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図面 (13)

課題

薬効を維持しながら、治療用タンパク質およびペプチド半減期延長させる技術の提供、および血清定性が高く、活性が高く、および対象に注射した場合に望ましくない免疫応答誘導する可能性の低いペプチド薬の提供。

解決手段

9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)などの可逆的リンカーを介して連結されたオキシントモジュリンおよびポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を含む組成物。逆ペグ化オキシントモジュリンを含む医薬組成物およびその使用方法

概要

背景

消化管は、膵臓タンパク質(PP)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、ペプチドYY(PYY)およびオキシントモジュリンを含む、摂食行動を調節する多くのペプチドホルモンの合成ならびに放出を担っている。OXMは、腸およびCNSにおけるプログルカゴン組織特異的な移行後のプロセシングから生じる。OXMは、インビトロおよびインビボの両方でOXMの特性に寄与するが、単独ではペプチドの作用に十分ではないことが示された基礎的なオクタペプチド伸長C末端に有する、完全なグルカゴン配列を含む37個のアミノ酸を含む。食物摂取応答して、OXMは、食事カロリー含量に比例して、腸のL細胞によって血流中に分泌される。

OXMは、経口投与腹腔内投与の両方の後にインスリン分泌刺激を介してグルコースクリアランスを向上させる。OXMは摂食量も調節する。視床下部の室傍および弓状核(ARC)へのOXMの脳室内注射(ICV)ならびに核内注射は、空腹のラットにおいて再摂食を抑制する。この抑制は、暗期の開始時に自由に摂食させたラットにおいても示されている。さらに、OXMの末梢投与は、空腹によって誘導される食物摂取および暗期の食物摂取の両方を用量依存的に抑制した。

短い血清半減期などの好ましくない薬物動態は、それ以外の点では有望な多くの薬剤候補医薬品開発を妨げ得る。血清半減期は、実験によって得られる分子の特性であり、それぞれの新しい有望な薬物について実験的に決定する必要がある。例えば、低分子量タンパク質薬物を用いて、濾過などの生理的なクリアランス機構は、必要な投与計画コストまたは頻度により実現不可能な薬物の治療ベルを維持することができる。

概要

薬効を維持しながら、治療用タンパク質およびペプチドの半減期延長させる技術の提供、および血清定性が高く、活性が高く、および対象に注射した場合に望ましくない免疫応答を誘導する可能性の低いペプチド薬の提供。9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)などの可逆的リンカーを介して連結されたオキシントモジュリンおよびポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を含む組成物。逆ペグ化オキシントモジュリンを含む医薬組成物およびその使用方法

目的

本発明は、デュアルGLP−1/グルカゴン受容体アゴニスト、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)もしくは2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を含むか、またはそれらからなる組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

以下の構造式のいずれか1つによって表される結合体であって、、または式中、R2は、HまたはSO3Hである、結合体。

請求項2

請求項1に記載の結合体であって、PEGは、PEG30であることを特徴とする結合体。

請求項3

請求項1に記載の結合体であって、R2は、2位にあることを特徴とする結合体。

請求項4

請求項1〜3のいずれか1項に記載の結合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物

請求項5

医薬を製造するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の結合体または請求項4に記載の医薬組成物の使用。

請求項6

肥満治療するための医薬を製造するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の結合体または請求項4に記載の医薬組成物の使用。

請求項7

以下の構造式によって表される結合体の製造方法であって、前記オキシントモジュリン(OXM、配列番号1のもの)は、前記オキシントモジュリンの末端アミノ基を介してリンクされ、R2は、HまたはSO3Hであり、それぞれはPEG−Fmoc−OXM(N末端)及びPEG−FMS−OXM(N末端)を表し、前記方法は、下記のMAL−FMS−NHSまたはMAL−Fmoc−NHS、即ちまたはと、樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンであって、前記樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンのLys12及びLys30のアミノ側鎖は、各々保護基で保護されている、該樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンと反応させて、樹脂結合MAL−Fmoc−保護OXM(N末端)または樹脂結合MAL−FMS−保護OXM(N末端)を得る反応ステップを含み、前記方法は更に、前記反応ステップの後に、(a)前記樹脂結合MAL−Fmoc−保護OXM(N末端)または前記樹脂結合MAL−FMS−保護OXM(N末端)とスルフヒドリルPEGポリマー(PEG−SH)とを反応させ、その後に前記保護基及び前記樹脂の除去を行うか、または(b)前記保護基及び前記樹脂の除去を行ってMAL−Fmoc−OXM(N末端)またはMAL−FMS−OXM(N末端)を得て、その後前記MAL−Fmoc−OXM(N末端)または前記MAL−FMS−OXM(N末端)とスルフヒドリルPEGポリマー(PEG−SH)とを反応させて、PEG−Fmoc−OXM(N末端)またはPEG−FMS−OXM(N末端)を得るステップを含むことを特徴とする方法。

請求項8

請求項7に記載の方法であって、前記PEGは、PEG30であることを特徴とする方法。

請求項9

請求項7に記載の方法であって、R2またはSO3Hは、2位にあることを特徴とする方法。

請求項10

請求項7に記載の方法であって、前記MAL−Fmoc−保護OXM(N末端)及び前記MAL−FMS−保護OXM(N末端)の前記Lys12及びLys30のアミノ側鎖の前記保護基は除去されて、MAL−Fmoc−OXM(N末端)及びMAL−FMS−OXM(N末端)がそれぞれ得られ、前記MAL−Fmoc−OXM(N末端)及び前記MAL−FMS−OXM(N末端)は更に精製されることを特徴とする方法。

請求項11

請求項7に記載の方法であって、前記MAL−Fmoc−保護OXM(N末端)及び前記MAL−FMS−保護OXM(N末端)の前記Lys12及びLys30のアミノ側鎖の前記保護基は、ivDde(1−[(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキサ−1−イリジンエチル])であることを特徴とする方法。

請求項12

請求項7に記載の方法であって、前記保護基は、塩基性条件下で除去されることを特徴とする方法。

請求項13

以下の構造式によって表される結合体の製造方法であって、前記オキシントモジュリン(OXM、配列番号1のもの)は、前記オキシントモジュリンのLys12のアミノ側鎖を介してリンクされ、R2は、HまたはSO3Hであり、それぞれはPEG−Fmoc−OXM(Lys12)及びPEG−FMS−OXM(Lys12)を表し、前記方法は、下記のMAL−FMS−NHSまたはMAL−Fmoc−NHS、即ちまたはと、樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンであって、前記樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンのLys30のアミノ側鎖及びHis1のアミノ末端は、各々保護基で保護されている、該樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンと反応させて、樹脂結合MAL−Fmoc−保護OXM(Lys12)または樹脂結合MAL−FMS−保護OXM(Lys12)を得る反応ステップを含み、前記方法は更に、前記反応ステップの後に、(a)前記樹脂結合MAL−Fmoc−保護OXM(Lys12)または前記樹脂結合MAL−FMS−保護OXM(Lys12)とスルフヒドリルPEGポリマー(PEG−SH)とを反応させ、その後に前記保護基及び前記樹脂の除去を行うか、または(b)前記保護基及び前記樹脂の除去を行ってMAL−Fmoc−OXM(Lys12)またはMAL−FMS−OXM(Lys12)を得て、その後前記MAL−Fmoc−OXM(Lys12)または前記MAL−FMS−OXM(Lys12)とスルフヒドリルPEGポリマー(PEG−SH)とを反応させて、PEG−Fmoc−OXM(Lys12)またはPEG−FMS−OXM(Lys12)を得るステップを含むことを特徴とする方法。

請求項14

請求項13に記載の方法であって、前記PEGは、PEG30であることを特徴とする方法。

請求項15

請求項13に記載の方法であって、R2またはSO3Hは、2位にあることを特徴とする方法。

請求項16

請求項13に記載の方法であって、前記MAL−Fmoc−保護OXM(Lys12)及び前記MAL−FMS−保護OXM(Lys12)の前記Lys30のアミノ側鎖及びHis1のアミノ末端の前記保護基は除去されて、MAL−Fmoc−OXM(Lys12)及びMAL−FMS−OXM(Lys12)がそれぞれ得られ、前記MAL−Fmoc−OXM(Lys12)及び前記MAL−FMS−OXM(Lys12)は更に精製されることを特徴とする方法。

請求項17

以下の構造式によって表される結合体の製造方法であって、前記オキシントモジュリン(OXM、配列番号1のもの)は、前記オキシントモジュリンのLys30のアミノ側鎖を介してリンクされ、R2は、HまたはSO3Hであり、それぞれはPEG−Fmoc−OXM(Lys30)及びPEG−FMS−OXM(Lys30)を表し、前記方法は、下記のMAL−FMS−NHSまたはMAL−Fmoc−NHS、即ちまたはと、樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンであって、前記樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンのLys12のアミノ側鎖及びHis1のアミノ末端は、各々保護基で保護されている、該樹脂結合した配列番号1のオキシントモジュリンと反応させて、樹脂結合MAL−Fmoc−保護OXM(Lys30)または樹脂結合MAL−FMS−保護OXM(Lys30)を得る反応ステップを含み、前記方法は更に、前記反応ステップの後に、(a)前記樹脂結合MAL−Fmoc−保護OXM(Lys30)または前記樹脂結合MAL−FMS−保護OXM(Lys30)とスルフヒドリルPEGポリマー(PEG−SH)とを反応させ、その後に前記保護基及び前記樹脂の除去を行うか、または(b)前記保護基及び前記樹脂の除去を行ってMAL−Fmoc−OXM(Lys30)またはMAL−FMS−OXM(Lys30)を得て、その後前記MAL−Fmoc−OXM(Lys30)または前記MAL−FMS−OXM(Lys30)とスルフヒドリルPEGポリマー(PEG−SH)とを反応させて、PEG−Fmoc−OXM(Lys30)またはPEG−FMS−OXM(Lys30)を得るステップを含むことを特徴とする方法。

請求項18

請求項17に記載の方法であって、前記PEGは、PEG30であることを特徴とする方法。

請求項19

請求項17に記載の方法であって、R2またはSO3Hは、2位にあることを特徴とする方法。

請求項20

請求項17に記載の方法であって、前記MAL−Fmoc−保護OXM(Lys30)及び前記MAL−FMS−保護OXM(Lys30)の前記Lys12のアミノ側鎖及びHis1のアミノ末端の前記保護基は除去されて、MAL−Fmoc−OXM(Lys30)及びMAL−FMS−OXM(Lys30)がそれぞれ得られ、前記MAL−Fmoc−OXM(Lys30)及び前記MAL−FMS−OXM(Lys30)は更に精製されることを特徴とする方法。

請求項21

生物学的半減期の長いオキシントモジュリンを含む組成物の製造方法であって、請求項7〜20のいずれか1項に記載の方法によってオキシントモジュリン結合体を製造するステップを含むことを特徴とする方法。

請求項22

必要な投与頻度が小さいオキシントモジュリンを含む組成物の製造方法であって、請求項7〜20のいずれか1項に記載の方法によってオキシントモジュリン結合体を製造するステップを含むことを特徴とする方法。

技術分野

0001

9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)などの可逆的リンカーを介して連結されたオキシントモジュリン(OXM)およびポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を含む組成物が開示される。逆ペグ化(reverse pegylated)オキシントモジュリンを含む医薬組成物およびその使用方法も開示される。

背景技術

0002

消化管は、膵臓タンパク質(PP)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、ペプチドYY(PYY)およびオキシントモジュリンを含む、摂食行動を調節する多くのペプチドホルモンの合成ならびに放出を担っている。OXMは、腸およびCNSにおけるプログルカゴン組織特異的な移行後のプロセシングから生じる。OXMは、インビトロおよびインビボの両方でOXMの特性に寄与するが、単独ではペプチドの作用に十分ではないことが示された基礎的なオクタペプチド伸長C末端に有する、完全なグルカゴン配列を含む37個のアミノ酸を含む。食物摂取応答して、OXMは、食事カロリー含量に比例して、腸のL細胞によって血流中に分泌される。

0003

OXMは、経口投与腹腔内投与の両方の後にインスリン分泌刺激を介してグルコースクリアランスを向上させる。OXMは摂食量も調節する。視床下部の室傍および弓状核(ARC)へのOXMの脳室内注射(ICV)ならびに核内注射は、空腹のラットにおいて再摂食を抑制する。この抑制は、暗期の開始時に自由に摂食させたラットにおいても示されている。さらに、OXMの末梢投与は、空腹によって誘導される食物摂取および暗期の食物摂取の両方を用量依存的に抑制した。

0004

短い血清半減期などの好ましくない薬物動態は、それ以外の点では有望な多くの薬剤候補医薬品開発を妨げ得る。血清半減期は、実験によって得られる分子の特性であり、それぞれの新しい有望な薬物について実験的に決定する必要がある。例えば、低分子量タンパク質薬物を用いて、濾過などの生理的なクリアランス機構は、必要な投与計画コストまたは頻度により実現不可能な薬物の治療ベルを維持することができる。

発明が解決しようとする課題

0005

タンパク質、特に短いペプチドは、血液、肝臓または腎臓において変性または酵素分解を受けやすい。したがって、タンパク質は、通常、循環半減期が数時間と短い。ペプチド薬は通常、安定性が低いため、活性ペプチドの有効血漿濃度を維持するために、持続的な頻度で送達される。さらに、ペプチド薬は通常、点滴により投与されるので、ペプチド薬の頻繁な注射は対象に対してかなりの不快感を引き起こす。したがって、その高い薬効を維持しながら、治療用タンパク質およびペプチドの半減期延長させる技術が必要である。このような所望のペプチド薬はまた、血清安定性が高いこと、活性が高いこと、および対象に注射した場合に望ましくない免疫応答を誘導する可能性の低いこと、の要件も満たすべきである。

