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技術 タンパク質のアロステリックモジュレーターを検出するための方法

出願人 バイオデシー,インコーポレイテッド
発明者 ジョシュアエス.サラフスキー
出願日 2018年3月2日 (2年2ヶ月経過) 出願番号 2018-037353
公開日 2018年6月14日 (1年10ヶ月経過) 公開番号 2018-091866
状態 未査定
技術分野 生物学的材料の調査,分析 特有な方法による材料の調査、分析
主要キーワード 超高速レーザー 非線形活性 真空ボトル パラレルレジスタ データ保存デバイス 光電流パルス 陥没領域 流体支持
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2018年6月14日)のものです。
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図面 (7)

課題

タンパク質アロステリックモジュレーターを検出するための方法の提供。

解決手段

本発明はとりわけ、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合し、これにより、その構造的コンフォメーションを変化させる薬剤を同定する目的で、標的タンパク質を、第二高調波発生または和周波発生による検出のためのSHG活性プローブで標識するための方法を開示する。特定の実施形態では、本発明によれば、第二高調波発生技術を使用して、標的タンパク質のアロステリックモジュレーターを同定および検出するための方法が提供される。

概要

背景

発明の背景
がん生物学における潜在的な治療標的の数は、最近20年間において、指数関数的に増大し、がんゲノミクスの理解の深化をもたらしている。しかし、同時に、承認された療法であって、最も多量に活性化するがん関連遺伝子をターゲティングする療法の数は、ごくわずかしか増大していない。生物学的視点からは魅力的な多くのがん標的が、化学的見地からは扱いにくい(「アンドラッガブル」)と考えられている。これらのタンパク質標的は典型的に、他のタンパク質と相互作用する(すなわち、タンパク質間相互作用または「PPI」)ときに、比較的大きな接触面積を保有するために、またはタンパク質の活性部位に極めて強固に結合するリガンドを保有するという事実に起因して、従来の薬物発見法には適さないことが理解されつつある。後者の場合の例は、そのリガンドであるGTPピコモル単位のアフィニティーで結合し、潜在的な薬物との競合を困難にしている、Rasなどのタンパク質に関して見出される。全ての既存の標的のうちの75〜80%は、古典的な低分子クラスまたは生物学的物質(タンパク質)クラスの治療剤であって、一般に、タンパク質の活性部位に競合的に結合することによりタンパク質の機能を阻害し、それらの中には、がんに対する妥当性の高いいくつかの標的が含まれる治療剤の範囲を越えていることが推定される。

このような「アンドラッガブル」標的に対するアロステリックモジュレーターは、魅力的な治療解決法をもたらす。定義により、アロステリック分子は、タンパク質の活性部位以外の部位に結合し、これにより、タンパク質のコンフォメーションを変化させ、共時的な機能的効果(例えば、受容体の阻害、活性化など)を及ぼす。加えて、他の利点(1)には、標的タンパク質のアロステリックモジュレーションが、意図されない臨床的副作用を結果としてもたらしうる、天然リガンドの、タンパク質への結合の阻害またはこれとの競合に依拠する必要がないというさらなる利益を有する。しかし、現在利用可能な従来の技法を使用して、アロステリックモジュレーターを同定することは困難であった。例えば、X線結晶構造解析またはNMR法から得られる構造的情報は、ロースループット、感度非生理学的条件、技法に適するタンパク質のサイズ、および他の多くの因子に起因して、薬物発見の目的では限定されたものである。したがって、必要とされているのは、標的タンパク質の構造をアロステリックにモジュレートすることが可能な薬剤(agent)を、迅速に、かつ、ハイスループット様式で同定する技法である。

本明細書では、標的タンパク質にアロステリックに結合し、これにより、そのコンフォメーション構造を変化させることが可能な薬剤を同定するための方法を開示することにより、このような技法を提供する。

本明細書を通して、多様な特許、特許出願、および他の種類の刊行物(例えば、雑誌論文)を参照する。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりそれらの全体において、全ての目的で本明細書に組み込まれる。

概要

タンパク質のアロステリックモジュレーターを検出するための方法の提供。本発明はとりわけ、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合し、これにより、その構造的コンフォメーションを変化させる薬剤を同定する目的で、標的タンパク質を、第二高調波発生または和周波発生による検出のためのSHG活性プローブで標識するための方法を開示する。特定の実施形態では、本発明によれば、第二高調波発生技術を使用して、標的タンパク質のアロステリックモジュレーターを同定および検出するための方法が提供される。なし

目的

本明細書では、標的タンパク質にアロステリックに結合し、これにより、そのコンフォメーション構造を変化させることが可能な薬剤を同定するための方法を開示することにより、このような技法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本願明細書に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願の引用
本願は、2013年3月11日に出願された米国特許出願第13/794,277号の一部継続出願である。米国特許出願第13/794,277号は、2012年4月25日に出願した米国特許出願第61/638,131号の米国特許法第119条(e)項の下での利益を主張する。この出願はまた、2012年11月2日に出願されたPCT特許出願第PCT/US2012/063286号への優先権を主張する。PCT特許出願第PCT/US2012/063286号はまた、2012年4月25日に出願された米国仮特許出願第61/638,026号の米国特許法第119条(e)項の下での利益を主張する。上記の出願は、全ての目的のために本明細書に参考として援用される。

0002

発明の分野
本発明は特に分子検出およびタンパク質検出の分野に関する。具体的には、本明細書では、第二高調波発生技術を使用して、標的タンパク質アロステリックモジュレーターを同定および検出するための方法が提供される。

背景技術

0003

発明の背景
がん生物学における潜在的な治療標的の数は、最近20年間において、指数関数的に増大し、がんゲノミクスの理解の深化をもたらしている。しかし、同時に、承認された療法であって、最も多量に活性化するがん関連遺伝子をターゲティングする療法の数は、ごくわずかしか増大していない。生物学的視点からは魅力的な多くのがん標的が、化学的見地からは扱いにくい(「アンドラッガブル」)と考えられている。これらのタンパク質標的は典型的に、他のタンパク質と相互作用する(すなわち、タンパク質間相互作用または「PPI」)ときに、比較的大きな接触面積を保有するために、またはタンパク質の活性部位に極めて強固に結合するリガンドを保有するという事実に起因して、従来の薬物発見法には適さないことが理解されつつある。後者の場合の例は、そのリガンドであるGTPピコモル単位のアフィニティーで結合し、潜在的な薬物との競合を困難にしている、Rasなどのタンパク質に関して見出される。全ての既存の標的のうちの75〜80%は、古典的な低分子クラスまたは生物学的物質(タンパク質)クラスの治療剤であって、一般に、タンパク質の活性部位に競合的に結合することによりタンパク質の機能を阻害し、それらの中には、がんに対する妥当性の高いいくつかの標的が含まれる治療剤の範囲を越えていることが推定される。

0004

このような「アンドラッガブル」標的に対するアロステリックモジュレーターは、魅力的な治療解決法をもたらす。定義により、アロステリック分子は、タンパク質の活性部位以外の部位に結合し、これにより、タンパク質のコンフォメーションを変化させ、共時的な機能的効果(例えば、受容体の阻害、活性化など)を及ぼす。加えて、他の利点(1)には、標的タンパク質のアロステリックモジュレーションが、意図されない臨床的副作用を結果としてもたらしうる、天然リガンドの、タンパク質への結合の阻害またはこれとの競合に依拠する必要がないというさらなる利益を有する。しかし、現在利用可能な従来の技法を使用して、アロステリックモジュレーターを同定することは困難であった。例えば、X線結晶構造解析またはNMR法から得られる構造的情報は、ロースループット、感度非生理学的条件、技法に適するタンパク質のサイズ、および他の多くの因子に起因して、薬物発見の目的では限定されたものである。したがって、必要とされているのは、標的タンパク質の構造をアロステリックにモジュレートすることが可能な薬剤(agent)を、迅速に、かつ、ハイスループット様式で同定する技法である。

0005

本明細書では、標的タンパク質にアロステリックに結合し、これにより、そのコンフォメーション構造を変化させることが可能な薬剤を同定するための方法を開示することにより、このような技法を提供する。

0006

本明細書を通して、多様な特許、特許出願、および他の種類の刊行物(例えば、雑誌論文)を参照する。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりそれらの全体において、全ての目的で本明細書に組み込まれる。

発明が解決しようとする課題

0007

発明の簡単な概要
本明細書で提供される本発明はとりわけ、第二高調波発生技術を使用することにより、標的タンパク質のコンフォメーション状態のアロステリックモジュレーターを同定および検出するための方法を開示する。

課題を解決するための手段

0008

したがって、いくつかの態様では、本明細書において、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤Bを同定するための方法であって、(a)標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤Aと接触させるステップと、(b)標的タンパク質を、薬剤Bと接触させるステップであって、標的タンパク質を、界面において正味配向性を有する第二高調波活性部分(標識など)で標識し、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分(標識など)に発生させ、検出可能なシグナルが、薬剤Bが標的タンパク質上のアロステリック部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化指し示すステップと、(c)標的タンパク質を薬剤Bと接触させた後で、検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニルオキサゾール−2−イルピリジニウムメタンスルホネート)、PyMPO−NHS、PyMPO−スクシンイミジルエステル、BADAN(商標)(6−ブロモアセチル−2−ジメチルアミノナフタレン)、およびACRYLODAN(商標)(6−アクリロイル−2−ジメチルアミノナフタレン)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)が、標的タンパク質の表面上の1または複数のスルフヒドリル基により、標的タンパク質へと結合されている。いくつかの実施形態では、前記1または複数のスルフヒドリル基は、天然スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、前記1または複数のスルフヒドリル基は、工学的に作製されたスルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、前記1または複数のスルフヒドリル基は、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)である。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)が、標的タンパク質の表面上の1または複数のアミン基により、標的タンパク質へと結合されている。いくつかの実施形態では、前記1または複数のアミン基は、天然アミン基である。いくつかの実施形態では、前記1または複数のアミン基は、工学的に作製されたアミン基である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、前記1または複数のアミン基は、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−スクシンイミジルエステルである。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質を、表面に結合させながら、in situにおいて標識する。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質の領域内に配置されている。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アラダンである。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、リガンドは、タンパク質、核酸リン脂質炭水化物、または補因子のうちの1または複数である。いくつかの実施形態では、リガンドは、キナーゼシグナル伝達カスケードタンパク質メンバーである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、Gタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、界面は、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面セラミック表面ポリマー表面ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、表面を、オリゴPEG分子または脂質で誘導体化する。いくつかの実施形態では、オリゴPEG分子または脂質は、Ni−NTAを保有するオリゴPEG分子またはNi−NTAを保有する脂質である。いくつかの実施形態では、表面は、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アフィニティータグを含む。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を、リアルタイムで検出する。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、薬剤Aおよび/または薬剤Bは、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである。

0009

いくつかの態様では、本明細書において、薬剤に結合するとき、コンフォメーション変化を受ける標的タンパク質の構造内の特異的部位を同定するための方法であって、(a)標的タンパク質を、薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質を、第1のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分(標識など)で標識し、表面選択技術を使用して、第1の検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分(標識など)に発生させ、第1の検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、(b)標的タンパク質を、薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、第2のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分(標識など)で標識されており、第2のアミノ酸残基は、第1のアミノ酸残基の位置とは異なる標的タンパク質の領域内に配置されており、表面選択技術を使用して、第2の検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分(標識など)に発生させ、第2の検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、(c)第1の検出可能なシグナルを、第2の検出可能なシグナルと比較するステップであって、第1のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、薬剤が標的タンパク質に結合し、第1のアミノ酸残基の部位においてタンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示し、第2のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、薬剤が第2のアミノ酸残基の部位において標的タンパク質に結合し、第2のアミノ酸残基の部位においてタンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示すステップとを含む方法が提供される。別の態様では、本明細書において、薬剤がタンパク質に結合した後のタンパク質の構造の部位特異的なコンフォメーション変化を同定するための方法であって、(a)標的タンパク質を、薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、第1のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、第1の検出可能なシグナルが、第二高調波活性部分により発生させられ、第1の検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、(b)標的タンパク質を、薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、第2のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、第2のアミノ酸残基は、第1のアミノ酸残基の位置とは異なる標的タンパク質の領域内に配置されており、表面選択技術を使用して、第2の検出可能なシグナルが、第二高調波活性部分により発生させられ、第2の検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、(c)第1の検出可能なシグナルを、第2の検出可能なシグナルと比較するステップであって、第1のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、薬剤が第1のアミノ酸残基の部位においてタンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示し、第2のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、薬剤が第2のアミノ酸残基の部位においてタンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示すステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤と接触させる最初のステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ステップ(b)および(c)を繰り返すステップをさらに含み、標的タンパク質内の1または複数の異なる部位に位置する1または複数のさらなるアミノ酸残基を、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分(標識など)で標識し、表面選択技術を使用して、1または複数のさらなる検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分(標識など)に発生させ、1または複数のさらなる検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示す。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、方法は、薬剤が、標的タンパク質上のアロステリック部位に特異的に結合するのか、または非特異的に結合するのかを決定するステップをさらに含み、薬剤が、1つの第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位では標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導するが、1または複数の他の第二高調波部分で標識されたアミノ酸の部位では標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導しない場合は、薬剤が標的タンパク質上のアロステリック部位に特異的に結合し、薬剤が全ての第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位において標的タンパク質の構造の同一のコンフォメーション変化を誘導する場合は、薬剤が標的タンパク質上のアロステリック部位に非特異的に結合する。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)、PyMPO−NHS、PyMPO−スクシンイミジルエステル、BADAN(商標)(6−ブロモアセチル−2−ジメチルアミノナフタレン)、およびACRYLODAN(商標)(6−アクリロイル−2−ジメチルアミノナフタレン)からなる群から選択される。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)が、標的タンパク質の表面上の1または複数のスルフヒドリル基により、標的タンパク質へと結合されている。いくつかの実施形態では、前記1または複数のスルフヒドリル基は、天然スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、前記1または複数のスルフヒドリル基は、工学的に作製されたスルフヒドリル基である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、前記1または複数のスルフヒドリル基は、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)が、標的タンパク質の表面上の1または複数のアミン基により、標的タンパク質へと結合されている。いくつかの実施形態では、前記1または複数のアミン基は、天然アミン基である。いくつかの実施形態では、前記1または複数のアミン基は、工学的に作製されたアミン基である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、前記1または複数のアミン基は、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−スクシンイミジルエステルである。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質を、表面に結合させながら、in situにおいて標識する。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質の領域内に配置されている。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アラダンである。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、リガンドは、タンパク質、核酸、リン脂質、炭水化物、または補因子のうちの1または複数である。いくつかの実施形態では、リガンドは、キナーゼシグナル伝達カスケードのタンパク質メンバーである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、Gタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、界面は、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、表面を、オリゴPEG分子または脂質で誘導体化する。いくつかの実施形態では、オリゴPEG分子または脂質は、Ni−NTAを保有するオリゴPEG分子またはNi−NTAを保有する脂質である。いくつかの実施形態では、表面は、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アフィニティータグを含む。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を、リアルタイムで検出する。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、薬剤は、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである。

