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技術 免疫原性組成物

出願人 グラクソスミスクラインバイオロジカルズソシエテアノニム
発明者 カスタード,シンディレクレニエール,ニコラス,ピエール,フェルナンドネイト,セシル,アンヌプールマン,ジャン
出願日 2017年9月15日 (3年3ヶ月経過) 出願番号 2017-177214
公開日 2018年3月29日 (2年9ヶ月経過) 公開番号 2018-048132
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 突然変異または遺伝子工学 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 中央領 PD比 特定位 平板菌数 参照文 ブロック壁 反応担体 液体性
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題

ブドウ球菌感染に対し有効なワクチンの提供。

解決手段

以下のa〜c群から選択される、タンパク質又はその免疫原性断片の少なくとも2つの群より選択される少なくとも2つの異なるタンパク質又はその免疫原性断片を含む免疫原性組成物a群)SdrC等のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質又はその免疫原性断片;b群)免疫優性ABC輸送体等のブドウ球菌輸送体タンパク質又はその免疫原性断片;c群)αトキシン等のブドウ球菌のビルレンス調節物質毒素又はその免疫原性断片

概要

背景

静脈内装置の使用の増加に伴い、地域および病院獲得感染の数はいずれも近年増加の一途をたどっている。病院獲得(院内)感染は、特に、毎年2百万人以上の患者罹患する米国では、罹病および死亡の主な原因となっている。様々な研究から、米国人患者の約6%が入院中に感染するとされる。米国における経済的負担は、1992年に45億ドルを超えると推定された(EmoriおよびGaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428)。最も頻度が高い感染は、尿管感染(UTI:感染の33%)、次いで肺炎(15.5%)、外科手術部位感染(14.8%)および主要血流感染(13%)が続く(EmoriおよびGaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428)。

黄色ブドウ球菌血液凝固酵素陰性ブドウ球菌(ほとんどが表皮ブドウ球菌)、腸球菌大腸菌および緑濃菌は、主な院内病原体である。これらの病原体はほぼ同数の感染を引き起こすが、これらが生み出しうる障害重症度と、抗生物質耐性分離菌の頻度を考え合わせると、このような順位、すなわち、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌を最も有意な院内病原体とする順位になる。

黄色ブドウ球菌は、院内感染の最も一般的な病原体であり、有意な罹病率および死亡率を有する(Romero-Vivasら、1995, Infect, Dis. 21; 1417)。これは、場合によっては、骨髄炎心内膜炎敗血性関節炎、肺炎、膿瘍およびトキシックショック症候群の原因となることがある。

表皮ブドウ球菌は、通常の皮膚共生生物であり、これは、移植した医療装置の感染および手術部位での感染を引き起こす重要な日和見性病原体でもある。表皮ブドウ球菌が感染する医療装置として、心臓ペースメーカー髄液シャント持続携帯式腹膜透析カテーテル整形外科装置および人工弁が挙げられる。

黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌感染は、抗生物質を用いて治療し、その際、選択される薬剤ペニシリンであるが、メチシリン耐性分離菌の場合にはバンコマイシンが用いられる。抗生物質に対して広範なスペクトル耐性を示すブドウ球菌株パーセンテージは1980年代から益々優勢となっており(Panlinoら、Infect, Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582)、有効な抗菌治療に脅威をもたらしている。加えて、近年、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌が出現したため、有効な治療法がみあたらないメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株が出現および拡大するのではないかと危惧され始めた。

受動免疫療法でブドウ球菌抗原に対する抗体を用いる別の手法が研究されている。ポリクローナル抗血清投与を含む治療法(WO 00/15238、WO 00/12132)、ならびにリポテイコ酸(WO 98/57994)に対するモノクローナル抗体による治療も開発中である。

別の手法は、活性ワクチン接種を用いて、ブドウ球菌に対する免疫応答を生じさせることである。ワクチン成分として含有させるいくつかの候補が確認されている。このような成分として、フィブロネクチン結合タンパク質(米国特許第5840846号)、MHCII類似体(米国特許第5648240号)、フィブロネクチン結合タンパク質(米国特許第6008341号)、GehD(米国特許第2002/0169288号)、コラーゲン結合タンパク質(米国特許第6288214号)、SdrF、SdrGおよびSdrH(WO 00/12689)、突然変異体SEAおよびSEB外毒素(WO 00/02523)および52kDaビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)が挙げられる。

黄色ブドウ球菌ゲノム配列決定され、コード配列の多くが同定されている(欧州特許第786519号、(WO 02/094868)。表皮ブドウ球菌についても同じことが言える(WO 01/34809)。この手法を改良したものとして、ブドウ球菌に感染した患者から超免疫血清により認識されるタンパク質もみいだされている(WO 01/98499、WO 02/059148)。

概要

ブドウ球菌感染に対し有効なワクチンの提供。以下のa〜c群から選択される、タンパク質又はその免疫原性断片の少なくとも2つの群より選択される少なくとも2つの異なるタンパク質又はその免疫原性断片を含む免疫原性組成物a群)SdrC等のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質又はその免疫原性断片;b群)免疫優性ABC輸送体等のブドウ球菌輸送体タンパク質又はその免疫原性断片;c群)αトキシン等のブドウ球菌のビルレンス調節物質毒素又はその免疫原性断片なし

目的

また、このようなワクチンを医薬に使用する方法、およびそれらの調製方法も提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

以下の群:a群)SdrG、ラミニン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質血液凝固酵素、FigおよびMAPからなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその免疫原性断片;b群)免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitCおよびNi ABC輸送体からなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌輸送体タンパク質またはその免疫原性断片;及びc群)αトキシン(Hla)、αトキシンH35R突然変異体、RNA III活性化タンパク質(RAP)からなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌のビルレンス調節物質毒素またはその免疫原性断片;から選択される、タンパク質またはその免疫原性断片の少なくとも2つの群より選択される少なくとも2つの異なるタンパク質またはその免疫原性断片を含む免疫原性組成物

請求項2

少なくとも1つのタンパク質または免疫原性断片をa群)から選択する、請求項1に記載の免疫原性組成物。

請求項3

少なくとも1つのタンパク質または免疫原性断片をb群)から選択する、請求項1または2に記載の免疫原性組成物。

請求項4

少なくとも1つのタンパク質または免疫原性断片をc群)から選択する、請求項1〜3に記載の免疫原性組成物。

請求項5

少なくとも1つのタンパク質または免疫原性断片をa群)、b群)およびc群)から選択する、請求項1〜4に記載の免疫原性組成物。

請求項6

黄色ブドウ球菌由来の少なくとも1つのタンパク質または免疫原性断片を含む、請求項1〜5に記載の免疫原性組成物。

請求項7

表皮ブドウ球菌由来の少なくとも1つのタンパク質または免疫原性断片を含む、請求項1〜6に記載の免疫原性組成物。

請求項8

PIA多糖またはオリゴ糖をさらに含む、請求項1〜7に記載の免疫原性組成物。

請求項9

黄色ブドウ球菌由来のV型および/またはVIII型莢膜多糖またはオリゴ糖をさらに含む、請求項1〜8に記載の免疫原性組成物。

請求項10

表皮ブドウ球菌由来のI型、および/またはII型および/またはIII型莢膜多糖もしくはオリゴ糖をさらに含む、請求項1〜9に記載の免疫原性組成物。

請求項11

グラム陽性菌由来リポテイコ酸をさらに含む、請求項1〜10に記載の免疫原性組成物。

請求項12

前記リポテイコ酸をブドウ球菌から抽出する、請求項11に記載の免疫原性組成物。

請求項13

ブドウ球菌莢膜多糖をタンパク質担体と結合させる、請求項8〜12に記載の免疫原性組成物。

請求項14

前記リポテイコ酸をタンパク質担体と結合させる、請求項11〜13に記載の免疫原性組成物。

請求項15

前記タンパク質担体が、破傷風トキソイドジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、ニューモリシンならびにαトキドイドからなる群より選択される、請求項13〜14に記載の免疫原性組成物。

請求項16

黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に対して有効な免疫応答を生じさせる、請求項1〜15に記載の免疫原性組成物。

請求項17

請求項1〜16に記載の免疫原性組成物と、薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン

請求項18

抗原を混合して、請求項1〜16に記載の免疫原性組成物を調製した後、薬学的に許容される賦形剤を添加する各ステップを含む、ワクチンの製造方法。

請求項19

請求項17に記載のワクチンを、それが必要な患者投与するステップを含む、ブドウ球菌感染を予防または治療する方法。

請求項20

ブドウ球菌感染を治療または予防するためのワクチンの製造における、請求項1〜16に記載の免疫原性組成物の使用。

請求項21

ブドウ球菌感染の予防または治療に用いる免疫グロブリンを調製する方法であって、請求項17に記載のワクチンで受容者を免疫し、該受容者から免疫グロブリンを単離する各ステップを含む、上記方法。

請求項22

請求項21に記載の方法により調製した免疫グロブリン。

請求項23

請求項22に記載の免疫グロブリンと、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物

請求項24

請求項23に記載の有効な量の医薬製剤を患者に投与するステップを含む、ブドウ球菌感染の治療または予防方法

請求項25

ブドウ球菌感染を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項23に記載の医薬製剤の使用。

技術分野

0001

本発明は、ブドウ球菌免疫原性組成物およびワクチン、それらの製造、ならびにこのような組成物医薬における使用の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、ブドウ球菌感染治療または予防のための、抗原組合せを含むワクチン組成物に関する。また、このようなワクチンを医薬に使用する方法、およびそれらの調製方法も提供する。

背景技術

0002

静脈内装置の使用の増加に伴い、地域および病院獲得感染の数はいずれも近年増加の一途をたどっている。病院獲得(院内)感染は、特に、毎年2百万人以上の患者罹患する米国では、罹病および死亡の主な原因となっている。様々な研究から、米国人患者の約6%が入院中に感染するとされる。米国における経済的負担は、1992年に45億ドルを超えると推定された(EmoriおよびGaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428)。最も頻度が高い感染は、尿管感染(UTI:感染の33%)、次いで肺炎(15.5%)、外科手術部位感染(14.8%)および主要血流感染(13%)が続く(EmoriおよびGaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428)。

0003

黄色ブドウ球菌血液凝固酵素陰性ブドウ球菌(ほとんどが表皮ブドウ球菌)、腸球菌大腸菌および緑濃菌は、主な院内病原体である。これらの病原体はほぼ同数の感染を引き起こすが、これらが生み出しうる障害重症度と、抗生物質耐性分離菌の頻度を考え合わせると、このような順位、すなわち、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌を最も有意な院内病原体とする順位になる。

0004

黄色ブドウ球菌は、院内感染の最も一般的な病原体であり、有意な罹病率および死亡率を有する(Romero-Vivasら、1995, Infect, Dis. 21; 1417)。これは、場合によっては、骨髄炎心内膜炎敗血性関節炎、肺炎、膿瘍およびトキシックショック症候群の原因となることがある。

0005

表皮ブドウ球菌は、通常の皮膚共生生物であり、これは、移植した医療装置の感染および手術部位での感染を引き起こす重要な日和見性病原体でもある。表皮ブドウ球菌が感染する医療装置として、心臓ペースメーカー髄液シャント持続携帯式腹膜透析カテーテル整形外科装置および人工弁が挙げられる。

0006

黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌感染は、抗生物質を用いて治療し、その際、選択される薬剤ペニシリンであるが、メチシリン耐性分離菌の場合にはバンコマイシンが用いられる。抗生物質に対して広範なスペクトル耐性を示すブドウ球菌株パーセンテージは1980年代から益々優勢となっており(Panlinoら、Infect, Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582)、有効な抗菌治療に脅威をもたらしている。加えて、近年、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌が出現したため、有効な治療法がみあたらないメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株が出現および拡大するのではないかと危惧され始めた。

0007

受動免疫療法でブドウ球菌抗原に対する抗体を用いる別の手法が研究されている。ポリクローナル抗血清投与を含む治療法(WO 00/15238、WO 00/12132)、ならびにリポテイコ酸(WO 98/57994)に対するモノクローナル抗体による治療も開発中である。

0008

別の手法は、活性ワクチン接種を用いて、ブドウ球菌に対する免疫応答を生じさせることである。ワクチン成分として含有させるいくつかの候補が確認されている。このような成分として、フィブロネクチン結合タンパク質(米国特許第5840846号)、MHCII類似体(米国特許第5648240号)、フィブロネクチン結合タンパク質(米国特許第6008341号)、GehD(米国特許第2002/0169288号)、コラーゲン結合タンパク質(米国特許第6288214号)、SdrF、SdrGおよびSdrH(WO 00/12689)、突然変異体SEAおよびSEB外毒素(WO 00/02523)および52kDaビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)が挙げられる。