課題を解決するための手段

0006

本発明は、可逆的ペグ化技術を利用してペプチドの半減期を延長させたOXM誘導体に関する。

0007

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリン(OXM)、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)からなる組成物に関し、前記PEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して前記オキシントモジュリンのアミノ末端に結合している。

0008

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)からなる組成物に関し、前記PEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列位置番号12のリシン残基(Lys12)に結合している。

0009

別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)からなる組成物に関し、前記PEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号30のリシン残基(Lys30)に結合している。

0010

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積(AUC)を改善する方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合するステップからなる方法に関する。

0011

別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの投与頻度を低下させる方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合するステップからなる方法に関する。

0012

別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させるための方法であって、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を1:1:1のモル比で結合するステップからなる方法に関し、前記PEGポリマーは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合している。

0013

本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態の中の実施例および図面から明らかになるであろう。しかし、本発明を実施するための形態から、本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および改変が当業者に明らかとなるであろうから、本発明を実施するための形態および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、例示のみを目的として目的で提示されることを理解されたい。

図面の簡単な説明

0014

生成したPEG−FMS−OXM結合体の異なる変異体を示す図である。
GLP−1受容体過剰発現しているCHO−K1細胞インキュベートした場合の異種PEG30−FMS−OXMおよび3種類のPEG30−FMS−OXM変異体(アミノ、Lys12およびLys30)のインビトロ活性(cAMPの定量)を示すグラフである。
PGTTモデルにおける異種PEG30−FMS−OXMおよび3種類のPEG30−FMS−OXM変異体(アミノ、Lys12およびLys30)のインビボ活性を示すグラフである。全ての化合物が、ビヒクル群と比較して耐糖能を誘導した。
雄のob/obマウスの体重に対する異種PEG30−FMS−OXMおよび3種類のPEG30−FMS−OXM変異体(アミノ、Lys12およびLys30)の効果を示すグラフである。
雄のob/obマウスにおける摂食量に対する異種PEG30−FMS−OXMおよび3種類のPEG30−FMS−OXM変異体(アミノ、Lys12およびLys30)の効果を示すグラフである。
雄のob/obマウスにおける非空腹時および空腹時のグルコースに対する異種PEG30−FMS−OXMおよび3種類のPEG30−FMS−OXM変異体(アミノ、Lys12およびLys30)の効果を示すグラフである。
雄のob/obマウスにおける累積摂食量に対するMOD−6031、OXMおよびリラグルチドの効果を示すグラフである。
雄のob/obマウスにおける体重に対するMOD−6031、OXMおよびリラグルチドの効果を示すグラフである。
雄のob/obマウスにおける自由摂食時および空腹時の血糖値に対するMOD−6031、OXMおよびリラグルチドの効果を示すグラフである。
雄のob/obマウスにおける試験の2日目の耐糖能(2g/kg po)に対するMOD−6031および同時飼育群の効果を示すグラフである。
雄のob/obマウスにおける試験の30日目の耐糖能(2g/kg po)に対するMOD−6031および同時飼育群の効果を示すグラフである。
雄のob/obマウスにおける末梢血漿(terminal plasma)コレステロールに対するMOD−6031、OXMおよびリラグルチドの効果を示すグラフである。

実施例

0015

長時間作用型のオキシントモジュリン(OXM)ならびにその生成法および使用法が本明細書に提供される。一態様において、本発明は、デュアルGLP−1/グルカゴン受容体アゴニスト、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)もしくは2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を含むか、またはそれらからなる組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)もしくは2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を含むか、またはそれらからなる組成物を提供する。別の実施形態において、PEGポリマーは、FmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基(Lys12)に結合している。一実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、およびFmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基(Lys12)に結合しているポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を含むか、またはそれらからなる組成物である。

0016

別の態様において、ペプチドの血清半減期を延長させるための新規な方法が本明細書に提供される。この方法は、天然ペプチドを血流中に徐放させる(FMSまたはFmocと呼ばれる)化学リンカーを介したペプチドへのポリエチレングリコール(PEG)鎖の可逆的結合に基づいている。その後、放出ペプチドは、血液脳関門を通過して中枢神経系(CNS)に入るか、または任意の他の標的臓器に入ることもできる。一実施形態において、FMSリンカーの独特化学構造は、特定の速度のペプチド放出につながる。

0017

したがって、別の実施形態において、OXMペプチドの生物学的半減期を延長させるための方法が本明細書に提供される。別の実施形態において、生体液中のOXMの循環時間を延長させるための方法であって、前記循環時間が無損傷のOXMペプチドの徐放により延長される方法が本明細書に提供される。別の実施形態において、前記OXMペプチドの前記生物学的半減期または前記循環時間の延長により、前記OXMは血液脳関門を通過し、CNSを標的にすることが可能になる。生体液が、血液、血清、および脳脊髄液CSF)などであってもよいことは当業者には理解されよう。

0018

一実施形態において、対象への本発明のPEG化オキシントモジュリン組成物の投与の際に、オキシントモジュリンは、前記組成物から前記FMSまたは前記Fmocリンカーの化学的加水分解の結果、対象の生体液中に放出される。別の実施形態において、放出されたオキシントモジュリンは損傷を受けておらず、完全なGLP−1およびグルカゴン受容体結合活性回復する。別の実施形態において、前記FMSまたは前記Fmocを化学的に加水分解すると、前記生体液中の前記OXMペプチドの循環時間が延びる。別の実施形態において、前記OXMの循環時間の延長により、前記OXMが血液脳関門を通過し、CNSを標的にすることが可能になる。別の実施形態において、前記OXMの循環時間の延長により、前記OXMが血液脳関門を通過し、視床下部を標的にすることが可能になる。別の実施形態において、前記OXMの循環時間の延長により、前記OXMが血液脳関門を通過し、弓状核を標的にすることが可能になる。

0019

一態様において、PEG30−FMS−OXMのアミノ変異体(MOD−6031と命名)は、二官能性リンカー(FMSまたはFmoc)を介して連結したOXMおよびmPEG(30)−SHを含む部位特異的結合体である。別の実施形態において、OXMペプチドは、一方の側からリンカー上のN−スクシンイミドエステル(NHS)基と反応するN末端側の末端アミンを介して連結されているが、mPEG(30)−SHは、そのチオール基によりFMSリンカーのマレイミド部分に連結されている(本明細書の実施例を参照のこと)。Lys12およびLys30変異体は、それらのリシン残基のアミン基を介してFMSリンカーに結合される。一実施形態において、可逆的PEG化方法を本明細書で利用して、本明細書に提供される長時間作用型オキシントモジュリン(OXM)ペプチド(例えば、PEG30−FMS−OXM)を作製する。

0020

一実施形態において、デュアル「GLP−1/グルカゴン受容体アゴニスト」および「アゴニスト」という用語は、本明細書において互換的に使用される。別の実施形態において、この用語は、当技術分野で公知の任意のGLP−1/グルカゴン受容体アゴニストも含む。別の実施形態において、好ましいアゴニストは、オキシントモジュリンもしくはOXMまたはその機能的変異体である。

0021

一実施形態において、「機能的」という用語は、本明細書にさらに提供されるような体重減少インスリン感受性の増加、インスリン抵抗性の低下、エネルギー消費の増加、耐糖能の誘導、血糖コントロールの誘導、コレステロール値の改善などを含むがこれらに限定されない生物活性を有する、本明細書に提供されるアゴニストまたはOXMの能力を指す。

0022

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を含む組成物を提供し、このPEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して前記オキシントモジュリンアミノ酸配列の位置番号30のリシン残基(Lys30)に結合している。一実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、およびFmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基(Lys30)に結合しているポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を含むか、またはそれらからなる組成物である。

0023

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)からなる組成物を提供し、このPEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して前記オキシントモジュリンアミノ酸配列の位置番号30のリシン残基(Lys30)に結合している。一実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、およびFmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基(Lys30)に結合しているポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を含むか、またはそれらからなる組成物である。

0024

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を含む組成物を提供し、このPEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して前記オキシントモジュリンのアミノ末端に結合している。一実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、およびFmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンアミノ酸配列のアミノ末端に結合しているポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を含むか、またはそれらからなる組成物である。

0025

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)からなる組成物を提供し、このPEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して前記オキシントモジュリンのアミノ末端に結合している。一実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、およびFmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンアミノ酸配列のアミノ末端に結合しているポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を含むか、またはそれらからなる組成物である。

0026

別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置12のリシンアミノ酸(Lys12)もしくは位置30のリシンアミノ酸(Lys30)またはオキシントモジュリンペプチドのアミノ末端のリシンアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含む組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置12のリシンアミノ酸(Lys12)もしくは位置30のリシンアミノ酸(Lys30)またはオキシントモジュリンペプチドのアミノ末端のリシンアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール(PEG)ポリマーからなる修飾されたオキシントモジュリンペプチドを提供する。別の実施形態において、PEGがLys12、Lys30またはアミノ末端でオキシントモジュリンに結合している組成物は、それぞれオキシントモジュリンの「Lys12変異体」、「Lys30変異体」または「アミノ変異体」と呼ばれる。一実施形態において、「アミノ変異体」という用語は、「N末端の変異体」、「N'変異体」または「N末端変異体」と同義である。当業者が、これらのリシン残基で本明細書に提供されるリンカー(FmocまたはFMS)/PEG結合体を結合させるために、部位特異的にまたはランダムにOXM配列全体にリシン残基を容易に挿入するように本発明によって導かれ得ることは理解されたい。一実施形態において、1以上のリシン残基が、OXM配列全体にわたって異なる位置に配置され、OXMをPEGおよび切断可能なリンカー(例えば、FMSまたはFmoc)に結合するために使用されている変異体も本発明に包含される。

0027

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置12のリシンアミノ酸(Lys12)および位置30のリシンアミノ酸(Lys30)に結合しているポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含む組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置12のリシンアミノ酸(Lys12)およびアミノ末端のリシンアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含む組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置30のリシンアミノ酸(Lys30)およびアミノ末端のリシンアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含む組成物を提供する。

0028

別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、ペグ化オキシントモジュリンである。別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは逆ペグ化オキシントモジュリンである。別の実施形態において、「長時間作用型オキシントモジュリン」、「逆ペグ化オキシントモジュリン」、「可逆的ペグ化OXM」、または「オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)もしくは2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を含むか、またはそれらからなる組成物」という語句は、互換的に使用される。別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、FmocまたはFMSを介してPEGに連結されたOXMである。別の実施形態において、長時間作用型OXMは、そのLys12残基、もしくはそのLys30残基またはそのアミノ(Ν')末端を介してFmocまたはFMSに連結されている。

0029

一実施形態において、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、PEGポリマーを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、FmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンペプチドのアミノ末端に結合しているPEGポリマーを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、FmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンペプチドのリシン残基12または30に結合しているPEGポリマーを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリンペプチドのアミノ末端ならびにオキシントモジュリンのリシン残基12および30の両方にFmocまたはFMSを介して結合しているPEGポリマーを含む。

0030

別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を1:0.2〜10:0.2〜10のモル比で含むか、またはそれらからなる組成物である。別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を1:0.5〜2:0.5〜2のモル比で含むか、またはそれらからなる組成物である。別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を1:1:1のモル比で含むか、またはそれらからなる組成物である。別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、FmocまたはFMSを介してオキシントモジュリンのアミノ末端に結合しているPEGポリマーを含む。別の実施形態において、OXM−PEG−リンカーのモル比は1:1:1〜1:1:3.5である。別の実施形態において、モル比は1:1:1〜1:1:10.0である。別の実施形態において、リンカーの比率が高いと、組成物の収率を最適化できる。

0031

別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、限定されないがFmocおよびFMSなどの可逆的リンカーを介してPEGに連結されている。別の実施形態において、FmocおよびFMSは、塩基感受性があり、生理的条件下で除去可能である。別の実施形態において、可逆的リンカーは、塩基に感受性があり、生理的条件下で除去可能であるリンカーである。別の実施形態において、可逆的リンカーは、塩基に感受性があり、血液、血漿、またはリンパ液中の生理的条件下で除去可能であるリンカーである。別の実施形態において、可逆的リンカーは、塩基に感受性があり、体液中の生理的条件下で除去可能であるリンカーである。別の実施形態において、可逆的リンカーは、塩基性pHを有する体液中で除去可能であるリンカーである。別の実施形態において、塩基に感受性があるリンカーは、塩基性環境への曝露時に切断され、リンカーおよびPEGからOXMを放出する。別の実施形態において、温度に感受性があるリンカーは、このような切断が生じることを可能にする特定の温度に曝されると切断される。別の実施形態において、リンカーの切断を可能にする温度は、生理学的範囲内である。

0032

別の実施形態において、逆ペグ化オキシントモジュリンは、OXMが可逆的リンカーを介してPEGに連結されている組成物である。別の実施形態において、逆ペグ化オキシントモジュリンは、塩基性環境にさらされると、遊離OXMを放出する。別の実施形態において、逆ペグ化オキシントモジュリンは、血液または血漿に曝露されると、遊離OXMを放出する。別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、標準的なペグ化手順のように、互いに直接連結されていないPEGおよびオキシントモジュリンを含むが、両方の残基はむしろ、塩基に対して非常に感受性があり、通常の生理的条件下で除去可能であるFmocまたはFMSの異なる位置に連結されている。別の実施形態において、通常の生理的条件は、血液または血漿などの生理的環境を含む。

0033

別の実施形態において、FmocおよびFMSの構造および作製プロセスは、米国特許第7585837号に記載されている。米国特許第7585837号の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

