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技術 細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド

出願人 モデルナティエックスインコーポレイテッド
発明者 バンセル、ステファヌチャクラボルティ、ティルタドゥフジェローレ、アントニンエルバシール、セイダエム.ジョン、マティアスロイ、アタヌホリスキー、スーザンウッド、クリスティエム.ハタラ、ポールシュラム、ジェイソンピー.エジェベ、ケネチエルスワース、ジェフリンギルド、ジャスティン
出願日 2017年8月2日 (2年8ヶ月経過) 出願番号 2017-149905
公開日 2018年2月15日 (2年2ヶ月経過) 公開番号 2018-023373
状態 拒絶査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 ペプチド又は蛋白質 化合物または医薬の治療活性 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 微生物による化合物の製造
主要キーワード タイガ 構造質量 均質薄膜 研磨デバイス 負電荷イオン 係留物 大気組成 ペルフルオロ炭素
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重要な関連分野

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図面 (14)

課題

目的とするポリペプチドをコードし、例えば、構造的及び機能的完全性を保持し、発現閾値を克服し、発現速度半減期、及び/又はタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、かつ免疫応答等の有害な生物応答及び/又は分解経路を回避しながら、核酸治療薬の製剤化及び送達の最適化に有用な特徴を有する核酸系化合物又はポリヌクレオチドの提供。

解決手段

本発明に係るポリヌクレオチドは、特定の配列からなる群から選択される目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域と、5’UTR、3’UTR、5’キャップ、及びポリ尾部とを含む。

概要

背景

タンパク質発現を生じさせる従前の方法には多くの問題がある。例えば、導入されたDNAは、ある頻度宿主細胞ゲノムDNAに組み込まれて、宿主細胞ゲノムDNAの変性および/または損傷をもたらし得る。あるいは、細胞に導入された異種デオキシリボ核酸(DNA)は、娘細胞(異種DNAが染色体に組み込まれたか否かにかかわらず)に、または子孫継承され得る。

加えて、適切に送達され、かつ宿主ゲノムの損傷も組み込みもないと仮定して、コードされたタンパク質が作製される前に生じなければならないステップが多く存在する。いったん細胞内に入ると、DNAは、それがRNA転写される核内に輸送されなければならない。その後、DNAから転写されたRNAは、それがタンパク質に翻訳される細胞質に入らなければならない。投与されたDNAからタンパク質までの複数の処理ステップが機能タンパク質の生成前に時間差を生み出すだけでなく、各ステップは、細胞のエラーおよび損傷の機会にもなる。さらに、DNAが頻繁に細胞に入るが、発現されないか、または妥当な速度もしくは濃度で発現されないため、細胞におけるDNA発現を達成することが困難であることが知られている。これは、DNAが一次細胞または修飾細胞株に導入されるときに特に問題になり得る。

1990年代初めに、Bloomおよび同僚は、インビトロで転写されたバソプレシンmRNA視床下部注入することによってバソプレシン欠乏ラット救助成功した(Science 255:996−998;1992)。しかしながら、低レベルの翻訳および分子免疫原性治療薬としてのmRNAの開発を妨害し、それ以来、むしろこれらの落とし穴を利用し得る代替用途、すなわち、癌抗原をコードするmRNAでの免疫化に労力を集中させている。

他者は、目的とするポリペプチドを送達するためのmRNAの使用を研究しており、m
RNA分子のある特定の化学修飾、具体的には、シュードウリジンおよび5−メチルシトシン免疫刺激作用を低下させたことを示している。

これらの研究は、例えば、Ribostem Limitedの2003年7月9日に出願され、現在は放棄されている英国特許出願第0331894.2号、国際公開第WO2005005622号として公開されている2004年7月9日出願のPCT出願第PCT/GB2004/002981号、米国特許第US20060247195号として公開され、現在は放棄されている2006年6月8日出願の米国特許出願国内段階登録第10/563,897号、および欧州特許EP1646714号として公開され、現在撤回されている2004年7月9日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2004743322号;Novozymes,Inc.の国際公開第WO2008140615号として公開された2007年12月19日出願のPCT出願第PCT/US2007/88060号、米国特許第US20100028943号として公開された2009年7月2日出願の米国特許出願国内段階登録第12/520,072号、および欧州特許第EP2104739号として公開された2009年7月7日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2007874376号;ロチェスター大学の国際公開第WO2007064952号として公開された2006年12月4日出願のPCT出願第PCT/US2006/46120号、および米国特許第US20070141030号として公開された2006年12月1日出願の米国特許出願第11/606,995号;BioNTech AGの2007年12月14日に出願され、現在は放棄されている欧州特許出願第EP2007024312号、国際公開第WO2009077134号として公開された2008年12月12日出願のPCT出願第PCT/EP2008/01059号、欧州特許第EP2240572号として公開された2010年6月2日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2008861423号、米国特許第US20110065103号として公開された2010年11月24日出願の米国特許出願国内段階第12/,735,060号、2005年9月28日出願の独国特許出願第DE 10 2005 046 490号、国際公開第WO2007036366号として公開された2006年9月28日出願のPCT出願第PCT/EP2006/0448号、2012年3月21日出願の国内段階欧州特許第1934345号、および第20100129877号として公開された2009年8月14日出願の国内段階米国特許出願第11/992,638号;Immune Disease Institute Inc.の米国特許第US20120046346号として公開された2011年4月15日出願の米国特許出願第13/088,009号および国際公開第WO20110130624号として公開された2011年4月15日出願のPCT出願第PCT/US2011/32679号;Shire HumanGenetic Therapeuticsの米国特許第US20110244026号として公開された2010年11月20日出願の米国特許出願第12/957,340号;Sequitur Inc.の国際公開第WO1999014346号として公開された1998年9月18日出願のPCT出願第PCT/US1998/019492号;The Scripps Research Instituteの国際公開第WO2010098861号として公開された2010年2月24日出願のPCT出願第PCT/US2010/00567号、および米国特許第US20120053333号として公開された2011年11月3日出願の米国特許出願国内段階登録第13/203,229号;ルートヴィヒ・マクシリアン大学の国際公開第WO2011012316号として公開された2010年7月30日出願のPCT出願第PCT/EP2010/004681号;Cellscript Inc.の2008年6月30日に出願され、2011年10月18日に許可された米国特許第8,039,214号、米国特許第US20110143436号として公開された2010年12月7日出願の米国特許出願第12/962,498号、米国特許第US20110143397号として公開された2010年12月7日出願の同第12/962,468号、米国特許第US20120009649号として公開された2011年9月20日出願の同第13/237,451号、ならびに国際公開第
WO2011071931号として公開された2010年12月7日出願のPCT出願PCT/US2010/59305、および国際公開第WO2011071936号として公開された2010年12月7日出願の同第PCT/US2010/59317号;ペンシルベニア大学理事会の国際公開第WO2007024708号として公開された2006年8月21日出願のPCT出願第PCT/US2006/32372号、および米国特許第US20090286852号として公開された2009年3月27日出願の米国特許出願国内段階第11/990,646号;CurevacGMBHの2001年6月5日出願の独国特許出願第DE10 2001 027 283.9号、2001年12月19日出願の同第DE10 2001 062 480.8号、および2006年10月31日出願の同第DE 20 2006 051 516号(これらすべて放棄されている)、2005年3月30日に許可された欧州特許第EP1392341号、および2008年1月2日に許可された欧州特許第EP1458410号、国際公開第WO2002098443号として公開された2002年6月5日出願のPCT出願第PCT/EP2002/06180号、国際公開第WO2003051401号として公開された2002年12月19日出願の同第PCT/EP2002/14577号、国際公開第WO2008052770号として公開された2007年12月31日出願の同第PCT/EP2007/09469号、国際公開第WO2009127230号として公開された2008年4月16日出願の同第PCT/EP2008/03033号、国際公開第WO2006122828号として公開された2005年5月19日出願の同第PCT/EP2006/004784号、国際公開第WO2008083949号として公開された2007年1月9日出願の同第PCT/EP2008/00081号、ならびに米国特許第US20050032730号として公開された2003年12月5日出願の米国特許出願第10/729,830号、米国特許第US20050059624号として公開された2004年6月18日出願の同第10/870,110号、米国特許第US20080267873号として公開された2008年7月7日出願の同第11/914,945号、米国特許第US2010047261号として公開され、現在は放棄されている2009年10月27日出願の同第12/446,912号、米国特許第US20100189729号として公開された2010年1月4日出願の同第12/522,214号、米国特許第US20110077287号として公開された2010年5月26日出願の同第12/787,566号、米国特許第US20100239608号として公開された2010年5月26日出願の同第12/787,755号、米国特許第US20110269950号として公開された2011年7月18日出願の同第13/185,119号、および米国特許第US20110311472号として公開された2011年5月12日出願の同第13/106,548号に記載されており、これらはすべて、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

シュードウリジンおよび5−メチル−シトシンを含む化学修飾の選択に限定されているこれらの報告書にもかかわらず、細胞内翻訳の効果的な調節およびポリペプチドまたはその断片をコードする核酸の処理を取り巻く無数障壁対処する治療法当技術分野において依然として必要とされている。

この目的を達成するために、本発明者らは、ある特定の修飾mRNA配列が、単に免疫応答を逃れるか、回避するか、または低減させるだけではない利点を有する治療薬としての可能性を有することを示した。そのような研究は、公開された同時係属出願である、2011年8月5日出願の国際出願第PCT/US2011/046861号および2011年10月3日出願の同第PCT/US2011/054636号、2011年10月3日出願の国際出願第PCT/US2011/054617号に詳述されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、目的とするポリペプチド(例えば、修飾mRNAまたはmmRNA)をコー
ドし、当技術分野における課題のうちの1つ以上を回避する構造的および/または化学的特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持し、発現の閾値を克服し、発現速度半減期、および/またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、かつ免疫応答等の有害な生物応答および/または分解経路を回避しながら、核酸系治療薬の製剤化および送達の最適化に有用な特徴を有する核酸系化合物またはポリヌクレオチドを提供することによって、この必要性に対処する。

概要

目的とするポリペプチドをコードし、例えば、構造的及び機能的完全性を保持し、発現の閾値を克服し、発現速度、半減期、及び/又はタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、かつ免疫応答等の有害な生物応答及び/又は分解経路を回避しながら、核酸系治療薬の製剤化及び送達の最適化に有用な特徴を有する核酸系化合物又はポリヌクレオチドの提供。本発明に係るポリヌクレオチドは、特定の配列からなる群から選択される目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域と、5’UTR、3’UTR、5’キャップ、及びポリ尾部とを含む。なし

目的

本発明は、目的とするポリペプチド(例えば、修飾mRNAまたはmmRNA)をコー
ドし、当技術分野における課題のうちの1つ以上を回避する構造的および/または化学的特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持し、発現の閾値を克服し、発現速度、半減期、および/またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、かつ免疫応答等の有害な生物応答および/または分解経路を回避しながら、核酸系治療薬の製剤化および送達の最適化に有用な特徴を有する核酸系化合物またはポリヌクレオチドを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