0009

黄色ブドウ球菌ゲノム配列決定され、コード配列の多くが同定されている(欧州特許第786519号、(WO 02/094868)。表皮ブドウ球菌についても同じことが言える(WO 01/34809)。この手法を改良したものとして、ブドウ球菌に感染した患者から超免疫血清により認識されるタンパク質もみいだされている(WO 01/98499、WO 02/059148)。

発明が解決しようとする課題

0010

黄色ブドウ球菌または、これが産生する外タンパク質に対してターゲッティングしたワクチンの最初の作製は限定的にしか成功しなかった(Lee 1996 TrendsMicrobiol. 4; 162)。依然として、ブドウ球菌感染に対し有効なワクチンを開発する必要がある。

課題を解決するための手段

0011

従って、本発明は、少なくとも2つの異なるタンパク質またはその免疫原性断片を含む免疫原性組成物を提供するが、その際、該タンパク質またはその免疫原性断片は、以下の群から選択される、タンパク質またはその免疫原性断片の少なくとも2つの群より選択される:
a群ラミニン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、FigおよびMAPからなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその免疫原性断片;
b群)免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitCおよびNi ABC輸送体からなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌輸送体タンパク質またはその免疫原性断片;
c群)αトキシン(Hla)、αトキシンH35R突然変異体、RNA III活性化タンパク質(RAP)からなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌のビルレンス調節物質毒素またはその免疫原性断片。

図面の簡単な説明

0012

好ましいタンパク質のポリペプチド配列を示す。表1は、各配列番号で表示するタンパク質情報を提供する。
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好ましいタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。表1は、各配列番号で表示するタンパク質情報を提供する。
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天然の条件下でのαトキシンの精製を示す。パネルAは、αトキシンの精製時に調製したサンプルのクマシー染色SDS-PAGEを示す。レーン1−分子量マーカー、レーン2−過剰発現したαトキシンを含む可溶性画分、レーン3−Ni-NTAカラムからの素通り画分、レーン4−10%バッファーBで溶離した画分、レーン5−20%バッファーBで溶離した画分、レーン6−30%バッファーBで溶離した画分、レーン7−50%バッファーBで溶離した画分、レーン8−75%バッファーBで溶離した画分、レーン9および10−100%バッファーBで溶離した画分、レーン11−誘導前のT=0時点での細菌、レーン12−誘導後のT=4時間の時点での細菌、レーン13−細胞溶解物、レーン14−可溶性画分、レーン15−不溶性画分。パネルBは、10、5、2および1μlの精製αトキシンのクマシー染色SDS-PAGEを示す。
変性条件下でのSdrCの精製を示す。パネルAは、αトキシンの精製時に調製したサンプルのクマシー染色SDS-PAGEを示す。レーンM−分子量マーカー、出発レーン−過剰発現したSdrCを含む不溶性画分から形成した上清、レーンFT1−Ni-NTAカラムからの素通り画分、レーンC−洗浄バッファーCで溶離した画分、レーンD−バッファーDで溶離した画分、レーンE−バッファーEで溶離した画分。パネルBは、1、2、5および10μlの精製SdrCのクマシー染色SDS-PAGEを示す。
精製タンパク質コーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対する抗血清についてのELISA結果を示す。プールマウス免疫前):接種前のマウスから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールマウス(III免疫後):接種後に抽出したプールマウス血清を用いて得られた結果。プールウサギ(免疫前):接種前のウサギから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールウサギ(III免疫後):接種後に抽出したプールウサギ血清を用いて得られた結果。Blc:負の対照
精製タンパク質をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対する抗血清についてのELISA結果を示す。プールマウス(免疫前):接種前のマウスから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールマウス(III免疫後):接種後に抽出したプールマウス血清を用いて得られた結果。プールウサギ(免疫前):接種前のウサギから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールウサギ(III免疫後):接種後に抽出したプールウサギ血清を用いて得られた結果。Blc:負の対照。
精製タンパク質をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対する抗血清についてのELISA結果を示す。プールマウス(免疫前):接種前のマウスから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールマウス(III免疫後):接種後に抽出したプールマウス血清を用いて得られた結果。プールウサギ(免疫前):接種前のウサギから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールウサギ(III免疫後):接種後に抽出したプールウサギ血清を用いて得られた結果。Blc:負の対照。
精製タンパク質をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対する抗血清についてのELISA結果を示す。プールマウス(免疫前):接種前のマウスから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールマウス(III免疫後):接種後に抽出したプールマウス血清を用いて得られた結果。プールウサギ(免疫前):接種前のウサギから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールウサギ(III免疫後):接種後に抽出したプールウサギ血清を用いて得られた結果。Blc:負の対照。
精製タンパク質をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対する抗血清についてのELISA結果を示す。プールマウス(免疫前):接種前のマウスから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールマウス(III免疫後):接種後に抽出したプールマウス血清を用いて得られた結果。プールウサギ(免疫前):接種前のウサギから抽出したプール血清を用いて得られた結果。プールウサギ(III免疫後):接種後に抽出したプールウサギ血清を用いて得られた結果。Blc:負の対照。
死滅ブドウ球菌をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するマウス抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫したマウスからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のマウス血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するマウス抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫したマウスからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のマウス血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するマウス抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫したマウスからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のマウス血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するマウス抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫したマウスからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のマウス血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌をコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するマウス抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫したマウスからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のマウス血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌でコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形の符号を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫した(1回の免疫しか投与していないHarAを除いて)ウサギからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のウサギ血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌でコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形の符号を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫した(1回の免疫しか投与していないHarAを除いて)ウサギからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のウサギ血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌でコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形の符号を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫した(1回の免疫しか投与していないHarAを除いて)ウサギからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のウサギ血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌でコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形の符号を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫した(1回の免疫しか投与していないHarAを除いて)ウサギからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のウサギ血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌でコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形の符号を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫した(1回の免疫しか投与していないHarAを除いて)ウサギからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のウサギ血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌でコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形の符号を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫した(1回の免疫しか投与していないHarAを除いて)ウサギからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のウサギ血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌でコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形の符号を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫した(1回の免疫しか投与していないHarAを除いて)ウサギからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のウサギ血清についてのELISA結果を示す。
死滅ブドウ球菌でコーティングしたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清についてのELISA結果を示す。パネルAは、黄色ブドウ球菌血清型5死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルBは、黄色ブドウ球菌血清型8死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。パネルCは、表皮ブドウ球菌死滅全細胞をコーティングしたプレートを用いる。正方形の符号を付けた線は、表示したブドウ球菌タンパク質で3回免疫した(1回の免疫しか投与していないHarAを除いて)ウサギからの血清を用いたELISA結果を示す。ひし形を付けた線は免疫前のウサギ血清についてのELISA結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

0013

詳細な説明
本発明は、ブドウ球菌抗原の特定の組合せを開示し、これらを組み合わせることにより、ブドウ球菌感染を治療または予防するのに有効な免疫原性組成物を製造することができる。本発明の免疫原性組成物は、様々なブドウ球菌機能に関与する抗原を好適に組み込む。このような免疫原性組成物は、ブドウ球菌機能の様々な側面に対する免疫応答をターゲッティングするため、特に有効な免疫応答を誘発することができる。

0014

ブドウ球菌感染は、いくつかの異なる段階を経て進行する。例えば、ブドウ球菌生活環は、共生生物コロニー形成、隣接する組織または血流への進入による感染の開始、血液中嫌気的増殖、黄色ブドウ球菌ビルレンス決定因子宿主防御機構間の相互作用、さらには、心内膜炎、転移性膿瘍形成および敗血症候群などの合併症の誘発を含む。細菌の表面における様々な分子が、感染周期の様々な段階に関与すると考えられる。ブドウ球菌感染の様々な過程に関与する具体的抗原の有効量の組合せに対する免疫応答をターゲッティングすることにより、増強された効力のブドウ球菌免疫原性組成物またはワクチンを達成することができる。

0015

特に、異種クラ由来の特定の抗原(そのうちのいくつかは宿主細胞との接着に関与し、またいくつかは鉄獲得または輸送機能に関与し、さらにいくつかは毒素、またはビルレンスの調節因子および免疫優性抗原である)の組合せにより、複数の感染段階から防御する免疫応答を誘発することができる。

0016

免疫応答の有効性は、実施例に記載するような動物モデルアッセイにおいて、および/または実施例に記載するようなオプソニン食作用アッセイを用いて、測定することができる。

0017

本発明の別の利点は、本発明に従い、免疫原性組成物に様々なファミリータンパク質由来の抗原を組み合わせることにより、さらに広範囲菌株からの保護を可能にすることである。

0018

本発明は、ブドウ球菌内に様々な機能を有する、少なくとも2つの異なるカテゴリーのタンパク質から選択した複数のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物に関する。このようなカテゴリーのタンパク質の例として、細胞外結合タンパク質、輸送体タンパク質(例えば、Fe獲得タンパク質)、毒素もしくはビルレンス調節因子、ならびにその他の免疫優性タンパク質が挙げられる。本発明のワクチン組合せは、相同的ブドウ球菌株(抗原が誘導された菌株)、ならびに好ましくは異種ブドウ球菌株に対して有効である。

0019

本発明の免疫原性組成物は、以下の群の2つまたは3つから選択された2、3、4、5もしくは6以上の数のタンパク質を含む:
a群)ラミニン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素(autolysin)、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素(coagulase)、FigおよびMAPからなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその免疫原性断片;
b群)免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitCおよびNi ABC輸送体からなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌輸送体タンパク質またはその免疫原性断片;
c群)αトキシン(Hla)、αトキシンH35R突然変異体、RNA III活性化タンパク質(RAP)からなる群より選択される少なくとも1つのブドウ球菌のビルレンス調節因子、毒素、もしくはその免疫原性断片。

0020

例えば、第1のタンパク質をa群)、b群)もしくはc群)から選択し、また第2のタンパク質を、第2のタンパク質を含まないa群)、b群)およびc群)から選択する。

0021

好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、a群)から選択した少なくとも1つのタンパク質と、b群)および/またはc群)から選択した別のタンパク質を含む。

0022

別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、b群)から選択した少なくとも1つの抗原と、c群)および/またはa群)から選択した別のタンパク質を含む。

0023

さらに別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、c群)から選択した少なくとも1つの抗原と、a群)および/またはb群)から選択した別のタンパク質を含む。

0024

本発明の免疫原性組成物は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)および/または表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)を含むのが好適である。

0025

タンパク質
本発明の免疫原性組成物は、図1のいずれかの配列のアミノ酸配列に対し、少なくとも85%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜99%の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列を含む単離タンパク質を含んでなる。

0026

本明細書でタンパク質について具体的に述べるとき、これは、好ましくは、あらゆるシグナル配列が除去された天然または組換え全長タンパク質、あるいは場合により成熟タンパク質を意味する。タンパク質は、ブドウ球菌株から直接単離してもよいし、組換えDNA技術により作製してもよい。タンパク質の免疫原性断片を本発明の免疫原性組成物に組み込んでもよい。これらは、タンパク質のアミノ酸配列から連続的に取り出した少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは20個のアミノ酸、さらに好ましくは30個のアミノ酸、さらに好ましくは40個または50個のアミノ酸、最も好ましくは100個のアミノ酸を含む断片である。加えて、このような免疫原性断片は、ブドウ球菌タンパク質に対して産生された抗体、またはブドウ球菌への哺乳動物宿主の感染により産生された抗体と、免疫学的反応性である。免疫原性断片はまた、有効な用量で投与される(単独で、または担体に結合したハプテンとして)と、ブドウ球菌感染に対する防御免疫応答を誘発し、さらに好ましくは、黄色ブドウ球菌および/または表皮ブドウ球菌感染に対して防御的である。このような免疫原性断片としては、例えば、N末端リーダー配列欠失したタンパク質、および/または膜貫通ドメインおよび/またはC末端アンカードメインが挙げられる。好ましい形態では、本発明の免疫原性断片は、図1から選択した配列のアミノ酸配列に対し、断片配列の長さ全体にわたって、少なくとも85%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜99%の同一性を有するタンパク質の細胞外ドメインの実質的に全部を含む。

0027

本発明の免疫原性組成物には、ブドウ球菌タンパク質、またはブドウ球菌タンパク質の免疫原性断片からなる融合タンパク質も含まれる。このような融合タンパク質は、組換えにより作製することができ、少なくとも2、3、4、5もしくは6種のブドウ球菌タンパク質の1部を含んでいてもよい。あるいは、融合タンパク質は、少なくとも2、3、4、5もしくは6種のブドウ球菌タンパク質の複数部を含んでいてもよい。これらは、様々なブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性断片を組み合わせたものでもよい。前記以外に、本発明は、異種配列との融合タンパク質としての、ブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性断片の個々の融合タンパク質も含み、このような異種配列として、T細胞エピトープまたは精製タグ供給物(例えば、βグラクトシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ緑色蛍光タンパク質(GFP))、エピトープタグ(例えば、FLAG、mycタグ、ポリヒスチジン)、もしくはウイルス表面タンパク質(例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素)、あるいは細菌タンパク質(例えば、破傷風トキソイドジフテリアトキソイド、CRM197)が挙げられる。

