRC2複合体に直接または間接的に結合するlncRNA、RNA転写物またはその領域(例えば、以下で記載されるようなピーク)を指す。そのような結合は、PRC2複合体の成分、例えば、Ezh2に対する抗体を用いる免疫沈降法によって決定され得る。配列番号1〜193,049は、本明細書で記載されるRIP‐シークエンシング法を用いてPRC2を結合することが実験的に決定された部分を含有するマウスRNA配列、またはこれらのマウスのRNA配列に対応するヒトのRNA配列を表す。

0014

遺伝子発現を調節するそのような方法は、インビトロエクスビボまたはインビボで実施され得る。表8はPRC2結合RNAが標的とする遺伝子を示し;PRC2結合RNAの配列番号が遺伝子名と同じ行に示される。いくつかの実施形態において、疾患、例えば、表9で述べられる疾患の部類治療する方法で使用するために阻害性核酸が提供される。治療には、PRC2結合RNAが標的とする遺伝子の発現を(上方または下方のいずれかに)調節すること、好ましくは遺伝子発現を上方調節することを含む。阻害性核酸は、非経口投与用の無菌組成物として製剤化され得る。本記載を通して、化合物の使用に対するどのような言及も、疾患の治療に使用される医薬組成物または医薬品の調製でのその化合物の使用を考慮すると理解される。従って、1つの非限定例として、本発明のこの態様は、PRC2結合RNAが標的とする遺伝子の発現を増加させることを含む疾患の治療における用途のため、医薬品の調製にそのような阻害性核酸を使用することを含む。

0015

本発明に従って治療され得る疾患、障害または状態には、循環器系障害、代謝性障害炎症性障害、骨の障害、神経性または神経変性障害肺障害肝臓障害腎臓障害、尿生殖器障害、骨の障害、癌および/またはタンパク質欠損障害が挙げられる。疾患の部類の例が表9に示される。

0016

関連する態様において、本発明は、遺伝子発現を調節する阻害性核酸を調製する方法であって、PRC2に結合するとして特定されているRNA配列、所望により、表1〜8または配列番号1〜193,049のいずれかのRNAに特異的に結合する、またはそれに対して相補的である、長さが5〜40塩基の間の阻害性核酸を合成する工程を含む前記方法を特色とする。本発明のこの態様は、所望により、本明細書で記載されるRIP‐シークエンシング法を介してPRC2に結合するRNA配列を特定する工程をさらに含む。

0017

本発明のさらなる態様において、ポリコーム抑制複合体2(PRC2)に結合するRNAに特異的に結合する阻害性核酸を調製する方法が提供され、その方法は、PRC2に結合するRNA配列、任意で表1〜8または配列番号1〜193,049のいずれかのRNAに特異的に結合する長さ5〜40塩基の間で、所望により、一本鎖の阻害性核酸を設計するおよび/または合成する工程を含む。
いくつかの実施形態において、阻害性核酸を合成する前に、方法はさらにPRC2に結合するRNAを特定することを含む。
いくつかの実施形態において、RNAはPRC2に結合するRNAを特定することを含む方法によって特定されている。

0018

いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、PRC2に結合する前記RNA配列における5〜40塩基の間の連続する配列に対して少なくとも80%相補的である。いくつかの実施形態において、設計されたおよび/または合成された阻害性核酸の配列は、PRC2に結合する前記RNA配列またはその一部に基づき、前記一部は5〜40の連続塩基対の長さを有する。
いくつかの実施形態において、設計されたおよび/または合成された阻害性核酸の配列は、PRC2に結合する前記RNA配列に対して相補的である、またはその一部に相補的である核酸配列に基づき、前記一部は5〜40の連続塩基対の長さを有する。

0019

設計されたおよび/または合成された阻害性核酸は、それが結合するもしくは標的とする、または結合するもしくは標的とすることを意図するRNA配列の一部に対して少なくとも80%相補性(任意で、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の1つにて相補性で)であり得る。いくつかの実施形態において、それは、標的RNA配列またはその相補体それぞれの一部と比較して1、2または3の塩基ミスマッチを含有し得る。いくつかの実施形態において、それは、15塩基について3までのミスマッチ、または10塩基について2までのミスマッチを有し得る。

0020

PRC2に結合する阻害性核酸またはRNA配列の一部は、少なくとも8〜40または10〜50または5〜50の塩基のうちの1つの長さ、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の塩基を有し得る。前記阻害性核酸が、PRC2に結合するRNA配列、PRC2に結合する前記RNA配列に相補的である核酸配列またはそのような配列の一部に基づく場合、それは、その配列についての情報、例えば、公的に利用可能な科学出版物または配列データベースに含有される配列情報を含み得る記録形態または電子形態で利用可能な配列情報に基づき得る。

0021

設計および/または合成がそのような配列情報によって記載される核酸に対して相補的である配列の設計および/または合成を含む場合、当業者は、例えば、その分野で共通する一般的な知識の一部を形成するワトソンクリック塩基対形成規則の理解を介して相補性の配列を容易に決定することができる。
上述の方法では、PRC2に結合するRNAを特定することを含む方法によってPRC2に結合するRNAを特定することができる、もしくは得ることができる、または、特定した、もしくは得た。

0022

そのような方法は以下の工程、すなわち、細胞核性リボ核酸を含有する試料を提供すること、PRC2またはそのサブユニットに特異的に結合する作用因子に試料を接触させて、試料において作用因子とタンパク質の間で複合体が形成できるようにすること、複合体を区分化すること、複合体に存在する核酸に対して相補的である核酸を合成することを含み得る。
必要に応じて、方法はさらに合成された核酸を増幅する工程、および/または核酸(または増幅された核酸)を精製する工程、および/またはそのように得られた核酸の配列決定を行う工程、および/またはそのように得られた核酸を選別し/解析して確率の高いPRC2(またはそのサブユニット)と相互作用する転写物を特定する工程を含み得る。

0023

一実施形態において、方法は、本明細書で記載されるRip‐シークエンシング法を含む。
上記によれば、いくつかの実施形態において、PRC2に結合するRNAは、PRC2を結合することが分っているものであってもよく、例えば、RNAの配列および/またはPRC2を結合するその能力に関する情報は、その情報に基づかれる阻害性核酸の設計および/または合成を可能にする記録形態または電子形態で一般に公開されている。従って、PRC2に結合するRNAは、既知の配列情報から選択され、阻害性核酸の設計および/または合成について情報を提供するのに使用され得る。
他の実施形態において、PRC2に結合するRNAは、設計および/または合成の方法の一部としてPRC2と結合するものとして特定され得る。
好ましい実施形態において、阻害性核酸の設計および/または合成には、当業者に既知の技法による出発物質からの核酸の製造が関与し、その際、合成はポリコーム抑制複合体2に結合することが分っているとして選択されているRNA(またはその一部)の配列に基づき得る。

0024

阻害性核酸の設計および/または合成の方法は、
PRC2に結合するRNA配列を特定する、および/または選択する工程;
PRC2に結合するRNA配列の一部を特定する、および/または選択する工程:
PRC2またはその一部に結合するRNA配列に対して所望の程度の配列同一性または相補性を有する核酸配列を設計する工程;
設計した配列に核酸を合成する工程;
合成した核酸を少なくとも1つの薬学上許容可能な希釈剤担体または賦形剤と混合して医薬組成物または医薬品を形成する工程
の1以上を含み得る。

0025

そのように設計されたおよび/または合成された阻害性核酸は本明細書で記載されるような遺伝子発現を調節する方法において有用であり得る。
従って、阻害性核酸を調製する方法は、疾患の治療で使用するための医薬組成物または医薬品の製造にて使用するためである方法であり得、その際任意で、PRC2に結合するRNAが標的とする遺伝子の発現を調節することが治療に含まれる。
さらに別の態様において、本発明は、表1、2、3、6および/または7、または表8、または、ここには添付されていないが、その全体が参照によって本明細書に組込まれる2010年12月20日に出願された米国仮特許出願第61/425,174号の別表Iにて参照される配列、または、たとえば別表Iで示されるような、少なくとも20ntを含むその断片を含む単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離される核酸は合成ものである。

0026

さらなる態様において、本発明は、細胞における癌遺伝子の発現を低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法には、表6で参照される長鎖非コードRNAもしくはそのPRC2結合断片、または表6で参照されるlncRNAもしくはそのPRC2結合断片に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%相同である核酸配列に細胞を接触させることが含まれる。PRC2と結合するlncRNAの能力を保持する、マウスのlncRNAまたはヒトのlncRNAを含むオルソログlncRNAのPRC2結合断片が考えられている。いくつかの実施形態において、癌遺伝子はc−mycである。いくつかの実施形態において、長鎖非コードRNAはPvt1である。

0027

さらに別の態様において、本発明は、それを必要とする哺乳類、例えば、ヒトにおいて腫瘍抑制因子の発現を上昇させる方法を特徴とする。方法には、表7の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトのPRC2と相互作用するlncRNAに特異的に結合するもしくは相補的である阻害性核酸、または表1のインプリント遺伝子に対応するヒトlncRNA、および/または表2の増殖抑制遺伝子に対応するヒトlncRNA、またはその少なくとも15(例えば、少なくとも20、21、25、30、100)の核酸塩基にわたってオルソログであるもしくは少なくとも90%、(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)同一である関連する天然に存在するlncRNAを、腫瘍抑制因子の発現を上昇させるのに有効な量で哺乳類に投与することが含まれる。従って、マウスのlncRNAに対応するヒトのオルソログlncRNAを決定する方法の1つは、マウスの配列の少なくとも15核酸塩基(または少なくとも20、21、25、30、40、50、60、70、80、90または100)に対して少なくとも90%同一である対応するヒト配列を特定することである。

0028

追加の態様において、本発明は、表7の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトのPRC2と相互作用するlncRNAに特異的に結合するもしくは相補的である阻害性核酸、または表1のインプリント遺伝子に対応するヒトlncRNA、および/または表2の増殖抑制遺伝子に対応するヒトlncRNA、またはその少なくとも15(例えば、少なくとも20、21、25、30、50、70、100)の核酸塩基にわたってオルソログであるもしくは少なくとも90%、(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)同一である関連する天然に存在するlncRNAを、腫瘍増殖を抑制するまたは阻害するのに有効な量で哺乳類に投与することを含む、前記哺乳類、例えば、癌のヒトにおいて腫瘍の増殖を抑制するまたは阻害する方法を提供する。

0029

別の態様において、本発明は、表7の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトlncRNAに特異的に結合するもしくは相補的である阻害性核酸、または表1のインプリント遺伝子に対応するヒトlncRNA、および/または表2の増殖抑制遺伝子に対応するヒトlncRNA、またはその少なくとも15(例えば、少なくとも20、21、25、30、50、70、100)の核酸塩基にわたってオルソログであるもしくは少なくとも90%、(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)同一である関連する天然に存在するlncRNAを、治療上有効な量で哺乳類に投与することを含む、前記哺乳類、例えば、癌のヒトを治療する方法を特徴とする。

0030

いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は、標的核酸の少なくとも一部とハイブリッドを形成し、その機能を調節するオリゴマー塩基化合物またはオリゴヌクレオチド模倣体である。いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は一本鎖または二本鎖である。様々な例となる阻害性核酸が当該技術で既知であり、記載されている。いくつかの例では、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドロックド核酸(LNA)分子ペプチド核酸(PNA)分子、リボザイム、siRNA、アンタゴmiR、外部ガイド配列EGS)オリゴヌクレオチド、マイクロRNA(miRNA)、小分子一本鎖RNA(stRNA)、または一本鎖もしくは二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物である。「LNA分子」という用語は、少なくとも1つのLNA修飾を含む分子を指すので、LNA分子は1以上のロックされたヌクレオチド(立体構造拘束された)および1以上のロックされないヌクレオチドを有し得ることが理解される。「LNA」という用語には、相補性RNAへの高い結合親和性ヌクレアーゼ耐性免疫刺激欠如、および迅速な動態という所望の特性を保持する制約付きの糖を含むヌクレオチドが含まれることも理解される。例となる制約付きの糖には以下に列記されるものが挙げられる。同様に、「PNA分子」という用語は少なくとも1つのPNA修飾を含み、そのような分子は非修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合を含み得ることが理解される。

0031

いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は、少なくとも1つのヌクレオチドおよび/またはヌクレオシドの修飾(例えば、修飾された塩基、または修飾された糖部分を伴う)、修飾されたヌクレオシド間結合および/またはそれらの組み合わせを含む。従って、阻害性核酸は、修飾されたヌクレオシドおよび結合、ならびに天然のヌクレオシドおよび結合を含むことができる。ハイブリッドまたはギャップマーを含むそのようなキメラ阻害性核酸の例は以下に記載される。

0032

いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、修飾された糖部分、および/または修飾されたヌクレオシド間結合、および/または修飾されたヌクレオチドおよび/またはそれらの組み合わせを含む1以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシド間結合は、アルキルホスホネートホスホロチオエートホスホジチオエート、アルキルホスホノチオエートホスホルアミデートカルバメートカルボネートリン酸三エステルアセトアミデートカルボキシメチルエステルまたはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖部分は、2’−O−メトキシエチル修飾の糖部分、2’−メトキシ修飾の糖部分、2’−O−アルキル修飾の糖部分、または二環式糖部分を含む。修飾の他の例には、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、アラビノ核酸(ANA)(任意で2’−F修飾を伴う)、2’−フルオロ−D−アラビノ核酸(FANA)、ホスホルアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)、エチレン架橋の核酸(ENA)(任意で2’−O,4’−C−エチレン架橋を伴う)、および二環式核酸(BNA)が挙げられる。さらなる他の例は以下で記載される、および/または当該技術で既知である。