単離ポリヌクレオチドであって、(a)結合ヌクレオシドの第1の領域であって、前記第1の領域が目的とするポリペプチドをコードし、前記目的とするポリペプチドが配列番号4924〜9439からなる群から選択される、結合ヌクレオシドの第1の領域と、(b)前記第1の領域の5’末端に位置する第1の隣接領域であって、(i)配列番号4924〜9439、配列番号1〜4、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然5’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、(ii)少なくとも1つの5’末端キャップと、を含む、第1の隣接領域と、(c)前記第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域であって、(i’)配列番号4924〜9439、配列番号5〜21、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然3’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、(ii’)結合ヌクレオシドの3’尾部配列と、を含む、第2の隣接領域と、を含む、単離ポリヌクレオチド。

請求項2

前記結合ヌクレオシドの第1の領域が核酸配列の少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含み、前記核酸配列が配列番号9440〜31892からなる群から選択される、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項3

前記結合ヌクレオシドの3’尾部配列が、約160個のヌクレオチドポリA尾部およびポリA〜G四重項からなる群から選択される、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項4

精製される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項5

前記少なくとも1つの5’末端キャップが、キャップ0、キャップ1、ARCAイノシン、N1−メチルグアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジド−グアノシンからなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項6

前記結合ヌクレオシドのうちの少なくとも1つが、A、G、U、またはCリボヌクレオチド化学構造と比較して、少なくとも1つの修飾を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項7

少なくとも1つの前記修飾がヌクレオシド塩基および/または糖部分に位置する、請求項6に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項8

前記第1の領域が、式(Ia):を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、Uが、O、S、N(RU)nu、またはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、が、一重または二重結合であり、が、一重結合であるか、または不在であり、R1’、R2’、R1”、R2”、R3、R4、およびR5の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシチオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、R3と、R1’、R1”、R2’、R2”、またはR5のうちの1つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、R5と、R1’、R1”、R2’、またはR2”のうちの1つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、R4と、R1’、R1”、R2’、R2”、R3、またはR5のうちの1つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリールであるか、または不在であり、各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、各Y5が、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、nが、1〜100,000の整数であり、Bが、核酸塩基であり、BとR1’の組み合わせ、BとR2’の組み合わせ、BとR1”の組み合わせ、もしくはBとR2”の組み合わせが、それらが結合する炭素と一緒になって、二環式基を任意に形成し得るか、またはBとR1”とR3の組み合わせもしくはBとR2”とR3の組み合わせが、三環式もしくは四環式基を任意に形成し得る、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項9

Bが、シュードウリジン(ψ)でも5−メチル−シチジン(m5C)でもない、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項10

Uが、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、1〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、R1、R1’、R1”、R2、R2’、およびR2”の各々が、存在する場合、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、R3およびR4の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシアルコキシであり、Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、各Y5が、独立して、Oまたは任意に置換されたアルキレンであり、nが、10〜10,000の整数である、請求項8または9に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項11

R1、R1’、およびR1”の各々が、存在する場合、Hである、請求項10に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項12

R2、R2’、およびR2”の各々が、存在する場合、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項13

R2、R2’、およびR2”の各々が、存在する場合、Hである、請求項10に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項14

R1、R1’、およびR1”の各々が、存在する場合、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである、請求項13に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項15

前記第1の領域が、式(IIa):を有するn個の結合ヌクレオチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項16

前記第1の領域が、式(IIb)もしくは(IIc)を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項15に記載の単離ポリペプチド

請求項17

前記第1の領域が、式(IId):を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項18

前記第1の領域が、式(IIe)もしくは(IIf)を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項17に記載の単離ポリペプチド。

請求項19

前記第1の領域が、n個の結合ヌクレオチドであって、前記結合ヌクレオチドの各々が、独立して、式(IIg)〜(IIj):のうちの1つを有するn個の結合ヌクレオチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項20

前記第1の領域が、式(IIk):を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項21

前記第1の領域が、式(IIl):を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項20に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項22

前記第1の領域が、式(IIm):を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R1’、R1”、R2’、およびR2”の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシであるか、または不在であり、R2’とR3の組み合わせまたはR2”とR3の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得る、請求項20に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項23

Uが、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、1〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、R1およびR2の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、R3およびR4の各々が、独立して、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、各Y5が、独立して、Oまたは任意に置換されたアルキレンであり、nが、10〜10,000の整数である、請求項11〜22のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項24

前記第1の領域が、式(IIn):を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、Uが、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、1〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、R1およびR4の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、R3’が、O、S、または−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、R3”が、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンであり、Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、各Y5が、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、nが、10〜10,000の整数である、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項25

前記n個のBにおいて、各Bが、独立して、式(b1)〜(b5):から選択される式、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、式(b1)における、V1とV2を連結するが、一重または二重結合であり、T1’、T1”、T2’、およびT2”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT1’とT1”の組み合わせもしくはT2’とT2”の組み合わせが一緒になって、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成し、V1およびV2の各々が、独立して、O、S、N(RVb)nv、またはC(RVb)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVbが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、R10が、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、R11が、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、R12aが、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアミノアルキルであり、R12cが、H、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノアルキルである、請求項8〜24のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項26

n個のBが、式(b6)〜(b9):、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、が、一重または二重結合であり、T1’、T1”、T2’、およびT2”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT1’とT1”の組み合わせもしくはT2’とT2”の組み合わせが一緒になって、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成し、W1およびW2の各々が、独立して、N(RWa)nwまたはC(RWa)nwであり、式中、nwが、0〜2の整数であり、各RWaが、独立して、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、各V3が、独立して、O、S、N(RVa)nv、またはC(RVa)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVaが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、RVaおよびR12cが、それらが結合する炭素原子と一緒になって、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、R12bが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアミノ酸であり、R12bとT1’の組み合わせまたはR12bとR12cの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、R12cが、H、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノアルキルである、請求項8〜25のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項27

R12a、R12b、R12c、もしくはRVaが、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’で置換され、式中、s1が、1〜10の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10の整数であり、R’が、HもしくはC1〜20アルキルであるか、または−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1で置換され、式中、s1が、1〜10の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10の整数であり、各RN1が、独立して、水素もしくは任意に置換されたC1〜6アルキルである、請求項26に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項28

n個のBが、式(b10)〜(b14):、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、T3’およびT3”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT3’とT3”の組み合わせが一緒になって、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成し、各V4が、独立して、O、S、N(RVc)nv、またはC(RVc)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVcが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、R13bとRVcの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、R13aおよびR13bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、R13bとR14の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、各R14が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアミノアルキルであり、R15およびR16の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである、請求項8〜27のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項29

n個のBが、式(b15)〜(b17):、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、T4’、T4”、T5’、T5”、T6’、およびT6”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、T4’とT4”の組み合わせまたはT5’とT5”の組み合わせまたはT6’とT6”の組み合わせが一緒になって、O、S、またはSeを形成し、V5およびV6の各々が、独立して、O、S、N(RVd)nv、またはC(RVd)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVdが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、シアノ、アミジン、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、R17、R18、R19a、R19b、R21、R22、R23、およびR24の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアミノ酸である、請求項7〜27のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項30

n個のBが、式(b18)〜(b20):、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、各V7が、独立して、O、S、N(RVe)nv、またはC(RVe)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVeが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、各R25が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、R26aおよびR26bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、または任意に置換されたアルコキシであり、各R27が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、各R28が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、各R29が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアミノである、請求項8〜29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド

請求項31

R26a、R26b、またはR29が、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’で置換され、式中、s1が、1〜10の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10の整数であり、R’が、HもしくはC1〜20アルキル)であるか、または−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1で置換され、式中、s1が、1〜10の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10の整数であり、各RN1が、独立して、水素もしくは任意に置換されたC1〜6アルキルである、請求項30に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項32

n個のBが、式(b21):、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、X12が、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、xaが、0〜3の整数であり、R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、T2が、O、S、またはSeである、請求項8〜31のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項33

n個のBが、式(b22):、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、R10’が、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、R11が、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、T1およびT2の各々が、独立して、O、S、またはSeである、請求項8〜32のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項34

n個のBが、式(b23):を有し、式中、R10が、任意に置換されたヘテロシクリルまたは任意に置換されたアリールであり、R11が、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、T1およびT2の各々が、独立して、O、S、またはSeである、請求項8〜33のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項35

n個のBが、式(b24):を有し、式中、T3が、O、S、またはSeであり、R13aおよびR13bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、R13bとR14の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、R14’が、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、各R15が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである、請求項8〜34のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項36

標的部分をさらに含み、前記標的部分が前記ポリヌクレオチドに共有結合される、請求項1〜35のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項37

請求項38

請求項1〜37のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物

請求項39

請求項1〜37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。

請求項40

前記賦形剤が、溶媒水性溶媒非水溶媒分散媒希釈剤分散剤、懸濁助剤表面活性剤等張剤、増粘剤または乳化剤防腐剤、脂質、リピドイドリポソーム脂質ナノ粒子コアシェルナノ粒子ポリマーリポプレックスペプチド、タンパク質細胞ヒアルロニダーゼ、およびこれらの混合物から選択される、請求項39に記載の薬学的組成物。

請求項41

前記薬学的組成物が脂質を含み、前記脂質が、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、DODMA、DSDMA、DLenDMA、reLNP、PLGA、およびPEG化脂質、ならびにこれらの混合物から選択される、請求項40に記載の薬学的組成物。

請求項42

哺乳類細胞組織、または生物体において目的とするポリペプチドを産生する方法であって、前記細胞、組織、または生物体に、請求項1〜37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項38〜41のいずれかに記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

請求項43

前記単離ポリヌクレオチドが製剤化される、請求項42に記載の方法。

請求項44

前記製剤が、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、DODMA、DSDMA、DLenDMA、reLNP、PLGA、PEG化脂質、およびこれらの混合物または組み合わせのうちの1つから選択される脂質を含む、請求項43に記載の方法。

請求項45

前記単離ポリヌクレオチドが1μg〜150μgの総1日用量で投与される、請求項44に記載の方法。

請求項46

投与が注入による、請求項45に記載の方法。

請求項47

投与が、皮内もしくは皮下または筋肉内または硝子体内である、請求項46に記載の方法。

請求項48

前記哺乳動物血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも2時間後、少なくとも50pg/mLである、請求項45に記載の方法。

請求項49

前記哺乳動物の血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも72時間後、50pg/mLを超えたままである、請求項45に記載の方法。

請求項50

前記哺乳動物の血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも72時間後、60pg/mLを超えたままである、請求項49に記載の方法。

請求項51

結果として生じるポリヌクレオチド製剤が、80nm〜160nmの平均粒径、0.02〜0.20のPDI、および10〜20の脂質:ポリヌクレオチド比(重量/重量)を有する、請求項44に記載の方法。

