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技術 RNA配列の測定方法

出願人 東ソー株式会社
発明者 武藤悠
出願日 2016年8月23日 (4年2ヶ月経過) 出願番号 2016-162429
公開日 2018年3月1日 (2年8ヶ月経過) 公開番号 2018-029496
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 効果確認 リアルタイムモニタ 測定シグナル MICR 蛍光強度変化 測定溶液 TRC 測定原理
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2018年3月1日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (4)

課題

RNA配列測定方法を提供する。

解決手段

RNA配列の測定方法において、測定対象のRNA配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するRNA鎖蛍光剤、及び消光剤を有するプローブ、並びにRNaseIII活性を有する酵素を用いて、(i)測定対象のRNA配列とプローブとの間でRNA二重鎖を形成させ、(ii)RNaseIII活性を有する酵素によりRNA二重鎖を切断し、(iii)消光が解消された蛍光剤由来蛍光を検出する。

概要

背景

PCR反応増幅DNAをリアルタイムで検出するプローブとしてTaqManプローブ(非特許文献1)が多用される。TaqManプローブはPCR反応液中のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の働きにより蛍光剤消光剤遊離されるため、大きな検出時蛍光強度を有する。この大きな蛍光強度変化はリアルタイムPCR蛍光プローブとして優れており、研究用試薬臨床診断薬のプローブとして多用されている。

一方で、RNA増幅反応であるTRC反応(非特許文献2)では、増幅核酸がRNAであるので、反応系でエキソヌクレアーゼ活性を利用できないため、TaqManプローブを用いることができない。そのため、INAFプローブなどの蛍光プローブが用いられる(非特許文献2)。TRC反応にINAFプローブなどのDNA骨格のプローブを用いた際、RNA−プローブ二重鎖(RNA−DNA二重鎖)のRNAが反応液中に存在するRNaseHにより分解され、INAFプローブ由来蛍光消光されるため、検出感度を低下していることが考えられた。

また、INAFプローブは、相補的配列核酸とのハイブリダイゼーションによる蛍光剤の周辺環境変化により蛍光増幅するプローブであり、TaqManプローブのような蛍光剤と消光剤の遊離を含まないため、大きな検出時蛍光強度変化を得ることが難しかった。

概要

RNA配列測定方法を提供する。 RNA配列の測定方法において、測定対象のRNA配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するRNA鎖、蛍光剤、及び消光剤を有するプローブ、並びにRNaseIII活性を有する酵素を用いて、(i)測定対象のRNA配列とプローブとの間でRNA二重鎖を形成させ、(ii)RNaseIII活性を有する酵素によりRNA二重鎖を切断し、(iii)消光が解消された蛍光剤由来の蛍光を検出する。

目的

本発明の目的は、測定対象RNAの検出時に蛍光剤と消光剤が解離されるRNA検出用プローブを利用した測定方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

RNA配列測定方法において、測定対象のRNA配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するRNA鎖蛍光剤、及び消光剤を有するプローブ、並びにRNaseIII活性を有する酵素を用いて、(i)測定対象のRNA配列とプローブとの間でRNA二重鎖を形成させ、(ii)RNaseIII活性を有する酵素によりRNA二重鎖を切断し、(iii)消光が解消された蛍光剤由来蛍光を検出する、ことを特徴とするRNA配列測定方法。

請求項2

プローブが、RNA鎖の一端に蛍光剤、他端に消光剤を有するものである、請求項1に記載の方法。

請求項3

蛍光剤がFAM、消光剤がBHQ1である、請求項1または2に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、RNA配列測定方法に関するものである。

背景技術

0002

PCR反応増幅DNAをリアルタイムで検出するプローブとしてTaqManプローブ(非特許文献1)が多用される。TaqManプローブはPCR反応液中のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の働きにより蛍光剤消光剤遊離されるため、大きな検出時蛍光強度を有する。この大きな蛍光強度変化はリアルタイムPCR蛍光プローブとして優れており、研究用試薬臨床診断薬のプローブとして多用されている。

0003

一方で、RNA増幅反応であるTRC反応(非特許文献2)では、増幅核酸がRNAであるので、反応系でエキソヌクレアーゼ活性を利用できないため、TaqManプローブを用いることができない。そのため、INAFプローブなどの蛍光プローブが用いられる(非特許文献2)。TRC反応にINAFプローブなどのDNA骨格のプローブを用いた際、RNA−プローブ二重鎖(RNA−DNA二重鎖)のRNAが反応液中に存在するRNaseHにより分解され、INAFプローブ由来蛍光消光されるため、検出感度を低下していることが考えられた。

0004

また、INAFプローブは、相補的配列核酸とのハイブリダイゼーションによる蛍光剤の周辺環境変化により蛍光増幅するプローブであり、TaqManプローブのような蛍光剤と消光剤の遊離を含まないため、大きな検出時蛍光強度変化を得ることが難しかった。

先行技術

0005

J. CLIN.MICROBIOL. 2516−2519, 2000
Anal. Biochem. 314::77−86, 2003

発明が解決しようとする課題

0006

本発明の目的は、測定対象RNAの検出時に蛍光剤と消光剤が解離されるRNA検出用プローブを利用した測定方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

