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図面 (20)

課題

改善された造血幹細胞および前駆細胞療法を提供すること。

解決手段

本発明は、細胞療法の改善法を提供する。特に、本発明は、生着特性およびホーミング特性が改善、改変された造血幹細胞および/または前駆細胞による治療用組成物、ならびに治療用組成物を作製する方法を提供する。本発明は、造血幹細胞移植および前駆細胞移植の有効性を改善する方法であって、造血系再構築を必要とする被験体に治療用組成物を移植するステップ包含する方法もさらに提供する。一実施形態において、本発明は、少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物を提供する。

概要

背景

関連技術の説明
再生医療とは、体内の特定の細胞組織、および臓器修復するかまたは回復させるための処置を開発する医療研究の分野である。究明されている再生療法の1つの側面は、増え続ける一連がんおよび変性障害を処置するための造血幹細胞移植の使用である。米国国立骨髄ドナープログラム登録商標)(NMDP)によれば、致死性悪性疾患および非悪性疾患を伴う患者を処置するために、毎年世界中で、約20,000例の同種異系造血細胞移植を含めた、推定45,000〜50,000例の造血細胞移植(骨髄移植末梢血幹細胞PBSC)移植、または臍帯血移植)が実施されている(非特許文献1)。さらに、毎年約4,800例の患者が、NMDPを介する非血縁ドナーまたは臍帯血ユニット(cord blood unit)を用いて移植を受けている。

1987年の創始以来、NMDPは、患者に第2の生存チャンスを与えるために、38,000例を超える骨髄移植および臍帯血移植を推進してきた。従来は、多様な種類の白血病貧血リンパ腫骨髄腫免疫不全障害、および充実性腫瘍、例えば、乳がんおよび卵巣がんを患う患者を処置するのに、骨髄からの造血幹細胞移植が用いられた。しかし、骨髄移植は、ドナーにとって苦痛であり、さらに、とりわけ、特定の民族集団において必須の程度のHLAドナー適合組織を見出すことは、しばしば困難であり、かつ時間を要する。加えて、同種異系の骨髄移植は、移植片対宿主病(GVHD)の著明発症率と関連することが多い。

多くの場合、造血幹細胞移植を受ける患者は、致死性の進行がんまたは他の代謝性障害を有する。したがって、適切に適合したHLA組織型を有するドナーを見出すのに遅延が生じると、患者の転帰(outcome)が損なわれる可能性があり、しばしば致死性をもたらす。したがって、近年、NMDPによる非血縁ドナー移植数の増大は、とりわけ劇的であり、2008年における4,300例と比較して、2009年だけでも4,800例を超える移植がなされている。加えて、非血縁ドナーまたは臍帯血ユニットを用いる同種異系移植比率も、着実に増大している。2006年には、世界中で実施された同種異系移植のうちの3分の1超において、非血縁ドナーが用いられた。2009年には、成人ドナーのうちの75%(2,800例を超える)が、NMDPを介して患者にPBSCを提供した。2009年には、NMDPにより1,056例の臍帯血移植が推進されたが、これは、2009年におけるNMDPによる総移植数のうちの22%を占める。これは、NMDPが898例の臍帯血移植を推進した2008年より18%の増大である。

臍帯血は容易に入手可能であり、レシピエントに対する移植片対宿主病の危険性が低く、ドナーにとって痛みがなく、ドナーとレシピエントとの間におけるHLA組織型の適合がそれほど必要とされないために、臍帯血を用いる同種異系の造血幹細胞移植が実施されている。

しかし、臍帯血移植に由来する造血幹細胞および前駆細胞生着(engraft)しえない危険性を含め、ヒト臍帯血移植を用いることには2〜3の欠点が存在することが認知されている。

臍帯血移植を用いることの別の欠点は、患者において臍帯血細胞が生着するのにより長時間を要し、これにより、患者を感染症の高い危険性に置くことである。加えて、臍帯血移植は、より新規な処置アプローチである。したがって、医療者は、臍帯血移植後における患者の長期にわたる成果について、骨髄移植について有するほど多くの情報を有さないために、臍帯血移植を用いることを思いとどまらせる場合がある。さらに、臍帯血移植はまた、骨髄移植および末梢血移植と全く同じ危険性も有する。

加えて、臍帯血をヒト血液移植のための細胞供給源として用いることに対する著明な障壁は、患者のサイズに対して、または特定の適応を処置するのに、単一の臍帯血ユニット中の血液形成細胞では十分でないことが多いことでもある。単一の臍帯のサイズ(すなわち、単一の臍帯中の血液形成細胞数)は、血液移植に不十分であることが多いため、2つの臍帯が必要とされる場合があり、このことは、GVHDおよび生着失敗の危険性を増大させる。したがって、多くの手法が、単離された移植片内における臍帯血中のヒト造血幹細胞および前駆細胞の数を、ex vivoの環境で増大させようと試みており、これにより、単一の臍帯を用いる移植が可能となる可能性もあるが、これらの努力が収めた成功は限定されたものである。

したがって、部分的には、有望な動物モデルプロトコールをヒトにおける臨床実践へと移行させるのが困難であること、既存の臨床プロトコールの有効性が低いこと、合併症、例えば、移植片対宿主病の発症率が高いこと、および十分に適合したドナーが比較的少ないことのために、回復または再生のための造血幹細胞療法の見込みは実感されていない。

概要

改善された造血幹細胞および前駆細胞療法を提供すること。本発明は、細胞療法の改善法を提供する。特に、本発明は、生着特性およびホーミング特性が改善、改変された造血幹細胞および/または前駆細胞による治療用組成物、ならびに治療用組成物を作製する方法を提供する。本発明は、造血幹細胞移植および前駆細胞移植の有効性を改善する方法であって、造血系再構築を必要とする被験体に治療用組成物を移植するステップ包含する方法もさらに提供する。一実施形態において、本発明は、少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物を提供する。なし

目的

本発明は、これらの問題に対する解決法を提供し、当業者に明らかとなる他の使用および利点もさらに提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

明細書中に記載される発明。

技術分野

0001

関連出願
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2010年8月12日に出願された米国仮特許出願第61/373,212号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。

0002

技術分野
本発明は一般に、細胞療法に関する。特に、本発明は、造血系のための細胞療法の改善に関する。より具体的に述べると、本発明は、個体の造血系を再構築するための改善法に関する。

背景技術

0003

関連技術の説明
再生医療とは、体内の特定の細胞組織、および臓器修復するかまたは回復させるための処置を開発する医療研究の分野である。究明されている再生療法の1つの側面は、増え続ける一連がんおよび変性障害を処置するための造血幹細胞移植の使用である。米国国立骨髄ドナープログラム登録商標)(NMDP)によれば、致死性悪性疾患および非悪性疾患を伴う患者を処置するために、毎年世界中で、約20,000例の同種異系造血細胞移植を含めた、推定45,000〜50,000例の造血細胞移植(骨髄移植末梢血幹細胞PBSC)移植、または臍帯血移植)が実施されている(非特許文献1)。さらに、毎年約4,800例の患者が、NMDPを介する非血縁ドナーまたは臍帯血ユニット(cord blood unit)を用いて移植を受けている。

0004

1987年の創始以来、NMDPは、患者に第2の生存チャンスを与えるために、38,000例を超える骨髄移植および臍帯血移植を推進してきた。従来は、多様な種類の白血病貧血リンパ腫骨髄腫免疫不全障害、および充実性腫瘍、例えば、乳がんおよび卵巣がんを患う患者を処置するのに、骨髄からの造血幹細胞移植が用いられた。しかし、骨髄移植は、ドナーにとって苦痛であり、さらに、とりわけ、特定の民族集団において必須の程度のHLAドナー適合組織を見出すことは、しばしば困難であり、かつ時間を要する。加えて、同種異系の骨髄移植は、移植片対宿主病(GVHD)の著明発症率と関連することが多い。

0005

多くの場合、造血幹細胞移植を受ける患者は、致死性の進行がんまたは他の代謝性障害を有する。したがって、適切に適合したHLA組織型を有するドナーを見出すのに遅延が生じると、患者の転帰(outcome)が損なわれる可能性があり、しばしば致死性をもたらす。したがって、近年、NMDPによる非血縁ドナー移植数の増大は、とりわけ劇的であり、2008年における4,300例と比較して、2009年だけでも4,800例を超える移植がなされている。加えて、非血縁ドナーまたは臍帯血ユニットを用いる同種異系移植比率も、着実に増大している。2006年には、世界中で実施された同種異系移植のうちの3分の1超において、非血縁ドナーが用いられた。2009年には、成人ドナーのうちの75%(2,800例を超える)が、NMDPを介して患者にPBSCを提供した。2009年には、NMDPにより1,056例の臍帯血移植が推進されたが、これは、2009年におけるNMDPによる総移植数のうちの22%を占める。これは、NMDPが898例の臍帯血移植を推進した2008年より18%の増大である。

0006

臍帯血は容易に入手可能であり、レシピエントに対する移植片対宿主病の危険性が低く、ドナーにとって痛みがなく、ドナーとレシピエントとの間におけるHLA組織型の適合がそれほど必要とされないために、臍帯血を用いる同種異系の造血幹細胞移植が実施されている。

0007

しかし、臍帯血移植に由来する造血幹細胞および前駆細胞生着(engraft)しえない危険性を含め、ヒト臍帯血移植を用いることには2〜3の欠点が存在することが認知されている。

0008

臍帯血移植を用いることの別の欠点は、患者において臍帯血細胞が生着するのにより長時間を要し、これにより、患者を感染症の高い危険性に置くことである。加えて、臍帯血移植は、より新規な処置アプローチである。したがって、医療者は、臍帯血移植後における患者の長期にわたる成果について、骨髄移植について有するほど多くの情報を有さないために、臍帯血移植を用いることを思いとどまらせる場合がある。さらに、臍帯血移植はまた、骨髄移植および末梢血移植と全く同じ危険性も有する。

0009

加えて、臍帯血をヒト血液移植のための細胞供給源として用いることに対する著明な障壁は、患者のサイズに対して、または特定の適応を処置するのに、単一の臍帯血ユニット中の血液形成細胞では十分でないことが多いことでもある。単一の臍帯のサイズ(すなわち、単一の臍帯中の血液形成細胞数)は、血液移植に不十分であることが多いため、2つの臍帯が必要とされる場合があり、このことは、GVHDおよび生着失敗の危険性を増大させる。したがって、多くの手法が、単離された移植片内における臍帯血中のヒト造血幹細胞および前駆細胞の数を、ex vivoの環境で増大させようと試みており、これにより、単一の臍帯を用いる移植が可能となる可能性もあるが、これらの努力が収めた成功は限定されたものである。

0010

したがって、部分的には、有望な動物モデルプロトコールをヒトにおける臨床実践へと移行させるのが困難であること、既存の臨床プロトコールの有効性が低いこと、合併症、例えば、移植片対宿主病の発症率が高いこと、および十分に適合したドナーが比較的少ないことのために、回復または再生のための造血幹細胞療法の見込みは実感されていない。

先行技術

0011

Horowitz MM.、「Uses and Growth of Hematopoietic Cell Transplantation」、Blume KG、Forman SJ、Appelbaum FR編、「Thomas’Hematopoietic Cell Transplantation」、3版、Malden、Mass:Blackwell;2004年:9〜15頁

発明が解決しようとする課題

0012

したがって、当技術分野では、造血幹細胞移植の適用可能性を拡大し、その成功を増大させるために、造血幹細胞および前駆細胞の骨髄への生着の効率を高めうる方法が必要とされている。本発明は、これらの問題に対する解決法を提供し、当業者に明らかとなる他の使用および利点もさらに提供する。

課題を解決するための手段

0013

本発明は、改善された造血幹細胞移植法および前駆細胞移植法を提供する。さらに、本発明は、生着/生着の潜在能を増大させ、かつ/または増殖を増大させた、優れた造血幹細胞または前駆細胞の調製物も提供する。多様な実施形態では、細胞を、in vivoにおいて増殖させる(expandedまたはproliferated)。他の多様な実施形態では、細胞をex vivoにおいて処理し、被験体投与し、in vivoにおいて増殖させる(expandedまたはproliferated)。

0014

一態様では、本発明は、少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、a)造血幹細胞または前駆細胞が、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触しており、b)造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、c)治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌治療的に許容される懸濁液を含む、治療用組成物を提供する。

0015

具体的な実施形態では、治療用組成物の造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約3倍増大している。

0016

一実施形態では、細胞集団が、CD34+細胞の収集物を含み、CD34+細胞の収集物におけるCXCR4の遺伝子発現が、CD34+細胞の接触していない収集物と比較して少なくとも約3倍増大している。

0017

別の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して約3倍〜約8倍増大している。

0018

治療用組成物のなお別の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約4倍増大している。

0019

治療用組成物のなお別の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約6倍増大している。治療用組成物のさらに別の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約7倍増大している。

0020

治療用組成物の別の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約8倍増大している。治療用組成物のなお別の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約10倍増大している。

0021

本発明のさらに別の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約12倍増大している。

0022

本発明の付加的な実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約16倍増大している。

0023

一部の実施形態では、治療用組成物を構成する造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して約8〜約18倍増大している。

0024

本発明の多様な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤が、cAMPエンハンサー、Gα−s活性化因子、およびPGE2EP4受容体に選択的に結合する化合物からなる群より選択される。

0025

具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤が、PGE2、またはPGE2類似体もしくはPGE2誘導体である。より具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤が、16,16−ジメチルPGE2である。

0026

本発明の治療用組成物の一実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、少なくとも約1時間にわたり薬剤と接触させている。多様な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、約1時間〜約6時間にわたり薬剤と接触させている。具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、約2時間〜約6時間にわたり薬剤と接触させている。より具体的な実施形態では、治療用組成物に含まれる造血幹細胞または前駆細胞を、約2時間にわたり薬剤と接触させている。

0027

本発明の具体的な実施形態では、治療用組成物に含まれる造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、1または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における1または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質EM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(amphiregulin)(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、およびFos関連抗原2(FOSL2)からなる群より選択される。

0028

より具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも2つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における2つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも5、10、15、または20倍増大している。より具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大している。

0029

多様な実施形態では、治療用組成物に含まれる細胞集団が、約0.10、0.50、1.0、3、5、10、15、20、または30%未満のCD34+細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団が、少なくとも約0.01%かつ約50%以下のCD34+細胞を含む。

0030

一部の実施形態では、細胞集団をex vivoにおいて増殖させない。

0031

多様な実施形態では、治療用組成物を、細胞集団を培養せずにポイントオブケア(point−of−care)で生成させ、患者に投与する。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与して24時間以内に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与して12時間以内に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与して6時間以内に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、組成物の注入日に生成させる。

0032

一部の実施形態では、治療用組成物が、薬剤を実質的に含まない。多様な実施形態では、治療用組成物が、5%ヒト血清アルブミンおよびデキストラン溶液中に懸濁させた造血幹細胞または前駆細胞を含む。

0033

一部の実施形態では、治療用組成物が、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の間葉系幹細胞を含む。具体的な実施形態では、治療用組成物が、約10%以下の間葉系幹細胞を含む。

0034

一部の実施形態では、治療用組成物が、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の内皮前駆細胞を含む。具体的な実施形態では、治療用組成物が、約10%以下の内皮前駆細胞を含む。

0035

本発明の具体的な実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのCD34について陽性である細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の、CD73、CD140B、CD14、およびVWFからなる群より選択される細胞表面マーカーについて陽性である細胞を含む。