請求項52

哺乳類細胞、組織、または生物体において配列番号4924〜9439からなる群から選択される増加した濃度の目的とするポリペプチドを産生するための方法であって、前記細胞、組織、または生物体に、請求項4〜37のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項38〜41のいずれか一項に記載の薬学的組成物の総1日用量を2回以上に均等または不均等に分割された用量で投与することを含む、方法。

請求項53

前記投与に応答して産生されたポリペプチドの濃度が、同一の総1日用量の前記単離ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物を単回投与で投与することによって産生される濃度よりも高い、請求項52に記載の方法。

請求項54

前記哺乳類生物体は、増加した濃度の前記目的とするポリペプチドを必要とするヒト患者である、請求項52に記載の方法。

請求項55

前記増加した濃度の前記目的とするポリペプチドが、前記患者体液中で検出可能である、請求項54に記載の方法。

請求項56

前記体液が、末梢血血清血漿腹水、尿、脳脊髄液CSF)、唾液骨髄滑液房水羊水耳垢母乳気管支肺胞洗浄液精液前立腺液クーパー腺液または射精前液、糞便毛髪涙液嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液粥状液、乳糜、胆汁間質液帯下皮脂嘔吐物膣分泌物粘膜分泌物、水便、膵液鼻腔からの洗浄液気管支肺吸引物胚盤胞腔液、ならびに臍帯血からなる群から選択される、請求項55に記載の方法。

請求項57

前記体液が血清であり、単位薬物当たり(PUD)の前記ポリペプチドが1を超える、請求項56に記載の方法。

請求項58

用量分因子DSF)が4を超える、請求項57に記載の方法。

請求項59

投与が経皮である、請求項55に記載の方法。

請求項60

経皮投与が、パッチクリーム軟膏機械デバイス、針、スポンジデポー、および織物からなる群から選択される1つ以上の要素の利用を含む、請求項59に記載の方法。

請求項61

投与が、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、または数年間にわたって行われる投薬レジメンに従う、請求項59に記載の方法。

請求項62

前記2回以上に分割された用量が、T1時点で投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の第1の用量と、その後のT2時点で投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の第2の用量と、を含み、前記T1時点および前記T2時点が、1分より長く隔てられることはなく、前記第1の用量および前記第2の用量が、前記目的とするポリペプチドをもたらす量のポリヌクレオチドまたは薬学的組成物が単回単位用量で一度に投与された場合よりも高い濃度の前記目的とするポリペプチドをもたらす前記量で前記対象に投与される、請求項52に記載の方法。

請求項63

前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の複数の用量をTn時点でNx回投与することをさらに含み、式中、xおよびnが、3〜約1000から独立して選択され、TnとTn+1との間の時間が、10秒より長い増分で隔てられることはない、請求項62に記載の方法。

請求項64

投与が直接注入により行われる、請求項63に記載の方法。

請求項65

直接注入が、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、および硝子体内からなる群から選択される、請求項64に記載の方法。

請求項66

前記第1の用量が前記第2の用量または複数の用量に対して近位に投与される、請求項64に記載の方法。

請求項67

前記第1の用量が前記第2の用量または複数の用量に対して遠位に投与される、請求項64に記載の方法。

請求項68

前記第1の用量の注入部位と第2の用量または複数の用量のうちのいずれかの注入部位との間の距離が約1mm〜約10cmである、請求項64に記載の方法。

請求項69

注入が0.1mm〜約1cmの深度で行われる、請求項64に記載の方法。

請求項70

直接注入が、多針注入システムカテーテルまたは管腔ステム、および超音波電気、または放射線に基づくシステムから選択される1つ以上のデバイスを用いることによって達成される、請求項65に記載の方法。

請求項71

任意の用量において投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の量が実質的に等しい、請求項63に記載の方法。

請求項72

T1時点およびT2時点が、30秒より長く隔てられることはない、請求項63に記載の方法。

請求項73

T1時点およびT2時点が、10秒より長く隔てられることはない、請求項63に記載の方法。

請求項74

前記第1の用量、前記第2の用量、および複数の用量のうちのいずれも、実質的に同時に投与される、請求項63に記載の方法。

請求項75

前記単回単位用量が約10mg/kg〜約500mg/kgである、請求項63に記載の方法。

請求項76

前記単回単位用量が約1.0mg/kg〜約10mg/kgである、請求項63に記載の方法。

請求項77

前記単回単位用量が約0.001mg/kg〜約1.0mg/kgである、請求項63に記載の方法。

請求項78

目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの脂質ナノ粒子製剤を調製する方法であって、第1のエタノール溶液を第2の水溶液中に迅速に注入することを含み、(a)前記第1のエタノール溶液が、50:10:38.5:1.5のモル比をもたらし、かつ約25mMの最終脂質濃度を有する脂質:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMGの混合物を含み、(b)前記第2の水溶液が、1〜2mg/mLの濃度および約3のpHを有する前記目的とするポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドのクエン酸ナトリウム緩衝液を含み、前記迅速な注入が、33%のエタノールを含有し、かつ少なくとも10:1の総脂質:ポリヌクレオチドの重量比の懸濁液をもたらす、方法。

請求項79

前記迅速な注入が、手動MI)で、またはシリンジポンプ(SP)を用いてのいずれかで行われる、請求項78に記載の方法。

請求項80

結果として生じる懸濁液をpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水PBS)に対して透析することをさらに含む、請求項79に記載の方法。

請求項81

透析が2回以上行われる、請求項80に記載の方法。

請求項82

前記透析した懸濁液を0.2μmの滅菌フィルターを通して濾過することをさらに含む、請求項81に記載の方法。

請求項83

前記脂質が、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、DODMA、DSDMA、DLenDMA、reLNP、PLGA、およびPEG化脂質からなる群から選択される、請求項78〜82のいずれか一項に記載の方法。

請求項84

前記ポリヌクレオチドが、請求項1〜37のいずれかに記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項78〜83のいずれか一項に記載の方法。

請求項85

請求項78〜84のいずれか一項に記載の方法によって産生され、かつ80nm〜160nmの粒径、0.02〜0.20のPDI、および10〜30の脂質:ポリヌクレオチド比(重量/重量)を有する、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの脂質ナノ粒子製剤。

請求項86

前記ポリヌクレオチドが、請求項1〜37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項85に記載の脂質ナノ粒子製剤。

請求項87

ポリヌクレオチドのreLNP製剤であって、前記ポリヌクレオチドが目的とするポリペプチドをコードする、reLNP製剤。

請求項88

前記ポリヌクレオチドが請求項1〜36のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項87に記載のreLNP製剤。

請求項89

ポリヌクレオチドの持続放出製剤であって、前記ポリヌクレオチドが目的とするポリペプチドをコードする、持続放出製剤。

請求項90

前記ポリヌクレオチドが請求項1〜36のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項89に記載の持続放出製剤。

請求項91

融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質が第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む、ポリヌクレオチド。

請求項92

前記第1のポリペプチドが、Fc受容体Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fv断片、IgAドメインIgDドメイン、IgEドメイン、IgDドメイン、IgMドメイン、IgVドメイン、IgC1ドメイン、IgC2ドメイン、およびIgIドメインからなる群から選択され、前記第2のポリペプチドが、目的とするポリペプチドである、請求項91に記載のポリヌクレオチド。

技術分野

0001

配列表の参照
本出願は、配列表とともに電子書式で出願されている。M306_PCTSQLST.txtと題される配列表ファイルは、2013年3月9日に作成され、79,392,555バイトの大きさである。この配列表の電子書式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0002

関連出願の相互参照
本出願は、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,742号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,224号、表題「Terminally Optimized Modified RNAs」、2012年12月14日出願の国際出願第PCT/US2012/069610号、表題「Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Compositions」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,862号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,645号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of
Biologics」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,130号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,866号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,647号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Antibodies」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,134号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,868号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,648号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,135号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,139号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polynucleot
ides for the Production of Secreted Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted
Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,878号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,885号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,658号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,155号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and
Cytoskeletal Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,896号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年7月5日出願の米国仮特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular
Membrane Bound Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear
Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,667号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,922号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,935号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,687号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,184号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,945号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,704号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,203号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,961号、表題「Dosing Methodsfor ModifiedmRNA」、2012年5月17日出願の米国仮特許出願第61/648,286号、表題「Dosing Methods for Modified mRNA」に対する優先権を主張するものであり、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0003

本出願は、2012年10月3日出願の国際公開第PCT/US2012/58519号、表題「Modified Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acids,and Uses Thereof」、および2012年12月14日出願の国際公開第PCT/US2012/69610号、表題「Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Compositions」にも関連する。

0004

本出願は、同時係属出願にも関連し、それぞれ、2013年3月9日に本出願と共に同時に出願され、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease」の代理人整理番号M300.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted
Proteins」の代理人整理番号M304.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins」の代理人整理番号M3
05.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」の代理人整理番号M301.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」の代理人整理番号M308.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」の代理人整理番号M309.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」の代理人整理番号M310.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」の代理人整理番号MNC1.20(PCT/US13/XXXXX)、および表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」の代理人整理番号MNC2.20(PCT/US13/XXXXX)を有し、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0005

発明の分野
本発明は、ポリヌクレオチド、一次構築物、および修飾mRNA分子(mmRNA)の組成、これらの設計、調製、製造、および/または製剤化の方法、プロセス、キット、ならびにデバイスに関する。

背景技術

0006

タンパク質発現を生じさせる従前の方法には多くの問題がある。例えば、導入されたDNAは、ある頻度宿主細胞ゲノムDNAに組み込まれて、宿主細胞ゲノムDNAの変性および/または損傷をもたらし得る。あるいは、細胞に導入された異種デオキシリボ核酸(DNA)は、娘細胞(異種DNAが染色体に組み込まれたか否かにかかわらず)に、または子孫継承され得る。

0007

加えて、適切に送達され、かつ宿主ゲノムの損傷も組み込みもないと仮定して、コードされたタンパク質が作製される前に生じなければならないステップが多く存在する。いったん細胞内に入ると、DNAは、それがRNA転写される核内に輸送されなければならない。その後、DNAから転写されたRNAは、それがタンパク質に翻訳される細胞質に入らなければならない。投与されたDNAからタンパク質までの複数の処理ステップが機能タンパク質の生成前に時間差を生み出すだけでなく、各ステップは、細胞のエラーおよび損傷の機会にもなる。さらに、DNAが頻繁に細胞に入るが、発現されないか、または妥当な速度もしくは濃度で発現されないため、細胞におけるDNA発現を達成することが困難であることが知られている。これは、DNAが一次細胞または修飾細胞株に導入されるときに特に問題になり得る。