0010

いくつかの態様では、本明細書において、Gタンパク質共役受容体(GPCR)上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法であって、(a)GPCRを、天然リガンドと接触させるステップであって、天然リガンドを、第二高調波活性部分(標識など)で標識し、標識が、GPCRに結合するときに、界面において正味の配向性を有するステップと、(b)GPCRを、薬剤と接触させるステップであって、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分(標識など)に発生させ、検出可能なシグナルが、薬剤がGPCR上のアロステリック部位に結合するときにもたらされるGPCRの構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、(c)標的タンパク質を薬剤と接触させた後で、検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、GPCRは、生体細胞リポソーム、または合成生体膜の表面上に配置されている。他の態様では、本明細書において、Gタンパク質共役受容体(GPCR)上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法であって、(a)GPCRを既知のリガンドと接触させるステップであって、既知のリガンドが、GPCRに結合することが既知であり、既知のリガンドは、第二高調波活性部分で標識されており、標識されたリガンドが、GPCRに結合するときに、界面において正味の配向性を有するステップと、(b)GPCRを薬剤と接触させるステップであって、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルを、第二高調波活性標識に発生させ、検出可能なシグナルが、薬剤がGPCR上の部位に結合するときにもたらされるGPCRの構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、(c)標的タンパク質を薬剤と接触させた後で、検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、生体細胞は、GPCRを生得的に(naturally)発現する。いくつかの実施形態では、生体細胞は、GPCRをコードする異種核酸を含む。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、GPCRは、アルファ1アドレナリン受容体(α1−AR)、ウロテンシンUT)受容体、5−HTセロトニン受容体および5−HT6セロトニン受容体、ヒポクレチン(オレキシン)受容体、ヒスタミンHI受容体、ブラジキニンB1受容体およびブラジキニンB2受容体、ボンベシンBB2受容体、P2Yプリン作動性受容体アセチルコリン受容体(acetycholine receptors)、mGluR5グルタミン酸受容体バソプレッシンV2受容体およびバソプレッシンVI受容体、アンジオテンシンGTR1受容体、コレシストキニンCKR受容体およびコレシストキニンCCKBR受容体エンドセリンNDRA受容体、グレリンGHSRla受容体メラトニンMTNRlA受容体、ニューロテンシンNTSR1受容体、血小板活性化因子PTAFR受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体PRLHR受容体、G共役5−HT2、5−HT2A、5−HT6、および5−HT7セロトニン受容体、Gi共役GABA−B受容体、ヒスタミンH3受容体、およびmGluR2/4グルタミン酸受容体からなる群から選択される。

0011

他の態様では、本明細書において、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤Bを同定するための方法であって、(a)標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤Aと接触させるステップであって、薬剤Aを、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分(標識など)で標識し、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分(標識など)に発生させ、検出可能なシグナルが、薬剤Bが標的タンパク質上のアロステリック部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、(b)標的タンパク質を、薬剤Bと接触させるステップと、(c)標的タンパク質を薬剤Bと接触させた後で、検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップとを含む方法が提供される。いくつかの態様では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)、PyMPO−NHS、PyMPO−スクシンイミジルエステル、BADAN(商標)(6−ブロモアセチル−2−ジメチルアミノナフタレン)、およびACRYLODAN(商標)(6−アクリロイル−2−ジメチルアミノナフタレン)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)が、薬剤Aの表面上の1または複数のスルフヒドリル基により、薬剤Aへと結合されている。いくつかの実施形態では、前記1または複数のスルフヒドリル基は、天然スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、前記1または複数のスルフヒドリル基は、工学的に作製されたスルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)である。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)が、薬剤Aの表面上の1または複数のアミン基により、薬剤Aへと結合されている。いくつかの実施形態では、前記1または複数のアミン基は、天然アミン基である。いくつかの実施形態では、前記1または複数のアミン基は、工学的に作製されたアミン基である。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、PyMPO−スクシンイミジルエステルである。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、非天然アミノ酸である。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アラダンである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、Gタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、界面は、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、表面を、オリゴPEG分子または脂質で誘導体化する。いくつかの実施形態では、オリゴPEG分子または脂質は、Ni−NTAを保有するオリゴPEG分子またはNi−NTAを保有する脂質である。いくつかの実施形態では、表面は、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アフィニティータグを含む。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、薬剤Aまたは薬剤Bは低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである。

0012

本発明は、標的生体分子候補結合パートナーとの結合相互作用特異性を決定する方法であって、(a)標的生体分子を、第1の部位において、第1の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、候補結合パートナーと接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第1の検出可能なシグナルを検出するステップと、(b)標的生体分子を、第2の部位において、第2の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、候補結合パートナーと接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第2の検出可能なシグナルを検出するステップとを含む方法をさらに提供する。第1の検出可能なシグナルと、第2の検出可能なシグナルとの差異(例えば、ノイズレベルを1%、2%、3%、4%、5%上回る)は、標的生体分子と、候補結合パートナーとの特異的結合相互作用を指し示す。必要に応じて、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、第二高調波活性部分により発生させられる。必要に応じて、表面選択技術は、第二高調波発生または和周波発生である。

0013

本発明は、標的生体分子をターゲティングする薬物候補ライブラリースクリーニングする方法であって、(a)標的生体分子を、第1の部位において、第1の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、第1の薬物候補と接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第1の検出可能なシグナルを検出するステップと、(b)標的生体分子を、第2の部位において、第2の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、第1の薬物候補と接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第2の検出可能なシグナルを検出するステップと、(c)第1の検出可能なシグナルと、第2の検出可能なシグナルとの第1の差異をもたらすステップと、(d)標的生体分子を、第1の部位において、第1の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、第2の薬物候補と接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第3の検出可能なシグナルを検出するステップと、(e)標的生体分子を、第2の部位において、第2の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、第2の薬物候補と接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第4の検出可能なシグナルを検出するステップと、(f)第3の検出可能なシグナルと、第4の検出可能なシグナルとの第2の差異をもたらすステップと、(g)第1の差異および第2の差異に基づき、薬物を選択するステップとを含む方法をさらに提供する。必要に応じて、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、第二高調波活性部分により発生させられる。必要に応じて、表面選択技術は、第二高調波発生または和周波発生である。必要に応じて、方法は、選択された薬物を、動物においてスクリーニングするステップをさらに含む。

0014

検出可能なシグナルは、標準化された第二高調波発生の強度の変化でありうる。標的生体分子は、タンパク質、DNA、RNA、またはオリゴ糖でありうる。必要に応じて、候補結合パートナーは、アロステリックモジュレーターである。