0036

具体的な実施形態では、本発明の治療用組成物に含まれる細胞集団は、CD34+細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満のCD14+/CD45−細胞を含む。本発明の他の実施形態では 、細胞集団が、CD34+細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満のVWF+細胞を含む。本発明の他の実施形態では 、細胞集団が、CD34+細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満のCD140B+細胞を含む。

0037

より具体的な実施形態では、細胞集団が、CD34+造血幹細胞または前駆細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の、CD14+/CD45−細胞、VWF+細胞、CD73+細胞、およびCD140B+細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのCD34について陽性であり、CD14、VWF、CD73、およびCD140Bからなる群より選択される少なくとも1つの細胞表面マーカーについて陰性である。他の実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのCD34について陽性であり、細胞表面マーカーのCD14、VWF、CD73、およびCD140Bについて陰性である。

0038

本発明の多様な実施形態では、細胞集団内の細胞のうちの少なくとも約15%が、CXCR4タンパク質を発現する。

0039

一部の実施形態では、細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血(mobilized peripheral blood)から得られる。

0040

具体的な実施形態では、細胞集団がHLAハプロタイピング(HLA haplotyped)されている。より具体的な実施形態では、細胞集団が、HLA−A、HLA−B、HLA−C、およびHLA−DRB1からなる群に基づきHLAハプロタイピングされている。一部の実施形態では、HLAハプロタイピングされている細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する。一部の実施形態では、HLAハプロタイピングされている細胞集団が、6つのHLAのうちの4つで特定のヒト被験体と適合する。

0041

別の実施形態では、本発明が、少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、a)造血幹細胞または前駆細胞が、ex vivoにおいて、約37℃の温度で約2時間にわたり、16,16−dmPGE2と接触しており、b)造血幹細胞または前駆細胞が、CD34+細胞の収集物を含み、CD34+細胞の収集物におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していないCD34+細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約3倍増大しており、c)治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、治療用組成物を提供する。

0042

一部の実施形態では、細胞集団が、CD34+細胞の収集物を含み、CD34+細胞の収集物におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していないCD34+細胞の収集物と比較して少なくとも約3倍増大している。

0043

多様な実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して約3倍〜約8倍増大している。より具体的な実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約4倍増大している。

0044

他の具体的な実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約6倍増大している。他の具体的な実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約7倍増大している。さらなる実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約8倍増大している。他の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約10倍増大している。他の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約12倍増大している。他の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約16倍増大している。他の実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して約8〜約18倍増大している。

0045

一部の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、1または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における1または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、およびFos関連抗原2(FOSL2)からなる群より選択される。

0046

他の実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも2つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における2つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも5、10、15、または20倍増大している。

0047

具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大している。

0048

他の実施形態では、細胞集団が、約0.10、0.50、1.0、3、5、10、15、20、または30%を超えるCD34+細胞を含まない。より具体的な実施形態では、細胞集団が、少なくとも約0.01%かつ約50%以下のCD34+細胞を含む。

0049

多様な実施形態では、細胞集団をex vivoにおいて増殖させない。

0050

具体的な実施形態では、細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる。

0051

一部の実施形態では、細胞集団がHLAハプロタイピングされている。

0052

別の実施形態では、本発明は、少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含むハプロタイピングされている細胞集団を含む治療用組成物であって、a)造血幹細胞または前駆細胞が、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触しており、b)造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、c)治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、治療用組成物を提供する。

0053

具体的な実施形態では、ハプロタイピングされている細胞集団が、HLA−A、HLA−B、HLA−C、およびHLA−DRB1からなる群に基づきハプロタイピングされている。より具体的な実施形態では、ハプロタイピングされている細胞集団が、HLA−DRB3/4/5、HLA−DQB1、およびDPB1からなる群に基づきハプロタイピングされている。一部の実施形態では、ハプロタイピングされている細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する。多様な実施形態では、HLAハプロタイピングされている細胞集団が、6つのHLAのうちの4つで特定のヒト被験体と適合する。

0054

一部の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約3倍増大している。具体的な実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現と比較して約3倍〜約8倍増大している。他の具体的な実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約4倍増大している。

0055

具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤が、cAMP類似体またはcAMPエンハンサー、Gα−s活性化因子、およびPGE2EP4受容体に選択的に結合する化合物からなる群より選択される。より具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤が、16,16−ジメチルPGE2である。

0056

多様な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、約1時間〜約6時間にわたり薬剤と接触させている。

0057

一部の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、1または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における1または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、およびFos関連抗原2(FOSL2)からなる群より選択される。

0058

具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも2つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における2つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも5、10、15、または20倍増大している。

0059

他の実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大している。他の実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約4倍増大している。他の実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約6倍増大している。

0060

なお他の実施形態では、細胞集団が、約0.10、0.50、1.0、3、5、10、15、20、または30%未満のCD34+細胞を含む。

0061

より具体的な実施形態では、細胞集団が、少なくとも約0.01%かつ約50%以下のCD34+細胞を含む。

0062

一部の実施形態では、細胞集団をex vivoにおいて増殖させない。

0063

他の実施形態では、治療用組成物を、細胞集団を培養せずにポイントオブケアで生成させ、患者に投与する。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与する約24時間前より後に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与する約12時間前より後に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与する約6時間前より後に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、組成物の注入日に生成させる。

0064

他の実施形態では、治療用組成物に含まれる細胞集団を、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得る。

0065

別の実施形態では、本発明が、部分的に、造血幹細胞移植または前駆細胞移植において用いられる治療用組成物を調製する方法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoまたはin vitroにおいて、約37℃の温度で、造血幹細胞または前駆細胞の遺伝子発現を改変するのに十分な条件下で接触させるステップを含み、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して、以下の遺伝子:ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、またはCXCケモカイン受容体4(CXCR4)のうちの1または複数の発現の増大を含む遺伝子発現シグネチャーを含む造血幹細胞または前駆細胞を結果としてもたらす、方法を意図する。

0066

別の実施形態では、本発明が、部分的に、被験体における造血幹細胞または前駆細胞の生着を増大させる方法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、PGE2およびdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を洗浄して薬剤を実質的に除去するステップと、接触させた細胞集団を被験体に投与するステップとを含み、被験体における接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、細胞集団を薬剤と接触させる、方法を意図する。

0067

一実施形態では、本発明が、部分的に、造血系再構築(hematopoietic system reconstruction)を必要とする被験体を処置する方法であって、造血系再構築を必要とする被験体を選択するステップと、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、PGE2およびdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を洗浄して薬剤を実質的に除去するステップと、接触させた細胞集団を被験体に投与するステップとを含み、細胞集団を、被験体における接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、薬剤と接触させ、これにより、造血系再構築を必要とする被験体を処置する方法を意図する。

0068

付加的な実施形態では、本発明が、部分的に、造血系再構築を必要とする被験体を処置する方法であって、造血系再構築を必要とする被験体を選択するステップと、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、約37℃の温度で、プロスタグランジンE2(PGE2)またはdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を洗浄して薬剤を実質的に除去するステップと、接触させた細胞集団を被験体に投与するステップとを含み、被験体における接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、細胞集団を薬剤と接触させ、これにより、造血系再構築を必要とする被験体を処置する、方法を意図する。

0069

さらなる実施形態では、本発明が、部分的に、in vivoにおいて造血幹細胞または前駆細胞の増殖を増大させるための細胞集団を調製する方法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoまたはin vitroにおいて、約37℃の温度で、プロスタグランジンE2(PGE2)またはdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップを含み、in vivoにおける接触させた造血幹細胞または前駆細胞の増殖を、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、細胞集団を薬剤と接触させる、方法を意図する。

0070

本発明の方法の具体的な実施形態では、細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる。

0071

本発明の他の具体的な実施形態では、dmPGE2活性を有する薬剤が、dmPGE2、cAMP類似体もしくはcAMPエンハンサー、またはGα−s活性化因子である。

0072

特定の実施形態では、薬剤がPGE2またはその類似体である。

0073

特定の具体的な実施形態では、PGE2類似体が16,16−ジメチルPGE2である。

0074

他の具体的な実施形態では、薬剤がcAMPエンハンサーである。

0075

本発明の特定の実施形態では、接触させた造血幹細胞または前駆細胞集団の遺伝子発現を改変する、生着または生着の潜在能を増大させる、または増殖を増大させるのに十分な条件が、細胞集団を、約1時間〜約6時間にわたり、1または複数の薬剤と接触させることを含み、薬剤のうちの少なくとも1つが、造血幹細胞または前駆細胞におけるPGE2R2またはPGE2R4のシグナル伝達を増大させる薬剤を含む。特定の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、約37℃の温度で、約2時間にわたり、約10μMの濃度の、造血幹細胞または前駆細胞におけるPGE2R2またはPGE2R4のシグナル伝達を増大させる薬剤と接触させる。

0076

他の実施形態では、造血幹細胞集団または前駆細胞集団を、約10μM以上の濃度の16,16−ジメチルPGE2と、約1時間〜約6時間にわたり接触させる。

0077

付加的な実施形態では、細胞集団を、約10μMの濃度の16,16−ジメチルPGE2と、約2時間にわたり接触させる。

0078

具体的な実施形態では、細胞集団における接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着の潜在能の増大は、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較したときの、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、またはCXCケモカイン受容体4(CXCR4)のうちの1または複数の遺伝子発現の増大、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較したときの自己再生能の増大、および、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して細胞生存度の実質的な低下がないことを含む。

0079

本発明の一部の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団が、内毒素を含まない容器において調製され、ここで、この容器は、容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも1つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも1つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する。

0080

造血幹細胞移植または前駆細胞移植のための細胞集団を調製するための方法、および造血幹細胞または前駆細胞の増殖を増大させるための細胞集団を調製するための方法を含め、本発明のこれらの方法を含めた本発明の特定の実施形態では、接触させた細胞集団を、細胞療法を必要とする被験体など、それを必要とする被験体に投与するが、本発明の方法は、接触させた細胞集団を、それを必要とする被験体に投与するステップをさらに含む。

0081

特定の具体的な実施形態では、被験体が、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、若年性骨髄単球性白血病ホジキンリンパ腫非ホジキンリンパ腫多発性骨髄腫重症再生不良性貧血ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症PNH)、赤芽球ろう、無巨核球症(amegakaryocytosis)/先天性血小板減少症重症複合型免疫不全症(severe combined immunodeficiency syndrome)(SCID)、ウィスコット−アルドリッチ症候群ベータサラセミアメジャー(beta−thalassemia major)、鎌状赤血球症ハーラー症候群副腎白質ジストロフィー異染性白質萎縮症脊髄形成異常症不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生家族性血球貪食性リンパ組織球症、充実性腫瘍、慢性肉芽腫症ムコ多糖症、またはダイアモンドブラックファン貧血を有する。

0082

特定の他の具体的な実施形態では、被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん肺がん結腸がん、皮膚がん肝臓がん膵臓がん、または肉腫を有する。

0083

他の特定の実施形態では、被験体に、骨髄除去化学療法(bone marrow ablative chemotherapy)もしくは骨髄除去的放射線療法(bone marrow ablative radiation therapy)、または非骨髄破壊的化学療法(non−myeolablative chemotherapy)もしくは非骨髄破壊的放射線療法(non−myeolablative radiation therapy)を施している。

0084

さらなる実施形態では、被験体が骨髄ドナーである。

0085

具体的な実施形態では、細胞集団が、1または複数の臍帯血ユニットを含む。特定の実施形態では、被験体に、1または複数の臍帯血ユニットを投与する。他の実施形態では、被験体に、部分臍帯血ユニットを投与する。他の具体的な実施形態では、被験体に、1臍帯血ユニットを投与する。