0008

1990年代初めに、Bloomおよび同僚は、インビトロで転写されたバソプレシンmRNAを視床下部注入することによってバソプレシン欠乏ラット救助成功した(Science 255:996−998;1992)。しかしながら、低レベルの翻訳および分子の免疫原性治療薬としてのmRNAの開発を妨害し、それ以来、むしろこれらの落とし穴を利用し得る代替用途、すなわち、癌抗原をコードするmRNAでの免疫化に労力を集中させている。

0009

他者は、目的とするポリペプチドを送達するためのmRNAの使用を研究しており、m
RNA分子のある特定の化学修飾、具体的には、シュードウリジンおよび5−メチルシトシン免疫刺激作用を低下させたことを示している。

0010

これらの研究は、例えば、Ribostem Limitedの2003年7月9日に出願され、現在は放棄されている英国特許出願第0331894.2号、国際公開第WO2005005622号として公開されている2004年7月9日出願のPCT出願第PCT/GB2004/002981号、米国特許第US20060247195号として公開され、現在は放棄されている2006年6月8日出願の米国特許出願国内段階登録第10/563,897号、および欧州特許EP1646714号として公開され、現在撤回されている2004年7月9日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2004743322号;Novozymes,Inc.の国際公開第WO2008140615号として公開された2007年12月19日出願のPCT出願第PCT/US2007/88060号、米国特許第US20100028943号として公開された2009年7月2日出願の米国特許出願国内段階登録第12/520,072号、および欧州特許第EP2104739号として公開された2009年7月7日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2007874376号;ロチェスター大学の国際公開第WO2007064952号として公開された2006年12月4日出願のPCT出願第PCT/US2006/46120号、および米国特許第US20070141030号として公開された2006年12月1日出願の米国特許出願第11/606,995号;BioNTech AGの2007年12月14日に出願され、現在は放棄されている欧州特許出願第EP2007024312号、国際公開第WO2009077134号として公開された2008年12月12日出願のPCT出願第PCT/EP2008/01059号、欧州特許第EP2240572号として公開された2010年6月2日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2008861423号、米国特許第US20110065103号として公開された2010年11月24日出願の米国特許出願国内段階第12/,735,060号、2005年9月28日出願の独国特許出願第DE 10 2005 046 490号、国際公開第WO2007036366号として公開された2006年9月28日出願のPCT出願第PCT/EP2006/0448号、2012年3月21日出願の国内段階欧州特許第1934345号、および第20100129877号として公開された2009年8月14日出願の国内段階米国特許出願第11/992,638号;Immune Disease Institute Inc.の米国特許第US20120046346号として公開された2011年4月15日出願の米国特許出願第13/088,009号および国際公開第WO20110130624号として公開された2011年4月15日出願のPCT出願第PCT/US2011/32679号;Shire HumanGenetic Therapeuticsの米国特許第US20110244026号として公開された2010年11月20日出願の米国特許出願第12/957,340号;Sequitur Inc.の国際公開第WO1999014346号として公開された1998年9月18日出願のPCT出願第PCT/US1998/019492号;The Scripps Research Instituteの国際公開第WO2010098861号として公開された2010年2月24日出願のPCT出願第PCT/US2010/00567号、および米国特許第US20120053333号として公開された2011年11月3日出願の米国特許出願国内段階登録第13/203,229号;ルートヴィヒ・マクシリアン大学の国際公開第WO2011012316号として公開された2010年7月30日出願のPCT出願第PCT/EP2010/004681号;Cellscript Inc.の2008年6月30日に出願され、2011年10月18日に許可された米国特許第8,039,214号、米国特許第US20110143436号として公開された2010年12月7日出願の米国特許出願第12/962,498号、米国特許第US20110143397号として公開された2010年12月7日出願の同第12/962,468号、米国特許第US20120009649号として公開された2011年9月20日出願の同第13/237,451号、ならびに国際公開第
WO2011071931号として公開された2010年12月7日出願のPCT出願PCT/US2010/59305、および国際公開第WO2011071936号として公開された2010年12月7日出願の同第PCT/US2010/59317号;ペンシルベニア大学理事会の国際公開第WO2007024708号として公開された2006年8月21日出願のPCT出願第PCT/US2006/32372号、および米国特許第US20090286852号として公開された2009年3月27日出願の米国特許出願国内段階第11/990,646号;CurevacGMBHの2001年6月5日出願の独国特許出願第DE10 2001 027 283.9号、2001年12月19日出願の同第DE10 2001 062 480.8号、および2006年10月31日出願の同第DE 20 2006 051 516号(これらすべて放棄されている)、2005年3月30日に許可された欧州特許第EP1392341号、および2008年1月2日に許可された欧州特許第EP1458410号、国際公開第WO2002098443号として公開された2002年6月5日出願のPCT出願第PCT/EP2002/06180号、国際公開第WO2003051401号として公開された2002年12月19日出願の同第PCT/EP2002/14577号、国際公開第WO2008052770号として公開された2007年12月31日出願の同第PCT/EP2007/09469号、国際公開第WO2009127230号として公開された2008年4月16日出願の同第PCT/EP2008/03033号、国際公開第WO2006122828号として公開された2005年5月19日出願の同第PCT/EP2006/004784号、国際公開第WO2008083949号として公開された2007年1月9日出願の同第PCT/EP2008/00081号、ならびに米国特許第US20050032730号として公開された2003年12月5日出願の米国特許出願第10/729,830号、米国特許第US20050059624号として公開された2004年6月18日出願の同第10/870,110号、米国特許第US20080267873号として公開された2008年7月7日出願の同第11/914,945号、米国特許第US2010047261号として公開され、現在は放棄されている2009年10月27日出願の同第12/446,912号、米国特許第US20100189729号として公開された2010年1月4日出願の同第12/522,214号、米国特許第US20110077287号として公開された2010年5月26日出願の同第12/787,566号、米国特許第US20100239608号として公開された2010年5月26日出願の同第12/787,755号、米国特許第US20110269950号として公開された2011年7月18日出願の同第13/185,119号、および米国特許第US20110311472号として公開された2011年5月12日出願の同第13/106,548号に記載されており、これらはすべて、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0011

シュードウリジンおよび5−メチル−シトシンを含む化学修飾の選択に限定されているこれらの報告書にもかかわらず、細胞内翻訳の効果的な調節およびポリペプチドまたはその断片をコードする核酸の処理を取り巻く無数障壁対処する治療法当技術分野において依然として必要とされている。

0012

この目的を達成するために、本発明者らは、ある特定の修飾mRNA配列が、単に免疫応答を逃れるか、回避するか、または低減させるだけではない利点を有する治療薬としての可能性を有することを示した。そのような研究は、公開された同時係属出願である、2011年8月5日出願の国際出願第PCT/US2011/046861号および2011年10月3日出願の同第PCT/US2011/054636号、2011年10月3日出願の国際出願第PCT/US2011/054617号に詳述されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0013

本発明は、目的とするポリペプチド(例えば、修飾mRNAまたはmmRNA)をコー
ドし、当技術分野における課題のうちの1つ以上を回避する構造的および/または化学的特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持し、発現の閾値を克服し、発現速度半減期、および/またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、かつ免疫応答等の有害な生物応答および/または分解経路を回避しながら、核酸系治療薬の製剤化および送達の最適化に有用な特徴を有する核酸系化合物またはポリヌクレオチドを提供することによって、この必要性に対処する。

0014

修飾mRNA(mmRNA)分子の組成、修飾mRNA(mmRNA)分子の設計、調製、製造、および/または製剤化方法、プロセス、キット、ならびにデバイスが本明細書に記載される。

0015

本発明の様々な実施形態の詳細が、以下の発明を実施するための形態において説明される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。

0016

前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に図示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の記述から明らかになり、その図面において、同様の参照文字は、異なる図面を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも原寸に比例しておらず、むしろ、本発明の様々な実施形態の原理を例示説明することに重点が置かれている。

図面の簡単な説明

0017

本発明の一次構築物の概略図である。
本発明において有用な先行技術における脂質構造を図示する。98N12−5(TETA5−LAP)、DLin−DMA、DLin−K−DMA(2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン)、DLin−KC2−DMA、DLin−MC3−DMA、およびC12−200の構造を示す。
同上。
本明細書に教示されるIVT反応において有用な代表的なプラスミドである。このプラスミドは、本発明者らによって設計された挿入物64818を含有する。
PLGAマイクロスフェアカプセル封入された修飾mRNAのゲルプロファイルである。
IX因子タンパク質産生PLGA製剤第IX因子修飾mRNAのヒストグラムである。
様々な用量での修飾mRNAのトランスフェクション後のヒトケラチノサイト細胞におけるVEGFタンパク質産生を示すヒストグラムである。図6Aは、天然ヌクレオシドトリホスフェート(NTP)を含む修飾mRNAのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。図6Bは、シュードウリジン(シュードU)および5−メチルシトシン(5mC)で完全に修飾された修飾mRNAのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。
図6Cは、N1−メチル−シュードウリジン(N1−メチル−シュードU)および5−メチルシトシン(5mC)で完全に修飾された修飾mRNAのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。
HEK293細胞におけるVEGFタンパク質産生のヒストグラムである。
末梢血単核球(PBMC)におけるVEGF修飾mRNAのトランスフェクション後のVEGF発現およびIFN−α誘導のヒストグラムである。図8Aは、VEGF発現を示す。図8Bは、IFN−α誘導を示す。
VEGF修飾mRNAからのHeLa細胞におけるVEGFタンパク質産生のヒストグラムである。
マウスにおけるリポプレックス化VEGF修飾mRNAからのVEGFタンパク質産生のヒストグラムである。
G−CSF修飾mRNAからのHeLa細胞におけるG−CSFタンパク質産生のヒストグラムである。
第IX因子修飾mRNAからのHeLa細胞上清における第IX因子タンパク質産生のヒストグラムである。

0018

治療薬、診断試薬の分野、および生物学的アッセイにおいて、例えば、核酸の細胞内翻訳およびコードされた目的とするポリペプチドの産生を引き起こすために、インビトロ、インビボインサイツ、またはエクスビボにかかわらず、細胞内に核酸、例えば、リボ核酸(RNA)を送達することができることは大変興味深いことである。非組み込みポリヌクレオチドの送達および機能が特に重要である。

0019

1個以上の目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組成物薬学的組成物を含む)、ならびにその設計、調製、製造、および/または製剤化方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを選択、設計、および/または利用するためのシステム、プロセス、デバイス、およびキットも提供される。

0020

本発明に従って、これらのポリヌクレオチドは、好ましくは、当技術分野の他のポリペプチドをコードする分子の欠陥を回避するように修飾される。したがって、これらのポリヌクレオチドは、修飾mRNAまたはmmRNAと称される。