0033

いくつかの実施形態において、阻害性核酸は長さ5〜40塩基(例えば、12〜30、12〜28、12〜25)である。阻害性核酸は長さ10〜50または5〜50塩基であってもよい。例えば、阻害性核酸は長さ5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50塩基のうちのいずれか1つであり得る。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は二本鎖であり、一方の末端または双方の末端でオーバーハング(任意で長さ2〜6の塩基)を含む。他の実施形態において、阻害性核酸は二本鎖であり、平滑末端である。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、標的RNAの少なくとも5、10、15、20、25または30塩基もしくは30もしくは40までの塩基に対して少なくとも80%または90%相補的である配列を含む、もしくはそれから成る、または標的RNAの10、15、20、25または30塩基にわたって3までのミスマッチ(例えば、1まで、または2までのミスマッチ)を有する塩基配列を含む。

0034

従って、阻害性核酸は、標的RNAの少なくとも10の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも15、もしくは15〜30もしくは15〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも20、もしくは20〜30もしくは20〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも25、もしくは25〜30もしくは25〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも30、もしくは30〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。さらに、阻害性核酸は、標的RNAの少なくとも10の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも15、もしくは15〜30もしくは15〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも20、もしくは20〜30もしくは20〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも25、もしくは25〜30もしくは25〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも30、もしくは30〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に、阻害性核酸は、標的RNAの少なくとも5、10または15の連続塩基に対して完全に相補性ある塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。

0035

相補性は、上で言及したように、相補性の塩基の対形成におけるミスマッチの数という点でも参照することができる。従って、阻害性核酸は、標的RNAの10の連続塩基にわたって3までのミスマッチを有する、または標的RNAの15の連続塩基にわたって3までのミスマッチを有する、または標的RNAの20の連続塩基にわたって3までのミスマッチを有する、または標的RNAの25の連続塩基にわたって3までのミスマッチを有する、または標的RNAの30の連続塩基にわたって3までのミスマッチを有する塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に阻害性核酸は、標的RNAの10の連続塩基にわたって2までのミスマッチを有する、または標的RNAの15の連続塩基にわたって2までのミスマッチを有する、または標的RNAの20の連続塩基にわたって2までのミスマッチを有する、または標的RNAの25の連続塩基にわたって2までのミスマッチを有する、または標的RNAの30の連続塩基にわたって2までのミスマッチを有する塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に阻害性核酸は、標的RNAの10、15、20、25または30の連続塩基にわたって1のミスマッチを有する塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。

0036

従って、いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、標的lncRNAの少なくとも5〜40塩基(任意で10、15、20、25または30塩基のうちの1つ、または5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50塩基のうちの1つ)の連続配列に対して少なくとも80%の相補性(任意で少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の相補性)である塩基配列を含む、長さ約5〜40、または10〜50または5〜50塩基配列を含み、またはそれから成る。従って、いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、標的lncRNAに対して配列で完全に相補的である同じ長さのアンチセンス核酸の塩基の連続配列に対して80%の同一性(任意で少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の同一性)を有する少なくとも5〜40または5〜50または10〜50の塩基(任意で10、15、20、25または30塩基のうちの1つまたは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50塩基のうちの1つ)の配列を含み得る、またはそれから成り得る。いくつかの実施形態において、阻害性核酸の配列は、標的lncRNAの10、15、20、25または30塩基(任意で10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30のうちの1つ)にわたる標的lncRNA配列と比べて相補性の塩基対形成において1、2または3のミスマッチを含有し得る。

0037

いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は、長さ5〜40または10〜50塩基(例えば、長さ12〜30、12〜28、12〜25、5〜25または10〜25の塩基)であり、15塩基にわたる相補性の塩基対形成において3までのミスマッチ、または10塩基にわたって2までのミスマッチを有する塩基配列を含む。

0038

いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロまたはインビボ、例えば、対象における癌細胞、例えば、腫瘍細胞である。他の実施形態において、細胞は、阻害性核酸、PRC2結合lncRNA、またはその断片と生体外で接触させて、多能性を高め、分化を高め、または幹細胞の特定の細胞種、例えば、神経、ニューロンドーパミン作動性ニューロン筋肉、皮膚、心臓、腎臓、肝臓神経内分泌網膜網膜色素上皮膵臓のαおよびβ細胞造血系細胞軟骨細胞骨細胞および/または血液細胞(例えば、T細胞、B細胞マクロファージ赤血球血小板等)への分化を誘導する幹細胞である。

0039

いくつかの実施形態において、遺伝子はNkx2−1(Titf1としても知られる)である。いくつかの実施形態において、Nkx2−1に対する長鎖非コード(アンチセンス)RNAは、AK14300を含むNkx2−1プロモーター;またはNR_003367.1とおそらく重複しておよそ57,636,100〜57,638,650の塩基対でマウスの第12染色体上にある。ヒトでは、類似のアンチセンス転写物は、ヒトNKX2−1遺伝子座に存在する(ヒト遺伝子BX161496;Chr14:ヒトのゲノムアセンブリバージョンGRCh37/hg19におけるbp36,988,521−36,991,722と、一致しないまでも、重複する)。Nkx2−1は、腫瘍抑制因子および癌遺伝子の両方である。早い段階では、Nkx2−1は腫瘍を形成するために必要とされ、後になってその発現が失われ、その喪失が予後不良に相関する。そのため、Nkx2−1を標的とするlncRNAは少なくとも2つの用途を有する。すなわち、そのlncRNAは、投与されてそれ自体が癌の形成を阻止することができ、または後になってその発現を低下させてNKX2−1の発現を上げることができる。ヒトでは、NKX2−1は、肺腺癌にて増幅され、変異することが多く、肺の腫瘍形成と直接関連付けられている。それは癌発生初期においては癌原遺伝子として説明されるが、同時にその発現の喪失は最終的に予後不良に関連する。従って、いくつかの実施形態において、プロモーターに関連するアンチセンス転写物を対象、例えば、癌、例えば、肺腺癌の対象に投与し、および/または腫瘍細胞に導入し、それによって、増幅したNKX2−1を発現した患者にてNKX2−1の発現を低下させる。或いは、NKX2−1の発現を喪失している予後不良の対象(例えば、癌、例えば、肺腺癌の対象)にて、LNA分子のような阻害性RNAを導入してPRC2と相互作用するアンチセンス転写物と拮抗させ、NKX2−1遺伝子の発現を再開させる。

0040

追加の態様において、本発明は幹細胞の多能性を高める方法を提供する。方法は、表3にあるような長鎖非コードRNAもしくはそのPRC2結合断片、表3にあるようなlncRNA配列もしくはそのPRC2結合断片に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%相同である核酸配列に細胞を接触させることを含む。マウスのlncRNA、またはヒトlncRNAを含むオルソログlncRNAのPRC2結合断片は前述の方法で企図される。

0041

さらなる態様において、本発明は、幹細胞の分化を高める方法を特徴とするが、該方法は、表3および表4にあるような長鎖非コードRNAに特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸に細胞を接触させることを含む。
いくつかの実施形態において、幹細胞は胚性幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞はiPS細胞または成体幹細胞である。

0042

追加の態様において、本発明は、非経口投与のための、表1、2、6もしくは7もしくは8のlncRNA(の少なくとも5、10、15、20、25または30塩基、または30もしくは40までの塩基)に特異的に結合するもしくはそれに対して少なくとも90%相補的である阻害性核酸、または表1、2、6もしくは7もしくは8のlncRNAの少なくとも15(例えば、少なくとも20、21、25、30、100)核酸塩基に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一である関連する天然に存在するlncRNAを含む無菌組成物を提供する。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、マイクロRNA(miRNA)、小分子一本鎖RNA(stRNA)、および一本鎖もしくは二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、RNAi化合物は、低分子干渉RNA(siRNA)、または低分子ヘアピンRNA(shRNA)、低分子RNA誘導の遺伝子活性化(RNAa)および低分子活性化RNA(saRNA)から成る群から選択される。

0043

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNAアンチセンスDNA、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る群から選択される。

0044

いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド結合、修飾されたヌクレオチドおよび/またはそれらの組み合わせを含む1以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシド結合は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸三エステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルまたはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖部分は、2’−O−メトキシエチル修飾の糖部分、2’−メトキシ修飾の糖部分、2’−O−アルキル修飾の糖部分、または二環式糖部分を含む。修飾の他の例には、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、アラビノ核酸(ANA)(任意で2’−F修飾を伴う)、2’−フルオロ−D−アラビノ核酸(FANA)、ホスホルアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)、エチレン架橋の核酸(ENA)(任意で2’−O,4’−C−エチレン架橋を伴う)、および二環式核酸(BNA)が挙げられる。さらなる他の例は以下で記載されるおよび/または当該技術で既知である。

0045

以下で要約される配列表に示されるRNAのいずれのPRC2結合断片も考えられている。いくつかの態様において、断片はPRC2をリクルートし、PRC2活性を高め得るが、それによって遺伝子発現を抑制する一方で、他の例では、断片はPRC2上のlncRNA結合部位を覆い隠すことによってPRC2活性を妨害し得る。特に、本発明は、以下のRNA断片を使用して、表9で示す(「逆鎖」の列または「同鎖」の列のいずれか)部類のいずれかに記載される疾患、障害、状態または関連を治療するのに使用するために表1〜8で示す遺伝子のいずれかの発現を調節することを特徴とする。

0046

さらに、以下で要約される配列表、配列番号1〜193,049で示すRNAのいずれかに特異的に結合する阻害性核酸も考えられている。特に、本発明は、表9で示す(表8の「逆鎖」の列または「同鎖」の列のいずれか)部類のいずれかに記載される疾患、障害、状態または関連を治療するのに使用するために表1〜8で示す遺伝子のいずれかの発現を上方調節するためのこれらの阻害性核酸の使用を特徴とし;いずれの部類において一緒に群分けされた一連の遺伝子の上方調節も考えられている。そのような阻害性核酸が、その遺伝子に対応するmRNAの発現を約50%(すなわち、正常の150%または1.5倍)または約2倍〜約5倍高めたという証拠も本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、発現が、約15倍、20倍、30倍、40倍、50倍または100倍、または前述の数のいずれかの間の範囲に高められ得ることが考えられている。他の実験では、高められたmRNA発現は、高められたタンパク質発現と相関することが示されている。
配列表における配列の要約を以下に示す。

0047

0048

配列番号は、PRC2(すなわち、阻害性核酸が指し向けられるRNA)に会合する(結合する)RNAを指す。(a)表に記載された基準遺伝子、(b)これらの遺伝子を標的とする(の発現を調節する)Prc2結合転写物またはピーク(すなわち、PRC2に結合するRNAのさらに小さい領域)、および(c)PRC2結合転写物またはピークに特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸のそれぞれは、以下の表9における番号によって表されるこれらの部類のうちのいずれか1つに好都合に群分けされ得る。

0049

疾患は、部類番号11、14、15、17、21、24、26、42、44、49、58、69、82、103、119、120、126、143、163、167、172、177、182、183、184、187、191、196、200、203、204、212、300〜323のうちのいずれか1つ、または400〜643のうちのいずれか1つによって指し示される。

0050

他の機能的な群は、部類番号10、12、13、16、18、19、20、22、23、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、43、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、121、122、123、124、125、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、164、165、166、168、169、170、171、173、174、175、176、178、179、180、181、185、186、188、189、190、192、193、194、195、197、198、199、201、202、205、206、207、208、209、210、211、213、214、215、216、217、または218よって指し示される。

0051

部類
番号名称
10アクチン細胞骨格組織化
11急性骨髄性白血病
12接着接合
13脂肪サイトカインシグナル伝達経路
14加齢
15アルツハイマー病
16アミノ糖およびヌクレオチド糖の代謝
17筋萎縮性側索硬化症ALS
18血管新生
19アポトーシス
20アルギニンおよびプロリンの代謝
21催不整脈性右心室心筋症(ARVC)
22軸索誘導
23B細胞受容体のシグナル伝達経路
24基底細胞癌(部類644にも該当)
25基底転写因子
26膀胱癌(部類644にも該当)
27血液凝固
28 血管の発生
29 骨の発達
30カルシウムのシグナル伝達経路

0052

31心筋収縮
32カチオンチャンネル活性
33細胞接着
34細胞周期(cell cycle)
35 細胞周期 (Cell cycle)
36細胞運動
37細胞表面受容体に連鎖したシグナル伝達
38ストレスに対する細胞応答
39チャンネル活性
40ケモカインのシグナル伝達経路
41コレステロール代謝過程
42慢性骨髄性白血病
43クエン酸サイクルTCAサイクル
44結腸直腸癌
45補体および凝固カスケード
46サイトカイン活性
47細胞骨格タンパク質結合
48細胞質ゾル
49拡張型心筋症
50 DNA結合
51DNA修復
52DNA複製
53 DNA複製
54薬剤代謝
55胎児性形態形成
56エンドサイトーシス(endocytosis)
57 エンドサイトーシス (Endocytosis)
58子宮内膜癌
59 小胞体

0053

60 ErbBのシグナル伝達経路
61細胞外領域
62 眼の発生
63脂肪酸の代謝
64フルクトースおよびマンノースの代謝
65Gタンパク質結合受容体タンパク質のシグナル伝達経路
66配偶子の生成
67ギャップ接合
68 miRNAによる遺伝子のサイレンシング
69神経膠腫
70グルコースの代謝過程
71解糖糖新生
72ゴルジ装置
73増殖因子の活性
74GTP分解酵素の調節因子活性
75心臓の発生
76ヘッジホッグシグナル伝達経路
77造血系細胞系列
78造血
79造血系またはリンパ系臓器の発生
80ヒストン修飾
81ハンチントン病
82肥大型心筋症(HCM
83免疫応答
84 免疫系の発達
85炎症反応
86インスリンのシグナル伝達経路
87細胞内のシグナル伝達カスケード
88イオンチャンネルの活性
89 イオン輸送