0015

本発明は、標的タンパク質内の機能的に関連する部位におけるコンフォメーション変化を測定する方法であって、(a)標的タンパク質を、タンパク質の活性部位に結合することが既知の天然リガンドまたは合成リガンドと共にプレインキュベートするステップと、(b)標的タンパク質を、候補アロステリック結合パートナーと接触させるステップと、(c)表面選択技術を使用して、標的タンパク質内の機能的に関連する部位におけるコンフォメーション変化を測定するステップとを含む方法をさらに提供する。必要に応じて、機能的に関連する部位は、結合パートナーと直接的な構造的接触をなす部位である。必要に応じて、機能的に関連する部位は、結合パートナーと間接的な構造的接触をなす部位である。必要に応じて、機能的に関連する部位は、結合分子の結合に非構造的に影響を及ぼし、かつ/またはこれをモジュレートする部位である。必要に応じて、機能的に関連する部位は、第二高調波活性部分で標識される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
項目1)
標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤Bを同定するための方法であって、
a.前記標的タンパク質を、前記標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤Aと接触させるか、または薬剤Aが、単離されたときに前記標的タンパク質の前記活性部位に生得的に結合しているステップと、
b.前記標的タンパク質を、前記薬剤Bと接触させるステップであって、前記標的タンパク質が、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記検出可能なシグナルが、前記薬剤Bが前記標的タンパク質上のアロステリック部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
c.前記標的タンパク質を前記薬剤Bと接触させた後で、前記検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップと
を含む方法。
(項目2)
前記第二高調波活性部分が、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)、PyMPO−NHS、PyMPO−スクシンイミジルエステル、BADAN(商標)(6−ブロモアセチル−2−ジメチルアミノナフタレン)、およびACRYLODAN(商標)(6−アクリロイル−2−ジメチルアミノナフタレン)からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記第二高調波活性部分が、前記標的タンパク質の表面上の1または複数のスルフヒドリル基により、前記標的タンパク質へと結合されている、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記1または複数のスルフヒドリル基が、天然スルフヒドリル基である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記1または複数のスルフヒドリル基が、工学的に作製されたスルフヒドリル基である、項目3に記載の方法。
(項目6)
前記1または複数のスルフヒドリル基が、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記第二高調波活性部分が、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)である、項目2に記載の方法。
(項目8)
前記第二高調波活性部分が、前記標的タンパク質の表面上の1または複数のアミン基により、前記標的タンパク質へと結合されている、項目2に記載の方法。
(項目9)
前記1または複数のアミン基が、天然アミン基である、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記1または複数のアミン基が、工学的に作製されたアミン基である、項目8に記載の方法。
(項目11)
前記1または複数のアミン基が、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記第二高調波活性部分が、PyMPO−スクシンイミジルエステルである、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記標的タンパク質を、表面に結合させながら、in situにおいて標識する、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記第二高調波活性部分が、非天然アミノ酸である、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記非天然アミノ酸が、1または複数のリガンドに接触することが既知である前記標的タンパク質の領域内に配置されている、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記非天然アミノ酸が、アラダンである、項目5に記載の方法。
(項目17)
前記リガンドが、タンパク質、核酸、リン脂質、炭水化物、または補因子のうちの1または複数である、項目6に記載の方法。
(項目18)
前記リガンドが、キナーゼシグナル伝達カスケードのタンパク質メンバーである、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記標的タンパク質が、Gタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記界面が、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記表面を、オリゴPEG分子または脂質で誘導体化する、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記オリゴPEG分子または脂質が、Ni−NTAを保有するオリゴPEG分子またはNi−NTAを保有する脂質である、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記表面が、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である、項目20に記載の方法。
(項目24)
前記標的タンパク質が、アフィニティータグを含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記標的タンパク質の構造の前記コンフォメーション変化を、リアルタイムで検出する、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記薬剤Aが、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記薬剤Bが、前記標的タンパク質の活性部位に特異的に結合する、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである、項目26に記載の方法。
(項目28)
薬剤がタンパク質に結合した後の前記タンパク質の構造の部位特異的なコンフォメーション変化を同定するための方法であって、
a.前記標的タンパク質を、前記薬剤と接触させるステップであって、前記標的タンパク質は、第1のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、第1の検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記第1の検出可能なシグナルが、前記薬剤が前記標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
b.前記標的タンパク質を、前記薬剤と接触させるステップであって、前記標的タンパク質は、第2のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、前記第2のアミノ酸残基は、前記第1のアミノ酸残基の位置とは異なる前記標的タンパク質の領域内に配置されており、表面選択技術を使用して、第2の検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記第2の検出可能なシグナルが、前記薬剤が前記標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
c.前記第1の検出可能なシグナルを、前記第2の検出可能なシグナルと比較するステップであって、前記第1のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、前記薬剤が前記第1のアミノ酸残基の前記部位において前記タンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示し、前記第2のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、前記薬剤が前記第2のアミノ酸残基の前記部位において前記タンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示すステップと
を含む方法。
(項目29)
前記標的タンパク質を、前記標的タンパク質の前記活性部位に結合する薬剤と接触させる最初のステップを含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
ステップ(b)および(c)を繰り返すステップをさらに含み、前記標的タンパク質内の1または複数の異なる部位に位置する1または複数のさらなるアミノ酸残基は、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、1または複数のさらなる検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記1または複数のさらなる検出可能なシグナルが、前記薬剤が前記標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示す、項目28に記載の方法。
(項目31)
前記薬剤が、前記標的タンパク質上のアロステリック部位に特異的に結合するのか、または非特異的に結合するのかを決定するステップをさらに含み、前記薬剤が、1つの第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位では前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導するが、1または複数の他の第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位では前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導しない場合は、前記薬剤が前記標的タンパク質上のアロステリック部位に特異的に結合し、前記薬剤が全ての第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位において前記標的タンパク質の構造の同一のコンフォメーション変化を誘導する場合は、前記薬剤が前記標的タンパク質上のアロステリック部位に非特異的に結合する、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記第二高調波活性部分が、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)、PyMPO−NHS、PyMPO−スクシンイミジルエステル、BADAN(商標)(6−ブロモアセチル−2−ジメチルアミノナフタレン)、およびACRYLODAN(商標)(6−アクリロイル−2−ジメチルアミノナフタレン)からなる群から選択される、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記第二高調波活性部分が、前記標的タンパク質の表面上の1または複数のスルフヒドリル基により、前記標的タンパク質へと結合されている、項目28に記載の方法。
(項目34)
前記1または複数のスルフヒドリル基が、天然スルフヒドリル基である、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記1または複数のスルフヒドリル基が、工学的に作製されたスルフヒドリル基である、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記1または複数のスルフヒドリル基が、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている、項目33に記載の方法。
(項目37)
前記第二高調波活性部分が、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)である、項目33に記載の方法。
(項目38)
前記第二高調波活性部分が、前記標的タンパク質の表面上の1または複数のアミン基により、前記標的タンパク質へと結合されている、項目28に記載の方法。
(項目39)
前記1または複数のアミン基が、天然アミン基である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記1または複数のアミン基が、工学的に作製されたアミン基である、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記1または複数のアミン基が、1または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている、項目38に記載の方法。
(項目42)
前記第二高調波活性部分が、PyMPO−スクシンイミジルエステルである、項目38に記載の方法。
(項目43)
前記標的タンパク質が、表面に結合しながら、in situにおいて標識されている、項目28に記載の方法。
(項目44)
前記第二高調波活性部分が、非天然アミノ酸である、項目28に記載の方法。
(項目45)
前記非天然アミノ酸が、1または複数のリガンドに接触することが既知である前記標的タンパク質の領域内に配置されている、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記非天然アミノ酸が、アラダンである、項目44に記載の方法。
(項目47)
前記リガンドが、タンパク質、核酸、リン脂質、炭水化物、または補因子のうちの1または複数である、項目36に記載の方法。
(項目48)
前記リガンドが、キナーゼシグナル伝達カスケードのタンパク質メンバーである、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記標的タンパク質が、Gタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記界面が、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記表面を、オリゴPEG分子または脂質で誘導体化する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記オリゴPEG分子または脂質が、Ni−NTAを保有するオリゴPEG分子またはNi−NTAを保有する脂質である、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記表面が、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である、項目50に記載の方法。
(項目54)
前記標的タンパク質が、アフィニティータグを含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記標的タンパク質の構造の前記コンフォメーション変化を、リアルタイムで検出する、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記薬剤Aが、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである、項目55に記載の方法。
(項目57)
Gタンパク質共役受容体(GPCR)上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法であって、
a.前記GPCRを既知のリガンドと接触させるステップであって、前記既知のリガンドが、前記GPCRに結合することが既知であり、前記既知のリガンドが、第二高調波活性部分で標識されており、前記標識されたリガンドが、前記GPCRに結合した後に界面において正味の配向性を有するステップと、
b.前記GPCRを前記薬剤と接触させるステップであって、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性標識により発生させられ、前記検出可能なシグナルが、前記薬剤が前記GPCR上の部位に結合するときにもたらされる前記GPCRの構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
c.前記標的タンパク質を前記薬剤と接触させた後で、前記検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップと
を含む方法。
(項目58)
前記GPCRが、生体細胞、リポソーム、または合成生体膜の表面上に配置されている、項目57に記載の方法。
(項目59)
前記生体細胞が、前記GPCRを生得的に発現する、項目57に記載の方法。
(項目60)
前記生体細胞が、前記GPCRをコードする異種核酸を含む、項目57に記載の方法。
(項目61)
前記GPCRが、アルファ1アドレナリン受容体(α1−AR)、ウロテンシン(UT)受容体、5−HT2セロトニン受容体および5−HT6セロトニン受容体、ヒポクレチン(オレキシン)受容体、ヒスタミンHI受容体、ブラジキニンB1受容体およびブラジキニンB2受容体、ボンベシンBB2受容体、P2Yプリン作動性受容体、アセチルコリン受容体、mGluR5グルタミン酸受容体、バソプレッシンV2受容体およびバソプレッシンVI受容体、アンジオテンシンAGTR1受容体、コレシストキニンCCKAR受容体およびコレシストキニンCCKBR受容体、エンドセリンENDRA受容体、グレリンGHSRla受容体、メラトニンMTNRlA受容体、ニューロテンシンNTSR1受容体、血小板活性化因子PTAFR受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体PRLHR受容体、G共役5−HT2、5−HT2A、5−HT6、および5−HT7セロトニン受容体、Gi共役GABA−B受容体、ヒスタミンH3受容体、およびmGluR2/4グルタミン酸受容体からなる群から選択される、項目57に記載の方法。
(項目62)
標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤Bを同定するための方法であって、
a.前記標的タンパク質を、前記標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤Aと接触させるステップであって、前記薬剤Aが、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記検出可能なシグナルが、薬剤Bが前記標的タンパク質上のアロステリック部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
b.前記標的タンパク質を、前記薬剤Bと接触させるステップと、
c.前記標的タンパク質を前記薬剤Bと接触させた後で、前記検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップと
を含む方法。
(項目63)
前記第二高調波活性部分が、前記薬剤Aの表面上の1または複数のスルフヒドリル基により、前記薬剤Aへと結合されている、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記1または複数のスルフヒドリル基が、天然スルフヒドリル基である、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記1または複数のスルフヒドリル基が、工学的に作製されたスルフヒドリル基である、項目63に記載の方法。
(項目66)
前記第二高調波活性部分が、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)である、項目62に記載の方法。
(項目67)
前記第二高調波活性部分が、前記薬剤Aの表面上の1または複数のアミン基により、前記薬剤Aへと結合されている、項目62に記載の方法。
(項目68)
前記1または複数のアミン基が、天然アミン基である、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記1または複数のアミン基が、工学的に作製されたアミン基である、項目67に記載の方法。
(項目70)
前記第二高調波活性部分が、PyMPO−スクシンイミジルエステルである、項目67に記載の方法。
(項目71)
前記第二高調波活性部分が、非天然アミノ酸である、項目62に記載の方法。
(項目72)
前記非天然アミノ酸が、アラダンである、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記標的タンパク質が、Gタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である、項目62に記載の方法。
(項目74)
前記界面が、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記表面が、オリゴPEG分子または脂質で誘導体化されている、項目74に記載の方法。
(項目76)
前記オリゴPEG分子または脂質が、Ni−NTAを保有するオリゴPEG分子またはNi−NTAを保有する脂質である、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記表面が、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である、項目62に記載の方法。
(項目78)
前記標的タンパク質が、アフィニティータグを含む、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記薬剤Aまたは前記薬剤Bが低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである、項目78に記載の方法。
(項目80)
a.標的タンパク質にコンジュゲートするための1もしくは複数のSHG活性標識もしくはSFG活性標識;
b.タンパク質をSHG活性標識もしくはSFG活性標識で標識するための1もしくは複数の試薬
c.標的タンパク質を結合させるための1もしくは複数の表面;
d.標的タンパク質−アロステリックモジュレーター相互作用を検出するための装置と共に使用するための1もしくは複数のシグナル周辺機器
e.標的タンパク質の機能性に必要な1もしくは複数の補因子;
f.1もしくは複数の標的タンパク質に結合することが既知である1もしくは複数のペプチドおよび/もしくはタンパク質;
g.1もしくは複数の標的タンパク質に結合することが既知である1もしくは複数の抗体;ならびに
h.SHG活性非天然アミノ酸(UAA)標識もしくはSFG活性非天然アミノ酸(UAA)標識をタンパク質へと導入するための1もしくは複数の成分
のうちの1または複数を含むキット
(項目81)
前記1または複数のSHG活性標識またはSFG活性標識が、マレイミド標識、PyMPO−NHS、オキサゾール標識、BADAN(商標)(6−ブロモアセチル−2−ジメチルアミノナフタレン)、ACRYLODAN(商標)(6−アクリロイル−2−ジメチルアミノナフタレン)、およびクマリンベース色素からなる群から選択される、項目80に記載のキット。
(項目82)
標的タンパク質を結合させるための前記表面が、ガラス、プラスチック、金属、ラテックス、ゴムセラミック、およびポリマーからなる群から選択される、項目80に記載のキット。
(項目83)
前記ポリマーが、ポリプロピレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、またはポリエチレンである、項目81に記載のキット。
(項目84)
標的タンパク質を結合させるための前記表面が、少なくとも1つのあらかじめ形成された表面特徴を含む、項目80に記載のキット。
(項目85)
前記少なくとも1つのあらかじめ形成された表面特徴が、トレンチ、v字溝メサ構造、および/またはウェルである、項目84に記載のキット。
(項目86)
標的タンパク質を結合させるための前記表面が、標的タンパク質への付着に適する表面化学特性をもたらす1または複数の分子であらかじめコーティングされている、項目80に記載のキット。
(項目87)
前記1または複数の分子が、アルデヒドシランBSA−NHS、またはオリゴポリエチレングリコールである、項目86に記載のキット。
(項目88)
前記オリゴポリエチレングリコールが、ニッケル−オリゴポリエチレングリコールである、項目87に記載のキット。
(項目89)
標的タンパク質を結合させるための前記表面が、支持脂質二重層または支持脂質類似体二重層であらかじめコーティングされている、項目80に記載のキット。
(項目90)
標的タンパク質−アロステリックモジュレーター相互作用を検出するための装置と共に使用するための前記シグナル周辺機器が、パスフィルターカラーフィルター干渉フィルター偏光素子、またはビーム方向付け、その焦点を絞るための1もしくは複数の鏡またはレンズである、項目80に記載のキット。
(項目91)
標的タンパク質の機能性に必要な前記補因子が、チアミンピロリン酸NAD+、NADP+、ピリドキサールリン酸リポアミドメチルコバラミンコバラミンビオチンコエンザイムAテトラヒドロ葉酸メナキノンアスコルビン酸フラビンモノヌクレオチドフラビンアデニンジヌクレオチドコエンザイムF420、アデノシン三リン酸ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、S−アデノシルメチオニン、コエンザイムB、コエンザイムM、コエンザイムQシチジン三リン酸グルタチオンヘムヌクレオチド糖ピロロキノリンキノン、またはテトラヒドロビオプテリンである、項目80に記載のキット。
(項目92)
第二高調波発生(SHG)および/または和周波発生(SFG)を使用して、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合し、かつ/またはこれをモジュレートする薬剤についてスクリーニングし、これらを同定するためのシステムであって、
a.SFG活性部分またはSHG活性部分で標識された標的タンパク質と、
b.標的タンパク質−薬剤相互作用を検出するための装置であって、i)基本波光源;ii)SFG活性部分またはSHG活性部分で標識された前記標的タンパク質を含む基質;およびiii)第二高調波ビーム、または他の非線形光学ビームの強度を測定するための検出器を含む装置と
を含み、
前記薬剤の、タンパク質上のアロステリック部位への結合を、前記装置により検出し、前記検出器により記録されるデータを、固定式またはデータ保存媒体を読み取るためのシステムを介してアクセス可能な固定式またはデータ保存媒体上に記録するシステム。
(項目93)
標的生体分子と候補結合パートナーとの結合相互作用の特異性を決定する方法であって、
a.前記標的生体分子を、第1の部位において、第1の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、前記候補結合パートナーと接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第1の検出可能なシグナルを検出するステップと、
b.前記標的生体分子を、第2の部位において、第2の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、前記候補結合パートナーと接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第2の検出可能なシグナルを検出するステップと
を含み、
表面選択技術を使用して、前記検出可能なシグナルを、前記第二高調波活性部分により発生させ、
前記第1の検出可能なシグナルと、前記第2の検出可能なシグナルとの差異が、前記標的生体分子と、前記候補結合パートナーとの特異的結合相互作用を指し示す方法。
(項目94)
前記差異が、ノイズレベルを2%上回る、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記差異が、ノイズレベルを5%上回る、項目93に記載の方法。
(項目96)
標的生体分子をターゲティングする薬物候補のライブラリーをスクリーニングする方法であって、
a.前記標的生体分子を、第1の部位において、第1の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、第1の薬物候補と接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第1の検出可能なシグナルを検出するステップと、
b.前記標的生体分子を、第2の部位において、第2の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、前記第1の薬物候補と接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第2の検出可能なシグナルを検出するステップと、
c.前記第1の検出可能なシグナルと、前記第2の検出可能なシグナルとの第1の差異をもたらすステップと、
d.前記標的生体分子を、第1の部位において、第1の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、第2の薬物候補と接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第3の検出可能なシグナルを検出するステップと、
e.前記標的生体分子を、第2の部位において、第2の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、前記第2の薬物候補と接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第4の検出可能なシグナルを検出するステップと、
f.前記第3の検出可能なシグナルと、前記第4の検出可能なシグナルとの第2の差異をもたらすステップと、
g.前記第1の差異および前記第2の差異に基づき、薬物を選択するステップと
を含み、
表面選択技術を使用して、前記検出可能なシグナルを、前記第二高調波活性部分により発生させる方法。
(項目97)
前記選択された薬物を、動物においてスクリーニングするステップをさらに含む、項目94に記載の方法。
(項目98)
前記検出可能なシグナルが、標準化された第二高調波発生の強度の変化である、項目93または項目94に記載の方法。
(項目99)
前記表面選択技術が、第二高調波発生または和周波発生である、項目93または項目94に記載の方法。
(項目100)
前記標的生体分子が、タンパク質である、項目93または項目94に記載の方法。
(項目101)
前記標的生体分子が、DNAである、項目93または項目94に記載の方法。
(項目102)
前記候補結合パートナーが、アロステリックモジュレーターである、項目93または項目94に記載の方法。
(項目103)
標的タンパク質内の機能的に関連する部位におけるコンフォメーション変化を測定する方法であって、
a.前記標的タンパク質を、前記タンパク質の活性部位に結合することが既知の天然リガンドまたは合成リガンドと共にプレインキュベートするステップと、
b.前記標的タンパク質を、候補アロステリック結合パートナーと接触させるステップと、
c.表面選択技術を使用して、前記標的タンパク質内の機能的に関連する部位におけるコンフォメーション変化を測定するステップと
を含む方法。
(項目104)
前記機能的に関連する部位が、結合パートナーと直接的な構造的接触をなす部位である、項目101に記載の方法。
(項目105)
前記機能的に関連する部位が、結合パートナーと間接的な構造的接触をなす部位である、項目101に記載の方法。
(項目106)
前記機能的に関連する部位が、結合分子の結合に非構造的に影響を及ぼし、かつ/または結合分子をモジュレートする部位である、項目101に記載の方法。
(項目107)
前記機能的に関連する部位を、第二高調波活性部分で標識する、項目101に記載の方法。

図面の簡単な説明

0016

図1は、タンパク質内のコンフォメーション変化を検出するための検出工程の概略を描示する。赤色の入射光は、表面に衝突し、全内部反射により、表面の平面に対して垂直に偏光し、表面から短い距離だけ進むエバネセント波を作り出す(左)。表面に結合させた、標識されたタンパク質であり、この法線に照らした色素の位置に依存するベースラインシグナルを伴うタンパク質である(中)。標識を、エバネセント波の法線へと引き寄せるコンフォメーション変化は、シグナルの増大を結果としてもたらす(左)。
図2は、SHG技術を活用して、既知のアロステリック結合剤であるGNF2と相互作用するときに、野生型AblキナーゼおよびK419C突然変異体のAblキナーゼにおいて誘導されるコンフォメーション変化を測定する実験の結果を描示する。
図3は、標識されたRasタンパク質を、支持脂質二重層(SLB)上のSHGにより検出しうることを示すSHGデータを描示する。
図4は、A)標準化されたSHG強度を示す図、およびB)シフトパーセントを描示する図により、3つの化合物の、アミンにおいて標識された(溶液による標識)Ras標的タンパク質への結合についてのSHGデータを描示する。ベースラインのSHGの測定値は、各化合物を、手作業により20μMの2倍濃度で注射する前に約5秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約60秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。
図4は、A)標準化されたSHG強度を示す図、およびB)シフトパーセントを描示する図により、3つの化合物の、アミンにおいて標識された(溶液による標識)Ras標的タンパク質への結合についてのSHGデータを描示する。ベースラインのSHGの測定値は、各化合物を、手作業により20μMの2倍濃度で注射する前に約5秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約60秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。
図5は、A)標準化されたSHG強度を示す図、およびB)シフトパーセントを描示する図により、3つの化合物の、システインにおいて標識されたRas標的タンパク質への結合についてのSHGデータを描示する。ベースラインのSHGの測定値は、各化合物を、手作業により20μMの2倍濃度で注射する前に約5秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約60秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。
図5は、A)標準化されたSHG強度を示す図、およびB)シフトパーセントを描示する図により、3つの化合物の、システインにおいて標識されたRas標的タンパク質への結合についてのSHGデータを描示する。ベースラインのSHGの測定値は、各化合物を、手作業により20μMの2倍濃度で注射する前に約5秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約60秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。

0017

本発明はとりわけ、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合し、これにより、その構造的コンフォメーションを変化させる薬剤を同定する目的で、標的タンパク質を、第二高調波発生または和周波発生による検出のためのSHG活性部分、標識、またはプローブで標識するための方法を開示する。

0018

構造ベースの薬物スクリーニングおよび生体分子機構についての基礎研究の目的は、生体分子がリガンド、薬物、または他の結合パートナーに結合するときの、生体分子の構造および構造的変化を測定しうるツールを要求する。構造的変化を決定するための現在の技法は、NMR(核磁気共鳴)およびX線結晶構造解析に主に限られている。これらの技法のうちのいずれも、構造的変化をリアルタイムで測定するのに適さない。さらに、それらは、時間集約的、かつ、労働集約的であり、薬物スクリーニングにおけるワイドスケールの使用に適さない。さらに、結晶化することが困難であり、したがって、それらの構造が決定されていないタンパク質(例えば、膜タンパク質)が多く存在する。

0019

第二高調波発生(SHG)は、タンパク質へと付着させたSHG活性色素プローブの構造的シフトに対して高感度である。対象のタンパク質を、アミン部位またはスルフヒドリル部位(例えば、リシン残基またはシステイン残基)において、SHG活性色素プローブで、共有結合的に標識する。SHG活性色素プローブは、蛍光プローブであることが多く、鍵となる構成要素は、双極子モーメントの差異が大きく、非中心対称性の構造であるという要件である。SHGの測定は、標識されたタンパク質を、表面に結合させ、それを、超高速レーザー由来する赤色のパルス光へと曝露することにより行う。照射下において、色素プローブは、赤色の入射光の小部分を、青色の光へと転換するが、これが、「第二高調波」シグナルである。光の吸収を伴わず、反射と類似の機構に依拠するこの現象は、標識の正味の平均配向性が存在する場合に限り生じるものであり、溶液中でランダム配向させた標識分子は、第二高調波光をもたらさない(図1)。理論的には、同じ軸に照らし、標識のうちの半分が表面を向き、他の半分は表面とは逆を向くタンパク質の集団であれば、第二高調波光をもたらさないであろう。実際は、正味の平均配向性が常に存在する。リガンドの結合および共時的なコンフォメーション変化に起因して標識の平均配向性がシフトする場合、第二高調波光の強度は変化し、これが、コンフォメーション変化を検出するSHGの能力基盤となる。