0034

別の実施形態において、逆ペグ化は、OXMを長時間作用型OXMにさせる。別の実施形態において、長時間作用型オキシントモジュリンは、生物学的半減期が延長したオキシントモジュリンである。別の実施形態において、逆ペグ化は、OXMの劣化に対する保護を提供する。別の実施形態において、逆PEG化は、OXMのCmaxを与え、本明細書に提供される組成物の投与に関連する副作用を低減する。別の実施形態において、逆ペグ化は、OXMのTmaxを延長する。別の実施形態において、逆ペグ化は、OXMの循環半減期を延長させる。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、非修飾OXMと比較してバイオアベイラビリティが改善している。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、非修飾OXMと比較して生物活性が改善している。別の実施形態において、逆ペグ化は、OXMの効力を増強する。

0035

他の実施形態において、逆ペグ化OXMは、生化学的測定の観点から、非修飾OXMと少なくとも同等である。他の実施形態において、逆ペグ化OXMは、薬理学的測定の観点から、非修飾OXMと少なくとも同等である。他の実施形態において、逆ペグ化OXMは、結合能(Kd)の観点から、非修飾OXMと少なくとも同等である。他の実施形態において、逆ペグ化OXMは、消化器系を介した吸収の観点から、非修飾OXMと少なくとも同等である。他の実施形態において、逆ペグ化OXMは、非修飾OXMよりも消化器系を介した吸収の間に、より安定である。

0036

別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、遊離OXMと比較して改善された血中濃度曲線下面積(AUC)レベルを示す。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、遊離OXMと比較して改善された生物活性および血中濃度曲線下面積(AUC)レベルを示す。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、遊離OXMと比較して改善された血液保持時間(t1/2)を示す。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、遊離OXMと比較して改善された生物活性および血液保持時間(t1/2)を示す。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、遊離OXMと比較して改善された血中Cmaxレベルを示し、別の実施形態において、本明細書に提供される逆ペグ化組成物の投与に関連する副作用を低減する、より遅い放出プロセスが与えられる。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、遊離OXMと比較して改善された生物活性および血中Cmaxレベルを示す。別の実施形態において、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介してポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を遊離OXMのアミノ末端に結合するステップを含むかまたはそれらからなるOXMのAUC、Cmax、t1/2、生物活性、もしくはそれらの任意の組み合わせを改善する方法を本明細書に提供される。

0037

別の実施形態において、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介してポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)を遊離OXMのアミノ末端に結合することによるOXMのAUC、Cmax、t1/2、生物活性、もしくはそれらの任意の組み合わせの改善は、OXMの投与頻度を低下させることができる。別の実施形態において、OXMの投与頻度を低下させるための方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介してポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をOXMのアミノ末端またはリシン残基に結合するステップを含むか、またはそれからなる方法が本明細書に提供される。別の実施形態において、OXMの逆ペグ化は、使用する投与量を低くすることが可能になる点で有利である。

0038

別の実施形態において、OXMは、配列番号1のアミノ酸配列を含む。別の実施形態においては、OXMは、配列番号1のアミノ酸配列からなる。別の実施形態において、配列番号1は、HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(配列番号1)のアミノ酸(AA)配列を含むかまたはそれからなる。別の実施形態において、OXMは、CAS番号62340−29−8で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

0039

別の実施形態において、OXMは、ヒトOXMまたは任意の哺乳類のOXMである。別の実施形態において、OXMは、グルカゴン−37または生物活性エンテログルカゴンとも呼ばれている。別の実施形態において、OXMは、デュアルGLP−1/グルカゴン受容体アゴニストである。別の実施形態において、OXMは、OXMの生物活性のある断片である。別の実施形態において、生物活性のあるOXMは、配列番号1のアミノ酸30〜アミノ酸37に及ぶ。別の実施形態において、生物活性のあるOXMは、配列番号1のアミノ酸19〜アミノ酸37に及ぶ。別の実施形態において、本発明のOXMは、2個のC末端アミノ酸が除去されたオクタペプチド型に相当する。別の実施形態において、本発明のOXMは、本明細書に提供されるようなOXM活性を保持する配列番号1の任意の断片に相当する。

0040

一実施形態において、OXMは、配列番号1のペプチドのペプチド相同体を指す。一実施形態において、本発明のOXMアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いる米国立バイオテクノロジー情報センターNCBI)のBlastPソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号1に記載のOXM配列と少なくとも50%相同である。一実施形態において、本発明のOXMのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるNCBIのBlastPソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号1に記載のOXM配列と少なくとも60%相同である。一実施形態において、本発明のOXMのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるNCBIのBlastPソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号1に記載のOXM配列と少なくとも70%相同である。一実施形態において、本発明のOXMのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるNCBIのBlastPソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号1に記載のOXM配列と少なくとも80%相同である。一実施形態において、本発明のOXMのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるNCBIのBlastPソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号1に記載のOXM配列と少なくとも90%相同である。一実施形態において、本発明のOXMのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるNCBIのBlastPソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号1に記載のOXM配列と少なくとも95%相同である。

0041

一実施形態において、本発明の長時間作用型OXMは、未修飾OXMの生物活性を維持する。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMは、OXMの生物活性を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、消化分泌液を減少させることを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、胃内容排出を減少および遅延させることを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、小腸における摂食運動パターンの抑制を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、ペンタガストリンによって刺激される酸分泌の抑制を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、ソマトスタチン放出の増加を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、ペプチドYYの効果を増強することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、グレリン放出の抑制を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、アミノピリン蓄積およびcAMP産生の刺激を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、GLP−1受容体に結合することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、グルカゴン受容体に結合することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、アデニル酸シクラーゼを活性化することによりH+産生を刺激することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、ヒスタミンに刺激された胃酸分泌を抑制することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、摂食量を抑制することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、インスリン放出を刺激することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、外分泌膵臓分泌を抑制することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、インスリン感受性を増加させることを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、グルコースレベルを低下させることを含む。

0042

一実施形態において、本発明は、さらに、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させるための方法であって、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を1:1:1のモル比で結合するステップからなる方法を提供し、別の実施形態において、このPEGポリマーは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合している。

0043

別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させるための方法であって、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を1:1:1のモル比で結合するステップからなる方法に関連し、前記PEGポリマーは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介してオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基に結合している。

0044

別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させるための方法であって、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を1:1:1のモル比で結合するステップからなる方法に関連し、前記PEGポリマーは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号30のリシン残基に結合している。

0045

別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させるための方法であって、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)および9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を1:1:1のモル比で結合するステップからなる方法に関連し、前記PEGポリマーは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列のアミノ末端に結合している。

0046

別の実施形態において、OXM−PEG−リンカーのモル比は1:1:1〜1:1:3.5である。別の実施形態において、このモル比は1:1:1〜1:1:10.0である。別の実施形態において、リンカーの比率が高いと、組成物の収率を最適化できる。

0047

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積(AUC)を改善する方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合するステップからなる方法に関する。

0048

別の実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積(AUC)を改善する方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基に結合するステップからなる方法に関する。

0049

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積(AUC)を改善する方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号30のリシン残基に結合するステップからなる方法に関する。

0050

一実施形態において、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積(AUC)を改善する方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をオキシントモジュリンのアミノ酸配列のアミノ末端に結合するステップからなる方法に関する。

0051

一態様において、オキシントモジュリンの投与頻度を低下させる方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合するステップからなる方法が本明細書に提供される。

0052

別の態様において、オキシントモジュリンの投与頻度を低下させる方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基に結合するステップからなる方法が本明細書に提供される。

0053

別の態様において、オキシントモジュリンの投与頻度を低下させる方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号30のリシン残基に結合するステップからなる方法が本明細書に提供される。

0054

別の態様において、オキシントモジュリンの投与頻度を低下させる方法であって、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)を介して、ポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)をオキシントモジュリンのアミノ酸配列のアミノ末端に結合するステップからなる方法が本明細書に提供される。

0055

別の態様において、本発明は、さらに、対象における摂食量を減少させるための方法であって、可動性リンカーを介してポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)に結合しているオキシントモジュリンからなる組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供し、前記可動性リンカーは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)であり、前記PEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合している。

0056

別の実施形態において、本発明は、さらに、対象の体重を減少させるための方法であって、可動性リンカーを介してポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)に結合しているオキシントモジュリンからなる組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供し、前記可動性リンカーは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)であり、前記PEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合している。

0057

別の実施形態において、本発明は、さらに、対象の血糖のコントロールを誘導するための方法であって、可動性リンカーを介してポリエチレングリコールポリマー(PEGポリマー)に結合しているオキシントモジュリンからなる組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供し、前記可動性リンカーは、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)または2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMS)であり、前記PEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号12のリシン残基もしくは位置番号30のリシン残基またはアミノ末端に結合している。

0058

本明細書に例示されるように(実施例5参照)、本明細書に提供されるアミノ変異体は、摂食量の減少、体重管理および血糖のコントロールを予想外に達成する。一実施形態において、本明細書に提供されるOXMペプチドのPEG修飾は、予想外にOXMの機能を妨げない。

0059

別の実施形態において、本発明は、対象のコレステロール値を改善するための方法であって、本明細書に提供される有効量の組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態において、コレステロール値を改善することは、対象においてLDLコレステロールを低下させる一方で、HDLコレステロールを増加させることを含む。別の実施形態において、LDLコレステロール値は、0mg/dLを超えるが、200mg/dL未満まで低下する。別の実施形態において、LDLコレステロール値は約100〜129mg/dLまで低下する。別の実施形態において、LDLコレステロール値は、0mg/dLを超えるが、100mg/dL未満まで低下する。別の実施形態において、LDLコレステロール値は、0mg/dLを超えるが、70mg/dL未満まで低下する。別の実施形態において、LDLコレステロール値は、0ミリモル/Lを超えるが、5.2ミリモル/L未満まで低下する。別の実施形態において、LDLコレステロール値は、約2.6〜3.3ミリモル/Lまで低下する。別の実施形態において、LDLコレステロール値は、0ミリモル/Lを超えるが、2.6ミリモル/L未満まで低下する。別の実施形態において、LDLコレステロール値は、0ミリモル/Lを超えるが、1.8ミリモル/L未満まで低下する。

0060

別の実施形態において、本発明は、さらに、対象におけるインスリン抵抗性を低下させる方法であって、本明細書に提供される有効量の組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。

0061

別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、迷走神経間接的な機構を介して膵臓分泌を抑制することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、小腸を通る水電解輸送の低下を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、グルコースの取り込みを刺激することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、ソマトスタチン分泌を調節/刺激することを含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、摂食量および体重増加の両方の低下を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、脂肪症の低下を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、食欲抑制を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、拒食症の誘導を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、過体重および肥満の対象における体重の減少を含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、脂肪ホルモンレプチンおよびアディポネクチンのレベルの変化を誘導すること含む。別の実施形態において、本発明の長時間作用型OXMの生物活性は、過体重および肥満の対象におけるエネルギー摂取を減少させることに加えて、エネルギー消費を増加させることを含む。

0062

別の実施形態において、PEGポリマーは、FmocまたはFMSを介して、オキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基に結合している。別の実施形態において、「結合」および「連結」という用語は、互換的に使用される。別の実施形態において、PEGポリマーは、OXMのα−アミノ酸側鎖に連結される。別の実施形態において、PEGポリマーは、OXMのε−アミノ酸側鎖に連結される。別の実施形態において、PEGポリマーは、OXMの1以上のε−アミノ酸側鎖に連結される。別の実施形態において、PEGポリマーはスルフヒドリル部分を含む。

0063

別の実施形態において、PEGは直鎖である。別の実施形態において、PEGは分岐鎖である。別の実施形態において、PEGは、200〜200,000Daの範囲の分子量を有する。別の実施形態において、PEGは、5,000〜80,000Daの範囲の分子量を有する。別の実施形態において、PEGは、5,000〜40,000Daの範囲の分子量を有する。別の実施形態において、PEG、20,000Da〜40,000Daの範囲の分子量を有する。

0064

別の実施形態において、長時間作用型OXMは、限定されないが、FmocまたはFMS部分のフルオレン環に存在するNH2、OH、SH、COOH、CHO、−N=C=O、−N=C=S、−SO2Cl、−SO2CH=CH2、−PO2Cl、−(CH2)xHalなどの官能基と反応することができる任意のPEG誘導体を意味するPEG化剤を用いて調製される。別の実施形態において、PEG化剤は、通常、PEG分子の一端にある1つだけのヒドロキシル基が結合に利用可能であるモノメトキシル化形態で使用される。別の実施形態において、両方の末端が結合に利用可能であるPEGの二官能型は、例えば、単一のPEG部分共有結合した2つのペプチドまたはタンパク質の残基との結合を得ることが望ましい場合などに使用することができる。

0065

別の実施形態において、分岐鎖のPEG類は、R(PEG−OH)mとして表され、式中、Rは、ペンタエリスリトールまたはグリセロールなどの中心コア部分を表し、mは分岐アームの数を表す。分枝アームの数(m)は、3〜100以上の範囲であってもよい。別の実施形態において、ヒドロキシル基は、化学的修飾を受けやすい。別の実施形態において、分枝鎖のPEG分子については、米国特許第6,113,906号、同第5,919,455号、同第5,643,575号、同第5,681,567号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。

0066

別の実施形態において、本発明は、標準的なペグ化手順のように、OXMに直接結合していないPEG部分を有するOXMを提供するが、このPEG部分はむしろ、FmocまたはFMSなどのリンカーを介して結合している。別の実施形態において、このリンカーは、塩基に非常に感受性があり、温和塩基性条件下で除去可能である。別の実施形態において、FmocまたはFMSを介してPEGに連結されたOXMは、遊離OXMと同等の活性がある。別の実施形態において、FmocまたはFMSを介してPEGに連結されたOXMは、遊離OXMよりも活性がある。別の実施形態において、FmocまたはFMSを介してPEGに連結されたOXMは、遊離OXMとは異なる活性を含む。別の実施形態において、FmocまたはFMSを介してPEGに連結されたOXMは、遊離OXMとは異なり、中枢神経系活性を有していない。別の実施形態において、FmocまたはFMSを介してPEGに連結されたOXMは、遊離OXMとは異なり、血液脳関門を通って脳に進入することができない。別の実施形態において、FmocまたはFMSを介してPEGに連結されたOXMは、遊離OXMと比較して延長した循環半減期を含む。別の実施形態において、FmocまたはFMSを介してPEGに連結されたOXMは、FmocまたはFMS部分と共にそのPEG部分を失い、したがって遊離OXMに戻る。