0028

0029

上の表に、図1および図2にそれぞれ示す好ましいタンパク質配列およびDNA配列の配列番号を記載する。SAは黄色ブドウ球菌由来の配列を、またSEは表皮ブドウ球菌由来の配列を示す。

0030

細胞外成分結合タンパク質
細胞外成分結合タンパク質とは、宿主細胞外成分に結合するタンパク質である。この用語は、アドジンを含むが、これに限定されるわけではない。

0031

細胞外成分結合タンパク質の例として、以下のものが挙げられる:ラミニン受容体(Naiduら、J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177)、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(米国特許第5801234号、WiltshireおよびFoster Infec. Immun. 2001, 69; 5198)、EbhA(Williamsら、Infect. Immun. 2002, 70; 6805)、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)(Parkら、1999, J. Biol. Chem. 274; 2845)、EFB(FIB)(WastfeltおよびFlock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347)、SBI(Zhangら、FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211)、自己溶解素(Ruppら、2001, J. Infect. Dis. 183; 1038)、ClfA(米国特許第6008341号、McDevittら、Mol. Microbiol. 1994, 11; 237)、SdrC、SdrG(McCreaら、Microbiology 2000, 146; 1535)、SdrH(McCreaら、Microbiology 2000, 146; 1535)、リパーゼGehD(米国特許第2002/0169288号)、SasA、FnbA(Flockら、Mol Microbiol. 1994, 12; 599, 米国特許第6054572号)、FnbB(WO 97/14799, Boothら、2001 Infec. Immun. 69; 345)、コラーゲン結合タンパク質Cna(Visaiら、2000, J. Biol. Chem. 275; 39837)、ClfB(WO 99/27109)、FbpA(Phonimdaengら、1988 J. Gen Microbiol.134; 75)、Npase(Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999)、IsaA/PisA(Lonenzら、FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145)、SsaA(Langら、FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213)、EPB(Hussain およびHermann symposium on Staph Denmark 14-17th 2000)、SSP-1(Veenstraら、1996, J. Bacteriol. 178; 537)、SSP-2(Veenstraら、1996, J. Bacteriol. 178; 537)、17 kDaヘパリン結合タンパク質HBP(Fallgrenら、2001, J. Med. Microbiol. 50; 547)、ビトロネクチン結合タンパク質(Liら、2001, Curr. Microbiol. 42; 361)、フィブロネクチン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig(WO 97/48727)およびMAP(米国特許第5648240号)。

0032

SitC/MntC/唾液結合タンパク質
これは、肺炎球菌(S. pneumoniae)のアドヘジンPsaAの相同体であるABC輸送体タンパク質である。これは、高度に免疫原性の32kDaリポタンパク質であり、細菌の細菌壁全体に分布する(Cockayneら、Infect, Immun. 1998 66; 3767)。これは、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に32kDaリポタンパク質として発現され、40kDa相同体がスタフィロコッカス・オミニス(S. hominis)に存在する。表皮ブドウ球菌においては、これは鉄調節オペロンの成分である。これは、ストレプトコッカスパラサンイスのFimAを含むアドヘジンと、証明されたまたは推定された金属イオン輸送機能を備えるABC輸送体ファミリーのリポタンパク質の両方に対して相当の相同性を示す。従って、SitCは細胞外結合タンパク質および金属イオン輸送体として含まれる。

0033

米国特許第5,801,234号に開示されている唾液結合タンパク質もSitCの形態であり、本発明の免疫原性組成物に含有させることができる。

0034

ClfAおよびClfB
これらのタンパク質はいずれも、フィブリノーゲン結合活性を有し、血漿の存在下で黄色ブドウ球菌を誘発して凝集塊を形成させる。両タンパク質は、細胞壁関連タンパク質に共通のLPXTGモチーフを含む。

0035

ClfAは米国特許第6008341号に記載され、ClfBはWO 99/27109に記載されている。

0036

血液凝固酵素(FbpA)
これは、フィブリノーゲン結合タンパク質であり、血漿の存在下で黄色ブドウ球菌を誘発して凝集塊を形成させる。このタンパク質については、血液凝固酵素に関する以下の参照文献に記載されている:Phonimdaengら(J. Gen. Microbio. 1988, 134:75-83)、Phonimdaengら(Mol Microbiol 1990; 4:393-404)、Cheungら(Infect Immun 1995; 63:1914-1920)およびShopsinら(J. Clin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456)。

0037

本発明の免疫原性組成物に含有させるのに好ましい断片として、シグナルペプチドが除去された成熟タンパク質(アミノ酸27からC末端まで)が挙げられる。

0038

血液凝固酵素は、3つの異なるドメインを有する。すなわち、超らせん領域であるアミノ酸59〜297、プロリンおよびグリシン豊富な領域であるアミノ酸326〜505、ならびに、βシートコンホメーションを有するアミノ酸506から645までのC末端ドメインである。これらドメインはいずれも本発明の好ましい断片である。

0039

SdrG-Fbe-EfB/FlG
Fbeは、表皮ブドウ球菌の多くの分離菌に存在するフィブリノーゲン結合タンパク質であり、その推定分子量は119 kDaである(Nilssonら、1998、Immun. 66; 2666)。その配列は、黄色ブドウ球菌由来の凝集因子(ClfA)のそれに関連する。Fbeに対する抗体は、フィブリノーゲンをコーティングしたプレートおよびカテーテルへの表皮ブドウ球菌の結合を阻止することができる(PeiおよびFlock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52)。このタンパク質は、WO 00/12689においてSdrGとしても記載されている。SdrGは凝集酵素陰性ブドウ球菌に存在し、LPXTG配列を含む細胞壁関連タンパク質である。

0040

SdrGは、シグナルペプチド(アミノ酸1〜51)、フィブリノーゲン結合部位とコラーゲン結合部位を含む領域(アミノ酸51〜825)、2つのCnaBドメイン(アミノ酸627〜698と738〜809)、SD反復領域(アミノ酸825〜1,000)、ならびにアンカードメイン(アミノ酸1009〜1056)を含んでいる。

0041

Fbeは、アミノ酸51と52の間に切断部位を有する推定シグナル配列を有する。従って、Fbeの好ましい断片は、アミノ酸52からC末端(アミノ酸1,092)まで延びるFbeの成熟形態を含む。

0042

アミノ酸52からアミノ酸825までのFbeのドメインはフィブリノーゲン結合を担当する。従って、Fbeの好ましい断片は、アミノ酸52〜825から構成されるか、またはこれらを含む。

0043

Fbeのアミノ酸373から516までの領域は、FbeとClfAの間に最大の保存を示す。従って、好ましい断片は、Fbeのアミノ酸373〜516を含むことになる。

0044

Fbeのアミノ酸825〜1,041は、タンデムに反復するアスパルギン酸およびセリン残基からなる高度の反復領域を含む。

0045

SdrGの好ましい断片としては、シグナルペプチドおよび/またはSD反復単位ならびにアンカードメインが除去されたポリペプチドがある。このようなものとして、以下のものをを含む、またはこれらからなるポリペプチドが挙げられる:アミノ酸50〜825、アミノ酸50〜633、アミノ酸50〜597(WO 03/76470の配列番号2)、アミノ酸273〜597(WO 03/76470の配列番号3)、アミノ酸273〜577(WO 03/76470の配列番号6)、配列番号70のアミノ酸1〜549、アミノ酸219〜549、アミノ酸225〜549、アミノ酸219〜528、アミノ酸225〜528。

0046

好ましくは、配列番号70、20もしくは21に対し少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%もしくは100%相同の配列を有するSdrGポリペプチドを本発明の免疫原性組成物に組み込む。

0047

本発明の組成物は、随意に、前記SdrGポリペプチドの断片を含む。

0048

好ましい断片は、シグナルペプチドおよび/またはSD反復ドメインおよび/またはアンカードメインを欠失している。例えば、配列番号76のアミノ酸1〜713、1〜549、225〜549、225〜529、24〜717、1〜707、1〜690、1〜680、1〜670、1〜660、1〜650、1〜640、1〜630、1〜620、1〜610、1〜600、34〜707、44〜697、36〜689に対応する配列、あるいは、配列番号70もしくは20または21に対し、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列が挙げられる。

0049

シグナルペプチドを欠失した好ましい断片は、正しい翻訳を確実にするために、該断片のN末端にメチオニン残基を有する。

0050

さらに好ましい断片は以下の配列を有する:
MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDE
LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGST
IIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNY
VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDE
EbhAおよびEbhB
EbhAおよびEbhBは、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に発現し(ClarkeおよびFoster Infect. Immun. 2002, 70; 6680;Williamsら、Infect. Immun. 2002, 20; 6805)、かつ、フィブロネクチンに結合するタンパク質である。フィブロネクチンは細胞外マトリックスの重要な成分であることから、EbhAおよびEbhBは、ブドウ球菌を宿主細胞外マトリックスに接着させる上で重要な機能を有する。

0051

Ebhタンパク質は大きく、分子量が1.1メガダルトンである。生産および製剤化が容易であるため、完全な配列よりも、Ebhタンパク質の断片を用いる方が有利である。該タンパク質の中央領域は、フィブロネクチン結合部位を含む不完全反復配列を含む。以下に記載する1以上の反復ドメインを含む断片は、本発明の免疫原性組成物に組み込むのに好ましい断片である。

0052

Ebhタンパク質は、以下の共通配列を含むことを特徴とする、長さ127アミノ酸の不完全な反復配列単位を含んでいる:
L.G.{10}A.{13}Q.{26}L…M..L.{33}A
好ましくは、
.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L…M..L.{33}A.{12}
さらに好ましくは、
.....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V..V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N/D.......
尚、上記配列において、‘.’は任意のアミノ酸を意味し、‘.{10}’は任意の10アミノ酸を意味し、I/Vは他のアミノ酸選択を示す。

0053

Kurodaら(2001)Lancet 357; 1225-1240、ならびに表2に開示された配列を参照することにより、Ebhタンパク質内の反復単位が容易に導き出される。

0054

本発明の免疫原性組成物に含有させるのに好ましい断片として、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個もしくはそれ以上の127アミノ酸反復単位を含むポリペプチドが挙げられる。このような断片は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個もしくはそれ以上の127アミノ酸反復領域から構成されるものでもよいし、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個もしくはそれ以上の反復単位から構成され、しかも、該断片のいずれか一端または両端に別のアミノ酸が存在するものでもよい。別の好ましい断片は、Clarkeら、Infecttion and Immunity 70, 6680-6687, 2002に記載されるように、3つの反復単位(アミノ酸3202〜3595)にわたる約44 kDaのH2ポリペプチドである。このような断片は、好ましくは、フィブロネクチンに結合する、および/または全Ebhタンパク質に対して反応性である抗体を誘発することができる。

0055

Ebhポリペプチドは、フィブロネクチンに結合することができる。これらポリペプチド配列の好ましい断片は、フィブロネクチンに結合する能力を保持する。フィブロネクチンとの結合は、Clarkeら(Infecttion and Immunity 70; 6680-6687, 2002)に記載されているように、ELISAにより評価することができる。

0056

さらに別の断片は、B細胞またはTヘルパーエピトープを含むものであり、例えば、表3および4に記載の断片/ペプチドが挙げられる。

0057

表2:Ebhの全長配列内の反復配列
Kurodaら(2001)Lancet 357; 1225-1240に、Ebhの全長配列が開示されている。以下の表は、全長配列内で127アミノ酸反復配列が開始および終了するアミノ酸残基を示す。

0058

0059

表3:127アミノ酸反復配列についてのB細胞エピトープ推定
Kurodaら(2001)Lancet 357; 1225-1240に、全長配列が開示されている。全長配列のアミノ酸3204〜3331によりコードされる、これら反復配列の1つを選択し、エピトープ推定を実施した:
MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI

0060

‐「開始」および「終了」の縦列は、127アミノ酸反復配列において推定したB細胞エピトープの位置を示す。

0061

‐「開始」および「終止」の縦列は、Ebh全長配列において推定したB細胞エピトープの位置を示す。

0062

表4:EbhにおけるT細胞エピトープ推定
TrEMBLデータベースに、全長配列、基準配列Q8NWQ6が開示されている。全長配列のアミノ酸3204〜3331によりコードされる、これら反復配列の1つを選択し、エピトープ推定を実施した:
MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI

0063

−「反復配列位置」の縦列は、反復配列において推定したT細胞エピトープの位置を示す。

0064

−「配列位置」の縦列は、Ebh全長配列において推定したT細胞エピトープの位置を示す。

0065

本発明のポリペプチドの断片を用いて、ペプチド合成により、対応する全長ポリペプチドを作製することができ;従って、これらの断片を中間体として用いて、本発明の全長ポリペプチドを作製することができる。

0066

数個、5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個もしくは1個のアミノ酸を任意に組み合わせて置換、欠失、もしくは付加した変異体が特に好ましい。