0054

90 Jak/STATシグナル伝達経路
91 学習または記憶
92白血球活性化
93 白血球の経内皮移動
94四肢の発達
95運動器官挙動
96 長期の強化
97肺の発生
98リソソーム(lysosome)
99 リソソーム (Lysosome)
100MAPKのシグナル伝達経路
101 MAPKKKのカスケード
102メラニン形成
103黒色腫
104ミスマッチ修復
105ミトコンドリア
106 ミトコンドリアの組織化
107 mTORのシグナル伝達経路
108筋肉組織の発達
109 非コードRNAの代謝過程
110ニューロンの発生
111神経栄養因子のシグナル伝達経路
112非小細胞肺癌(部類644にも該当)
113ノッチのシグナル伝達経路
114核小体
115卵母細胞減数分裂
116酸化還元
117酸化的リン酸化
118 p53のシグナル伝達経路
119膵臓癌(部類644にも該当)
120 パーキンソン病

0055

121 癌における経路(部類644にも該当)
122ホスファターゼ活性
123リンタンパク質ホスファターゼ活性
124細胞性生合成過程の正の調節
125 PPARのシグナル伝達経路
126前立腺癌(部類644にも該当)
127プロテアソーム
128タンパク質アミノ酸脱リン酸化
129 タンパク質の折り畳み
130タンパク質キナーゼ活性
131 タンパク質セリンスレオニンキナーゼ活性
132プリン代謝
133ピリミジン代謝
134Rasタンパク質のシグナル伝達
135アクチン細胞骨格の調節
136自食作用の調節
137細胞死の調節(部類644にも該当)
138細胞増殖の調節(部類644にも該当)
139細胞の大きさの調節
140 タンパク質のユビキチン化の調節
141 Rasタンパク質のシグナル伝達の調節
142転写の調節
143腎細胞癌(部類644にも該当)
144低酸素に対する応答
145ステロイドホルモン刺激に対する応答
146ウイルスに対する応答
147リボソーム
148 RNAの分解
149 RNAのプロセシング
150エステル交換反応を介したRNAのスプライシング

0056

151分泌
152骨格系の発達
153 骨格系の形態形成
154小細胞肺癌(部類644にも該当)
155 低分子のGTP分解酵素調節因子の活性
156精子形成
157スフィンゴ脂質の代謝
158スプライセオソーム(spliceosome)
159 スプライセオソーム (Spliceosome)
160幹細胞の分化
161ステロイドの生合成
162シナプス
163全身性エリテマトーデス
164 T細胞活性
165T細胞受容体のシグナル伝達経路
166 TGF−βのシグナル伝達経路
167甲状腺癌(部類644にも該当)
168トール様受容体のシグナル伝達経路
169転写活性化因子の活性
170転写因子の活性
171翻訳
172II型糖尿病
173ユビキチン介在性のタンパク質分解
174血管平滑筋収縮
175 血管系の発生
176VEGFのシグナル伝達経路
177ウイルス性心筋炎
178 Wntのシグナル伝達経路
179アミノ酸の生合成
180 ankの反復

0057

181ブロモドメイン
182心筋症
183白内障
184シャルコー・マリー・ツース
185サイトカイン
186サイトカイン受容体
187難聴
188 疾患の変異
189 egf様ドメイン
190エンドソーム
191癲癇
192糖タンパク質
193増殖因子
194 増殖因子の結合
195増殖因子受容体
196魚鱗癬
197免疫グロブリンドメイン
198イオンチャンネル
199ロイシンリッチ反復
200大脳白質萎縮症
201メチル化
202メチルトランスフェラーゼ
203神経変性
204神経症
205 核
206肥満
207タンパク質ホスファターゼ
208 タンパク質ホスファターゼ阻害因子
209癌遺伝子(癌原遺伝子を含む)(部類644にも該当)
210分泌される

0058

211セリン/スレオニン特異的タンパク質キナーゼ
212全身性エリテマトーデス
213膜貫通
214膜貫通タンパク質
215腫瘍抑制因子(部類644にも該当)
216チロシンタンパク質キナーゼ
217 ubl抱合経路
218 wd反復
300膀胱癌において下方調節(部類644にも該当)

0059

301白血病において下方調節(部類644にも該当)
302脳腫瘍において下方調節(部類644にも該当)
303乳癌において下方調節(部類644にも該当)
304子宮頸癌において下方調節(部類644にも該当)
305結腸癌において下方調節(部類644にも該当)
306食道癌において下方調節(部類644にも該当)
307胃癌において下方調節(部類644にも該当)
308頭頸部癌において下方調節(部類644にも該当)
309腎臓癌において下方調節(部類644にも該当)
310肝臓癌において下方調節(部類644にも該当)
311肺癌において下方調節(部類644にも該当)
312リンパ腫において下方調節(部類644にも該当)
313黒色腫において下方調節(部類644にも該当)
314多発性骨髄腫において下方調節(部類644にも該当)
315卵巣癌において下方調節(部類644にも該当)
316膵臓癌において下方調節(部類644にも該当)
317前立腺癌において下方調節(部類644にも該当)
318肉腫において下方調節(部類644にも該当)
319 非黒色腫の皮膚癌において下方調節(部類644にも該当)
320 部類644にもある子宮癌において下方調節(部類644にも該当)
321中皮腫において下方調節(部類644にも該当)
322副腎癌において下方調節(部類644にも該当)
323副甲状腺癌において下方調節(部類644にも該当)

0060

400腎臓の明細胞肉腫において上方調節(部類644にも該当)
401急性の肺損傷において上方調節
402 急性巨核芽球性白血病において上方調節(部類644にも該当)
403急性骨髄性白血病において上方調節(部類644にも該当)
404 詳細不明の急性膵炎において上方調節
405食道腺癌において上方調節(部類644にも該当)
406 肺の腺癌において上方調節(部類644にも該当)
407小腸腺腫において上方調節(部類644にも該当)
408アデノウイルス感染において上方調節
409脳炎を伴ったAIDSにおいて上方調節
410アルコール中毒症において上方調節
411 アレキサンダー病において上方調節
412 α−1アンチトリプシン欠乏症において上方調節
413アルツハイマー病において上方調節
414退形成性乏突起星細胞腫において上方調節(部類644にも該当)
415アンドロゲン不感症症候群において上方調節
416星状細胞腫において上方調節(部類644にも該当)
417筋肉萎縮において上方調節
418自己免疫性肝炎において上方調節
419細菌感染において上方調節
420バレット食道において上方調節
421 小腸のその場での癌腫において上方調節(部類644eにも該当)
422心筋症において上方調節
423慢性肉芽腫性疾患において上方調節
424慢性リンパ性白血病において上方調節
425慢性閉塞性気道疾患において上方調節
426 慢性多関節性若年性関節リウマチにおいて上方調節
427肝硬変において上方調節
428コカイン依存症において上方調節
429 複雑齲歯において上方調節
430クローン病において上方調節

0061

431非代償性心不全において上方調節
432脱水において上方調節
433拡張型心筋症において上方調節
434ウイルス性心筋炎に続発する拡張型心筋症において上方調節
435表皮増殖において上方調節
436中枢神経系の大腸菌感染において上方調節
437本態性血小板血症において上方調節
438過度労作による消耗において上方調節
439家族性低リン酸血症骨疾患において上方調節
440骨折において上方調節
441大腿骨の骨折において上方調節
442 汎虚血性心筋機能障害において上方調節
443膠芽腫において上方調節(部類644にも該当)
444ハマン・リッチ症候群において上方調節
445ヘリコバクターピロリによる消化管の感染において上方調節
446C型肝炎において上方調節
447HIV感染において上方調節
448ハンチントン病において上方調節
449高コレステロール血症において上方調節
450肥大において上方調節

0062

451特発性血小板減少性紫斑病において上方調節
452腸炎エルシニアによる感染において上方調節
453無精子症による不妊において上方調節
454心臓の損傷において上方調節
455ISM−皮膚のその場での黒色腫において上方調節
456レーバーの黒内障において上方調節
457肝癌において上方調節(部類644にも該当)
458黄斑変性症において上方調節
459悪性リンパ腫において上方調節(部類644にも該当)
460子宮頸部悪性腫瘍において上方調節(部類644にも該当)
461十二指腸の悪性腫瘍において上方調節(部類644にも該当)
462前立腺の悪性腫瘍において上方調節(部類644にも該当)
463の悪性腫瘍において上方調節(部類644にも該当)
464精巣の悪性腫瘍において上方調節(部類644にも該当)
465結腸の悪性腫瘍において上方調節(部類644にも該当)
466多発性良性色素細胞母斑において上方調節
467糖尿病性神経症において上方調節
468 非インスリン依存性糖尿病において上方調節
469栄養欠乏において上方調節
470閉塞性睡眠時無呼吸症において上方調節
471乏突起膠腫において上方調節(部類644にも該当)
472甲状腺乳頭癌において上方調節(部類644にも該当)
473パーキンソン病において上方調節
474ブタ腎症において上方調節
475 前子癇において上方調節
476原発性心筋症において上方調節
477原発性開放隅角緑内障において上方調節
478 原発性肺形成不全において上方調節
479シュードモナス感染において上方調節
480肺気腫において上方調節
481肺高血圧症において上方調節

0063

482II型糖尿病に関連する腎障害において上方調節
483腎損傷において上方調節
484網膜色素変性症において上方調節
485関節リウマチにおいて上方調節
486有棘細胞癌において上方調節(部類644にも該当)
487肺の有棘細胞癌において上方調節(部類644にも該当)
488癲癇重積症において上方調節
489全身性感染において上方調節
490血小板減少症において上方調節
491胸腺癌において上方調節(部類644にも該当)
492移行上皮癌において上方調節(部類644にも該当)
493 その場での移行上皮癌において上方調節(部類644にも該当)
494潰瘍性大腸炎において上方調節
495子宮筋腫において上方調節
496人工呼吸器関連の肺損傷において上方調節
497心室肥大において上方調節
498 心室肥大([左])において上方調節
499ビタミンA欠乏症において上方調節
500腎臓の明細胞肉腫において下方調節(部類644にも該当)
501急性肺損傷において下方調節
502急性巨核芽球性白血病において下方調節(部類644にも該当)
503急性骨髄性白血病において下方調節(部類644にも該当)
504 詳細不明の急性膵炎において下方調節
505食道の腺癌において下方調節(部類644にも該当)
506 肺の腺癌において下方調節(部類644にも該当)
507小腸の腺腫において下方調節(部類644にも該当)
508アデノウイルス感染において下方調節
509脳炎を伴ったAIDSにおいて下方調節
510アルコール中毒症において下方調節

0064

511 アレキサンダー病において下方調節
512 α−1アンチトリプシン欠乏症において下方調節
513アルツハイマー病において下方調節
514退形成性乏突起星細胞腫において下方調節
515アンドロゲン不感症症候群において下方調節
516星状細胞腫において下方調節(部類644にも該当)
517筋肉の委縮において下方調節
518自己免疫性肝炎において下方調節
519細菌感染において下方調節
520バレット食道において下方調節
521小腸のその場での癌腫において下方調節(部類644にも該当)
522心筋症において下方調節
523慢性肉芽腫性疾患において下方調節
524慢性リンパ性白血病において下方調節
525慢性閉塞性気道疾患において下方調節
526 慢性多関節性若年性関節リウマチにおいて下方調節
527肝硬変において下方調節
528コカイン依存症において下方調節
529 複雑齲歯において下方調節
530クローン病において下方調節
531非代償性心不全において下方調節
532脱水において下方調節
533拡張型心筋症において下方調節
534ウイルス性心筋炎に続発する拡張型心筋症において下方調節
535表皮増殖において下方調節
536中枢神経系の大腸菌感染において下方調節
537本態性血小板血症において下方調節
538過度の労作による消耗において下方調節
539家族性低リン酸血症性骨疾患において下方調節
540骨折において下方調節

0065

541大腿骨の骨折において下方調節
542 汎虚血性心筋機能障害において下方調節
543膠芽腫において下方調節(部類644にも該当)
544ハマン・リッチ症候群において下方調節
545ヘリコバクターピロリによる消化管の感染において下方調節
546C型肝炎において下方調節
547HIV感染において下方調節
548ハンチントン病において下方調節
549高コレステロール血症において下方調節
550肥大において下方調節
551特発性血小板減少性紫斑病において下方調節
552腸炎エルシニアによる感染において下方調節
553無精子症による不妊において下方調節
554心臓の損傷において下方調節
555ISM−皮膚のその場での黒色腫において下方調節(部類644にも該当)
556レーバーの黒内障において下方調節
557肝癌において下方調節(部類644にも該当)
558黄斑変性症において下方調節
559悪性リンパ腫において下方調節(部類644にも該当)
560子宮頸部の悪性腫瘍において下方調節(部類644にも該当)
561十二指腸の悪性腫瘍において下方調節(部類644にも該当)
562前立腺の悪性腫瘍において下方調節(部類644にも該当)
563胃の悪性腫瘍において下方調節(部類644にも該当)
564精巣の悪性腫瘍において下方調節(部類644にも該当)
565結腸の悪性腫瘍において下方調節(部類644にも該当)
566多発性良性色素細胞性母斑において下方調節
567糖尿病性神経症において下方調節
568 非インスリン依存性糖尿病において下方調節
569栄養欠乏において下方調節
570閉塞性睡眠時無呼吸症において下方調節