0021

抗体、ウイルス獣医学における適用の分野、および様々なインビボ環境における修飾ポリヌクレオチドの使用が本発明者らによって研究されており、これらの研究は、例えば、同時係属および共同所有の、mmRNAのインビボ適用を教示する2011年3月31日出願の米国仮特許出願第61/470,451号;抗体ポリペプチドの産生のために操作された核酸を教示する2011年4月26日出願の同第61/517,784号;mmRNA技術の獣医学における適用を教示する2011年5月17日出願の同第61/519,158号;mmRNA技術の抗菌剤における適用を教示する2011年9月12日出願の同第61/533,537号;mmRNA技術のウイルス適用を教示する2011年9月12日出願の同第61/533,554号;mmRNA技術で用いる様々な化学修飾を教示する2011年10月3日出願の同第61/542,533号;mmRNA技術の作製および使用で用いるモバイルデバイスを教示する2011年12月14日出願の同第61/570,690号;救急治療状況下でのmmRNAの使用を教示する2011年12月14日出願の同第61/570,708号;mmRNAの末端修飾構造を教示する2011年12月16日出願の同第61/576,651号;リピドイドを用いたmmRNAの送達方法を教示する2011年12月16日出願の同第61/576,705号;mmRNAを用いて器官または組織生存率を増加させるための方法を教示する2011年12月21日出願の同第61/578,271号;細胞透過性ペプチドをコードするmmRNAを教示する2011年12月29日出願の同第61/581,322号;mmRNAへの細胞傷害性ヌクレオシドの組み込みを教示する2011年12月29日出願の同第61/581,352号;および血液脳関門横断するためにmmRNAを用いる方法を教示する2012年1月10日出願の同61/631,729号に開示されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0022

組織における安定性および/もしくは排除、受容体の取り込みおよび/もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、mRNA半減期、翻訳の効率、免疫回避、タンパク質産生能力分泌の効率(適用される場合)、血液循環への到達可能性、タンパク質半減期、ならびに/または細胞の状態、機能、および/もしくは活性の調節のうちの
1つ以上を改善するように設計された、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAが本明細書の一部分に提供される。

0023

I.本発明の組成物(mmRNA)
本発明は、1個以上の目的とするポリペプチドをコードする核酸分子、具体的には、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを提供する。「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドポリマーを含む任意の化合物および/または物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと称される。本発明の例示の核酸またはポリヌクレオチドには、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA、β−D−リボ配置を有するLNA、α−L−リボ配置を有するα−LNA(LNAのジアステレオマー)、2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−LNA、および2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−α−LNAを含む)、またはこれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。

0024

好ましい実施形態において、核酸分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)である。本明細書で使用するとき、「メッセンジャーRNA(mRNA)」という用語は、目的とするポリペプチドをコードし、かつ翻訳されてインビトロ、インビボ、インサイツ、またはエクスビボで、コードされた目的とするポリペプチドを産生することができる任意のポリヌクレオチドを指す。

0025

従来、mRNA分子の主要成分には、少なくともコーディング領域、5’UTR、3’UTR、5’キャップ、およびポリ尾部が含まれる。この野生型モジュール構造を基に、本発明は、モジュール組織を維持するが、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが導入される部分への細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む、有用な特性をポリヌクレオチドに付与する1つ以上の構造および/もしくは化学修飾または改変を含むポリヌクレオチドまたは一次RNA構築物を提供することによって従来のmRNA分子の機能の範囲を拡大する。したがって、本発明の修飾mRNA分子は、「mmRNA」と称される。本明細書で使用するとき、「構造的」特徴または修飾は、2個以上の結合ヌクレオチドが、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なく、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいて挿入、欠失、複製、反転、またはランダム化される特徴または修飾である。化学結合が必然的に破壊および再形成されて構造修飾をもたらすため、構造修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ATCG」は、「AT−5meC−G」に化学修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは、「ATCG」から「ATCCCG」に構造修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「CC」が挿入されており、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。

0026

mmRNA構造
本発明のmmRNAは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポリペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および/または構造的設計特徴において野生型mRNAと区別される。

0027

図1は、本発明の代表的なポリヌクレオチド一次構築物100を示す。本明細書で使用するとき、「一次構築物」または「一次mRNA構築物」という用語は、1個以上の目的とするポリペプチドをコードし、その中でコードされる目的とするポリペプチドが翻訳されることを可能とするのに十分な構造的および/または化学的特徴を保持する、ポリヌクレオチド転写物を指す。一次構築物は、本発明のポリヌクレオチドであり得る。構造または化学修飾された場合、一次構築物は、mmRNAと称され得る。

0028

図1を参照して、ここで、一次構築物100は、第1の隣接領域104および第2の隣接領域106に隣接する結合ヌクレオチド102の第1の領域を含有する。本明細書で使用するとき、「第1の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第1の領域」と称され得る。この第1の領域は、コードされた目的とするポリペプチドを含み得るが、これに限定されない。目的とするポリペプチドは、その5’末端に、シグナル配列領域103によってコードされた1つ以上のシグナル配列を含み得る。隣接領域104は、1つ以上の完全または不完全な5’UTR配列を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域104は、5’末端キャップ108も含み得る。第2の隣接領域106は、1つ以上の完全または不完全な3’UTRを含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域106は、3’尾部配列110も含み得る。

0029

第1の領域102と第1の隣接領域104の5’末端の架橋は、第1の操作領域105である。従来、この操作領域は、開始コドンを含む。あるいは、この操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。

0030

第1の領域102と第2の隣接領域106の3’末端の架橋は、第2の操作領域107である。従来、この操作領域は、終止コドンを含む。あるいは、この操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。本発明に従って、複数の連続終止コドンも使用され得る。

0031

概して、本発明の一次構築物の第1の領域の最短の長さは、ジペプチドトリペプチドテトラペプチドペンタペプチドヘキサペプチドヘプタペプチドオクタペプチドノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであり得る。別の実施形態において、この長さは、2〜30個のアミノ酸、例えば、5〜30、10〜30、2〜25、5〜25、10〜25、または10〜20個のアミノ酸のペプチドをコードするのに十分であり得る。この長さは、少なくとも11、12、13、14、15、17、20、25、もしくは30個のアミノ酸のペプチド、または40個のアミノ酸より長くないペプチド、例えば、35、30、25、20、17、15、14、13、12、11、もしくは10個のアミノ酸より長くないペプチドをコードするのに十分であり得る。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例には、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、それらに限定されない。

0032

概して、本発明の目的とするポリペプチドをコードする第1の領域の長さは、約30ヌクレオチド長を超える(例えば、少なくとも、約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、および3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、もしくは100,000ヌクレオチド長(100,000を含む)まで、またはそれらを超える)。本明細書で使用するとき、「第1の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第1の領域」と称され得る。

0033

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、約30〜約100,000個のヌクレオチド(例えば、30〜50、30〜100、30〜250、30〜500、30〜1,000、30〜1,500、30〜3,000、30〜5,000、30〜7,000、30〜10,000、30〜25,000、30〜50,000、30〜70,000、100〜250、100〜500、100〜1,000、100〜1,500、100〜3,000、100〜5,000、100〜7,0
00、100〜10,000、100〜25,000、100〜50,000、100〜70,000、100〜100,000、500〜1,000、500〜1,500、500〜2,000、500〜3,000、500〜5,000、500〜7,000、500〜10,000、500〜25,000、500〜50,000、500〜70,000、500〜100,000、1,000〜1,500、1,000〜2,000、1,000〜3,000、1,000〜5,000、1,000〜7,000、1,000〜10,000、1,000〜25,000、1,000〜50,000、1,000〜70,000、1,000〜100,000、1,500〜3,000、1,500〜5,000、1,500〜7,000、1,500〜10,000、1,500〜25,000、1,500〜50,000、1,500〜70,000、1,500〜100,000、2,000〜3,000、2,000〜5,000、2,000〜7,000、2,000〜10,000、2,000〜25,000、2,000〜50,000、2,000〜70,000、および2,000〜100,000個)を含む。

0034

本発明に従って、第1および第2の隣接領域は、独立して、15〜1,000ヌクレオチド長の範囲(例えば、30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、および900を超えるヌクレオチド長、または少なくとも30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、および1,000ヌクレオチド長)であり得る。

0035

本発明に従って、尾部配列は、0〜500ヌクレオチド長の範囲(例えば、少なくとも60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、または500ヌクレオチド長)であり得る。尾部領域がポリA尾部である場合、長さは、ポリA結合タンパク質結合の単位で、またはその関数として決定され得る。この実施形態において、ポリA尾部は、ポリA結合タンパク質の少なくとも4個の単量体に結合するのに十分な長さである。ポリA結合タンパク質の単量体は、一続きの約38個のヌクレオチドに結合する。したがって、約80個のヌクレオチドおよび160個のヌクレオチドのポリA尾部が機能的であることが観察されている。

0036

本発明に従って、キャッピング領域は、単一のキャップまたはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、キャッピング領域は、1〜10、例えば、2〜9、3〜8、4〜7、1〜5、5〜10、または少なくとも2、もしくは10以下のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、キャップは不在である。

0037

本発明に従って、第1および第2の操作領域は、3〜40、例えば、5〜30、10〜20の範囲、15、または少なくとも4、もしくは30以下のヌクレオチド長であり得、開始コドンおよび/または終止コドンに加えて、1つ以上のシグナルおよび/または制限配列を含み得る。

0038

環状mmRNA
本発明に従って、一次構築物またはmmRNAは、環化またはコンカテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリA結合タンパク質と5’末端結合タンパク質との間の相互作用補助し得る。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも3つの異なる経路、すなわち1)化学的経路、2)酵素的経路、および3)リボザイム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された5’/3’連結は、分子内または分子間であり得る。

0039

第1の経路において、核酸の5’末端および3’末端は、接近しているときに分子の5
’末端と3’末端との間に新たな共有結合を形成する化学反応基を含有する。有機溶媒中で、合成mRNA分子の3’末端上の3’−アミノ末端ヌクレオチドが5’−NHS−エステル部分上で求核攻撃を経て新たな5’/3’アミド結合を形成するように、5’末端は、NHS−エステル反応基を含有し得、3’末端は、3’−アミノ末端ヌクレオチドを含有し得る。

0040

第2の経路において、T4RNAリガーゼを用いて、5’−リン酸化核酸分子を核酸の3’−ヒドロキシル基酵素結合させて、新たなホスホジエステル結合を形成することができる。反応の例において、1μgの核酸分子が、製造業者プロトコルに従って、1〜10単位のT4 RNAリガーゼ(New England Biolabs、Ipswich,MA)と37℃で1時間インキュベートされる。連結反応が、5’領域および3’領域の両方と並んで塩基対合して、酵素的連結反応を補助することができる分裂したオリゴヌクレオチドの存在下で生じ得る。

0041

第3の経路において、cDNA鋳型の5’末端または3’末端のいずれかは、インビトロ転写中に、結果として生じる核酸分子が核酸分子の5’末端を核酸分子の3’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含有し得るように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、I群イントロン、I群イントロン、デルタ肝炎ウイルスヘアピンリボザイム由来し得るか、またはSELEX(試験管進化法、systematic evolution of ligandsby exponential enrichment)によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、0〜37℃の温度で1〜24時間かかり得る。