0020

本発明では、第二高調波発生法を使用して、標的タンパク質のアロステリックモジュレーターについてスクリーニングし、これを同定する。本発明者らはとりわけ、標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合することが既知の薬剤もしくはリガンドと共にプレインキュベートするか、または候補アロステリックモジュレーターのSHGスクリーニングの前に天然リガンドをその活性部位に結合させたタンパク質を単離することにより、SHGにより検出される標的タンパク質のコンフォメーション変化が、標的タンパク質上の、活性部位ではなく、アロステリック部位における候補モジュレーターの相互作用に起因する可能性が増大することを発見した。したがって、本出願の方法は、本明細書で記載される方法を使用する、タンパク質のコンフォメーションおよび挙動についてのアロステリックモジュレーターの同定が、結果を得るのに長時間を要求することが多く、リガンドに結合した後のタンパク質のコンフォメーショナルダイナミクススナップショットをもたらすに過ぎないことがせいぜいである従来の方法とは対照的に、ハイスループットアッセイとして、かつ、リアルタイムで実施しうるという点で、当技術分野で既に実施された方法に対する改善を表す。

0021

I.一般的な技法
本発明の実施は、別段に指し示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学組換え法を含む)、微生物学細胞生物学生化学、非線形光学による検出および測定、ならびに免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、2版(Sambrookら、1989年);「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、1984年);「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney編、1987年);「Methodsin Enzymology」(Academic Press, Inc.);「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987年、および定期的な改訂版);「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994年)といった文献において十分に説明されている。Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、2版、J. Wiley & Sons(New York、N.Y.、1994年);March、「Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure」4版、John Wiley & Sons(New York、N.Y.、1992年);「Bioconjugate Techniques」、Elsevier(G .T. Hermanson、2008年)、「Second-order nonlinear optical effects at surfaces and interfaces」、Nonlinear Surface Electromagnetic Phenomena、Elsevier(H. PonathおよびG.I. Stegeman編、1991年);ならびに「Neuronal Calcium Sensor Proteins」、NOVA Publishers(PhilippovおよびKoch編、2006年)は、当業者に、本出願において使用される用語のうちの多くに対する一般的な指針を提供している。

0022

II.定義
本明細書で使用される「第二高調波」とは、周波数が光の基本波ビーム(fundamental beam)の2倍の周波数の光を指す。

0023

本明細書で使用される通り、全ての原子反転(x,y,z)→(−x,−y,−z)であって、分子または物質を変化させずにおく反転がなされる空間内の点(「中心」または「反転中心」)が存在する場合、分子相または物質相は「中心対称性」である。非中心対称性の分子または物質は、この反転の中心を欠く。例えば、分子が均一の組成であり、球または立方体の形状である場合、それは中心対称性である。中心対称性の分子または物質は、第二高調波発生、和周波発生、および差周波発生に必要な非線形感受率または超偏光度を有さない。

0024

本明細書で使用される「表面選択性」とは、当技術分野で公知の第二高調波発生もしくは和/差周波発生、または他の表面特異的技法などの非線形光学法を指す。

0025

本明細書で使用される「和周波発生」(SFG)とは、1つの周波数における光(Ω1)を、別の周波数における光(Ω2)と混合して、和周波数(Ω1+Ω2)における応答をもたらす非線形光学法である(Shen、1984年、1989年)。例えば、SFGは、分子を、表面において、それらの特徴的な振動遷移を介して検出するのに特に有用であり、この場合は本質的に、可視光周波数および赤外周波数におけるΩ1およびΩ2による表面選択性の赤外線分光法である。「SHG」または「第二高調波発生」という用語を本明細書で使用する場合、SFGおよび「和周波発生」は、当業者に周知の方法によるSHGに置きかえることができ、SHGの代わりに使用しうることが理解される。

0026

本明細書で使用される「非線形活性部分」とは、超偏光度を保有する物質である。

0027

本明細書で使用される「第二高調波活性部分」または「第二高調波活性部分」とは、それをより非線形光学活性とするために、分子(例えば、酵素などのタンパク質)、粒子、または相(例えば、脂質二重層)へと付着(共有結合的に、または非共有結合的に)させうる、非線形活性部分、粒子、または分子を指す。

0028

本明細書で使用される「アロステリック」、「アロステリックモジュレーター」、または「アロステリック候補」とは、活性部位以外の部位に主に結合し、SHGまたはSFGにより決定されるコンフォメーション変化を引き起こし、したがって、アロステリック作用機構を介してそれらの効果を及ぼす分子、部分、または物質を指す。

0029

本明細書で使用される「活性部位」または「活性結合部位」とは、その形状および帯電電位の結果として、多様な共有結合的結合力および/または非共有結合的結合力を介して、別の薬剤(限定せずに述べると、リガンド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、DNAもしくはRNAを含む核酸、分子、化合物、抗生剤もしくは薬物、分子、部分、基質、生成物類似体、または阻害剤を含む)と好適に相互作用または会合し、触媒作用シグナル伝達、および/またはエフェクターの活性化などであるがこれらに限定されないタンパク質の機能が果たされる標的タンパク質の領域を指す。

0030

本明細書で用いられる「超偏光度」または「非線形感受率」とは、非線形光の発生を可能とする、分子、粒子、界面、または相の特性を指す。「超偏光度」、「二次非線形偏光度」、および「非線形感受率」という用語は場合によって、互換的に使用される。

0031

本明細書で言及される通り、本明細書で定義される「機能的に関連する」結合パートナーイベント関与する部位は、X線結晶構造解析、NMR、またはSHGなどの構造的技法により決定される、結合パートナー(例えば、エフェクター分子)との直接的または間接的な構造的接触をなす任意の部位を含む。直接的な構造的接触とは、その一部が、結合パートナー分子の一部から2nm以内にある任意の残基と定義される。間接的な構造的接触とは、その一部が、X線、NMR、またはSHGなどの構造的技法により見られる通り、結合パートナー(例えば、エフェクター分子)、または結合パートナーの模倣体もしくは類似体が結合するときに、その配向性、コンフォメーション、または相対的な座標を、結合パートナー、模倣体、または類似体の非存在下におけるその配向性、コンフォメーション、または相対的な座標と比べて変化させる任意の残基と定義される。「機能的に関連する」という用語はまた、結合分子の結合またはモジュレーション(例えば、活性化、阻害、調節など)に重要であることが、非構造的手段(例えば、突然変異誘発または特定の残基が結合パートナーの結合またはモジュレーションに重要であることを示す生化学的データ)により既知である残基も含む。

0032

本明細書で定義される「リガンド」という用語は、別のタンパク質に結合する1つのタンパク質、タンパク質に結合する炭水化物、またはタンパク質に結合する低分子などであるがこれらに限定されない、別の分子に結合する任意の分子を含む。

0033

本明細書で使用される「非線形」とは、入射光ビーム別称基本波)の周波数を変換することが可能な光学法を指す。非線形ビームとは、このような変換から生じる高次周波数ビーム、例えば、第二高調波である。第二高調波発生、和周波発生、または差周波発生では、非線形ビームをコヒーレントに発生させる。第二高調波発生(SHG)では、基本波ビームの2つのフォトンが、界面により事実上散乱され、第二高調波の1つのフォトンをもたらす。本明細書ではまた、「非線形」を、「非線形光学」または「表面選択性非線形」とも称する。

0034

本明細書で用いられる「非線形活性」または「非線形的に活性」という用語はまた、1または複数の入射放射ビームにより駆動されると、非線形光学放射を発生させる、分子、粒子、界面、または相の能力の一般的な特性も指す。

0035

本明細書で非線形光学法に言及する場合、「検出」または「〜を検出すること」とは、表面選択性非線形光学放射の特性を使用して、プローブ−標的間相互作用(タンパク質と候補モジュレーター化合物との相互作用など)の特性または相互作用の効果を検出するか、測定するか、または非線形光の特性(例えば、強度、波長、偏光、または電磁放射に一般的な他の特性)と相関させうる技法を指す。

0036

本明細書で使用される「コンフォメーション変化」という用語は、生物学的分子種(例えば、酵素などのタンパク質)の構造的コンフォメーションの変化を指す。

0037

本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、ポリペプチドの断片、および融合ポリペプチドを含む。

0038

本明細書で使用される「モジュレーター」という用語は、SHGにより検出されるタンパク質のコンフォメーションを変化させる任意の物質(例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質など)を指す。

0039

本明細書で使用される「界面」とは、非線形光学シグナルを発生させる領域、または正味の配向性を保有する第二高調波活性部分で標識された標的が存在する表面近傍の領域である。界面はまた、2つの表面、異なる媒体(例えば、水溶液と接触したガラス表面、緩衝液と接触した細胞表面)と接触した表面、または物理的特性または化学的特性の異なる2つの媒体の間の接触部近傍の領域からもなりうる。

0040

本明細書では、別段に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

0041

本明細書で使用される「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」という単数形の用語は、文脈により別段に明確に指し示されない限り、複数の指示対象を含む。

0042

本明細書を通して与えられるあらゆる最大の数値限界は、あらゆる低値の数値的限界を、このような低値の数値的限界が本明細書に明示的に書き込まれた場合と同様に含むことが意図される。本明細書を通して与えられるあらゆる最小の数値的限界は、あらゆる高値の数値的限界を、このような高値の数値的限界が本明細書に明示的に書き込まれた場合と同様に含むであろう。本明細書を通して与えられるあらゆる数値的範囲は、このような広範な数値的範囲内に収まるあらゆる狭小な数値的範囲を、このような狭小な数値的範囲がすべて本明細書に明示的に書き込まれた場合と同様に含むであろう。

0043

III.組成物
A.開示される方法における使用のための標的タンパク質
本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおける使用のための標的タンパク質は、ウイルス微生物(細菌、真菌藻類、および原虫を含む)、非脊椎動物昆虫および蠕虫を含む)、動物、脊椎動物(哺乳動物鳥類または魚類、および、哺乳動物の中では、例えば、ヒト、類人猿サルウシブタヤギラマヒツジラットマウスウサギモルモットネコ、およびイヌなど)の正常細胞もしくは病理学的細胞、または植物の正常細胞もしくは病理学的細胞を含む、任意の天然の供給源に由来する自然発生物質またはそのサブユニットもしくはドメインでありうる。標的タンパク質はあるいは、in vitroにおいて作り出されるかもしくは突然変異などにより修飾された非自然発生タンパク質、キメラタンパク質、または人工タンパク質でありうる。標的タンパク質は、糖タンパク質リポタンパク質リンタンパク質、または金属タンパク質でありうる。標的タンパク質は、核タンパク質細胞質タンパク質、膜会合タンパク質、または分泌タンパク質でありうる。標的タンパク質は、単一の高分子である必要がない。例えば、標的タンパク質は、高分子のホモ多量体二量体三量体、または四量体などであるがこれらに限定されない)の場合もあり、ヘテロ多量体(二量体、三量体、または四量体などであるがこれらに限定されない)の場合もある。加えて、標的タンパク質は、他のタンパク質、オリゴペプチドもしくはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、あるいは有機低分子もしくは無機低分子または有機イオンもしくは無機イオンなど、生理学的機能を果たすための1または複数のリガンドも要求しうる。さらなる例は、補因子、リボソームポリソーム、およびクロマチンを含む。

0044

本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のための標的タンパク質の生物学的活性は、受容体活性または酵素活性などの特異的な活性に限定されない。標的タンパク質の非限定的な例は、核受容体オーファン核受容体、チロシンキナーゼ受容体、エンドセリン、エリスロポエチン受容体FAリガンド受容体プロテインキナーゼ(例えば、プロテインキナーゼCチロシンキナーゼセリンキナーゼトレオニンキナーゼ、ヌクレオチドキナーゼ、またはポリヌクレオチドキナーゼ)、タンパク質ホスファターゼ(セリン/トレオニンホスファターゼチロシンホスファターゼ、ヌクレオチドホスファターゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、またはピロホスファターゼ)、細胞周期調節因子サイクリンcdk2、CDC2、CDC25、P53、RB)、GTPアーゼ、Rac、Rho、Rab、Ras、エンドプロテアーゼエクソプロテアーゼメタロプロテアーゼセリンプロテアーゼシステインプロテアーゼヌクレアーゼポリメラーゼ逆転写酵素インテグラーゼイオンチャネルシャペロニン(すなわち、熱ショックタンパク質)、デアミナーゼ、ヌクレアーゼ(すなわち、デオキシリボヌクレアーゼリボヌクレアーゼエンドヌクレアーゼエクソヌクレアーゼ)、テロメラーゼプライマーゼヘリカーゼデヒドロゲナーゼトランスフェラーゼペプチジルトランスフェラーゼ、トランスアミナーゼグリコシルトランスフェラーゼリボシルトランスフェラーゼアセチルトランスフェラーゼグアニリルトランスフェラーゼ、またはメチルトランスフェラーゼ)、ヒドロラーゼカルボキシラーゼイソメラーゼグリコシダーゼ、デアミナーゼ、リパーゼエステラーゼスルファターゼセルラーゼリアーゼレダクターゼリガーゼ、または細胞内ユビキチン化経路プロセシング酵素(E1、E2、もしくはE3酵素、またはデユビキチナーゼなど)を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のための標的タンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、植物タンパク質動物タンパク質、およびヒトタンパク質の中から選択される構造的タンパク質および非構造的タンパク質でありうる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、インフルエンザウイルスA型肝炎ウイルスB型肝炎ウイルスC型肝炎ウイルスヒト免疫不全ウイルストリインフルエンザウイルスエボラウイルスSARSウイルスハンタウイルス、または東部ウマ脳炎ウイルスなどであるがこれらに限定されないウイルスタンパク質でありうる。

0045

本明細書で提供される方法のうちのいずれかについてのいくつかの態様では、標的タンパク質は、受容体である。「受容体」という用語は、表面受容体および細胞内受容体の両方を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、核受容体である。核受容体とは、リガンドにより活性化される転写活性化因子ファミリーである。これらの受容体は、リガンドへの結合、二量体化トランス活性化、およびDNAへの結合のための別個のドメインへと組織化される。ステロイド受容体ファミリーとは、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイドアンドロゲンプロゲスチン、およびエストロゲンに対する受容体からなる大きなファミリーである。受容体の活性化は、リガンドへの結合時に生じ、これにより、受容体の二量体化および共活性化タンパク質の結合を可能とするコンフォメーション変化が誘導される。これらの共活性化因子は、受容体のDNAへの結合、および後続標的遺伝子転写活性化を容易とする。共活性化タンパク質の動員に加えて、リガンドの結合はまた、受容体を、受容体機能の共抑制因子として用いられるタンパク質の結合を置きかえるかまたは阻止するコンフォメーションに置くとも考えられる。リガンドが、薬理学アゴニストである場合、新たなコンフォメーションは、生物学的シグナル伝達経路の他の構成要素、例えば、転写因子と相互作用して、標的組織内生物学的応答を誘発するコンフォメーションである。リガンドが、薬理学的アンタゴニストである場合、新たなコンフォメーションは、受容体が、そうでなければその受容体を活性化しうる1または複数のアゴニストによって活性化されえないコンフォメーションである。NRの非網羅的なリストは、この開示が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願公開第2006/046134号(14および15頁、ならびに図1を参照されたい)において記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のためのNRは、エストロゲン受容体アンドロゲン受容体グルココルチコイド受容体レチノイン酸受容体アルファ(RARG)、レチノイドX受容体(RXR)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)、肝臓X受容体アルファ(LXRG)、またはプロゲステロン受容体の中から選択することができる。

