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技術 タンパク質が結合した作用物質化合物のインタクト質量の測定

出願人 シアトルジェネティクス,インコーポレイティド
発明者 ジョンフェイバリエール-ダグラスオスカーサラス
出願日 2018年1月11日 (2年5ヶ月経過) 出願番号 2018-002748
公開日 2018年4月19日 (2年2ヶ月経過) 公開番号 2018-063265
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 その他の電気的手段による材料の調査、分析 クロマトグラフィによる材料の調査、分析 医薬品製剤
主要キーワード 周囲環境圧力 分解イオン 総サイクル 不揮発性酸 脱塩システム 不揮発性塩 囲み部分 エラー閾値
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2018年4月19日)のものです。
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図面 (13)

課題

本発明は、鎖間システイン残基への薬物コンジュゲートの結合から生じる非共有結合した抗体重鎖(HC)と軽鎖(LC)のインタクト質量の迅速な測定のための方法とシステムとを提供する。

解決手段

非変性脱塩条件下で抗体薬物コンジュゲートADC)を分析することにより、通常はLCMSのために典型的に使用される変性クロマトグラフィー条件の結果として分解するであろうADCのインタクト2価構造が維持される。次に、脱溶媒和化およびイオン化ESI−MS条件を使用して、脱塩されたADCの質量が決定される。本明細書に記載の方法は、鎖間システイン残基で結合したADCのインタクト質量の直接測定を提供する。本明細書に記載の方法はまた、個々のADC分子種相対的定量を提供する。

概要

背景

抗体薬物コンジュゲートADC)は、標的へのペイロード標的化送達のための化合物である。多くの例において、標的は腫瘍関連抗原(TAA)であり、ペイロードは薬物である。

IgG1やIgG2を含む様々なクラスの抗体が存在する。IgG1抗体及びIgG2抗体の構造は、2つの重鎖(HC)と2つの軽鎖(LC)とを含む。複合体として提示されるこれらの2つの重鎖と2つの軽鎖は、インタクト抗体を構成する。各IgG1抗体は12個の鎖内ジスルフィド結合と4個の鎖間ジスルフィド結合とを有し、これらは各抗体鎖上にあるそれぞれのシステイン酸化により形成される。重鎖と軽鎖との間に2つのジスルフィド結合が、そして重鎖と重鎖との間に2つのジスルフィド結合とがある。IgG1抗体の鎖間ジスルフィド結合の完全な還元は、非共有結合で維持される抗体複合体を与える。

IgG1抗体の鎖間ジスルフィド結合の完全な還元は、一般にリンカーを介して、薬物との結合のための8個の利用可能なチオールを与える。還元パラメータを変化させることにより、結合に利用できる0〜8個のチオールを有する抗体異性体を得ることができる。例えば、IgG1をDTTで還元すると、2、4、6、又は8個の利用可能なチオールを有する抗体を与えることができる。完全に還元されたADCは、水素結合イオン結合疎水結合、及びファンアワールス相互作用などの非共有結合により結びつけられ、変性条件(例えば逆相クロマトグラフィー)下で軽鎖と重鎖とに分離するであろう。完全には還元されていないADCは、共有結合と非共有結合とにより結びつけられる。共有的手段により結合された完全には還元されていないADCの部分はまた、変性条件下で分離することができる。

完全に搭載されたIgG1ADCは、抗体の鎖間ジスルフィドを構成する各システインに1つの薬物分子が結合しており、従って抗体1つあたり全部で8個の薬物がある。部分的に搭載されたADCは一般に、システイン残基に2、4、又は6個の薬物分子が結合している。部分的に搭載されたADCはまた、システイン残基に1、3、及び5個の薬物分子が結合していることも観察されている。搭載されたADCの構成断片の質量は質量分析法(MS)により測定されているが、インタクト搭載されたADCの質量の測定については、本発明が関連する分野においてまだ問題がある。

インタクト搭載されたADCの質量を直接測定するための方法は欠如しているが、搭載されたADCの質量を測定するための種々の間接的手段が知られている。例えば、ADCの質量は、典型的にはイオン対合性の酸(例えばトリフルオロ酢酸)を含有し、不揮発性酸界面活性剤試料から洗浄される(一般に脱塩と呼ばれる)ことを可能にする有機溶媒の存在下又は非存在下で、加熱された逆相高速液体クロマトグラフィーカラム(rp−HPLC)に試料(例えばADC)を結合させることにより、測定されている。この例では、疎水性タンパク質ドメインとrp−HPLCカラムの表面との相互作用が非極性有機溶媒により破壊される点まで溶媒有機物含量を上昇させることにより、タンパク質がrp−HPLCカラムから溶出される。この方法の望ましくない作用は、タンパク質試料を加熱、酸、及び有機溶媒(これらのいずれも、タンパク質を変性させタンパク質構造を破壊することができる)に付すことにより、これがタンパク質構造を破壊することである。非共有結合性タンパク質複合体は、rp−HPLCに付されると、共有性構成成分に分かれる。8個の鎖間結合したシステイン薬物を有するIgG1の場合、rp−HPLCカラム上での脱塩は、1個の鎖当たり3個の薬物を有する重鎖と1個の鎖当たり1個の薬物を有する軽鎖への、ADCの完全な解離を引き起こす。構成断片の質量は質量分析法(MS)により測定できるが、本発明が関連する分野では、インタクト物質の質量を測定するための技術が欠如している。

現在のMS技術は、一部は、これらの技術がタンパク質を変性させ、及び/又は本明細書で企図される用途には時間を使いすぎるため、インタクトADCの質量を測定するための技術が欠如している。タンパク質の固有電子噴霧イオン化ESI)MSの実質的にすべての方法は、標準的ESIで使用される加熱シース脱溶媒和ガスから発生し得るタンパク質構造の破壊を最小にするために、この方法がナノ噴霧スケール(100〜500ナノリットル/分の流速)で行われるべきであると記載する。従来法のナノ噴霧ESI−MS法を使用してADCの完全な質量を測定するための試料取り扱い法は、非常に時間がかかり、高処理能力化に適さない。抗体を脱グリコシル化する時間を含めなくても、質量測定値を得るために1試料につき少なくとも1時間がかかる。

概要

本発明は、鎖間システイン残基への薬物コンジュゲートの結合から生じる非共有結合した抗体重鎖(HC)と軽鎖(LC)のインタクト質量の迅速な測定のための方法とシステムとを提供する。非変性脱塩条件下で抗体薬物コンジュゲート(ADC)を分析することにより、通常はLCMSのために典型的に使用される変性性クロマトグラフィー条件の結果として分解するであろうADCのインタクト2価構造が維持される。次に、脱溶媒和化およびイオン化ESI−MS条件を使用して、脱塩されたADCの質量が決定される。本明細書に記載の方法は、鎖間システイン残基で結合したADCのインタクト質量の直接測定を提供する。本明細書に記載の方法はまた、個々のADC分子種相対的定量を提供する。

目的

この方法の望ましくない作用は、タンパク質試料を加熱、酸、及び有機溶媒(これらのいずれも、タンパク質を変性させタンパク質構造を破壊することができる)に付すことにより、これがタンパク質構造を破壊することである

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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この技術が所属する分野

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請求項1

[1]タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法であって、(a)不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非共有結合した非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程と、(b)該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程と、(c)該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析計により直接確立する工程と、を含む方法。

請求項2

請求項1に記載の方法を実施するように構成されたシステム

請求項3

明細書中に記載される発明。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2011年9月29日に出願された米国仮特許出願第61/540,839号と2012年9月12日に出願された米国仮特許出願第61/701,489号号(これらの開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる)の優先権と利益とを主張する。

背景技術

0002

抗体薬物コンジュゲートADC)は、標的へのペイロード標的化送達のための化合物である。多くの例において、標的は腫瘍関連抗原(TAA)であり、ペイロードは薬物である。

0003

IgG1やIgG2を含む様々なクラスの抗体が存在する。IgG1抗体及びIgG2抗体の構造は、2つの重鎖(HC)と2つの軽鎖(LC)とを含む。複合体として提示されるこれらの2つの重鎖と2つの軽鎖は、インタクト抗体を構成する。各IgG1抗体は12個の鎖内ジスルフィド結合と4個の鎖間ジスルフィド結合とを有し、これらは各抗体鎖上にあるそれぞれのシステイン酸化により形成される。重鎖と軽鎖との間に2つのジスルフィド結合が、そして重鎖と重鎖との間に2つのジスルフィド結合とがある。IgG1抗体の鎖間ジスルフィド結合の完全な還元は、非共有結合で維持される抗体複合体を与える。

0004

IgG1抗体の鎖間ジスルフィド結合の完全な還元は、一般にリンカーを介して、薬物との結合のための8個の利用可能なチオールを与える。還元パラメータを変化させることにより、結合に利用できる0〜8個のチオールを有する抗体異性体を得ることができる。例えば、IgG1をDTTで還元すると、2、4、6、又は8個の利用可能なチオールを有する抗体を与えることができる。完全に還元されたADCは、水素結合イオン結合疎水結合、及びファンアワールス相互作用などの非共有結合により結びつけられ、変性条件(例えば逆相クロマトグラフィー)下で軽鎖と重鎖とに分離するであろう。完全には還元されていないADCは、共有結合と非共有結合とにより結びつけられる。共有的手段により結合された完全には還元されていないADCの部分はまた、変性条件下で分離することができる。

0005

完全に搭載されたIgG1ADCは、抗体の鎖間ジスルフィドを構成する各システインに1つの薬物分子が結合しており、従って抗体1つあたり全部で8個の薬物がある。部分的に搭載されたADCは一般に、システイン残基に2、4、又は6個の薬物分子が結合している。部分的に搭載されたADCはまた、システイン残基に1、3、及び5個の薬物分子が結合していることも観察されている。搭載されたADCの構成断片の質量は質量分析法(MS)により測定されているが、インタクト搭載されたADCの質量の測定については、本発明が関連する分野においてまだ問題がある。

0006

インタクト搭載されたADCの質量を直接測定するための方法は欠如しているが、搭載されたADCの質量を測定するための種々の間接的手段が知られている。例えば、ADCの質量は、典型的にはイオン対合性の酸(例えばトリフルオロ酢酸)を含有し、不揮発性酸界面活性剤試料から洗浄される(一般に脱塩と呼ばれる)ことを可能にする有機溶媒の存在下又は非存在下で、加熱された逆相高速液体クロマトグラフィーカラム(rp−HPLC)に試料(例えばADC)を結合させることにより、測定されている。この例では、疎水性タンパク質ドメインとrp−HPLCカラムの表面との相互作用が非極性有機溶媒により破壊される点まで溶媒有機物含量を上昇させることにより、タンパク質がrp−HPLCカラムから溶出される。この方法の望ましくない作用は、タンパク質試料を加熱、酸、及び有機溶媒(これらのいずれも、タンパク質を変性させタンパク質構造を破壊することができる)に付すことにより、これがタンパク質構造を破壊することである。非共有結合性タンパク質複合体は、rp−HPLCに付されると、共有性構成成分に分かれる。8個の鎖間結合したシステイン薬物を有するIgG1の場合、rp−HPLCカラム上での脱塩は、1個の鎖当たり3個の薬物を有する重鎖と1個の鎖当たり1個の薬物を有する軽鎖への、ADCの完全な解離を引き起こす。構成断片の質量は質量分析法(MS)により測定できるが、本発明が関連する分野では、インタクト物質の質量を測定するための技術が欠如している。