0042

mmRNA多量体
本発明に従って、複数のはっきりと異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、3’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて3’末端を介して結合され得る。化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、HepG2細胞に1:1の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝を変化させ得る。この比率は、一方のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種に3’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種にC5−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを化学結合させることによって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って末端トランスフェラーゼ(New England Biolabs、Ipswich,MA)を用いて転写後に添加される。3’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら2個のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種は、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載のクリック化学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。

0043

別の例において、3個以上のポリヌクレオチドが官能化リンカー分子を用いて結合され得る。例えば、官能化サッカリド分子は、複数の化学反応基(SH−、NH2−、N3等)を含有して3’−官能化mRNA分子上の同族部分(すなわち、3’−マレイミドエステル、3’−NHS−エステル、アルキニル)と反応するように化学修飾され得る。この修飾されたサッカリド上の反応基の数は、化学量論的様式で制御されて、複合体化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの化学量論比直接制御し得る。

0044

mmRNA複合体および組み合わせ
タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明の一次構築物またはmmRNAは、他のポリヌクレオチド、染料挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレンマイトマイシンC)、ポルフィリンTPPC4、テキサフィリンサフィリン)、
多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジンジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノアルキル置換アルキル放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリンビタミンE葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンド特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン炭水化物ビタミン共同因子、または薬物と複合体化されるように設計され得る。

0045

複合体化は、安定性および/または半減期の増加をもたらし得、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを、細胞、組織、または生物体の特定の部位に標的化するときに特に有用であり得る。

0046

本発明に従って、mmRNAまたは一次構築物は、RNAi剤、siRNA、shRNA、miRNA、miRNA結合部位アンチセンスRNA、リボザイム、触媒DNA、tRNA三重らせん形成を誘導するRNA、アプタマー、もしくはベクター等のうちの1つ以上とともに投与され得るか、またはこれらをさらにコードし得る。

0047

二機能性mmRNA
本発明の一実施形態は、二機能性ポリヌクレオチド(例えば、二機能性一次構築物または二機能性mmRNA)である。その名称が示すように、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも2つの機能を有するか、または少なくとも2つの機能の能力があるポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により、多機能性とも称され得る。

0048

二機能性ポリヌクレオチドの複数の機能は、RNAによってコードされ得る(この機能は、コードされた産物が翻訳されるまで現れ得ない)か、またはポリヌクレオチド自体の特性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に関連した機能を含み得る。さらに、これら2つの機能は、mmRNAおよび別の分子の複合体との関連において提供され得る。

0049

二機能性ポリヌクレオチドは、抗増殖性ペプチドをコードし得る。これらのペプチドは、線状、環状、拘束、またはランダムコイルであり得る。これらは、アプタマー、シグナル伝達分子リガンド、またはこれらの模倣物もしくはミメティックとして機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、3〜50アミノ酸長であり得る。それらは、5〜40、10〜30、または約15アミノ酸長であり得る。それらは、一本鎖、多本鎖、または分岐鎖であり得、翻訳されると、複合体、凝集体、または任意の多ユニット構造を形成し得る。

0050

非コードポリヌクレオチドおよび一次構築物
本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、非コード領域を有するポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。そのような非コード領域は、一次構築物の「第1の領域」であり得る。あるいは、非コード領域は、第1の領域以外の領域であり得る。そのような分子は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移RNA(tRNA)等の1つ以上の翻訳機構成分への結合および隔離のうちの1つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における1つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる。ポリヌクレオチドまたは一次構築物は、1個以上の長い非コードRNA(lncRNAもしくはlincRNA)もしく
はその部分、低分子核RNA(sno−RNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、またはPiwi干渉RNA(piRNA)を含有し得るか、あるいはこれらをコードし得る。

0051

目的とするポリペプチド
本発明に従って、一次構築物は、1個以上の目的とするポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的とするポリペプチドは、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、これらに限定されず、これらは、独立して、1個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、または前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、「目的とするポリペプチド」という用語は、選択されて本発明の一次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基天然または非天然)のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約50個のアミノ酸よりも小さい場合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド相同体オルソログパラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または二量体三量体、もしくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合が多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、1個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。

0052

「ポリペプチド変異形」という用語は、それらのアミノ酸配列天然配列または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列変異形は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および/または挿入を有し得る。通常、変異形は、天然配列または参照配列と少なくとも約50%の同一性相同性)を有し、好ましくは、それらは、天然配列または参照配列と少なくとも約80%、より好ましくは、少なくとも約90%同一(相同)である。

0053

いくつかの実施形態において、「変異形模倣物」が提供される。本明細書で使用するとき、「変異形模倣物」という用語は、活性化配列模倣する1個以上のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−トレオニンおよび/またはホスホロ−セリンの模倣物の役割を果たし得る。あるいは、変異形模倣物は、その模倣物を含有する産物の失活または不活性化をもたらし得、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換としての機能を果たし得るか、またはアラニンは、セリンの不活性化置換としての機能を果たし得る。

0054

「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、最大の相同パーセントを得るために、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の第2の配列のアミノ酸配列内の残基と同一の候補アミノ酸配列内の残基の割合(%)と定義される。整列させるための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。相同性が同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されるギャップおよびペナルティのため値が異なり得ることが理解される。

0055

「相同体」とは、ポリペプチド配列に適用されるとき、第2の種の第2の配列に対してかなりの割合の同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。

0056

「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの1つ以上を依然として維持する、1つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチド変異形を含むよう意図される。

0057

本発明は、変異形および誘導体を含むポリペプチド系のいくつかの種類の組成物を企図する。これらは、置換、挿入、欠失、および共有結合変異形および誘導体を含む。「誘導体」という用語は、「変異形」という用語と同義に使用されるが、概して、任意の方法で参照分子または出発分子に対して修飾され、かつ/または変化した分子を指す。

0058

したがって、参照配列、具体的には、本明細書に開示のポリペプチド配列に対して置換、挿入および/または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するポリペプチドをコードするmmRNAが、本発明の範囲内に包含される。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、1個以上のリジンが、本発明のペプチド配列に付加され得る(例えば、N末端またはC末端で)。配列タグは、ペプチド精製または局在化に使用され得る。リジンを用いて、ペプチド溶解度を増加させるか、またはビオチン化を可能にする。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基が任意に欠失されて、切断配列を提供し得る。あるいは、ある特定のアミノ酸(例えば、C末端またはN末端残基)は、配列の使用に応じて、例えば、可溶性のより大きい配列の一部として配列の発現時に欠失され得るか、または固体支持体に結合され得る。

0059

置換変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然配列または出発配列内の少なくとも1個のアミノ酸残基が除去され、その場所の同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。これらの置換は、単一置換であり、分子中の1個のアミノ酸のみが置換されたものであり得、またはこれらの置換は、多置換であり、同一の分子中の2個以上のアミノ酸が置換されたものであり得る。

0060

本明細書で使用するとき、「保存アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸を、同様の大きさ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを指す。保存置換の例には、イソロイシンバリン、およびロイシン等の非極性疎水性)残基の別の非極性残基との置換が挙げられる。同様に、保存置換の例には、アルギニンとリジン、グルタミンアスパラギン、およびグリシンのセリン等の極性(親水性)残基の別の残基との置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジン等の塩基性残基の別の塩基性残基との置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等のある酸性残基の別の酸性残基との置換が、保存置換のさらなる例である。非保存置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニン等の非極性(疎水性)アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジン等の極性(親水性)残基との置換、および/または極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。

0061

挿入変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、1個以上のアミノ酸が天然配列または出発配列内の特定の位置のアミノ酸にすぐ隣接して挿入されたものである。アミノ酸に「すぐ隣接した」とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。

0062

欠失変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然アミノ酸配列または出発アミノ酸配列内の1個以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異形は、1個以上のアミノ酸を分子の特定の領域で欠失させる。

0063

「共有結合誘導体」は、ポリペプチドについて言及するとき、有機タンパク質性もしくは非タンパク質誘導体化剤での天然タンパク質もしくは出発タンパク質の修飾、および
/または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、従来、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。結果として生じる共有結合誘導体は、組換え糖タンパク質免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体生物学的活性免疫学的アッセイ、または調製に重要な残基の特定を目的としたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、当技術分野の技術の範囲内であり、過度実験なく行われる。

0064

ある特定の翻訳後修飾は、発現ポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で、翻訳後に対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態も、本発明に従って産生されたポリペプチドに存在し得る。

0065

他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79−86(1983))。

0066

「特徴」は、ポリペプチドについて言及するとき、分子のはっきりと異なるアミノ酸配列に基づく成分と定義される。本発明のmmRNAによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現局所立体配座形状、折り畳み、ループ半ループドメイン、半ドメイン、部位、末端、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。

0067

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「表面出現」という用語は、タンパク質のポリペプチド系成分が最も外側の表面に現れることを指す。

0068

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「局所立体配座形状」という用語は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチド系構造の出現を意味する。

0069

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「折り畳み」という用語は、エネルギー最小化時のアミノ酸配列の結果として生じる立体構造を指す。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次または三次レベルで生じ得る。二次レベルの折り畳みの例には、βシートおよびαヘリックスが挙げられる。三次レベルの折り畳みの例には、エネルギー力の凝集または分離が原因で形成されるドメインおよび領域を含む。このようにして形成された領域は、疎水性および親水性ポケット等を含む。

0070

本明細書で使用する「回転」という用語は、タンパク質構造に関するとき、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変化させる屈曲を意味し、1、2、または3個以上のアミノ酸残基が関与し得る。

0071

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ループ」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させる役目を果たし得るポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドで見つけられ、かつ骨格の方向のみを変化させる場合、これは、4個以上のアミノ酸残基を含み得る。Olivaらは、少なくとも5つのクラスのタンパク質ループを特定している(J.Mol Biol 266(4):814−830;1997)。ループは、開ループまたは閉ループであり得る。閉ループまたは「環状」ループは、架橋部分の間に2、3、4、5、6、7、8、9、または10個
以上のアミノ酸を含み得る。そのような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドにおいて典型的なシステイン−システイン架橋(Cys−Cys)を含み得るか、またはあるいは架橋部分は、本明細書で用いられるジブロモジルイル剤(dibromozylyl agent)等の非タンパク質系のものであり得る。

0072

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ループ」という用語は、それが由来するループとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するループの部分を指す。ループが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のループの半ループは、ループの整数部分または次の整数部分(ループのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸)を含む。例えば、7アミノ酸ループと特定されたループは、3個のアミノ酸または4個のアミノ酸(7/2=3.5+/−0.5で3または4になる)の半ループをもたらし得る。

0073

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ドメイン」という用語は、1つ以上の特定可能な構造または機能特徴または特性(例えば、結合能力タンパク質間の相互作用の部位としての役割を果たす)を有するポリペプチドのモチーフを指す。