0066

571乏突起膠腫において下方調節
572甲状腺乳頭癌において下方調節
573パーキンソン病において下方調節
574ブタの腎症において下方調節
575 前子癇において下方調節
576原発性心筋症において下方調節
577原発性開放隅角緑内障において下方調節
578 原発性肺形成不全において下方調節
579シュードモナス感染において下方調節
580肺気腫において下方調節
581肺高血圧症において下方調節
582II型糖尿病に関連する腎障害において下方調節
583腎損傷において下方調節
584網膜色素変性症において下方調節
585関節リウマチにおいて下方調節
586有棘細胞癌において下方調節(部類644にも該当)
587 肺の有棘細胞癌において下方調節(部類644にも該当)
588癲癇重積症において下方調節
589全身性感染において下方調節
590血小板減少症において下方調節
591胸腺癌において下方調節(部類644にも該当)
592移行上皮癌において下方調節(部類644にも該当)
593 その場での移行上皮癌において下方調節(部類644にも該当)
594潰瘍性大腸炎において下方調節
595子宮筋腫において下方調節
596人工呼吸器関連の肺損傷において下方調節
597心室肥大において下方調節
598 心室肥大([左])において下方調節
599ビタミンA欠乏症において下方調節
600骨疾患に関連する

0067

601癌疾患に関連する(部類644にも該当)
602循環器疾患に関連する
603結合組織障害疾患に関連する
604皮膚病に関連する
605発達障害に関連する
606の疾患に関連する
607内分泌疾患に関連する
608消化器疾患に関連する
609血液疾患に関連する
610免疫疾患に関連する
611代謝性疾患に関連する
612多発性疾患に関連する
613筋肉疾患に関連する
614神経疾患に関連する
615栄養性疾患に関連する
616眼科疾患に関連する
617 他の疾患に関連する
618精神疾患に関連する
619腎臓疾患に関連する
620呼吸器疾患に関連する
621骨格疾患に関連する
622骨疾患で低下する
623 癌疾患で低下する(部類644にも該当)
624 循環器疾患で低下する
625 結合組織障害疾患で低下する
626皮膚疾患で低下する
627 発達障害で低下する
628 耳、鼻、喉の疾患で低下する
629 内分泌疾患で低下する
630 消化器疾患で低下する

0068

631血液疾患で低下する
632免疫疾患で低下する
633代謝性疾患で低下する
634多発性疾患で低下する
635筋肉疾患で低下する
636神経疾患で低下する
637栄養性疾患で低下する
638眼科疾患で低下する
639 他の疾患で低下する
640精神疾患で低下する
641腎臓疾患で低下する
642呼吸器疾患で低下する
643骨格疾患で低下する
644 癌に関与する

0069

従って、様々な態様において、本発明は、表で示される部類の1つ以上の範囲内に入る基準遺伝子の群の発現を調節し、(各基準遺伝子に関連する疾患を示す)表9で示される部類の任意の1つ以上における対応する疾患、障害または状態を治療するための、表1〜8のいずれかのRNA配列のいずれかに特異的に結合する阻害性核酸を特徴とする。

0070

別の態様において、本発明はまた、「逆鎖」の列または「同鎖」の列のいずれかで表8にて示される配列番号124437〜190716または190934〜191086または191087(ヒトのピーク)、または配列番号21583〜124436または190717〜190933または191088(マウスのピーク)のRNA配列のいずれかに特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸も特徴とする。いくつかの実施形態において、PRC2結合RNAが標的とする遺伝子(例えば、以下の表1〜8で示されるインターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)の発現を調節する方法における使用のために阻害性核酸が提供される。そのような方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。いくつかの実施形態において、例えば、以下の表9で記載されるような疾患を治療する方法で使用するために阻害性核酸が提供される。治療には、PRC2結合RNAが標的とする遺伝子の発現を(上方または下方のいずれかに)調節すること、好ましくは遺伝子発現を上方調節することが関与する。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は非経口投与用に無菌組成物として製剤化される。これらのRNA配列が標的とする基準遺伝子は表8で示され、表9における部類1〜643に従って群分けされている。従って、1つの態様において、本発明は、部類1〜643のうちのいずれか1つにおけるRNA配列、転写物またはピークのいずれかの群に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸の群を記載する。特に、本発明は、表9で示される部類のいずれか(例えば、部類番号11、14、15、17、21、24、26、42、44、49、58、69、82、103、119、120、126、143、163、167、172、177、182、183、184、187、191、196、200、203、204、212、300〜323、および/または400〜643のうちのいずれか1以上)に記載される疾患、障害、状態または関連を治療するのに使用するための、表8で示される基準遺伝子のいずれかの発現を上方調節するためのそのような阻害性核酸の使用を特徴とする。

0071

非限定例として、部類45(補体と凝固のカスケード)には、TFPI、F2、F2R、CD46、PROS1、SERPINE1、A2M、C1S、C3AR1、BDKRB1、C1R、SERPING1、BDKRB2、F5、C8G、THBD、および/またはPLAU(それぞれ遺伝子ID7035、2147、2149、4179、5627、5054、2、716、719、623、715、710、624、2153、733、7056、および5328)から成る群から選択される基準遺伝子が含まれる。次いで、TFPI、F2、F2R、CD46、PROS1、SERPINE1、A2M、C1S、C3AR1、BDKRB1、C1R、SERPING1、BDKRB2、F5、C8G、THBD、および/またはPLAUのそれぞれは、表8の適用可能な列で示される配列番号を有するPRC2結合RNAによって標的とされる。例えば、TFPIの配列番号には、表8に従って13245[F]、155228[F]、155229[F]、155230[F]、155231[F]、155232[F]、155233[F]、155234[F]、155235[F]、155236[F]、155237[F]、155238[F]、155239[F]、155240[F]、155241[F]、155242[F]、155243[F]、155244[F]、155245[F]、155246[F]、155247[F]、155248[F]、155249[F]、155250[F]、155251[F]、155252[F]、155255[F]、155256[F]、13245[66912]、155237[−806]、879[F]、68709[F]、68710[F]、68711[F]、68712[F]、68713[F]、68714[F]、68715[F]、68716[F]、68717[F]、68718[F]、68719[F]、68720[F]、68721[F]、68722[F]、68723[F]、68724[F]、68725[F]、68726[F]、68727[F]、68728[F]、68729[F]、68730[F]、68731[F]、68732[F]、68733[F]、68734[F]、68735[F]、68736[F]、68737[F]、68738[F]、68739[F]、68740[F]、68741[F]、68742[F]、68743[F]、68744[F]、68745[F]、68746[F]、68747[F]、68748[F]、68749[F]、および/または68713[−245]が含まれる。標的となる基準遺伝子TFPI、F2、F2R、CD46、PROS1、SERPINE1、A2M、C1S、C3AR1、BDKRB1、C1R、SERPING1、BDKRB2、F5、C8G、THBD、および/またはPLAUとして表8に列記されるこれらの配列番号のうちのいずれか1つに特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸から成る群から選択される阻害性核酸の群が、部類45(補体と凝固のカスケード)の疾患を治療することにおける使用を含むが、これらに限定されない本明細書で記載される組成物および方法のいずれかにおける使用について企図されるが、治療には、基準遺伝子TFPI、F2、F2R、CD46、PROS1、SERPINE1、A2M、C1S、C3AR1、BDKRB1、C1R、SERPING1、BDKRB2、F5、C8G、THBD、および/またはPLAUのいずれかの調節が関与する。同様に、部類643(「骨格疾患で低下する」)における遺伝子に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸が、骨格疾患を治療することにおける使用を含むが、これらに限定されない本明細書で記載される組成物および方法のいずれかにおける使用について企図される。部類644(癌に含まれる)の一部でもある部類における遺伝子に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸が、癌を治療することにおける使用を含むが、これらに限定されない本明細書で記載される組成物および方法のいずれかにおける使用について企図される。

0072

様々な態様において、本発明はさらに、互いに近傍の、例えば、互いに100塩基、200塩基、300塩基、400塩基、500塩基、1kbまたは2kbの範囲内である染色体座標に対応し、好ましくは(i)表9における同一基準遺伝子または(ii)表9における同一UCSC転写物に関連する1以上のピーク間でのRNA配列に結合する阻害性核酸を特徴とする。例えば、本発明は、配列番号1〜21582または191089〜193049のRNA転写物のいずれかの、長さ約2000、約1750、約1500または約1250ヌクレオチド、または好ましくは長さ約1000、約750、約500、約400、約300ヌクレオチド、または長さ約200、約150もしくは約100の断片に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を特徴とし、その際、RNAの断片は、配列番号124437〜190716または190934〜191086または191087(ヒトのピーク)または配列番号21583〜124436または190717〜190933または191088(マウスのピーク)のいずれか、または本明細書に添付はされないが、その全体が参照によって本明細書に組込まれる米国仮特許出願第61/425,174号の別表IのcDNA配列のいずれかの逆相補配列内での少なくとも5つの連続するヌクレオチドのストレッチを含む。例となる実施形態において、RNAの断片は、配列番号124437〜190716または190934〜191086または191087(ヒトのピーク)または配列番号21583〜124436または190717〜190933または191088(マウスのピーク)のいずれか、または2010年12月20日に出願された米国仮特許出願第61/425,174号の別表IのcDNA配列のいずれかの逆相補配列内での少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50の連続したヌクレオチドを含む。

0073

いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は、例えば、長さ約5〜40塩基、または10〜50塩基、または5〜50塩基である。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、標的RNA(すなわち、配列番号1〜193,049のいずれか)の例えば、少なくとも5、10、15、20、25もしくは30塩基、または30もしくは40までの塩基に対して少なくとも80%または90%相補的である配列を含むまたはそれから成り、または標的RNAの10、15、20、25もしくは30塩基にわたって3までのミスマッチ(例えば、1までの、または2までのミスマッチ)を伴った塩基配列を含む。

0074

従って、上で言及したように、阻害性核酸は、標的RNAの少なくとも10、もしくは10〜30、もしくは10〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも15、もしくは15〜30、もしくは15〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも20、もしくは20〜30、もしくは20〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも25、もしくは25〜30、もしくは25〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも30、もしくは30〜40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である、または標的RNAの少なくとも40の連続塩基に対して少なくとも80%相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。さらに、阻害性核酸は、標的RNAの少なくとも5、もしくは5〜30、もしくは5〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも10、もしくは10〜30、もしくは10〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも15、もしくは15〜30、もしくは15〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも20、もしくは20〜30、もしくは20〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも25、もしくは25〜30、もしくは25〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも30、もしくは30〜40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である、または標的RNAの少なくとも40の連続塩基に対して少なくとも90%相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に、阻害性核酸は、標的RNAの少なくとも5、10、または15の連続塩基に対して完全に相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。幾つかの追加の非相補性の塩基が含まれ得ることが理解される。記載された塩基のそのような配列を含む阻害性核酸は他の非相補性の塩基も含み得ることが理解される。例えば、阻害性核酸は、全長20塩基であり得るが、標的RNAの15塩基に対して完全に相補的である15塩基部分を含むことができる。同様に、阻害性核酸は、全長20塩基であり得るが、標的RNAの15塩基に対して少なくとも80%相補的である15塩基部分を含むことができる。

0075

相補性は、上で言及したように、相補性の塩基対形成におけるミスマッチの数という点でも参照することができる。従って、阻害性核酸は、標的RNAの10の連続塩基にわたって3までのミスマッチ、または標的RNAの15の連続塩基にわたって3までのミスマッチ、または標的RNAの20の連続塩基にわたって3までのミスマッチ、または標的RNAの25の連続塩基にわたって3までのミスマッチ、または標的RNAの30の連続塩基にわたって3までのミスマッチを伴った塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に、阻害性核酸は、標的RNAの10の連続塩基にわたって2までのミスマッチ、または標的RNAの15の連続塩基にわたって2までのミスマッチ、または標的RNAの20の連続塩基にわたって2までのミスマッチ、または標的RNAの25の連続塩基にわたって2までのミスマッチ、または標的RNAの30の連続塩基にわたって2までのミスマッチを伴った塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に、阻害性核酸は、標的RNAの10、15、20、25、または30の連続塩基にわたって1つのミスマッチを伴った塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。

0076

本明細書(例えば、要約、詳細な説明、または実施形態の実施例にて)で記載される阻害性核酸またはそれを設計するもしくは合成する方法のいくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は任意で、(a)作製され、実際に開示される(すなわち、特定の化学物質、一本鎖または二本鎖、特定の修飾および特定の塩基配列)、以下の配列番号で示される特定の阻害性核酸の1以上;および/または(b)(a)の阻害性核酸の1以上の塩基配列;および/または(c)(a)の1以上の阻害性核酸と同じRNAの特定の部分(連続塩基のストレッチ)に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸の群を除外し得、それらは以下の出版物の1つ以上で開示されるとおりである:

0077

標的HOTAIR RNA(Rinnら、2007)、Tsix、RepAまたはXist RNA((Zhaoら、2008)配列番号194206〜194210]、または(Sarmaら、2010)[配列番号194217〜194226]または(Zhaoら、2010)[配列番号194227〜194228]または(Prasanathら、2005)[配列番号194213〜194216]または(Shamovskyら、2006)[配列番号194212]または(Marinerら、2008)[配列番号194211]または(Sunwooら、2008)または(Bernardら、2010)[配列番号194229]として;或いはPRC2調節因子として特定される50〜200ntのターゲティング短鎖RNA(Kanhereら、2010);または(Kuwabaraら、米国特許出願公開第2005/0226848号)[配列番号194230〜194231]または(Liら、米国特許出願公開第2010/0210707号)[配列番号194232〜194267]または(Coreyら,7,709,456)[配列番号194268〜194285]または(Mattickら,国際公開第WO2009/124341号)または(Coreyら、米国特許出願公開第2010/0273863号)[配列番号194286〜194305]、または(Wahlstedtら、米国特許出願公開第2009/0258925号)[配列番号193140〜193206]、またはBACE:米国特許出願公開第2009/0258925号[配列番号193140〜193206];ApoA1:米国特許出願公開第2010/0105760号/欧州特許第235283号[配列番号193207〜193379],P73,p53,PTEN,国際公開第WO2010/065787A2号/欧州特許2370582号[配列番号193380〜193425];SIRT1:国際公開第WO2010/065662A2号/欧州特許第09831068号[配列番号193426〜193472];VEGF:国際公開第WO2010/065671A2号/欧州特許第2370581号[配列番号193473〜193483];EPO:国際公開第WO2010/065792A2号/欧州特許第09831152号[配列番号193484〜193492];BDNF:国際公開第WO2010/093904号[配列番号193493〜193503],DLK1:国際公開第WO2010/107740号[配列番号193504〜193510];NRF2/NFE2L2:国際公開第WO2010/107733号[配列番号193511〜193518];