0086

他の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団が、被験体と同体(autogeneic)である。

0087

特定の実施形態では、細胞集団が、被験体の末梢血または骨髄から動員される。

0088

さらなる実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団が、被験体に対して同種異系である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、
a)上記造血幹細胞または前駆細胞が、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、上記細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触しており、
b)上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、
c)上記治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、
治療用組成物。
(項目2)
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約3倍増大している、項目1に記載の治療用組成物。
(項目3)
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、cAMP類似体またはcAMPエンハンサー、Gα−s活性化因子、およびPGE2EP4受容体に選択的に結合する化合物からなる群より選択される、項目1に記載の治療用組成物。
(項目4)
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、PGE2、またはPGE2類似体もしくはPGE2誘導体である、項目1に記載の治療用組成物。
(項目5)
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、16,16−ジメチルPGE2である、項目1に記載の治療用組成物。
(項目6)
上記造血幹細胞または前駆細胞が、少なくとも約1時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目1に記載の治療用組成物。
(項目7)
上記造血幹細胞または前駆細胞が、約1時間〜約6時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目1に記載の治療用組成物。
(項目8)
上記造血幹細胞または前駆細胞が、約2時間〜約6時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目1に記載の治療用組成物。
(項目9)
上記造血幹細胞または前駆細胞が、約2時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目1に記載の治療用組成物。
(項目10)
上記造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、1または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記1または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、上記シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、およびFos関連抗原2(FOSL2)からなる群より選択される、項目1に記載の治療用組成物。
(項目11)
上記シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも2つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記2つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも5、10、15、または20倍増大している、項目10に記載の治療用組成物。
(項目12)
上記シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記シグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大している、項目10に記載の治療用組成物。
(項目13)
上記細胞集団が、約0.10、0.50、1.0、3、5、10、15、20、または30%未満のCD34+細胞を含む、項目1に記載の治療用組成物。
(項目14)
上記細胞集団が、少なくとも約0.01%かつ約50%以下のCD34+細胞を含む、項目1に記載の治療用組成物。
(項目15)
上記細胞集団をex vivoにおいて増殖させない、項目1に記載の治療用組成物。
(項目16)
上記細胞集団を培養せずにポイントオブケアで生成させ、患者に投与する、項目1に記載の治療用組成物。
(項目17)
上記薬剤を実質的に含まない、項目1に記載の治療用組成物。
(項目18)
上記細胞集団が、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の間葉系幹細胞を含む、項目1に記載の治療用組成物。
(項目19)
上記細胞集団が、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の内皮前駆細胞を含む、項目1に記載の治療用組成物。
(項目20)
上記細胞集団内の細胞のうちの少なくとも約15%が、CXCR4タンパク質を発現する、項目1に記載の治療用組成物。
(項目21)
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目1に記載の治療用組成物。
(項目22)
上記細胞集団がHLAハプロタイピングされている、項目1に記載の治療用組成物。
(項目23)
上記細胞集団が、HLA−A、HLA−B、HLA−C、およびHLA−DRB1からなる群に基づきHLAハプロタイピングされている、項目1に記載の治療用組成物。
(項目24)
上記HLAハプロタイピングされている細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する、項目1に記載の治療用組成物。
(項目25)
上記HLAハプロタイピングされている細胞集団が、6つのHLAのうちの4つで特定のヒト被験体と適合する、項目1に記載の治療用組成物。
(項目26)
少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、
a)上記造血幹細胞または前駆細胞が、ex vivoにおいて、約37℃の温度で約2時間にわたり、16,16−dmPGE2と接触しており、
b)上記造血幹細胞または前駆細胞が、CD34+細胞の収集物を含み、上記CD34+細胞の収集物におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していないCD34+細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約3倍増大しており、
c)上記治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、
治療用組成物。
(項目27)
上記造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、1または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記1または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、上記シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、およびFos関連抗原2(FOSL2)からなる群より選択される、項目26に記載の治療用組成物。
(項目28)
上記シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも2つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記2つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも5、10、15、または20倍増大している、項目26に記載の治療用組成物。
(項目29)
上記シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記シグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大している、項目26に記載の治療用組成物。
(項目30)
上記細胞集団が、約0.10、0.50、1.0、3、5、10、15、20、または30%未満のCD34+細胞を含む、項目26に記載の治療用組成物。
(項目31)
上記細胞集団が、少なくとも約0.01%かつ約50%以下のCD34+細胞を含む、項目26に記載の治療用組成物。
(項目32)
上記細胞集団をex vivoにおいて増殖させない、項目26に記載の治療用組成物。
(項目33)
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目26に記載の治療用組成物。
(項目34)
上記細胞集団がHLAハプロタイピングされている、項目26に記載の治療用組成物。
(項目35)
少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含むハプロタイピングされている細胞集団を含む治療用組成物であって、
a)上記造血幹細胞または前駆細胞が、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、上記細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触しており、
b)上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、
c)上記治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、
治療用組成物。
(項目36)
上記ハプロタイピングされている細胞集団が、HLA−A、HLA−B、HLA−C、およびHLA−DRB1からなる群に基づきハプロタイピングされている、項目35に記載の治療用組成物。
(項目37)
上記ハプロタイピングされている細胞集団が、HLA−DRB3/4/5、HLA−DQB1、およびDPB1からなる群に基づきハプロタイピングされている、項目35に記載の治療用組成物。
(項目38)
上記ハプロタイピングされている細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する、項目35に記載の治療用組成物。
(項目39)
上記HLAハプロタイピングされている細胞集団が、6つのHLAのうちの4つで特定のヒト被験体と適合する、項目37に記載の治療用組成物。
(項目40)
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも約3倍増大している、項目35に記載の治療用組成物。
(項目41)
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、cAMP類似体またはcAMPエンハンサー、Gα−s活性化因子、およびPGE2EP4受容体に選択的に結合する化合物からなる群より選択される、項目35に記載の治療用組成物。
(項目42)
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、16,16−ジメチルPGE2である、項目35に記載の治療用組成物。
(項目43)
上記造血幹細胞または前駆細胞が、約1時間〜約6時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目35に記載の治療用組成物。
(項目44)
上記造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、1または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記1または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大しており、上記シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、およびFos関連抗原2(FOSL2)からなる群より選択される、項目35に記載の治療用組成物。
(項目45)
上記シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも2つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記2つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも5、10、15、または20倍増大している、項目35に記載の治療用組成物。
(項目46)
上記シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記シグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約2倍増大している、項目35に記載の治療用組成物。
(項目47)
上記細胞集団が、約0.10、0.50、1.0、3、5、10、15、20、または30%未満のCD34+細胞を含む、項目35に記載の治療用組成物。
(項目48)
上記細胞集団が、少なくとも約0.01%かつ約50%以下のCD34+細胞を含む、項目35に記載の治療用組成物。
(項目49)
上記細胞集団をex vivoにおいて増殖させない、項目35に記載の治療用組成物。
(項目50)
上記細胞集団を培養せずにポイントオブケアで生成させ、患者に投与する、項目35に記載の治療用組成物。
(項目51)
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目35に記載の治療用組成物。
(項目52)
治療用組成物を調製する方法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoにおいて、1または複数の薬剤と、約37℃の温度で、上記造血幹細胞または前駆細胞の遺伝子発現を改変するのに十分な条件下で接触させ、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して、以下の遺伝子:ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、またはCXCケモカイン受容体4(CXCR4)のうちの1または複数の発現の増大を含む遺伝子発現シグネチャーを含む造血幹細胞または前駆細胞を結果としてもたらすステップを含む、方法。
(項目53)
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目52に記載の方法。
(項目54)
上記1または複数の薬剤のうちの少なくとも1つが、上記造血幹細胞または前駆細胞におけるPGE2R2またはPGE2R4のシグナル伝達を増大させる、項目52に記載の方法。
(項目55)
上記1または複数の薬剤のうちの少なくとも1つが、cAMPエンハンサー、Gα−s活性化因子、およびPGE2EP4受容体に選択的に結合する薬剤からなる群より選択される、項目52に記載の方法。
(項目56)
上記1または複数の薬剤が、PGE2またはその類似体を含む、項目52に記載の方法。
(項目57)
上記PGE2類似体が、16,16−ジメチルPGE2を含む、項目56に記載の方法。
(項目58)
上記造血幹細胞または前駆細胞の上記遺伝子発現を改変するのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、約1時間〜約6時間にわたり、上記1または複数の薬剤と接触させることを含み、上記薬剤のうちの少なくとも1つが、上記造血幹細胞または前駆細胞におけるPGE2R2またはPGE2R4のシグナル伝達を増大させる薬剤を含む、項目52に記載の方法。
(項目59)
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約37℃の温度で、約2時間にわたり、約10μMの濃度の、上記造血幹細胞または前駆細胞におけるPGE2R2またはPGE2R4のシグナル伝達を増大させる上記薬剤と接触させる、項目58に記載の方法。
(項目60)
上記治療用組成物が、内毒素を含まない容器において調製され、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも1つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも1つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目52に記載の方法。
(項目61)
上記治療用組成物を、細胞療法を必要とする被験体に投与する、項目52に記載の方法。
(項目62)
上記被験体が、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症(PNH)、赤芽球ろう、無巨核球症/先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症(SCID)、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、充実性腫瘍、慢性肉芽腫症、ムコ多糖症、またはダイアモンドブラックファン貧血を有する、項目61に記載の方法。
(項目63)
上記被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、項目61に記載の方法。
(項目64)
上記被験体が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けた、項目61に記載の方法。
(項目65)
上記被験体が骨髄ドナーである、項目61に記載の方法。
(項目66)
被験体における造血幹細胞および前駆細胞の生着を増大させる方法であって、
(a)造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、プロスタグランジンE2(PGE2)およびdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップと、
(b)上記細胞集団を洗浄して上記薬剤を実質的に除去するステップと、
(c)上記細胞集団を被験体に投与するステップと
を含み、
上記被験体における上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、上記細胞集団を上記薬剤と接触させる、方法。
(項目67)
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目66に記載の方法。
(項目68)
上記薬剤がPGE2またはその類似体である、項目66に記載の方法。
(項目69)
上記PGE2類似体が16,16−ジメチルPGE2である、項目68に記載の方法。
(項目70)
生着を増大させるのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、
(a)約10μM以上の16,16−ジメチルPGE2濃度で、
(b)約1時間〜約6時間にわたり
接触させることを含む、項目66に記載の方法。
(項目71)
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約10μMの16,16−ジメチルPGE2濃度で、約2時間にわたり接触させる、項目66に記載の方法。
(項目72)
上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞が、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、またはCXCケモカイン受容体4(CXCR4)のうちの1または複数の遺伝子発現の増大を含む、項目66に記載の方法。
(項目73)
上記細胞集団が、内毒素を含まない容器において上記1または複数の薬剤と接触し、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも1つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも1つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目52または66に記載の方法。
(項目74)
上記細胞集団が、1または複数の臍帯血ユニットを含む、項目66に記載の方法。
(項目75)
上記被験体に、1または複数の臍帯血ユニットを投与する、項目74に記載の方法。
(項目76)
上記被験体に、1臍帯血ユニットまたは部分臍帯血ユニットを投与する、項目74に記載の方法。
(項目77)
上記被験体が、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症(PNH)、赤芽球ろう、無巨核球症/先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症(SCID)、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、または充実性腫瘍を有する、項目66に記載の方法。
(項目78)
上記被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、項目66に記載の方法。
(項目79)
上記被験体が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けた、項目66に記載の方法。
(項目80)
上記被験体が骨髄ドナーである、項目66に記載の方法。
(項目81)
上記細胞集団が、上記被験体と同体である、項目66に記載の方法。
(項目82)
上記細胞集団が、上記被験体の末梢血または骨髄から動員される、項目81に記載の方法。
(項目83)
上記細胞集団が、上記被験体に対して同種異系である、項目66に記載の方法。
(項目84)
造血系再構築を必要とする被験体を処置する方法であって、
(a)造血系再構築を必要とする被験体を選択するステップと、
(b)造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、プロスタグランジンE2(PGE2)およびdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップと、
(c)上記細胞集団を洗浄して上記薬剤を実質的に除去するステップと、
(d)上記細胞集団を上記被験体に投与するステップと
を含み、
上記被験体における上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、上記細胞集団を上記薬剤と接触させ、これにより、造血系再構築を必要とする上記被験体を処置する、方法。
(項目85)
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目84に記載の方法。
(項目86)
上記薬剤がPGE2またはその類似体である、項目84に記載の方法。
(項目87)
上記PGE2類似体が16,16−ジメチルPGE2である、項目84に記載の方法。
(項目88)
上記生着を増大させるのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、
(a)約10μM以上の16,16−ジメチルPGE2濃度で、
(b)約1時間〜約6時間にわたり
接触させることを含む、項目84に記載の方法。
(項目89)
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約10μMの16,16−ジメチルPGE2濃度で、約2時間にわたり接触させる、項目88に記載の方法。
(項目90)
上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞が、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、またはCXCケモカイン受容体4(CXCR4)のうちの1または複数の遺伝子発現の増大を含み、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して自己再生能の増大を含み、かつ、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して細胞生存度の実質的な低下を含まない、項目84に記載の方法。
(項目91)
上記細胞集団が、内毒素を含まない容器において調製され、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも1つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも1つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目84に記載の方法。
(項目92)
上記細胞集団が、1または複数の臍帯血ユニットを含む、項目84に記載の方法。
(項目93)
上記被験体に、部分臍帯血ユニットまたは1または複数の臍帯血ユニットを投与する、項目92に記載の方法。
(項目94)
上記被験体が、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症(PNH)、赤芽球ろう、無巨核球症/先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症(SCID)、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、または充実性腫瘍を有する、項目84に記載の方法。
(項目95)
上記被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、項目84に記載の方法。
(項目96)
上記被験体が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けた、項目84に記載の方法。
(項目97)
上記被験体が骨髄ドナーである、項目84に記載の方法。
(項目98)
上記細胞集団が、上記被験体と同体である項目84に記載の方法。
(項目99)
上記細胞集団が、上記被験体の末梢血または骨髄から動員される、項目98に記載の方法。
(項目100)
上記細胞集団が、上記被験体に対して同種異系である、項目84に記載の方法。
(項目101)
in vivoにおいて造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させるための細胞集団を調製する方法であって、造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、プロスタグランジンE2(PGE2)およびdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップを含み、in vivoにおける上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞の増殖を、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、上記細胞集団を上記薬剤と接触させる、方法。
(項目102)
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目101に記載の方法。
(項目103)
上記薬剤がPGE2またはその類似体である、項目101に記載の方法。
(項目104)
上記PGE2類似体が16,16−ジメチルPGE2である、項目101に記載の方法。
(項目105)
上記薬剤がcAMPエンハンサーである、項目101に記載の方法。
(項目106)
in vivoにおける上記造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させるのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、
(a)約10μM以上の16,16−ジメチルPGE2濃度で、
(b)約1時間〜約6時間にわたり
接触させることを含む、項目101に記載の方法。
(項目107)
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約10μMの16,16−ジメチルPGE2濃度で、約2時間にわたり接触させる、項目106に記載の方法。
(項目108)
上記細胞集団が、内毒素を含まない容器において調製され、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも1つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも1つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目106に記載の方法。
(項目109)
上記細胞集団を、細胞療法を必要とする被験体に投与する、項目106に記載の方法。
(項目110)
in vivoの被験体における造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させる方法であって、
(a)造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、プロスタグランジンE2(PGE2)またはdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップと、
(b)上記細胞集団を被験体に投与するステップと
を含み、
in vivoの上記被験体における上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞の増殖を、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、上記細胞集団を上記薬剤と接触させる、方法。
(項目111)
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目110に記載の方法。
(項目112)
上記薬剤がPGE2またはその類似体である、項目110に記載の方法。
(項目113)
上記PGE2類似体が16,16−ジメチルPGE2である、項目110に記載の方法。
(項目114)
上記薬剤がcAMPエンハンサーである、項目110に記載の方法。
(項目115)
in vivoにおける上記造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させるのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、
(a)約10μM以上の16,16−ジメチルPGE2濃度で、
(b)約1時間〜約6時間にわたり
接触させることを含む、項目112に記載の方法。
(項目116)
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約10μMの16,16−ジメチルPGE2濃度で、約2時間にわたり接触させる、項目115に記載の方法。
(項目117)
上記細胞集団が、内毒素を含まない容器において調製され、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも1つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも1つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目110に記載の方法。
(項目118)
上記細胞集団が、1または複数の臍帯血ユニットを含む、項目110に記載の方法。
(項目119)
上記被験体に、1または複数の臍帯血ユニットを投与する、項目118に記載の方法。
(項目120)
上記被験体に、1臍帯血ユニットまたは部分臍帯血ユニットを投与する、項目118に記載の方法。
(項目121)
上記被験体が、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症(PNH)、赤芽球ろう、無巨核球症/先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症(SCID)、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、または充実性腫瘍を有する、項目110に記載の方法。
(項目122)
上記被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、項目110に記載の方法。
(項目123)
上記患者が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けた、項目110に記載の方法。
(項目124)
上記被験体が骨髄ドナーである、項目110に記載の方法。
(項目125)
上記細胞集団が、上記被験体と同体である項目110に記載の方法。
(項目126)
上記細胞集団が、上記被験体の末梢血または骨髄から動員される、項目125に記載の方法。
(項目127)
上記細胞集団が、上記被験体に対して同種異系である、項目110に記載の方法。