0074

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ドメイン」という用語は、それが由来するドメインとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するドメインの部分を意味する。ドメインが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分(ドメインのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸)を含む。例えば、7アミノ酸ドメインと特定されたドメインは、3個のアミノ酸または4個のアミノ酸(7/2=3.5+/−0.5で3または4になる)の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない(すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、またはサブドメインをもたらし得る)ことも理解される。

0075

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「部位」という用語は、アミノ酸系の実施形態に関するとき、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。部位は、本発明のポリペプチド系分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変更され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。

0076

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「末端(termini)」または「末端(terminus)」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの端を指す。そのような端は、ペプチドまたはポリペプチドの第1または最終部位に限定されるだけでなく、末端領域にさらなるアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチド系分子は、N末端(アミノ酸によって遊離アミノ基(NH2)で終端する)もC末端(アミノ酸によって遊離カルボキシル基(COOH)で終端する)もいずれも有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、ある場合には、ジスルフィド結合または非共有結合力(多量体、オリゴマー)によって結び付けられた複数のポリペプチド鎖から成り得る。これらの種類のタンパク質は、複数のN末端およびC末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、それらが場合によって有機複合体等の非ポリペプチド系部分で始まるか、または終了するように修飾され得る。

0077

これらの特徴のうちのいずれかが本発明の一次構築物またはmmRNAによってコードされるポリペプチドの所望の成分であると特定または定義されると、これらの特徴のいくつかの操作および/または修飾のうちのいずれも、移動、交換、反転、欠失、ランダム化、または複製によって行われ得る。さらに、特徴の操作が本発明の分子に対する修飾と同一の結果をもたらすことが理解される。例えば、ドメインの欠失を伴う操作は、全長分子未満をコードする核酸の修飾のような分子の長さの改変をもたらす。

0078

修飾および操作は、部位特異的変異誘発等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法によって達成され得る。その後、結果として生じる修飾された分子は、本明細書に記載のアッセイ等のインビトロまたはインビボアッセイ、または当技術分野で既知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを用いて活性について試験され得る。

0079

本発明に従って、ポリペプチドは、一連の実験によって発見されるコンセンサス配列を含み得る。本明細書で使用するとき、「コンセンサス」配列とは、1つ以上の部位で可変性を可能にする配列の集合集団を表す単一配列である。

0080

業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本発明の目的とするポリペプチドの範囲内であると見なされる。例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または100を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片(少なくとも1個のアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列よりも短いが、他の点では同一であるポリペプチド配列を意味する)が本明細書に提供される。別の例において、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、または約100%同一の一続きの約20、約30、約40、約50、または約100個のアミノ酸を含む任意のタンパク質が本発明に従って利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のうちのいずれかに示される2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の変異を含む。

0081

コードされたポリペプチド
本発明の一次構築物またはmmRNAは、生物製剤、抗体、ワクチン治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質原形質膜タンパク質、細胞質もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質ヒト疾患に関連したタンパク質、標的部分、またはいかなる治療指標も特定されていないにもかかわらず、研究および発見の分野において有用性を有するヒトゲノムによってコードされたタンパク質を含むが、これらに限定されないいくつかの標的カテゴリーのうちのいずれかから選択される目的とするポリペプチドをコードするように設計され得る。

0082

一実施形態において、一次構築物またはmmRNAは、参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有する変異形ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用するとき、「参照ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。参照配列は、別の配列の設計において参照される野生型配列または任意の配列であり得る。「参照ポリペプチド配列」は、例えば、本明細書に開示の配列番号4924〜9439のうちのいずれか1つ、例えば、配列番号4672、4673、4674、4675、4676、4677、4678、4679、4680、4681、4682、4683、4684、4685、4686、4687、4688、4689、4690、4691、4692、4693、4694、4695、4696、4697、4698、4699、4700、4701、4702、4703、4704、4705、4706、4707、4708、4709、4710、4711、4712、4713、4714、4715、4716、4717、4718、4719、4720、4721、4722、4723、4724、4725、4726、4727、4728、4729、4730、4731、4732、4733、4734、
4735、4736、4737、4738、4739、4740、4741、4742、4743、4744、4745、4746、4747、4748、4749、4750、4751、4752、4753、4754、4755、4756、4757、4758、4759、4760、4761、4762、4763、4764、4765、4766、4767、4768、4769、4770、4771、4772、4773、4774、4775、4776、4777、4778、4779、4780、4781、4782、4783、4784、4785、4786、4787、4788、4789、4790、4791、4792、4793、4794、4795、4796、4797、4798、4799、4800、4801、4802、4803、4804、4805、4806、4807、4808、4809、4810、4811、4812、4813、4814、4815、4816、4817、4818、4819、4820、4821、4822、4823、4824、4825、4826、4827、4828、4829、4830、4831、4832、4833、4834、4835、4836、4837、4838、4839、4840、4841、4842、4843、4844、4845、4846、4847、4848、4849、4850、4851、4852、4853、4854、4855、4856、4857、4858、4859、4860、4861、4862、4863、4864、4865、4866、4867、4868、4869、4870、4871、4872、4873、4874、4875、4876、4877、4878、4879、4880、4881、4882、4883、4884、4885、4886、4887、4888、4889、4890、4891、4892、4893、4894、4895、4896、4897、4898、4899、4900、4901、4902、4903、4904、4905、4906、4907、4908、4909、4910、4911、4912、4913、4914、4915、4916、4917、4918、4919、4920、4921、4922、4923、4924、4925、4926、4927、4928、4929、4930、4931、4932、4933、4934、4935、4936、4937、4938、4939、4940、4941、4942、4943、4944、4945、4946、4947、4948、4949、4950、4951、4952、4953、4954、4955、4956、4957、4958、4959、4960、4961、4962、4963、4964、4965、4966、4967、4968、4969、4970、4971、4972、4973、4974、4975、4976、4977、4978、4979、4980、4981、4982、4983、4984、4985、4986、4987、4988、4989、4990、4991、4992、4993、4994、4995、4996、4997、4998、4999、5000、5001、5002、5003、5004、5005、5006、5007、5008、5009、5010、5011、5012、5013、5014、5015、5016、5017、5018、5019、5020、5021、5022、5023、5024、5025、5026、5027、5028、5029、5030、5031、5032、5033、5034、5035、5036、5037、5038、5039、5040、5041、5042、5043、5044、5045、5046、5047、5048、5049、5050、5051、5052、5053、5054、5055、5056、5057、5058、5059、5060、5061、5062、5063、5064、5065、5066、5067、5068、5069、5070、5071、5072、5073、5074、5075、5076、5077、5078、5079、5080、5081、5082、5083、5084、5085、5086、5087、5088、5089、5090、5091、5092、5093、5094、5095、5096、5097、5098、5099、5100、5101、5102、5103、5104、5105、5106、5107、5108、5109、5110、5111、5112、5113、5114、5115、5116、5117、5118、5119、5120、5121、5122、5123、5124、5125、5126、5127、5128、5129、5130、5131、5132、5133、5134、
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0083

当技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される2個以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性は、2個以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチ数によって決定されるペプチド間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)によって処理されるギャップアライメント(存在する場合)を有する2つ以上の配列のうちのより小さい配列間の同一のマッチの割合(%)を測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。そのような方法には、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988、Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993、Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994、Sequence Analysis in Molecular Biology,von
Heinje,G.,Academic Press,1987、Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991、およびCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。

0084

いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異形は、参照ポリペプチドと同一または同様の活性を有し得る。あるいは、変異形は、参照ポリペプチドと比較して変化(例えば、増加または減少)した活性を有し得る。概して、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形は、本明細書に記載され、かつ当業者に既知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定されるように、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%であるが、100%未満の配列同一性を有する。そのようなアライメントのツールは、BLASTプログラム一式を含む(Stephen
F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaeffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb
Miller,and David J.Lipman(1997),“Gapped
BLAST and PSI−BLAST:a new generation of
protein databese search programs”,Nucleic AcidsRes.25:3389−3402)。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。

0085

BLASTアルゴリズムの初期設定パラメータは、例えば、予測閾値10、ワードサイズ28、マッチ/ミスマッチスコア1、−2、線形ギャップコストを含む。任意のフィルター、ならびに種特異的繰り返し配列、例えば、ヒト特異的繰り返し配列の選択が適用され得る。

0086

生物製剤
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の生物製剤をコードし得る。本明細書で使用するとき、「生物製剤」は、本明細書に提供される方法によって産生され、かつ重病もしくは命にかかわる疾患または病状を治療、治癒、軽減、予防、または診断するために用いられ得るポリペプチド系分子である。生物製剤には、本発明に従って、アレルゲン抽出物(例えば、アレルギー注射および試験用)、血液成分、遺伝子治療産物、移植に用いられるヒト組織または細胞産物、ワクチン、モノクローナル抗体サイトカイン成長因子、酵素、血栓溶解剤、ならびに免疫調節因子等が含まれるが、これらに限定されない。

0087

本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1つ以上の生物製剤が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的には、特異性純度、および/または構築物設計の選択性により、既知の生物製剤をコードするポリヌクレオチドの本発明の一次構築物またはmmRNAへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。

0088

抗体
本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の抗体またはその断片をコードし得る。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する全長抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、二特異性抗体(diabody)、および一本鎖分子)、ならびに抗体断片を含む。「免疫グロブリンIg)」という用語は、本明細書において「抗体」と同義に使用される。本明細書で使用するとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体、すなわち、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異および/または翻訳後修飾(例えば、異性化アミド化)を除いて同一であるその集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。

0089

本明細書におけるモノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である一方で、鎖(複数可)の残りの部分が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、ならびにそのような抗体の断片を明確に含む。本明細書における目的とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル類人猿等)由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれるが、これに限定されない。

0090

「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合および/または可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFv断片;二特異性抗体;線形抗体;ナノボディ一本鎖抗体分子;および抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。

0091

α、δ、ε、γ、およびμと指定される重鎖を含む、それぞれ、免疫グロブリン、IgAIgDIgEIgG、およびIgMの5つのクラスのうちのいずれかが本発明のmmRNAによってコードされ得る。サブクラス、γおよびμをコードするポリヌクレオ
チド配列も含まれる。したがって、以下のサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2を含む抗体のサブクラスのうちのいずれかが、部分的または全体的にコードされ得る。

0092

本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1個以上の抗体または断片が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、およびmmRNA設計の選択性により、本発明の一次構築物への組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。

0093

本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいてコードされる抗体を利用して、血液、心臓血管CNS中毒抗毒素を含む)、皮膚科学内分泌学胃腸医療画像筋骨格腫瘍学免疫学呼吸器知覚、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。