0067

エラスチン結合タンパク質(EbpS)
EbpSは、486個のアミノ酸を含む、分子量が83 kDaのタンパク質である。これは、黄色ブドウ球菌の細胞質膜に関連し、膜にタンパク質を保持する3つの疎水領域を有する(Downerら、2002, J. Biol. Chem. 277; 243;Parkら、1996, J. Biol. Chem. 271; 15803)。

0068

アミノ酸1〜205と343〜486の間の2つの領域は、細胞質膜の外側表面が露出している。EbpSのリガンド結合ドメインは、N末端で残基14〜34の間に位置する(Parkら、1999, J. Biol. Chem. 274;2845)。

0069

本発明の免疫原性組成物に含有させるのに好ましい断片は、エラスチン結合領域を含む表面露出断片(アミノ酸1〜205)である。いくつかの好ましい断片は、全露出ループを含まないが、エラスチン結合領域(アミノ酸14〜34)は含まなければならない。用いることができる別の断片は、第2の表面露出ループを形成するアミノ酸(アミノ酸343〜486)からなる。これ以外にも、一端または両端のアミノ酸が1、2、5、10、20、50個まで少ない別の断片を用いることも可能である。

0070

ラミニン受容体
黄色ブドウ球菌のラミニン受容体は、病原性に重要な役割を果たす。感染特有の特徴は、血流侵入であり、これによって、転移性膿瘍形成が拡大する。血流侵入には、血管基底膜を介して血液を溢出させる能力が必要である。これは、ラミニン受容体を介したラミニンとの結合により達成される(Lopesら、Science 1985, 229; 275)。

0071

ラミニン受容体は表面露出であり、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌を含む多くのブドウ球菌株に存在する。

0072

SBI
Sbiは、IgG結合領域と、アポリポタンパク質H結合ドメインとを有するタンパク質であり、ほとんどの黄色ブドウ球菌株に発現する(Zhangら、1998, Microbiology 144; 985)。

0073

Sbiの配列のN末端は、アミノ酸29の後に切断部位を備えた典型的なシグナル配列を有する。従って、本発明の免疫原性組成物に含有させるのに好ましいSbiの断片は、Sbi、例えば、配列番号26のアミノ酸残基30、31、32もしくは33から出発し、そのC末端まで続くものである。

0074

SbiのIgG結合ドメインは、アミノ酸41〜92からタンパク質のN末端に向かう領域として同定されている。このドメインは、プロテインAのIgG結合ドメインと相同である。

0075

Sbiの最小IgG結合ドメインは次の配列を含む:

0076

尚、上記配列において、*はIgG結合ドメイン間で類似するアミノ酸を示す。

0077

本発明の免疫原性組成物に含有させるのに好ましいSbiの断片は、IgG結合ドメインを含む。この断片は、上記配列において*で示すIgG結合ドメインの共通配列を含む。該断片は、上記の完全な配列を含むか、または該完全な配列からなるのが好ましい。さらに好ましくは、この断片は、Sbi、例えば、配列番号26のアミノ酸30〜92、33〜92、30〜94、33〜94、30〜146、33〜146、30〜150、33〜150、30〜160、33〜160、33〜170、33〜180、33〜190、33〜200、33〜205もしくは33〜210を含むか、またはこれらアミノ酸からなる。

0078

好ましい断片は、示した配列から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10のアミノ酸置換を含んでもよい。

0079

好ましい断片は、IgG結合ドメインの複数(2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)の反復配列を含んでもよい。

0080

EFB-FIB
Fibは、19 kDaフィブリノーゲン結合タンパク質であり、黄色ブドウ球菌により細胞外媒質分泌される。これは、被験黄色ブドウ球菌分離菌から産生される(WastfeltおよびFlock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347)。

0081

黄色ブドウ球菌は、フィブリノーゲンの存在下で凝集し、フィブリノーゲン被覆表面に結合する。この能力により、カテーテルおよび内皮細胞でのブドウ球菌コロニー形成が促進される。

0082

Fibは、アミノ酸約30に推定切断部位を備えるタンパク質のN末端にシグナル配列を含む。従って、本発明の免疫原性組成物に含有させるのに好ましい断片は、成熟タンパク質の配列(該タンパク質のアミノ酸約30からC末端まで)を含む。

0083

IsaA/PisA
IsaAは29kDaタンパク質であり、PisAとしても知られ、入院患者の敗血症における免疫優性ブドウ球菌タンパク質であることがわかっている(Lorenzら、2000, FEMS Immunol. Med. Microb. 29; 145)。

0084

IsaA配列の最初の29個のアミノ酸は、シグナル配列であると考えられる。従って、本発明の免疫原性組成物に含有させるのに好ましいIsaA断片は、コードされた配列のアミノ酸残基30から、末端まで含む。

0085

フィブロネクチン結合タンパク質
フィブロネクチン結合プロテインA(FnbA)は、米国特許第5320951およびSchenningsら(1993, Microb. Pathog. 15; 227)に記載されている。フィブロネクチン結合プロテインAは、フィブロネクチンとの結合に関与する数個のドメインを含む(WO 94/18327)。これらは、D1、D2、D3およびD4と呼ばれる。フィブロネクチン結合プロテインAまたはBの好ましい断片は、D1、D2、D3、D4、D1-D2、D2-D3、D3-D4、D1-D3、D2-D4もしくはD1-D4を含むか、あるいはこれらからなる(WO 94/18327に記載の通り)。

0086

フィブロネクチン結合タンパク質は、36アミノ酸シグナル配列、例えば、次の配列を含む:
VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA
随意に、このシグナル配列を除去した成熟タンパク質を本発明の免疫原性組成物に含有させる。

0087

輸送体タンパク質
グラム陽性細菌の細胞壁は、代謝物が細菌に自由に拡散するのを阻止するブロック壁として作用する。一ファミリーのタンパク質は、細菌内への必須栄養素経路組織化するため、細菌の生存に必須である。「輸送体タンパク質」という用語は、代謝物(例えば、鉄)との結合の初期段階に関与するタンパク質、ならびに細菌内への代謝物の実際の輸送に関与するタンパク質を包含する。

0088

分子鉄は細菌増殖の必須補因子である。遊離鉄に結合するサイドロホア(siderophore)は、分泌された後、細胞膜横断する輸送のために鉄を送達する細菌表面受容体により捕捉される。鉄獲得は、ヒト感染の確立のために重要であることから、このクラスのタンパク質に対する免疫応答が発生すれば、ブドウ球菌生存能の喪失につながる。

0089

輸送体タンパク質の例として、免疫優性ABC輸送体(Burnieら、2000 Infect. Immun. 68; 3200)、IsdA(Mazmanianら、2002 PNAS 99; 2293)、IsdB(Mazmanianら、2002 PNAS 99; 2293)、Mg2+輸送体、SitC(WiltshireおよびFoster 2001 Infect. Immun. 69; 5198)およびNi ABC輸送体が挙げられる。

0090

免疫優性ABC輸送体
免疫優性ABC輸送体は、良好に保存されたタンパク質であり、これは、様々なブドウ球菌株に対して交差防御的な(cross-protective)免疫応答を生み出すことができる(Meiら、1997, Mol. Microbiol. 26; 399)。このタンパク質に対する抗体は、敗血症の患者にみいだされている(Burnieら、2000 Infect. Immun. 68; 3200)。

0091

免疫優性ABC輸送体の好ましい断片としては、ヒト免疫系により認識されるエピトープを含む配列であることから、次のペプチドが挙げられる:DRHFLN、GNYD、RRYPF、KTTLLK、GVTTSLS、VDWLR、RGFL、さらに好ましくはKIKVYVGNYDFWYQS、TVIVVSHDRHFLYNNVおよび/またはTETFLRGFLGRMLFS。

0092

IsdA-IsdB
黄色ブドウ球菌のisd遺伝子(鉄調節表面決定因子)は、ヘモグロビン結合および細胞質へのヘム鉄の輸送を担当するタンパク質をコードし、該細胞質においてヘム鉄は必須栄養素として作用する。IsdAおよびIsdBは、ブドウ球菌の細胞壁内に位置する。IsdAは、プロテイナーゼK消化被りやすいため、細菌の表面に露出していると考えられる。IsdBは一部が消化されていたことから、細菌の表面に一部露出していることを示唆している(Mazmanianら、2003 Science 299; 906)。

0093

IsdAおよびIsdBはいずれも、ヘムに結合する29kDaタンパク質である。これらの発現は、Furリプレッサーを介した鉄の利用性により調節される。これらの発現は宿主への感染時に高くなり、その際、宿主における鉄の濃度は低くなる。

0094

また、上記タンパク質は、FrpAおよびFrpBとしても知られる(Morrisseyら、2002, Infect. Immun. 70; 2399)。FrpAおよびFrpBは、高い電荷を有する主要表面タンパク質である。これらは、プラスチックへの接着に大きく寄与することがわかっている。

0095

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、WO 01/98499またはWO 03/11899に記載されているIsdAおよび/またはIsdBの断片を含む。

0096

毒素およびビルレンス調節物質
このタンパク質ファミリーメンバーには、αトキシン、溶血素エンテロトキシンBおよびTSST-1のような毒素、ならびに、RAPのような毒素の産生を調節するタンパク質が含まれる。

0097

αトキシン(Hla)
αトキシンは、ほとんどの黄色ブドウ球菌により産生される重要なビルレンス決定因子である。これは、溶血活性を有する細孔形成毒素である。αトキシンに対する抗体は、動物モデルにおいてαトキシンの有害および致死作用を中和することが示されている(Adlamら、1977 Infect. Immun. 17; 250)。ヒト血小板、内皮細胞および単核細胞はαトキシンの作用を受けやすい。

0098

αトキシンには高い毒性があるため、免疫原として用いる前に解毒する必要がある。これは、化学的処理、例えば、ホルムアルデヒド、他の架橋試薬グルタルアルデヒドで処理するか、もしくは後述するように細菌多糖化学的に結合させることにより、達成することができる。

0099

毒性を除去する別の方法は、毒素の抗原性は保持しながら、毒性を除去する点突然変異を導入するものである。αトキシンのアミノ酸35に点突然変異を導入し、そこでヒスチジン残基ロイシン残基で置換することにより、毒素の抗原性は保持しながら、毒性を除去する(MenziesおよびKernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839)。ヒスチジン35は、細孔形成に必要な適正なオリゴマー化に重要であると考えられ、この残基の突然変異により、毒性が失われる。

0100

本発明の免疫原性組成物に含有させる場合には、His 35の突然変異、最も好ましくは、His 35をLeuまたはArgで置換することにより、解毒するのが好ましい。別の実施形態では、免疫原性組成物の別の成分、好ましくは、莢膜多糖、最も好ましくは、黄色ブドウ球菌V型多糖および/または黄色ブドウ球菌VIII型多糖および/またはPNAGとの結合により、αトキシンの解毒を実施する。

0101

RNA III活性化タンパク質(RAP)
RAPはそれ自体毒素ではないが、発病因子の発現の調節物質である。RAPは、黄色ブドウ球菌により産生および分泌される。これは、別のブドウ球菌のagr調節系を活性化し、溶血素、エンテロトキシンBおよびTSST-1のような発病因子の発現および後の放出を活性化する。

0102

RAPに対して生み出される免疫応答は、細菌を死滅させないが、細菌の病原性を妨害する。これは、新たな耐性菌株が出現するための低選択性圧力をもたらすという利点がある。

0103

これには、感染の罹患率を低減する上で役立つ免疫応答を生み出すという第2の利点もある。

0104

具体的には、別の抗原が、細菌を死滅させることができる免疫応答をもたらす場合に、ワクチンにRAPと別の抗原を組み合わせれば特に有利である。

0105

その他のタンパク質
蓄積関連タンパク質(Aap)
Aapは、表面への表皮ブドウ球菌株の蓄積に必須の140kDaタンパク質である(Hussainら、Infect. Immun. 1997, 65; 519)。このタンパク質を発現する菌株は有意に多量のバイオフィルムを産生するため、Aapはバイオフィルム形成に関与すると考えられる。Aapに対する抗体はバイオフィルム形成を阻害し、表皮ブドウ球菌の蓄積を阻害することができる。

0106

Aapの好ましい断片は、アミノ酸550〜1069を含むか、またはこれらからなる保存ドメインである。

0107

ブドウ球菌分泌抗原SsaA
SsaAは、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌の両方に存在する30 kDaの強度に免疫原性のタンパク質である(Langら、2000 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29; 213)。心内膜炎におけるその発現は、感染性疾患病因に特異的なビルレンスを有することを示唆している。

0108

SsaAは、N末端リーダー配列およびシグナルペプチダーゼ切断部位を含む。リーダーペプチドの後に、残基30から残基130までの約100個のアミノ酸からなる親水領域が続く。