0046

いくつかの態様では、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおける使用のための標的タンパク質は、Gタンパク質共役受容体(また、7回膜貫通ドメイン受容体としても公知)である。「Gタンパク質共役受容体(GPCR)」とは、Gタンパク質とカップリングすることによりシグナル伝達を媒介する受容体のスーパーファミリーの任意のメンバーを指す。GPCRは、細胞外環境に存在する分子に結合し、細胞内のシグナル伝達カスケードを誘発し、最終的には、細胞応答を誘発することが可能な膜貫通受容体タンパク質の大ファミリー(ヒトの全ゲノムのうちの約5%を表す)を含む。GPCRは、酵母襟鞭毛虫、および動物を含む真核生物だけに見出される。これらの受容体に結合し、これらを活性化させる分子は、感光性化合物香気物質フェロモンホルモン、および神経伝達物質を含むがこれらに限定されず、低分子からペプチドおよび大型のタンパク質へとサイズも様々である。細胞質ゾルカルシウムベルに影響を及ぼすGPCRのクラスの1つの例は、ホスホリパーゼCPLC)経路を活性化させ、その結果として、ホスホイノシチド加水分解をもたらして、異なる第2のメッセンジャーの2つのクラス、すなわち、ジアシルグリセロールおよびイノシトールリン酸を発生させる、Gタンパク質のGq型を介して作動する。ジアシルグリセロールは、ある種のプロテインキナーゼC(PKC)を活性化させるが、イノシトールリン酸(IP3などであるがこれらに限定されない)は、小胞体筋小胞体筋細胞の場合)、および/またはミトコンドリアなどの細胞内貯蔵庫からのカルシウムの移動を刺激する。GPCRは、酵母、襟鞭毛虫、および動物を含む真核生物だけに見出される。これらの受容体に結合し、これらを活性化させる分子は、感光性化合物、香気物質、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質を含むがこれらに限定されず、低分子からペプチドおよび大型のタンパク質へとサイズも様々である。

0047

本明細書で開示される方法における使用のためのGPCRは、Gqタンパク質またはGq/11、アルファ1アドレナリン受容体(α1−AR)、ウロテンシン(UT)受容体、5−HT2セロトニン受容体および5−HT6セロトニン受容体、ヒポクレチン(オレキシン)受容体、ヒスタミンHI受容体、ブラジキニンB1受容体およびブラジキニンB2受容体、ボンベシンBB2受容体、P2Yプリン作動性受容体、アセチルコリン受容体(例えば、M1、M3、およびM5)、mGluR5グルタミン酸受容体、バソプレッシンV2受容体およびバソプレッシンVI受容体、アンジオテンシンAGTR1受容体、コレシストキニンCCKAR受容体およびコレシストキニンCCKBR受容体、エンドセリンENDRA受容体、グレリンGHSRla受容体、メラトニンMTNR1A受容体、ニューロテンシンNTSR1受容体、血小板活性化因子PTAFR受容体、黄体形成ホルモン受容体(LHR)、濾胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体(GnRHR)、およびプロラクチン放出ペプチド受容体PRLHR受容体を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、GPCRは、カルシウムセンサータンパク質を発現させる細胞内で内因的に発現させる。他の実施形態では、GPCRは、カルシウムセンサータンパク質を発現させる細胞内で異種発現させる。

0048

他の態様では、本発明の方法における使用のための標的タンパク質は、キナーゼでありうる。キナーゼとは、リン酸化と称する過程である、リン酸基を、ATPなど、高エネルギードナー分子から、特異的な基質へと転移させる種類の酵素である。キナーゼの最大のグループのうちの1つは、特異的なタンパク質に作用し、その活性を修飾するプロテインキナーゼである。キナーゼは、シグナルを伝送し、細胞内の複雑な過程を制御するのに広範に使用される。ヒトでは、500を超える異なるキナーゼが同定されている。それらの大きな多様性、ならびにシグナル伝達におけるそれらの役割のために、それらは、特に、キナーゼ発現またはキナーゼ調節の異常を特徴とする疾患状態に関する研究の対象となっている。

0049

プロテインキナーゼは、そのコンフォメーションが、キナーゼ活性を調節すると考えられている、活性化ループまたはAループと称する、大型の可撓性のループを含有する。多くのキナーゼでは、Aループのコンフォメーションは、この領域内の特異的な残基のリン酸化により制御される(Johnson、1996年)。活性化ループは一般に、保存的なAspPheGly配列で始まり、保存的なAlaProGluで終わる。不活性キナーゼの構造では、このループは、基質またはATPの結合性部位遮断することが多い(Hubbard、1994年;Mohammadi、1996年;およびMcTigue、1999年)。チロシンキナーゼは通常、ループ内に1つまたは2つのチロシンを有し、MAPKキナーゼは、TおよびYのいずれにおいてもリン酸化された、T[DE]Yモチーフを有するが、他の大半のキナーゼは、ループ内にトレオニンを有する。

0050

本発明の方法における使用のための標的タンパク質は、任意のプロテインキナーゼに広く適用可能である。これらは、タンパク質チロシンキナーゼおよびタンパク質セリンキナーゼを含みうる。タンパク質チロシンキナーゼの非限定的な例は、pp60c−src、p56lck、ZAPキナーゼ、血小板由来成長因子受容体チロシンキナーゼ、Bcr−Abl、VEGF(血管内皮成長因子)受容体チロシンキナーゼ、および上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ、および上皮成長因子受容体様チロシンキナーゼである。本発明における使用のために適用可能なセリンプロテインキナーゼの非限定的な例は、MAP(マイトジェン活性化タンパク質)キナーゼ、プロテインキナーゼC、プロテインキナーゼA、Akt、およびCDK(サイクリン依存性プロテインキナーゼ)を含む。哺乳動物生物学において、ras遺伝子の突然変異および成長因子受容体の調節異常と関連する様々な増殖性細胞疾患(例えば、がんなど)では、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)ファミリーに属するプロテインキナーゼが不適切に活性化される(Magnusonら、「Seminars in Cancer Biology」、5巻:247〜252頁(1994年))。MAPキナーゼは、当技術分野で公知であり、このようなキナーゼの部分的な非限定的リストは、abl、Aurora−A、Aurora−B、Aurora−C、ATK、bcr−abl、Blk、Brk、Btk、c−Kit、c−Met、c−Src、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、cRafl、CSF1R、CSK、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、ERK、Fak、fes、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Fgr、FLK−4、Flt−1、Fms、Fps、Frk、Fyn、Hck、IGF−1R、INS−R、Jak、KDR、Lck、Lyn、MEK、p38、PDGFR、PIK、PKC、PYK2、Ros、Tiel、Tie2、Trk、Yes、およびZap70を含む。本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態では、キナーゼは、ablキナーゼである。

0051

キナーゼに関しては、複数種類の化合物が、キナーゼの機能をモジュレートすることが公知である。例えば、I型キナーゼ阻害剤は、キナーゼの活性コンフォメーションを認識する。I型キナーゼ阻害剤は、ATPにより通常形成される水素結合模倣する1つ〜3つの水素結合を提示することにより、ATP結合性部位に結合する。理論に束縛されずに述べると、I型キナーゼ阻害剤とは対照的に、II型キナーゼ阻害剤は、キナーゼの不活性コンフォメーションを認識し、ATP結合性部位に直に隣接する疎水性ポケット占有することにより、ATPと間接的に競合しうると考えられる。この疎水性ポケットは、活性化ループの固有DFG−outコンフォメーションにより作り出される。これは、機能性に必要でないが、いくつかのII型阻害剤は、ATP結合性部位へと直接に水素結合を形成することが可能である(GotinkおよびVerheul、Angiogenesis、2010年、13巻(1号):1〜14頁)。これに対し、III型キナーゼ阻害剤とは、活性化ループ以外の部位に結合することにより(すなわち、キナーゼ上のアロステリック部位に結合することにより)キナーゼ活性をモジュレートする、非ATP競合キナーゼ阻害剤である。III型化合物は、キナーゼ上のそれほど保存的でない部位に結合するという事実に起因して、高度に選択性であり、研究および薬物発見コミュニティーの関心を増大させつつある。

0052

本発明の方法の範囲内における使用にはまた、標的タンパク質の突然変異形態も想定されている。本明細書で使用される「突然変異」は、標的タンパク質のアミノ酸一次配列など、規定されたアミノ酸一次配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基についての、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、および/またはアミノ酸残基の置換を含む。アミノ酸「置換」とは、規定されたアミノ酸一次配列の少なくとも1つのアミノ酸構成要素を、別のアミノ酸(例えば、システイン残基またはリシン残基)で置きかえることを意味する。当技術分野では、標準的な技法により、突然変異または置換を、標的タンパク質のアミノ酸一次配列に工学的に作製するための方法が周知である。本明細書で記載される方法における使用のための標的タンパク質は、保存的置換を含みうる。保存的置換を、下記の「好ましい置換」の表題の下の「アミノ酸置換表」に示す。置換が生物学的活性の変化を結果としてもたらす場合は、下記の表中の「例示的な置換」と命名されるか、またはアミノ酸のクラスに言及しながら下記でさらに記載される、より実質的な変化を導入することができる。

0053

標的タンパク質の生物学的特性の実質的な修飾は、それらの(a)置換の領域内のポリペプチド骨格の、例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての構造、(b)標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のバルクの維持に対する効果が著明に異なる置換を選択することにより達成する。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、別のクラスのメンバーへの交換を伴うであろう。

0054

さらなる実施形態では、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のための突然変異体の標的タンパク質は、1または複数の非自然発生のアミノ酸または修飾アミノ酸を含みうる。「非自然発生のアミノ酸残基」とは、上記で列挙した自然発生のアミノ酸残基以外の残基であって、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基(複数可)に共有結合的に結合することが可能な残基を指す。非天然アミノ酸は、ホモリシンホモアルギニンホモセリンアゼチジンカルボン酸、2−アミノアジピン酸、3−アミノアジピン酸、ベータアラニンアミノプロピオン酸、2−アミノ酪酸、4−アミノ酪酸、6−アミノカプロン酸、2−アミノヘプタン酸、2−アミノイソ酪酸、3−アミノイソ酪酸(aminoisbutyric acid)、2−アミノピメリン酸三級ブチルグリシン、2,4−ジアミノイソ酪酸デスモシン、2,2’−ジアミノピメリン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸、N−エチルグリシン、N−エチルアスパラギン、ホモプロリンヒドロキシリシンアロヒドロキシリシン、3−ヒドロキシプロリン4−ヒドロキシプロリンイソデスモシンアロイソロシン、N−メチルアラニン、N−メチルグリシン、N−メチルイソロイシン、N−メチルペンチルグリシン、N−メチルバリンナフチルアラニン(naphthalanine)、ノルバリンノルロイシンオルニチンシトルリンペンチルグリシン、ピペコリン酸、およびチオプロリンを含むがこれらに限定されない。修飾アミノ酸は、例えば、N−メチル化されたDアミノ酸およびLアミノ酸、別の官能基へと化学的修飾された側鎖官能基など、可逆的もしくは不可逆的に化学的に保護されているか、またはそれらのN末端アミノ基もしくはそれらの側鎖基において修飾されている天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。例えば、修飾アミノ酸は、メチオニンスルホキシド;メチオニンスルホンアスパラギン酸−(ベータ−メチルエステル)、アスパラギン酸の修飾アミノ酸;N−エチルグリシン、グリシンの修飾アミノ酸;またはアラニンカルボキサミドおよびアラニンの修飾アミノ酸を含む。当技術分野では、さらなる非天然アミノ酸および修飾アミノ酸、ならびにそれらをタンパク質およびペプチドへと組み込む方法が公知である。(例えば、Sandbergら(1998年)、J. Med. Chem.、41巻:2481〜91頁;XieおよびSchultz(2005年)、Curr. Opin. Chem. Biol.、9巻:548〜554頁;HodgsonおよびSanderson(2004年)、Chem. Soc. Rev.、33巻:422〜430頁を参照されたい)。

0055

いくつかの実施形態では、本明細書で記載される方法における使用のための突然変異体の標的タンパク質は、標準的なタンパク質精製法を使用する適切な精製スキームにより、細胞(がん細胞など)から単離することができる。別の実施形態では、本明細書で記載される方法における使用のための突然変異体の標的タンパク質は、組換えDNA法により作製される。組換え発現に対する代替法としては、本明細書で記載される方法における使用のための突然変異体の標的タンパク質は、標準的なペプチド合成法を使用して化学合成することができる。

0056

B.標的タンパク質のアロステリックモジュレーターを同定する方法における使用のための薬剤
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、標的タンパク質の未知の候補アロステリックモジュレーターでありうる。本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸のうちのいずれか、またはこれらの任意の組合せでありうる。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体(ヒト化抗体など)またはその断片である。あるいは、薬剤は、低分子化合物でありうる。他の実施形態では、薬剤は、非抗体ポリペプチド(単離非抗体ポリペプチドなど)でありうる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチド(例えば、単離ペプチド)である。

0057

1.非抗体結合性ポリペプチド
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、非抗体結合性ポリペプチドである。結合性ポリペプチドは、本明細書で記載される標的タンパク質のうちのいずれかなどの標的タンパク質に好ましくは特異的に結合するポリペプチドである。結合性ポリペプチドは、公知のポリペプチド合成法を使用して化学合成することもでき、組換え技術を使用して調製および精製することもできる。結合性ポリペプチドは通常、少なくとも約5アミノ酸の長さ、あるいは、少なくとも約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100アミノ酸以上の長さであり、ここで、このような結合性ポリペプチドは、好ましくは特異的に野生型または突然変異体の標的タンパク質に結合することが可能である。結合性ポリペプチドは、過度の実験なしに、周知の技法を使用して同定することができる。この点で、当技術分野では、ポリペプチド標的に結合することが可能な結合性ポリペプチドについてのポリペプチドライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることが注意される(例えば、米国特許第5,556,762号、同第5,750,373号、同第4,708,871号、同第4,833,092号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,571,689号、同第5,663,143号;PCT公開第WO84/03506号および同第WO84/03564号;Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、81巻:3998〜4002頁(1984年);Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、82巻:178〜182頁(1985年);Geysenら、Synthetic Peptides as Antigens、130〜149頁(1986年);Geysenら、J. Immunol. Meth.、102巻:259〜274頁(1987年);Schoofsら、J. Immunol.、140巻:611〜616頁(1988年)、Cwirla, S. E.ら(1990年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87巻:6378頁;Lowman, H.B.ら(1991年)、Biochemistry、30巻:10832頁;Clackon, T.ら(1991年)、Nature、352巻:624頁;Marks, J. D.ら(1991年)、J. Mol. Biol.、222巻:581頁;Kang, A.S.ら(1991年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88巻:8363頁;およびSmith, G. P.(1991年)、Current Opin. Biotechnol.、2巻:668頁を参照されたい)。

0058

バクテリオファージファージディスプレイとは、大規模なポリペプチドライブラリーをスクリーニングして、本明細書で開示される方法における使用のための野生型または突然変異体の標的タンパク質などの標的ポリペプチドに結合することが可能なライブラリーのメンバー(複数可)を同定することを可能とする1つの周知の技法である。ファージディスプレイは、変異体のポリペプチドを、バクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質として提示する技法である(Scott, J.K.およびSmith, G. P.(1990年)、Science、249巻:386頁)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質の変異体(またはランダムにクローニングされたcDNA)の大規模なライブラリーは、標的分子に結合する配列について、迅速かつ効率的に、高アフィニティーで分取しうるという事実にある。ファージ上のペプチドライブラリー(Cwirla, S. E.ら(1990年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87巻:6378頁)またはタンパク質ライブラリー(Lowman, H.B.ら(1991年)、Biochemistry、30巻:10832頁;Clackson, T.ら(1991年)、Nature、352巻:624頁;Marks, J. D.ら(1991年)、J. Mol. Biol.、222巻、581頁;Kang, A.S.ら(1991年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88巻:8363頁)のディスプレイが、何百万ものポリペプチドまたはオリゴペプチドを、特異的結合特性を伴うポリペプチドまたはオリゴペプチド(Smith, G. P.(1991年)、Current Opin. Biotechnol.、2巻:668頁)についてスクリーニングするのに使用されている。ランダムな突然変異体のファージライブラリーの分取は、多数の変異体を構築し、繁殖させるための戦略標的受容体を使用するアフィニティー精製のための手順、および結合強化の結果を評定する手段を要求する。米国特許第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,571,689号、および同第5,663,143号を参照されたい。