0078

GDNF:国際公開第WO2010/093906号[配列番号193519〜193556];SOX2,KLF4,Oct3A/B,「再プログラム因子」:国際公開第WO2010/135329号[配列番号193557〜193573];ジストロフィン:国際公開第WO2010/129861号[配列番号193574〜193605];ABCA1,LCAT,LRP1,ApoE,LDLR,ApoA1:国際公開第WO2010/129799号[配列番号193606〜193884];HgF:国際公開第WO2010/127195号[配列番号193885〜193889];TTP/Zfp36:国際公開第WO2010/129746号[配列番号193890〜193904];TFE3,IRS2:国際公開第WO2010/135695号[配列番号193905〜193919];RIG1,MDA5,IFNA1:国際公開第WO2010/138806号[配列番号193920〜193958];PON1:国際公開第WO2010/148065号[配列番号193959〜193965];コラーゲン:国際公開第WO/2010/148050号[配列番号193966〜193998];Dyrk1A,Dscr1,「ダウン症候群遺伝子」:国際公開第WO/2010/151674号[配列番号193999〜194022];TNFR2:国際公開第WO/2010/151671号[配列番号194023〜194029];インスリン:国際公開第WO/2011/017516号[配列番号194030〜194039];ADIPOQ:国際公開第WO/2011/019815号[配列番号194040〜194064];CHIP:国際公開第WO/2011/022606号[配列番号194065〜194074];ABCB1:国際公開第WO/2011/025862号[配列番号194075〜194082];NEUROD1,EUROD1,HNF4A,MAFA,PDX,KX6,「膵臓発生遺伝子」:国際公開第WO/2011/085066号[配列番号194083〜194115];MBTPS1:国際公開第WO/2011/084455号[配列番号194116〜194119];SHBG:国際公開第WO/2011/085347号[配列番号194120〜194133];IRF8:国際公開第WO/2011/082409号[配列番号194134〜194137];UCP2:国際公開第WO/2011/079263号[配列番号194138〜194148];HGF:国際公開第WO/2011/079261号[配列番号194149〜194156];GH:国際公開第WO/2011/038205号[配列番号194157〜194161];IQAP:国際公開第WO/2011/031482号[配列番号194162〜194166];NRF1:国際公開第WO/2011/090740号[配列番号194167〜194172];P63:国際公開第WO/2011/090741号[配列番号194173〜194176];RNAseH1:国際公開第WO/2011/091390号[配列番号194177〜194184];ALOX12B:国際公開第WO/2011/097582号[配列番号194185〜194189];PYCR1:国際公開第WO/2011/103528号[配列番号194190〜194193];CSF3:国際公開第WO/2011/123745号[配列番号194194〜194198];FGF21:国際公開第WO/2011/127337号[配列番号194199〜194205]として(上述のものはその全体が参照によって本明細書に組込まれる)。いくつかのまたは任意の実施形態において、本発明から任意で除外されるのは、以下の領域のうちの1以上に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸である:

0079

配列番号193208のヌクレオチド1〜932;配列番号193386のヌクレオチド1〜1675;配列番号193387のヌクレオチド1〜518;配列番号193388のヌクレオチド1〜759;配列番号193389のヌクレオチド1〜25892;配列番号193390のヌクレオチド1〜279;配列番号193391のヌクレオチド1〜1982;配列番号193392のヌクレオチド1〜789;配列番号193393のヌクレオチド1〜467;配列番号193427のヌクレオチド1〜1028;配列番号193428のヌクレオチド1〜429;配列番号193429のヌクレオチド1〜156;配列番号193430のヌクレオチド1〜593;配列番号193475のヌクレオチド1〜643;配列番号193476のヌクレオチド1〜513;配列番号193486のヌクレオチド1〜156;配列番号193494のヌクレオチド1〜3175;配列番号193506のヌクレオチド1〜1347;配列番号193513のヌクレオチド1〜5808;配列番号193520のヌクレオチド1〜237;配列番号193521のヌクレオチド1〜1246;配列番号193522ヌクレオチド1〜684;配列番号193553のヌクレオチド1〜400;配列番号193554のヌクレオチド1〜619;配列番号193555のヌクレオチド1〜813;配列番号193560のヌクレオチド1〜993;配列番号193560のヌクレオチド1〜401;配列番号193561のヌクレオチド1〜493;配列番号193562のヌクレオチド1〜418;配列番号193576のヌクレオチド1〜378;配列番号193577のヌクレオチド1〜294;配列番号193578のヌクレオチド1〜686;配列番号193579のヌクレオチド1〜480;配列番号193580のヌクレオチド1〜501;配列番号193613のヌクレオチド1〜1299;配列番号193614のヌクレオチド1〜918;配列番号193615のヌクレオチド1〜1550;配列番号193616のヌクレオチド1〜329;配列番号193617のヌクレオチド1〜1826;配列番号193618のヌクレオチド1〜536;配列番号193619ヌクレオチド1〜551;配列番号193620ヌクレオチド1〜672;配列番号193621のヌクレオチド1〜616;配列番号193622のヌクレオチド1〜471;配列番号193623ヌクレオチド1〜707;配列番号193624のヌクレオチド1〜741;配列番号193625のヌクレオチド1〜346;配列番号193626のヌクレオチド1〜867;配列番号193627のヌクレオチド1〜563;配列番号193892のヌクレオチド1〜970;配列番号193893のヌクレオチド1〜1117;配列番号193894のヌクレオチド1〜297;配列番号193907のヌクレオチド1〜497;配列番号193923のヌクレオチド1〜1267;配列番号193924のヌクレオチド1〜586;

0080

配列番号193925ヌクレオチド1〜741;配列番号193926のヌクレオチド1〜251;配列番号193927のヌクレオチド1〜681;配列番号193928のヌクレオチド1〜580;配列番号193960ヌクレオチド1〜534;配列番号193969のヌクレオチド1〜387;配列番号193970のヌクレオチド1〜561;配列番号193971のヌクレオチド1〜335;配列番号193972のヌクレオチド1〜613;配列番号193973のヌクレオチド1〜177;配列番号193974のヌクレオチド1〜285;配列番号194001のヌクレオチド1〜3814;配列番号194002のヌクレオチド1〜633;配列番号194003のヌクレオチド1〜497;配列番号194004のヌクレオチド1〜545;配列番号194306のヌクレオチド1〜413;配列番号194307のヌクレオチド1〜413;配列番号194308のヌクレオチド1〜334;配列番号194309のヌクレオチド1〜582;配列番号194310のヌクレオチド1〜416;配列番号194311のヌクレオチド1〜3591;配列番号194312のヌクレオチド1〜875;配列番号194313のヌクレオチド1〜194;配列番号194314のヌクレオチド1〜2074;配列番号194315のヌクレオチド1〜1237;配列番号194316のヌクレオチド1〜4050;配列番号194317のヌクレオチド1〜1334;配列番号194318のヌクレオチド1〜1235;配列番号194319のヌクレオチド1〜17,964;

0081

配列番号194320のヌクレオチド1〜50,003;配列番号194321のヌクレオチド1〜486;配列番号194322のヌクレオチド1〜494;配列番号194323のヌクレオチド1〜1992;配列番号194324のヌクレオチド1〜1767;配列番号194325のヌクレオチド1〜1240;配列番号194326のヌクレオチド1〜3016;配列番号194327のヌクレオチド1〜1609;配列番号194328のヌクレオチド1〜312;配列番号194329のヌクレオチド1〜243;配列番号194330のヌクレオチド1〜802;配列番号194331のヌクレオチド1〜514;配列番号194332のヌクレオチド1〜936;配列番号194333のヌクレオチド1〜1075;配列番号194334のヌクレオチド1〜823;配列番号194335のヌクレオチド1〜979;配列番号194336のヌクレオチド1〜979;配列番号194337のヌクレオチド1〜288;配列番号194338のヌクレオチド1〜437;配列番号194339のヌクレオチド1〜278;配列番号194340のヌクレオチド1〜436;配列番号194341のヌクレオチド1〜1140;配列番号194342のヌクレオチド1〜2082;配列番号194343のヌクレオチド1〜380;配列番号194344のヌクレオチド1〜742;配列番号194345のヌクレオチド1〜4246。

0082

いくつかのまたは任意の実施形態において、表3のマウスのRNA配列の1以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表3のヒトのRNA配列の1以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表4のマウスのRNA配列の1以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表4のヒトのRNA配列の1以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表5のマウスのRNA配列の1以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表5のヒトのRNA配列の1以上が除外され得る。

0083

本明細書に記載される阻害性核酸またはそれらを設計するもしくは合成する方法のいくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は遺伝子発現を上方調節し、タンパク質をコードする基準遺伝子と同じ鎖から転写されるPRC2結合RNAに特異的に結合し得る、またはそれと特異的にハイブリッド形成し得る、またはそれに対して相補的であり得る。阻害性核酸は、基準遺伝子(refGene)のタンパク質をコードするセンス鎖イントロンエクソン、イントロン/エクソン接合部、5’UTR、3’UTR、翻訳開始領域、または翻訳終止領域の範囲内を起源とするまたはそれと重複するPRC2結合RNAの領域に結合し得る。

0084

本明細書に記載される阻害性核酸またはそれらを設計するもしくは合成する方法のいくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は遺伝子発現を上方調節し、タンパク質をコードする基準遺伝子に比べて反対側の鎖(アンチセンス鎖)から転写されるPRC2結合RNAに特異的に結合し得る、またはそれと特異的にハイブリッド形成し得る、またはそれに対して相補的であり得る。

0085

本明細書に記載される阻害性核酸は修飾され得る、例えば、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾されたヌクレオチドおよび/またはそれらの組み合わせを含み得る。加えて、阻害性核酸は、1以上の以下の特性を示すことができる、すなわち、標的RNAの実質的な切断または分解を誘導しない;標的RNAの実質的に完全な切断または分解を引き起こさない;RNA分解酵素Hの経路を活性化しない;RISCを活性化しない;いかなるアルノートファミリータンパク質をもリクルートしない;ダイサーによって切断されない;選択的スプライシングに介在しない;免疫刺激性ではない;ヌクレアーゼ耐性である;修飾されていないオリゴヌクレオチドに比べて改善された細胞取り込みを有する;細胞または哺乳類にとって毒性ではない;改善されたエンドソームの出口を有し得る;PRC2、好ましくはEzh2であるが、任意でSuz12、Eed、RbAp46/48サブユニットまたは例えば、Jarid2のようなアクセサリ分子とのlncRNAの相互作用に干渉する;H3−リシン27のメチル化を低下させるおよび/または遺伝子発現を上方調節する。

0086

本明細書に記載される阻害性核酸またはそれらを設計するもしくは合成する方法のいくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は任意で、Kuwabaraらの米国特許出願公開第2005/0226848号またはLiらの米国特許出願公開第2010/0210707号またはCoreyらの米国特許第7,709,456号またはMattickらの国際公開第WO2009/124341号に記載されるようなプロモーター領域のDNAを結合するもの、またはCoreyらの米国特許出願公開第2010/0273863号に記載されるような3’UTR領域のDNAを結合するものを除外し得る。

0087

RNAと相互作用して遺伝子発現を調節するように設計される阻害性核酸は、標的DNAを結合するように設計されるもの(例えば、RNAが転写される根底にあるゲノムDNA配列に対して相補的である)とは区別される塩基配列のサブセットである。

0088

本明細書に記載されるのはまた、従来のノックダウン法にあまり従わないRNAのサブクラスである核の長鎖非コードRNAを標的とするロックド核酸(LNA)分子の使用方法である(Jepsen et al., Oligonucleotides, 14, 130-146 (2004); Khalil et al., PNAS 106(28)11675-11680 (2009))。本明細書で記載されるように、LNA分子は、同族結合配列(すなわち、同族の結合相手)、例えば、染色体またはPRC2から速い動態でlncRNAを外すのに使用することができる。
従って、1つの態様において、本発明は、長鎖非コードRNA(lncRNA)に対して相補的であるか、またはそれに特異的に結合するロックド核酸(LNA)を提供する。

0089

別の態様において、本発明は、その同族の結合相手から長鎖非コードRNA(lncRNA)を解離させる(例えば、結合を破壊するまたは結合親和性を低下させる)方法を特徴とする。方法には、lncRNAに対して相補的であるか、またはそれに特異的に結合するロックド核酸(LNA)にlncRNAを接触させることが含まれる。
いくつかの実施形態において、lncRNAは、高分子遺伝子間非コードRNA(li非コードRNA)、プロモーターに関連する短鎖RNA(PASR)、内在性のアンチセンスRNA、またはクロマチン修飾因子、例えば、ポリコーム複合体、例えば、ポリコーム抑制複合体2と結合するRNAである。