図面の簡単な説明

0089

図1は、造血幹細胞および前駆細胞に存在するプロスタグランジンE2受容体2/受容体4によるGタンパク質結合型受容体細胞シグナル伝達経路についての概略図を示す。
図2は、異なるセットの実験条件下において16,16−ジメチルPGE2で処理した、精製されたCD34+細胞集団またはヒト臍帯血の解析についての実験フローチャートを示す。
図3は、異なるセットの実験条件下において16,16−ジメチルPGE2で処理したCD34+細胞でのcAMPアッセイについての結果を示す。
図4は、x軸におけるビヒクルで処理したCD34+細胞の遺伝子発現データを、y軸における10μMの16,16−ジメチルPGE2で処理したCD34+細胞の遺伝子発現データと対比させる散布図(scatterplot)である。ビヒクルで処理した細胞と比較して、10μMの16,16−ジメチルPGE2で処理したCD34+細胞においては、CREMの発現が8倍増大し、CXCR4の発現が18倍増大することが注目される。
図5は、10μMの16,16−ジメチルPGE2で処理したCD34+細胞の遺伝子発現における処理時間の解析についての実験フローチャートを示す。
図6は、10μMの16,16−ジメチルPGE2で5、15、30、60、および120分間の処理時間にわたり処理したCD34+細胞(y軸)を、ビヒクルで処理した細胞(x軸)と対比させる遺伝子発現プロファイルを示す。遺伝子発現プロファイルは、120分間のインキュベーション期間の後に得た。
図7は、37℃、100nM、1μM、10μM、または100μMの16,16−ジメチルPGE2で120分間にわたり処理したCD34+細胞(y軸)を、ビヒクルで処理した細胞(x軸)と対比させる遺伝子発現プロファイルを示す。
図8は、37℃、100nM、1μM、10μM、25μM、または50μMの16,16−ジメチルPGE2で120分間にわたり処理した、臍帯血から精製されたCD34+細胞(y軸)を、ビヒクルで処理した細胞(x軸)と対比させる遺伝子発現プロファイルを示す。
図9は、37℃(左パネル)または4℃(右上パネル)または25℃(右下パネル)、10μMの16,16−ジメチルPGE2で60分間(上パネル)または120分間(下パネル)にわたり処理したCD34+細胞(y軸)を、ビヒクルで処理した細胞(x軸)と対比させる遺伝子発現プロファイルを示す。
図10は、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2と共に120分間にわたりインキュベートしたCD34+細胞が、ビヒクルで処理した細胞、または4℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で120分間にわたり処理した細胞と比較して細胞生存度を低下させないことを示す。
図11は、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2と共に120分間にわたりインキュベートしたCD34+細胞が、ビヒクルで処理した細胞、または4℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で120分間にわたり処理した細胞と比較して、細胞がコロニー形成単位を形成する能力を低下させないことを示す。顆粒球単球のコロニー形成単位(CFU−GM)、赤血球のコロニー形成単位(CFU− E)、赤芽球バースト形成単位(burst forming unit erythroid)(BFU−E)、多系統のコロニー形成単位ミックス(CFU−GM/M/Eosi)。
図12は、16,16−ジメチルPGE2で処理したヒト臍帯血を用いる臨床試験の概略図である。
図13は、16,16−ジメチルPGE2による処理プロトコールのゲノム全体の発現解析を示す。図13Aは、4℃で1時間にわたり処理した細胞における遺伝子発現を示す。細胞は、DMSO対照(N=3)と比較される、10μMの16,16−ジメチルPGE2(y軸、N=3)で処理した。図13Bは、37℃で2時間にわたり処理した細胞における遺伝子発現を示す。細胞は、DMSO対照(N=3)と比較される、10μMの16,16−ジメチルPGE2(y軸、N=3)で処理した。
図14は、Fluidigm遺伝子発現プラットフォームを用いる37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2によるインキュベーションで処理した細胞についての遺伝子発現解析検証研究を示す。図14Aは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞における選択された遺伝子群の遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図14Bは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞における、表3で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子:ARPC2、CXCL5、CXCL6、FGF9、GNAL、GULP1、LRIG2、PDE4D、PLAT(1)、PLAT(2)、SSTR1、SYT4、およびTMCC3は、発現挙動が思わしくなく、図14Bに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。パネルBに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子:ACTB、GAPDH、HPTR1、およびQARSを用いた。図14Cは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞におけるCXCR4の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図14のための全ての遺伝子発現プロファイルは、指定された時間にわたる細胞の処理後において、処理後におけるさらなる細胞のインキュベーションを伴わずに得た。
図14は、Fluidigm遺伝子発現プラットフォームを用いる37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2によるインキュベーションで処理した細胞についての遺伝子発現解析検証研究を示す。図14Aは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞における選択された遺伝子群の遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図14Bは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞における、表3で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子:ARPC2、CXCL5、CXCL6、FGF9、GNAL、GULP1、LRIG2、PDE4D、PLAT(1)、PLAT(2)、SSTR1、SYT4、およびTMCC3は、発現挙動が思わしくなく、図14Bに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。パネルBに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子:ACTB、GAPDH、HPTR1、およびQARSを用いた。図14Cは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞におけるCXCR4の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図14のための全ての遺伝子発現プロファイルは、指定された時間にわたる細胞の処理後において、処理後におけるさらなる細胞のインキュベーションを伴わずに得た。
図14は、Fluidigm遺伝子発現プラットフォームを用いる37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2によるインキュベーションで処理した細胞についての遺伝子発現解析検証研究を示す。図14Aは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞における選択された遺伝子群の遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図14Bは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞における、表3で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子:ARPC2、CXCL5、CXCL6、FGF9、GNAL、GULP1、LRIG2、PDE4D、PLAT(1)、PLAT(2)、SSTR1、SYT4、およびTMCC3は、発現挙動が思わしくなく、図14Bに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。パネルBに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子:ACTB、GAPDH、HPTR1、およびQARSを用いた。図14Cは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で0、20、40、60、80、120、180、および240分間にわたり処理したCD34+細胞におけるCXCR4の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図14のための全ての遺伝子発現プロファイルは、指定された時間にわたる細胞の処理後において、処理後におけるさらなる細胞のインキュベーションを伴わずに得た。
図15は、完全な生物学的効果を駆動するのに十分な、10μMの16,16−ジメチルPGE2のパルス処理で処理した細胞、またはDMSOで処理した細胞を示す。CD34+細胞を、10μMの16,16−ジメチルPGE2と共に、示される通りの異なる時間(0、20、40、80、および120分間)にわたりインキュベートした後、全インキュベーション時間が120分間となるように、37℃で16,16−ジメチルPGE2を伴わない回復時間を置いた。データは、Fluidigm遺伝子発現プラットフォームを用いて解析した。図15Aおよび15Bは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで5、15、30、60、および120分間にわたり処理したCD34+細胞における、表3で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子:ACDY7、CCND1、CREB5、GULP1、MPPE1、PDE3B、PTGER2、RGS2、およびYPEL4は、発現挙動が思わしくなく、図15Bに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。図15Bに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子:ACTB、ARPC2、GAPDG、HPRT1、LRIG2、およびQARSを用いた。遺伝子発現プロファイルは、120分間のインキュベーション期間後に得た。
図15は、完全な生物学的効果を駆動するのに十分な、10μMの16,16−ジメチルPGE2のパルス処理で処理した細胞、またはDMSOで処理した細胞を示す。CD34+細胞を、10μMの16,16−ジメチルPGE2と共に、示される通りの異なる時間(0、20、40、80、および120分間)にわたりインキュベートした後、全インキュベーション時間が120分間となるように、37℃で16,16−ジメチルPGE2を伴わない回復時間を置いた。データは、Fluidigm遺伝子発現プラットフォームを用いて解析した。図15Aおよび15Bは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで5、15、30、60、および120分間にわたり処理したCD34+細胞における、表3で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子:ACDY7、CCND1、CREB5、GULP1、MPPE1、PDE3B、PTGER2、RGS2、およびYPEL4は、発現挙動が思わしくなく、図15Bに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。図15Bに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子:ACTB、ARPC2、GAPDG、HPRT1、LRIG2、およびQARSを用いた。遺伝子発現プロファイルは、120分間のインキュベーション期間後に得た。
図16は、16,16−ジメチルPGE2の濃度またはDMSOによる処理の、Fluidigm遺伝子発現プラットフォームを用いる遺伝子発現に対する効果を示す。図16Aおよび16Bは、37℃、0、0.1、1、10、50、および100μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで120分間にわたり処理したCD34+細胞における、表3で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子:ACDY7、CCND1、CREB5、GULP1、FGFR1、FLJ27352、MPPE1、PDE4D、PTGER2、PDG3B、およびYPEL4は発現挙動が思わしくなく、図16Bに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。図16Bに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子:ACTB、ARPC2、GAPDH、HPRT1、LRIG2、およびQARSを用いた。
図16は、16,16−ジメチルPGE2の濃度またはDMSOによる処理の、Fluidigm遺伝子発現プラットフォームを用いる遺伝子発現に対する効果を示す。図16Aおよび16Bは、37℃、0、0.1、1、10、50、および100μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで120分間にわたり処理したCD34+細胞における、表3で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子:ACDY7、CCND1、CREB5、GULP1、FGFR1、FLJ27352、MPPE1、PDE4D、PTGER2、PDG3B、およびYPEL4は発現挙動が思わしくなく、図16Bに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。図16Bに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子:ACTB、ARPC2、GAPDH、HPRT1、LRIG2、およびQARSを用いた。
図17は、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で2時間にわたり処理した細胞についての遺伝子発現解析を、DMSOで処理した細胞と比較して示す。図17Aは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で2時間にわたり処理した全臍帯血細胞についてのゲノム全体の発現解析を、DMSOで処理した臍帯血細胞と比較して示す。図17Bは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で2時間にわたり処理したLin+CD34+細胞についてのゲノム全体の発現解析を、DMSOで処理したLin(+)CD34+細胞と比較して示す。図17Cは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で2時間にわたり処理したLin(−)CD34+CD38+細胞についてのゲノム全体の発現解析を、DMSOで処理したLin(−)CD34+CD38+細胞と比較して示す。図17Dは、37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で2時間にわたり処理したLin(−)CD34+CD38−CD90+細胞についてのゲノム全体の発現解析を、DMSOで処理したLin(−)CD34+CD38−CD90+細胞と比較して示す。
図18は、異なる温度、10μMの16,16−ジメチルPGE2で異なる長さの時間にわたり処理した細胞におけるCXCR4の発現を示す。図18Aは、この実験系列で比較した実験条件を示す。図18Bは、4℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで1時間にわたり処理した細胞、および37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで2時間にわたり処理した細胞の、処理の1、6、および24時間後の細胞表面におけるCXCR4の発現を示す。図18Cは、4℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで1時間にわたり処理した細胞、および37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで2時間にわたり処理した細胞の、処理の1、6、および24時間後の細胞表面におけるCXCR4を発現する細胞の百分率を示す。
図18は、異なる温度、10μMの16,16−ジメチルPGE2で異なる長さの時間にわたり処理した細胞におけるCXCR4の発現を示す。図18Aは、この実験系列で比較した実験条件を示す。図18Bは、4℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで1時間にわたり処理した細胞、および37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで2時間にわたり処理した細胞の、処理の1、6、および24時間後の細胞表面におけるCXCR4の発現を示す。図18Cは、4℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで1時間にわたり処理した細胞、および37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで2時間にわたり処理した細胞の、処理の1、6、および24時間後の細胞表面におけるCXCR4を発現する細胞の百分率を示す。
図18は、異なる温度、10μMの16,16−ジメチルPGE2で異なる長さの時間にわたり処理した細胞におけるCXCR4の発現を示す。図18Aは、この実験系列で比較した実験条件を示す。図18Bは、4℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで1時間にわたり処理した細胞、および37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで2時間にわたり処理した細胞の、処理の1、6、および24時間後の細胞表面におけるCXCR4の発現を示す。図18Cは、4℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで1時間にわたり処理した細胞、および37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSOで2時間にわたり処理した細胞の、処理の1、6、および24時間後の細胞表面におけるCXCR4を発現する細胞の百分率を示す。
図19は、表示される温度、10μMの16,16−ジメチルPGE2で表示される時間にわたり処理したCD34+細胞についての生存度解析および増殖解析を示す。次いで、処理した細胞を、in vivoにおけるCFU−Sアッセイを用いて解析した。図19Aは、37℃におけるインキュベーションにより、造血前駆細胞数が増大することを示す。図19Bは、4℃、25℃、および37℃、多様な濃度の16,16−ジメチルPGE2と共に120分間にわたりインキュベートしたヒト全臍帯血細胞についての細胞生存度データを示す。図19Cは、4℃および37℃、多様な濃度の16,16−ジメチルPGE2と共に120分間にわたりインキュベートしたヒトCD34+細胞についての細胞生存度データを示す。図19Dは、37℃、dmPGE2で処理したCD34+細胞におけるCFU−Cコロニー形成の増大を、4℃、DMSOまたはdmPGE2で処理したCD34+細胞と比較して示す。
図19は、表示される温度、10μMの16,16−ジメチルPGE2で表示される時間にわたり処理したCD34+細胞についての生存度解析および増殖解析を示す。次いで、処理した細胞を、in vivoにおけるCFU−Sアッセイを用いて解析した。図19Aは、37℃におけるインキュベーションにより、造血前駆細胞数が増大することを示す。図19Bは、4℃、25℃、および37℃、多様な濃度の16,16−ジメチルPGE2と共に120分間にわたりインキュベートしたヒト全臍帯血細胞についての細胞生存度データを示す。図19Cは、4℃および37℃、多様な濃度の16,16−ジメチルPGE2と共に120分間にわたりインキュベートしたヒトCD34+細胞についての細胞生存度データを示す。図19Dは、37℃、dmPGE2で処理したCD34+細胞におけるCFU−Cコロニー形成の増大を、4℃、DMSOまたはdmPGE2で処理したCD34+細胞と比較して示す。
図20は、in vitroにおける走化性機能アッセイについての実験フローチャートを示す。CD34+細胞を、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSO対照で4時間にわたり処理し、次いで、4時間にわたり0〜50ng/mlのSDF1αの存在下の遊走ウェルアッセイへと移した。
図21は、in vitroにおける走化性機能アッセイについての代表的なデータを示す。CD34+細胞を、10μMの16,16−ジメチルPGE2またはDMSO対照で4時間にわたり処理し、次いで、4時間にわたり0〜50ng/mlのSDF1αの存在下の遊走ウェルアッセイへと移した。
図22Aは、4℃、25℃、または37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で120分間にわたり処理したCD34+細胞(y軸)についてのゲノム全体の発現解析を、ビヒクルで処理した細胞(x軸)と対比して示す。図22Bは、細胞における、図22Aで例示される発現解析に由来するシグネチャー遺伝子のサブセットについての平均倍変化(average fold change)を提示する。
図22Aは、4℃、25℃、または37℃、10μMの16,16−ジメチルPGE2で120分間にわたり処理したCD34+細胞(y軸)についてのゲノム全体の発現解析を、ビヒクルで処理した細胞(x軸)と対比して示す。図22Bは、細胞における、図22Aで例示される発現解析に由来するシグネチャー遺伝子のサブセットについての平均倍変化(average fold change)を提示する。
図23Aは、37℃、10μMのdmPGE2またはフォルスコリンで120分間にわたり処理したCD34+細胞(y軸)についてのゲノム全体の発現解析を、ビヒクルで処理した細胞(x軸)と対比させて示す。図23B(上パネル)は、dmPGE2またはフォルスコリンで処理した細胞における、図23Aで例示されるシグネチャー遺伝子のサブセットについての平均倍変化を示す。図23B(下パネル)は、37℃、1mMのdbcAMPで120分間にわたり処理するか、または37℃、1mMのdmPGE2で120分間にわたり処理したCD34+細胞におけるシグネチャー遺伝子のサブセットについての、Fluidigm qPCRによる平均倍変化を示す。
図23Aは、37℃、10μMのdmPGE2またはフォルスコリンで120分間にわたり処理したCD34+細胞(y軸)についてのゲノム全体の発現解析を、ビヒクルで処理した細胞(x軸)と対比させて示す。図23B(上パネル)は、dmPGE2またはフォルスコリンで処理した細胞における、図23Aで例示されるシグネチャー遺伝子のサブセットについての平均倍変化を示す。図23B(下パネル)は、37℃、1mMのdbcAMPで120分間にわたり処理するか、または37℃、1mMのdmPGE2で120分間にわたり処理したCD34+細胞におけるシグネチャー遺伝子のサブセットについての、Fluidigm qPCRによる平均倍変化を示す。
図24は、本発明の治療用組成物を用いてマウスにおける造血細胞移植を実施するための実験戦略を示す。

0090

A.序説
本発明は、治療用組成物および造血幹細胞移植または前駆細胞移植の有効性を改善し、再生細胞療法の分野における医療従事者が直面する多面的な難題に取り組む方法を提供する。本発明者らは、幹細胞移植において用いられる造血幹細胞および前駆細胞の有効性を増大させる方法を開発するために、プロスタグランジン経路を刺激し、CXCR4の遺伝子発現および細胞表面におけるCXCR4の発現を上方制御する薬剤を含めた、細胞の遺伝子発現を改変する薬剤で処理した造血幹細胞集団および前駆細胞集団についての複数の生物学的パラメータを解析した。移植時における被験体の造血系を再構築するときの細胞集団の有効性は、細胞集団が、in vivoにおいて骨髄にホーミングおよび生着し、自己再生し、増殖する能力などの特性に依存する。本発明は、細胞集団を調節して、このような細胞特性を改善し、結果としてもたらされる、造血再構築における治療的改善をもたらす方法を提供する。