0059

大半のファージディスプレイ方法では、繊維状ファージを使用しているが、ラムイドファージディスプレイシステム(WO95/34683;U.S.5,627,024)、T4ファージディスプレイシステム(Renら、Gene、215巻:439頁(1998年);Zhuら、Cancer Research、58巻(15号):3209〜3214頁(1998年);Jiangら、Infection & Immunity、65巻(11号):4770〜4777頁(1997年);Renら、Gene、195巻(2号):303〜311頁(1997年);Ren、Protein Sci.、5巻:1833頁(1996年);Efimovら、Virus Genes、10巻:173頁(1995年))、およびT7ファージディスプレイシステム(SmithおよびScott、Methodsin Enzymology、217巻:228〜257頁(1993年);U.S.5,766,905)もまた公知である。

0060

さらなる改善は、ペプチドライブラリーを選択された標的分子への結合についてスクリーニングし、これらのタンパク質を所望の特性についてスクリーニングする潜在的可能性を伴う機能的なタンパク質を提示するディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応デバイスが開発されており(WO98/14277)、二分子間相互作用(WO98/20169;WO98/20159)およびコンストレインドへリックスペプチドの特性(WO98/20036)を解析および制御するのにファージディスプレイライブラリーが使用されている。WO97/35196は、アフィニティーリガンドを単離する方法であって、ファージディスプレイライブラリーを、リガンドが標的分子に結合する1つの溶液、およびアフィニティーリガンドが、標的分子に結合せずに、結合性リガンドを選択的に単離する第2の溶液と接触させる方法について記載している。WO97/46251は、ランダムなファージディスプレイライブラリーを、アフィニティー精製された抗体でバイオパニングし、次いで、結合性ファージを単離した後で、マイクロプレートウェルを使用するマイクロパニング工程を施して、高アフィニティー結合性ファージを単離する方法について記載している。Staphylococcus aureusのプロテインAのアフィニティータグとしての使用もまた報告されている(Liら(1998年)、Mol Biotech.、9巻:187頁)。WO97/47314は、ファージディスプレイライブラリーでありうるコンビナトリアルライブラリーを使用して酵素の特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用について記載している。洗浄剤を使用するファージディスプレイにおける使用に適する酵素を選択するための方法は、WO97/09446において記載されている。特異的結合性タンパク質を選択するさらなる方法は、米国特許第5,498,538号、同第5,432,018号、およびWO98/15833において記載されている。

0061

米国特許第5,723,286号、同第5,432,018号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,498,530号、同第5,770,434号、同第5,734,018号、同第5,698,426号、同第5,763,192号、および同第5,723,323号ではまた、ペプチドライブラリーを作り出し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法についても開示されている。

0062

結合性ポリペプチドは、それらの阻害性効果(例えば、アフィニティーの増強、半減期、安定性、およびクリアランス速度、毒性の低減などの薬物動態特性の改善を含む)を増強するように修飾することができる。このような修飾は、例えば、グリコシル化、PEG化、非自然発生であるが機能的に同等なアミノ酸による置換、連結基などを含む。

0063

2.低分子
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、低分子化合物である。低分子は、好ましくは、本明細書で定義される結合性ポリペプチドまたは非抗体有機分子であって、好ましくは特異的に、野生型または突然変異体の標的タンパク質に結合する有機分子である。有機低分子は、公知の方法(例えば、PCT公開第WO00/00823号および同第WO00/39585号を参照されたい)を使用して同定および化学合成することができる。有機低分子は、通常約2000ドルトン未満のサイズ、あるいは、約1500、750、500、250、または200ドルトン未満のサイズであり、好ましくは特異的に野生型または突然変異体の標的タンパク質に結合することが可能なこのような有機低分子は、過度の実験なしに、周知の技法を使用して同定することができる。この点で、当技術分野では、ポリペプチド標的に結合することが可能な分子についての有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることが注意される(例えば、PCT公開第WO00/00823号および同第WO00/39585号を参照されたい)。有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトンオキシムヒドラゾンセミカルバゾンカルバジド一級アミン二級アミン三級アミン、N置換されたヒドラジンヒドラジドアルコールエーテルチオールチオエーテルジスルフィドカルボン酸、エステル、アミド尿素カルバメート炭酸ケタールチオケタール、アセタールチオアセタールハロゲン化アリールスルホン酸アリールハロゲン化アルキルスルホン酸アルキル芳香族化合物複素環化合物アニリンアルケンアルキンジオール、アミノアルコール、オキサゾリジンオキサゾリンチアゾリジンチアゾリンエナミンスルホンアミドエポキシドアジリジンイソシアン酸スルホニルクロリドジアゾ化合物酸塩化物などでありうる。

0064

いくつかの態様では、低分子化合物は、コンビナトリアル化学ライブラリーの構成要素である。コンビナトリアル化学ライブラリーとは、小型のサブユニットまたは単量体を含む複数の分子種の化合物のコレクションである。コンビナトリアルライブラリーは、数百〜数十万の異なる分子種の化合物の範囲の様々なサイズに収まる。炭水化物、オリゴヌクレオチド、および有機低分子などの化合物を含む、オリゴマーライブラリーおよびポリマーライブラリーを含む、様々なライブラリーの種類もまた存在する。このようなライブラリーは、固定化およびクロマトグラフィーによる化合物の分離、ならびにアクセプター分子(c−metタンパク質など)に結合するか、または対象の生物学的活性(細胞内増殖の阻害などであるがこれらに限定されない)を媒介することが可能なリガンドを同定し、特徴づけるための使用など、様々な使用がなされる。

0065

当技術分野では、固相支持体上で化合物のライブラリーを合成するための多様な技法が公知である。固相支持体は、サブユニットまたは単量体と結合して、ライブラリーの化合物を形成するように官能化された表面を伴うポリマー対象であることが典型的である。1つのライブラリーの合成は、多数の固相支持体を伴うことが典型的である。コンビナトリアルライブラリーを作製するには、固相支持体を、化合物の1または複数のサブユニットと反応させ、注意深く制御された所定の化学反応の連鎖において、1またはより多数の試薬と反応させる。言い換えれば、ライブラリーのサブユニットを、固相支持体上で「成長させる」。ライブラリーが大規模になるほど、要求される反応の数が増大することから、ライブラリーを構成する化合物の複数の分子種の化学組成を追跡する作業が複雑化する。いくつかの実施形態では、低分子は、約2000ドルトン未満のサイズ、あるいは、約1500、750、500、250、または200ドルトン未満のサイズである。

0066

本明細書における態様のうちのいずれかにおいて記載されている低分子薬剤は、固体支持体上で実行しうる任意の種類の化学反応に由来しうる。このような化学反応は、ブタジエントラッピングを含む[2+2]付加環化イソキサゾリンフラン、および修飾ペプチドの合成を含む[2+3]付加環化;ジオール、アルデヒド、およびケトンの固定化を含むアセタール形成;アルデヒドの誘導体化、プロパンジオールの合成を含むアルドール縮合;アルデヒドの誘導体化を含むベンゾイン縮合ベンゾジアゼピンおよびヒダントイン、チアゾリジン、ターン模倣体、ポルフィリンフタロシアニンを含む環化縮合;ジエステルの環化を含むディクマン環化;アクリル酸の誘導体化を含むディールスアルダー反応;アルコールのアルケンへの付加を含む求電子付加;アルデヒドの誘導体化を含むグリニャール反応二置換アルケンの合成を含むヘック反応;in situにおけるニトリルオキシドの合成([2+3]付加環化を参照されたい)を含むヘンリー反応;フェロモンおよびペプチドの合成を含む接触水素化(アルケンの水素化);スルファニルケトン、ビシクロ[2.2.2]オクタンの合成を含むマイケル反応アリールエーテル、ペプチジルホスホネート、およびチオエーテルの合成を含む光延反応キノロンの合成を含む求核芳香族置換;アルデヒドおよびケトンの合成を含む酸化;ペンチノールを伴うノルボルナジエンの環化を含むポーソンカンド付加環化;ヘリセンの合成を含む光化学環化;アルデヒドおよびアシクロリドの誘導体化を含む、有機金属化合物を伴う反応;カルボニル、カルボン酸、エステル、およびニトロ基還元を含む、錯体ヒドリドおよびスズ化合物を伴う還元;カルボキシル基の還元を含むそ合(Soai)反応;ビフェニル誘導体の合成を含むスティル反応;置換シクロヘキサノンの合成を含むストーク反応;キノロンの合成を含む還元アミノ化フェニル酢酸誘導体の合成を含む鈴木反応;ならびにアルデヒド、フェロモン、およびスルファニルケトンによる反応を含むウィティッヒ−ホルナー反応を含むがこれらに限定されない。

0067

化学ライブラリーの合成ならびに個々の固相支持体上のそれらのライブラリーの個々の化合物のデコンボリューションについて開示する参考文献は、米国特許出願第2009/0032592号;Needelsら(1993年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻:10700〜10704頁;およびWO97/15390において見出すことができる。

0068

3.抗体
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、抗体である。抗体とは、標的タンパク質に好ましくは特異的に結合するタンパク質である。抗体の変異体は、抗体の活性に実質的に影響を及ぼさずに、当技術分野で公知の情報に基づき作製することができる。例えば、抗体の変異体は、異なる残基により置きかえられた、抗体分子内の少なくとも1つのアミノ酸残基を有しうる。抗体では、置換突然変異誘発のために最大の関心の対象となる部位は一般に、超可変領域を含むが、フレームワーク領域(FR)の変化もまた想定される。

0069

抗体では、置換変異体の1つの種類は、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1または複数の超可変領域の残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択された、結果として得られる変異体(複数可)は、それらがそこから作製される親抗体と比べて生物学的特性が改善されているであろう。このような置換変異体を作り出すための簡便な方途は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟を伴う。略述すると、複数の超可変領域部位(例えば、6つ〜7つの部位)を突然変異させて、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を発生させる。このようにして作り出される抗体は、各粒子内にパッケージングされたM13の遺伝子III産物への融合体として、繊維状ファージ粒子から提示される。次いで、ファージにより提示された変異体を、本明細書で開示されるそれらの生物学的活性(例えば、結合アフィニティー)についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニン走査突然変異誘発を実施して、抗原の結合に著明に寄与する超可変領域の残基を同定することができる。あるいはまたは加えて、抗原−抗体複合体結晶構造を解析して、抗体と抗原との接触点を同定することが有益でありうる。このような接触残基および近傍の残基は、本明細書で精緻化される技法による置換のための候補である。このような変異体を発生させたら、変異体のパネルを、本明細書で記載されるスクリーニングにかけ、1または複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を伴う抗体を、さらなる開発のために選択することができる。

0070

抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製する。これらの方法は、天然供給源(自然発生のアミノ酸配列変異体の場合)からの単離、または既に調製された抗体の変異体または抗体の非変異形に対する、オリゴヌクレオチドを媒介する(または部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。

0071

本発明の免疫グロブリンポリペプチドFc領域に、1カ所または複数カ所のアミノ酸修飾を導入し、これにより、Fc領域変異体を作り出すことが所望でありうる。Fc領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸修飾を含む、1または複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾(例えば、置換)を含む、ヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域)を含みうる。

0072

一実施形態では、Fc領域変異体は、新生児Fc受容体(FcRn)の結合アフィニティーの改変を提示しうる。このような変異体のFc領域は、Fc領域のアミノ酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439、または447のうちの任意の1または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Fc領域内の残基の番号付けは、KabatにおけるEUインデックスによる番号付けである。FcRnへの結合が低減されたFc領域変異体は、Fc領域のアミノ酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439、または447のうちの任意の1または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Fc領域内の残基の番号付けは、KabatにおけるEUインデックスによる番号付けである。あるいは、上述のFc領域変異体は、FcRnへの結合の増大を提示し、Fc領域のアミノ酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434のうちの任意の1または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Fc領域内の残基の番号付けは、KabatにおけるEUインデックスによる番号付けである。

0073

FcRへの結合が低減されたFc領域変異体は、Fc領域のアミノ酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438、または439のうちの任意の1または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Fc領域内の残基の番号付けは、KabatにおけるEUインデックスによる番号付けである。

0074

例えば、Fc領域変異体は、FcRIの結合の低減を提示し、Fc領域のアミノ酸位置238、265、269、270、327、または329のうちの任意の1または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Fc領域内の残基の番号付けは、KabatにおけるEUインデックスによる番号付けである。

0075

Fc領域変異体は、FcRIIの結合の低減を提示し、Fc領域のアミノ酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438、または439のうちの任意の1または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Fc領域内の残基の番号付けは、KabatにおけるEUインデックスによる番号付けである。

0076

対象のFc領域変異体は、FcRIIIの結合の低減を提示し、Fc領域のアミノ酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435、または437のうちの1または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Fc領域内の残基の番号付けは、KabatにおけるEUインデックスによる番号付けである。

0077

Clqへの結合および/または補体依存性細胞傷害作用(CDC)を改変(すなわち、改善または減殺)したFc領域変異体は、国際特許出願第WO99/51642号において記載されている。このような変異体は、Fc領域のアミノ酸位置270、322、326、327、329、331、333、または334のうちの1または複数におけるアミノ酸置換を含みうる。また、Fc領域変異体に関するDuncanおよびWinter Nature、322巻:738〜40頁(1988年);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;および国際特許出願第WO94/29351号も参照されたい。

0078

C.第二高調波活性部分(標識など)
本明細書で提供される方法のうちのいずれかについてのいくつかの態様では、野生型または突然変異体の標的タンパク質を、第二高調波活性部分または第二高調波活性標識(別称:SHG部分またはSHG標識)で標識する。第二高調波活性部分(標識など)は、結果として得られる標的タンパク質を、第二高調波発生に対して感受性とし、表面選択技術を使用する、界面における研究に適切とするために、標的タンパク質に共有結合的または非共有結合的に結合しうる。次いで、標識された標的タンパク質は、第二高調波発生または和周波発生などの表面選択技術により研究することができる。外因性部分(標識など)は、標的タンパク質へとあらかじめ付着させることができ、任意の非結合標識または未反応標識は、測定を行う前に標識された実体から分離する。一実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)を、in vitroにおいて、標的タンパク質へと付着させる。標的タンパク質の第二高調波活性部分(標識など)による標識は、結合反応(標的タンパク質を、活性コンフォメーションまたは不活性コンフォメーションへと安定化させることが可能な薬剤の結合など)が、標識の配向性またはコンフォメーションの変化を結果としてもたらす場合に、標的タンパク質のコンフォメーション変化を、表面選択性非線形光学法を使用して検出する直接的な光学手段を可能とする。蛍光標識による検出とは異なり、SHG標識は、界面において標識され、正味の配向性を伴う標的タンパク質だけが、第二高調波シグナルに寄与し;表面に付着しない、標識された標的タンパク質は、シグナルに寄与しないという重要な利点を有する。したがって、薬剤に結合した後のSHGで標識された標的タンパク質分子内のコンフォメーション変化を検出するためのシグナル対ノイズ比は、変わらず常に高い。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を、in situにおいて、SHG活性部分(標識など)で標識する(すなわち、表面へと付着させた後において)。他の実施形態では、支持脂質二重層表面または支持脂質類似体二重層表面へと付着させた後において、標的タンパク質を、SHG活性部分(標識など)で標識する。