0007

現在のMS技術は、一部は、これらの技術がタンパク質を変性させ、及び/又は本明細書で企図される用途には時間を使いすぎるため、インタクトADCの質量を測定するための技術が欠如している。タンパク質の固有電子噴霧イオン化ESI)MSの実質的にすべての方法は、標準的ESIで使用される加熱シース脱溶媒和ガスから発生し得るタンパク質構造の破壊を最小にするために、この方法がナノ噴霧スケール(100〜500ナノリットル/分の流速)で行われるべきであると記載する。従来法のナノ噴霧ESI−MS法を使用してADCの完全な質量を測定するための試料取り扱い法は、非常に時間がかかり、高処理能力化に適さない。抗体を脱グリコシル化する時間を含めなくても、質量測定値を得るために1試料につき少なくとも1時間がかかる。

発明が解決しようとする課題

0008

さらに、鎖間でシステイン結合したADCを分析するための公知の方法は、オンライン質量分析法(例えばHIC)に適していないか、又はクロマトグラフィー分離及び以後の質量測定(例えばrp−HPLC)中の結合した重鎖と軽鎖の変性的解離を引き起こす。従って、本発明が関連する分野には、システイン結合ADCのインタクト質量を日常的にかつ迅速に測定するための方法に対するニーズがある。

0009

驚くべきことに、本発明は、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート(protein agent conjugate)の質量を検出するための方法、装置、及びシステムを提供することにより、このニーズおよび関連分野の満たされていないニーズを満たす。

課題を解決するための手段

0010

ある形態において本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートの質量を検出するための方法を提供する。この方法は、不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非共有結合している非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程と、このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程と、このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立する工程とを含む。

0011

第2の携帯において本発明は、特に限定されないが、本明細書に記載の方法の1つを実施するように構成された質量分析計などのシステムを提供する。

図面の簡単な説明

0012

図1は、抗体と、ある形態において薬物、別の形態において標識物、さらに別の形態において毒素である作用物質との結合により産生される異性体を含む、0〜8のMRを有する種々の代表的ADCのIgG1構造を示す。抗体(図ではmAbとして表示される)(MR=0)のサブユニット間のジスルフィド結合は、ADC中の薬物に結合しており、非共有結合した2LC−2HC薬物結合分子種を与える。

0013

図2は、変性及び非変性条件下での、脱グリコシル化mAb−Aの質量測定に関連する未処理MSとデコンボリューションされた(deconvoluted)MSとを示す。変性条件下で得られた未処理MSとデコンボリューションされたMSデータはそれぞれパネルAとCに示され、非変性条件下で得られた未処理MSとデコンボリューションされたMSデータはそれぞれパネルBとDに示される。変性した抗体が明らかとなるであろう領域であるパネルB中の200〜3500m/z間で明らかなイオンは、脱グリコシル化のために使用されたPNGaseFと非イオン性界面活性剤ツイーン80との存在が原因である。

0014

図3は、変性及び非変性条件下での、脱グリコシル化マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチン(auristatin)F(mcMMAF)コンジュゲートADC−Aの質量測定に関連する未処理MSとデコンボリューションされたMSとを示す。変性条件下で得られた未処理MSとデコンボリューションされたMSデータはそれぞれパネルAとCに示され、非変性条件下で得られた未処理MSとデコンボリューションされたMSデータはそれぞれパネルBとDに示される。インタクトADC−Aについての多重荷電したイオンは、パネルB中の囲み部分で示され、パネルCとD中のデコンボリューションされたアーチファクト星印で示される。

0015

図4は、脱グリコシル化マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンF(mcMMAF)コンジュゲートADC−Aと、対応する親物質mAb−Aのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。非共有結合したADC構造は、MS中で対応するイオンの上に示される。

0016

図5は、脱グリコシル化mc−Val−Cit−PABモノメチルアウリスタチンE(vcMMAE)コンジュゲートADC−Bと、対応する親物質mAb−Bのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。非共有結合したADC構造は、MS中で対応するイオンの上に示される。

0017

図6は、デコンボリューションされた質量スペクトルからのMSに基づく定量とICにより分離された分子種のUV積分により測定される、IgG1ADC−Aに対するvcMMAF(パネルA)とIgG1 ADC−Bに対するvcMMAE(パネルB)のモル比相対的レベルを示す。

0018

図7は、脱塩したADCと、対応する出発物質の2重カラムSEC分析からのクロマトグラムの比較を示す。

0019

図8は、0、2、4、6、及び8のMR値を有するコンジュゲートの、塩濃度に対するvcMMAEの相対的パーセントを示す。

0020

図9は、HIC(パネルA)と次のSEC−MS(パネルB)による採取した画分の分析による、mcMMAFADCの分離の性状解析の結果を示す。

0021

図10は、HIC分離からの個々の画分の分析を示し、ADCポリペプチド鎖上の薬物結合の位置が、SEC−MSを使用して解離された断片の質量により評価できることを示す。

0022

図11は、MR=0、2、4、6、又は8を有するタンパク質作用物質コンジュゲートのデコンボリューションされたMS質量測定を示す。

0023

図12は、MR=0、2、4、又は6を有するタンパク質作用物質コンジュゲートのデコンボリューションされたMS質量測定を示す。

0024

I.総論
本発明は、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法を示す。これらの方法は、(a)マトリックス中でタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程と、(b)溶出したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程と、(c)質量分析法により、このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を直接確立する工程と、を含む。さらなる態様において、分離媒体は、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で適用して、マトリックスからタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を分離させる。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に変性していない。さらなる態様において、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、揮発性塩中で分離媒体から溶出される。

0025

I.定義
特に明記しない場合は、本明細書で使用されるすべて技術用語表記及び他の科学用語または専門用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合に、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために及び/または即時参照のために本明細書で定義されるが、そのような定義の包含は、必ずしも当技術分野で一般に理解されているものに対して実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照される技術及び手順の多くは、当業者によりよく理解され従来の方法論を用いて一般的に使用される。特に明記しない場合は、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は適宜、一般に、製造業者により規定されたプロトコル及び/またはパラメータに従って行われる。

0026

本明細書において商品名が使用される時、これは、商品名製品調合物、商品名製品のジェネリック医薬品及び活性医薬成分を、独立に含むことを意図する。

0027

本明細書において、略語「MR」は、例えばタンパク質又は抗体に結合した薬物分子の数をいう。例えば、MR=0は、あるタンパク質又はある抗体に0個の薬物分子が結合していることを意味する。MR=8は、あるタンパク質又はある抗体に8個の薬物分子が結合していることを意味する。MRは、0、1、2、3、4、5、6、7、及び8を含んでよい。

0028

特に明記しない場合は、本明細書において以下の用語及び語句は以下の意味を有することが意図される。

0029

本明細書において用語「ADC」は、抗体薬物コンジュゲートをいう。ADCの抗体部分は、抗原に対する特異性を有する。目的の抗原は、特に限定されないが、CD30、CD40、CD19、CD33、及びCD70を含む。

0030

本明細書において用語「タンパク質」は、典型的には3次元形に折り畳まれた1つ以上のポリペプチドを含み、生物学的機能を促進し得る化合物をいう。

0031

本明細書において用語「ポリペプチド」は、アミノ酸ポリマー及びその同等物をいい、特定の長さの生成物をいうものではない。すなわち「ペプチド」及び「タンパク質」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。またタンパク質の定義には、本明細書に記載の「抗体」も含まれる。「ポリペプチド領域」はポリペプチドの部分をいい、この部分は、例えば1つ以上のドメイン又はモチーフを含んでよい(例えば、抗体のポリペプチド領域は、例えば1つ以上のCDRを含むことができる)。

0032

本明細書において用語「断片」は、典型的には、ポリペプチドの少なくとも20個の連続アミノ酸又は少なくとも50個の連続アミノ酸を有するポリペプチドの部分をいう。

0033

本明細書において用語「非共有結合したタンパク質」は、ポリペプチド鎖間の少なくとも1つの共有結合が破壊されており、かつ完全な3次又は4次構造を維持しているタンパク質をいう。例えば、ADCについて、非共有結合したタンパク質は、鎖間ジスルフィド結合の還元を受けているが、その完全な構造を維持しているタンパク質である(すなわち、2つの重鎖が2つの軽鎖に結合されたままである)。ADCは、共有結合的相互作用と非共有結合的相互作用の複合体である。共有結合的相互作用は一部のADC、例えば2、4、又は6個の薬物が搭載されたADCで維持されている。2個の薬物を搭載を有するADCの例では、ADCは2個の重鎖と1個の軽鎖間に共有結合性鎖間ジスルフィドを有し、他の軽鎖−重鎖は非共有結合構造として存在する。同様に、4個の薬物が搭載されたADCの例では、これも重鎖と軽鎖間の共有結合的相互作用と非共有結合的相互作用との複合体である。

0034

本明細書において用語「タンパク質作用物質コンジュゲート化合物」は、作用物質に結合したタンパク質を含む化合物をいう。タンパク質は、特に限定されないが、抗体、抗体断片Fc融合タンパク質、又は非共有結合タンパク質複合体でもよい。ある形態において、タンパク質は抗体でもよい。別の形態において、タンパク質は抗体断片である。他の形態において、タンパク質はFc融合タンパク質でもよい。さらに別の形態において、タンパク質は、共有結合によっては結合されていないサブユニットの複合体から構成されてもよい。これらのタイプのタンパク質の例は、2つのアルファ鎖と2つのベータ鎖非共有結合的に結合したテトラマーアセンブリーであるヘモグロビン、テトラマーであるコンカナバリンA、及びダイマーであるエストロゲン受容体である。Fcタンパク質は、Fcダイマーへの機能性タンパク質又はタンパク質ドメイン移植を含み、ここでFcモノマーは、Fcのヒンジ領域でシステイン残基により結合される。このタンパク質は、共有結合によっては結びつけられておらず、非共有結合によってのみ結びつけられている4次構造を有してもよい。例はヘモグロビンであり、これは、変性条件下で解離させることができる4個のサブユニットからなる。ヘモグロビンのシステインは、薬物と結合してもよいが、抗体とは異なり、システインは、サブユニット構造を共有結合により結びつけることには実際には参加していない。

0035

本明細書において用語「作用物質」は、薬物、標識物、毒素などをいう。

0036

本明細書において用語「マトリックス」は、タンパク質又はタンパク質作用物質コンジュゲート化合物が存在する背景又は環境をいう。例えば、「マトリックス」は、調製緩衝液生物学的血清、界面活性剤、賦形剤、又は細胞培養培地を含む。

0037

本明細書において用語「非変性条件」は、タンパク質(例えば抗体)がその2次、3次、又は4次構造を喪失しない条件をいう。非変性条件は、熱的展開を引き起こすような過剰レベルの熱(例えば50℃以上)や極端なpH(例えばpH5未満及びpH8超)が存在しないことを含む。