0067

別の実施形態において、本発明は、(X)n−Yの式の化合物およびその薬学的に許容される塩を提供し、式中、Yは、遊離アミノ基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基を有するOXMの部分であり、Xは、以下の式(i)

0068

の基である。

0069

別の実施形態において、R1は、タンパク質またはポリマー担体部分;ポリエチレングリコール(PEG)部分を含む基であり、R2は、水素アルキルアルコキシアルコキシアルキルアリールアルカリルアラルキルハロゲンニトロ、−SO3H、−SO2NHR、アミノ、アンモニウムカルボキシル、PO3H.sub.2およびOPO3H2からなる基から選択され、Rは、水素、アルキルおよびアリールからなる基から選択され、R3およびR4は、同一または異なるが、それぞれ、水素、アルキルおよびアリールからなる基から選択され、Aは、この基がOXM−Yのアミノ基またはヒドロキシル基に連結しているときに共有結合であり、nは少なくとも1つの整数である。

0070

別の実施形態において、「アルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アリール」、「アルカリル」および「アラルキル」という用語を使用して、1〜8個、好ましくは1〜4個の炭素原子アルキル基、例えば、メチルエチルプロピルイソプロピル、およびブチル、ならびに6〜10個の炭素原子のアリール基、例えば、フェニルおよびナフチルを示す。「ハロゲン」という用語は、ブロモフルオロクロロおよびヨードを含む。

0071

別の実施形態において、R2、R3およびR4はそれぞれ水素であり、Aは、−OCO−、すなわち、9−フルオレニルメトキシカルボニル基(以下、「Fmoc」)である。別の実施形態において、Rは、フルオレン環の2位にある−SO3Hであり、R3およびR4はそれぞれ水素であり、Aは、−OCO−、すなわち、2−スルホ−9−フルオレニルメトキシカルボニル基(以下、「FMS」)である。

0072

別の実施形態において、OXMのペグ化および(PEG−Fmoc)n−OXMまたは(PEG−FMS)n−OXM結合体の調製は、MAL−FMS−NHSまたはMAL−Fmoc−NHSをOXMのアミン成分に結合することによって、MAL−FMS−OXMまたはMAL−Fmoc−OXM結合体を取得し、次いで、マレイミド部分をPEG−SHで置換して、それぞれ(PEG−FMS)n−OXMまたは(PEG−Fmoc)n−OXM結合体を生成することを含む。

0073

別の実施形態において、OXMのペグ化は、MAL−FMS−NHSまたはMAL−Fmoc−NHSとPEG−SHとを反応させることによって、PEG−FMS−NHSまたはPEG−Fmoc−NHS結合体を形成し、次いで、これをOXMのアミン成分と反応させて、それぞれ所望の(PEG−FMS)n−OXMまたは(PEG−Fmoc)n−OXM結合体を与えることを含む。別の実施形態において、OXMなどのペプチド/タンパク質のペグ化については、米国特許第7585837号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。別の実施形態において、FmocまたはFMSによるOXMなどのペプチド/タンパク質の逆ペグ化については、米国特許第7585837号に記載されている。

0074

別の実施形態において、「長時間作用型OXM」および「逆ペグ化OXM」という語句は、互換的に使用される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、(PEG−FMS)n−OXMまたは(PEG−Fmoc)n−OXMの式によって本明細書で特定されるPEG−FMS−OXMおよびPEG−Fmoc−OXMで構成され、式中、nは少なくとも1の整数であり、OXMは、少なくとも1つのアミノ基を介してFMSまたはFmoc基に連結されている。

0075

別の実施形態において、OXMのLys12もしくはLys30またはアミノ末端へのPEG−FmocまたはPEG−FMSの結合は、OXMを不活性にさせない。

0076

一実施形態において、Lys12変異体は、本明細書に提供される他の変異体よりも体重を管理するのにより有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるLys30変異体は、本明細書に提供される他の変異体よりも体重管理を達成することにおいてより有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるアミノ変異体は、本明細書に提供される他の変異体よりも体重管理を達成することにおいてより有効である。

0077

一実施形態において、Lys12変異体は、本明細書に提供される他の変異体よりも慢性的な血糖のコントロールを達成することにおいてより有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるLys30変異体は、本明細書に提供される他の変異体よりも慢性的な血糖のコントロールを達成することにおいてより有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるアミノ変異体は、本明細書に提供される他の変異体よりも血糖のコントロールを達成することにおいてより有効である。

0078

治療的使用
別の実施形態において、PEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXMならびにそれらを含む医薬組成物は、高血糖の予防のため、血糖のコントロールを改善するため、非インスリン依存性糖尿病(一実施形態において、2型糖尿病)、インスリン依存性糖尿病(一実施形態において、1型糖尿病)、および妊娠糖尿病、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される糖尿病の治療のために利用される。別の実施形態において、PEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXMならびにそれらを含む医薬組成物は、2型糖尿病を治療するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、インスリン感受性を増大させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、インスリン抵抗性を低下させるために利用される。

0079

別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、食欲を抑制するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、満腹感を誘導するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、体重の減少のために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、体脂肪の減少のために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、肥満度指数の低下のために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、摂食量の低下のために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、肥満を治療するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、肥満に関連する糖尿病を治療するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、心拍数を増加させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、基礎代謝率BMR)を増加させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、エネルギー消費を増加させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、耐糖能を誘導するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、血糖のコントロールを誘導するために利用される。一実施形態において、血糖のコントロールは、高くないおよび/もしくは変動しない血糖値、ならびに/または高くないおよび/もしくは変動しないグリコシル化ヘモグロビン値を指す。

0080

別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、体重増加を抑制するために利用され、別の実施形態において、この体重増加は脂肪の増加に起因する。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、血糖値を減少させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、カロリー摂取量を減少させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、食欲を減少させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、体重管理に利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、体重減少を誘導または促進するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、所望の体重、所望の肥満度指数、所望の外観および良好な健康状態のうちのいずれか1以上を維持するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、脂質プロファイルを制御するために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、トリグリセリド値を低下させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、グリセロールレベルを低下させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、アディポネクチンレベルを増加させるために利用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、遊離脂肪酸値を低下させるために利用される。

0081

一実施形態において、「レベルの低下」という用語は、元のレベル、野生型のレベル、正常なレベルまたは対照のレベルに対して約1〜10%の低下を指す。別の実施形態において、低下は、約11〜20%である。別の実施形態において、低下は約21〜30%である。別の実施形態において、低下は約31〜40%である。別の実施形態において、低下は約41〜50%である。別の実施形態において、低下は約51〜60%である。別の実施形態において、低下は約61〜70%である。別の実施形態において、低下は約71〜80%である。別の実施形態において、低下は81〜90%である。別の実施形態において、低下は約91〜95%である。別の実施形態において、低下は約96〜100%である。

0082

一実施形態において、「レベルの増加」または「延長」という用語は、元のレベル、野生型のレベル、正常なレベルまたは対照のレベルに対して約1〜10%の増加を指す。別の実施形態において、増加は約11〜20%である。別の実施形態において、増加は約21〜30%である。別の実施形態において、増加は約31〜40%である。別の実施形態において、増加は約41〜50%である。別の実施形態において、増加は約51〜60%である。別の実施形態において、増加は約61〜70%である。別の実施形態において、増加は約71〜80%である。別の実施形態において、増加は約81〜90%である。別の実施形態において、増加は約91〜95%である。別の実施形態において、増加は約96〜100%である。

0083

別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を低下させるために利用される。一実施形態において、コレステロール値の低下は、天然のOXMの投与後に観察される低下よりも大きい。一実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を60〜70%低下させる。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を50〜100%低下させる。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を25〜90%低下させる。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を50〜80%低下させる。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を40〜90%低下させる。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、HDLコレステロール値を増加させるために利用される。

0084

一実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、投与の間に有効性が著しく低下することなく、本明細書に記載の目的のために使用することができる。一実施形態において、PEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXMならびにそれらを含む医薬組成物は、1日中有効である。別の実施形態において、PEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXMならびにそれらを含む医薬組成物は、2〜6日間有効である。一実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、1週間有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびそれらを含む医薬組成物は、2週間有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、3週間有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、4週間有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、6週間有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、2ヶ月間有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、4ヶ月間有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、6ヶ月間有効である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、1年以上有効である。

0085

一実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、本明細書に記載の目的のために使用することができ、第1の用量の投与時にすぐに有効になり得る。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびにそれらを含む医薬組成物は、2以上の用量が投与された後に有効になる。

0086

別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびに上述したようなそれらを含む医薬組成物は、OXMによって軽減、抑制、および/もしくは治療され得る疾患または病状罹患しているヒト対象に適用される。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびに上述したようなそれらを含む医薬組成物を利用する方法は、獣医方法である。別の実施形態において、本明細書に提供されるPEG−Fmoc−OXMおよびPEG−FMS−OXM変異体ならびに上述したようなそれらを含む医薬組成物を利用する方法は、家畜ペットおよび実験動物などの動物に適用される。したがって、一実施形態において、本発明の対象は、ネコイヌウシブタマウスウマなどである。

0087

別の実施形態において、本発明は、OXMもしくはOXMを含む医薬製剤により治療可能または修復可能な対象における疾患を治療または軽減するための方法であって、本明細書に提供される治療有効量のPEG−Fmoc−OXMおよび/またはPEG−FMS−OXM変異体を対象に投与することによって、OXMにより治療可能または修復可能な対象における疾患を治療または軽減するステップを含む方法を提供する。

0088

別の実施形態において、本明細書で使用するOXM、「ペプチド」または「タンパク質」は、天然ペプチド(分解産物合成タンパク質または組換えタンパク質のいずれか)およびペプチド模倣体(典型的には、合成タンパク質)、ならびに一部の実施形態において、これらのタンパク質を体内でより安定にさせるか、または細胞への浸透をより可能にするように修飾したタンパク質類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドを包含する。

0089

別の実施形態において、「PEG−Fmoc−OXMおよび/またはPEG−FMS−OXM変異体」は、FMSもしくはFmocのいずれかがLys12でOXMに結合しているPEG−Fmoc−OXMおよび/またはPEG−FMS−OXM変異体である。別の実施形態において、PEG−Fmoc−OXMおよび/またはPEG−FMS−OXM変異体は、FMSもしくはFmocのいずれかがLys30でOXMに結合しているPEG−Fmoc−OXMおよび/またはPEG−FMS−OXM変異体である。別の実施形態において、PEG−Fmoc−OXMおよび/またはPEG−FMS−OXM変異体は、FMSもしくはFmocのいずれかがアミノ末端でOXMに結合しているPEG−Fmoc−OXMおよび/またはPEG−FMS−OXM変異体である。

0090

別の実施形態において、修飾は、CH2−NH、CH2−S、CH2−S=O、O=C−NH、CH2−O、CH2−CH2、S=C−NH、CH=CHまたはCF=CH、骨格修飾、および残基修飾を含むが、これらに限定されないN末端修飾、C末端修飾、ペプチド結合修飾を含むが、これらに限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、定量的ドラッグデザイン(Quantitative Drug Design)、C.A.Ramsden Gd.、17.2章、F.Choplin Pergamon Press(1992)に記載されており、同文献は、本明細書に完全に記載したものとして、参照により援用される。この点に関するさらなる詳細を以下に提供する。

0091

別の実施形態において、ペプチド内のペプチド結合(−CO−NH−)は置換されている。一部の実施形態において、ペプチド結合は、N−メチル化結合(−N(CH3)−CO−)で置換されている。別の実施形態において、ペプチド結合は、エステル結合(−C(R)H−C−O−O−C(R)−N−)で置換されている。別の実施形態において、ペプチド結合は、ケトメチレン結合(−CO−CH2−)で置換されている。別の実施形態において、ペプチド結合は、α−アザ結合(−NH−N(R)−CO−)で置換され、式中、Rは任意のアルキル、例えば、メチル、カルバ結合(−CH2−NH−)である。別の実施形態において、ペプチド結合は、ヒドロキシエチレン結合(−CH(OH)−CH2−)で置換されている。別の実施形態において、ペプチド結合は、チオアミド結合(−CS−NH−)で置換されている。一部の実施形態において、ペプチド結合はオレフィン二重結合(−CH=CH−)で置換されている。別の実施形態において、ペプチド結合はレトロアミド結合(−NH−CO−)で置換されている。別の実施形態において、ペプチド結合は、ペプチド誘導体(−N(R)−CH2−CO−)で置換されており、式中、Rは、天然では炭素原子上に存在する「通常の」側鎖である。一部の実施形態において、これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のいずれかで生じ、さらに同時に、いくつか(2〜3個)の結合で生じる。

0092

一実施形態において、Trp、TyrおよびPheなどのタンパク質の天然の芳香族アミノ酸は、フェニルグリシン、TIC、ナフチルラニン(naphthylelanine)(Nol)、Pheの環メチル化誘導体、Pheのハロゲン化誘導体またはO−メチル−Tyrなどの合成の非天然アミノ酸で置換されている。別の実施形態において、本発明のペプチドには、1以上の修飾アミノ酸または1以上の非アミノ酸モノマー(例えば、脂肪酸複合糖質など)が含まれる。