0090

いくつかの実施形態において、lncRNAは核に局在する。
いくつかの実施形態において、LNA分子は、既知のRNA局在化モチーフを含むlncRNAの領域に対して相補的である。
いくつかの実施形態において、LNA分子は、少なくとも1つのロックされない分子を含む。そのようなLNA分子は1以上のロックされたヌクレオチドおよび1以上のロックされないヌクレオチドを有し得る。用語「LNA」には、相補性RNAへの高い親和性、ヌクレアーゼ耐性、免疫刺激の欠如、および速い動態という所望の特性を保持する制約付きの糖を含むヌクレオチドが含まれる。例となる制約付きの糖には以下に列記されるものが挙げられる。

0091

特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明で使用するために方法および材料が本明細書に記載されるが;当該技術で既知の他の好適な方法および材料も使用することができる。材料、方法および実施例は例示説明のためにすぎず、限定を意図するものではない。本明細書で言及される出版物、特許出願、特許、配列、データベース登録項目および他の参照はすべて、その全体が参照によって本明細書に組込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含めて本明細書が優先される。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面からおよび特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

0092

コンパクトディスク上に提示される配列表への参照
本出願は配列表を含有するコンパクトディスクを含む。配列表は以下のようにコンパクトディスクで特定される。



配列表の全体が参照により本明細書に組込まれる。

図面の簡単な説明

0093

図面の説明
図1A〜1Kは、本明細書において記載されるようなRNA免疫沈降(RIP)‐シークエンシング方法とパイロットライブラリーの解析の1つの実施形態を示す図である。図1Aは代表的なRIP‐シークエンシング概略図である。
図1Bは、野生型(WT)ES細胞およびEzh2−/−ES細胞におけるEzh2タンパク質のウェスタンブロット分析(右のパネル)と等量を負荷したことを示すクマシー染色(左のパネル)の結果を示す一対の画像である。図1Cは、RNA免疫沈降産物のサイズ選別のための調製用アガロースゲルの結果を示す画像である。図1Dは、等価の数の細胞(列2)、図7に示される基準を用いて選別した後のリード(列3)、および重複配列および反復配列を除去した後の別個のリード(列4)についてのWTライブラリーと対照ライブラリーのパイロットライブラリーの統計を示す表である。図1Eは、オリジナルのWTライブラリーに対する対比較での表示のライブラリーの相関係数(CC)を表す表である。図1Fは、ゲノム中の示されたコピー数を有するエレメントに対して対応するWTリードの累積頻度を示す線グラフである。

0094

図1Gは、WTライブラリーでの様々な反復物の相対頻度を示す円グラフである。ゲノム当たり10回より多く繰り返したエレメントは全てのリードの20%未満を占めた。単純反復配列は85.714%を占め、そして、LINE、SINE、LTR、低複雑性反復配列およびサテライトは、それぞれ、4.881%、4.130%、2.636%、2.487%および0.002%(グラフには示されない)に相当した。
図1Hは別個のWTパイロットリードのマウスX染色体に対するアラインメントを示すグラフである。ユニークエレメントと反復配列の両方についての100kbのウインドウ毎のリード数セントロメア(CEN)から遠位テロメアTELO)までプロットしてある。100キロベースのウインドウはオーバーラップせず、そして、連続的である。「n」箇所に対応するリードが各位置でn分の1リードとして数えられるようにリードを正規化した。Chr:染色体、濃灰色:フォワード鎖、明灰色:リバース鎖。図1Iは、パイロットWTリードを記載するX染色体不活性化センターを拡大したものを示すグラフである。Ezh2−/−ライブラリーではこれらのリードが失われている。頻度が3以下のリードが示されている。*:非コードRNA。
図1Jは一対のグラフを示す。上のグラフは別個のWTパイロットリードのマウス12番染色体に対するアラインメントを示す。ユニークエレメントと反復配列の両方についての100kbのウインドウ毎のリード数をセントロメア(CEN)から遠位テロメア(TELO)までプロットしてある。100キロベースのウインドウはオーバーラップせず、そして、連続的である。「n」箇所に対応するリードが各位置でn分の1リードとして数えられるようにリードを正規化した。Chr:染色体、濃灰色:フォワード鎖、明灰色:リバース鎖。下のグラフは、パイロットWTリードを記載するインプリントドメインを拡大したものを示す。Ezh2−/−ライブラリーではこれらのリードが失われている。頻度が3以下のリードが示されている。*:非コードRNA。

0095

図1Kは一対のグラフを示す。左のグラフは別個のWTパイロットリードのマウス12番染色体に対するアラインメントを示す。ユニークエレメントと反復配列の両方についての100kbのウインドウ毎のリード数をセントロメア(CEN)から遠位テロメア(TELO)までプロットしてある。100キロベースのウインドウはオーバーラップせず、そして、連続的である。「n」箇所に対応するリードが各位置でn分の1リードとして数えられるようにリードを正規化した。Chr:染色体、濃灰色:フォワード鎖、明灰色:リバース鎖。右のグラフは、パイロットWTリードを記載するインプリントドメインを拡大したものを示す。Ezh2−/−ライブラリーではこれらのリードが失われている。頻度が3以下のリードが示されている。*:非コードRNA。図1Lは、各遺伝的部類中の(3回以上の頻度を有する)リードの数を示す表である。括弧は、各部類に属する別個のリードのパーセントを示す(例えば、非コードRNAに対応するリードは50.7%)。図1Mは、3回以上の頻度でリードがヒットした転写単位の数を示す表である。各部類の転写物の総数は列2に示されている。括弧はPRC2トランスクリプトームにおける各部類のパーセント表示を示す(例えば、PRC2トランスクリプトームでは既知のSuz12ドメインについて13.7%が相当する)。

0096

図2A〜2Dは、PRC2トランスクリプトームを捕捉するためのより大規模のシークエンシングに関連するデータを示す。図2Aは、UCSCの連結したトランスクリプトームデータベース由来の39,003転写物を野生型ライブラリー(x軸)およびヌルライブラリー(y軸)におけるそれらのRPKM値により示す散布図である。WTライブラリーにもヌルライブラリーにも表されないUCSC転写物は(0、0)にプロットされる。統計ソフトRの機能であるsmoothScatterにより平滑化を行った。濃い色合いは、グラフ上の所与の点でのより高い遺伝子密度に対応する。3:1WT/ヌル濃縮線とx=0.4閾値が灰色の点線として示される。「PRC2トランスクリプトーム」と記されたプールの中で、3:1以上のRPKM濃縮と0.4以上のWT RPKMという基準に合う転写物が強陽性とみなされ、赤色で示される。カットオフ値よりも下にある転写物はバックグランドとみなされ、オレンジ色で示される。Tsixは、示される(x、y)座標を有する図の外側(矢印)にある。
図2BはPRC2トランスクリプトームの特徴を示す表である。括弧中の数は各部類の遺伝子の総数を示す(例えば、793腫瘍抑制遺伝子のうち325遺伝子がPRC2トランスクリプトーム中に見出される)。
図2CはX染色体不活性化センターのより高い分解能での解析の結果を示すグラフである。別個のリードが、200bpのウインドウをx軸上にスライドし、それらの表出をy軸上にプロットすることにより平滑化された。
図2Dメタジーン解析の結果を示すグラフである。PRC2トランスクリプトームに由来する別個のリードが転写開始点TSS)からの距離の関数としてプロットされている。

0097

図2Eは、WT(左)ライブラリーおよびEzh2‐/‐(右)ライブラリーについての、TSSからの距離の関数としてプロットされたリード全ての頻度を示す一対のグラフである。x軸は、UCSC refGeneデータベースから獲得した遺伝子全てのプロモーター領域を示し、TSSに対する塩基対(bp)単位の座標を有する。フォワード鎖のリードは青色で示され、リバース鎖は赤色で示される。矢印はTSS近傍の濃縮を示す。図2Fは、WT試料、Ezh2‐/‐試料およびIgG試料についての、TSSからの距離の関数としてプロットされた(重複配列が除去された)別個のリードを示す3つのグラフのセットである。矢印はTSS近傍の濃縮を示す。

0098

図3A〜BはNesp/Gnas(A)インプリントクラスターおよびDlk1/Gtl2(B)インプリントクラスターについてのリード密度プロットである。別個のリードが、200bpまたは2kbのウインドウをx軸上にスライドし、それらの表出をy軸上にプロットすることにより平滑化された。*、非コードRNA。Chr:染色体、濃灰色:フォワード鎖、明灰色:リバース鎖。Ezh2−/−ライブラリーではこれらのリードが失われている。
同上

0099

図4は、未変性RNA免疫沈降/qRT‐PCRUV架橋RNA免疫沈降による確認。図4Aは、抗Ezh2抗体プルダウンおよびIgGプルダウンを比較するためのqRT‐PCRの結果を示す9つの棒グラフのセットである。実験は、3セットを2〜3回繰り返して行われた。エラーバー=1標準偏差(SD)。スチューデントの両側t検定を用いてPを計算した。アスタリスク検出不可能なレベル
図4Bは、野生型ES細胞とヌルES細胞の未変性抗Ezh2抗体によるRNA免疫沈降後のqRT‐PCRの結果をそれぞれIgGによるRNA免疫沈降での数値に対して正規化して示す8つの棒グラフのセットである。Xist、Gtl2‐asおよびFoxn2‐asについての数値はグラフ外であった。実験は、3セットを2〜4回繰り返して行われた。1SDが示されている。スチューデントの関連2群両側t検定を用いてPが計算されている。アスタリスク:検出不可能なRNAレベル。
図4Cは、未変性RNA免疫沈降のUV架橋RNA免疫沈降による確認の結果を示す7つの棒グラフのセットである。各実験は、3セットを2〜4回繰り返して行われ、IgGプルダウンに対して正規化され、そして、t検定(P)を用いてEzh2−/−対照の実験と比較された。1SDが示されている。図4Eは、リボヌクレアーゼ前処理がある未変性RNA免疫沈降とそれに続くqRT‐PCR定量の結果を示す画像である。
図4Dは、表示のRNA種についてのノーザンブロット分析の結果を示す画像である。

0100

図5A〜FはRNAとPRC2の間の直接的相互作用を示す生化学的分析の結果を示す。図5AはヒトPRC2とサブユニットのクマシー染色されたゲルを示す画像である。様々な移動度は各タンパク質のFlagタグ型と非タグ型を反映する。図5Bは、二重ステムループ構造として、WT型および変異体(Mut)型のRepA(配列番号193118および193119)とHes1(配列番号193120および193121)を示す概略図である。
図5Cは、精製したPRC2複合体と末端標識したプローブを用いるRNAEMSAの結果を示す画像である。負の対照:RepA以外のXistに由来するRNA配列であるDsIおよびDsII。二重のシフトは複数のPRC2サブ複合体の存在を示している。
図5Dは、精製したPRC2サブユニットを用いるRNA EMSAの結果を示す画像である。複数のレーンが同じゲルで泳動されたが、各パネルの間で1つのレーンを切り出したため、画像では切り離された。
図5Eは、0.1〜1.0mgのEZH2に対する1〜25fmolのHes1‐asRNAプローブタイトレーションの結果を示す画像である。
図5Fは、精製したPRC2と等モル負荷された表示のRNAプローブを用いるRNAプルダウンアッセイの結果を示す4つの画像のセットである。免疫沈降画分の25%、通過画分の10%およびインプットRNAの10%が示されている。

0101

図6A〜Eは、Gtl2がターゲティングPRC2によりDlk1を制御することを示す。図6Aは、Dlk1‐Gtl2ならびにshRNAおよびRNA免疫沈降とクロマチン免疫沈降(ChIP)で用いられたプライマーペアの位置のマップである。点線は、転写物がさらに伸長し得ることを示す。
図6Bは、Gtl2のノックダウン(KD)(各グラフの左棒)またはスクランブルKD(右棒)の後のGtl2、Dlk1およびGtl2‐asのRNAレベルのqRT‐PCRを示す3つの棒グラフのセットである。ノックダウン細胞のプールを用いている。RNAレベルはGapdhのレベルに対して正規化され、スクランブルノックダウン対照(Scr)でのレベルに対して比較されている。実験は、3セットを2回繰り返して行われた。1SDが示されている。Gtl2 KDとScr KDの間でスチューデントの両側t検定を用いてPが計算されている。図6CはKD細胞におけるPRC2の結合についてのqChIPの結果を示す一対の棒グラフである。抗Ezh2抗体(上)および抗K27トリメチル化ヒストンH3抗体(下)を用いて、通常のウサギIgGを対照として用いてChIPを行った。qPCRレベルはインプットDNAのパーセンテージとして表されている。DMR、メチル化可変領域。ICR、インプリント制御領域。1SDが示されている。Gtl2 KDとScr KDの間でスチューデントの両側t検定を用いてPが計算されている。図6Dは、Gtl2‐KDクローンとScr‐KDクローンでのEzh2のmRNAレベルのqRT‐PCRを示す棒グラフである。図6Eは、Ezh2−/−細胞とWT細胞でのGtl2発現に対するDlk1発現のqRT‐PCRを示す棒グラフである。1SDが示されている。

0102

図7A〜Cは試験試料および対照試料でのRIP‐シークエンシングおよびバイオインフォマテクス解析を示す。図7Aは試験試料および対照試料でのRIP‐シークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析を説明するフローチャートである。図7Bは、リボヌクレアーゼA(10ug/mL)およびリボヌクレアーゼV1(0.001U/mL)でのRNA免疫沈降産物の処理が(四角で囲まれた)200〜2,000ヌクレオチドの範囲のサイズの産物を破壊することを示す画像であり、プルダウンされた物質がRNAであったことを示唆する。200ヌクレオチド未満の範囲にあるバンドPCRプライマーダイマーである。図7Cはメタジーン解析の結果、すなわち、(同じスケールにプロットされた)WTパイロット試料、Ezh2−/−パイロット試料およびIgGパイロット試料についてのTSSからの距離の関数としてプロットされた別個のリードの数を示す3つのグラフのセットである。