0109

本発明の免疫原性組成物に含有させるのに好ましいSsaAの断片は、成熟タンパク質(アミノ酸27からC末端またはアミノ酸30からC末端)からなる。

0110

別の好ましい断片は、アミノ酸30からアミノ酸130までのSsaAの親水領域を含む。

0111

好ましい組合せ
本発明の免疫原性組成物における好ましいタンパク質の組合せは、ラミニン受容体と、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0112

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SitCと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0113

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、EbhAと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0114

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、EbhBと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0115

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、EbhSと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0116

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、EFB(FIB)と、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0117

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SBIと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0118

本発明の免疫原性組成物における好ましいタンパク質の組合せは、自己溶解素と、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0119

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、ClfAと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0120

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SdrCと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0121

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SdrGと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0122

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SdrHと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0123

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、リパーゼGehDと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0124

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SasAと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0125

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、FnbAと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0126

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、FnbBと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0127

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、Cnaと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0128

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、ClfBと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0129

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、FbpAと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0130

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、Npaseと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0131

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、IsaA/PisAと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0132

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SsaAと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0133

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、EPBと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0134

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SSP-1と、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0135

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SSP-2と、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0136

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、HPBと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0137

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、ビトロネクチン結合タンパク質と、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0138

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、フィブリノーゲン結合タンパク質と、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0139

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、血液凝固酵素と、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0140

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、Figと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0141

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、MAPと、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0142

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、免疫優性ABC輸送体と、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0143

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、IsdAと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0144

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、IsdBと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0145

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SitCと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、αトキシン、αトキシンH35L OR H35R突然変異体、RAP、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0146

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、αトキシンと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0147

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、αトキシンH35L OR H35R変異体と、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0148

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、RAPと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、AapおよびSsaAからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0149

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、Aapと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、RAP、αトキシンおよびH35L OR H35Rαトキシンからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0150

本発明の免疫原性組成物における別の好ましいタンパク質の組合せは、SsaAと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、RAP、αトキシンおよびH35L OR H35Rαトキシンからなる群より選択される1、2、3、4もしくは5の別の抗原とを含む。

0151

本発明者らは、抗原を混合した場合、特定の抗原が、特に有効な免疫応答を生み出すことを証明している。従って、本発明の実施形態は、IsaAとブドウ球菌輸送体タンパク質、またはIsaAとブドウ球菌ビルレンスもしくは毒素調節物質を含むか、あるいはSbiとブドウ球菌輸送体タンパク質、またはSbiとブドウ球菌ビルレンスもしくは毒素調節物質を含むか、あるいは、SdrCとブドウ球菌輸送体タンパク質、またはSdrCとブドウ球菌ビルレンスもしくは毒素調節物質、またはIsaAとSbi、またはIsaAとSdrC、またはIsaAと自己溶解素、またはIsaAとEbh、またはSbiとSdrC、またはSbiと自己溶解素、またはSbiとEbh、またはSdrCと自己溶解素、またはSdrCとEbh、または自己溶解素−グルコサミニダーゼとEbhを含む免疫原性組成物である。これら組合せの各々について、タンパク質は、全長または断片のいずれでもよく、図1の配列に対し少なくとも85%、90%、95%、98%もしくは100%同一の配列を有する。

0152

前述および後述の組合せにおいて、指定したタンパク質は、前述したように、断片または融合タンパク質として随意に本発明の免疫原性組成物に含有させることができる。

0153

本発明の好ましい免疫原性組成物は、WO 02/094868に開示するタンパク質配列を含まない。

0154

3つのタンパク質の組合せ
本発明の好ましい免疫原性組成物は、αトキシン、細胞外成分結合タンパク質(好ましくは、アドヘジン(adhesin))および輸送体タンパク質(好ましくは鉄結合タンパク質)を組み合わせた3つのタンパク質を含む。

0155

このような組合せの場合、αトキシンは、化学的に、または点突然変異、好ましくはHis35Leu点突然変異の導入により遺伝子的に解毒することができる。αトキシンは、遊離タンパク質として存在するか、あるいは、免疫原性組成物の多糖またはLTA成分に結合している。

0156

好ましい組合せを以下に挙げる:
αトキシン、IsdAと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、FigおよびMAPからなる群より選択される細胞外成分結合タンパク質とを含む免疫原性組成物。

0157

αトキシン、IsdBと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、FigおよびMAPからなる群より選択される細胞外成分結合タンパク質とを含む免疫原性組成物。

0158

αトキシン、IsdAと、ラミン受容体、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、自己溶解素、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、FigおよびMAPからなる群より選択されるアドヘジンとを含む免疫原性組成物。

0159

αトキシン、IsdBと、ラミン受容体、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、FigおよびMAPからなる群より選択されるアドヘジンとを含む免疫原性組成物。

0160

αトキシン、IsdAおよびラミン受容体を含む免疫原性組成物。

0161

αトキシン、IsdAおよびEbhAを含む免疫原性組成物。

0162

αトキシン、IsdAおよびEbhBを含む免疫原性組成物。

0163

αトキシン、IsdAおよびEbpSを含む免疫原性組成物。

0164

αトキシン、IsdAおよびFEB(FIB)を含む免疫原性組成物。

0165

αトキシン、IsdAおよびSdrGを含む免疫原性組成物。

0166

αトキシン、IsdAおよびClfAを含む免疫原性組成物。

0167

αトキシン、IsdAおよびClfBを含む免疫原性組成物。

0168

αトキシン、IsdAおよびFnbAを含む免疫原性組成物。

0169

αトキシン、IsdAおよび血液凝固酵素を含む免疫原性組成物。

0170

αトキシン、IsdAおよびFigを含む免疫原性組成物。

0171

αトキシン、IsdAおよびSdrHを含む免疫原性組成物。

0172

αトキシン、IsdAおよびSdrCを含む免疫原性組成物。

0173

αトキシン、IsdAおよびMAPを含む免疫原性組成物。

0174

IsaAとSbiを含む免疫原性組成物。

0175

IsaAとIsdBを含む免疫原性組成物。

0176

IsaAとIsdAを含む免疫原性組成物。

0177

IsaAとSdrCを含む免疫原性組成物。

0178

IsaAとEbhまたは前述したその断片を含む免疫原性組成物。

0179

SbiとSdrCを含む免疫原性組成物。

0180

SbiとEbhまたは前述したその断片を含む免疫原性組成物。

0181

IsaA、SbiもしくはSdrCを含む免疫原性組成物。

0182

様々なクローン系統に発現させた抗原の選択
黄色ブドウ球菌の集団構造に関する発病因子発生の分析から、黄色ブドウ球菌の天然の集団発病遺伝子不定に存在することがわかった。

0183

黄色ブドウ球菌の臨床分離菌のうち、少なくとも5つのクローン系統が極めて優勢であることがわかった(Boothら、2001 Infect Immun. 69(1):345-52)。α溶血素(hla)、フィブロネクチン結合プロテインA(fnbA)および凝集因子(clumpingfactor) A(clfA)は、系統同一性に関係なく、ほとんどの分離菌に存在することが明らかになり、これは、黄色ブドウ球菌の生存にこれらのタンパク質が重要な役割を有することを示唆している(Boothら、2001 Infect Immun. 69(1):345-52)。さらに、Peacockら、2002によれば、fnbA、clfA、血液凝固酵素、spa、map、pvl(パントン−バレンチロイコシジン)、hlg(γトキシン)、αトキシンおよびicaは、基礎となるクローン構造とは無関係のようであり、これは、これら遺伝子の相当な水平移動を示唆している。

0184

対照的に、フィブロネクチン結合プロテインB(fnbB)、β溶血素(hlb)、コラーゲン結合タンパク質(can)、TSST-1(tst)およびメチシリン耐性遺伝子(mecA)は、特定の系統と強く関連している(Boothら、2001 Infect Immun. 69(1):345-52)。同様に、Peacockら、2002(Infect Immun. 70(9):4987-96)は、集団内でのエンテロトキシン、tst、エキスホラチン(etaおよびetb)、βおよびδトキシン、sdr遺伝子(sdrD、sdrEおよびbbp)、cna、ebpSおよびefbの分布がすべて、MLST由来のクローン複合体に極めて有意に関連することを明らかにした。

0185

MLSTデータは、院内感染病の原因である菌株が、地域獲得疾病を起こす菌株、または無症候性保菌者から回収した菌株からの独特サブ集団呈示する証拠を提供していない(Feilら、2003 J Bacteriol. 185(11):3307-16)。

0186

本発明の好ましい免疫原性組成物は、様々なクローン系統由来のブドウ球菌に対して有効である。

0187

一実施形態では、これは、ブドウ球菌のほとんどの分離菌に発現する1、2、3、4、好ましくは1以上のタンパク質を含有させることにより達成される。このようなタンパク質の例として、α溶血素(hla)、フィブロネクチン結合プロテインA(fnbA)および凝集因子A(clfA)、血液凝固酵素、spa、map、pvl(パントン−バレンチンロイコシジン)、hlg(γトキシン)およびicaが挙げられる。本発明者らはまた、以下に挙げるものも同定した:ABC輸送体、RAP、自己溶解素(Ruppら、2001, J. Infect. Dis. 183; 1038)、ラミニン受容体、SitC、IsaA/PisA、SPOIIIE()、SsaA、EbpS、SasF(Rocheら、2003, Microbiology 149; 643)、EFB(FIB)、SBI、ClfB、IsdA、IsdB、FnbB、Npase、EBP、骨シアロ結合タンパク質II、IsaB/PisB(Lorenzら、FEMS Immuno. Med. Microb. 2000, 29; 145)、SasH(Rocheら、2003, Microbiology 149; 643)、MRPI、SasD(Rocheら、2003, Microbiology 149; 643)、SasH(Rocheら、2003, Microbiology 149; 643)、オーレオリシン(AUR)/Sepp1および新規の自己溶解素。

0188

別の実施形態では、異なるセットのクローン系統に発現する2以上のタンパク質を本発明の免疫原性組成物に含有させる。好ましくは、多数のクローン系統、最も好ましくは、すべてのクローン系統に対して有効である、抗原の組合せにより、免疫応答を発生させる。好ましい組合せを以下に挙げる:FnbBとβ溶血素、FnbBとCna、FnbBとTSST-1、FnbBとmecA、FnbBとSdrD、FnbBとSdrF、FnbBとEbpS、FnbBとEfb、β溶血素とCna、β溶血素とTSST-1、β溶血素とmecA、β溶血素とSdrD、β溶血素とSdrF、β溶血素とEbpS、β溶血素とEfb、CnaとTSST-1、CnaとmecA、CnaとSdrD、CnaとSdrF、CnaとEbpS、CnaとEfb、TSST-1とmecA、TSST-1とSdrD、TSST-1とSdrF、TSST-1とEbpS、TssT-1とEfb、MecAとSdrD、MecAとSdrF、MecAとEbpS、MecAとEfb、SdrDとSdrF、SdrDとEbpS、SdeDとEfb、SdrFとEbpS、SdrFとEfb、およびEbpSとEfb。

0189

以上挙げた好ましい組合せを後述する別の成分と組み合わせてもよい。

0190

様々な増殖期に発現する抗原の選択
ブドウ球菌は、特定のセットのタンパク質が発現する対数増幅期を経て増殖する。これらのタンパク質には、多くの細胞外成分結合タンパク質および輸送体タンパク質が含まれる。対数増幅期の後、ブドウ球菌は、後対数期に戻り、その間、増殖は低速になり、タンパク質発現が調節される。その際、対数増幅期に発現したタンパク質の多くがダウンレギュレートされるのに対し、酵素や大部分の毒素(αトキシンを含む)などその他のタンパク質は、より高いレベルで発現する。

0191

本発明の好ましい免疫原性組成物は、対数増幅期に、より高いレベルで発現するタンパク質と、後対数増幅期に、より高いレベルで発現するタンパク質を含む。

0192

ここで、「より高いレベル」とは、ある時期における発現レベルが、他の時期と比較して高いことを意味する。

0193

好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、αトキシンおよび細胞外成分結合タンパク質(好ましくは、FnbA、FnbB、ClfAおよびClfB)または輸送体タンパク質を含む。

0194

さらに好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、αトキシンまたはCnaもしくはリパーゼGehDと、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶解素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、SasA、FnbA、FnbB、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、FigおよびMAP、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、AapおよびSsaAからなる群より選択されるタンパク質とを含む。

0195

以上記載した組合せにおいて、前述のように、αトキシンを遺伝子的または化学的に解毒することができ、これを後述するように多糖に結合させても、させなくてもよい。

0196

多糖
本発明の免疫原性組成物は、さらに、莢膜多糖、例えば、1以上のPIA(また、PNAGとしても知られる)および/または黄色ブドウ球菌V型および/またはVIII型莢膜多糖および/または表皮ブドウ球菌I型、および/またはII型および/またはIII型莢膜多糖を含むのが好ましい。