0093

本発明のOXM誘導体または変異体は、野生型OXMと比較して、いくつかのアミノ酸置換を含み、かつ/またはPEG化または他の方法で(例えば、組換え的にまたは化学的に)修飾することができる。

0094

本明細書に提供されるOXMは、上記のOXM配列の任意の類似体も含む。配列内の任意の1以上のアミノ酸残基は、当技術分野で公知の保存的置換、すなわち、1つの疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換することなどの同様の化学型の1つとアミノ酸を置換することにより独立して置換することができる。あるいは、非保存的なアミノ酸変異は、OXMの増強された効果または生物活性を与えるように行うことができる。一実施形態において、OXMは、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断および不活性化耐性があるように修飾される。誘導体およびOXMの変異体ならびにそれらの生成法は、米国特許出願公開第2011/0152182号、同第2011/0034374号、同第2010/0144617号に開示されており、これらの全ては参照により本明細書に援用される。

0095

一実施形態において、本明細書に提供されるデュアルGLP−1/グルカゴン受容体アゴニストは、化学的に修飾することができる。別の実施形態において、本明細書に提供されるOXMは、化学的に修飾することができる。特に、アミノ酸側鎖、アミノ末端および/またはOXMのカルボキシル末端を修飾することができる。例えば、OXMは、アルキル化ジスルフィド形成、金属錯体形成アシル化エステル化アミド化ニトロ化、酸を用いた処理、塩基を用いた処理、酸化または還元のうちの1以上を受けることができる。これらのプロセスを実施するための方法は当技術分野で公知である。特に、OXMは、低級アルキルエステル、低級アルキルアミド、低級ジアルキルアミド酸付加塩カルボン酸塩またはそれらのアルカリ付加塩として提供される。特に、OXMのアミノ末端またはカルボキシル末端は、例えば、エステル化、アミド化、アシル化、酸化または還元によって誘導体化することができる。特に、OXMのカルボキシル末端は、アミド部分を形成するように誘導体化することができる。

0096

一実施形態において、「アミノ酸」または「アミノ酸類」は、天然に存在する20種類のアミノ酸を含むと理解される。これらのアミノ酸は、インビボで翻訳後修飾される場合が多く、例えば、ヒドロキシプロリンホスホセリンおよびホスホスレオニンを含み、他の独特なアミノ酸は、2−アミノアジピン酸ヒドロキシリシンイソデスモシンノルバリンノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、「アミノ酸」は、D−およびL−アミノ酸の両方を含む。他の合成アミノ酸または修飾アミノ酸を使用することもできることを理解されたい。

0097

一実施形態において、本発明のOXMは、OXMが可溶性形態であることを必要とする治療に利用される。別の実施形態において、本発明のOXMは、水酸基含有側鎖によりタンパク質の溶解度を増加させることができるセリンおよびスレオニンを含むがこれらに限定されない、1以上の非天然または天然の極性アミノ酸を含む。

0098

一実施形態において、本発明のOXMは、標準的な固相技術などを用いることによって生化学的に合成される。別の実施形態において、これらの生化学的方法には、排他的固相合成(exclusive solid phase synthesis)、部分的固相合成、フラグメント縮合、または古典的な溶液合成が含まれる。

0099

一実施形態において、固相OXM合成法は、当業者に公知であり、さらにJohn Morrow Stewart and Janis Dillaha Young、固相タンパク質合成((Solid Phase Protein Syntheses)、第2版、Pierce Chemical社、1984)に記載されている。別の実施形態において、合成タンパク質は、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製され(Creighton T.(1983)Proteins,structures and molecular principles.WH Freeman and Co.N.Y.)、その組成は、当業者に公知の方法によりアミノ酸配列決定を介して確認することができる。

0100

別の実施形態において、組換えタンパク質技術を用いて、本発明のOXMを生成する。一部の実施形態において、組換えタンパク質技術は、本発明のOXMの大量生成に使用される。別の実施形態において、組換え技術については、Bitterら(1987)酵素学の方法(Methodsin Enzymol)153:516−544、Studierら(1990)酵素学の方法(Methods in Enzymol)185:60−89、Brissonら(1984)Nature 310:511−514、Takamatsuら(1987)EMBO J.6:307−311、Coruzziら(1984)EMBO J.3:1671−1680およびBrogliら(1984)Science 224:838−843、Gurleyら(1986)Mol.Cell.Biol.6:559−565ならびにWeissbach & Weissbach,1988、植物分子生物学のための方法(Methods for Plant Molecular Biology)、Academic Press、ニューヨーク州,第VIII節、pp421−463に記載されている。

0101

別の実施形態において、本発明のOXMは、本発明のOXMをコードするポリヌクレオチドを用いて合成される。一部の実施形態において、本発明のOXMをコードするポリヌクレオチドは、シス調節配列(例えば、プロモーター配列)の転写制御を含む発現ベクターに連結される。一部の実施形態において、シス調節配列は、本発明のOXMの構成的発現を指示するのに適する。

0102

一実施形態において、「ポリヌクレオチド」という語句は、RNA配列相補的ポリヌクレオチド配列cDNA)、ゲノムポリヌクレオチド配列および/または複合ポリヌクレオチド配列(例えば、上記の組み合わせ)の形態で単離され、提供される一本鎖または二本鎖核酸配列を指す。

0103

一実施形態において、「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のRNA依存性DNAポリメラーゼを用いてメッセンジャーRNA逆転写から生じる配列を指す。一実施形態において、その後、この配列は、DNAポリメラーゼを用いてインビボまたはインビトロで増幅することができる。

0104

一実施形態において、「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体由来の(単離された)配列を指し、したがって、染色体の連続した部分を表す。

0105

一実施形態において、「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも部分的に相補的で、少なくとも部分的にゲノムである配列を指す。一実施形態において、複合配列は、本発明のペプチドをコードするのに必要ないくつかのエクソン配列、ならびにそれらの間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。一実施形態において、イントロン配列は、他の遺伝子を含む、任意の供給源のものであり得、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。一実施形態において、イントロン配列には、シス作用性発現調節エレメントが含まれる。

0106

一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に公知のPCR技術、または任意の他の方法もしくは手順を用いて調製される。一部の実施形態において、この手順は、2つの異なるDNA配列ライゲーションを含む(例えば、「分子生物学最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、Ausubelら(編)、John Wiley & Sons、1992を参照されたい)。

0107

一実施形態において、様々な原核細胞または真核細胞宿主−発現系として使用して、本発明のOXMを発現させることができる。別の実施形態において、これらには、タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクター形質転換した細菌などの微生物、タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)で感染させた植物細胞系またはタンパク質コード配列を含むTiプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換した植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。

0108

一実施形態において、本発明のOXMを発現させるために、非細菌発現系(CHO細胞などの哺乳類発現系)が使用される。一実施形態において、哺乳類細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いられる発現ベクターは、CMVプロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むpCI−DHFRベクターである。

0109

別の実施形態において、本発明の細菌系において、タンパク質発現を意図した使用に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。一実施形態において、大量のOXMが望まれる。一実施形態において、おそらく、細菌のペリプラズムまたはタンパク質産物が容易に精製される培地発現産物を導く疎水性シグナル配列との融合物として、高レベルのタンパク質産物の発現を指示するベクターが望まれる。一実施形態において、特異的切断部位を有するように遺伝子操作された特定の融合タンパク質は、タンパク質の回収補助する。一実施形態において、このような操作に適応できるベクターには、大腸菌発現ベクターのpETシリーズが含まれるが、これらに限定されない[Studier et al.,Methodsin Enzymol.185:60−89(1990)]。

0110

一実施形態において、酵母発現系が使用される。一実施形態において、米国特許出願第5,932,447号に開示されているものなどの構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むいくつかのベクターが酵母で使用できる。別の実施形態において、酵母染色体への外来DNA配列の組込みを促進するベクターが使用される。

0111

一実施形態において、本発明の発現ベクターは、さらに、例えば、内部リボソーム侵入部位(IRES)およびプロモーター−キメラタンパク質のゲノム組込みのための配列などの単一mRNAからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にする追加のポリヌクレオチド配列を含むことができる。

0112

一実施形態において、哺乳類発現ベクターには、Invitrogen社から入手可能なpcDNA3、pcDNA3.1(+/−)、pGL3、pZeoSV2(+/−)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81、Promega社から入手可能なpCI、Strategene社から入手可能なpMbac、pPbac、pBK−RSVおよびpBK−CMV、Clontech社から入手可能なpTRES、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。

0113

別の実施形態において、レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが、本発明によって使用される。SV40ベクターは、pSVT7およびpMT2を含む。別の実施形態において、ウシパピローマウイルス由来のベクターは、pBV−1MTHAを含み、エプスタイン・バーウイルス由来のベクターは、pHEBOおよびp2O5を含む。他の例示的なベクターとしては、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo−5、バキュロウイルスpDSVE、および真核細胞における発現に有効性を示すSV−40初期プロモーター、SV−40後期プロモーターメタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリドリンプロモーター、または他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。

0114

一実施形態において、植物発現ベクターが使用される。一実施形態において、OXMコード配列の発現は、いくつかのプロモーターによって促進される。別の実施形態において、CaMVの35S RNAおよび19S RNAプロモーターなどのウイルスプロモーター[Brisson et al.,Nature 310:511−514(1984)]、またはTMVに対するコートタンパク質プロモーター[Takamatsu et al.,EMBO J.6:307−311(1987)]が使用される。別の実施形態において、例えば、RUBISCO小サブユニット[Coruzzi et al.,EMBO J.3:1671−1680(1984)およびBrogli et al.,Science 224:838−843(1984)]または熱ショックプロモーター、例えば、ダイズhspl7.5−Eまたはhspl7.3−B[Gurley et al.,Mol.Cell.Biol.6:559−565(1986)]などの植物プロモーターが使用される。一実施形態において、構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド植物ウイルスベクター、直接DNA形質転換、マイクロインジェクションエレクトロポレーション、および当業者に公知の他の技術を用いて植物細胞に導入される。例えば、Weissbach&Weissbach[植物分子生物学のための方法(Methodsfor Plant Molecular Biology),Academic Press,NY,第VIII節,pp421−463(1988)]を参照されたい。当技術分野で公知である昆虫および哺乳類宿主細胞系などの他の発現系も本発明によって使用することができる。

0115

(タンパク質をコードする)挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物が、発現タンパク質の安定性、産生、精製、収量または活性を最適化するように遺伝子操作された配列も含むことができることを理解されたい。

0116

一部の実施形態において、様々な方法を用いて、宿主細胞系に本発明の発現ベクターを導入することができる。一部の実施形態において、このような方法は、一般的に、Sambrookらの分子クローニング(Molecular Cloning):ラボラトリーマニュアルコールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州(1989,1992)、Ausubelらの分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley and Sons、メリーランド州ボルチモア(1989)、Changらの体細胞遺伝子治療(Somatic Gene Therapy)、CRCPress、ミシガン州アナーバー(1995)、Vegaらの遺伝子ターゲティング(Gene Targeting)、CRC Press、ミシガン州アナーバー(1995)、ベクター:分子クローニングベクターおよびそれらの使用の調査(A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths)、マサチューセッツボストン(1988)およびGilboaら[Biotechniques 4(6):504−512,1986]に記載されており、例えば、組換えウイルスベクターでの安定なまたは一過的なトランスフェクションリポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染を含む。さらに、陽性陰性選択法については米国特許第5,464,764号および同第5,487,992号を参照されたい。

0117

一実施形態において、形質転換細胞は、多量の組換えOXMの発現を可能にする有効な条件下で培養される。別の実施形態において、有効な培養条件としては、タンパク質産生を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、pHおよび酸素条件を挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態において、有効な培地は、細胞が本発明の組換えOXMを生成するために培養される任意の培地を指す。別の実施形態において、培地は、代表的には、同化可能な炭素窒素およびリン酸源、適切な塩、ミネラル、金属ならびにビタミンなどの他の栄養素を有する水溶液を含む。一実施形態において、本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ試験管マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。別の実施形態において、培養は、組換え細胞に適切な温度、pHおよび酸素含有量で行われる。別の実施形態において、培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。

0118

一実施形態において、産生のために使用されるベクターおよび宿主系に応じて、結果として得られる本発明のOXMは、組換え細胞内に残るか、発酵培地中に分泌されるか、大腸菌内のペリプラズムスペースなどの2つの細胞膜の間のスペースに分泌されるか、または細胞膜もしくはウイルス膜外表面上に保持される。

0119

一実施形態において、培養の所定時間後に、組換えOXMの回収が行われる。

0120

一実施形態において、本明細書で使用する「組換えOXMの回収」という語句は、OXMを含む発酵培地全体を収集することを指し、分離または精製の追加のステップを意味する必要はない。

0121

一実施形態において、本発明のOXMは、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動疎水性相互作用クロマトグラフィーゲル濾過クロマトグラフィー逆相クロマトグラフィーコンカナバリンAクロマトグラフィークロマトフォーカシングおよび分画可溶化(differential solubilization)などの様々な、標準的なタンパク質精製技術を用いて精製される。

0122

一実施形態において、回収を容易にするために、発現させるコード配列は、本発明のタンパク質および融合された切断可能な部分をコードするように遺伝子操作することができる。一実施形態において、タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、切断可能な部分に特異的なカラム上での固定によって容易に単離することができるように、融合タンパク質を設計することができる。一実施形態において、切断部位をタンパク質と切断可能な部分の間にあるように遺伝子操作し、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素または薬剤での処理によって、タンパク質をクロマトグラフィーカラムから放出することができる[例えば、Booth et al.,Immunol.Lett.19:65−70(1988);およびGardella et al.,J.Biol.Chem.265:15854−15859(1990)を参照されたい]。別の実施形態において、本発明のOXMは、「実質的に純粋な」形態で取り出される。別の実施形態において、「実質的に純粋な」という語句は、本明細書に記載の用途におけるOXMの効果的な使用を可能にする純度を指す。