0079

本発明の代替的な態様では、少なくとも2つの識別可能な第二高調波活性部分(標識など)を使用することができる。その場合は、付着された2つ以上の識別可能な標識の配向性を、発散するコヒーレントの非線形光ビームの方向を十分に規定することが容易となるように選ぶことになろう。2つ以上の識別可能な標識は、試料に照らして1または複数の偏光方向で入射する、1または複数の周波数における複数の基本波光ビームを使用し、少なくとも2つの非線形光ビームの発散を結果としてもたらすアッセイで使用することができる。一実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、第二高調波活性部分(標識など)の全体的な非線形感受率を増大させるように、各々が非線形感受率を有し、互いに対して一定でかつ明確な配向性で併せて結合する複数の個々の第二高調波活性部分(標識など)を含む。

0080

1.第二高調波活性色素
本明細書で記載される方法のうちのいくつかの態様では、第二高調波活性部分(標識など)は、色素である。標的タンパク質は、特異的な標識または非特異的な標識を介して、色素により標識することができる。

0081

第二高調波活性部分は、特異的な標識を介して、例えば、共有結合または水素結合を介して、標的タンパク質へと付着させることができる。例えば、第二高調波活性部分(標識など)は、検出される標的タンパク質のアミノ酸一次配列内のアミン基、リシン基、またはスルフヒドリル基へと、共有結合的に付着させることもでき、非共有結合的に付着させることもできる。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)は、アミン反応性スクシンイミジルエステル、チオール反応性マレイミド、またはアルデヒド反応性ヒドラジドおよび/もしくはケトン反応性ヒドラジド、ならびにヒドロキシルアミンを保有する。いくつかの実施形態では、SFG色素標識またはSHG活性色素標識は、アジドへとカップリングするための「クリック化学反応」を介してコンジュゲートすることができる。コンジュゲート形成における使用のためのクリック化学反応の詳細は、「Synthesis and Functionalization of Biomolecules via Click Chemistry」、C. Schillingら、15章、355〜378頁、「Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science」、J. Lahann(編)、Wiley(2009年)において記載されている。

0082

本明細書で開示される方法における第二高調波または和周波活性部分(標識など)としての使用に適切な色素の例は、限定せずに述べると、マレイミド標識(システイン残基上のタンパク質を特異的に標識する、PyMPO−MALEIMIDE(商標)(1−(2−マレイミジルエチル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムメタンスルホネート)など)、PyMPO−NHS(リシン残基を特異的に標識する)、オキサゾール標識(アミンを特異的に標識するPyMPO−スクシンイミジルエステルなど)、BADAN(商標)(6−ブロモアセチル−2−ジメチルアミノナフタレン)、およびACRYLODAN(商標)(6−アクリロイル−2−ジメチルアミノナフタレン)を含む。他の実施形態では、標識は、ケトクマリンおよび3,3’−カルボニルビス(7−ジエチルアミノクマリン)などであるがこれらに限定されない、クマリンベースの色素でありうる。他の実施形態では、標識は、PyMPO−SE(商標)(1−(3−(スクシンイミジルオキシカルボニルベンジル)−4−(5−(4−メトキシフェニル)オキサゾール−2−イル)ピリジニウムブロミド)でありうる。

0083

本明細書で開示される方法のうちのいくつかの態様では、標的タンパク質のアミノ酸一次配列内の天然のアミノ酸残基は、突然変異させることもでき、第二高調波活性色素に結合することが可能な別のアミノ酸で置換することもできる。本明細書で使用される「突然変異」は、標的タンパク質のアミノ酸一次配列など、規定されたアミノ酸一次配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基についての、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、および/またはアミノ酸残基の置換を含む。アミノ酸「置換」とは、規定されたアミノ酸一次配列の少なくとも1つのアミノ酸構成要素を、別のアミノ酸(例えば、システイン残基またはリシン残基)で置きかえることを意味する。アミノ酸一次配列内の1または複数のアミノ酸残基の突然変異または置換(保存的突然変異または置換など)は、その標的タンパク質のリガンドに結合するとき、または標的タンパク質にアロステリックに結合することが可能な未知の候補薬剤に結合するときに、そのアミノ酸配列によりコードされる標的タンパク質がコンフォメーション変化を受ける感受率の実質的な変化を結果としてもたらさないことが所望される。

0084

当技術分野では、標準的な技法により、突然変異または置換を、標的タンパク質などのタンパク質のアミノ酸一次配列に工学的に作製するための方法が周知である。本明細書で記載される標的タンパク質は、保存的置換を含みうる。保存的置換を、上記の「アミノ酸置換表」の、「好ましい置換」の表題の下に示す。

0085

2.非天然アミノ酸
他の態様では、第二高調波活性部分(標識など)は、非天然アミノ酸(UAA)でありうる。従来の標識とは対照的に、UAAは、包埋部位および露出部位のいずれにおいてもタンパク質を標識する手段をもたらす。加えて、タンパク質の固有の成分として、それらは、アミノ酸官能基(システインおよびアミンなど)へと付着させた標識(色素など)より大きな感度および忠実度で構造的変化を報告しうる。UAAは、第二高調波発生などの非線形法を使用してタンパク質を検出するための超偏光度を保有する。したがって、これらの特異的な非天然アミノ酸はまた、SHAA(「第二高調波アミノ酸」)とも称されている。タンパク質の構造的コンフォメーションの変化を検出するためのプローブとしてUAAを使用することの別の利点は、検出を、in vivoにおいて(すなわち、生細胞内で)実行しうることである。例えば、本明細書で記載される方法を使用して、候補薬剤の結合に応答して、生細胞内の標的タンパク質により呈示されるコンフォメーション変化を検出することができる。標的タンパク質の、表面に照らして配向させたタンパク質集団を使用することにより、リアルスペースおよびリアルタイムにおける構造またはコンフォメーション変化の高精度のマップを、UAAをそのアミノ酸配列の一部として含有する標的タンパク質を使用して構築することができる。アミノ酸一次配列内の1または複数のアミノ酸残基の、UAAによる置換は、GDPもしくはGTPに結合するとき、またはGTPが加水分解するとき、または標的タンパク質に結合することが可能な未知の候補薬剤に結合して、それを不活性コンフォメーションもしくは活性コンフォメーションへと安定化させるときに、そのアミノ酸配列によりコードされる標的タンパク質がコンフォメーション変化を受ける感受率の実質的な変化を結果としてもたらさないことが所望される。

0086

任意の超偏光性UAAは、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおいて、候補薬剤に結合した後の標的タンパク質の構造内のコンフォメーション変化を測定するための第二高調波活性部分(標識など)として使用することができる。いくつかの実施形態では、UAAが、アラダンである(それらの開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている、Cohenら、2002年、Science、296巻:1700頁;Abbyadら、2007年、J. Phys. Chem.、111巻:8269頁)。他の実施形態では、UAAは、ダンシルアラニンである(Summererら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、2006年、103巻(26号):9785〜9789頁)。一実施形態では、非天然アミノ酸は、和周波発生活性(SFG活性)である。本明細書で使用される「和周波発生活性」とは、超偏光度を保有し、SFGにより検出可能なSH活性の標識を指す。他の実施形態では、UAAは、超偏光性ではないが、それが、上記で記載した色素のうちのいずれかなどの第二高調波活性標識色素に結合することを可能とする、適切な1または複数の化学官能基を保有する。他の実施形態では、UAAは、タンパク質内の不連続の部位に工学的に作製して、SFGにより部位特異的コンフォメーション変化を同定するように振動特性が調整されたプローブを含みうる。いくつかの実施形態では、UAAへと組み入れるためのプローブ部分は、それらが天然のタンパク質構造攪乱しないように、十分に小型であることが所望され、NO、CN、SCN、またはN3を含みうるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、プローブ部分は、内因性のタンパク質振動からは十分に隔てられた、約1,900〜2,300cm−1の間のスペクトル範囲内で固有の振動シグネチャーを提示する。別の実施形態では、第二高調波活性部分(標識など)が表面に対して正味の配向性を保有するように、UAAを使用して、標的タンパク質を表面へと付着させることができる。

0087

したがって、いくつかの態様では、標的タンパク質のコンフォメーションの構造的変化は、標的タンパク質の異なる突然変異体内のアミノ酸配列に工学的に作製された非天然アミノ酸標識またはこのような標識のシリーズ傾斜角または絶対傾斜角を測定することにより、リアルタイムおよびリアルスペースで決定することができる。プローブは、標的タンパク質内の任意の部位に組み込むこともでき、その末端に組み込むこともでき、その任意のドメイン内に組み込むこともできる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、UAAと共有結合的に反応するように化学的に装備された第二高調波活性標識を含みうる。例えば、タンパク質へと組み込まれたUAAが、パラ−アセチル−フェニルアラニン(pAcF)であれば、第二高調波活性色素は、pAcFに共有結合的に結合するのに適切な化学反応をその上で生じさせるであろう。別の実施形態では、第2のUAA(これは一般に第二高調波活性ではない)に加えてSHAAを組み込むことにより、第2のUAAとの反応に適切な化学反応で誘導体化された表面に照らして配向させた形での、タンパク質の、化学的に直交する共有結合的カップリングが可能となる。SH活性である、高度に配向させた標的タンパク質試料(2つのUAAを使用して)により、ベースラインのSHGシグナルおよび対比SHGシグナル(コンフォメーション変化によるシグナルの変化)のいずれも、SHGシグナルをもたらすのにUAAを使用しない標的タンパク質と比較して大きくすることができる。

0088

他の態様では、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける、標的タンパク質のアミノ酸配列内の1または複数のUAAを使用することにより、標的タンパク質内の1または複数の部位における、1または複数の標識の傾斜角を時間の関数として決定することを介して、候補アロステリックモジュレーターに結合するときに、標的タンパク質が受ける実際のコンフォメーション変化を決定することが可能となる。標的タンパク質の三次元構造は、各々が異なる位置に配置されたSHAAプローブを含有する、タンパク質の1または複数の突然変異体を作製することにより決定することができる(すなわち、各突然変異体内の、表面に照らしたプローブの配向性を、各突然変異体内のプローブについて決定することができ、したがって、側鎖の配向性を、各突然変異体内のプローブについて決定することができ、この情報を使用して、全体的な三次元タンパク質構造のモデルを構築することができる)。測定されたプローブ傾斜角を踏まえ、当業者に公知の立体障害法、統計学的方法分子的動力学ラマチャンドランプロット、またはエネルギー最小化法からの情報を使用して、構造をさらに決定する一助とすることができる。プローブの傾斜角の時間分解された測定により、リアルタイムで生じるタンパク質のコンフォメーション変化の動画がもたらされる。SHG(およびSFG)の事実上瞬間的な応答および感度のために、特定のプローブ(例えば、表面に照らした傾斜角または絶対傾斜角)の空間的配向性は、対象のほぼ任意の時間スケールにおいて、リアルタイムで測定することができる。

0089

SHG法におけるUAAの使用と関連するさらなる情報は、その開示が参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第2010/0068144号において見出すことができる。

0090

D.界面
本明細書で開示される方法のうちのいくつかの態様では、標的タンパク質は、固体表面に結合させるか、または標的タンパク質に結合させた第二高調波活性標識が正味の配向性を有するように、界面に対して配向させる。GTPまたはGDPに結合するとき、標的タンパク質の活性部位内でGTPが加水分解するとき、または薬剤が標識された標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導すると仮定する場合、突然変異体もしくは野生型の標的タンパク質の構造を不活性コンフォメーションもしくは活性コンフォメーションへと安定化させることが可能な候補薬剤が結合するときに変化しうるのは、この正味の配向性である。いくつかの実施形態では、界面は、シリカ、ガラス、ケイ素、ポリスチレン、ナイロン、プラスチック、金属、半導体、もしくは絶縁体の表面、または生物学的成分吸着もしくは付着させうる任意の表面から作製することができる。異なる実施形態では、界面は、蒸気液体界面液体間界面、液体−固体界面、または固体間界面でありうる。一実施形態では、蒸気−液体界面は、空気−水界面である。一実施形態では、液体間界面は、油−水界面である。異なる実施形態では、液体−固体界面は、水−ガラス界面またはベンゼン−SiO2界面である。

0091

いくつかの態様では、界面はまた、生体細胞表面およびリポソーム表面も含みうる。付着または固定化は、当技術分野で周知の様々な技法を介して施すことができる。例えば、タンパク質に対して、表面は、生体分子の表面上のアミンへとカップリングするために、アルデヒドシランで誘導体化することができる(MacBeathおよびSchreiber、2000年(その関連する部分が参照により本明細書に組み込まれている))。また、まずBSAの分子層を表面へと付着させ、次いで、それをN,N’−ジスクシンイミジルカーボネートで活性化することにより、BSA−NHS(BSA−N−ヒドロキシスクシンイミド)表面も使用することができる。BSA上の活性化したリシン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基は、タンパク質上の表面アミンと反応する。

0092

また、支持リン脂質二重層も、例えば、Salafskyら、Biochemistry、1996年(その関連する部分が参照により本明細書に組み込まれている)、その関連する部分が参照により本明細書に組み込まれている、「Biomembranes」、Gennis、Springer-Verlag、Kalbら、1992年;およびBrianら、1984年などにおける、膜タンパク質または他の膜会合成分を伴うかまたはこれを伴わずに使用することができる。当技術分野では、支持リン脂質二重層が周知であり、会合膜タンパク質を伴うかまたは伴わずにそれらを作製するのに、多数の技法が利用可能である。これらの支持二重層は、水溶液中に浸して、それらが空気へと曝露されるときのそれらの破壊を防止しなければならないことが典型的である。いくつかの実施形態では、表面は、脂質類似体二重層表面である。

0093

固体表面(例えば、平面状基質、ビーズなど)を使用する場合、固体表面もまた、その正味の表面電荷密度を低減または増強する多様な化学反応を介して誘導体化して、標的タンパク質−候補アロステリックモジュレーター間相互作用の検出を最適化することができる。他の実施形態では、固体表面は、ガラス表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリスチレン表面、またはポリエチレン表面(ポリエチレングリコール表面など)でありうる。その上に標的タンパク質を固定化させる支持体は、生物学的材料非生物的材料有機材料無機材料、または粒子、ストランド沈殿物ゲル、シート、チューブ、球、容器キャピラリーパッドスライスフィルムプレート、もしくはスライドとして存在する材料のうちのいずれかの組合せなどであるがこれらに限定されない、広範囲にわたる材料からなりうる。表面は、ディスク方形、球、または円形などであるがこれらに限定されない、任意の簡便な形状をとりうる。表面は、好ましくは平坦でありうるが、また、様々な代替的な表面の立体形状もとりうる。例えば、表面は、試料(タンパク質など)が配置される隆起領域または陥没領域を含有しうる。表面は、その上に試料を形成しうる硬質の支持体を形成することが好ましい。表面はまた、適切な光吸収特徴をもたらすようにも選ぶ。例えば、表面は、限定せずに述べると、多量体化されたラングミュアブロジェットフィルム、官能化されたガラス、Si、Ge、GaAsGaP、SiO2、SiN4、修飾ケイ素、または(ポリ)テトラクロロエチレン((poly)tetrafhioroefhylene)、(ポリ)ビニリデンジフルオリド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリ炭酸、もしくはこれらの組合せなど、多種多様なゲルまたはポリマーのうちのいずれか1つでありうる。当業者には、他の表面材料もたやすく明らかであろう。一実施形態では、基質は、平坦なガラスまたはシリカである。