0091

特に、本発明は、増強されたヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団を含む治療用組成物、および増強された治療用組成物を作製し、幹細胞移植においてこれを用いる方法を提供する。本発明の治療用組成物は、移植療法において細胞集団を用いる前に、ex vivoにおいて細胞集団の治療的特性を増強するように改変されたヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団を含む。治療用組成物の改変された細胞は、骨髄にホーミングおよび生着する能力の増大を実証し、加えて、改善された細胞生存度および自己再生能を保有する。

0092

細胞の生着能およびホーミング能を含めた、治療用組成物の造血幹細胞および前駆細胞の治療的特性は、細胞集団を、ex vivoにおいて、細胞における、CXCR4を含めた、細胞のホーミングおよび生着と関連すると考えられる遺伝子の発現を改変する薬剤で処理した方法を介して増大させる。したがって、本発明の方法は、細胞移植時において最も有益な治療効果を達成するための、治療用組成物に含まれる細胞を予備刺激する(prime)。本発明の方法では、治療用組成物の造血幹細胞または前駆細胞を、ex vivoにおいて、ホーミング、生着、およびin vivoにおける細胞集団の増殖など、細胞の有益な生物学的特性と関連する遺伝子の発現を結果として増大させる、生理学的に適切な温度で、薬剤により処理する。増強された造血幹細胞または前駆細胞を含む治療用組成物は、以下で記載される例において、ホーミング、生着、および増殖の利点を有することが実証される。

0093

したがって、治療用組成物は、採取された血液細胞、および、明確のために述べると、臍帯血を含めた血液細胞の生着の潜在能を改善する方法、ならびに移植された造血細胞におけるホーミング、生存度、および自己再生を増大させる方法を提供する。加えて、本発明は、in vivoにおいて造血幹細胞および前駆細胞を増殖させる方法も提供する。本発明で記載される治療用組成物および方法は、臍帯血移植における部分臍帯ユニットまたは単一の臍帯ユニットの使用を可能としうる。

0094

移植の前に造血幹細胞を操作するための注意についての最新の基準では、移植時における細胞生存度および生着の成功を最大化するために、4℃における厳密な温度制御が必要とされている。本発明は、細胞生存度の低下および薬剤半減期の短縮と関連すると考えられている条件下で、造血幹細胞および前駆細胞におけるプロスタグランジンによる細胞シグナル伝達経路を刺激すること(37℃で2時間の期間にわたる細胞の操作など)により、予測外にも、細胞生存度に負の影響を及ぼすことなく、細胞が骨髄にホーミングする能力の増大、自己再生の増大、および幹細胞/前駆細胞の生着の潜在能の増大が結果としてもたらされることを実証する。より具体的に述べると、本発明者らは、完全な生物学的効果を達成するには、体温など、生理学的に適切な温度においてPGE2活性を及ぼす処理薬剤での、造血幹細胞および前駆細胞の曝露延長(少なくとも1時間にわたる)が必要とされることを発見した。とりわけ、短い持続時間にわたり、生理学的に適切な温度で造血幹細胞または前駆細胞を処理する結果、cAMPの生成の増大はもたらされるが、細胞のホーミングおよび生着と関連すると考えられている遺伝子の発現の増大はもたらされないことは予測外である。遺伝子発現の増大を達成するには、生理学的に適切な温度でのより長い細胞の処理が必要とされ、これは、細胞のホーミングおよび生着を増大させる所望の生物学的効果を達成するのに必要であることが、本発明により実証される。任意の任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本明細書で記載される方法は、被験体への投与の際に造血幹細胞および前駆細胞の増殖および生着の潜在能の増大を結果としてもたらす。

0095

プロスタグランジンE2(PGE2)は、多様な細胞型における多数の異なるプロスタグランジン受容体に作用し、限定なしに述べると、PI3−キナーゼ(PI3−KまたはPI3K)経路を含めた、多様なシグナル伝達経路を活性化させることにより、その機能を果たす。これらのプロスタグランジン受容体は、Gタンパク質結合型受容体(GPCR)と称する細胞表面7回膜貫通型受容体のサブファミリーを代表する。4つのサブタイプのプロスタグランジンE2受容体、PGE2R1、PGE2R2、PGE2R3、およびPGE2R4が存在する。プロスタグランジンまたはその類似体、例えば、PGE2R2またはPGE2R4アゴニストなど、適切なリガンドまたはアゴニストにより活性化されると、これらのプロスタグランジン受容体は、多様な下流の生物学的機能を開始する。例えば、造血幹細胞および前駆細胞におけるPGE2R2および/またはPGE2R4による細胞シグナル伝達の刺激/活性化は、部分的に、Gタンパク質アルファ−s(またはGα−s)の活性化およびアデニル酸シクラーゼの刺激と共役している。

0096

アデニリルシクラーゼが活性化されると、ATPのcAMPへの転換触媒される。第2メッセンジャーであるcAMPの濃度を増大させると、環状ヌクレオチド依存性イオンチャネルの活性化がもたらされ、RAPGEF3など、cAMPにより活性化されるタンパク質に交換される可能性がある。cAMP依存性経路を介する、GPCRとその最終的な分子標的との間のシグナル伝達の特異性は、GPCR、アデニリルシクラーゼ、およびエフェクタータンパク質を含めた、多重タンパク質複合体の形成を介して達成されうる。

0097

上記で言及した通り、環状AMPは、プロテインキナーゼAPKA、また、cAMP依存性プロテインキナーゼとしても公知である)を活性化させる。PKAは通常、2つの触媒性ユニットと2つの制御性ユニットとからなる四量体ホロ酵素(C2R2)として不活性であり、制御性ユニットにより触媒性ユニットの触媒性の中心部がブロックされる。環状AMPは、PKAの制御性ユニットにおける特異的な位置に結合し、制御性サブユニットと触媒性サブユニットとを解離させ、これにより、基質タンパク質リン酸化することを可能とする触媒性ユニットを活性化させる。例えば、プロテインキナーゼCを含めた、いくつかのタイプのプロテインキナーゼはcAMP依存性ではないので、全てのプロテインキナーゼがcAMPに応答するわけではない。

0098

PKAの活性サブユニットは、ATPからタンパク質基質の特定のセリン残基またはトレオニン残基へのリン酸イオンの移動を触媒しうる。リン酸化されたプロテインキナーゼは、細胞におけるイオンチャネル直接作用する場合もあり、他の酵素を活性化させるかまたは阻害する場合もある。PKAはまた、DNAのプロモーター領域に結合する特定のタンパク質もリン酸化し、特異的遺伝子の発現の増大を引き起こす。さらなる下流の効果は、PKAの多様な役割に依存し、これらは、細胞型に基づき異なりうる。例えば、活性化されたPKAは、例えば、グリコーゲングルコースへと転換するタンパク質、心臓における筋収縮を促進して、心拍数の増大をもたらすタンパク質、および遺伝子発現を制御する転写因子を含めた、他の多数のタンパク質をリン酸化しうる。

0099

したがって、PGE2R2およびPGE2R4による細胞シグナル伝達経路の刺激は、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB)およびCREBの標的遺伝子、例えば、cAMP応答エレメントモジュレーター(CREM)などの転写因子の活性化を増大させうる(図1を参照されたい)。cAMPを増大させた造血幹細胞および前駆細胞を投与することにより、造血幹細胞/前駆細胞の生存度を維持し、ホーミングを増大させ、自己再生を増大させ、生着の増大および移植された細胞集団のin vivoにおける増殖の増大をもたらすことができる。

0100

PGE2R2およびPGE2R4による細胞シグナル伝達の刺激/活性化はまた、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK−3)のリン酸化の増大およびB−カテニンのシグナル伝達の増大とも関連し(Hullら、2004年; Regan、2003年)、これらのいずれもがWnt経路の活性化を示す。PGE2によるWnt経路の刺激は、造血幹細胞/前駆細胞の増殖、ならびに幹細胞ニッチからのシグナル伝達のほか、細胞自体の内部におけるシグナル伝達も介する自己再生を活発に増強しうる(Northら、447巻(7147号)、Nature、1007〜11頁(2007年))。造血幹細胞および前駆細胞におけるWnt経路の活性化はまた、in vivoにおける細胞集団の増殖も増大させうる。

0101

PGE2R4による刺激はまた、PI3K経路も活性化させることが示されており、また、幹細胞のホーミング、増殖、生存、および生着の増大という所望の生物学的効果を達成するのにも重要でありうる。PGE2R2およびPGE2R4による、PI3K経路などの細胞シグナル伝達経路の刺激/活性化はまた、幹細胞のホーミングおよび生着に重要な遺伝子、例えば、CXCケモカイン受容体4(CXCR4)、セレクチンインテグリンの発現も増大させうる。

0102

本発見以前には、EP受容体を、細胞の生存度およびまた処理化合物の安定性を最大化する条件下において被験化合物で完全に飽和させうるであろうという考えのもとに、造血幹細胞および前駆細胞を化合物で処理した。造血幹細胞移植についての最新のケア基準によれば、4℃における処理により、処理した細胞の細胞生存度が改善されるほか、この温度における被験化合物の半減期について予測される延長も、より高い温度、例えば、25℃または37℃、およびより長いインキュベーション時間、例えば、2、3、4時間以上の場合と比較して改善されると考えられていた。

0103

任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明は、部分的に、細胞を、ホーミングおよび生着と関連する遺伝子の発現を増大させる薬剤で、高温で長いインキュベーション期間にわたり処理することにより造血幹細胞および前駆細胞の生着、細胞が骨髄にホーミングする能力、および細胞の自己再生を増大させ、細胞生存度は維持しうることを意図する。

0104

適切な薬剤には、例えば、プロスタグランジンE2ならびにcAMP類似体およびcAMPエンハンサーおよび/またはGα−s活性化因子を含めたdmPGE2活性を有する薬剤の改善された組成物が含まれる。さらに、本発明は、生理学的に適切な温度(体温または37℃など)のプロスタグランジンE2およびdmPGE2活性を有する薬剤を含めたこのような薬剤で長いインキュベーション期間(すなわち、少なくとも1時間)にわたり処理した細胞を投与することにより、細胞の生着が増大するだけでなく、造血幹細胞および前駆細胞集団のin vivoにおける増殖も結果としてもたらされることを実証する。

0105

したがって、多様な実施形態では、本発明が、ex vivoにおいて、約37℃の温度で、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と接触させたヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む治療用組成物を提供する。本発明はまた、造血再構築のための治療用組成物として用いられる造血幹細胞および前駆細胞を調製する方法であって、ヒト造血幹細胞集団および/または前駆細胞集団を、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤など、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と、造血幹細胞集団または前駆細胞集団の生着および増殖を最適化する条件下で接触させるステップを含む方法も提供する。

0106

本明細書では、「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」という詞が、その冠詞の文法目的語のうちの1つまたは1つより多く(すなわち、少なくとも1つの)を指すのに用いられる。例として述べると、「ある要素」とは、1つの要素または1つより多い要素を意味する。

0107

選択肢(例えば、「または」)の使用は、選択肢のうちの1つ、両方、またはこれらの任意の組合せを意味すると理解されたい。本明細書で用いられる「包含する」という用語と「含む」という用語とは、同義に用いられる。

0108

本明細書で用いられる「約(about)」という用語または「約(approximately)」という用語は、基準の量(quantity)、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量(amount)、重量、または長さに照らして最大で15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%変化する、量(quantity)、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量(amount)、重量、または長さを指す。一実施形態では、用語「約(about)」または「約(approximately)」が、基準の量(quantity)、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量(amount)、重量、または長さについて±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±1%となる、ある範囲の量(quantity)、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量(amount)、重量、または長さを指す。

0109

本明細書を通して、文脈により別段に要求されない限り、「〜を含む(comprise)」、「〜を含む(comprises)」、および「〜を含む(comprising)」という語は、言及されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含は示唆するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は示唆しないことが理解される。「〜からなる」とは、「〜からなる」という語句後続するあらゆる語句を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるかまたは必須であり、他の要素は存在しえないことを示す。「〜から本質的になる」とは、この語句の後に列挙された任意の要素を包含し、かつ、列挙された要素についての本開示で特定された活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。

0110

本明細書の全体における「一実施形態」または「ある実施形態」に対する言及は、この実施形態との関連において記載されている特定の特徴(feature)、構造、または特徴(characteristic)が、本発明の少なくとも1つの実施形態に包含されていることを意味する。したがって、本明細書全体の多様な箇所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特徴(feature)、構造、または特徴(characteristic)を、任意の適切な形で1または複数の実施形態において組み合わせることもできる。

0111

B.本発明の治療用組成物
本発明は、患者への投与に適する無菌で治療的に許容される溶液中に懸濁させたヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団を含む治療用組成物を提供する。本発明の治療用組成物は、ヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団であって、造血幹細胞または前駆細胞が、ex vivoにおいて細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させることが可能である1または複数の薬剤と接触しており、細胞が、接触していない幹細胞または前駆細胞と比べたCXCR4の発現の増大を含む遺伝子発現シグネチャーにより特徴づけられる、ヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団を含む。造血幹細胞または前駆細胞は、CXCR4の遺伝子発現レベルおよび細胞表面におけるCXCR4の発現レベルの増大に基づき特徴づけることができる。

0112

本発明の治療用組成物では、造血幹細胞または前駆細胞におけるCXCR4の遺伝子発現が、接触していない細胞におけるCXCR4の発現と比較して少なくとも2、3、4、5、10、15、または20倍増大している。

0113

本発明の治療用組成物は、遺伝子発現シグネチャーであって、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、およびFos関連抗原2(FOSL2)からなる群より選択される1または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない細胞と比べて増大する遺伝子発現シグネチャーによってもさらに特徴づけることができる。

0114

本明細書で用いられる「接触していない」細胞とは、対照薬剤以外の薬剤で処理されていない(例えば、それと共に培養されていない、それと接触させない、またはそれと共にインキュベートされていない)細胞である。DMSO(対照薬剤)と接触させた細胞、または別のビヒクルと接触させた細胞が、接触していない細胞である。

0115

本明細書で用いられる「シグネチャー遺伝子」とは、表3に示されるシグネチャー遺伝子のセット中の任意の遺伝子を意味する。例えば、シグネチャー遺伝子には、ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、およびCXCケモカイン受容体4(CXCR4)が含まれる。明確のために述べると、シグネチャー遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子を包含しない。

0116

シグネチャー遺伝子の発現は、接触していない細胞と比較して2倍以上増大する可能性があり、具体的な実施形態では、少なくとも2、3、4、5、6、10、15、または20倍増大している。一部の実施形態では、1または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、本発明の治療用組成物を構成する細胞において増大する。具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも2つ、3つ、4つ以上の発現が、接触していない細胞と比較して、少なくとも2、3、4、5、6、10、15、または20倍増大している。多様な実施形態では、シグネチャー遺伝子の発現が、接触していない細胞と比較して少なくとも6倍増大している可能性がある。

0117

本発明の具体的な実施形態では、CXCR4の遺伝子発現が、少なくとも約4倍増大し、CREMの遺伝子発現が、少なくとも約10倍増大している。

0118

治療用組成物を構成するヒト造血幹細胞または前駆細胞はまた、全てのシグネチャー遺伝子の平均倍数変化(average fold change)が少なくとも約2、4、または6倍である遺伝子発現プロファイルにより特徴づけることもできる。一部の実施形態では、全てのシグネチャー遺伝子の平均倍数変化が、少なくとも約4である。一部の実施形態では、全てのシグネチャー遺伝子の平均倍数変化が、少なくとも約6である。一部の実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、または90%の平均倍数変化が、少なくとも6倍である。一部の実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、または90%の平均倍数変化が、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10倍である。具体的な実施形態では、治療用組成物を、図14(B)、図15(B)、または図16(B)で示される、全てのシグネチャー遺伝子についての平均倍数変化を有する遺伝子発現プロファイルにより特徴づけることができる。