0007

上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
(1)RNA配列の測定方法において、測定対象のRNA配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するRNA鎖、蛍光剤、及び消光剤を有するプローブ、並びにRNaseIII活性を有する酵素を用いて、
(i)測定対象のRNA配列とプローブとの間でRNA二重鎖を形成させ、
(ii)RNaseIII活性を有する酵素によりRNA二重鎖を切断し、
(iii)消光が解消された蛍光剤由来の蛍光を検出する、
ことを特徴とするRNA配列の測定方法。
(2)プローブが、RNA鎖の一端に蛍光剤、他端に消光剤を有するものである(1)に記載の方法。
(3)蛍光剤がFAM、消光剤がBHQ1である、(1)または(2)に記載の方法。

0008

以下、本発明を詳細に説明する。
(1)測定原理
本発明の測定原理の概略を図1に示す。図1は本発明の代表的な測定原理を示す図であり、本発明はこれに限定されない。
(1−1)測定対象のRNA配列の少なくとも一部に対して相補的配列を有するRNAプローブと測定対象のRNAとの間でRNA−RNA二重鎖が形成される
(1−2)RNaseIII活性を有する酵素の働きにより、当該RNA二重鎖が分解される。
(1−3)その結果、プローブ分子中の蛍光剤と消光剤が解離し、蛍光の消光が解消される。
(1−4)消光が解消された蛍光剤由来の蛍光を検出する。

0009

(2)プローブ
本発明に用いられるプローブは、測定対象のRNA配列の少なくとも一部と相補的な配列を有し、その結果、測定対象のRNAと二重鎖を形成可能なRNAプローブであり、プローブ中に蛍光剤及び消光剤を有するものであればよい。特にプローブRNAの一端に蛍光剤、他端に消光剤を有するものが好ましい。プローブのRNAの鎖長はRNaseIII活性を有する酵素によって、RNA二重鎖を切断可能な長さであり、消光剤による蛍光消光が起こり得る長さであればよい。本発明におけるプローブのRNAの長さは15〜40塩基が好ましい。

0010

(3)蛍光剤及び消光剤
本発明に用いられる蛍光剤及び消光剤は、消光剤による蛍光消光が起こりうる組合せであればよく、例えば通常のリアルタイムPCRに用いられるものを用いればよく特に限定されない。具体的には、蛍光剤としてはFAM、TET、Cy5などを、消光剤としてはBHQ1、TAMRAなどを用いればよい。特に蛍光剤としてはFAM、消光剤としてはBHQ1が好ましい。

0011

(4)RNaseIII活性を有する酵素
本発明に用いられるRNaseIII活性を有する酵素は、RNA二重鎖を分解可能な酵素であればよく特に限定されないが、RNaseIIIなどを挙げることができる。RNaseIII活性を有する酵素の由来に特に制限はないが、本発明においては、より短鎖のRNA二重鎖を切断可能なE.Coli由来の酵素を用いることが好ましい。

0012

(5)検出装置
検出装置を必要とする場合は、リアルタイムPCR装置を用いればよい。また本実施例で用いた、TRCRリアルタイムモニター(TRCRapid−160 東ソー製)を用いてもよい。

発明の効果

0013

本発明の方法によれば、RNAプローブは、RNA検出時に蛍光剤と消光剤とが解離するため、大きな測定シグナルを得ることが可能である。

図面の簡単な説明

0014

本発明の測定系の概要を示す図である。
各濃度のRNAを測定した際の蛍光強度変化を示す図である。
反応系中のRNaseIIIの有無による蛍光強度変化の違いを示す図である。

0015

以下、本発明を実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。
実施例1プローブの作製
5’末端をFAM、3’末端をBHQ1で修飾したプローブ(配列番号1)はグライナー社による受託合成により作製した。

0016

実施例2測定対象RNAの作製
配列番号1と相補的な配列を有するRNA(配列番号2)はグライナー社による受託合成により作製した。

0017

実施例3 RNAの測定
実施例2で作製したRNAを実施例1で作製したプローブを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度などの詳細を以下に示す。プローブ40nM、RNaseIII(E. coli, Life technologies) 3U/30μL、RNaseIII Buffer(Life technologies)、反応温度42℃。

0018

上記測定溶液中に各濃度の実施例2で作製したRNAを共存させ、プローブ由来の蛍光強度の変化を時間経過ごとにTRCRapid−160(東ソー製)を用いて確認した。結果を図2に示す。RNA濃度に応じて時間あたりの蛍光強度増幅が起こることが確認された。

0019

実施例4RNaseIIIの効果確認
25nMの実施例2で作製したRNA存在下で、RNaseIIIの有無での蛍光強度変化を確認した。測定溶液中のプローブ濃度などの詳細を以下に示す。実施例1で作製したプローブ40nM、RNaseIII Buffer(Life technologies)、反応温度42℃。RNaseIIIが有りの場合は、RNaseIII(E. coli, Life technologies) 3U/30μL。

0020

上記測定溶液中でRNaseIIIの有無による、プローブ由来の蛍光強度変化を時間経過ごとにTRCRapid−160(東ソー製)を用いて確認した。結果を図3に示す。RNaseIIIが存在する時のみ、時間経過に応じて蛍光強度が増幅することが確認された。

0021

以上の結果から、本発明の方法により、RNAを測定できることが確認された。

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