0094

いくつかの態様では、表面は、周知の技法を使用してエッチングして、所望の表面特徴をもたらすことができる。例えば、トレンチ、v字溝、メサ構造などの形態により、標的タンパク質(タンパク質の合成領域など)を、衝突光の焦点内により緊密に配置することができる。表面はまた、それにより集光される発光最大化するための反射「鏡」構造も装備しうる。別の例として述べると、表面は、エッチングして、ウェルを形成することもできる。

0095

本発明の別の態様では、アフィニティータグ付けされた標的タンパク質を、SHGまたはSFGを検出するための表面へと固定化するのに、オリゴポリエチレングリコール(PEG)分子も使用することができる。いくつかの実施形態では、PEGは、SAT(PEG4)(N−スクシンイミジルS−アセチル(チオテトラエチレングリコール)でありうる。SHGシグナルを検出するのに適するPEG化された界面は、上記で記載した表面のうちのいずれかなどの適切な表面を、オリゴPEG溶液でコーティングすることにより調製することができる。一実施形態では、表面は、ガラスでありうる。別の実施形態では、表面は、アミノ末端シラン誘導体化ガラスでありうる。当技術分野では、アフィニティータグは一般的であり、例えば、ヒスチジンタグ(His6タグなど)、マルトース結合性タンパク質タグ、HAタグ、ビオチンタグ、チオールタグ、またはGSTタグでありうる。いくつかの実施形態では、アフィニティータグは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上のヒスチジン残基のうちのいずれかを有するヒスチジンである。一実施形態では、オリゴPEG分子を、標的タンパク質上で発現させるアフィニティータグに結合する薬剤で修飾する。薬剤は、ヒスチジンタグの場合、ニッケルであることが可能であり、糖(マルトースなど)、抗体、またはアフィニティータグに結合することが可能である当技術分野で公知の他の任意の分子でもありうる。

0096

IV.本発明の方法
A.第二高調波発生
第二高調波発生(SHG)とは、非線形物質と相互作用するフォトンが効果的に「組み合わされて」、2倍のエネルギーを伴い、したがって、最初のフォトンの2倍の周波数および半分の波長を伴う新たなフォトンを形成する、非線形光学工程である。SHGは、和周波発生(SFG)の特殊な場合である。SHGなどの表面選択性非線形光学(SSNLO)法は、バルク分子種の存在下における、界面分子または界面粒子の検出を可能とする。強いレーザービーム(基本波)を、いくつかの試料の界面へと方向付け、界面が非中心対称性である場合、試料は、非線形光、すなわち、基本波高調波を発生させることが可能である。基本波ビームまたは第二高調波ビームは、ストークスシフトによる分離がより狭小な励起光および放出光を伴う、蛍光法における典型的な場合とは異なり、互いから容易に分離することができる。個々の分子または粒子は、それらが、1)非線形的に活性である(超偏光度を保有する)場合、および2)表面に近接し、その影響を介して(化学的力または電気的力を介して)ランダムでなく配向する場合に検出することができる。分子種のこの正味の配向性および内因的SHG活性が、界面においてSHGにより可能となる効果の一因となる。

0097

SHGは、SH活性プローブを使用して生体分子のコンフォメーション変化を検出および研究する高感度の技法として出現した(Salafsky, J. S. Journal of Chemical Physics、2006年、125巻、074701頁;Salafsky, J. S. Physical Chemistry Chemical Physics、2007年、9巻、5704頁)。表面上に吸着させるかまたは共有結合的に固定化させた標識されたタンパク質は、表平面に照らした、SHG標識の非線形偏光度の平均の正味の配向性に起因して、SHGシグナルをもたらす。具体的には、SH強度は、ISH=G(χs(2))2I2[式中、ISHは、第二高調波強度であり、Gは、実験形状および波長に依存する定数であり、Iは、基本波ビームの強度である]として与えられる。非線形感受率であるχs(2)は、式:




[式中、Nsは、分子の表面密度であり、カッコは、配向の平均を描示し、α(2)は、基本波ビームの2つの入射フォトンから第二高調波フォトンをもたらす可能性を決定する量子力学的特性である、それらの非線形偏光度である]を介して、表面上のSH活性分子の詳細を保有する。χs(2)を測定することにより、表面上の分子の配向性についての情報がもたらされる。例えば、α(2)で、分子的軸ζに沿った単一のエレメントζζζ(2)が優勢となり、表面の平面内で分子の方位角分布がランダムである場合、χs(2)のエレメントであって、消去されない唯一のエレメントは、




[式中、θは、ζと面法線との間の極角であり、添え字である




は、それぞれ、表面に対して垂直な方向および平行な方向を指す]である(Heinz, T. F.ら、Physical Review A、1983年、28巻、1983頁)。

0098

SH光は、コヒーレントでかつ指向性であるので、SHビームの集光および単離は単純化され、基本波高調波と第二高調波とは、スペクトル的に十分に隔てられているため、SHGには、蛍光測定を困難にしうるクロストークが存在しない。プローブの光崩壊は、2つのフォトンにより誘導される吸収を介して比較的緩慢に生じることから、比較的長い時間スケールにわたる測定が可能となる。SHGによる得失代償は、シグナル強度である(蛍光より何桁か弱い)。しかし、表面近傍でランダムに拡散する分子は、シグナルをもたらさず、式1によるそれらの配向平均はゼロであるので、第二高調波光に寄与するのは、表面上に固定化させたSH活性分子だけである。したがって、SHGは、表面結合分子と遊離分子とを弁別するように内因的に装備されている。SHシグナルは、プローブの配向平均について報告し、したがって、コンフォメーション変化に起因する変化について報告する。

0099

標的タンパク質−アロステリックモジュレーター間相互作用、および標的タンパク質のコンフォメーション構造に対するそれらの効果を検出するための装置は、様々な立体形状を前提としうる。その最も単純な形態では、装置は、以下:i)基本波光源;ii)表面付着プローブを伴う基質(SHGで標識された標的タンパク質など);およびiii)第二高調波ビーム、または他の非線形光学ビームの強度を測定するための検出器を含むであろう。装置のより精緻な変化形は、例えば、モノクロメーター(波長を選択するための)、パスフィルター、カラーフィルター、干渉もしくは他のスペクトルフィルター(波長を選択するため、または基本波(複数可)をより高次の高調波から分離するための)、1もしくは複数の偏光素子、ビームを方向付け、その焦点を絞るための1もしくは複数の鏡もしくはレンズ、コンピュータによる制御、またはソフトウェアを使用するであろう。

0100

非線形光を送達するかまたは発生させる方式(例えば、SHG)は、以下の手段:TIR(全内部反射)、光ファイバー(ビーズを付着させるかまたは付着させない)、透過(試料内の基本波の通過)、反射(基本波は、試料から反射される)、走査造影(試料を走査することを可能とする)、共焦点造影または走査、複合空洞共振器(resonance cavity for power build−up)、多重経路セットアップのうちの1または複数に基づきうる。

0101

測定された情報は、以下のパラメータ:光の強度(PMTまたはフォトダイオードにより光起電力へと転換されることが典型的)、光の波長(モノクロメーターおよび/またはフィルターにより決定される)、時間、または位置のうちの1または複数を含みうるベクターの形態を取りうる。装置の2つの一般的な構成は、画像走査装置(基質の造影:x,y座標の関数としての強度、波長など)および分光光度装置(いくつかの平面状表面についての、または細胞、リポソーム、もしくは他の粒子の懸濁液についての強度、波長などの測定)である。

0102

基本波ビームは、試料へと、様々な様式で送達することができる(例えば、その開示が参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第2002/0094528号を参照されたい)。和周波構成または差周波構成では、基本波ビームは、2つ以上のビームを含み、界面において、差周波ビームまたは和周波ビームを発生させることが理解される。

0103

別の態様によれば、基質位置(x,y)の関数としての情報が所望される場合は、電荷結合検出器(CCD)のアレイ検出器を使用することができる。CCDは、ピクセル(すなわち、フォトダイオード)のアレイを含み、その各々のピクセルは、その上への光の衝突を独立に測定しうる。所与の装置形状では、特定の基質位置(x,y)から生じる非線形光は、基質からある距離にあるCCD位置(Q,R)における非線形光の衝突の強度(これは、蛍光発光自発的で、確率的で、多方向的性格と比較して、コヒーレントで平行な(そして一般に基本波と共に共伝搬する)非線形光学ビームのために決定することができる)を測定することにより決定することができる。CCDアレイにより、検出器内の1または複数のアレイエレメント(10)が、基質表面の具体的な領域へとマップされることから、基質位置(x,y)の関数としての情報の容易な決定が可能となる。フォトダイオード検出器および光電子増倍管(PMT)、アバランシェフォトダイオードフォトトランジスター真空フォトダイオード、または入射光を電気的シグナル(すなわち、電流電圧など)へと変換するための、当技術分野で公知の他の検出器もまた、光強度を検出するのに使用することができる。CCD検出器では、CCDは、装置のコンピュータにインストールされたデータ収集ボードと連絡され、これにより制御される。データ収集ボードは、Computer BoardsInc.製のCIO−DAS16/Jrなど、当技術分野で周知の種類でありうる。データ収集ボードおよびCCDサブシステムは、例えば、以下の様式で作動しうる。データ収集ボードは、クロック信号をCCDサブシステムへと送信することにより、CCDの積分時間を制御する。一実施形態では、CCDサブシステムは、CCDの積分時間を、4096クロック周期に設定する。クロック速度を変化させることにより、CCDがデータを組み入れる実際の時間を、操作することができる。積分時間において、各フォトダイオードは、それに到達する光の量に比例する電荷を蓄積する。積分時間が終わると、電荷は、CCDのシフトレジスターへと転送され、新たな積分時間が始まる。シフトレジスターは、CCDアレイに入射する光パターンを表す電圧として、電荷を保存する。次いで、クロック速度で電圧をデータ収集ボードへと伝送し、そこで、電圧をデジタル化し、コンピュータのメモリに保存する。このようにして、各積分時間において試料ストリップを造影する。その後、試料を完全に走査するまで、後続の行を組み入れる。

0104

一態様では、SH光の検出器は、単一フォトンカウンティング方式で作動する光電子増倍管でありうる。光電流パルスは、電圧に変換し、増幅し、Model SR445 Fast PreamplifierおよびModel SR 400 Discriminator(Stanford Research Systems,Inc.により販売される)を使用して弁別にかけ、次いで、カウンターへと送信することができる。フォトンカウンターゲーティングとDAC出力を介する検流計の制御とは、デジタル遅延パルス発生器を使用して同期させることができる。PCコンピュータとの連絡は、パラレルレジスター、CAMACコントローラーカード、およびPCアダプターカードの使用を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の複数の方法により達成することができる。

0105

代替的な態様では、バンドパスフィルターノッチフィルター、またはカラーフィルターを、ビーム経路(例えば、基本波高調波、第二高調波など)のうちのいずれかまたは全てに配置して、例えば、スペクトルバンド幅の増大または光スループットの増大を可能とする。一実施形態では、干渉フィルター、ノッチパスフィルター、バンドパスフィルター、反射フィルター、または吸収フィルターを、図中のフィルターの代わりに使用して、基本波ビームまたは非線形光学ビームを通過させることもでき、遮断することもできる。

0106

本明細書で提供される方法のうちのいくつかの態様では、検出器により記録されるデータを、固定式またはデータ保存媒体を読み取るためのシステムを介してアクセス可能な固定式またはデータ保存媒体上に記録することができる。例えば、データ保存媒体を読み取るためのシステムは、中央処理装置(「CPU」)、例えば、RAM(ランダムアクセスメモリ)または「コア」メモリ、マスストレージメモリ(1または複数のディスクドライブまたはCD−ROMドライブなど)でありうる作業用メモリ、1または複数のディスプレイデバイス(例えば、ブラウン管(「CRT」)ディスプレイ、発光ダイオード(「LED」)ディスプレイ、液晶ディスプレイ(「LCD」)、エレクトロルミネセントディスプレイ、真空蛍光ディスプレイ、電界放出ディスプレイ(「FED」)、プラズマディスプレイプロジェクションパネルなど)、1または複数のユーザー入力デバイス(例えば、キーボードマイクロフォン、マウス、タッチスクリーンなど)、それらの全てが従来の双方向性システムバスにより相互接続された、1または複数の入力線、および1または複数の出力線を含むコンピュータを含みうる。システムは、単体のコンピュータの場合もあり、他のシステム(例えば、コンピュータ、ホスト、サーバーなど)へとネットワーク接続される(例えば、ローカルエリアネットワークワイドエリアネットワークイントラネットエクストラネット、またはインターネットを介して)場合もある。システムはまた、大衆消費電子製品および家庭用電気製品などのさらなるコンピュータ制御デバイスも含みうる。

0107

入力ハードウェアは、入力線によりコンピュータへとカップリングすることができ、様々な様式で実装することができる。本発明の機械可読データは、電話線または専用のデータ回線により接続された1または複数のモデムの使用を介して入力することができる。あるいは、または加えて、入力ハードウェアは、CD−ROMドライブまたはディスクドライブも含みうる。ディスプレイ末端と共に、キーボードもまた入力デバイスとして使用することができる。

0108

出力ハードウェアは、出力線によりコンピュータへとカップリングし、従来のデバイスにより同様に実装することができる。例として述べると、出力ハードウェアは、QUANTAなどのプログラムを使用して、本発明の活性部位の画像表示を表示するためのディスプレイデバイスを含みうる。出力ハードウェアはまた、ハードコピーの出力を作製しうるように、プリンターを含む場合もあろうし、後日の使用のためのシステム出力を保存するためのディスクドライブを含む場合もあろう。

0109

本発明において有用な機械可読の保存デバイスは、磁気デバイス電気デバイス光学デバイス、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。このようなデータ保存デバイスの例は、ハードディスクデバイス、CDデバイス、デジタルビデオディスクデバイス、フロッピー登録商標)ディスクデバイスリムーバブルハードディスクデバイス、磁気光学ディスクデバイス、磁気テープデバイス、フラッシュメモリデバイスバブルメモリデバイス、ホログラフィック保存デバイス、および他の任意のマスストレージ周辺デバイスを含むがこれらに限定されない。これらの保存デバイスは、データの保存を可能とするのに必要なハードウェア(例えば、ドライブ、コントローラー、電源など)ならびに任意の必要な媒体(例えば、ディスク、フラッシュカードなど)を含むことを理解されたい。

0110

当業者は、データを送受信または保存する他の任意の方法または技法もまた、候補モジュレーターに結合した後の標的タンパク質のコンフォメーション変化についてのリアルタイムのデータを、機械可読のフォーマットで提供するために想定されることを察知するであろう。

0111

B.SHGの検出および標識
Ti:Sフェムト秒レーザーからのビームを、当業者に公知の手順により、基本波として使用する。具体的には、パルス持続時間を約150fsとする80MHzおよび0.5Wの平均電力で作動するアルゴンポンプ式のTi:サファイアシステムを使用した(Coherent,Inc.)。ビームは、スライド−緩衝液間界面の地点へと優先的に焦点を当てる。表面が発生させる第二高調波光は、当業者に公知の手順により、集光し、基本波からフィルターで取り出し、光電子増倍管(PMT)で検出する。光退色に起因して強度を減衰させたベースラインのシグナルを記録する。基本波ビームの偏光を変化させて、最大のシグナル出力をもたらした。第二高調波としてのシグナルは、基本波強度に対するその二次依存を決定し、その特徴的なスペクトル線形を測定することにより検証した。各データ点は、フォトンをカウントする1秒間の積分時間を使用することにより得た。

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