0119

治療用組成物を構成するヒト造血幹細胞または前駆細胞の遺伝子発現シグネチャーは解析することができる、すなわち、細胞を薬剤で処理した後で得ることもでき、または細胞を、処理後、ある期間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析することもできる。例えば、細胞は、ex vivoにおいて薬剤で処理し、洗浄して薬剤を除去し、さらなる細胞のインキュベーションを伴わずに遺伝子発現を解析することができる。あるいは、一部の実施形態では細胞を薬剤で処理し、洗浄して細胞集団から薬剤を除去し、次いで、細胞を、ex vivoにおいて、ある時間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析する。

0120

一部の実施形態では、細胞を洗浄して薬剤を除去し、次いで、1〜6時間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析する。一部の実施形態では、細胞を洗浄し、次いで、少なくとも約1時間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析する。一部の実施形態では、細胞を洗浄し、次いで、約2時間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析する。

0121

本明細書で用いられる「遺伝子発現」とは、本発明の治療用組成物における造血幹細胞および前駆細胞、または造血幹細胞集団もしくは前駆細胞集団などの生物学的試料における遺伝子発現の相対的なレベルおよび/または遺伝子の発現パターンを指す。遺伝子の発現は、cDNA、RNA、mRNA、またはこれらの組合せのレベルで測定することができる。「遺伝子発現プロファイル」または「遺伝子発現シグネチャー」とは、同じ試料、すなわち、細胞集団について測定される複数の異なる遺伝子の発現レベルを指す。

0122

本明細書では、本発明の治療用組成物を構成する細胞を特徴づける遺伝子の発現を検出するのに当技術分野において利用可能な任意の方法が包含される。本明細書で用いられる「発現を検出する」という用語は、RNA転写物またはその遺伝子の発現産物の量または存在を決定することを意味する。遺伝子の発現を検出する方法、すなわち、遺伝子発現プロファイリングには、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学法、およびプロテオミクスベースの方法が含まれる。方法は一般に、目的の遺伝子の発現産物(例えば、mRNA)を検出する。一部の実施形態では、逆転写PCR(RT−PCR)など、PCRベースの方法(Weisら、TIG、8巻:263〜64頁、1992年)、およびマイクロアレイなど、アレイベースの方法(Schenaら、Science、270巻:467〜70頁、1995年)を用いる。「マイクロアレイ」とは、例えば、担体(substrate)上のポリヌクレオチドプローブなど、ハイブリダイズ可能なアレイエレメント秩序のある配置を意図する。「プローブ」という用語は、特別に意図された標的の生体分子、例えば、内因性遺伝子によりコードされるかまたはこれに対応するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合することが可能である任意の分子を指す。プローブは、当業者が合成することもでき、適切な生物学的調製物から誘導することもできる。標識化するために、プローブを特別にデザインすることができる。プローブとして用いうる分子の例には、RNA、DNA、アプタマー、タンパク質、抗体、および有機分子が含まれるがこれらに限定されない。

0123

RNA抽出のための一般的な方法は、当技術分野において周知であり、Ausubelら編、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、New York、1987〜1999年を含めた分子生物学標準的な教科書において開示されている。パラフィン包埋された組織からRNAを抽出するための方法は、例えば、RuppおよびLocker(Lab Invest.、56巻:A67頁、1987年)ならびにDe Andresら(Biotechniques、18巻:42〜44頁、1995年)において開示されている。特に、RNAの単離は、製造元指示書に従い、Qiagen(Valencia、Calif.)など、商業上の製造者からの精製用キット緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて実施することができる。例えば、培養物中の細胞に由来する全RNAは、Qiagen製のRNeasy mini−columnsを用いて単離することができる。他の市販されるRNA単離キットには、MASTERPURE、Complete DNA and RNA Purification Kit(Epicentre、Madison、Wis.)、およびParaffin Block RNA Isolation Kit(Ambion、Austin、Tex.)が含まれる。組織試料に由来する全RNAは、例えば、RNA Stat−60(Tel−Test、Friendswood、Tex.)を用いて単離することができる。加えて、多数の組織試料は、例えば、Chomczynski(米国特許第4,843,155号)による単一ステップのRNA単離工程など、当業者に周知の技法を用いて、容易に加工することもできる。

0124

単離されたRNAは、PCR解析およびプローブアレイが含まれるがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて用いることができる。RNAレベルを検出する1つの方法は、単離されたRNAを、検出される遺伝子によりコードされるmRNAとハイブリダイズしうる核酸分子(プローブ)と接触させるステップを伴う。核酸プローブは、例えば、全長cDNAの場合もあり、少なくとも7、15、30、60、100、250、または500ヌクレオチドの長さであり、とりわけ、ストリンジェントな条件下で、本発明の内因性遺伝子、または任意の誘導体DNAもしくは誘導体RNAと特異的にハイブリダイズするのに十分であるオリゴヌクレオチドなど、その一部の場合もある。mRNAのプローブとのハイブリダイゼーションは、問題の内因性遺伝子が発現していることを示す。

0125

一実施形態では、mRNAを固体表面に固定化し、例えば、単離されたmRNAを、アガロースゲル上で泳動させ、このmRNAを、ゲルからニトロセルロースなどの膜へと転写することにより、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、プローブを固体表面に固定化し、mRNAを、例えば、Agilent製の遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触させる。当業者は、公知のmRNA検出方法を、本発明の内因性遺伝子の発現レベルを検出するのに用いるのに容易に適合させることができる。

0126

試料における遺伝子発現レベルを決定する代替的な方法は、例えば、RT−PCR(米国特許第4,683,202号)、リガーゼ連鎖反応(Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88巻:189〜93頁、1991年)、自家持続配列複製(Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87巻:1874〜78頁、1990年)、転写による増幅システム(Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻:1173〜77頁、1989年)、Q−Beta Replicase法(Lizardiら、Bio/Technology、6巻:1197頁、1988年)、ローリングサークル複製(米国特許第5,854,033号)、または他の任意の核酸増幅法を介する核酸増幅工程の後で、当業者に周知の技法を用いる、増幅された分子の検出を伴う。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少数で存在する場合に核酸分子を検出するのにとりわけ有用である。

0127

本発明の具体的な態様では、遺伝子発現を、定量的RT−PCRにより評価する。当技術分野では、多くの異なるPCRプロトコールまたはQPCRプロトコールが公知であり、これらは本明細書の以下でも例示され、先に記載した組成物を用いる、表3で列挙される遺伝子を検出および/または定量化するための使用に直接適用するかまたは適合させることができる。一般に、PCRでは、標的のポリヌクレオチド配列を、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマー対を伴う反応により増幅する。プライマー複数可)は、標的核酸相補性領域とハイブリダイズし、DNAポリメラーゼが、プライマー(複数可)を伸長させて、標的配列を増幅する。ポリメラーゼベースの核酸増幅産物をもたらすのに十分な条件下では、1つのサイズの核酸断片が、反応産物増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列)の大半を占める。増幅サイクルを繰り返して、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増大させる。反応は、PCRに一般的に用いられる任意のサーマルサイクラーにより実施できる。しかし、リアルタイム蛍光測定能力を有するサイクラー、例えば、SMARTCYCLER(Cepheid、Sunnyvale、Calif.)、ABIPRISM 7700(Applied Biosystems、FosterCity、Calif.)、ROTOR−GENE(Corbett Research、Sydney、Australia)、LIGHTCYCLER(Roche Diagnostics Corp、Indianapolis、Ind.)、ICYCLER(Biorad Laboratories、Hercules、Calif.)、およびMX4000(Stratagene、La Jolla、Calif.)が好ましい。

0128

一部の状況下では、定量的PCR(QPCR)(また、リアルタイムPCRとも称する)が、定量的測定だけでなく、時間の短縮および汚染の低減をもたらすために好ましい。場合によっては、新鮮凍結させた組織および専用の実験装置に対する要件のために、完全な遺伝子発現プロファイリング技術の利用可能性は限定されており、臨床状況下におけるこのような技法の日常的な使用は困難となっている。本明細書で用いられる「定量的PCR」(または「リアルタイム QPCR」)とは、それが反応産物を繰り返してサンプリングする必要なしに行われるので、PCR増幅の進行を直接的にモニタリングすることを指す。定量的PCRにおいて、反応産物が生成され、追跡されるのは、シグナルバックグラウンドレベルを上回って上昇した後であるが、反応がプラトー状態に到達する前であるので、シグナル発生機構(例えば、蛍光)を介して反応産物をモニタリングすることができる。検出可能レベルまたは「閾値」レベルの蛍光を達成するのに必要とされるサイクル数は、PCR工程の開始時における増幅可能な標的の濃度により直接変化し、シグナル強度尺度により、試料中の標的核酸の量の尺度をリアルタイムでもたらすことを可能としている。

0129

本発明の別の実施形態では、発現プロファイリングのためにマイクロアレイを用いる。マイクロアレイは、異なる実験間における再現性のために、特にこの目的に十分に適する。DNAマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定する1つの方法を提供する。各アレイは、固体の支持体に結合させた捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識化されたRNAまたはDNAは、アレイ上の相補的なプローブとハイブリダイズし、次いで、レーザー走査により検出される。アレイ上の各プローブについてのハイブリダイゼーション強度を決定し、相対遺伝子発現レベルを表す定量的な値に変換する。例えば、米国特許第6,040,138号、同第5,800,992号、および同第6,020,135号、同第6,033,860号、および同第6,344,316号を参照されたい。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のRNAについての遺伝子発現プロファイルを決定するのに特に有用である。

0130

マイクロアレイ解析は、Affymetrix GenChip技術、Illumina Bead Array技術、またはAgilentインクジェットマイクロアレイ技術などを用いることにより、製造元のプロトコールに従う市販の装置を介して実施することができる。

0131

「正規化」は、試料間の変動を取り除くのに用いることができる。マイクロアレイデータの場合、正規化の工程は、2つの標識化色素蛍光強度を比較することにより、系統的誤差を除去することを目的とする。色素の偏りは、色素の標識化効率、熱感受性および光感受性のほか、2つのチャネル走査するためのスキャナーの設定における差違を含めた多様な発生源から生じうる。正規化因子(normalization factor)を計算するのに一般に用いられる一部の方法には、(i)対数目盛による頑健な多重アレイ解析(RMA)などにより、アレイ上の全ての遺伝子を用いる、包括的正規化(global normalization)、(ii)一定に発現されるハウスキーピング遺伝子/不変遺伝子を用いる、ハウスキーピング遺伝子による正規化、および(iii)ハイブリダイゼーション時に添加される既知量の外因性対照遺伝子を用いる、内部対照による正規化(Quackenbush(2002年)、Nat. Genet.、32巻(増刊号)、496〜501頁)が含まれる。一実施形態では、本明細書で開示される遺伝子の発現を、対照のハウスキーピング遺伝子に対して、または対数目盛の頑健な多重アレイ解析(RMA)を介して正規化することができる。

0132

多様な例示的実施形態では、本発明が、部分的に、移植、例えば、骨髄移植において用いられる細胞集団を含む治療用組成物を提供する。本明細書で用いられる「細胞集団」とは、造血幹細胞および/または前駆細胞を含む不均質な細胞集団または均質な細胞集団を指す。造血幹細胞および/または前駆細胞を含む細胞集団は、骨髄細胞、臍帯血細胞、または動員末梢血細胞の場合もあり、とりわけ、骨髄、動員末梢血、および臍帯血を含めた、任意の適切な供給源から得られた細胞集団の場合もある。「細胞収集物」という用語はまた、細胞集団も指し、一部の実施形態では、「細胞集団」と同義である。しかし、細胞収集物が、任意の特定の細胞集団を指す必要はない。

0133

造血幹細胞および/または前駆細胞は、臍帯血、骨髄、末梢血、または他の供給源のいずれから得られたものであれ、所望に応じて血清を伴うかまたは伴わない、任意の適切な市販の培地中またはカスタムで規定される培地中で成長させるか、処理するか、または増殖させることができる(例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Hartshornら、Cell Technology for Cell products、221〜224頁; R. Smith編、Springer Netherlands、2007年を参照されたい)。例えば、特定の実施形態では、無血清培地では、無血清培地におけるCD34+細胞の成長および増殖に有用であることが示されている、アルブミンおよび/またはトランスフェリンを用いることができる。とりわけまた、Flt−3リガンド、幹細胞因子(SCF)、およびトロンボポエチンTPO)などのサイトカインも包含されうる。HSCは、バイオリアクターなどの容器内で成長させることもできる(例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Liuら、Journal of Biotechnology、124巻:592〜601頁、2006年を参照されたい)。ex vivoにおけるHSCの増殖に適する培地はまた、例えば、リンパ組織の解離から誘導することができ、in vitro、ex vivo、およびin vivoにおけるHSCのならびにそれらの後代の維持、成長、および分化を支持することが示されている、間質細胞(例えば、リンパ網内系間質細胞)などのHSC支持細胞も含みうる。

0134

具体的な実施形態では、細胞集団を、被験体に投与する前に、ex vivoまたはin vitroにおいて増殖させない。具体的な実施形態では、増殖させていない細胞集団を得、この細胞集団を、本明細書で示されるプロトコールに従い、ex vivoにおいて処理し、洗浄して処理薬剤を除去し、ex vivoにおいて細胞集団を増殖させることなしに患者に投与することができる。一部の実施形態では、細胞を、臍帯血を含めたドナーから得、そして細胞の処理前もしくは処理後に、または患者に治療用組成物を投与する前の任意の時点において増殖させない。一実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、集団内の細胞のex vivoにおける任意の実質的な細胞分裂の前に、またはex vivoにおける任意の実質的な細胞分裂に必要とされる時間の前に患者に投与する。他の実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、集団内の細胞のex vivoにおける任意の実質的な有糸分裂の前に、またはex vivoにおける任意の実質的な有糸分裂に必要とされる時間の前に患者に投与する。一部の実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、集団内の細胞の倍化時間の前に患者に投与する。一実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、集団内の細胞の倍化時間の前に患者に投与する。一部の実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、細胞を処理して6、12、または24時間以内に患者に投与する。他の実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、細胞を処理して2時間以内に患者に投与する。

0135

多様な実施形態では、細胞集団を、ex vivoにおいて薬剤で処理する前に、または患者に投与する前の任意の時点において培養しない。一部の実施形態では、細胞集団を、約24時間未満にわたり培養する。他の実施形態では、細胞集団を、約12時間、10時間、8時間、6時間、4時間、または2時間未満にわたり培養する。

0136

多様な実施形態では、本明細書の別の個所で記載される薬剤で処理され、その後被験体に投与する細胞集団が、全骨髄、臍帯血、動員末梢血、造血幹細胞、造血前駆細胞、ならびに顆粒球(例えば、前骨髄球骨髄球後骨髄球好中球好酸球好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、血小板(例えば、巨核芽球、血小板を生成する巨核球、血小板)、および単球(例えば、単球、マクロファージ)を含めた、造血幹細胞および前駆細胞の後代を含めた、不均質な細胞集団である。