0197

PIA(PNAG)
PS/A、PIAおよびSAAとして同定される様々な形態のブドウ球菌表面多糖は同じ化学的実体−PNAGである(Maria-Litranら、Vaccine 22; 872-879 (2004))。従って、PIAまたはPNAGという用語は、これらすべての多糖、またはそれらに由来するオリゴ多糖を包含する。

0198

PIAは、多糖細胞間アドヘジンであり、N-アセチルおよびO-スクシニル成分で置換したβ-(1→6)-結合グルコサミンポリマーからなる。この多糖は、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌の両方に存在し、いずれの供給源からも単離することができる(Joyceら、2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira-Litranら、2002, Infect. Imun. 70; 4433)。例えば、PNAGは黄色ブドウ球菌株MN8,(WO 04/43407)から単離することができる。

0199

表皮ブドウ球菌から単離したPIAは、バイオフィルムの不可欠な成分である。これは、細胞間接着仲介を担当し、恐らくはまた、宿主の免疫応答から成長するコロニーを保護する機能も果たすと考えられる。

0200

ポリ-N-スクシニル-β-(1→6)-結合グルコサミン(PNSG)として以前から知られる多糖は、N-スクシニル化の同定が間違っていたため、予想していた構造をしていないことが近年わかった(Maria-Litranら、2002, Infect. Immun. 70; 4433)。従って、これまでPNSGとして知られ、現在PNAFであることが認められた多糖も用語「PIA」に含まれる。

0201

PIA(またはPNAG)は、400 kDaを超えるものから、75〜400 kDaまで、10〜75 kDaまで、30以下の反復単位からなるオリゴ糖(N-アセチルおよびO-スクシニル成分で置換したβ-(1→6)-結合グルコサミンからなる)まで、様々なサイズのものでよい。本発明の免疫原性組成物には、あらゆるサイズのPIA多糖またはオリゴ糖を用いてよいが、40 kDaを超えるものが好ましい。サイジングは当分野で周知のあらゆる方法、例えば、マイクロ流動体化、超音波照射もしくは化学的切断(WO 03/53462、欧州特許第497,524号、欧州特許第495,525号)により達成することができる。

0202

PIA(またはPNAG)の好ましいサイズの範囲は、40〜400 kDa、40〜300 kDa、50〜350 kDa、60〜300 kDa、50〜250 kDaおよび60〜200 kDaである。

0203

PIA(PNAG)は、酢酸基によるアミノ基での置換によって、様々な程度のアセチル化を有しうる。in vitroで生産したPIAは、アミノ基でほぼ完全に(95〜100%)置換されている。あるいは、60%以下、好ましくは50%、40%、30%、20%、10%以下のアセチル化を有する脱アセチル化PIA(PNAG)を用いることもできる。PNAGの非アセチル化エピトープは、オプソニンによるグラム陽性菌、好ましくは黄色ブドウ球菌および/または表皮ブドウ球菌の死滅を仲介するのに効果的であるため、脱アセチル化PIA(PNAG)を用いるのが好ましい。最も好ましくは、PIA(PNAG)は、40 kDa〜300 kDaのサイズを有し、60%、50%、40%、30%もしくは20%以下のアミノ基がアセチル化されるように、脱アセチル化する。

0204

用語「脱アセチル化PIA(dPNAG)」とは、60%、50%、40%、30%、20%もしくは10%以下のアミノ基がアセチル化されているPNAG多糖またはオリゴ糖を意味する。

0205

一実施形態では、天然の多糖を化学的に処理することにより、PNAGを脱アセチル化して、dPNAGを形成する。例えば、天然PNAGを塩基性溶液で処理し、pHが10を超えるようにする。例えば、0.1〜5M、0.2〜4M、0.3〜3M、0.5〜2M、0.75〜1.5Mまたは1M NaOH、KOHもしくはNH4OHでPNAGを処理する。処理は、20〜100、25〜80、30〜60もしくは30〜50または35〜45℃の温度で、少なくとも10または30分、あるいは1、2、3、4、5、10、15もしくは20時間実施する。 dPNAGは、WO 04/43405に記載されているように調製することもできる。

0206

本発明の免疫原性組成物に含有させる多糖は、好ましくは、後述するように担体タンパク質と結合させるか、あるいは、結合させない。

0207

黄色ブドウ球菌由来の5型または8型多糖
ヒトへの感染を引き起こす黄色ブドウ球菌のほとんどの菌株が、5型または8型多糖のいずれかを含む。約60%のヒト菌株が8型であり、約30%が5型である。5型および8型莢膜多糖抗原の構造は、Moreauら、Carbohydrate Res. 201; 285 (1990)および Fournierら、Infect. Immun. 45; 87 (1984) に記載されている。両者とも、その反復配列にFucNAcpと、スルフヒドリル基を導入するのに用いることができるManNAcAを有する。これらの構造は以下のように報告されていた:
5型
→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1 →4)-α-L-FucNAc(1 →3)-β-D-FucNAc-(1 →
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 →3)-α-L-FucNAc(1 →3)-β-D-FucNAc-(1 →
近年(Jones, Carbohydrate Research 340, 1097-1106 (2005))、NMR分光学的方法により、以下に示す構造に訂正された:
5型
→4)-β-D-ManNAcA-(1 →4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1 →3)-β-D-FucNAc-(1 →
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1 →3)-α-L-FucNAc(1 →3)-α-D-FucNAc(1 →
多糖は、当業者には周知の方法(例えば、米国特許第6294177号に記載の方法)を用いて、黄色ブドウ球菌の好適な菌株から抽出することができる。例えば、ATCC12902は5型黄色ブドウ球菌株であり、ATCC 12605は8型黄色ブドウ球菌株である。

0208

多糖は天然のサイズでもよいし、あるいは、例えば、マイクロ流動体化、超音波照射もしくは化学処理によりサイジングしてもよい。本発明はまた、黄色ブドウ球菌由来の5および8型多糖から誘導したオリゴ多糖も包含する。

0209

本発明の免疫原性組成物に含有させる5および8型多糖は、好ましくは、後述するように、担体タンパク質と結合させるか、あるいは、結合させない。

0210

あるいはまた、本発明免疫原性組成物は、5型または8型多糖のいずれかを含有する。

0211

黄色ブドウ球菌336抗原
一実施形態では、本発明免疫原性組成物は、米国特許第6294177号に記載の黄色ブドウ球菌336抗原を含む。

0212

336抗原は、β結合ヘキソサミンを含み、Oアセチル基を一切含まず、ATCC55804で寄託された黄色ブドウ球菌336型に対する抗体に特異的に結合する。

0213

一実施形態では、336抗原は、天然のサイズの多糖であるか、あるいは、例えば、マイクロ流動体化、超音波照射もしくは化学処理によりサイジングしてもよい。本発明はまた、336抗原から誘導したオリゴ多糖も包含する。

0214

336抗原は、本発明の免疫原性組成物に含有させる場合、好ましくは、後述するように、担体タンパク質と結合させるか、あるいは、結合させない。

0215

表皮ブドウ球菌由来のI、IIおよびIII型多糖
表皮ブドウ球菌の菌株ATCC-31432、SE-360およびSE-10は、3つの異なる莢膜タイプ:それぞれI、IIおよびIII型を特徴とする(IchimanおよびYoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229)。表皮ブドウ球菌の各血清型から抽出した莢膜多糖は、I、IIおよびIII型多糖を形成する。多糖は、いくつかの方法(例えば、米国特許第4197290に記載の方法、またはIchimanら、1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176に記載の方法など)により抽出することができる。

0216

本発明の一実施形態では、本免疫原性組成物は、表皮ブドウ球菌由来のIおよび/またはIIおよび/またはIII型多糖もしくはオリゴ糖を含む。

0217

多糖は、天然のサイズの多糖であるか、あるいは、例えば、マイクロ流動体化、超音波照射もしくは化学的切断によりサイジングしてもよい。本発明はまた、表皮ブドウ球菌株から抽出したオリゴ多糖も包含する。

0218

これらの多糖は、非結合であるか、好ましくは、後述するように結合している。

0219

多糖の結合
ワクチン接種への多糖の使用に伴う問題として、多糖はそれ自体では不十分な免疫原であることが挙げられる。この免疫原性の不足を解消するために設計されてきた戦略には、バイスタンダー(bystander)T細胞の助けをもたらす大きなタンパク質担体と多糖を結合させるものがある。本発明で用いる多糖は、バイスタンダーT細胞の助けをもたらすタンパク質担体と結合するのが好ましい。多糖免疫原に結合しうるこのような担体の例を以下に挙げる:ジフテリアおよび破傷風トキソイド(それぞれDT、DT crm197およびTT)、スカシガイヘモシアニン(KLH)、ならびに、ツベルクリン精製タンパク質誘導体PPD)、緑膿菌エキソプロテインA(rEPA)、インフルエンザ菌由来のプロテインD、ニューモリシン、もしくはこれらのうちいずれかの断片。用いるのに適した断片として、Tヘルパーエピトープを含む断片が挙げられる。特に、プロテインD断片は、タンパク質のN末端1/3を含んでいるのが好ましい。プロテインDは、インフルエンザ菌(EP 0 594 610 B1)由来のIgD結合タンパク質であり、有望な免疫原である。

0220

この他に、ブドウ球菌タンパク質は、本発明の多糖コンジュゲートにおける担体タンパク質として用いてもよい。以下に記載するブドウ球菌タンパク質を担体タンパク質として用いることができる:例えば、ラミン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Fig、MAP、免疫優性ABC輸送体、IsdA、IsdB、Mg2+輸送体、SitC、Ni ABC輸送体、αトキシン(Hla)、αトキシンH35R突然変異体、RNA III活性化タンパク質(RAP)、もしくはこれらの断片。

0221

ブドウ球菌ワクチンの場合に使用するのに特に有利な新規の担体タンパク質は、ブドウ球菌αトキソイドである。これは、結合の過程で毒性が低減することから、天然形態を多糖と結合させてもよい。残留毒性が低減するため、His35LeuまたはHis35Arg変異体のような遺伝子的に解毒したαトキシンを用いるのが好ましい。あるいは、架橋試薬、ホルムアルデヒドもしくはグルタルアルデヒドでの処理により、αトキシンを化学的に解毒する。随意に、遺伝子的に解毒したαトキシンを、好ましくは、架橋試薬、ホルムアルデヒドもしくはグルタルアルデヒドでの処理により化学的に解毒し、毒性をさらに低減する。

0222

周知の方法(例えば、Likhiteによる米国特許第4,372,945号、Armorらによる米国特許第4,474,757号、およびJenningsら、米国特許第4,356,170号)のいずれかにより多糖を担体タンパク質に結合させてもよい。好ましくは、CDAP結合化学を実施する(WO 95/08348参照)。

0223

CDAPでは、シアニル試薬1-シアノ−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)を多糖−タンパク質コンジュゲートの合成に用いるのが好ましい。シアニル化反応は、比較的穏やかな条件下でで行なうことができ、これによって、アルカリ感受性多糖の加水分解を阻止する。この合成により、担体タンパク質に直接結合させることができる。

0224

多糖は水溶液または塩水に可溶性にする。CDAPをアセトニトリルに溶解させ、多糖溶液直接添加する。CDAPは、多糖のヒドロキシル基と反応して、シアネートエステルを形成する。活性化ステップの後、担体タンパク質を添加する。リシンのアミノ基が活性化多糖と反応して、イソ尿素共有結合を形成する。結合反応後、多量の過剰グリシンを添加することにより、残留活性化官能基クエンチングする。生成物ゲル透過カラムに通過させ、非反応担体タンパク質と残留試薬を除去する。

0225

結合は、担体タンパク質と多糖の直接結合を形成するものが好ましい。随意に、担体タンパク質と多糖の間にスペーサーアジピン酸水素化物ADH))を導入してもよい。

0226

黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌からの防御
本発明の好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、ブドウ球菌の1以上の菌株、好ましくは、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌の両方に由来する菌株に対して、有効な免疫応答をもたらす。さらに好ましくは、ブドウ球菌の5型および8型血清型に対し、防御免疫応答を生み出す。さらに好ましくは、表皮ブドウ球菌の複数の菌株、例えば、表皮ブドウ球菌の血清型I、IIおよびIIIの少なくとも2つの菌株に対し、防御免疫応答を生み出す。

0227

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物の使用は、病院での治療の前に、接種することにより、院内感染を予防することを目的とする。この段階で、どのブドウ球菌株に患者がさらされるかを正確に予測することは難しい。従って、ブドウ球菌の様々な菌株に対して有効な免疫応答を生み出すことができるワクチンを接種するのが有利である。

0228

有効な免疫応答は、実施例に記載するようなマウスチャレンジモデルまたはオプソニン食作用アッセイにおいて有意な防御をもたらす免疫応答として定義する。マウスチャレンジモデルにおける有意な防御、例えば、実施例5のそれは、担体を接種したマウスと比較して、LD50の少なくとも10%、20%、50%、100%もしくは200%の増加として定義する。コトンラットチャレンジモデルにおける有意な防御、例えば、実施例8のそれは、平均観測LogCFU/の少なくとも10%、20%、50%、70%もしくは90%の低下として定義される。オプソニン作用抗体の存在は、防御と相関することが知られており、従って、有意な防御は、オプソニン食作用アッセイ、例えば、実施例7のアッセイにおいて、細菌数の少なくとも10%、20%、50%、70%もしくは90%の減少により示される。