0038

本明細書において用語「非変性タンパク質」は、その2次、3次、及び適宜4次構造を維持しているタンパク質(例えば抗体)を意味する。

0039

本明細書において用語「還元されたタンパク質」(例えば抗体)は、鎖間ジスルフィド結合が破壊されているタンパク質をいう。

0040

本明細書において用語「変性タンパク質」(例えば抗体)は、タンパク質がその2次、3次、又は4次構造を喪失したタンパク質である。

0041

本明細書において用語「実質的に」は、デコンボリューションされた質量スペクトルからのMSに基づく定量、及びHICにより分離された分子種のUV積分により測定されるモル比の相対レベルにより測定される量の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、又は10%を意味し、このタンパク質(例えば抗体)は、分離媒体工程(例えばSEC)後に変性されない。

0042

本明細書において用語「溶離液」は、クロマトグラフィーカラム固定相からアナライトを解離させる液体移動相をいう。アナライトは、特に限定されないが、測定すべき目的の化合物を含む。

0043

本明細書において用語「直接」は、完全な4元集合体(例えば、抗体複合体などのインタクト物質)の質量を測定することを含む、タンパク質の質量を確立する状況をいう。

0044

本明細書において用語「間接的」は、4元集合体を構成するサブユニット(例えば、抗体の軽鎖と重鎖)の質量を測定し、これらの質量を一緒に加えてインタクト物質の数を求めることにより、タンパク質の質量を測定することを意味する。

0045

「脱塩」は、不揮発性塩、賦形剤、及び/又は界面活性剤からタンパク質(タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を含む)試料を分離することをいう。

0046

「揮発性塩」は、周囲環境圧力(1気圧)で気相に入る塩をいう。揮発性塩は、例えばギ酸アンモニウム酢酸アンモニウム炭酸アンモニウムを含む。

0047

「界面活性剤」は、特に限定されないが、マトリックスの不揮発性化合物をいう。例えば界面活性剤は、非イオン性及び双性イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート20(「ツイーン20」)及びポリソルベート80(「ツイーン80」)を含む。

0048

カオトロピック剤」は、タンパク質間の及びタンパク質内のサブドメイン間の水素結合、ファンデアワールス力、及び疎水性相互作用不安定化させこうして変性を引き起こす化学物質をいう。化合物の例は、特に限定されないが、グアニジン−HCl、尿素、及び当業者に公知の他の化合物を含む。

0049

「賦形剤」は、糖及びポリオール、例えばショ糖トレハロース、及びソルビトールなどの化合物を含む。

0050

「質量分析法」(MS)は、荷電粒子質量電荷比を測定するために使用される分析技術である。これは、タンパク質の1次構造を解明するために使用してもよい。

0051

液体クロマトグラフィー」又は「LC」は、混合物の分離のための方法をいう。混合物は、固定相と呼ばれる構造中をタンパク質を運搬する移動相と呼ばれる流体に溶解される。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の場合、混合物の種々の成分は異なる速度で移動し、これが分離を引き起こす。分離は、移動相と固定相間の示差的配置に基づく。

0052

「サイズ排除クロマトグラフィー」(SEC)は、分子がそのサイズにより分離され、他の分離パラメータ(例えば分子量又は極性)によっては分離されないクロマトグラフィー法をいう。これは、タンパク質などの大きな分子に適用される。サイズ排除クロマトグラフィーでは、塩は主に移動相として使用される。ある場合には、移動相内に有機物質及びカオトロピック剤も存在してもよい。固定相は通常、特に限定されないが、以下の1つである:架橋ポリスチレン誘導体化シリカアクリルヒドロキシル化アクリル、アクリル、アガロース、又はポリヒドロキシオキシエチルアスパルトアミド骨格樹脂骨格は、任意の数の分子種を用いて誘導体化され、誘導体化剤の選択は典型的には、分離すべきアナライトと、化合物のサイズ以外の分離パラメータに基づく分離法で使用されるであろうカラムとの、望ましくない分子的相互作用を低下させる必要性により決定される。

0053

本明細書において用語「質量分析法に適合性揮発性SEC緩衝液」は、MSで使用するのに適合したSEC用の移動相をいう。

0054

本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で本発明が関連する分野で使用される抗体をいい、特に、モノクローナル抗体ポリクローナル抗体多重特異的抗体(例えば、二重特異的抗体)、及び抗体断片を包含する。抗体は、ネズミ、ヒト、ヒト化キメラ、又は他の種由来でもよい。

0055

本明細書において用語「抗体」はまた、完全長免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、目的の標的の抗原又はその部分に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子をいい、そのような標的は、特に限定されないが、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。本明細書に開示される免疫グロブリンは、任意のタイプ(例えば、IgG、IgEIgMIgD、及びIgA)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又は免疫グロブリン分子のサブクラスでもよい。

0056

本明細書において用語「抗原断片」は、特に限定されないが、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;Fc、半Fc(1/2)、ダイアボディ;線状抗体;Fab発現ライブラリーにより産生される断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、CDR(相補性決定領域)、ECD(細胞外ドメイン)、及び癌細胞抗原ウイルス抗原もしくは微生物抗原に免疫特異的に結合する上記のいずれかのエピトープ結合断片;1本鎖抗体分子;及び抗原断片から形成される多重特異的抗体を含む。

0057

本明細書において「インタクト抗体」は、VL及びVHドメインと、完全な軽鎖及び重鎖定常ドメインとを含み、少なくとも1種の非共有結合性相互作用を介して結合している抗体をいう。「インタクト抗体断片」は、少なくとも1種の非共有結合性相互作用を介して結合している完全長抗体の一部を含む。

0058

用語「鎖間ジスルフィド結合」は、抗体の文脈において、2つの重鎖間、又は重鎖と軽鎖間のジスルフィド結合をいう。

0059

用語「鎖内ジスルフィド結合」は、抗体の文脈において、同じポリペプチド鎖上の2つのシステイン残基から形成されるジスルフィド結合をいう。

0060

用語「鎖間チオール」は、鎖間ジスルフィド結合の形成に参加することができる抗体の重鎖又は軽鎖のチオール基をいう。

0061

本明細書において用語「モノクローナル抗体」又は「mAb」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原性部位に向けられている。さらに、異なる決定基エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられている。

0062

本明細書においてモノクローナル抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導される抗体、又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同的であり、鎖の残りは別の種から誘導される抗体、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同的である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体の断片を含む。

0063

インタクト抗体は、抗体のFc領域未変性の配列Fc領域又はアミノ酸配列変種Fc領域)に帰因する生物活性をいう1つ以上の「エフェクター機能」を有することができる。抗体のエフェクター機能の例は、特に限定されないが、C1q結合;補体依存性細胞障害Fc受容体結合;抗体依存性細胞障害ADCC);食作用;及び細胞表面受容体(例えばB細胞受容体;BCR)のダウンレギュレーションを含む。

0064

抗体は、抗体の融合タンパク質、又はその機能活性断片でもよい。例えば抗体は、N末端又はC末端で、抗体ではない別のタンパク質のアミノ酸配列(又はその一部、例えばそのタンパク質の少なくとも10、20、又は50アミノ酸の部分)に、共有結合(例えばペプチド結合)を介して融合されてよい。抗体又はその断片は、定常ドメインのN末端で他のタンパク質に共有結合されてよい。

0065

本明細書において用語「融合タンパク質」は、また文脈で、結合ドメインIg融合体をいい、ここで、結合ドメインは、例えばリガンド、受容体の細胞外ドメイン、ペプチド、天然に存在しないペプチドなどでもよいが、但し、結合ドメインは抗体の可変ドメインを含まない。本明細書に記載のタンパク質及び抗体と同様に、融合タンパク質のIg部分は、少なくとも1つの還元性ジスルフィド結合を含まなければならない。ある形態においてIgドメインは、抗体のFc領域であろう。ドメイン−Ig融合タンパク質の例は、sTNFRIIとFc領域との融合タンパク質であるエタネルセプト(米国特許第5,605,690号)、抗原提示細胞上に発現されたLFA−3とFc領域との融合タンパク質であるアレフセプト(米国特許第5,914,111号)、細胞毒性Tリンパ球関連抗原−4(CTLA−4)とFc領域との融合タンパク質(J. Exp. Med. 181:1869 (1995))、インターロイキン−15とFc領域との融合タンパク質(J. Immunol. 160:5742 (1998))、第VII因子とFc領域との融合タンパク質(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12180 (2001))、インターロイキン−10とFc領域との融合タンパク質(J. Immunol. 154:5590 (1995))、インターロイキン2とFc領域との融合タンパク質(J. Immunol. 146:915 (1991))、CD40とFc領域との融合タンパク質(Surgery 132: 149 (2002))、Flt−3(fms様チロシンキナーゼ)と抗体Fc領域との融合タンパク質(Acta. Haeraato. 95:218 (1996))、OX40と抗体Fc領域との融合タンパク質(J. Leu. Biol. 72:522 (2002))、及び、他のCD分子(例えばCD2、CD30(TNFRSF8)、CD95(Fas)、CD106(VCAM−I)、CD137)、接着分子(例えばALCAM(活性化白血球接着分子)、カドヘリンICAM(細胞内接着分子)−l、ICAM−2、ICAM−3)サイトカイン受容体(例えばインターロイキン−4R、インターロイキン−5R、インターロイキン−6R、インターロイキン−9R、インターロイキン−10R、インターロイキン−12R、インターロイキン−13Rアルファ1、インターロイキン−13Rアルファ2、インターロイキン−15R、インターロイキン−21Rアルファ)、ケモカイン細胞死滅誘導シグナル分子(例えばB7−H1、DR6(Death receptor 6)、PD−1(Programmed death−1)、TRAILRl)、同時刺激分子(例えばB7−1、B7−2、B7−H2、ICOS(誘導性同時刺激物質))、増殖因子(例えばErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR)、分化誘導因子(例えばB7−H3)、活性化因子(例えばNKG2D)、シグナル伝達分子(例えばgp130)、BCMA、及びTACIとの融合タンパク質を含む。

0066

略語「MMAE」は、モノメチルアウリスタチンEをいう。

0067

略語「MMAF」は、ドバリン−バリン−ドライソロシンドラロインフェニルアラニンをいい、モノメチルアウリスタチンFともいわれる。

0068

用語「標識物」は、抗体に共有結合されることができる部分であり、かつ(i)検出可能なシグナルを与える、(ii)第2の標識物と相互作用して、第1又は第2の標識物、例えばFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)により与えられる検出可能なシグナルを修飾する、(iii)抗原又はリガンドとの相互作用を安定させるか又は結合の親和性を上昇させる、(iv)電荷疎水性、形、又は他の物理的パラメータにより、移動度(例えば電気泳動移動度)又は細胞透過性に影響を与える、又は(v)捕捉部分を与えて、リガンド親和性、抗体/抗原結合、又はイオン錯体形成を調節する、ように機能する部分を意味する。

0069

抗体は、システインチオールを介して抗体に共有結合することができる任意の標識物部分と結合してもよい。診断用途では、抗体は典型的には検出可能な部分で標識されるであろう。