0123

一実施形態において、本発明のOXMは、インビトロ発現系を用いて合成することもできる。一実施形態において、インビトロ合成法は当技術分野で公知であり、系の構成要素は市販されている。

0124

別の実施形態において、インビトロ結合活性は、本明細書に記載の天然の、組換え型のおよび/または逆ペグ化されたOXMならびにそれを含む医薬組成物の、限定されないが、糖尿病、肥満、摂食障害代謝障害などの疾患もしくは病状を治療または改善する能力を測定することによって確認される。別の実施形態において、インビボ活性は、治療される疾患の既知の手段によって推定される。

0125

別の実施形態において、本発明のOXMペプチドの投与量は、注射溶液中0.005〜0.1mg/kgを含む。別の実施形態において、この投与量は、0.005〜0.5mg/kgのOXMペプチドを含む。別の実施形態において、この投与量は、0.05〜0.1μgのOXMペプチドを含む。別の実施形態において、この投与量は、注射溶液中0.005〜0.1mg/kgのOXMペプチドを含む。

0126

別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は1日1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、36時間に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、48時間に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、60時間に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、72時間に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、84時間に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、96時間に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、5日に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、6日に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、7日に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、8〜10日に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、10〜12日に1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量ごとに12〜15日1回投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMの投与量は、15〜25日に1回投与される。

0127

別の実施形態において、本発明の逆ペグ化OXMは、筋肉内(IM)注射、皮下(SC)注射、または静脈内(IV)注射によって週に1回投与される。
投与される

0128

別の実施形態において、本発明の逆ペグ化OXMは、個人それ自体に提供することができる。一実施形態において、本発明の逆ペグ化OXMは、薬学的に許容される担体と混合される医薬組成物の一部として個人に提供することができる。

0129

別の実施形態において、「医薬組成物」は、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分を用いた本明細書に記載の長時間作用型OXNの製剤を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を促進することである。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは生物学的効果を有する。

0130

別の実施形態において、本発明の組成物のいずれかは、少なくとも逆ペグ化OXMを含む。一実施形態において、本発明は複合製剤を提供する。一実施形態において、「組み合わせ製剤」は、上記で定義した組み合わせパートナーが、独立して投与されるか、または区別された量の組み合わせパートナーとの固定された異なる組み合わせの使用により、すなわち、同時に、並行して、別々にまたは連続して投与され得るという意味において、特に「パーツキット」を定義する。一部の実施形態において、パーツのキットのパーツは、その後、例えば、同時に投与されるか、経時的に、すなわち、異なる時点でおよびパーツのキットの任意のパーツについて等しい時間間隔または異なる時間間隔で調製することができる。組み合わせパートナーの総量の割合は、一部の実施形態において、組み合わせ製剤で投与することができる。一実施形態において、例えば、患者亜集団が治療されるニーズまたは異なるニーズが特定の疾患、疾患の重症度年齢性別、または体重によるものであり得る単一患者のニーズに対処するために、当業者が容易に行うことができるように、組み合わせ製剤を変更することができる。

0131

別の実施形態において、互換的に使用される「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対して著しい刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。アジュバントはこれらの語句に含まれる。一実施形態において、薬学的に許容される担体に含まれる成分の一つは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、有機媒体および水性媒体の両方において広範囲溶解性を有する生体適合性ポリマーであり得る(Mutter et al.(1979))。

0132

別の実施形態において、「賦形剤」は、長時間作用型OXNの投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。一実施形態において、賦形剤としては、炭酸カルシウムリン酸カルシウム、様々な糖類および様々な種類のデンプンセルロース誘導体ゼラチン植物油およびポリエチレングリコールを挙げることができる。

0133

薬物の製剤化および投与のための技術は、参照により本明細書に援用される「レミントンの薬学」、マック出版社、ペンシルニアイーストン、最新版に見られる。

0134

別の実施形態において、本発明のペプチドの適切な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜経鼻、腸または筋肉内、皮下および内への注射を含む非経口送達、ならびに髄腔内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内への注射を挙げることができる。

0135

本発明はまた、上記の治療方法のいずれかのために、脳への末梢経路による投与のための薬物の製造に使用するための逆ペグ化OXMも含む。末梢経路の例としては、吸入による投与を含め、経口、直腸、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、もしくは腹腔内、粘膜、例えば、口腔下、鼻腔、皮下または経皮投与が挙げられる。これらの薬物のためのOXMの好ましい投与量を以下に示す。

0136

本発明は、吸入による投与を含め、経口、直腸、非経口、例えば、静脈内、筋肉内または腹腔内、粘膜、例えば、口腔、舌下、鼻腔、皮下もしくは経皮投与に適した形態で、逆ペグ化OXMおよび薬学的に適切な担体を含む医薬組成物を提供する。単位剤形の場合は、単位当たりの投与量は、例えば、下記のようにまたは以下に与えられる1kgあたりの投与量に基づいて算出されるようなものであり得る。

0137

別の実施形態において、製剤は、全身的な方法よりもむしろ局所的に、製剤の注射を介して患者の身体の特定の領域に直接投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、鼻腔内剤形で製剤化される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、注射可能な剤形で製剤化される。

0138

投与量範囲の様々な実施形態が本発明によって企図される。逆ペグ化OXM組成物内のOXMペプチド成分は、3日ごとに0.01〜0.5mg/kg体重の範囲で投与される(PEGのサイズが実質的に異なり得るように、逆ペグ化OXM組成物内のOXMの重量のみが提供される)。別の実施形態において、逆ペグ化OXM組成物内のOXMペプチド成分は、7日ごとに0.01〜0.5mg/kg体重の範囲で投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXM組成物内のOXMペプチド成分は、10日ごとに0.01〜0.5mg/kg体重の範囲で投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXM組成物内のOXMペプチド成分は、14日ごとに0.01〜0.5mg/kg体重の範囲で投与される。別の実施形態において、予想外に、逆ペグ化OXM組成物中のOXMの有効量は、遊離OXMの有効量の1/4〜1/10である。別の実施形態において、予想外に、OXMの逆ペグ化は、遊離OXMと比較して、患者に処方されるOXMの量を少なくとも50%制限することができる。別の実施形態において、予想外に、OXMの逆ペグ化は、遊離OXMと比較して、患者に処方されるOXMの量を少なくとも70%制限することができる。別の実施形態において、予想外に、OXMの逆ペグ化は、遊離OXMと比較して、患者に処方されるOXMの量を少なくとも75%制限することができる。別の実施形態において、予想外に、OXMの逆ペグ化は、遊離OXMと比較して、患者に処方されるOXMの量を少なくとも80%制限することができる。別の実施形態において、予想外に、OXMの逆ペグ化は、遊離OXMと比較して、患者に処方されるOXMの量を少なくとも85%制限することができる。別の実施形態において、予想外に、OXMの逆ペグ化は、遊離OXMと比較して、患者に処方されるOXMの量を少なくとも90%制限することができる。

0139

別の実施形態において、逆ペグ化OXM組成物内のOXMペプチド成分は、3日に1回、0.01〜0.5mg/kg体重の範囲で投与される(PEGのサイズが実質的に異なり得るように、逆ペグ化OXM組成物内のOXMの重量のみ提供される)。別の実施形態において、逆ペグ化OXM組成物内のOXMペプチド成分は、7日に1回、0.01〜0.5mg/kg体重の範囲で投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXM組成物内のOXMペプチド成分は、10日に1回、0.01〜0.5mg/kg体重の範囲で投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXM組成物内のOXMペプチド成分は、14日に1回、0.01〜0.5mg/kg体重の範囲で投与される。

0140

別の実施形態において、遊離OXMと比較して、逆ペグ化OXMは、有効投与頻度を少なくとも2倍低下させ、有効週用量を少なくとも2倍低下させ、したがって有害事象リスクを制限し、OXM療法の使用によるコンプライアンスを高める。別の実施形態において、遊離OXMと比較して、逆ペグ化OXMは、有効投与頻度を少なくとも3倍低下させ、有効週用量を少なくとも3倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、OXM療法の使用によるコンプライアンスを高める。別の実施形態において、遊離OXMと比較して、逆ペグ化OXMは、有効投与頻度を少なくとも4倍低下させ、有効週用量を少なくとも4倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、OXM療法の使用によるコンプライアンスを高める。別の実施形態において、遊離OXMと比較して、逆ペグ化OXMは、有効投与頻度を少なくとも5倍低下させ、有効週用量を少なくとも5倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、OXM療法の使用によるコンプライアンスを高める。別の実施形態において、遊離OXMと比較して、逆ペグ化OXMは、有効投与頻度を少なくとも6倍低下させ、有効週用量を少なくとも6倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、OXM療法の使用によるコンプライアンスを高める。別の実施形態において、有効投薬頻度および有効週用量は、(1)逆ペグ化OXM組成物内の投与されるOXM成分の重量、および(2)遊離OXM(非修飾OXM)組成物内の投与されるOXM成分の重量に基づく。

0141

別の実施形態において、本発明の方法は、OXM療法を必要としている慢性疾患に罹患した患者のコンプライアンスを高めることを含む。別の実施形態において、本発明の方法は、上述したように逆PEG化OXMによりOXMの投与頻度の低下を可能にする。別の実施形態において、本発明の方法は、OXMの投与の頻度を低下させることによってOXM治療を必要とする患者のコンプライアンスを高めることを含む。別の実施形態において、OXMの投与頻度の低下は、OXMをより安定させ、より強力にさせる逆ペグ化のおかげで達成される。別の実施形態において、OXMの投与頻度の低下は、OXMのT1/2の増加の結果として達成される。別の実施形態において、OXMの投与頻度の低下は、OXMの血液クリアランスの低下の結果として達成される。別の実施形態において、OXMの投与頻度の低下は、OXMのT1/2の増加の結果として達成される。別の実施形態において、OXMの投与頻度の低下は、OXMのAUC測定値の増加の結果として達成される。

0142

別の実施形態において、逆ペグ化OXMは1日に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、2日に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、3日に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、4日に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、5日に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、6日に1回患者に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、週に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、7〜14日に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、10〜20日に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、5〜15日に1回対象に投与される。別の実施形態において、逆ペグ化OXMは、15〜30日に1回対象に投与される。

0143

経口投与は、一実施形態において、錠剤カプセル剤トローチ剤チュアブル錠、懸濁液、および乳剤などを含む単位剤形を含む。このような単位剤形は、本発明の安全かつ有効な量のOXMを含み、それらの各々は、一実施形態において、約0.7もしくは3.5mgから約280mg/70kg、または別の実施形態において、約0.5もしくは10mgから約210mg/70kgである。経口投与用の単位剤形の調製に適する薬学的に許容される担体は、当技術分野で公知である。一部の実施形態において、錠剤は、代表的には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムマンニトール乳糖およびセルロースなどの不活性希釈剤、デンプン、ゼラチンおよびショ糖などの結合剤、デンプン、アルギン酸およびクロスカルメロースなどの崩壊剤ステアリン酸マグネシウムステアリン酸およびタルクなどの潤滑剤のような従来の薬学的に適合性のあるアジュバントを含む。一実施形態において、二酸化ケイ素などの流動促進剤を用いて、粉末混合物流動特性を改善することができる。一実施形態において、FD&C染料などの着色剤は、外観のために添加することができる。アスパルテームサッカリンメントールペパーミント、およびフルーツフレーバーなどの甘味料および香味剤は、チュアブル錠に有用なアジュバントである。カプセル剤は、代表的には、上記で開示した1以上の固体希釈剤を含む。一部の実施形態において、担体成分の選択は、本発明の目的にとって重要ではない味、コストおよび貯蔵安定性などの二次的考慮事項に依存し、当業者によって容易になされ得る。

0144

一実施形態において、経口剤形は、あらかじめ定義された放出プロファイルを含む。一実施形態において、本発明の経口剤形は、徐放性の錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態において、本発明の経口剤形は、徐放性の錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態において、本発明の経口剤形は、即時放出性の錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態において、経口剤形は、当業者に公知の長時間作用型OXNの所望の放出プロファイルに従って製剤化される。

0145

別の実施形態において、本発明の方法で使用するための組成物は、溶液または乳濁液を含み、これらは、別の実施形態において、本発明の安全かつ有効な量の化合物、必要に応じて、局所鼻腔内投与用の他の化合物を含む水性溶液または乳濁液である。一部の実施形態において、これらの組成物は、鼻腔内経路によって化合物の全身送達のために使用される対象化合物を約0.001%〜約10.0%w/v、より好ましくは、約0.01%〜約2.0%含む。

0146

別の実施形態において、これらの医薬組成物は、液体製剤の静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内注射により投与される。別の実施形態において、液体製剤は、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、および油類などを含む。一実施形態において、これらの医薬組成物は、静脈内投与され、したがって、静脈内投与に適した形態で製剤化される。別の実施形態において、これらの医薬組成物は動脈内投与され、したがって、動脈内投与に適した形態で製剤化される。別の実施形態において、これらの医薬組成物は筋肉内投与され、したがって、筋肉内投与に適した形態で製剤化される。

0147

さらに、他の実施形態において、これらの医薬組成物は体表面に局所的に投与され、したがって、局所投与に適した形態で製剤化される。適切な局所製剤としては、ゲル軟膏クリームローション、および液滴などを挙げることができる。局所投与のために、本発明の化合物は、医薬担体の有無にかかわらず、追加の適切な治療剤と組み合わせて調製され、生理学的に許容される希釈剤中の液剤懸濁剤、または乳剤として適用される。