0137

一実施形態では、治療用組成物が、約100%の造血幹細胞および前駆細胞である細胞集団を含む。一部の実施形態では、治療用組成物における細胞集団が、約0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、または30%未満の造血幹細胞および前駆細胞である。一部の実施形態では、細胞集団が、約0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、または30%未満のCD34+細胞である。他の実施形態では、細胞集団が、約0.1%〜約1%、約1%〜約3%、約3%〜約5%、約10%〜約15%、約15%〜20%、約20%〜25%、約25%〜30%、約30%〜35%、約35%〜40%、約40%〜45%、約45%〜50%、約60%〜70%、約70%〜80%、約80%〜90%、約90%〜95%、または約95%〜約100%の造血幹細胞および前駆細胞である。具体的な実施形態では、細胞集団が、約0.1%〜約1%、約1%〜約3%、約3%〜約5%、約10%〜約15%、約15%〜20%、約20%〜25%、約25%〜30%、約30%〜35%、約35%〜40%、約40%〜45%、約45%〜50%、約60%〜70%、約70%〜80%、約80%〜90%、約90%〜95%、または約95%〜約100%のCD34+細胞である。

0138

本発明の治療用組成物における細胞は、自系/同体(「自己」)の場合もあり、非自系(「非自己」、例えば、同系異種、同系、または異種)の場合もある。本明細書で用いられる「自系」とは、同じ被験体に由来する細胞を指す。本明細書で用いられる「同系異種」とは、比較される細胞とは遺伝子的に異なる、同じ種の細胞を指す。本明細書で用いられる「同系」とは、比較される細胞と遺伝子的に同一である、異なる被験体の細胞を指す。本明細書で用いられる「異種」とは、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。具体的な実施形態では、本発明の細胞が同系異種である。

0139

「幹細胞」とは、分化していない細胞であって、(1)長期にわたる自己再生、または元の細胞の少なくとも1つの同一のコピーを生成させる能力、(2)単一の細胞レベルにおける、複数の特化した細胞型への分化、および、場合によって、唯一の特化した細胞型への分化、ならびに(3)in vivoにおける組織の機能的再生が可能な細胞を指す。幹細胞は、それらの発生上の能力により、全能性多能性(pluripotent)、多分化能(multipotent)、および少能性/単能性下位分類される。「前駆細胞」もまた、自己再生能およびより成熟した細胞へ分化する能力を有するが、系統(例えば、造血前駆細胞は、血液系統に拘束され、骨髄前駆細胞は、骨髄系統に拘束され、リンパ前駆細胞は、リンパ系統に拘束される)に拘束されるのに対し、幹細胞は、必ずしもそのようには限定されない。「自己再生」とは、変化していない娘細胞をもたらし、したがって、その集団数を補充および維持し、特化した細胞型を生成させる固有の能力(効力)を有する細胞を指す。自己再生は、2つの方法で達成されうる。非対称性の細胞分裂は、親細胞と同一である1つの娘細胞と、親細胞とは異なり、より拘束された前駆細胞またはより分化した細胞である今1つの娘細胞とをもたらす。対称性の細胞分裂は、2つの同一な娘細胞をもたらす。細胞の「増殖(proliferation)」または「増殖(expansion)」とは、対称的に分裂する細胞を指す。

0140

造血幹細胞(HSC)は、生体生存期間にわたり、成熟血液細胞のレパートリー全体を生成させることが可能な、拘束された造血前駆細胞(HPC)をもたらす。「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、骨髄系統(例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞)およびリンパ系統(例えば、T細胞、B細胞NK細胞)、ならびに当技術分野において公知である他の系統(Fei, R.ら、米国特許第5,635,387号; McGlaveら、米国特許第5,460,964号; Simmons, P.ら、米国特許第5,677,136号; Tsukamotoら、米国特許第5,750,397号; Schwartzら、米国特許第5,759,793号; DiGuistoら、米国特許第5,681,599号; Tsukamotoら、米国特許第5,716,827号を参照されたい)を含めた、生体の全ての血液細胞型をもたらす、多分化能幹細胞を指す。致死的照射された動物またはヒトへと移植されると、造血幹細胞は、赤血球プール、好中球−マクロファージプール、巨核球プール、およびリンパ造血細胞プールを再配置させる(repopulate)ことが可能である。

0141

HSCは、特定の表現型マーカーまたは遺伝子型マーカーに従い同定することができる。例えば、HSCは、それらのサイズが小型であること、系統(lin)マーカーが欠如していること、ロダミン123(また、rholoとも呼ばれる、ロダミンDULL)またはHoechst 33342などの生体色素によってあまり染色されないこと(サイドポピュレーション(side population))、およびそれらの表面における多様な抗原性マーカー(そのうちの多くが分化系列のクラスター(例えば、CD34、CD38、CD90、CD133、CD105、CD45、およびc−kit、幹細胞因子の受容体)に属する)が存在することにより同定することができる。HSCは、主に、系統への拘束を検出するのに用いられることが典型的であるマーカーについて陰性であり、したがって、Lin(−)細胞と称することが多い。大半のヒトHSCは、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/−、C−kit/CD117+、およびLin(−)として特徴づけることができる。しかし、あるHSCは、CD34−/CD38−であるので、全ての幹細胞がこれらの組合せにより網羅されるわけではない。また、一部の研究は、最初期の幹細胞が、細胞表面におけるc−kitを欠く場合があることを示唆する。ヒトHSCでは、CD34+HSCおよびCD34−HSCの両方がCD133+であることが示されているので、CD133が、初期マーカーを表しうる。当技術分野では、CD34+およびLin(−)細胞がまた、造血前駆細胞も包含することが公知である。

0142

本発明の方法において用いられる造血幹細胞および前駆細胞の適切な供給源には、造血起源の細胞を含有する体内の臓器から単離されるかまたは得られる細胞が含まれるがこれらに限定されない。「単離される」とは、その元の環境から取り出される材料を意味する。例えば、細胞が、通常はその天然状態においてそれに随伴する一部または全ての構成要素から分離される場合に、その細胞は単離される。例えば、本明細書で用いられる「単離された細胞集団」、「単離された細胞の供給源」、または「単離された造血幹細胞および前駆細胞」などは、in vitroまたはex vivoにおいて、1または複数の細胞を、それらの天然細胞環境から、かつ、組織または臓器の他の構成要素との関連から分離すること、すなわち、それがin vivoにおける物質と著明に関連するわけではないことを指す。

0143

本発明の方法において用いられる造血幹細胞および前駆細胞からは、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球細胞などの成熟造血細胞、および骨髄吸引物、臍帯血、または動員末梢血(動員された白血球搬出産物)に由来するそれらの拘束された前駆細胞を枯渇させることができる。成熟した、系統に拘束された細胞は、免疫枯渇により、例えば、固体担体を、いわゆる「系統」抗原:CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、およびCD235aのパネルに結合する抗体で標識化することにより枯渇させる。CD34+抗原に結合する抗体で標識した担体を用いて未分化の造血幹細胞および前駆細胞を単離する後続のステップを実施して、細胞集団をさらに精製することができる。造血幹細胞および前駆細胞を、多様な細胞供給源から精製するためのキットが市販されており、具体的な実施形態では、これらのキットが、本発明の方法と共に用いるのに適する。造血幹細胞および前駆細胞を精製するための例示的な市販のキットには、Lineage(Lin)Depletion Kit(Miltenyi Biotec)、CD34+ enrichment kit(Miltenyi Biotec)、RosettaSep(Stem Cell Technologies)が含まれるがこれらに限定されない。

0144

一部の実施形態では、本発明の治療用組成物を構成する細胞集団が、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の間葉系幹細胞を含む。具体的な実施形態では、細胞集団が、約10%以下の間葉系幹細胞を含む。間葉系幹細胞(MSC)とは、骨芽細胞筋細胞軟骨細胞、および脂肪細胞を含めた系統へと容易に分化しうる多分化能幹細胞である(Pittengerら、Science、284巻、143頁(1999年); Haynesworthら、Bone、13巻、69頁(1992年); Prockop、Science、276巻、71頁(1997年))。

0145

他の実施形態では、本発明の治療用組成物を構成する細胞集団が、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の内皮前駆細胞を含む。他の実施形態では、細胞集団が、約10%未満の内皮前駆細胞を含む。本明細書で用いられる「内皮前駆細胞」とは、血管内皮細胞へと分化する能力を有する多分化能細胞または単能性細胞を指す。

0146

より具体的な実施形態では、細胞集団が、約10%以下の間葉系幹細胞または内皮前駆細胞を含む。

0147

ドナーから得られるかまたは別の形で提供される細胞集団は、間葉系幹細胞および/または内皮前駆細胞を実質的に含まない場合があり、具体的な実施形態では、約10%未満の間葉系幹細胞および約10%未満の内皮前駆細胞を含む場合がある。代替的に、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、免疫磁気選択技術(immunomagnetic selection technique)、蛍光活性細胞分取、またはこれらの組合せを用いて、間葉系幹細胞および/または内皮前駆細胞を枯渇させることもできる。枯渇法は、本明細書で記載される細胞表面マーカーのうちの少なくとも1つに特異的な少なくとも1つの抗体の使用をさらに含みうる。

0148

一部の実施形態では、細胞集団から、CD14細胞表面マーカーについて陽性であり、かつ、CD45について陰性である(CD14+/CD45−)細胞、および/またはVWF(フォンウィレブランド因子)について陽性である(VWF+)細胞を含めた、内皮前駆細胞を枯渇させる。他の実施形態では、細胞集団から、CD73および/またはCD140B細胞表面マーカーについて陽性である細胞を枯渇させる。本発明の具体的な実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのCD34について陽性である細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の、CD73、CD140B、CD14、およびVWFからなる群より選択される細胞表面マーカーについて陽性である細胞を含む。

0149

具体的な実施形態では、本発明の治療用組成物を構成する細胞集団が、CD34+細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満のCD14+/CD45−細胞を含む。本発明の他の実施形態では、細胞集団が、CD34+細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満のVWF+細胞を含む。本発明の他の実施形態では 、細胞集団が、CD34+細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満のCD140B+細胞を含む。

0150

より具体的な実施形態では、細胞集団が、CD34+造血幹細胞またはCD34+前駆細胞を含み、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満のCD14+/CD45−細胞、VWF+細胞、CD73+細胞、およびCD140B+細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのCD34について陽性であり、CD14、VWF、CD73、およびCD140Bからなる群より選択される少なくとも1つの細胞表面マーカーについて陰性である。他の実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのCD34について陽性であり、細胞表面マーカーであるCD14、VWF、CD73、およびCD140Bについて陰性である。

0151

造血幹細胞および前駆細胞は、成体分画されていない骨髄または分画された骨髄から得ることもでき、これらから単離することもでき、これらには大腿骨寛骨肋骨胸骨、および他の骨が含まれる。造血幹細胞および前駆細胞は、注射針およびシリンジを用いて寛骨から取り出すことにより、直接得るかまたは単離することもでき、しばしば、細胞が骨髄コンパートメントから放出または動員されるように誘導する、G−CSF顆粒球コロニー刺激因子)などのサイトカインによる前処理の後で、血液から得るかまたは単離することもできる。造血幹細胞および前駆細胞の他の供給源には、臍帯血、胎盤血(placental blood)、および動員末梢血が含まれる。実験目的では、動物の胎仔肝臓、胎仔脾臓腎臓髄質(kidney marrow)、およびAGM(Aorta−gonad−mesonephros)もまた、造血幹細胞および前駆細胞の有用な供給源である。

0152

具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、造血源、例えば、骨髄細胞、臍帯血、または動員末梢血細胞から採取する。造血幹細胞および前駆細胞を「採取する」とは、マトリックスからの細胞の脱離または分離と定義される。これは、酵素的方法、非酵素的方法、遠心分離法電気的方法、もしくはサイズベースの方法など、多数の方法を用いて達成することもでき、好ましくは、培地(例えば、細胞がインキュベートされる培地)を用いて細胞をフラッシングすることにより達成することもできる。具体的な実施形態では、移植に十分な量の細胞を採取することが、ドナーにおいて幹細胞および前駆細胞を動員するステップを必要としうる。

0153

「造血幹細胞の動員」とは、幹細胞移植の前の白血球搬出を目的とする、幹細胞の骨髄から末梢血循環への放出を指す。動員を刺激するために、造血性増殖因子、例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)または化学療法剤を用いることが多い。幹細胞動員薬が市販されており、これをG−CSFと組み合わせて用いて、被験体への移植に十分な量の造血幹細胞および前駆細胞を動員することができる。例えば、移植に十分な数の造血細胞を採取するために、G−CSFおよびMozobil(商標)(Genzyme Corporation)をドナーに投与することができる。

0154

ドナーから採取される幹細胞数、被験体に戻して移植するのに利用可能な幹細胞数を増大させることにより、被験体の転帰を顕著に改善し、これにより、生着までの時間を短縮することを可能とし、その結果、被験体が有する好中球および血小板が不十分となる時間を短縮し、このために、感染、出血、または他の合併症を防止することができる。当業者には、造血幹細胞および前駆細胞を動員する他の方法が明らかであろう。

0155

具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、臍帯血から得る。臍帯血は、当技術分野において公知の技法(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,147,626号および同第7,131,958号を参照されたい)に従い採取することができる。

0156

一実施形態では、治療用組成物および本発明の方法において用いられる造血幹細胞および前駆細胞を、多能性幹細胞の供給源、例えば、人工多能性幹細胞(iPSC)および胚性幹細胞ESC)から得ることができる。本明細書で用いられる用語「人工多能性幹細胞」または「iPSC」とは、多能性状態へと再プログラム化された非多能性細胞を指す。被験体の細胞を多能性状態へと再プログラム化したら、細胞を、造血幹細胞または前駆細胞など、所望の細胞型へとプログラム化することができる。本明細書で用いられる「再プログラム化する」という用語は、細胞がより分化していない状態を指向する能力を増大させる方法を指す。本明細書で用いられる「プログラム化する」とは、細胞のこの能力を減少させるか、または細胞をより分化した状態へと分化させる方法を指す。

0157

多様な実施形態では、本発明が、治療用組成物の、ヒト患者、または療法を必要とする被験体への投与を意図する。治療用組成物に含有され、患者に投与される造血幹細胞または前駆細胞の量は、細胞の供給源、個体の疾患状態(disease state)、年齢性別、および体重、ならびに造血幹細胞および前駆細胞が個体において所望の応答を誘発する能力と共に変化する。

0158

一実施形態では、被験体に投与する治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞(例えば、CD34+細胞、Lin(−))の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または少なくとも0.1×105個の細胞、少なくとも0.5×105個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも5×105個の細胞、少なくとも10×105個の細胞、少なくとも0.5×106個の細胞、少なくとも0.75×106個の細胞、少なくとも1×106個の細胞、少なくとも1.25×106個の細胞、少なくとも1.5×106個の細胞、少なくとも1.75×106個の細胞、少なくとも2×106個の細胞、少なくとも2.5×106個の細胞、少なくとも3×106個の細胞、少なくとも4×106個の細胞、少なくとも5×106個の細胞、少なくとも10×106個の細胞、少なくとも15×106個の細胞、少なくとも20×106個の細胞、少なくとも25×106個の細胞、もしくは少なくとも30×106個の細胞である。

0159

具体的な実施形態では、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞(例えば、CD34+細胞、Lin(−))の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または約0.1×105個の細胞〜約10×105個の細胞、約0.5×106個の細胞〜約5×106個の細胞、約1×106個の細胞〜約3×106個の細胞、約1.5×106個の細胞〜約2.5×106個の細胞、もしくは約2×106個の細胞〜約2.5×106個の細胞である。

0160

具体的な実施形態では、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または約1×106個の細胞〜約3×106個の細胞、約1.0×106個の細胞〜約5×106個の細胞、約1.0×106個の細胞〜約10×106個の細胞、約10×106個の細胞〜約20×106個の細胞、約10×106個の細胞〜約30×106個の細胞、もしくは約20×106個の細胞〜約30×106個の細胞である。