0070

「薬物」又は「薬物部分」は、任意の細胞毒性、細胞増殖抑制性、又は免疫調節性(例えば、免疫抑制)薬物でもよい。多くの例において、薬物は、リンカーを介して抗体に結合される。例えばリンカーは、米国特許第7,754,681号、7,375,078号、7,829,531号、7,659,241号、7,851,437号、7,829,531号、7,659,241号、7,498,298号、7,994,135号、7,964,567号、及び7,964,567号(これらのそれぞれは、参照することにより及びすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。ある形態においてリンカーは、バリン−シトルリン(「Val−Cit」又は「vc」)である。別の形態においてリンカーは、マレイミドカプロイル(「mc」)である。
II.方法

0071

ここで、いくつかの態様が詳細に参照される。列挙された態様に関連して本発明が説明されるが、これらが、本発明をこれらの実施形態に限定するものではないことは理解されるであろう。それどころか、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物修正物、及び等価物を包含することを意図している。

0072

当業者は、本発明の実施において使用され得る多くの方法、及び本明細書に記載のものと類似または同等の物質を認識するであろう。本発明は、記載される方法及び物質に限定されるものではない。

0073

ある態様において本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法を提供する。ある態様において本方法は以下の工程を含む:(a)不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非共有結合した非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程、(b)このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程、及び(c)このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立する工程。

0074

ある態様において本発明は、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法を提供する。ある態様において本方法は以下の工程を含む:(a)不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程、(b)このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程、及び(c)このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立する工程。

0075

本明細書に記載のある方法では、この方法はさらに、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物のための非変性条件下で分離媒体を適用して、マトリックスからタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行うことを含み、従って、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に変性しない。他の態様において本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物のための非変性条件下で分離媒体を導入して、マトリックスからタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行う工程を含み、従って、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に変性しない。

0076

本明細書に記載の方法のある態様において、この方法は、分離媒体から、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を溶出する方法を含む。ある態様において非変性条件は、質量分析法に適合性のある揮発性SEC緩衝液を含む。あるさらなる態様において、揮発性塩はギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又は炭酸アンモニウムを含む。ある態様において、揮発性塩はギ酸アンモニウムである。他のある態様において、揮発性塩は酢酸アンモニウムである。他の態様において、揮発性は炭酸アンモニウムである。他のある態様において、揮発性塩は、本明細書に記載の揮発性塩の混合物である。

0077

ある態様において本発明は、マトリックスが不揮発性塩、界面活性剤、又は緩衝液を含んでなる、本明細書に記載の方法を提供する。

0078

本明細書に記載した方法のさらなる態様において、本発明は、デコンボリューションされたイオン強度により、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の相対分布を定量することを含む方法を提供する。これらのある態様において本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の相対分布を定量することを含む方法を提供する。これらのある態様において本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の相対分布を定量するために、本明細書に記載のアッセイのイオン強度をデコンボリューションすることを含む方法を提供する。

0079

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が抗体薬物コンジュゲートを含むことを記載する。

0080

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、マトリックスが調合物を含むことを記載する。ある態様において、マトリックスは調合物である。

0081

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、分離媒体がサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を含むことを記載する。ある態様において、分離媒体はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)である。本明細書に記載のいくつかの方法において、本方法は、本明細書に記載の、タンパク質作用物質コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離する工程を含む。

0082

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、作用物質が、薬物、毒素、又は標識物を含むことを記載する。本発明のいくつかの態様において、作用物質は薬物である。本発明のいくつかの他の態様において、作用物質は毒素である。本発明のいくつかの他の態様において、作用物質は標識物である。ある態様において作用物質は、本明細書に記載の任意の作用物質の組合せである。

0083

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、SECが、シリカ、ポリスチレンジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドカラムを含むことを記載する。ある態様において、SECはシリカカラムを含む。他のある態様において、SECはポリスチレン−ジビニルベンゼンカラムを含む。他のある態様において、SECはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドカラムを含む。

0084

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、非変性条件が50℃の温度を含むことを記載する。ある態様において、非変性条件の温度は50℃以下である。ある態様において、非変性条件の温度は室温である。室温は、特に限定されないが、20〜24℃の温度を含む。

0085

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、質量分析法がESI−MSで行われることを記載する。他の態様において、本発明は、質量分析法が、分析すべき試料をMSに送るためのクロマトグラフ又は噴霧ノズルなどの別の器具に結合されている質量分析計で行われることを記載する。

0086

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、揮発性塩の濃度が50〜400mMであることを記載する.ある態様において、揮発性塩の濃度は50mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は400mMである。ある態様において揮発性塩の濃度は、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、1 15、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、又は400mMである。ある態様において揮発性塩の濃度は、約50〜約400mMである。本文脈において、約は、約という単語で修飾される値の10%以内の値をいう。例えば、約50mMは、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、及び55mMを含む。例えば.約400mMは、360、370、380、390、400、410、420、430、及び440mMを含む。ある態様において、揮発性塩の濃度は、約50〜約300mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約50〜約200mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約50〜約100mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約100〜約400mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約200〜約400mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約300〜約400mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約50〜約100mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約50〜約200mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約50〜約300mMである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約50〜約350mMである。

0087

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、溶出されたタンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、直ちに質量分析計に導入される。

0088

本明細書に記載の方法のある態様において、溶出されたタンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、連続的に質量分析計に導入される。ある態様において分離媒体は、非変性条件下で運転されるHICカラムである。他の態様において、SECはポリヒドロキシエチル−Aカラムである。

0089

本明細書に記載の方法のいくつかのさらなる態様において、SECカラムのサイズは、内径0.1〜7.8mmで長さ100〜300mmである。

0090

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を脱グリコシル化試薬で処理する工程を含む。ある態様において、脱グリコシル化試薬はPNGaseFである。他の態様において、脱グリコシル化剤は、エクソグリコシダーゼ酵素処理、エンドグリコシダーゼ処理、又はN−グリカン上の第1N−アセチルグルコサミン残基と第2N−アセチルグルコサミン残基との間を切断する酵素処理を含む。

0091

本明細書に記載のいくつかの態様において、エクソグリコシダーゼ酵素処理は、シアリダーゼ又はベータガラクトシダーゼを含む。

0092

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、N−グリカン上の第1N−アセチルグルコサミン残基と第2N−アセチルグルコサミン残基との間を切断する酵素処理は、Endo−F1、F2、又はF3を含む。

0093

本明細書に記載の方法のいくつかのさらなる態様において、揮発性塩のpHは5.5〜7.0である。他の態様において本明細書に記載の方法は、揮発性塩のpHが、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、又は7.0である工程を含む。本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、揮発性塩のpHは6.0である。本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、揮発性塩のpHは6.5である。本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、揮発性塩のpHは7.0である。

0094

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本方法は、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を、質量分析法により定量することを含む。

0095

本明細書に記載の方法のいくつかのさらなる態様において、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、重鎖又は軽鎖抗体断片を含む。これらのある態様において、重鎖又は軽鎖抗体断片は、1つ以上の薬物をさらに含む。

0096

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、抗体薬物コンジュゲートの抗体は抗体断片である。

0097

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、抗体断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、ダイアボディ、線状抗体、又は1本鎖抗体分子から選択される。本明細書に記載のいくつかの態様において、抗体は、抗CD30、抗CD40、抗CD19、抗CD33、又は抗CD70抗体からなる群から選択される。他の態様において、抗体薬物コンジュゲートの抗体はヒト化抗体である。ある態様において、抗体薬物コンジュゲートの抗体はヒト化抗体を含む。

0098

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、7.5Da以内で測定される。他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は25Da以内で測定される。ある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9、20.0、20.1、20.2、20.3、20.4、20.5、20.6、20.7、20.8、20.9、21.0、21.1、21.2、21.3、21.4、21.5、21.6、21.7、21.8、21.9、22.0、22.1、22.2、22.3、22.4、22.5、22.6、22.7、22.8、22.9、23.0、23.1、2、23.3、23.4、23.5、23.6、23.7、23.8、23.9、24.0、24、1、24.2、24.3、24.4、24.5、24.6、24.7、24.8、24.9、25.0、25.1、25.2、25.3、25.4、25.5、25.6、25.7、25.8、又は25.9Da以内で測定される。

0099

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、8.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、9.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、10.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、11.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、12.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、13.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、14.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、15.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、16.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、17.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、18.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、19.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、20.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、21.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、22.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、23.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、24.0Da以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、25.0Da以内で測定される。

0100

本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、理論値の100ppm以内で測定される。他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、理論値の80、90、100、110、120、又は130ppm以内で測定される。

0101

本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートの未変性のインタクト質量をアッセイする方法を示す。本発明はまた、タンパク質作用物質コンジュゲートの未変性のインタクト質量をしてする方法を示す。

0102

本発明は、不揮発性塩を含まない揮発性塩中で非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供し、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計中に導入し、そしてタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立することにより、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法を示す。

0103

本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらの態様の1つにおいて、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、ギ酸アンモニウム中である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、酢酸アンモニウム中である。これらの態様の他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、炭酸アンモニウム中である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性であり炭酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性でありギ酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性であり酢酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物である。

0104

本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計中に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらの態様の他のいくつかにおいて、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性で炭酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物の断片である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性でギ酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物の断片である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性で酢酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物の断片である。

0105

本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計中に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらの任意の態様において、薬物はMMAE又はMMAFを含む。

0106

関連する態様において、本明細書に記載の方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が、非変性の抗体抗体作用物質コンジュゲート化合物であることを記載する。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において本発明は、薬物が、特に限定されないが、MMAE又はMMAFを含む方法を提供する。これらの任意の態様において、本発明は、薬物がMMAEである方法を提供する。これらの任意の態様において、本発明は、薬物がMMAFである方法を提供する。

0107

本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性である。いくつかの他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中であり、作用物質は毒素である。いくつかの他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中であり、作用物質は毒素である。いくつかの他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中であり、作用物質は毒素である。これらの任意の態様において、本発明は、作用物質が毒素である方法を提供する。これらの任意の態様において、本発明は、塩の濃度が任意選択的に50〜400mMである方法を提供する。これらの任意の態様において、本発明は、作用物質が薬物である方法を提供する。

0108

本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性の抗体作用物質コンジュゲート化合物である。これらの任意の態様において、本発明は、塩の濃度が50〜400mMである方法を提供する。これらのある態様において、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。

0109

本明細書に記載のこれらの任意の態様において、本方法は、コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される工程を含んでよい。

0110

本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。いくつかの態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性の抗体作用物質コンジュゲート化合物である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。いくつかの態様において、塩の濃度は50〜400mMである。いくつかの態様において、塩の濃度は200mMである。他の関連する態様において、作用物質は薬物である。他の態様において、緩衝液のpHは5.0〜7.0である。これらの任意の態様において、本発明は、作用物質が薬物でもよい方法を提供する。

0111

本明細書に記載の方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性でギ酸アンモニウム中にある抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、塩の濃度は200mMであり、作用物質は薬物であり、そして緩衝液のpHは5.0〜7.0である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。

0112

本発明の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性で酢酸アンモニウム中にある抗体作用物質コンジュゲート化合物である。いくつかの態様において、塩の濃度は200mMであり、緩衝液のpHは5.0〜7.0であり、そして作用物質は薬物である。