0103

図8A〜Cは重複配列を除去してプロットした野生型トランスクリプトームについての染色体イデオグラムを示す。野生型トランスクリプトームにおける重複配列を除去した後のパイロットリード全てのマウスゲノムに対するアラインメントが示される。ユニークエレメントと反復配列の両方についての100kbのウインドウ毎のリード数をセントロメア(CEN)から遠位テロメア(TELO)まで距離(bp単位)の関数としてプロットしてある。100キロベースのウインドウはオーバーラップせず、そして、連続的である。「n」箇所に対応するリードが各位置でn分の1リードとして数えられるようにリードを正規化し、そして、免疫沈降試料と比較して非常に減少した対照ライブラリーの複雑性を説明するためにさらに正規化した。Chr:染色体。暗灰色:フォワード鎖、明灰色:リバース鎖。
同上
同上

0104

図9A〜Cは重複配列を除去してプロットしたEzh2−/−対照ライブラリーについての染色体イデオグラムを示す。図8の凡例に説明されるように解析を行った。野生型ライブラリーについてのグラフと同じスケールでグラフがプロットされていることに留意すること。
同上
同上
図10A〜Cは重複配列を除去してプロットしたIgG対照ライブラリーについての染色体イデオグラムを示す。図8の凡例に説明されるように解析を行った。野生型ライブラリーについてのグラフと同じスケールでグラフがプロットされていることに留意すること。
同上
同上
図11A〜Cは重複配列を除去してプロットした野生型の技術的反復についての染色体イデオグラムを示す。図8の凡例に説明されるように解析を行った。野生型ライブラリーについてのグラフと同じスケールでグラフがプロットされていることに留意すること。
同上
同上

0105

図12A〜C図11A〜Cは重複配列を除去してプロットした野生型の生物学的反復についての染色体イデオグラムを示す。図8の凡例に説明されるように解析を行った。野生型ライブラリーについてのグラフと同じスケールでグラフがプロットされていることに留意すること。
同上
同上
図13は、c‐Myc癌遺伝子(棒)の周辺の領域を示すプロットを表す。
図14は、(Titf1としても知られる)Nkx2‐1遺伝子の周辺の領域を示すプロットを表す。

0106

図15A〜Cは、XistのリピートCを標的とするLNA分子が不活性型X染色体(Xi)上のXist RNAの局在を消失させることを示す。図15Aは14種のタンデムマウスリピートC(配列番号193122〜193135)のアラインメントである。保存されたヌクレオチドがアスタリスクで示される。LNA分子により標的とされる領域は線により示される。
図15BはLNA分子のヌクレオフェクション後の表示の時点でのXist RNAのFISHの結果の定量を示す一対のグラフである。LNA‐C1についての結果が示されているが、LNA‐C2も同様の結果をもたらす。図15Cは、LNA分子により標的とされるマウスとヒトのリピートC領域(左)(配列番号193136〜193139)のアラインメントを示す。

0107

図16は、Xist RNAの排除にはPRC2の局在の消失が伴い、そして、Xist RNAの回復はXistの近傍で最初に起こることを示す。棒グラフは、GapdhのRNAに対して正規化された、XistレベルのリアルタイムqRT‐PCR分析の結果を示す。
図17A〜Cは、リピートCの周辺の広範なドメインがXistの局在に必要であることを示す。図17AはXistのエクソン/イントロン構造と利用したLNA分子の位置の概略マップである。図17Bは、Gapdhの量に対して正規化された、XistレベルのqRT‐PCRの結果を示す棒グラフである。
図17CはEzh2抗体を用いるウェスタンブロットの画像である。負荷対照(loading control)としてアクチンを用いている。

0108

図18A〜Dは、LNA分子のヌクレオフェクション後のEzh2の回復はXiに沿って一様であるが動態が遅いことを示す。図18AはX染色体上の遺伝子の概略図である。図18Bは、X染色体上の遺伝子でのEzh2のChIP分析を示す棒グラフである。
図18Cは、LNA分子のヌクレオフェクション後のEzh2のChIP分析を示す一対の棒グラフである。アスタリスク:スチューデントのt検定によるP<0.05。
図18D常染色体上のEn1プロモーターでのEzh2濃縮のChIP分析を示す棒グラフである。

0109

表1:PRC2トランスクリプトームによってヒットするインプリント領域
PRC2トランスクリプトームのインプリント遺伝子座標(geneimprint.comにおいてオンラインにより入手可能)との積集合。PRC2結合転写物によって標的とされるマウスインプリント遺伝子(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)が列1に示される。列1はまたマウスインプリント遺伝子の染色体鎖を示す(「+」サインは遺伝子がトップ鎖またはプラス鎖から転写されることを示し、「−」サインはPRC2結合転写物がボトム鎖またはマイナス鎖から転写されることを示す)。PRC2結合転写物のmm9における染色体位置座標とヌクレオチド座標、ならびにPRC2結合転写物がトップ鎖から転写されるのか(プラス鎖ヒット)、またはボトム鎖から転写されるのか(マイナス鎖ヒット)示す「+」サインまたは「−」サインが列2に示される。列3はマウスPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列2のマウスの染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列4は、メイン州のバー・ハーバーにあるジャソンラボラトリーのマウスゲノムインフォマティクス内のマウスゲノムデータベース(MGD)、ワールドワイドウェッブ(www.informatics.jax.org)、から得た、列1のマウスインプリント遺伝子に対応するヒト遺伝子の名前を示す。列2のマウス染色体座標のマウス対ヒトLiftOverが、本明細書において記載されるようにUCSCゲノムブラウザにおいて実行されて、列5に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。LiftOver解析のために50%保存が用いられた。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列6は予想されるヒトPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列5のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。PRC2相互作用転写物が列1のインプリント基準遺伝子と比較して反対の鎖から転写されるとき、そのことは、PRC2相互作用性RNAが基準インプリント遺伝子に対して相補的である、または方向についてアンチセンス鎖(「逆鎖」)であることを意味している。PRC2結合転写物は必ずしも基準インプリント遺伝子そのものではなく、位置についてオーバーラップする別個の転写物であることに留意すること。

0110

表2:PRC2トランスクリプトーム
マウスES細胞においてPRC2と結合する9,788転写物が示される。WTライブラリーにおけるリードをマップするために、連結型UCSCトランスクリプトームが使用された。リードがヒットしたUCSC転写物は列1に示される(「MTR」は連結された遺伝子の名前である)。列2はUCSC転写物の染色体鎖を示す(「+」サインはトップ鎖またはプラス鎖を示し、「−」サインはボトム鎖またはマイナス鎖を示す)。PRC2結合転写物のmm9における染色体位置座標とヌクレオチド座標、ならびにPRC2結合転写物がトップ鎖から転写されるのか(プラス鎖ヒット)、またはボトム鎖から転写されるのか(マイナス鎖ヒット)示す「+」サインまたは「−」サインが列3に示される。0.4以上のRPKM値が「ヒット」とみなされた。列4はマウスPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列3のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列3のマウス染色体座標のマウス対ヒトLiftOverが、本明細書において記載されるようにUCSCゲノムブラウザにおいて実行されて、列5に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列6は予想されるヒトPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列5のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。LiftOver解析のために50%保存が用いられた。重複遺伝子の方向に関わらず、リードがマッチする染色体鎖に基づいてリードのアラインメントが報告されている。基準転写物の反対の鎖に対する単一のヒットは、PRC2結合RNAが基準転写物に対して相補的である、または方向についてアンチセンス鎖(「逆鎖」)であることを意味している。列2のマウスPRC2結合転写物によって、方向に関わらず、標的とされるどのオーバーラップしているrefGene(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)も列7に示される。

0111

表3:二価ドメイン(bivalent domain)と関連のPRC2相互作用転写物
PRC2トランスクリプトームのES細胞の二価ドメイン(bivalent domain)との積集合。この解析のために、Mikkelsenら(2007年)のmm8座標がmm9に変換された。列1は、鎖の方向に関わらず列2のPRC2結合転写物によって標的とされる、オーバーラップするrefGene(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)を示す。PRC2結合転写物の染色体座標(mm9)、ならびにPRC2結合転写物がトップ鎖(プラス鎖)から転写されるのか、またはボトム鎖(マイナス鎖)から転写されるのか示す「+」サインまたは「−」サインが列2に示される。列3はマウスPRC2結合RNAの配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列2のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列2のマウス染色体座標のマウス対ヒトLiftOver(LiftOver解析のために50%保存が用いられた)が、本明細書において記載されるようにUCSCゲノムブラウザにおいて実行されて、列4に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列5は予想されるヒトPRC2結合RNAの配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列3のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。

0112

表4:PRC2結合部位と関連のPRC2相互作用転写物
PRC2トランスクリプトームとES細胞中の既知のSuz12結合部位との積集合。Boyerら(2006年)のmm8座標がmm9に変換された。列1は、鎖の方向に関わらず列2のPRC2結合転写物によって標的とされる、オーバーラップするrefGene(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)を示す。PRC2結合転写物の染色体座標、ならびにPRC2結合転写物がトップ鎖(プラス鎖)から転写されるのか、またはボトム鎖(マイナス鎖)から転写されるのか示す「+」サインまたは「−」サインが列2に示される。列3はマウスPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列2のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列2のマウス染色体座標のマウス対ヒトLiftOver(LiftOver解析のために50%保存が用いられた)が、本明細書において記載されるようにUCSCゲノムブラウザにおいて実行されて、列4に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列5は予想される対応するヒトPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列4のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。

0113

表5:PRC2トランスクリプトームと交わりを持つ長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)ドメイン
PRC2トランスクリプトームのマウス長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)ドメイン (Guttman et al., 2009)との積集合。mm6からmm9への直接的LiftOverがないので、座標がmm6からmm8へ、その後、mm9へ変換された。長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)ドメインのどちらかの鎖に対してヒットが生じうる。PRC2結合転写物の染色体座標、ならびにPRC2結合転写物がトップ鎖(プラス鎖)から転写されるのか、またはボトム鎖(マイナス鎖)から転写されるのか示す「+」サインまたは「−」サインが列1に示される。列2はマウスPRC2結合RNAの配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列1のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列1のマウス染色体座標のマウス対ヒトLiftOver(LiftOver解析のために50%保存が用いられた)が、本明細書において記載されるようにUCSCゲノムブラウザにおいて実行されて、列3に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列4は予想される対応するヒトPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列3のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列1のマウスPRC2結合転写物によって、方向に関わらず、標的とされるオーバーラップしているrefGene(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)は列5に示される。

0114

表6:癌遺伝子座内でのPRC2トランスクリプトームへのヒット
PRC2トランスクリプトームの既知の癌遺伝子座 (cbio.mskcc.org/CancerGenesにおいてオンラインにより入手可能)との積集合。この解析のために、最初にrefGene中の当該の名前の遺伝子を有する同鎖および同染色体上の座標をマージし、次に、大文字の使用を顧慮せずに、癌遺伝子の同一の名前をrefGene中の遺伝子の名前とインターセクトすることにより、ヒト癌遺伝子座がマウス座標にマップされた。列1は、PRC2結合転写物によって標的とされる列6のヒト癌遺伝子に対応するマウス遺伝子の名前を示す。メイン州のバー・ハーバーにあるジャクソン・ラボラトリーのマウスゲノムインフォマティクス内のマウスゲノムデータベース(MGD)(www.informatics.jax.org)から対応するマウスとヒトの遺伝子の名前を獲得した。列1はまたマウス癌遺伝子の染色体鎖を示す(「+」サインは遺伝子がトップ鎖またはプラス鎖から転写されることを示し、「−」サインは遺伝子がボトム鎖またはマイナス鎖から転写されることを示す)。PRC2結合転写物のmm9における染色体位置座標とヌクレオチド座標、ならびにPRC2結合転写物がトップ鎖(プラス鎖)から転写されるのか、またはボトム鎖(マイナス鎖)から転写されるのか示す「+」サインまたは「−」サインが列2に示される。列3はマウスPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列2のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列2のマウス染色体座標のマウス対ヒトLiftOver(LiftOver解析のために50%保存が用いられた)が、本明細書において記載されるようにUCSCゲノムブラウザにおいて実行されて、列4に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列5は予想される対応するヒトPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列4のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列6は、列2のマウスPRC2結合転写物によって標的とされる各マウス癌遺伝子のヒトrefGene名(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)を示す。PRC2結合転写物がrefGeneと反対の鎖にあるとき、それは、PRC2相互作用性RNAが基準癌遺伝子に対して相補的である、または方向についてアンチセンス鎖(「逆鎖」)であることを意味している。PRC2相互作用転写物は必ずしもrefGeneそのものである必要はなく、位置についてrefGeneとオーバーラップする別個の転写物であることに留意すること。癌遺伝子と関連がある癌は列7に示されている。

0115

表7:腫瘍抑制遺伝子座内でのPRC2トランスクリプトームへのヒット
PRC2トランスクリプトームの既知の腫瘍抑制遺伝子座 (cbio.mskcc.org/CancerGenesにおいてオンラインにより入手可能)との積集合。この解析のために、ヒト腫瘍抑制遺伝子座が表6の癌遺伝子と同じ方法でマウス座標にマップされた。その表は表6の凡例において説明されているように構成されている。列1は、PRC2結合転写物によって標的とされる列6のヒト腫瘍抑制遺伝子に対応するマウス腫瘍抑制遺伝子を示す。メイン州のバー・ハーバーにあるジャクソン・ラボラトリーのマウスゲノムインフォマティクス内のマウスゲノムデータベース(MGD)(www.informatics.jax.org)から対応するマウスとヒトの遺伝子の名前を獲得した。列1はまたマウス腫瘍抑制遺伝子の染色体鎖を示す(「+」サインは遺伝子がトップ鎖またはプラス鎖から転写されることを示し、「−」サインは遺伝子がボトム鎖またはマイナス鎖から転写されることを示す)。PRC2結合転写物のmm9における染色体位置座標とヌクレオチド座標、ならびにPRC2結合転写物がトップ鎖(プラス鎖)から転写されるのか、またはボトム鎖(マイナス鎖)から転写されるのか示す「+」サインまたは「−」サインが列2に示される。列3はマウスPRC2結合RNAの配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列2のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列2のマウス染色体座標のマウス対ヒトLiftOver(LiftOver解析のために50%保存が用いられた)が、本明細書において記載されるようにUCSCゲノムブラウザにおいて実行されて、列4に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列5は予想される対応するヒトPRC2結合転写物の配列番号を示す(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、列4のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列)。列6は、列2のマウスPRC2結合転写物によって標的とされる各腫瘍抑制遺伝子のヒトrefGene名(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)を示す。