0161

別の実施形態では、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または約1×106個の細胞〜約30×106個の細胞; 約1.0×106個の細胞〜約20×106個の細胞、約1.0×106個の細胞〜約10×106個の細胞、約2.0×106個の細胞〜約30×106個の細胞、約2.0×106個の細胞〜約20×106個の細胞、もしくは約2.0×106個の細胞〜約10×106個の細胞である。

0162

具体的な実施形態では、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞の量が、約1×106個の造血幹細胞または前駆細胞、約2×106個の細胞、約5×106個の細胞、約7×106個の細胞、約10×106個の細胞、約15×106個の細胞、約17×106個の細胞、約20×106個の細胞、約25×106個の細胞、または約30×106個の細胞である。

0163

一実施形態では、被験体に投与する、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または体重1kg当たり少なくとも0.1×105個の細胞、体重1kg当たり少なくとも0.5×105個の細胞、体重1kg当たり少なくとも1×105個の細胞、体重1kg当たり少なくとも5×105個の細胞、体重1kg当たり少なくとも10×105個の細胞、体重1kg当たり少なくとも0.5×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも0.75×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも1×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも1.25×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも1.5×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも1.75×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも2×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも2.5×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも3×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも4×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも5×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも10×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも15×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも20×106個の細胞、体重1kg当たり少なくとも25×106個の細胞、もしくは体重1kg当たり少なくとも30×106個の細胞である。

0164

任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明は、部分的に、本方法の利点のうちの1つが、本発明の治療用組成物における、増強された造血幹細胞および前駆細胞は、対照の処理した細胞、および、例えば、4℃において薬剤で処理した細胞と比較して、生着の潜在能を増大させ、ホーミングを改善し、in vivoにおける増殖能を増大させているために、移植において用いる造血幹細胞および前駆細胞を少なくし得ることであることを意図する。

0165

C.本発明の方法
本発明者らは、幹細胞移植において用いられる造血幹細胞および前駆細胞の有効性を増大させるために、プロスタグランジン経路を刺激し、CXCR4の遺伝子発現および細胞表面におけるCXCR4の発現を上方制御する薬剤を含めた、細胞の遺伝子発現を改変する薬剤で処理した造血幹細胞集団および前駆細胞集団についての複数の生物学的パラメータを解析した。移植時における被験体の造血系を再構築するときの細胞集団の有効性は、細胞集団が、in vivoにおいて骨髄にホーミングおよび生着し、自己再生し、増殖する能力などの特性に依存する。本発明は、細胞集団を調節して、このような細胞特性を改善し、結果としてもたらされる、造血再構築における治療的改善をもたらす方法を提供する。

0166

「生着の潜在能」とは、細胞が生着する能力を指す。具体的な実施形態では、CD34+細胞、Lin(−)細胞など、造血幹細胞または前駆細胞の生着の潜在能を、例えば、PGE2R2/R4細胞シグナル伝達経路の活性、細胞におけるホーミングまたは生着、細胞生存度、および細胞の自己再生能と関連する遺伝子の発現を測定することにより、決定することができる。当然ながら、当業者は、また、造血幹細胞または前駆細胞における生着の潜在能の増大も示す、他の適切なアッセイについても理解するであろう。本明細書で用いられる用語「生着する」とは、細胞が組織などの位置へと組み込まれ、ある時間にわたり、特定の位置に残存する能力、例えば、造血幹細胞または前駆細胞が骨髄に組み込まれ、残存する能力を指す。「ホーミング」とは、造血幹細胞または前駆細胞が局在化する能力、すなわち、移植された幹細胞の骨髄への局在化など、特定の領域または組織に移動する能力を指す。

0167

多様な実施形態では、本発明が、プロスタグランジン経路、例えば、PGE2R2/R4細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させることが可能である1または複数の薬剤と接触させたヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む治療用組成物を提供する。処理した細胞の治療用組成物は、例えば、in vivoにおける細胞集団のホーミング、生着、および増殖の増大など、幹細胞移植において既に用いられている細胞を凌駕する多くの利点をもたらす。本明細書で用いられる「薬剤」とは、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤を指す。このような薬剤には、例えば、しかし限定なしに述べると、PGE2またはdmPGE2活性を有する薬剤、限定なしに述べると、本明細書の別の個所で記載される、PGE2類似体、cAMP類似体もしくはcAMP活性化因子、および/またはGα−s活性化因子を含めた、PGE2またはdmPGE2活性を有する薬剤が含まれる。具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、任意に組み合わされた1つ、2つ、3つ、4つ、5つ以上の薬剤と、同時的または逐次的に接触させることができる。

0168

PGE2またはdmPGE2活性を有する薬剤など、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と、生着および/または生着の潜在能および/または増殖を増大させるのに十分な条件下で接触させたヒト造血幹細胞または前駆細胞は、生化学的アッセイにより決定される、細胞内のcAMPのシグナル伝達レベル、例えば、CREBのリン酸化レベルの増大により、遺伝子発現アッセイ、例えば、マイクロアレイにより決定される、PGE2R2/R4細胞シグナル伝達経路に関与する遺伝子(、例えば、CREM)、および造血幹細胞および前駆細胞のホーミングおよび生着を増大させる遺伝子(例えば、CXCR4遺伝子)の上方制御を示す遺伝子発現シグネチャーにより、細胞生存度アッセイ、例えば、7−アミノアクチノマイシンD(7−AAD)染色により決定される、造血幹細胞生存度および前駆細胞生存度において測定可能な減少がないこと、および/または、例えば、in vitroにおけるコロニー形成単位(CFU−C)アッセイにより決定される、造血幹細胞の自己再生能の増大など、複数で多様にわたる方法により特徴づけることができる。

0169

一実施形態では、PGE2またはdmPGE2活性を有する薬剤など、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と、生着および/または生着の潜在能および/または増殖を増大させるのに十分な条件下で接触させた造血幹細胞または前駆細胞は、接触させた(処理した)細胞の遺伝子発現シグネチャーを、ビヒクルで処理した細胞、または4℃において薬剤で処理した細胞と比較して検討することにより同定することができる。

0170

具体的な実施形態では、生着および/もしくは生着の潜在能を増大させ、かつ/またはin vivoにおける増殖を増大させた、処理した造血幹細胞または前駆細胞が、以下の遺伝子:ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性プロテインホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核内受容体関連1タンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP応答性エレメントモジュレーター(CREM)、I型コラーゲンアルファ1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、およびCXCケモカイン受容体4(CXCR4)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または全ての発現を、ビヒクルで処理した細胞、または4℃において薬剤で処理した細胞と比較して増大させている。本発明の特定の実施形態では、CXCR4が、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞において、処理されていない細胞におけるCXCR4の発現レベルと比較して、少なくとも4倍上方制御される。

0171

前臨床研究に由来する観察とは対照的に、本発明者らは、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤と、本明細書で記載される特定の条件下で接触させた造血幹細胞および前駆細胞が、細胞の増殖および生着の潜在能を増大させることを発見した。これらの条件は、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤による処理の、幹細胞のホーミング、生存、増殖、および生着を含めた所望の生物学的応答を最適化する。

0172

したがって、本発明者らは、造血幹細胞および前駆細胞の生存度を低下させ、dmPGE2の半減期を短縮すると考えられている条件が、細胞生存度を保持する、骨髄へのホーミングおよび生着を増大させ(例えば、CXCR4発現の増大)、細胞の自己再生能を増大させるために、予測外にも、生着および/またはin vivoにおける増殖の潜在能の増大を示す造血幹細胞または前駆細胞を結果としてもたらすことを発見した。

0173

したがって、本発明は、骨髄移植、末梢血移植、および臍帯血移植を、部分的には、造血幹細胞集団または前駆細胞集団を、dmPGE2など、PGE2R2/R4細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるCXCR4の発現を上方制御する、本明細書で記載される薬剤で、造血幹細胞および前駆細胞の生着、またはin vivoにおける造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させるのに好ましいとは予測されていない条件下において処理することにより実施するための新規の方法を意図する。

0174

本明細書で用いられる「十分な条件」または「十分な条件下で」という用語は、移植材料、例えば、骨髄細胞、末梢血細胞、もしくは臍帯血細胞、ならびに/または造血幹細胞および/もしくは前駆細胞を含む他の細胞集団、ならびに/または濃縮もしくは選択された造血幹細胞集団および前駆細胞集団の供給源を、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる薬剤で処理するためのインキュベーション条件を指す。一実施形態では、条件が、被験体に投与する造血幹細胞および前駆細胞の生着を増大させるのに十分な条件である。一実施形態では、この条件は、被験体に投与する造血幹細胞または前駆細胞の増殖を増大させるのに十分なものである。別の実施形態では、条件が、被験体に投与する造血幹細胞集団または前駆細胞集団の生着および増殖を増大させるのに十分である。インキュベーション条件には、細胞の供給源、薬剤の濃度、細胞と薬剤とのインキュベーションの持続時間、およびインキュベーションの温度が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、薬剤が、PGE2またはdmPGE2活性を有する薬剤である。一実施形態では、薬剤が、16,16−ジメチルPGE2である。

0175

多様な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞の生着および/または増殖を増大させるのに十分な条件には:約22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、および39℃の温度が含まれるがこれらに限定されない、約39℃の温度範囲(ほぼ室温〜ほぼ体温)など、生理学的に適切な温度;約100nM、約500nM、約1μM、約10μM、約20μM、約30μM、約40μM、約50μM、約60μM、約70μM、約80μM、約90μM、約100μM、約110μM、もしくは約120μM、または他の任意の中間の濃度の16,16−ジメチルPGE2(例えば、0.1μM、1μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)が含まれるがこれらに限定されない、約10nM〜約120μMの16,16−ジメチルPGE2の最終濃度において;ならびに約60分間、約70分間、約80分間、約90分間、約100分間、約110分間、約2時間、約2.5時間、約3時間、約3.5時間、もしくは約4時間の持続時間、またはインキュベーションの他の任意の中間の持続時間(例えば、111分間、112分間、113分間、114分間、115分間、116分間、117分間、118分間、119分間)にわたるインキュベーションが含まれるがこれらに限定されない、約60分間〜約4時間にわたるインキュベーションが含まれる。

0176

本明細書で用いられる「約(about)」または「約(approximately)」という用語は、基準の濃度、温度、持続時間、量(quantity)、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量(amount)、重量、または長さに対して、最大で30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1%変化する濃度、温度、持続時間、量(quantity)、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量(amount)、重量、または長さを意味する。例えば、好ましい実施形態では、この用語が、ほぼ特定の量±10%を中心とする量の範囲を指す、例えば、約37℃という温度が、33℃〜41℃の温度範囲を指す。別の好ましい実施形態では、この用語が、ほぼ特定の量±5%を中心とする量の範囲を指す。別の好ましい実施形態では、この用語が、ほぼ特定の量±1%を中心とする量の範囲を指す。

0177

具体的な実施形態では、造血幹細胞および前駆細胞の生着および/またはin vivoにおける増殖を増大させるのに十分な条件には、約35℃〜約39℃の温度範囲、約10μM〜約25μMの16,16−ジメチルPGE2の最終濃度におけるインキュベーション、および約1時間〜約4時間にわたる、約2時間〜約3時間にわたる、約2時間〜約4時間にわたる、または約3時間〜約4時間にわたるインキュベーションが含まれる。

0178

別の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞の生着および/またはin vivoにおける増殖を増大させるのに十分な条件には、約37℃(ほぼ体温)の温度、約10μM以上の16,16−ジメチルPGE2の最終濃度におけるインキュベーション、および約2時間にわたるインキュベーションが含まれる。

0179

別の実施形態では、造血幹細胞もしくは前駆細胞を含むヒト臍帯血、骨髄細胞、もしくは動員末梢血細胞、またはLin(−)CD34+、造血幹細胞もしくは前駆細胞の精製された集団を、120分間以上にわたり、37℃の温度で、最終濃度を10μMとする16,16−dmPGE2(dmPGE2)と接触させることにより、造血幹細胞または前駆細胞の、被験体の骨髄における生着の潜在能を増大させる。接触させた細胞は、細胞生存度の統計学的に有意な低下を示さず、造血幹細胞または前駆細胞のホーミングおよび生着ならびに自己再生能と関連する遺伝子発現の統計学的に有意な増大を示す。

0180

別の実施形態では、造血幹細胞もしくは前駆細胞を含むヒト臍帯血、骨髄細胞、もしくは動員末梢血細胞、またはLin(−)CD34+、造血幹細胞もしくは前駆細胞の精製された集団を、120分間以上にわたり、37℃の温度で、最終濃度を10μMとする16,16−dmPGE2(dmPGE2)と接触させることにより、被験体に投与する造血幹細胞集団または前駆細胞集団のin vivoにおける増殖を増大させる。

0181

多様な実施形態では、本発明が、部分的に、造血幹細胞移植および前駆細胞移植のための細胞集団を取得および調製するための方法であって、細胞集団を、細胞の生着の潜在能および/または生着を増大させるのに十分な条件下で、PGE2R2および/またはPGE2R4細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる1または複数の薬剤と接触させるステップを含む方法を提供する。

0182

具体的な実施形態では、本発明が、部分的に、被験体における造血幹細胞および前駆細胞の量を増大させるための細胞集団を取得および調製するための方法であって、細胞集団を、in vivoにおける細胞集団の増殖を増大させるのに十分な条件下で、PGE2R2および/またはPGE2R4細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるCXCR4の遺伝子発現を増大させる1または複数の薬剤と接触させるステップを含む方法を提供する。

0183

他の多様な実施形態では、本発明が、部分的に、被験体における造血幹細胞および前駆細胞の生着を増大させる方法であって、CD34は発現するがLinは発現しない造血細胞(例えば、Lin(−)CD34+細胞)を含む細胞集団を、プロスタグランジンE2(PGE2)またはdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を被験体に投与するステップとを含む方法を提供する。細胞は、本明細書の別の個所で記載される、被験体における接触させた造血幹細胞および前駆細胞の生着を増大させるのに十分な条件下で薬剤と接触させる。

0184

特定の実施形態では、本発明が、部分的に、in vivoの被験体における造血幹細胞および前駆細胞集団を増殖させる方法であって、CD34は発現するがLinは発現しない造血細胞(例えば、Lin(−)CD34+細胞)を含む細胞集団を、プロスタグランジンE2(PGE2)またはdmPGE2活性を有する薬剤からなる群より選択される1または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を被験体に投与するステップとを含む方法を提供する。細胞は、本明細書の別の個所で記載される、被験体における、接触させた造血幹細胞集団および前駆細胞集団を増殖させるのに十分な条件下で薬剤と接触させる。

0185

本発明は、部分的に、それを必要とする被験体(例えば、ヒト)における幹細胞の生着を増大させる方法であって、造血幹細胞および/または前駆細胞(例えば、骨髄細胞、末梢血細胞、および/または臍帯血細胞)を含む細胞集団を、PGE2またはその類似体、例えば、16,16−ジメチルPGE2(dmPGE2)またはdmPGE2活性を有する薬剤と接触させるステップと、細胞を被験体に投与するステップとを含む方法を意図する。一実施形態では、造血幹細胞および/または前駆細胞を含む細胞の供給源を、dmPGE2などのPGE2類似体と接触させる。多様な実施形態では、造血幹細胞および/または前駆細胞を含む細胞の供給源を、dmPGE2など、dmPGE2活性を有する薬剤、cAMP類似体もしくはcAMPエンハンサー、またはGα−s活性化因子と接触させる。

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