0113

本明細書に記載の方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性の抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、塩の濃度は200mMであり、作用物質は薬物であり、緩衝液のpHは6.5である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。これらのある態様において、作用物質は薬物を含み、ここで薬物は本明細書に記載の薬物である。

0114

本発明のある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行う。いくつかの態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、コンジュゲートは質量分析計に導入され、そしてインタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。

0115

本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。本明細書に記載の方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、こうしてタンパク質作用物質コンジュゲートは実質的に非変性である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物はギ酸アンモニウム中である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は炭酸アンモニウム中である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は酢酸アンモニウム中である。関連する態様において、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行う。関連する態様において、分離媒体はSECである。

0116

上記方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が非変性であり、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従ってタンパク質作用物質コンジュゲート化合物が実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のHICであることを含んでよい。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中である。

0117

上記方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が非変性であり、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従ってタンパク質作用物質コンジュゲート化合物が実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のHICであることを含んでよい。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。本明細書に記載の任意の方法において、分離媒体はSECを含んでよい。

0118

上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物が実質的に非変性であり、分離媒体はHICである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0119

タンパク質コンジュゲートが質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本方法のある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲートは実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のHICである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0120

タンパク質コンジュゲートが質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本方法のある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲートは実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のHICである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。関連する態様において、分離媒体はSECであり、質量分析計はESI−MSである。

0121

上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、コンジュゲートは質量分析計に導入され、質量分析計はESI−MSであり、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物は直接測定される。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0122

上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0123

上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のHICであり、コンジュゲートは質量分析計に導入され、質量分析計はESI−MSである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0124

上記方法のいずれかにおいて、本方法は、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される工程を含んでよい。上記方法のいずれかにおいて、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0125

上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のHICである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。関連する態様において、質量分析計はESI−MSである。いくつかの他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは連続的に質量分析計に導入される。

0126

タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される本明細書に記載のいずれかの方法において、コンジュゲートは連続的な方法で導入されてよい。タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される本明細書に記載のいずれかの方法において、コンジュゲートは連続的に導入されてよい。

0127

上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、質量分析計はESI−MSである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0128

ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のHICである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0129

本明細書に記載のいずれかの形態において、質量分析計はESI−MSである。

0130

上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のHICである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。他の関連する態様において、質量分析計はESI−MSである。

0131

本発明は、分離媒体がSECであり、タンパク質コンジュゲートが質量分析計に導入され、質量分析計がESI−MSであり、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、抗体薬物コンジュゲート化合物の質量が定量される、方法を提供する。別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。他の関連する態様において、分離媒体は非変性条件下のHICである。

0132

ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲートは抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドであり、抗体作用物質コンジュゲート化合物は質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0133

上記方法のある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECである。関連する態様において、SECはシリカである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。他の関連する態様において、SECはポリスチレン−ジビニルベンゼンを含む。

0134

抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法はさらに、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドであることを、含んでよい。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0135

抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法はさらに、以下の形態を含んでよい。別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0136

関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは任意選択的に脱グリコシル化されており、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。

0137

抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される方法の別の形態において、本方法はさらに、以下の形態を含んでよい。別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは脱グリコシル化されており、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性である。他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中であり、炭酸アンモニウムの濃度は50〜400mMである。他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中であり、炭酸アンモニウムの濃度は50〜400mMである。他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中であり、炭酸アンモニウムの濃度は50〜400mMである。

0138

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートが炭酸アンモニウムであり、炭酸アンモニウムの濃度が50〜400mMであることを規定してもよい。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートが酢酸アンモニウムであり、酢酸アンモニウムの濃度が50〜400mMであることを規定してもよい。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートがギ酸アンモニウムであり、ギ酸アンモニウムの濃度が50〜400mMであることを規定してもよい。

0139

抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法はさらに、以下の形態を含んでよい。ある形態において、分離媒体は、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件を有し、適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECである。関連する態様において、SECカラムはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートが炭酸アンモニウムであり、炭酸アンモニウムの濃度が50〜400mMであることを規定してもよい。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートが酢酸アンモニウムであり、酢酸アンモニウムの濃度が50〜400mMであることを規定してもよい。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートがギ酸アンモニウムであり、ギ酸アンモニウムの濃度が50〜400mMであることを規定してもよい。

0140

関連する態様において、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートが非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物が実質的に非変性であり、分離媒体はがECであり、SECカラムがシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである、方法を提供する。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が50〜400mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が50〜400mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が50〜400mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中である。他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中である。

0141

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が50mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が50mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が50mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中であることを、本方法が任意選択的に含んでよいことを規定する。

0142

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が150mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が150mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が150mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中であることを、本方法が任意選択的に含んでよいことを規定する。

0143

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が250mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が250mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が250mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中であることを、本方法が任意選択的に含んでよいことを規定する。

0144

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が400mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が400mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が400mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中であることを、本方法が任意選択的に含んでよいことを規定する。

0145

抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、かつ質量分析計がESI−MSである本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法は、以下の形態を含んでよい。ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中である。

0146

抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、かつ質量分析計がESI−MSである本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法は、以下の形態を含んでよい。ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中である。

0147

抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、かつ質量分析計がESI−MSである本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法は、以下の形態を含んでよい。ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物で、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中である。

0148

本明細書に記載のいくつかの方法において、抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中である。

0149

抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、かつ質量分析計がESI−MSである本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法は、以下の形態を含んでよい。本明細書に記載の方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、作用物質は薬物であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はSECであり、SECカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が250mMでpHが6.5である酢酸アンモニウム中である。

0150

いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物のインタクト質量の迅速測定を含む。ある態様において、重鎖(HC)と軽鎖(LC)の抗体作用物質コンジュゲート化合物は、抗体の還元と以後の鎖間システイン残基への薬物の結合により生じる複合体として存在する。本明細書に記載の方法は、ADCのインタクト2価構造が維持される固有の脱塩条件を使用して、ADCを分析する工程を含んでよい。本発明のさらなる態様は、次に、脱溶媒和化イオン化条件を使用して、脱塩されたADCの質量が測定される工程を含む。これらのある態様において、脱溶媒和化とイオン化条件は、標準的脱溶媒和化とイオン化条件である。

0151

本明細書に記載の方法は、脱塩と質量測定法に基づいて半固有サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を提供することにより、システイニル結合ADCを分析することを含んでよい。この方法はまた、鎖間システイン結合ADCのインタクト質量を測定し、デコンボリューションされたイオン強度により薬物結合分子種の相対分布を定量することを含んでよい。本明細書に記載の方法は、ADCの高処理能力質量測定に適合させてもよい。

0152

本明細書に記載の方法は、ADCを脱グリコシル化する任意の工程を含んでよい。脱グリコシル化工程は、PNGaseF又は当業者に公知の他の化合物を使用することを含んでよい。本明細書に記載の方法は、グリカンの不均一性を排除する工程を含んでよい。ある実施態様において、本方法は、各薬物搭載分子種の改善された又は強化された又はより大きなシグナル強度を与える。さらなる態様において、本方法は定量する工程を含む。本発明は、上昇したMSシグナル強度のために、脱グリコシル化がより良好な質量の正確性を可能にする方法を提供する。

0153

任意の脱グリコシル化以外に、本明細書に記載の方法は分離媒体工程を含んでよい。分離媒体工程は、例えばSEC又はHICなどの種々のクロマトグラフィー法を含む。この工程においてADCは、緩衝液系から、質量測定のために基礎アミノ酸の陽性荷電を支持する揮発性塩に交換される。これらのある態様において、不揮発性塩、界面活性剤、及び緩衝液はADCから除去される。他の形態において、SECを非変性条件下で使用してクロマトグラフィー工程が行われ、揮発性塩へのADCの緩衝液交換が可能になる。

0154

本明細書に記載の方法は、質量分析工程を含んでよい。ある形態において、MS工程は、分離媒体工程の直後に行われてよい。他の形態において、分離媒体工程とMS工程との間に介在工程があってもよい。さらに別の形態において、MS工程は、分離媒体工程後に連続してもよい。MS工程では、ADCの質量が測定される。さらに本明細書に記載の方法は、定量的薬物搭載が豊富なMSイオン量を介して測定されることを規定してもよい。ある形態において、MSは、TOF−MS、Q−TOF、FTICR、Orbitrap、又は高分解イオン捕捉MSで行われる。この工程では、質量は高分解能質量分析計を用いて測定され、多重荷電(m/z)データはゼロ荷電質量スペクトルにデコンボリューションされる。個々の薬物搭載分子種は、未処理の生データの強度の積であるデコンボリューションされたスペクトルのイオン強度に基づいて定量される。タンパク質からのESI−MS生データは、典型的には、ある単一の分子種が、そこに結合したいくつかのイオンを有し、各関連イオンは陽性荷電の数が異なる連続荷電イオンとして視覚化される。生データのデコンボリューションは、各イオンが運搬している電荷の数を測定し、すべての関連イオンをゼロ電荷質量スペクトル(これは、分析されている分子種の分子量である)に変換するプロセスをいう。デコンボリューションされた質量スペクトルで特定の分子種に関連する生データ中の各イオンは、そこに結合した強度又は量の尺度を有し、特定の分子種に結合したすべてのイオンの量は、分析される試料中のその分子種の量の近似値を構成する。分子種が定量されると、試料中の特定の分子種の量は、試料中のすべての関連する分子種の量の合計と比較され、こうして、その特定の分子種の相対的モル過剰量の尺度を与える。こうして定量することは、ある例では、すべての分子種がほぼ同等のイオン化効率を有することを仮定する。

0155

III.薬物動態
哺乳動物における薬物動態(PK測定値半減期クリアランス曲線下の面積(AUC)、及び分布容量を含む)について、治療薬循環レベルを追跡することは、安全性/毒性限界及び投与処方を確立するために必要である(Welling, P. (1997) Pharmacokinetics Processes, Mathematics, and Applications, 2nd Ed., American Chemical Society, Washington, D.C.)。バイオアベイラビリティは、投与された化合物が、投与された剤型から全身循環に到達する程度であり、通常投与された用量のパーセントとして表される。化合物の半減期は、排泄又は生物変換(代謝)により化合物のピーク血漿濃度の50%が除去されるのに必要な時間である。治療指数は、所望の治療活性と望ましくない毒性副作用との間の化合物の選択性を表す。本発明の方法からの薬物動態測定は、抗体及び抗体−薬物コンジュゲート(ADC)の吸収、分布、代謝、及び排泄(ADME)を解明する。

0156

IV.薬物搭載
結合反応からのADCの調製において抗体当たりの薬物の平均数は、本発明の方法により解析し得る。本発明の方法は、ADCの抗体当たりの結合薬物の量(搭載)及び重鎖や軽鎖などの断片上の薬物部分の分布を決定することができる。

0157

V.抗体薬物コンジュゲートの投与
ADCは、治療すべき症状に適した任意の経路により、生物学的供給源に接触又は投与することができる。ADCは典型的には、哺乳動物に非経口的に、例えば注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下、及び硬膜外投与されるであろう。