0148

一実施形態において、本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒糖衣錠作製、研和乳化カプセル化封入または凍結乾燥のプロセスによって、当技術分野で公知のプロセスによって製造される。

0149

一実施形態において、本発明に従って使用するための医薬組成物は、薬学的に使用できる製剤へのOXMのプロセシングを促進する賦形剤および補助剤を含む1以上の生理学的に許容される担体を用いて従来の方法で製剤化される。一実施形態において、製剤は、選択される投与経路に依存する。

0150

一実施形態において、本発明の注射剤は水溶液に製剤化される。一実施形態において、本発明の注射剤は、ハンクス溶液リンゲル溶液、または生理食塩緩衝液などの生理的に適合する緩衝液に製剤化される。一部の実施形態において、経粘膜投与のために、透過すべき障壁に適する浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は当技術分野で公知である。

0151

一実施形態において、本明細書に記載の製剤は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化される。別の実施形態において、注射用製剤は、例えば、必要に応じて防腐剤を添加したアンプルまたは多用量容器の中に単位剤形で提供される。別の実施形態において、組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤であり、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの処方剤を含む。

0152

これらの組成物はまた、別の実施形態において、塩化ベンザルコニウムおよびチメロサールなどの保存剤エデト酸ナトリウムなどのキレート剤リン酸クエン酸および酢酸などの緩衝剤塩化ナトリウム塩化カリウムグリセリン、およびマンニトールなどの等張化剤アスコルビン酸アセチルシスチン、およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤芳香剤、セルロースおよびその誘導体を含むポリマーなどの粘度調整剤ポリビニルアルコール、ならびに必要に応じてこれらの水性組成物のpHを調整するための酸および塩基も含む。これらの組成物はまた、一部の実施形態において、局所麻酔薬または他の活性成分も含む。これらの組成物は、スプレーミスト、および液滴などとして使用することができる。

0153

一実施形態において、非経口投与用の医薬組成物は、水溶性形態活性製剤の水溶液を含む。さらに、長時間作用型OXMの懸濁液は、一部の実施形態において、適切な油性または水系の注射用懸濁液として調製される。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、一部の実施形態において、ゴマ油などの脂肪油類、またはオレイン酸エチルトリグリセリドもしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステル類を含む。水性注射用懸濁液は、一部の実施形態において、カルボキシメチルセルロースナトリウムソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含む。別の実施形態において、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にする長時間作用型OXMの溶解度を増大させる好適な安定化剤または薬剤も含む。

0154

別の実施形態において、活性化合物は、小胞、特に、リポソームに送達され得る(Langer,Science 249:1527−1533(1990);Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez− Berestein and Fidler(編),Liss,New York,pp.353−365(1989);Lopez−Berestein,同書のpp.317−327を参照されたい;一般的に同書を参照されたい)。

0155

別の実施形態において、制御放出系で送達される医薬組成物は、静脈内注入植込み型浸透圧ポンプ経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式のために製剤化される。一実施形態において、ポンプが使用される(Langer,上記;Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987);Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980);Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989)を参照されたい)。別の実施形態において、高分子材料を用いることができる。さらに別の実施形態において、制御放出系は、治療標的、すなわち、脳の近傍に配置することができ、したがって、全身用量の一部しか必要ではない(例えば、Goodson,in Medical Applications of Controlled Release、上記の第2巻、pp.115−138(1984)を参照されたい)。他の制御放出系は、Langerによる総説(Science 249:1527−1533(1990))に記載されている。

0156

一実施形態において、長時間作用型OXMは、適当なビヒクル、例えば、無菌の、発熱物質を含まない水ベースの溶液で使用前に構成するための粉末形態である。組成物は、一部の実施形態において、微粒化および吸入投与用に製剤化される。別の実施形態において、組成物は微粒化手段により容器に入れられる。

0157

一実施形態において、本発明の製剤は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化される。

0158

一実施形態において、本発明の文脈における使用に適する医薬組成物は、長時間作用型OXMが、意図された目的を達成するために有効量で含まれる組成物を含む。別の実施形態において、治療有効量は、治療される対象の疾患の症状を予防、緩和もしくは改善するか、または生存を延長するのに有効な長時間作用型OXMの量を意味する。

0159

一実施形態において、治療有効量の決定は十分に当業者の能力の範囲内である。

0160

これらの組成物は、塩化ベンザルコニウムおよびチメロサールなどの保存剤、エデト酸ナトリウムなどのキレート剤、リン酸、クエン酸および酢酸などの緩衝剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびマンニトールなどの等張化剤、アスコルビン酸、アセチルシスチン、およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、芳香剤、セルロースおよびその誘導体を含むポリマーなどの粘度調整剤、ポリビニルアルコール、ならびに必要に応じてこれらの水性組成物のpHを調整するための酸および塩基も含む。これらの組成物は、局所麻酔薬、または他の活性物質も含む。これらの組成物はスプレー、ミスト、および液滴などとして使用することができる。

0161

薬学的に許容される担体またはその成分として機能し得る物質の一部の例としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびメチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体、粉末トラガカント麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤硫酸カルシウム落花生油綿実油、ゴマ油、オリーブ油トウモロコシ油およびカカオ油などの植物油類プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール類、アルギン酸、Tween(登録商標ブランド乳化剤などの乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤、着色剤、香味剤、錠剤化剤、安定化剤、酸化防止剤、防腐剤、発熱物質を含まない水、等張食塩水、ならびにリン酸緩衝液が挙げられる。化合物と組み合わせて使用される薬学的に許容される担体の選択は、基本的に化合物が投与される方法により決定される。対象化合物が注入される場合に、一実施形態において、薬学的に許容される担体は、pHが約7.4に調整されている、血液適合性懸濁剤を有する無菌の生理食塩水である。

0162

さらに、組成物は、結合剤(例えば、アカシアコーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガムヒドロキシプロピルセルロースヒドロキシプロピルメチルセルロースポビドン)、崩壊剤(例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウムクロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム)、様々なpHおよびイオン強度の緩衝液(例えば、トリスHCI、酢酸塩リン酸塩)、表面への吸収を防ぐためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤界面活性剤(例えば、Tween20、Tween80、プルロニックF68、胆汁酸塩)、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)、透過促進剤可溶化剤(例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール)、安定化剤(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、増粘剤(例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム)、甘味料(例えば、アスパルテーム、クエン酸)、防腐剤(例えば、チメロサール、ベンジルアルコールパラベン)、滑剤(例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、流動助剤(例えば、コロイド状二酸化ケイ素)、可塑剤(例えば、フタル酸ジエチルクエン酸トリエチル)、乳化剤(例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム)、ポリマーコーティング(例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン)、コーティング剤およびフィルム形成剤(例えば、エチルセルロース、アクリレートポリメタクリレート)ならびに/またはアジュバントをさらに含む。

0163

シロップ剤エリキシル剤、乳剤および懸濁剤用の担体の典型的な成分としては、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトールおよび水を挙げることができる。懸濁液については、典型的な懸濁剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース(例えば、Avicel(登録商標)、RC−591)、トラガカントおよびアルギン酸ナトリウムが含まれ、典型的な湿潤剤としては、レシチンおよびポリエチレンオキシドソルビタン(例えば、ポリソルベート80)を挙げることができる。典型的な防腐剤としては、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムを挙げることができる。別の実施形態において、経口液体組成物はまた、上記に開示した甘味料、香味剤および着色剤などの1以上の成分も含む。

0164

これらの組成物はまた、ポリ乳酸ポリグリコール酸ヒドロゲルなどの高分子化合物粒子状製剤の中もしくは上、またはリポソーム、マイクロエマルジョンミセル単層もしくは多層の小胞、赤血球ゴースト、もしくはスフェロプラスト上への活性物質の取り込みも含む。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼすであろう。

0165

ポリマー(例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン)でコーティングされた微粒子組成物、および組織特異的な受容体、リガンドもしくは抗原に対する抗体に結合した化合物または組織特異的受容体のリガンドに結合した化合物も本発明に包含される。

0166

一実施形態において、化合物は、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールコポリマーカルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンなどの水溶性ポリマーの共有結合によって修飾される。別の実施形態において、修飾された化合物は、実質的に、対応する非修飾化合物よりも静脈内注射後の血中半減期が長い。一実施形態において、修飾は、水溶液中の化合物の溶解度を増加させ、凝集を排除し、化合物の物理的および化学的安定性を高め、化合物の免疫原性および反応性を著しく低下させる。別の実施形態において、所望のインビボ生物活性は、非修飾化合物を用いた場合よりも少ない頻度または低い用量でこのような高分子化合物の投与により達成される。

0167

別の実施形態において、有効量または有効用量の製剤は、インビトロアッセイから最初に推定することができる。一実施形態において、動物モデルにおける用量を製剤化することができ、そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。

0168

一実施形態において、本明細書に記載の長時間作用型OXMの毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における、インビトロの標準的な薬学的手順によって決定することができる。一実施形態において、インビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲で製剤化するのに用いることができる。一実施形態において、投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して変化する。一実施形態において、正確な製剤、投与経路および投薬量は、患者の病状を考慮して個々の医師が選択することができる[例えば、Fingl,et al.,(1975)"The Pharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1、p.1を参照されたい]。

0169

一実施形態において、治療すべき病状の重症度および応答性に依存して、投薬は、数日〜数週間続く治療の過程か、治癒が得られるか、または病態縮小が達成されるまでの単回または複数回投与であり得る。

0170

一実施形態において、投与されるべき組成物の量は、当然、治療される対象、苦痛重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。

0171

一実施形態において、適合する医薬担体中に製剤化される本発明の製剤を含む組成物も、調製され、適切な容器に入れられ、示される病状の治療について表示される。

0172

別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMは、全身投与によって投与される。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMは、静脈内、筋肉内または皮下注射によって投与される。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMは、非イオン性界面活性剤(surface active agent)(すなわち、界面活性剤(surfactant))、各種糖類、有機ポリオール類および/またはヒト血清アルブミンなどの複合有機賦形剤および安定化剤と組み合わせた凍結乾燥(lyophilize)(すなわち、凍結乾燥(freeze−dried))製剤である。別の実施形態において、医薬組成物は、注射用滅菌水中に本明細書に記載の凍結乾燥逆ペグ化OXMを含む。別の実施形態において、医薬組成物は、注射用滅菌PBS中に本明細書に記載の凍結乾燥逆ペグ化OXMを含む。別の実施形態において、医薬組成物は、注射用の滅菌0.9%NaCl中に本明細書に記載の凍結乾燥逆ペグ化OXMを含む。

0173

別の実施形態において、この医薬組成物は、本明細書に記載の逆ペグ化OXMならびにヒト血清アルブミン、ポリオール類、糖類、アニオン性界面活性剤、および安定化剤などの複合担体を含む。例えば、国際公開第89/10756号(原ら、ポリオールおよびp−ヒドロキシ安息香酸を含む)を参照されたい。別の実施形態において、この医薬組成物は、本明細書に記載の逆ペグ化OXMならびにラクトビオン酸および酢酸/グリシン緩衝液を含む。別の実施形態において、この医薬組成物は、本明細書に記載の逆ペグ化OXMおよび水中におけるインターフェロン組成物の溶解性を高めるアルギニンまたはグルタミン酸などのアミノ酸を含む。別の実施形態において、この医薬組成物は、本明細書に記載の凍結乾燥逆ペグ化OXMならびにグリシンまたはヒト血清アルブミン(HSA)、緩衝剤(例えば、酢酸)、および等張剤(例えば、NaCl)を含む。別の実施形態において、この医薬組成物は、本明細書に記載の凍結乾燥逆ペグ化OXMならびにリン酸緩衝液、グリシンおよびHSAを含む。

0174

別の実施形態において、本明細書に記載のペグ化または逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、pH約4〜7.2の緩衝溶液中に置かれたときに安定化する。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、安定化剤としてアミノ酸および場合によって(アミノ酸が荷電側鎖を含まない場合)塩で安定化される。

0175

別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、約0.3%〜5重量%のアミノ酸である安定化剤を含む液体組成物である。

0176

別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、投薬精度および製品の安全性を提供する。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、注射可能な用途に使用するための生物活性のある安定な液体製剤を提供する。別の実施形態において、この医薬組成物は、本明細書に記載の凍結乾燥されていない逆ペグ化OXMを含む。

0177

別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、保管を容易にし、投与前に出荷するために、液体状態長期間保管できる液体製剤を提供する。

0178

別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、マトリックス材料として固体脂質を含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む注射可能な医薬組成物は、マトリックス材料として固体脂質を含む。別の実施形態において、噴霧凝固による脂質微粒子の生成は、Speiser(Speiser and al.,Pharm.Res.8(1991)47−54)によって記載されており、その後、経口投与のための脂質ナノペレットにされる(Speiserの欧州特許第0167825号(1990))。別の実施形態において、使用される脂質(例えば、非経口栄養用の乳剤に存在する脂肪酸からなるグリセリド)は、体内で十分に耐容性を示す。

0179

別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、リポソームの形態である(J.E.Diederichs and al.,Pharm./nd.56(1994)267−275)。

0180

別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、ポリマー微粒子を含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む注射用医薬組成物は、高分子微粒子を含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、ナノ粒子を含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、リポソームを含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、脂質乳剤を含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、マイクロスフェアを含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、両親媒性脂質を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態において、本明細書に記載の逆ペグ化OXMを含む医薬組成物は、薬物、脂質マトリックスおよび界面活性剤を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態において、脂質マトリックスは、少なくとも50%w/wであるモノグリセリド含量を有する。