0229

免疫優性ABC輸送体、RNA III活性化タンパク質、ラミニン受容体、SitC、IsaA/PisA、SsaA、EbhA/EbhB、EbpSおよびAapは、黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の間で良好に保存され、実施例8から、IsaA、ClfA、IsdB、SdrG、HarA、FnbpAおよびSbiが、交差反応性免疫応答(例えば、少なくとも1つの黄色ブドウ球菌と少なくとも1つの表皮ブドウ球菌株との間の交差反応性)を生み出しうることがわかる。PIAもまた、黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の間で良好に保存され、交差防御免疫応答を誘発することができる。

0230

従って、好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、2、3もしくは4の前記タンパク質を含み、好ましくは、さらにPIA(PNAG)を含む。

0231

ポリヌクレオチドワクチン
別の態様では、本発明は、ブドウ球菌感染の治療、予防もしくは診断における図2のポリヌクレオチドの使用に関する。このようなポリヌクレオチドとしては、図1のアミノ酸配列に対し、配列の全長にわたって、少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、さらに好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにまた好ましくは少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。これに関し、少なくとも97%の同一性を有するポリペプチドが非常に好ましいが、少なくとも98〜99%の同一性を有するものはさらに好ましく、少なくとも99%の同一性を有するものが最も好ましい。

0232

本発明において有用な別のポリヌクレオチドとして、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対し、配列の全長にわたって、少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、さらに好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにまた好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。これに関し、少なくとも97%の同一性を有するポリペプチドが非常に好ましいが、少なくとも98〜99%の同一性を有するものはさらに好ましく、少なくとも99%の同一性を有するものが最も好ましい。

0233

その他のポリヌクレオチドとして、図1の配列に対し、少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、さらに好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにまた好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。これに関し、少なくとも97%の同一性を有するポリペプチドが非常に好ましいが、少なくとも98〜99%の同一性を有するものはさらに好ましく、少なくとも99%の同一性を有するものが最も好ましい。上記ポリヌクレオチドは好適なプラスミドまたは組換え微生物ベクターに挿入して、免疫に用いることができる(例えば、Wolffら、Science 247:1465-1468 (1990);Corrら、J. Exp. Med. 184:1555-1560 (1996);Doeら、Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8578-8583 (1996)参照)。

0234

本発明は、本発明の前記タンパク質をコードする核酸、ならびに薬剤におけるその使用を提供する。好ましい実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、一本鎖(コードまたはアンチセンス)もしくは二本鎖のいずれでもよく、また、DNA(ゲノム、cDNAもしくは合成)またはRNA分子のいずれでもよい。本発明のポリヌクレオチド内に別のコードまたは非コード配列が存在してもよいが、必ずしも必要ではない。別の関連する実施形態では、本発明は、図2に開示する配列と実質的に同一のポリヌクレオチド変異体を提供するが、該変異体は、本明細書に記載の方法(例えば、標準パラメーターを用いたBLAST分析)を用いて、本発明のポリヌクレオチドと比較して、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%以上の配列同一性を有する。関連する実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、図1のアミノ酸配列に対し、図1のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも90%、好ましくは95%以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;または前記の単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む。

0235

本発明はまた、前記ポリヌクレオチドのすべてと相補的なポリヌクレオチドの使用も考慮する。

0236

本発明はまた、被験者に投与すると、図1のポリヌクレオチドと同じ免疫原性を有する本発明のポリヌクレオチドの断片の使用も提供する。

0237

本発明は、本明細書ですでに定義した図1のタンパク質の免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドの使用も提供する。また、図2に記載したポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列の免疫原活性レベルの少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約70%、さらに好ましくは少なくとも約90%の免疫原活性レベルを有するこのような断片の使用も考えられる。

0238

本発明に従い使用するポリペプチド断片は、本明細書に記載のポリペプチド組成物(例えば、前記のもの)の少なくとも約5、10、15、20、25、50もしくは100個以上(その間に含まれる長さをすべて含む)の連続したアミノ酸を含むのが好ましい。

0239

本発明で用いるポリヌクレオチドは、ヒト発癌前または腫瘍組織(例えば、)の細胞におけるmRNA由来のcDNAライブラリーから、標準クローニングおよびスクリーニング技術を用いて、取得することができる(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1989))。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムDNAライブラリーのような天然の供給源からも得られ、あるいは、周知で、かつ商業的に入手可能な技術を用いて、合成することもできる。

0240

全長cDNAを取得する、または短いcDNAを伸長するために利用可能で、かつ当業者には周知のいくつかの方法、例えば、cDNA末端の迅速増幅(RACE)方法に基づく方法がある(例えば、Frohmanら、PNAS USA 85, 8998-9002, 1988参照)。例えば、Marathon(商標)技術(Clontech Laboratories Inc.)など、近年の技術の改良により、さらに長いcDNAの検索が有意に単純化された。Marathon(商標)技術では、選択した組織から抽出し、その両端に「アダプター」配列を結合したmRNAからcDNAが作製されている。次に、核酸増幅PCR)を実施して、遺伝子特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて、cDNAの「ミッシング(missing)」5’末端を増幅する。次に、「ネスティッド(nested)」プライマー、すなわち、増幅した産物内でアニーリングするよう設計されたプライマー(典型的には、アダプター配列において別の3’をアニーリングするアダプター特異的プライマー、および既知遺伝子配列において別の5’をアニーリングする遺伝子特異的プライマー)を用いてPCR反応を繰り返す。次に、この反応の産物をDNA配列決定により分析し、既存のcDNAに該産物を直接結合して完全な配列を取得するか、あるいは、5’プライマー設計のための新しい配列情報を用いて、個別の全長PCRを実施するかのいずれかにより、全長cDNAを構築する。

0241

このようなDNAを含むベクター、これにより形質転換した宿主、ならびに、後述のように発現させた末端切断型タンパク質またはハイブリッドタンパク質そのものは、すべて本発明の範囲に含まれる。

0242

発現系は、生きた組換え微生物、例えば、ウイルスまたは細菌でもよい。目的の遺伝子を生きた組換えウイルスまたは細菌のゲノムに挿入することができる。この生きたベクターを用いた接種およびin vivo感染により、抗原のin vivo発現および免疫応答の誘発が起こる。

0243

従って、特定の実施形態では、多数の周知のウイルスベースの系のいずれかを用いて、本発明に従い使用する免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現のための好適な哺乳動物宿主細胞に導入する。例えば、一実施形態では、レトロウイルスは、遺伝子送達系のために好都合かつ有効なプラットフォームを提供する。本発明で使用するのに選択した、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をベクターに挿入し、当分野で周知の技術を用いて、レトロウイルス粒子パッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、被験者に送達する。多数のレトロウイルス系の例が記載されている(例えば、米国特許第5,219,740号;MillerおよびRosman (1989) BioTechniques 7:980-990;Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14;Scarpaら、(1991) Virology 180:849-852;Burnsら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037;ならびに、 Boris-LawrieおよびTemin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109)。

0244

加えて、多数のアデノウイルスベースの系の例も記載されている。宿主ゲノムに組み込むレトロウイルスとは違い、アデノウイルスは、染色体外で生存し続けるため、挿入突然変異誘発に伴う危険性が最小限に抑えられる(Haj-AhmadおよびGraham (1986) J. Virol. 57:267-274;Bettら、(1993) J. Virol. 67:5911-5921;Mitterederら、(1994) Human Gene Therapy 5:717-729;Sethら、(1994) J. Virol. 68:933-940;Barrら、(1994) Gene Therapy 1:51-58;Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629;およびRichら、(1993) Human Gene Therapy 4:461-476)。

0245

多様なアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター系も、ポリヌクレオチド送達のために作製されている。AAVベクターは、当業者には周知の技術を用いて、容易に構築することができる。例えば、以下の文献を参照されたい:米国特許第5,173,414号および第5,139,941号;国際公開番号WO 92/01070およびWO 93/03769;Lebkowskiら、(1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996;Vincentら、(1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press);Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539;Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129;Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801;ShellingおよびSmith (1994) Gene Therapy 1:165-169;ならびにZhouら、(1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875。

0246

遺伝子伝達により、本発明で用いるポリペプチドをコードする核酸分子を送達するのに有用な別のウイルスベクターとして、ポックスファミリーのウイルス、例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルス由来のものが挙げられる。例として、目的の分子を発現するワクシニアウイルス組換え体を次のように構築することができる。最初に、ポリペプチドをコードするDNAを好適なベクターに挿入することにより、これが、ワクシニアプロモーターフランキングワクシニアDNA配列(例えば、チミジンキナーゼ(TK)をコードする配列)に隣接するようにする。次に、このベクターを用いて、細胞をトランスフェクションすると同時に、これら細胞をワクシニアに感染させる。相同組換えを用いて、ワクシニアプロモーターに加え、目的のポリペプチドをコードする遺伝子をウイルスゲノムに挿入する。5-ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、これに耐性のウイルスプラーク採取することにより、得られたTK.sup.(-)組換え体を選択することができる。

0247

生物の宿主細胞において、本明細書に記載する1以上のポリペプチドの誘導性一過性発現または共発現を達成するために、ワクシニアを用いた感染/トランスフェクション系を用いるのが好都合である。この具体的系では、最初に、バクテリオファージT7RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体に細胞をin vitroで感染させる。このポリメラーゼは、T7プロモーターを有する鋳型しか転写しないという鋭敏特異性を示す。感染後、T7プロモーターにより駆動した目的の(単数または複数の)ポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクションする。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質に発現したポリメラーゼは、トランスフェクションしたDNAをRNAに転写するが、これは次に、宿主の翻訳機構によりポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のRNAの高レベル一過性細胞質生産と、その翻訳産物をもたらす。例えば、Elroy-SteinおよびMoss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743-6747;Fuerstら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122-8126を参照のこと。

0248

あるいは、アビポックスウイルス(例えば、鶏痘およびカナリアポックスウイルスなど)を用いて、目的のコード配列を送達することもできる。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非トリ種に投与すると、防御免疫を賦与することが知られている。アビポックス属は、感受性の高いトリ種でしか生産的に複製することができず、従って、哺乳動物細胞には感染性でないため、アビポックスベクターの使用はヒトおよびその他の哺乳動物種において特に望ましい。組換えアビポックスウイルスを作製する方法は、当分野では周知であり、ワクシニアウイルスの作製に関しては、前述のように、遺伝子組換えを用いる。例えば、WO 91/12882;WO 89/03429;およびWO 92/03545を参照。

0249

また、多数のアルファウイルスベクターのいずれかを用いて、本発明で用いるポリヌクレオチド組成物を送達することができ、このようなベクターは例えば、米国特許第5,843,723号;第6,015,686号;第6,008,035号および第6,015,694号に記載されている。ベネズエラウマ脳炎(VEE)に基づく特定のベクターも用いることができ、それらの例は米国特許第5,505,947号および第5,643,576号に記載されている。

0250

さらに、分子コンジュゲートベクター、例えば、Michaelら、J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869およびWagnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103に記載したアデノウイルスキメラベクターを、本発明に従う遺伝子送達に用いることもできる。

0251

これ以外にも、前記およびその他の周知のウイルスを用いた送達系について実例を示す情報は、例えば、以下の文献にみいだすことができる:Fisher-Hochら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989;Flexnerら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989;Flexnerら、Vaccine 8:17-21, 1990;米国特許第4,603,112号、第4,769,330号および第5,017,487号;WO 89/01973;米国特許第4,777,127号;GB 2,200,651;欧州特許第0,345,242号;WO 91/02805;Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988;Rosenfeldら、Science 252:431-434, 1991;Kollsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994;Kass-Eislerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993;Guzmanら、Circulation 88:2838-2848, 1993;ならびにGuzmanら、Cir. Res. 73:1202-1207, 1993。

0252

前述の生きた組換え微生物は毒性でもよいし、あるいは、生ワクチンにするために様々な方法で弱毒化してもよい。このような生ワクチンも本発明の範囲に含まれる。

0253

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムに組み込むことができる。この組込みは、相同性組換え(遺伝子置換)を介した特定の位置および配向で行なっても、あるいは、ランダムな非特定位置(遺伝子添加)に組み込んでもよい。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、DNAの個別のエピソームセグメントとして、細胞中に安定して維持することができる。このようなポリヌクレオチドセグメント、すなわち、「エピソーム」は、宿主細胞周期とは独立に、またはこれと同期して、維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物を細胞に送達し、細胞中にポリヌクレオチドを維持する様式は、用いた発現構築物の種類によって変わる。