0158

VI.本明細書に記載の方法での使用に適した薬物
抗体への結合用の薬物の例は、細胞毒性薬物又は作用物質、特に癌治療法に使用されるものを含む。そのような薬物は、一般にDNA損傷作用物質、代謝拮抗物質、天然の生成物、及びこれらの類似体を含む。細胞障害剤のクラスの例は、例えばジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤及びチミジレートシンターゼ阻害剤などの酵素阻害剤、DNAインターカレーター、DNA切断剤トポイソメラーゼ阻害剤アントラサイクリン群の薬物、ビンカ薬物、マイトマイシンブレオマイシン細胞障害性ヌクレオシドプテリジン群の薬物、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチンメイタンシノイド(maytansinoid)、分化誘導剤、及びタキソールを含む。薬物部分の例は、特に限定されないが、アウリスタチン(例えば、MMAF及びMMAE)、メソトレキサート、メトプテリンジクロロメソトレキサート、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリンシトシンアラビノシドメルファラン、ロイロシン、 ロイロシデインアクチノマイシンダウノルビシンドキソルビシンマイトマイシンC、マイトマイシンA 、メイタンシノイド、カルミノマイシン、アミノプテリンタリソマイシン、ポドフィロトキシン、及びポドフィロトキシン誘導体(例えば、エトポシドリン酸エトポシド、ビンブラスチンビンクリスチンビンデシン、タキソール、タキソテールレチノイン酸酪酸カンプトテシンカリケアマイシンエスペラマイシン、エンジイン、及びこれらの誘導体及び類似体)を含む。

0159

ADCの薬物部分はまた、ドラスタチンとそのペプチド類似体で誘導体であるアウリスタチン(米国特許第5,635,483号、5,780,588号)を含むことができる。ドラスタチンとアウリスタチンは、微小管動力学GTP加水分解、及び核分裂細胞分割を妨害し(Woyke et al (2001)Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5,663,149号)と抗真菌活性(Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965)を有することが証明されている。いくつかの態様において、薬物は抗チューブリン剤のアウリスタチンである。ドラスタチン又はアウリスタチン薬物部分は抗体に、ペプチド薬物部分のN(アミノ末端又はC(カルボキシル)末端を介して結合してもよい(WO02/088172)。アウリスタチンEの変種は、米国特許第5,767,237号及び米国特許第6,124,431号に開示されている。

0160

MMAE及びMMAF免疫コンジュゲート、これらの合成と構造は、米国特許第7,851,437号、7,829,531号、7,659,241号、7,498,298号、7,994,135号、7,964,567号(これらの各々は、参照することにより及びすべての目的のために本明細書に組み込まれる)に開示されている。アウリスタチンは、特に限定されないが、アウリスタチンE及びその誘導体を含む。AFP、AEB、AEVB、MMAF、及びMMAEは、本明細書で使用できるアウリスタチンの例である。

0161

VII.医薬調合物
治療用ADCの医薬調合物は、典型的には非経口投与(例えばボーラス、静脈内、筋肉内注射)のために、医薬的に許容し得る非経口ビヒクルを用いて、単位用量注射可能形態で調製される。所望の純度を有する抗体−薬物コンジュゲート(ADC)は、任意選択的に医薬的に許容し得る希釈剤担体、賦形剤、又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.)と、凍結乾燥製剤または水溶液の形で混合される。

0162

許容し得る希釈剤、担体、賦形剤、及び安定剤は、使用される用量及び濃度で生物学的起源受容者に対して非毒性であり、リン酸塩クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤防腐剤(例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化ヘキサメトニウム塩化ベンザルコニウム塩化ベンゼトニウムフェノールブチル又はベンジルアルコールメチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベンカテコールレソルシノールシクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミンゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマーグリシングルタミンアスパラギンヒスチジンアルギニン、又はリジンなどのアミノ酸;単糖類二糖類、及びグアーガム及びデキストリンを含む他の炭水化物グルコースマンノーススクロースマンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖;EDTAなどのキレート剤ナトリウムなどの塩形成対イオン金属錯体(例えばZn−タンパク質錯体);及び/又は、ツイーン(登録商標)、プルロニクス(登録商標)、又はポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。

0163

VIII.脱グリコシル化
N−グリカン上の末端シアル酸及びガラクトース残基の変化の程度から生じる不均一性を低下させるために、任意の脱グリコシル化工程が使用される。末端N−グリカン不均一性は、エクソグリコシダーゼ酵素処理(例えば、それぞれシアリダーゼ及びベータガラクトシダーゼ)、又は占有されたAsn残基からN−グリカンを除去する酵素(例えば、PNGase−F)を用いる、又はエンドグリコシダーゼ処理、又はN−グリカン上の第1N−アセチルグルコサミン残基と及び第2N−アセチルグルコサミン間を切断する酵素(例えば、Endo−F1、F2、又はF3)により、低下させることができる。

0164

ある形態において、N−グリカンからの不均一性を低下させるための最も簡単で最も有効な方法は、PNGase−Fを用いて消化することである。未変性で残されたグリカンを用いてまだ定量が可能であるという点で、脱グリコシル化工程は任意選択である。しかし、MSスペクトルは必要以上に複雑であり、再現性ある定量のためには高性能の質量分析計が必要であろう。

0165

IX.クロマトグラフィー
タンパク質試料からの不揮発性塩及びイオン性及び非イオン性界面活性剤の除去は、質量測定の前に行われる。ある態様において、ADCは質量分析計に導入され、不揮発性塩を含まない。別の態様において、ADCは質量分析計に導入され、不揮発性塩を実質的に含まない。さらに別の態様において、ADCは質量分析計に導入され、例えば界面活性剤を除いて、不揮発性塩を含まない。システイン結合されたADCの脱塩技術は、非イオン性塩及び界面活性剤を除去しながら、天然のタンパク質構造をインタクトに保持しなければならない。MS適合性緩衝液系で脱塩し及び天然の構造を保持できるクロマトグラフィーカラムの種類は、サイズ排除(SE)及びHICカラムを含む。SEC様モードで、SECカラムとはいえないカラム(例えばHICカラム)を使用できることが企図される。カラムは、例えば均一溶媒の酢酸アンモニウム緩衝液中で実行されるであろう。カラムは、不揮発性塩がクロマトグラフィー媒体の孔に入ることを可能にしながら、タンパク質がクロマトグラフィー媒体の孔に入ることを防ぐように作動するため、移動相の条件下でタンパク質が最初に溶出され、塩を後で溶出される。

0166

SECカラムは、典型的にはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミド固定相からなるクロマトグラフィー媒体を、直径1.7〜20ミクロン孔径が60〜2000オングストロームの範囲の大きさの粒子の形で使用する。ある形態において、孔径は、60、80、100、120、150、200、300、500、1000、2000、又は4000Åである。ある形態において、任意のSECカラム充填材料が使用され、カラムサイズは、内径0.1〜7.8mmで長さ50〜600mmでもよい。カラムサイズは、0.1、0.15、0.3、0.5、1、2.0、2.1、3.0、4.0、4.6、又は7.8mmでもよい。カラムの長さは、50、100、150、200、250、又は300mmでもよい。

0167

このクラスのカラムは、不揮発性塩や界面活性剤とタンパク質のサイズは大きく異なるため、タンパク質から不揮発性塩及び界面活性剤を除去する。具体的には、小分子の塩と界面活性剤はクロマトグラフィー粒子中の孔と相互作用(例えば中に入る)して、これが、これらの分子種のカラム内の通過を遅延させ、一方、充分なサイズのタンパク質は粒子の多孔性構造と相互作用せず、従って不揮発性塩や界面活性剤よりはるかに前に溶出する。脱塩システムの別の形態は、MS適合性SEC緩衝塩とその塩のpH及び濃度の選択である。緩衝塩は、MS入り口の結晶化と腐食とを避けるために揮発性でなければならない。一般に使用される揮発性のMS緩衝塩は、ギ酸アンモニウム/ギ酸、および酢酸アンモニウム/酢酸(例えば、酸/塩基対)である。例えば、カラムは、pH7の酢酸アンモニウムで洗浄し、酢酸で6.5のpHまで滴定することができる。ある形態において塩は酢酸アンモニウムである。

0168

塩の濃度は、50〜400mMである。ある形態において、塩濃度は200mMである。別の形態において、塩濃度は250mMである。緩衝液のpHは、5.0〜7.0である。ある形態において、pHは5.5〜7.0である。別の形態において、pHは6.5である。さらに別の形態において、pHは7.0である。pHの範囲は有用な質量データを与えるようなもの(例えば、有用な質量データはpH7.5又は8.0で得られる)であることは、当業者に理解されるであろう。

0169

分析が有機溶媒と酸性イオン対合試薬の非存在下で行われるなら、ADCの変性とその後の断片化を防ぐことができる。ある形態において、ポリヒドロキシエチル−Aカラムとともに使用されるpH6.5の200mMの酢酸アンモニウムは、脱グリコシル化IgG1 mAbの脱塩を提供する。

0170

X.質量分析法
MS法では、試料はMS装置投入される。試料はタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を含む。試料は、陽性又は陰性イオン化MSについて、それぞれ酸または塩基でイオン化される。試料は、小滴微細スプレーとしてソースに入る。小滴を含有する試料は、加熱された乾燥ガスにより脱溶媒和化(蒸発)される。小滴のサイズは、陽性荷電したタンパク質分子が、静電的反発により小滴が爆発してより小さい小滴になるようにする点まで低下する。このプロセスは、真のガス相のタンパク質イオンを有するようになるまで、ほんの一瞬で何度も繰り返され、このイオンは次に質量測定のために質量分析計に入る。このプロセスは典型的には、電子噴霧イオン化(ESI)と呼ばれる。分子イオンの質量電荷比(m/z)が決定され、この生データが、販売業者の特異的なソフトウェアによりさらに処理(デコンボリューション)されて、目的のアナライトについてゼロ電荷分子質量を与える。、MSは、薬物動態を研究し、未知のタンパク質又は小分子を特定し、タンパク質に起きる翻訳後修飾と分解を性状解析するために、使用される。典型的なESI装置は、水Xevo Q-TOF, Agilent 6510 Q-TOFを含む。

0171

タンパク質の1次構造を確認するために、質量分析データが使用される。1次構造の確認は、タンパク質の実験的に測定された質量が、あるエラー閾値内で理論的質量(これは、予測されるアミノ酸配列から求められる)に一致する時に得られる。組換えmAbのインタクト質量の測定は、商業的に最も利用されている飛行時間質量分析計を使用して行うことができる。変性溶媒系を使用する典型的な脱塩法は、しばしば理論値の50ppm(約7.5Da)以内でmAbの実験的質量データを与える。別の形態において、質量データは約25Da以内である。酢酸アンモニウム緩衝液系でSEC−MSを使用するmAbとADCの本来の脱塩は、塩基性残基中性緩衝液pHでは陽性に荷電しているため、より低いイオン化効率を与える。低強度生データは、理論的質量からの、実験的に測定された質量のより大きなずれを引き起こす。しかし、本明細書に記載のSEC−MSを使用して脱塩されたADCについて得られた実験的質量データは、日常的に閾値の50ppm(約7.5Da)以内でいつも100ppm未満である質量データを与える。高度の質量正確度は、タンパク質に結合している可能性のあるすべての一般的な塩付加物が質量を少なくとも18Da(アンモニウムイオンの質量)だけ上昇させるであろうから、ADCが完全に脱塩されていることを示す。非共有結合されているサブユニットを有するADCの質量を測定するための従来のアプローチは、遠心ろ過、単回使用ゲル浸透カートリッジ、および透析などのオフライン技術と、その後の脱塩されたADCのナノ噴霧MSによる脱塩を含む。このアプローチを使用する不完全な脱付加物化は極めて一般的であり、理論値から最大5000ppmずれている質量データを与えることがある。