0181

一実施形態において、本発明の組成物は、長時間作用型OXMを含む1以上の単位剤形を含有する米国食品医薬品局FDA)によって承認されたキットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供される。一実施形態において、このパックは、例えば、金属またはブリスターパックなどのプラスチックホイルを含む。一実施形態において、このパックまたはディスペンサー装置は、投与のための説明書が添付されている。一実施形態において、このパックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用または販売規制する政府機関により定められた形式で容器に添付された通知が収容されており、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与についての当局による承認を反映する。このような通知は、一実施形態において、処方薬または承認された製品添付文書について米国食品医薬品局によって承認されたラベリングである。

0182

一実施形態において、本発明の逆ペグ化OXMは、各薬剤を単独で用いた治療と比較して改善された治療効果を達成するために、追加の活性薬剤を個体に提供することができることが理解されるであろう。別の実施形態において、併用療法に関連する有害副作用に対して措置(例えば、相補的な薬剤の投薬および選択)が行われる。

0183

さらなる目的、利点、および本発明の新規な特徴は、限定されるものではないが、以下の実施例を考察すれば、当業者に明らかになるであろう。さらに、上記で説明し、特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、以下の実施例の実験によって支持される。

0184

実施例
一般的に、本明細書で使用する用語および本発明で利用する実験方法として、分子、生化学、微生物学および組換えDNAの技術を挙げることができる。このような技術は、各種文献に詳細に説明されている。例えば"分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A laboratory Manual)"Sambrookら(1989);"Current Protocols in Molecular Biology"I−III巻 Ausubel,R.M.(編)(1994);Ausubelら"分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)"、John Wiley and Sons、メリーランド州ボルチモア(1989);Perbalの"分子クローニングの実用ガイド(A Practical Guide to Molecular Cloning)"、John Wiley & Sons、ニューヨーク州(1988);Watsonらの"組換えDNA(Recombinant DNA)"、Scientific American Books、ニューヨーク州;Birrenら(編)"ゲノム解析:実験室マニュアルシリーズ(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)"、1〜4巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州(1998);米国特許第4,666,828号、同第4,683,202号、同第4,801,531号、同第5,192,659号、同第5,272,057号に記載の方法;"細胞生物学:実験ハンドブック(Cell Biology:A Laboratory Handbook)"、I−III巻 Cellis、J.E.(編)(1994);Freshneyによる"動物細胞の培養−基本技術マニュアル(Culture of Animal Cells−A Manual of Basic Technique" Wiley−Liss,ニューヨーク州(1994)、第3版;"免疫学における最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)"I−III巻、Coligan J.E.(編)(1994);Stitesら(編)"基本的な臨床免疫(Basic and Clinical Immunology)"(第8版)、Appleton & Lange、コネチカットノーウォーク(1994);Mishell and Shiigi(編)"細胞免疫学の選択法(Selected Methodsin Cellular Immunology)"、W.H.Freeman and Co.、ニューヨーク州(1980);利用可能なイムノアッセイは広範囲に特許および科学文献に記載されている。例えば、米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,850,578号、同第3,853,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号、同第4,098,876号、同第4,879,219号、同第5,011,771号、同第5,281,521号;"オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)"Gait,M.J.(編)(1984);"核酸ハイブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization)"Hames,B.D.およびHiggins S.J.(編)(1985);"転写と翻訳(Transcription and Translation)"Hames,B.D.およびHiggins S.J.(編)(1984);"動物細胞培養(Animal Cell Culture)"Freshney,R.I.(編)(1986);"固定化細胞および酵素(Immobilized Cells and Enzymes)"IRL Press,(1986);"分子クローニングの実用ガイド(A Practical Guide to Molecular Cloning)"Perbal,B.(1984)および"酵素学における方法(Methods in Enzymology)"1−317巻、Academic Press;"PCRプロトコル:方法と応用へのガイド(PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications)"、Academic Press、カリフォルニアサンディエゴ(1990);Marshakらの"タンパク質の精製および特徴づけのための戦略研究室コースマニュアル(Strategies for Protein Purification and Characterization − A Laboratory Course Manual)"CSHLPress(1996)を参照されたく、これらの全ては、参照により援用される。他の一般的な文献は本明細書の中に提供される。

0185

材料および方法
PEG30−FMS−OXM合成−異種
1.1段階1:OXM合成
以下のペプチド配列からなるオキシントモジュリンを合成した。
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(配列番号1)

0186

このペプチドを、ペプチド鎖のアセンブリ全体にFmoc戦略を用いた固相法により合成した(Almac Sciences社、スコトランド)。

0187

このペプチド配列を、以下のステップを用いて構築した:
1.キャッピング
樹脂DMF(Rathburn社)中の0.5M無水酢酸(Fluka社)溶液を用いてキャップした。

0188

2.脱保護
Fmoc−保護基を、DMF(Rathburn社)中20%v/vのピペリジン(Rathburn社)溶液を用いて、成長するペプチド鎖から除去した。

0189

3.アミノ酸のカップリング
DMF(Rathburn社)中0.5Mのアミノ酸(Novabiochem社)溶液を、DMF(Rathburn社)中1MのHOBt(Carbosynth社)溶液およびDMF(Rathburn社)中1MのDIC(Carbosynth社)溶液を用いて活性化した。カップリングごとに各アミノ酸の4当量を使用した。

0190

粗ペプチドを樹脂から切断し、保護基をトリイソプロピルシラン(Fluka社)、水、ジメチルスルフィドAldrich社)およびヨウ化アンモニウム(Aldrich社)およびTFAアプライドバイオシステムズ社)の混合物中で4時間撹拌することにより除去する。粗ペプチドを冷ジエチルエーテルからの沈殿により回収する。

0191

ペプチド精製
粗ペプチドを、アセトニトリル(Rathburn社)/水(ミリQ)(5:95)に溶解し、分取HPLCカラム上に添加した。クロマトグラフィーのパラメータを以下に示す。
カラム:Phenomenex Luna C18 250mm×30、15μm、300A
移動相A:水+0.1%v/vのTFA(Applied Biosystems社)
移動相B:アセトニトリル(Rathburn社)+0.1%v/vのTFA(Applied Biosystems社)
UV検出:214または220nm
勾配カラム体積の4倍を超える25%B〜31%B
流速:43mL/分

0192

段階2−リンカー合成

0193

化合物2〜5の合成は、AlbericioらのSynthetic Communication,2001,31(2),225−232に記載の手順に基づく。

0194

2−(Boc−アミノ)フルオレン(2):
2−アミノフルオレン(18g、99ミリモル)を、磁気撹拌しながら氷浴中でジオキサン:水(2:1)(200ml)および2NのNaOH(60ml)の混合物に懸濁した。次いで、Boc2O(109ミリモル、1.1当量)を加え、室温で攪拌し続けた。反応をTLC(Rf=0.5、ヘキサン酢酸エチル2:1)によって監視し、2NのNaOHの添加によりpHを9〜10に維持した。反応完了時に、懸濁液をpH=3まで1MのKHSO4で酸性化した。固体を濾過し、冷水(50ml)、ジオキサン−水(2:1)で洗浄し、次いで、次のステップで使用する前に2回トルエン共沸した。

0195

9−ホルミル−2−(Boc−アミノ)フルオレン(3):
3口RBFに、NaH(油中60%;330ミリモル、3.3当量)を、乾燥THF(50ml)に懸濁し、ステップ2に記載の乾燥THF(230ml)中2−(Boc−アミノ)フルオレン溶液(28g;100ミリモル)を20分かけて滴加した。濃厚な黄色のスラリーが観察され、混合物を窒素下、室温で10分間攪拌した。ギ酸エチル(20.1ml、250ミリモル、2.5当量)を滴加した(注意ガス発生)。このスラリーは淡褐色溶液に変化した。この溶液を20分間攪拌した。反応をTLC(Rf=0.5、ヘキサン/酢酸エチル1:1)によって監視し、出発材料痕跡のみが観察された時に、氷水(300ml)でクエンチした。混合物を、THFの大部分が除去されるまで減圧下で蒸発させた。得られた混合物をpH=5まで酢酸で処理した。得られた白色沈殿物を酢酸エチルに溶解し、有機層を分離した。水層を酢酸エチルで抽出し、全ての有機層を合わせ、飽和重炭酸ナトリウムブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させた。濾過および溶媒除去後黄色固体が得られた。この物質を次のステップで使用した。

0196

9−ヒドロキシメチル−2−(Boc−アミノ)フルオレン(4):
上記の化合物3をMeOH(200ml)に懸濁し、水素化ホウ素ナトリウムを15分かけて少しずつ添加した。混合物を30分間撹拌した(注意:発熱反応およびガス発生)。反応をTLC(Rf=0.5、ヘキサン/EtOAc 1:1)により監視し、完成させた。水(500ml)を添加し、酢酸でpHを5に調整した。仕上げ作業には、酢酸エチルでの2回抽出、合わせた有機層の重炭酸ナトリウムおよびブラインでの洗浄、MgSO4での乾燥、濾過および濃縮乾燥が伴う。得られた粗生成物を、ヘプタン/EtOAc(3:1)を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色泡状物を得た(36g、純度97.5%、酢酸エチルおよびジエチルエーテルの痕跡が1H−NMRで観察された)。

0197

MAL−Fmoc−NHS(7):
オーバーヘッド撹拌によりクリーンな乾燥RBF500mlに乾燥THF(55ml)中のトリホスゲン(1.58g、0.35当量)を添加し、周囲環境で溶液を形成させた。これを水浴で0℃まで冷却し、乾燥THF(19ml)中NHS(0.67g、0.38当量)の溶液を窒素下、0℃で10分間かけて滴加した。得られた溶液を30分間攪拌した。乾燥THF(36ml)中のNHS(1.34g、0.77当量)を、さらに0℃で10分かけて滴加し、15分間撹拌した。

0198

化合物6(5.5g、1当量)、乾燥THF(55ml)およびピリジン(3.07ml、2.5当量)を共に撹拌し、懸濁液を形成させた。これを0〜5℃でNHS溶液に少しずつ添加し、次いで、氷浴を除去して、室温まで放置した。

0199

20時間後、反応を停止した(出発原料がまだ存在しており、反応が完了するまで、少し不純物が観察された)。

0200

反応混合物を濾過し、濾液に、4%ブライン(200ml)およびEtOAc(200ml)を添加した。分離後、有機層を5%クエン酸(220ml)および水(220ml)で洗浄した。次いで、有機層を濃縮し、粗MAL−Fmoc−NHS7.67gを得た。この物質を、70:30〜40:60の勾配のシクロヘキサン/EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含む画分を真空濃縮し、MAL−Fmoc−NHS3.47g(45%)を得た。

0201

MAL−FMS−NHS
トリフルオロ酢酸(10ml)中のMAL−Fmoc−NHS(100mg、0.2ミリモル)の溶液に、クロロスルホン酸(0.5ml)を加えた。15分後、氷冷したジエチルエーテル(90ml)を添加し、生成物が沈殿した。この物質を遠心分離により収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。ベージュ色の固体41.3mg(35%)を得た。

0202

段階3−結合
OXMペプチド中の3つのアミン部位(Lys12、Lys30およびアミノ末端)の異種結合を「ワンポット反応」として行い、OXM、mPEG−SHおよびFMSリンカーの各成分の1当量を、30分間、pH7.2で混合した。pHを4まで下げるために酢酸を添加することによって、反応を停止した。

0203

PEG30−FMS−OXM合成−同種
段階1:スペーサーMAL−FMS−NHS(FMS)合成:異種結合体について説明した通りである。

0204

段階2:オキシントモジュリン(OXM)の合成:
N末端部位特異的OXM−異種結合体について上記で説明した通りである。

0205

Lys12またはLys30部位特異的OXM−リシンの位置12または30中のFmoc−Lys(ivDde)−OHおよび結合される最後のアミノ酸としてBoc−His(Boc)−OHを用いること以外は同じ戦略を使用する。

0206

段階3:同種結合
FMSのOXMへのカップリング:
MAL−FMS−NHSリンカー溶液(0.746ml、DMF中10mg/ml、2当量)をOXM樹脂(1当量、樹脂200mg、31.998μモル/gの遊離アミン)に添加した。樹脂が自由に可動可能になるまでDMFを添加し、次いで、19時間超音波処理した。樹脂をDMFおよびメタノールで洗浄し、真空デシケーター中で一晩乾燥した。切断カクテルは、TFA/TIS/H2Oを含んでいた。切断を、室温で3.5時間かけて行った。樹脂を濾過した後、FMS−OXMを冷ジエチルエーテルで沈殿させた。切断段階の最後に、粗FMS−OXM(36%純度)42.1mgを得た。

0207

FMSのLys12部位特異的OXMへのカップリング:
MAL−FMS−NHSリンカー溶液(DMF中10mg/ml、2.5当量)を、(Lys12)OXM樹脂(1当量)に添加し、DIEA(5当量)を添加した。樹脂が自由に可動可能になるまでDMFを添加し、次いで、一晩超音波処理した。樹脂をDMFおよびメタノールで洗浄し、真空デシケーター中で一晩乾燥した。切断および沈殿を、N末端部位特異的OXMについて記載したように行った。

0208

FMSのLys30部位特異的OXMへのカップリング:
MAL−FMS−NHSリンカー(2.5当量)をDCMに溶解させ、DIEA(5当量)を加えた。このリンカー/DIEA溶液を(Lys30)OXM樹脂に添加し、次いで、一晩超音波処理した。樹脂をDCMおよびメタノールで洗浄し、真空デシケーター中で一晩乾燥した。切断および沈殿を、N末端部位特異的OXMについて記載したように行った。

0209

精製
得られた粗FMS−OXMを一度に精製した。
試料希釈剤:水中の10%アセトニトリル
カラム:Luna C18(2),100Å,250×21.2mm
注入流量:9ml/分
実行中の流速:9ml/分
緩衝液A:水(0.1%TFA)
緩衝液B:アセトニトリル(0.1%TFA)
勾配:32分かけて10〜45%B
監視:230nm

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