0116

表8:PRC2トランスクリプトームと別表Iにおいてリードを重ね合わせることにより作成されたピークの標的遺伝子との積集合
別表Iにおける配列リード(実施例1〜2に従ってcDNAをシーケンシングすることにより得られた)はRNA免疫沈降法の間に内在性のヌクレアーゼから保護された領域を表し、したがって、PRC2に結合するRNAの領域を表す。上記のように、別表Iは2010年12月20日に提出された米国特許仮出願第61/425,174号に現れ、本明細書に添付されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。WTとヌルで3:1に濃縮され、そして、0.4という最小RPKM値を示す、別表Iのこれらの配列リードが重ねあわされて、本明細書において「ピーク」と称される配列のより長い連続領域が作成される。マウスのピークの対応するヌクレオチド配列(TをUで置換することによりRNAに変換される)が配列表中に配列番号21583〜124436、または配列番号190717〜190933または配列番号191088として現れる。これらのマウスピークのマウス染色体座標および染色体鎖のマウス対ヒトLiftOverが、本明細書において記載されるようにUCSCゲノムブラウザにおいて実行されて、オルソロガスなヒト染色体座標を作成した。それぞれ対応するヒトピークRNA配列(すなわち、TをUで置換することによりRNAに変換される、ヒト染色体座標と染色体鎖のヌクレオチド配列)は配列表中に配列番号124437〜190716または配列番号190934〜191086または配列番号191087として現れる。

0117

PRC2結合RNAによって標的とされる遺伝子(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)を同定するために、NCBIのrefGeneデータベースに由来する公知の遺伝子とこれらのヒトでのピークとヒトPRC2トランスクリプトーム(すなわち、表1〜7に記載されたPRC2結合転写物のヒト配列)をインターセクトした。同様に、PRC2結合RNAによって標的とされる遺伝子(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子)を同定するために、NCBIのrefGeneデータベースに由来する公知の遺伝子と表1〜7のマウスでのピークとマウスPRC2トランスクリプトームをインターセクトした。

0118

列1および2は、(a)ヒトPRC2結合転写物、(b)PRC2結合RNA内のヒトピーク配列、(c)マウスPRC2結合転写物、および(d)PRC2結合RNA内のマウスピーク配列の全ての配列の配列番号を示すが、それらは列3に示されるNCBI遺伝子(すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子である)を標的とする。列3はNCBI遺伝子の名前と唯一のNCBI遺伝子ID番号(米国国立医学図書館、国立生物工学情報センター;第19章、Entrez Gene:遺伝子のディレクトリー、 www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)を示す。ヒト遺伝子の名前は全て大文字として現れるが、マウス遺伝子の名前は最初の1文字のみが大文字で現れる。

0119

列1は、基準NCBI遺伝子と同じ鎖から転写される「同鎖」PRC2結合RNAの配列番号を示す(例えば、NCBI遺伝子が染色体のマイナス鎖から転写される場合、PRC2結合RNAもまたマイナス鎖から転写される)。列2は、基準NCBI遺伝子と比較して反対の鎖、またはアンチセンス鎖から転写される「逆鎖」PRC2結合RNAの配列番号を示す。配列番号1から21582まで、または配列番号191089から192972までは転写物を表すが、配列番号21583から191088まではピークを表す。

0120

列1および2において、(a)転写物座標またはピーク座標と(b)NCBI遺伝子座標の間の重複程度が角括弧中に現れている。正の数は2つの間でオーバーラップするヌクレオチドの数を示し、そして、負の数は2つの間でのギャップのサイズ(すなわち、2つの間で離れているヌクレオチドの数)を表す。ピークについて、角括弧内の「F」は、ピーク座標が遺伝子座標と完全に重なることを示す。転写物について、角括弧内の「F」は、転写物座標が遺伝子座標と完全に重なること、またはその逆を示す。

0121

表9:PRC2結合RNAの部類、RNAによって標的とされる遺伝子、および疾患の治療における使用法
列1はNCBI遺伝子の名前と唯一の遺伝子IDを示す。列2は、遺伝子の機能的グループおよびこれらの遺伝子に関係があり、そして、それらの発現を調節することにより治療され得る疾患、障害または病気の部類である。列3はNCBI由来の遺伝子の説明である。

0122

その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2010年12月20日に提出された米国特許仮出願第61/425,174号の別表Iは完全なRIP‐シークエンシングデータセットの表であり、そのデータセット中のリードの全てを示す。別表Iは本明細書に添付されてはいない。別表Iにおける配列リードはイルミナGA‐IIゲノムアナライザーから直接由来するものであり、PRC2結合転写物の逆相補鎖の方向である。別表Iは、バイオインフォマティクスの選別がアダプター/プライマーダイマー、ミトコンドリアRNA、rRNAホモポリマ未確定性ヌクレオチドを有するリード、および短縮型リード(15ヌクレオチド未満)を除去した後のリード全ての選別済みサブセットである。

0123

詳細な説明
本明細書に記載のRNA免疫沈降(RIP)‐シークエンシング技術が、PRC2複合体と結合する長鎖転写物(>200nt)のゲノムワイドなプールを捕捉するために直接または間接的に使用された。本明細書に記載のPRC2トランスクリプトームは、マウストランスクリプトーム全体の実際の大きさに応じて、おそらくマウスの発現した配列の5〜25%を占める、マウスES細胞内の約10000のRNAからなる。トランスクリプトームの特性は、今後、バイオマーカーおよび治療標的として使用され得る、数十のインプリント遺伝子座、数百の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子座および多数の幹細胞関連ドメインを含む、医学的に重要な標的のクラスを特定している。マウスPRC2−転写物の全てではないにしても多くはヒトエピゲノムの直接の対応物を有する。

0124

本明細書に実証されるように、少なくともRNAのサブセットはインビボでポリコームタンパク質と相互作用し、多くの場合、相互作用するサブユニットはEzh2である。最近の研究では、Suz12もRNAと相互作用することが示されている(Kanhere et al., 2010)。細菌性バキュロウイルスにより生成されたサブユニットとの間の違いは、結合特性の効果を有する転写後修飾物を生じることである。しかし、PRC2の多数のサブユニットをRNAにより制御することができ(特に、ともに核酸結合モチーフを有する、Ezh2およびSuz12)、これにより、PRC2サブユニット間の結合、クロマチンのPRC2の結合親和性および/またはEzh2触媒速度を調節することができる。このシナリオは、ポリコームを制御するRNAにより可能性のある機構の数を増幅する。本試験は、RIP‐シークエンシングに、特にPRC2複合体の一部として使用されるおとりであるEzh2の何千ものRNA補因子を示唆する。本発明者らの知る限り、Ezh2は、標識されたEzh2を使用する生化学的精製としてポリコーム複合体に存在するのみであり、ポリコーム関連ポリペプチドのみを特定し(Li et al., 2010)、PRC2の他のサブユニットをノックアウトすることによりEzh2の急速な分解を生じる(Pasini et al., 2004; Montgomery et al., 2005; Schoeftner et al., 2006)。

0125

シスおよびトランスの機構はともに、PRC2トランスクリプトームのRNAにより使用され得る。HOTAIRがトランスで作用することが前提であったが(Rinn et al., 2007; Gupta et al.)、トランスクリプトームの多くのアンチセンス転写物は、Tsixなどの多くがシスで重複または結合されたコード遺伝子座にPRC2を指向することにより機能し得ることが示唆されている。本明細書において、シスでH3K27トリメチル化を指向するDlk1遺伝子座にPRC2と結合し、標的とする結合RNAであるGtl2の例を挙げる。

0126

本明細書に挙げる証拠により、RNA補因子がポリコーム制御の一般的特徴であり、PRC2トランスクリプトームのRNAを標的とする本明細書の記載の抑制性核酸が恐らくPRC2関連抑制を阻害することにより遺伝子発現を上方制御することに成功することができることが実証されている。アンチセンス鎖の配向または同鎖の配向のいずれかにおいて、およびPRC2結合RNAの配置から1kb以上伸長する場合に、シスで遺伝子を制御することができる。RNAによる制御は、ポリコームタンパク質に特異的である必要はない。RIP‐シークエンシング技術を利用し、他のクロマチン修飾因子のRNA補因子を特定することができ、異なる細胞型は発達プロフィールと一致した個別のトランスクリプトームを有する。PRC2などのクロマチン修飾因子は幹細胞の多能性を維持する中心的な役割を果たし、癌において、制御RNAのゲノムワイドなプロフィールが疾患の診断および処置を求める中で貴重な手助けとなるだろう。

0127

RIP‐シークエンシング、長鎖非コードRNAを生成する方法
本明細書において、lncRNAのライブラリーを生成する方法について記載する。このような方法を使用して、PRC2複合体のEzh2部分と結合するRNAを特定したが、他のPRC2サブユニットまたは関連のタンパク質との接触は排除されていない。いくつかの実施形態において、このような方法は、図1Aに示されるステップを含み、当業者であれば、他の技法と示されるものと置き換えることができることが理解されるだろう。

0128

いくつかの実施形態において、その方法には、細胞核性リボ核酸(「nRNA」)を含む試料、例えば核溶解物を含む、例えば核タンパク質に結合するnRNAを含む試料を得、試料と物質、例えば細胞核性リボ核酸に結合すると知られており、または疑われる核タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させることを含む。細胞核性リボ核酸に結合すると知られており、または疑われる核タンパク質のいくつかの例として、Ezh2(Zhao et al., Science. 2008 Oct 31;322(5902):750-6; Khalil et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jul 14;106(28):11667-72. Epub 2009 Jul 1)、G9a(Nagano et al., Science. 2008 Dec 12;322(5908):1717-20. Epub 2008 Nov 6)およびCbx7(Yap et al., Mol Cell. 2010 Jun 11;38(5):662-74)が挙げられる。

0129

いくつかの実施形態において、前記方法は、物質とタンパク質との間で複合体を形成するために十分な条件下で適用され、以下の一部または全てを含む:複合体の単離、nRNAに相補的なDNAを合成し、cDNAの初期集団を得、必要であれば、鎖特異的プライマーを使用したPCR増幅、cDNAの初期集団を精製し、長さが少なくとも20ヌクレオチド(nt)であるcDNAの精製集団を得、そして、精製したcDNAの集団のハイスループットシークエンシングを行う。ホモポリマーのリードが選別され、ミトコンドリアゲノムおよびリボソームRNAとアラインするリードを次の分析全てから除外する。基準ゲノムに1以下のミスマッチでアラインするリードを保持し、ミトコンドリアゲノムおよびリボソームRNAにアラインするリードであるホモポリマーは除外する。次いで、可能性の高いPRC2相互作用転写物を2つの基準、すなわち(1)候補転写物がRPKMに関して(百万のリード毎のキロベース当たりのリード数)で最小リード量を有し、および/または(2)候補転写物が適切な対照ライブラリー(例えば、タンパク質−ヌルライブラリーまたは並行して行われたIgGプルダウンから作製されたライブラリー)に対して野生型ライブラリーにおいて増加されることに基づき分類する。

0130

一般に、RIP‐シークエンシングライブラリーを構築するため、細胞核を調製し、デオキシリボヌクレアーゼで処理し、対照IgG反応を並行して行うとともに、対象のクロマチン関連因子に対して指向された抗体とインキュベーションする。次いでRNAタンパク質複合体アガロースビーズ磁性ビーズまたは溶液中もしくは固体マトリクス上の任意の他のプラットフォーム(例えば、カラムマイクロ流体デバイス)を用いて免疫沈降させる。標準的な技法を使用してRNAを抽出する。全てのRNA(ポリA RNAだけではない)を捕捉し、鎖情報を保存するため、非対称なプライマーを使用し、RNAテンプレートからcDNAを生成し、この場合、ファーストストランドcDNAを作製する第1アダプター(アダプター1)は3’末端にランダムマルチマー配列(例えば、ランダムヘキサマー)を含有する。逆転写酵素を使用して、ファーストストランドを作製する。別個の第2アダプター(アダプター2)を使用してセカンドストランドを作製する。一例は以下の通りである:Superscript IIを使用する場合、非テンプレートCCC3’オーバーハングを追加し、次いで、その非テンプレートCCCオーバーハングにアニーリングするGGGを3’末端に含む第2アダプターにハイブリダイズするようにそれを使うことができる。セカンドストランドを作製する他の方法と置き換えることができる。次いで、アダプター1およびアダプター2に特異的なプライマーペアを使用するPCRを行ってcDNAを合成し、ハイスループットシークエンシングの標準的な方法により生成物の配列を決定した。シークエンシングの前に、(例えば、NuSieveアガロースゲルまたはアクリルアミドゲルでの)ゲル電気泳動または例えば、マイクロ流体デバイスもしくは標準的な生化学用カラムでの精製などの他の精製方法による分離後に所望のサイズのRNAまたはcDNAを切り出すサイズ選択ステップを(所望の場合)組み込むことができる。

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