0254

本発明の別の実施形態では、ポリヌクレオチドを「ネイキッド」DNAとして投与/送達するが、これは、例えば、Ulmerら、Science 259:1745-1749, 1993に記載され、Cohen, Science 259:1691-1692, 1993により総説されている。ネイキッドDNAの取込みは、生物分解性ビーズにDNAをコーティングすることにより増加することができ、細胞に該ビーズを効率的に輸送する。

0255

別の実施形態では、本発明の組成物をパーティクルボンバードメント手法により送達するが、これらの多くは記載されている。一実施例では、ガス駆動粒子加速を、装置(例えば、Powderject PharmaceuticalsPLC(英国オックスフォード)およびPowderject Vaccines Inc.(ウィスコシン州マディソン)製装置)で達成するが、そのいくつかの例が以下の文献に記載されている:米国特許第5,843,796号;第6,010,487号;第5,865,796号;第5,584,807号;および欧州特許第0500 799号。この手法は、針のない送達手法を提供し、その際、手で保持した装置により生成されるヘリウムガスジェット内で、顕微鏡的粒子(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド粒子)の乾燥粉末製剤高速まで加速し、粒子を目的の標的組織中に噴射する。

0256

関連する実施形態では、本発明の組成物のガス駆動針なし注射に有用なその他の装置および方法として、Bioject, Inc.(オレゴン州ポートランド)により提供されるものが挙げられ、その例が、米国特許第4,790,824号;第5,064,413号;第5,312,335号;第5,383,851号;第5,399,163号;第5,520,639号および第5,993,412号に記載されている。

0257

ワクチン
好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物を、薬学的に許容される賦形剤、さらに好ましくはアジュバントと混合することにより、ワクチンを形成する。

0258

本発明のワクチンにアジュバントを添加するのが好ましい。好適なアジュバントとして、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲルミョウバン)またはリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウムマグネシウム、鉄もしくは亜鉛の塩でもよく、あるいは、アシル化チロシン、アシル化糖、カチオン性もしくはアニオン性誘導体化した多糖またはポリホスホスファゼンの不溶性懸濁液でもよい。

0259

TH1またはTH2型応答のいずれかの優先誘発物質となるようなアジュバントを選択するのが好ましい。高レベルのTh1型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞性免疫応答の誘発を助ける傾向があるのに対し、高レベルのTh2型サイトカインは、該抗原に対する体液性免疫応答の誘発を助ける傾向がある。

0260

Th1およびTh2型免疫応答の区別は絶対的ではないことに留意する必要がある。実際には、個体は、主にTh1または主にTh2として表示される免疫応答を支持する。しかし、多くの場合、MosmannおよびCoffmanによりマウスCD4 +veT細胞クローンに記載されている(Mosmann, T.R.およびCoffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173)ような表現でサイトカインのファミリーを考えるのが好都合である。伝統的には、Th1-型応答は、T-リンパ球によるINF-γおよびIL-2サイトカインの生産と関連している。Th1-型免疫応答の誘発に直接関連することが多いその他のサイトカインは、T細胞(例えば、IL-12)により生産されない。対照的に、Th2型応答は、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10の分泌に関連する。主にTh1型応答を促進する好適なアジュバント系を以下に挙げる:モノホスホリルリピドAまたはその誘導体、具体的には3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)(その調製については、GB2220211 Aを参照);ならびに、モノホスホリルリピドA、好ましくは、アルミニウム塩(例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム)もしくは水中油型エマルションのいずれかと、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAとの組合せ。このような組合せの場合、同じ粒状構造に抗原と3D-MPLを含有させることにより、抗原および免疫刺激シグナルのさらに効率的な送達が可能になる。様々な研究から、3D-MPLはミョウバン吸着抗原の免疫原性をさらに増強できることが明らかにされた[Thoelenら、Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1]。

0261

増強された系には、モノホスホリルリピドAとサポニンの組合せ、特に、WO 94/00153に開示されているようなQS21と3D-MPLの組合せ、もしくは、WO 96/33739に開示されているように、QS21をコレステロールでクエンチングする低反応原性(less reactogenic)組成物が含まれる。水中油型エマルションにQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に効力の高いアジュバントがWO 95/17210に記載されており、これは好ましい製剤である。好ましくは、前記に加え、ワクチンはサポニン、さらに好ましくはQS21を含む。製剤は、さらに水中油型エマルションとトコフェロール(WO 95/17210)を含んでもよい。本発明は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、3D-MPLと一緒に本発明のタンパク質を混合することを含む、ワクチン製剤の製造方法も提供する。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(WO 96/02555)もまたTH1応答の好ましい誘導物質であり、本発明における使用に適している。

0262

本発明の好ましい組成物は、リポソーム構造を形成する組成物である。ステロール/免疫学的には活性のサポニン画分ISCOM構造を形成する組成物も本発明の一形態をなす。

0263

QS21:ステロールの比は、典型的におよそ1:100〜1:1重量/重量(w/w)である。好ましくは、過剰ステロールが存在し、QS21:ステロールの比は、少なくとも1:2w/wである。ヒトへの投与のために、典型的には、QS21とステロールは、1用量当たり約1μg〜約100μg、好ましくは約10μg〜約50μgの範囲でワクチンに存在する。

0264

リポソームは、好ましくは、中性脂質、例えば、ホスファチジルコリンを含み、これは、室温で非晶質であるのが好ましく、例えば、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンもしくはジラウリルホスファチジルコリンである。リポロームはまた、飽和脂質からなるリポソームのリポソーム−QS21構造の安定性を高める荷電脂質を含んでもよい。これらのケースでは、荷電脂質の量は好ましくは1〜20%w/w、最も好ましくは5〜10%である。ステロールとリン脂質の比は1〜50%(モル/モル)、最も好ましくは20〜25%である。

0265

好ましくは、本発明の組成物は、MPL(3-脱アシル化モノ-ホスホリルリピドA、3D-MPLとしても知られる)を含む。3D-MPLは、3種類の脱-O-アシル化モノホスホリルリピドAと4、5もしくは6のアシル化鎖との混合物としてGB 2 220 211(Ribi)から知られ、Ribi Immunochem(モンタナ州)により製造される。好ましい形態は、国際公開出願番号92/116556に開示されている。

0266

本発明の好適な組成物は、初めに、MPLなしでリポソームを調製し、次に、好ましくは100 nm粒子としてMPLを添加する。従って、MPLは小胞膜内に含まれない(MPLアウトとして知られる)。MPLが小胞膜内に含まれる(MPLインとして知られる)組成物も本発明の一形態をなす。抗原は、小胞膜内または小胞膜外のいずれに含有させてもよい。可溶性抗原は膜外にあるのが好ましく、また、疎水性もしくは脂質化抗原は膜内または外のいずれに含有させてもよい。

0267

本発明のワクチン製剤を用いて、全身または粘膜経路を介した該ワクチンの投与により、感染しやすい哺乳動物を防御または治療することができる。このような投与としては、筋内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路;または、口内/消化管気道、尿生殖管への粘膜投与が挙げられる。肺炎または耳炎媒体の治療のためにはワクチンの鼻内投与が好ましい(肺炎球菌の鼻咽頭保有は、より有効に予防することができ、従って、早期段階で感染を軽減するため)。本発明のワクチンは単一用量として投与することもできるが、その成分を同時に、または時間を変えて共投与してもよい(例えば、免疫応答相互の最適な協調を達成するために、肺炎球菌多糖は、ワクチンの細菌タンパク質成分の投与と同時に、またはその1〜2週間後、別々に投与することができる)。共投与のために、任意のTh1アジュバントを様々な投与形態の一部または全部に存在させてもよいが、これは、ワクチンの細菌タンパク質成分と組み合わせて含有する場合に好ましい。単一の投与経路以外にも、2つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、多糖をIM(またはID)投与し、細菌タンパク質をIN(またはID)投与することができる。さらには、本発明のワクチンを初回免疫ではIM投与し、追加免疫ではIN投与することも可能である。

0268

各ワクチン用量におけるコンジュゲート抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意な有害副作用を起こさずに、免疫防御性応答を誘発する量として選択する。このような量は、どの具体的免疫原を用いたか、またどのようにそれが提示されるかに応じて変動する。一般に、各用量は、0.1〜100μgの多糖、好ましくは0.1〜50μgの多糖コンジュゲート、好ましくは0.1〜10μg、さらに好ましくは1〜10μgの多糖を含み、中でも1〜5μgがさらに好ましい範囲である。

0269

タンパク質抗原の含量は、典型的には1〜100μg、好ましくは5〜50μg、最も典型的には5〜25μgの範囲にある。最初のワクチン接種後、適切な間隔をおいて、1または複数回の追加免疫を被験者に実施してもよい。

0270

ワクチン製剤は、Vaccine Design(“The subunit and adjuvant approach” (Powell M.F.およびNewman M.J.編) (1995 Plenum Press New York)に概要が記載されている。リポソーム内への包膜はFullertonにより、米国特許第4,235,877号に記載されている。

0271

本発明のワクチンは溶液として、または凍結乾燥させて保存することができる。好ましくは、スクローストレハロースもしくはラクトースのような糖の存在下で溶液を凍結乾燥する。さらには、凍結乾燥し、使用前に即座に再構成するのが好ましい。凍結乾燥によって、さらに安定した組成物(ワクチン)が得られ、3D-MPLの存在下で、しかもアルミニウム主体のアジュバントの非存在下で、より高い抗体力価を達成できると考えられる。

0272

抗体および受動免疫
本発明の別の態様は、本発明のワクチンで受容者を免疫し、該受容者から免疫グロブリンを単離する各ステップを含む、ブドウ球菌感染の予防または治療に用いるための免疫グロブリンの調製方法である。この方法により調製した免疫グロブリンもまた本発明の別の態様である。本発明の免疫グロブリンと薬学的に許容される担体を含む医薬組成物は、ブドウ球菌疾患の治療または予防のための薬剤の製造に用いることができる本発明の別の態様である。有効な量の本発明の医薬調製物を患者に投与するステップを含む、ブドウ球菌感染の治療または予防方法も、本発明の別の態様である。

0273

ポリクローナル抗体生産のための接種物は、典型的に、生理学的に許容される希釈液(例えば、塩水)、またはヒトへの使用に適したその他のアジュバントに抗原性組成物を分散させて、水性組成物を形成することにより調製する。免疫刺激量の接種物を哺乳動物に投与した後、抗原性組成物が防御抗体を誘発するのに十分な時間、接種した哺乳動物を維持する。

0274

周知の技術(例えば、アフィニティークロマトグラフィー)により所望の程度まで抗体を単離することができる(HarlowおよびLane, Antibodies; a laboratory manual 1988)。

0275

抗体としては、通常用いられる多種の動物、例えば、ヤギ霊長類ロバ白鳥ウマモルモット、ラットもしくはヒトに由来する抗血清製剤が挙げられる。動物から採血し、血清を回収する。

0276

本発明に従い生産される免疫グロブリンとしては、全抗体、抗体フラグメントもしくはサブフラグメントが挙げられる。抗体は、あらゆるクラス、例えば、IgG、IgMIgA、IgDもしくはIgE全免疫グロブリンキメラ抗体、もしくは本発明の2以上の抗原に対し二重特異性を有するハイブリッド抗体でよい。これらはまた、フラグメント、例えば、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fvなど(ハイブリッドフラグメントを含む)でもよい。また、免疫グロブリンには、特定の抗原に結合して、複合体を形成することにより、抗体のように作用する天然、合成もしくは遺伝子工学により作製したタンパク質も含まれる。

0277

本発明のワクチンを受容者に投与することもでき、この後、該受容者は、具体的ワクチンからのチャレンジに応答して産生される免疫グロブリンの供給源としての役割を果たす。このような処理を受けた被験者が血漿を供与し、この血漿から、通常の血漿分画方法によって超免疫グロブリンが得られる。ブドウ球菌感染に対する耐性を賦与するか、またはそのような感染を治療するために、上記超免疫グロブリンを別の被験者に投与する。本発明の免疫グロブリンは、特に、小児、免疫弱体化個体の治療または予防、あるいは治療が必要な場合および個体がワクチン接種に応答して抗体を産生する時間がない場合に有用である。

0278

本発明の別の形態は、本発明の免疫原性組成物の少なくとも2つの成分に対して反応性の2以上のモノクローナル抗体(もしくはそのフラグメント;好ましくは、ヒトまたはヒト化)を含む医薬組成物であり、これを用いて、グラム陽性菌、好ましくは、ブドウ球菌、さらに好ましくは黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌の感染を治療または予防することができる。

0279

このような医薬組成物はモノクローナル抗体を含み、該モノクローナル抗体は、本発明の2以上の抗原に対し特異性を有する、あらゆるクラス(例えば、IgG、IgM、IgDもしくはIgE)の全免疫グロブリン、キメラ抗体もしくはハイブリッド抗体でよい。これらはまた、フラグメント、例えば、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fvなど(ハイブリッドフラグメントを含む)でもよい。

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