0172

タンパク質(例えばADC)がSECカラムから揮発性塩(例えば酢酸アンモニウム)で溶出されると、そのタンパク質は、1〜1000μl/分で流れている緩衝液中でタンパク質を脱溶媒和及びイオン化できる市販の分析ESI源を使用して、質量分析計に導入される。流速は、操作者により決定され、カラム直径に依存することがある。例えば、0.1mmのカラムは1μl/分の流速で操作することができ、7.8mmのカラムは1000μl/分で操作することができる。この流速は、はるかに高速の質量測定を可能にする。キャピラリー電圧ガス流速(脱溶媒和およびシース)及びコーン電圧は、ADCを脱溶媒和(例えば、溶媒を蒸発)するのに充分な値に設定しなければならないが、薬物結合重鎖及び軽鎖へのADCのソース内断片化を最小にするのに充分に穏やかでなければならない。ADCの天然の折り畳まれた構造が維持されると、生データは、4800〜7000m/zの間の電荷エンベロープとして明らかである。天然の構造が維持されない場合、これは2000〜4000のm/z間の電荷エンベロープを有するADCの有意な集団として明らかである。ADCのMS測定からの生データは、市販のデコンボリューションソフトウェア(例えば、Agilent MassHunter最大エントロピーデコンボリューション)を使用してゼロ電荷質量スペクトルに変換され、各薬物結合分子種の量は、特定の薬物結合分子種のイオン量を全イオン量(すべての薬物結合分子種の合計量)で割ることにより定量される。完全なタンパク質の質量測定は、典型的には飛行時間及び四重極飛行時間(それぞれTOFおよびQTOF)装置で行われるが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT−ICR)とオービトラップ質量分析計で行ってもよい。ある形態において、この作業は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析計と高解像度イオントラップ質量分析計で行うことができる。

0173

本発明と異なり、以前はクロマトグラフィー工程から採取された各画分は、個々にMSに導入された。各画分の構成化合物とコンジュゲートの質量をアッセイすることにより、すべての採取されたピークの質量の合計が計算されて全体の質量が求められた。本明細書に記載のように、本発明は、インタクトADCをMSにより直接分析する方法を提供する。

0174

XI.電子噴霧イオン化質量分析法(ESI)
抗体などの比較的高分子量の化合物の質量は、ほとんどの質量分析計により容易に測定される質量電荷比(m/z)で検出することができる(典型的なm/z範囲は最大2000、最大3000、最大8000)。電子噴霧イオン化質量分析法ESI−MSは特に、荷電した、極性の、又は塩基性の化合物に適しており、及び優れた検出限界を有する多重荷電化合物を分析するのに適している。すなわちESIは、分子量(MW)が150,000又はそれ以上の抗体−薬物コンジュゲートなどの大きな生物学的分子の検出と性状解析とを可能にする。

0175

XII.システム
ある態様において本発明は、本明細書に記載の方法を実施するように構成されたシステムを提供する。これらのいくつかの態様において、本システムは質量分析計を含む。

0176

ある態様において質量分析計は、本明細書に記載の方法を実施するように構成されており、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲートの質量を検出するための手段を含む。ある態様において、この手段は質量分析計を含む。ある態様において、本システムは、不揮発性塩を含まない揮発性塩中で変性していないタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供するための手段をさらに含む。さらなる態様において、本システムは、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入するための手段を含む。さらに別の態様において、本システムは、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立する手段を含む。

0177

XIII.実施例
以下の例は本発明を例示するが、これらは本発明を限定することを意図しない。

0178

材料
抗体−薬物コンジュゲート
組換えモノクローナル抗体はCHO細胞で発現され、Shukia, A et al, (2007) J Chromatogr B Anafyt Techno! Biomed Life Sci 848, 28-39に記載の標準的方法に従って精製された。Val−CitモノメチルアウリスタチンE(vcMMAE)又はマレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンF(mcMMAF)へのmAbシステイン残基の結合は、Sun, M. et al, (2005) Bioconjug Chem 16, 1282-1290で確立された方法に従って行われた。抗体は、100μgの抗体又はADC当たり1μlのPNGaseF(New England Biolabs, Ipswich, MA)を加えて脱グリコシル化し、37℃で少なくとも4時間インキュベートした。

0179

実施例1
SEC−MSクロマトグラフィー
mAbとADCを、大きさが2.1×200mmで、300Å孔を有する5ミクロン粒子を含むポリヒドロキシエチル−Aカラム(PolyLC, Columbia, MD)で分離させた。カラムを、非変性質量分析のために200mMの酢酸アンモニウム(pH6.5〜7.0)で、又は変性質量分析(対照)のために30%アセトニトリル、0.2%ギ酸で平衡化させた。実験中流速を0.1ml/分に維持し、mAb又はADCは3.5〜4.5分で溶出された。mAbとADCの溶出後、流れと緩衝液組成を維持し、総サイクル時間は、実験当たり10分であった。

0180

質量分析法
mAbとADCの質量分析データは、Agilent 6510 Q-TOF(Agilent, Santa Clara, CA)で陽性ESIモードで1000〜8000m/zの範囲で得られた。乾燥ガス温度は350℃であり、乾燥ガスの流速とネブライザーガスガス圧は、それぞれ12L/時間と35psiであった。キャピラリー電圧、フラグメンター電圧、および八重極RF電圧は、それぞれ5000、450、及び350に設定された。生データは、MassHunterワークステーションソフトウェアバージョンB.03.01内で最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムを用いて中性電荷質量スペクトルに変換した。

0181

疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)
vcMMAEとmcMMAFADCは、McDonagh, C.F. et al., (2006) Protein Eng Des Sel 19, 299-307に記載された方法に従ってHICにより分離された。薬物搭載分子種の定量は、280nmでのUV積分により測定された。図6では、HICデータは、本明細書に記載のインタクト質量データから、ADCMR0〜8の相対的パーセントの比較として使用される。

0182

図6以外に、表1は、個々の薬物搭載分子種のMRについてのイオン面積とHIC UV面積値とを示す。

0183

30%アセトニトリル、0.2%ギ酸の存在下で脱塩された対照mAb試料から得られた生MSデータと、mAb/酢酸アンモニウム脱塩試料の比較は、前者の条件が、電荷エンベロープにより証明されるように、抗体を完全に変性させる(これは、2000〜4000m/zで観察された)ことを示し、一方、酢酸アンモニウム脱塩は、4800〜6800m/zで観察される電荷エンベロープ(それぞれ図2のパネルAとB)を与えた。変性抗体が明らかである領域であるパネルB中の200〜3500m/zで明らかなイオンは、脱グリコシル化のために使用されたPNGaseFと非イオン性界面活性剤ツイーン80の存在のためである。いずれかの方法により測定された抗体のデコンボリューションされたMSは、理論値の10ppm以内であった(図2、パネルCとD)。

0184

上記のmAb−AのmcMMAFコンジュゲートはまた、変性及び非変性クロマトグラフィー脱塩法を使用して分析された。30%アセトニトリル、0.2%ギ酸の存在下でのADCの脱塩は、1500〜4000m/zの電荷エンベロープを与えた(図3、パネルA)。デコンボリューションされたMSは、薬物結合抗体断片(1つの薬物を有する1LC、2つの薬物を有する1LC1HC、2つの薬物を有する2HC、及び1つの薬物を有する1LC2、および0個の薬物を有する2LC2HCを含む)で占められた(図3、パネルC)。対照条件は、インタクトADC−Aの存在の証拠を示さなかった。酢酸アンモニウム脱塩ADC−A MS中の同じm/z領域(図3、パネルB)もまたデコンボリューションされ、ADCの観察された断片化ははるかに小さく、1つの薬物を有する1LCと2つの薬物を有する1LC1HCのみが観察された(図3、パネルD)。ADC−Aの多重荷電されたイオンは、酢酸アンモニウム脱塩試料についての生データでのみ観察され、図3、パネルBで括弧で示した領域に示される。

0185

本明細書で上記した同じ酢酸アンモニウム脱塩法によるmcMMAFとvcMMAEADCの分析は、0〜8個の薬物の取り込みを有するmAbに一致する質量を有する分子種の分布を与えた。mcMMAFコンジュゲートADC−Aと親物質(mAb−A)のインタクト質量スペクトルは図4に示される。個々の薬物搭載分子種の相対的イオン強度は、デコンボリューションされた質量スペクトルに関連するイオン量から定量された。インタクト質量データからと直交法HICとから測定されたADCMR0〜8の相対量の比較は、図6のパネルAに示される。vcMMAEコンジュゲートADC−Bと親物質(mAb−B)の分析について同様の結果が得られ、図5に示される。インタクト質量データからとHICにより測定されたADC MR0〜8の相対量の比較は、図6のパネルBに示される。

0186

実施例2
サイズ排除クロマトグラフィー
ADC試料は、2重カラムSECによりオフラインで分析された。250Å孔を有する5μm粒子を充填した2つの7.8mm×30cmのTSKゲルG3000SWXLカラム(Tosoh, JPN)は、直列に連結された。ADC試料は、200mM酢酸アンモニウム(pH7)からなる移動相を0.8ml/分の流速で使用して分離された。低波長で移動相の妨害性バックグランド吸収のために、280nmでのUV吸収が検出に使用された。

0187

ADCサブユニットの解離に対する脱塩法の作用は、脱塩カラムからADCを採取し、次に脱塩カラムから採取したADC並びに脱塩前のADCを2重カラムSECにより分析することにより評価された。図7において、脱塩されたADCと対応する出発物質の2重SEC分析からのクロマトグラムの比較は、脱塩法の結果としての解離の増加は無いことを示した。

0188

実施例3
実験
50mM〜400mMの範囲の種々の塩濃度の酢酸アンモニウム緩衝液で、PHEA SECカラムを平衡化させた。脱グリコシル化したADC−Bは、上記の移動相塩濃度で運転したSEC−MSにより分析され、MR0〜MR8の相対レベルは、既に記載されているようにデコンボリューションされたイオン強度に基づいて定量された。

0189

結果
50mMの塩濃度では、MR2とMR6のレベルは、すべての他の塩濃度で観察されるレベルと比較して、より高くおよびより低くなっているようである。これは、SEC−MS移動相中の酢酸アンモニウムの濃度は、50mMより上でなければならないこと、及び100〜400mMの移動相酢酸アンモニウム塩濃度は、相対的MR分布について大きく異なる結果を与えないことを示差するであろう。

0190

図8は、塩濃度が100〜400mMである時、移動相中の酢酸アンモニウムの濃度を変化させても、個々の薬物搭載形態の相対的分布に影響を与えないことを例示する。

0191

実施例4
実験
ADC−Cは、mc−MMAFに結合したIgG1分子である。種々の薬物搭載形態は、HICクロマトグラフィーにより分離され精製された(図9A)。次に、精製された画分並びにADC−C出発物質(HIC分離前)は、既に記載されているようにSEC−MSにより評価された(図9B)。

0192

結果
SEC−MSからの結果は、直交データ(還元された軽鎖と重鎖のLCMS分離)に一致し、ピークA〜FがADC−Cの種々の薬物搭載形態に対応することを示す(図9B)。HICピークCとDは同じ名目質量を有し、その質量はMR4分子種に一致する。1500〜4000の低m/z範囲の生データのデコンボリューション(図10)は、2つの薬物を有する観察された薬物結合LC及びHCダイマーにより証明されるように、ピークCが主に、抗体Fab中に取り込まれる薬物を有するMR4から構成されることを示す。HICピークDの同様の分析は、これが主に、2つの薬物を有する観察される共有結合性HC−LCにより証明されるように、抗体ヒンジ中に取り込まれる薬物を有するMR4から構成されることを示す。解離された抗体鎖の分析から得られる情報に基づいて、HICによりピークCとDに分離されたMR4位置異性体の本体を決定することができる。

0193

図9は、HIC(パネルA)と、次にSEC−MS(パネルB)により採取された画分の分析による、mcMMAFADCの分離の性状解析の結果を示す。図10において、HIC分離からの個々の画分の分析は、ADCポリペプチド鎖上の薬物結合の位置が、SEC−MSを使用して解離された断片の質量により評価できることを示す。

0194

実施例5
マイクロフローSEC−MSクロマトグラフィー
ADCは、300Å孔を有する5ミクロン粒子を含有する0.3×150mmの大きさのポリヒドロキシエチル−Aカラム(PolyLC, Columbia, MD)を使用して分離された。カラムは、非変性質量分析用に、200mMの酢酸アンモニウム(pH6.5〜7.0)を用いて平衡化させた。カラムに投入された試料の量は、2.5μg〜50ngの範囲であった。ポジティブフィードバックマイクロフローLCコントローラーとESIマイクロフロー噴霧装置を使用して、25分間の200mM酢酸アンモニウムの均一溶媒勾配中、流速は1.0μl/分に維持されると、ADC溶出が15.5〜19.5分に観察された。

0195

質量分析法
ADCの質量分析データは、Agilent 6510 Q-TOF(Agilent, Santa Clara, CA)を使用して陽性ESIモードで1000〜8000m/zの範囲で得られた。乾燥ガス温度は350℃であり、乾燥ガスと流速とネブライザーガスのガス圧は、それぞれ5.0L/時間と15psiに設定された。それぞれ3000ボルトと300ボルトに設定されたキャピラリー電圧とスキマー電圧を含むマイクロフロー/マイクロESIインターフェースについて最適化されたものを除いて、すべての他のMS設定は分析スケール実験と同じであった。生データは、MassHunterワークステーションソフトウェアバージョンB.03.01内で最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムを用いて中性質量単位に変換された。

0196

分析法と比較して、低流速は溶出時間を遅延させたが、検出限界は劇的に上昇し、すべての4つの薬物搭載分子種は、カラム上で50ngの脱グリコシル化ADCまで視覚化できた。例えば、500ngのADC注入(図11参照)では、MRDは分析シリカSEC法とHIC分析を使用して観察されるものに匹敵する。観察された質量正確度/質量誤差はまた、実質的に装置の規格より下である。

0197

実施例6
血漿定性/ADC親和性精製
ろ過した雌のK2EDTAスプラーグドーレイ(Sprague-Dawley)ラットの血漿を、MabSelectとインキュベートして、内因性IgGを枯渇させた。IgG欠損ラット血漿にADCを1mg/mlで加え、アリコートを取り、37℃で保存した。37℃保存からアリコートを取り出し、指定に時点(0時間、6時間、1日、2日、4日、7日)に−80℃に分析するまで保存した。次に、500μlの1mg/mlのADCをMabSelectに結合させ、1×PBS(pH7.4)で3回洗浄し、100μlのIgG溶出緩衝液で溶出させ、1Mトリス(pH8)(1:10v/v)で中和した。

0198

マイクロフローSEC−MSクロマトグラフィー
ADCは、300Å孔を有する5ミクロン粒子を含有する0.3×150mmの大きさのポリヒドロキシエチル−Aカラム(PolyLC, Columbia, MD)を使用して分離された。カラムは、非変性質量分析用に、200mMの酢酸アンモニウム(pH6.5〜7.0)を用いて平衡化させた。ポジティブフィードバックマイクロフローLCコントローラーとESIマイクロフロー噴霧装置を使用して、200mM酢酸アンモニウムの均一溶媒勾配中85分間、流速を1.0μl/分に維持すると、ADC溶出が15.5〜19.5分に観察された。各採取のために、約1μgのADCが注入された。

0199

質量分析測定
ADCの質量分析データは、Agilent 6510 QTOF(Agilent, Santa Clara, CA)を使用して陽性ESIモードで1000〜8000m/zの範囲で得られた。乾燥ガス温度は350℃であり、乾燥ガスの流速とネブライザーガスのガス圧は、それぞれ5.0L/時間と15psiであった。それぞれ3000ボルトと300ボルトに設定されたキャピラリー電圧とスキマー電圧を含むマイクロフロー/マイクロESIインターフェースについて最適化されたものを除いて、すべての他のMS設定は分析スケール実験と同じであった。生データは、MassHunterワークステーションソフトウェアバージョンB.03.01内で最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムを用いて中性質量単位に変換された。

0200

生物学的汚染物質からの干渉を低下させるために、カラム再平衡化を、血漿から精製されたADCの各注入後1時間まで延長させた。これは、シグナル対ノイズとADCピークの解像度を上昇させた。0時点のデコンボリューションされたデータは、予測されるように、偶数搭載された分子種のみで観察される。インキュベーション時間が増加すると、奇数搭載された分子種が現れ、経時的に量が増加する(図12参照)。インキュベーションの最初のADCピークは予測されるものであるが、経時的ピークのテーリングが増加する。これは、全体の試料の不均一性が増加するためである。特に、各薬物搭載部位は、逆Michal付加又はマレイミド環開環を受けることと競合している。これは、還元質量分析を使用して確認されている。観察されるMRDの経時的減少は、37℃でのIgG欠損ラット血漿中の薬物の喪失を反映する。

0201

前述の発明は理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、当業者は、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲内で実施できることを理解するであろう。さらに各引用文献は、個別に参照により組み込まれたかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願と本明細書に提供される引用文献との間に矛盾が存在する場合には、本出願が優先するものとする。

実施例

0202

[1]タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法であって、
(a)不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非共有結合した非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程と、
(b)該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程と、
(c)該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析計により直接確立する工程と、を含む方法。
[2]
項目1に記載の方法であって、マトリックスから該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行うために、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体を適用する工程をさらに含み、従って該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に変性していない、方法。
[3]
非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を分離媒体から溶出する工程をさらに含む、項目2に記載の方法。
[4]
該非変性条件は、質量分析法に適合性の揮発性SEC緩衝液を含む、項目2に記載の方法。
[5]
該揮発性塩は、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又は炭酸アンモニウムを含む、項目1に記載の方法。
[6]
該マトリックスは、不揮発性塩、界面活性剤、又は緩衝液をさらに含む、項目2に記載の方法。
[7]
タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の相対分布をデコンボリューションされたイオン強度により定量する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
[8]
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体薬物コンジュゲートを含む、項目1に記載の方法。
[9]
該マトリックスは調合物を含む、項目2に記載の方法。
[10]
該分離媒体はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を含む、項目2に記載の方法。
[11]
該作用物質は、薬物、毒素、又は標識物を含む、項目3に記載の方法。
[12]
該SECは、シリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドカラムを含む、項目10に記載の方法。
[13]
該非変性条件は、50℃以下の温度を含む、項目2に記載の方法。
[14]
質量分析法はESI−MSで行われる、項目1に記載の方法。
[15]
該揮発性塩の濃度は50〜400mMである、項目1に記載の方法。
[16]
該揮発性塩の濃度は50mM〜1Mである、項目1に記載の方法。
[17]
該溶出されたタンパク質作用物質コンジュゲート化合物は直ちに質量分析計に導入される、項目3に記載の方法。
[18]
該溶出されたタンパク質作用物質コンジュゲート化合物は連続的に質量分析計に導入される、項目3に記載の方法。
[19]
該分離媒体は非変性条件で行われるHICカラムを含む、項目2に記載の方法。
[20]
該SECはポリヒドロキシエチル−Aカラムを含む、項目12に記載の方法。
[21]
該SECカラムのサイズは、直径が0.1〜7.8であり、長さが100〜300mmである、項目12に記載の方法。
[22]
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を脱グリコシル化試薬で処理する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
[23]
該脱グリコシル化試薬はPNGaseFを含む、項目22に記載の方法。
[24]
該脱グリコシル化剤は、エクソグリコシダーゼ酵素処理、エンドグリコシダーゼ処理、又はN−グリカン上の第1N−アセチルグルコサミン残基と第2N−アセチルグルコサミン残基との間を切断する酵素処理を含む、項目22に記載の方法。
[25]
該エクソグリコシダーゼ酵素処理は、シアリダーゼ又はベータガラクトシダーゼを含む、項目24に記載の方法。
[26]
N−グリカン上の第1N−アセチルグルコサミン残基と第2N−アセチルグルコサミン残基との間を切断する該酵素処理は、Endo−F1、F2、又はF3を含む、項目24に記載の方法。
[27]
該揮発性塩のpHは5.5〜7.0である、項目1に記載の方法。
[28]
該非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析法により定量する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
[29]
該非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、重鎖又は軽鎖抗体断片を含む、項目1に記載の方法。
[30]
該重鎖又は軽鎖抗体断片は1つ以上の薬物をさらに含む、項目29に記載の方法。
[31]
該抗体薬物コンジュゲートの抗体は抗体断片を含む、項目8に記載の方法。
[32]
該抗体断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、ダイアボディ、線状抗体、又は1本鎖抗体分子から選択される、項目31に記載の方法。
[33]
該抗体は、抗CD30、抗CD40、抗CD19、抗CD33、又は抗CD70抗体からなる群から選択される、項目8に記載の方法。
[34]
該抗体薬物コンジュゲートの抗体はヒト化抗体である、項目8に記載の方法。
[35]
該薬物はマイタンシノイドである、項目11に記載の方法。
[36]
該薬物はアウリスタチンである、項目11に記載の方法。
[37]
該薬物はMMAEである、項目11に記載の方法。
[38]
該薬物はMMAFである、項目11に記載の方法。
[39]
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は7.5Da以内で測定される、項目1に記載の方法。
[40]
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は25Da以内で測定される、項目1に記載の方法。
[41]
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、理論値の100ppm以内で測定される、項目1に記載の方法。
[42]
項目1に記載の方法を実施するように構成されたシステム。
[43]
該システムは質量分析計を含む、項目42に記載のシステム。

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