0094

一実施形態において、本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、モノクローナル抗体および/またはその変異形をコードし得る。抗体の変異形には、置換変異形、保存アミノ酸置換、挿入変異形、欠失変異形、および/または共有結合誘導体も含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書に開示の一次構築物および/またはmmRNAは、免疫グロブリンFc領域をコードし得る。別の実施形態において、一次構築物および/またはmmRNAは、変異形免疫グロブリンFc領域をコードし得る。非限定的な例として、一次構築物および/またはmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,217,147号に記載の変異形免疫グロブリンFc領域を有する抗体をコードし得る。

0095

ワクチン
本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上のワクチンをコードし得る。本明細書で使用するとき、「ワクチン」は、特定の疾患または感染体に対する免疫を高める生物学的調製物である。本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1個以上のワクチンが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、および構築物設計の選択性により、本発明の一次構築物またはmmRNAへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。

0096

本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいてコードされるワクチンを利用して、心臓血管、CNS、皮膚科学、内分泌学、腫瘍学、免疫学、呼吸器、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。

0097

治療用タンパク質またはペプチド
本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の有効なまたは「試験用の」治療用タンパク質またはペプチドをコードし得る。

0098

本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1個以上の治療用タンパク質またはペプチドが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、および構築物設計の選択性により、本発明の一次構築物またはmmRNAへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。

0099

本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいてコードされる治療
用タンパク質およびペプチドを利用して、血液、心臓血管、CNS、中毒(抗毒素を含む)、皮膚科学、内分泌学、遺伝学泌尿生殖器、胃腸、筋骨格、腫瘍学、および免疫学、呼吸器、知覚、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。

0100

細胞透過性ポリペプチド
本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用するとき、「細胞透過性ポリペプチド」またはCPPは、分子の細胞取り込みを促進し得るポリペプチドを指す。本発明の細胞透過性ポリペプチドは、1つ以上の検出可能な標識を含有し得る。ポリペプチドは、部分的に標識化され得るか、または完全に全体を通して標識化され得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、検出可能な標識を完全にコードし得るか、部分的にコードし得るか、または全くコードし得ない。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」は、タンパク質翻訳中に新生タンパク質のアミノ末端に結合されるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列を用いて、細胞透過性ポリペプチドの分泌をシグナル伝達することができる。

0101

一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、融合タンパク質もコードし得る。融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に動作可能に結合させることによって作成され得る。本明細書で使用するとき、「動作可能に結合する」とは、治療用タンパク質および荷電タンパク質が細胞に導入されたときに複合体の発現を可能にするような形で結合していることを指す。本明細書で使用するとき、「荷電タンパク質」は、正電荷負電荷、または全体的に中性の電荷を持つタンパク質を指す。好ましくは、治療用タンパク質は、融合タンパク質の形成時に荷電タンパク質に共有結合され得る。全アミノ酸または表面アミノ酸に対する表面電荷の比率は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、または0.9であり得る。

0102

ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされる細胞透過性ポリペプチドは、翻訳された後に複合体を形成し得る。この複合体は、細胞透過性ポリペプチドに結合、例えば、共有結合された荷電タンパク質を含み得る。「治療用タンパク質」は、細胞に投与されたときに、治療、診断、および/もしくは予防効果を有し、かつ/または所望の生物学的および/もしくは薬理学的効果を誘発するタンパク質を指す。

0103

一実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第1のドメインおよび第2のドメインを含み得る。第1のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第2のドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用するとき、「タンパク質結合パートナー」は、抗体およびその機能的断片足場タンパク質、またはペプチドを含むが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーの細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが導入され得る細胞から分泌されることができ得る。細胞透過性ポリペプチドは、第1の細胞に浸透することもでき得る。

0104

さらなる実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第2の細胞に浸透することができる。第2の細胞は、第1の細胞と同一の領域に由来し得るか、または異なる領域に由来し得る。この領域は、組織および器官を含み得るが、これらに限定されない。第2の細胞は、第1の細胞の近位にあるか、またはその遠位にあり得る。

0105

一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、タンパク質結合パートナーを含み得る細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。タンパク質結合パートナーは、抗体、超荷電抗体、または機能的断片を含み得るが、これらに限定されない
。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、タンパク質結合パートナーを含む細胞透過性ポリペプチドが導入される細胞に導入され得る。

0106

分泌タンパク質
ヒトおよび他の真核細胞は、膜によって多くの機能的にはっきりと異なる区画に細分される。各膜結合型区画、または小器官は、小器官の機能に必須の異なるタンパク質を含有する。この細胞は、タンパク質内に位置するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を用いて、タンパク質を特定の細胞小器官に標的化する。

0107

シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列と呼ばれる一種の選別シグナルは、タンパク質のクラスを小胞体ER)と呼ばれる小器官に指向する。

0108

シグナル配列によってERに標的化されたタンパク質は、分泌タンパク質として細胞外空間に放出され得る。同様に、細胞膜上に存在するタンパク質は、タンパク質を膜に保持する「リンカー」のタンパク質分解切断によって細胞外空間に分泌され得る。理論によって束縛されることを望まないが、上述の細胞輸送を利用するために本発明の分子が用いられ得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、分泌タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。分泌タンパク質は、本明細書または米国特許公開第20100255574号に記載のものから選択され得、その内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0109

一実施形態において、これらは、大量の有益なヒト遺伝子産物の製造時に用いられ得る。

0110

原形質膜タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、原形質膜のタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。

0111

細胞質または細胞骨格タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、細胞質または細胞骨格タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。

0112

細胞内膜結合タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、細胞内膜結合タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。

0113

核タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、核タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。

0114

ヒト疾患に関連したタンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、ヒト疾患に関連したタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。

0115

種々のタンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、現在未知の治療的機能を有するタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。

0116

標的部分
本発明のいくつかの実施形態において、標的部分を発現するポリヌクレオチド、一次構
築物、またはmmRNAが提供される。これらには、インビボもしくはインビトロのいずれかで、細胞を特定の組織空間に標的化するか、または特定の部分と相互作用する働きをする細胞の表面上のタンパク質結合パートナーまたは受容体が含まれる。好適なタンパク質結合パートナーには、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分もしくは生体分子の合成および細胞外局在化を指向することができる。

0117

ポリペプチドライブラリ
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、ポリペプチドライブラリを生成することができる。これらのライブラリは、それぞれ、様々な構造または化学修飾設計を有する、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの集団の生成から生じ得る。この実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの集団は、本明細書に教示されるか、または当技術分野で既知の抗体もしくは抗体断片、タンパク質結合パートナー、足場タンパク質、および他のポリペプチドを含むが、これらに限定されない複数のコードされたポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、その後にコードされたポリペプチドを合成し得る標的細胞または培養物への直接導入に好適であり得るmmRNAを含む本発明の一次構築物である。

0118

ある特定の実施形態において、それぞれ異なるアミノ酸修飾(複数可)を有するタンパク質の複数の変異形は、薬物動態、安定性、生体適合性、および/もしくは生物学的活性、または発現レベル等の生物物理学的特性の点で最善の変異形を決定するために、産生および試験され得る。そのようなライブラリは、10、102、103、104、105、106、107、108、109、または109を超える可能な変異形(1個以上の残基の置換、欠失、および1個以上の残基の挿入を含むが、これらに限定されない)を含有し得る。

0119

抗菌性および抗ウイルス性ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、1個以上の抗菌性ペプチドAMP)または抗ウイルス性ペプチドAVP)をコードするように設計され得る。AMPおよびAVPは、微生物無脊椎動物、植物、両生類鳥類、および哺乳動物等であるが、これらに限定されない様々な動物から単離され、説明されている(Wang et al.,Nucleic AcidsRes.2009;37(データベース刊行):D933−7)。例えば、抗菌性ポリペプチドは、抗菌性ペプチドデータベース(http://aps.unmc.edu/AP/main.php;Wang et al.,Nucleic Acids Res.2009;37(データベース刊行):D933−7)、CAMP:Collection of Anti−Microbial Peptides(http://www.bicnirrh.res.in/antimicrobial/);Thomas et al.,Nucleic Acids Res.2010;38(データベース刊行):D774−80)、米国特許第US5221732号、同第US5447914号、同第US5519115号、同第US5607914号、同第US5714577号、同第US5734015号、同第US5798336号、同第US5821224号、同第US5849490号、同第US5856127号、同第US5905187号、同第US5994308号、同第US5998374号、同第US6107460号、同第US6191254号、同第US6211148号、同第US6300489号、同第US6329504号、同第US6399370号、同第US6476189号、同第US6478825号、同第US6492328号、同第US6514701号、同第US6573361号、同第US6573361号、同第US6576755号、同第US6605698号、同第US6624140
号、同第US6638531号、同第US6642203号、同第US6653280号、同第US6696238号、同第US6727066号、同第US6730659号、同第US6743598号、同第US6743769号、同第US6747007号、同第US6790833号、同第US6794490号、同第US6818407号、同第US6835536号、同第US6835713号、同第US6838435号、同第US6872705号、同第US6875907号、同第US6884776号、同第US6887847号、同第US6906035号、同第US6911524号、同第US6936432号、同第US7001924号、同第US7071293号、同第US7078380号、同第US7091185号、同第US7094759号、同第US7166769号、同第US7244710号、同第US7314858号、および同第US7582301号に記載されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が組み込まれる。

0120

本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、1個以上のエンベロープウイルス(例えば、HIV、HCV)による細胞融合および/またはウイルス侵入ブロックし得る。例えば、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えば、HIV−1 gp120またはgp41の膜貫通サブユニットの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。HIV−1
gp120またはgp41のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、Kuiken et al.,(2008)“HIV Sequence Compendium,”Los Alamos National Laboratoryに記載される。

0121

いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、100%の配列相同性を有し得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、または100%の配列相同性を有し得る。

0122

他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、カプシド結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、カプシド結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、または100%の配列相同性を有し得る。

0123

本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ二量体化をブロックし、機能的タンパク質へのウイルスプロタンパク質(例えば、HIVGag−pol処理)の切断を阻害し、それによって、1個以上のエンベロープウイルス(例えば、HIV、HCV)の放出を阻止し得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、100%の配列相同性を有し得る。

0124

他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、プロテアーゼ結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、100%の配列相同性を有し得る。

0125

本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、ウイルス性病原体に対して指向されるインビトロで進化したポリペプチドを含み得る。

0126

抗菌性ポリペプチド
抗菌性ポリペプチド(AMP)は、細菌、ウイルス、真菌原虫寄生虫プリオン、および腫瘍/癌細胞を含むが、これらに限定されない様々な微生物に対して広域活性を有する可変長、可変配列、および可変構造小ペプチドである(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Zaiou,J Mol Med,2007;85:317を参照のこと)。AMPが広範囲の迅速に発生する殺活性を有し、低レベルの誘導耐性および同時に起こる広範囲の抗炎症作用を有する可能性があることが示されている。

0127

いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、10kDa未満、例えば、8kDa、6kDa、4kDa、2kDa、または1kDa未満であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、約6〜約100個のアミノ酸、例えば、約6〜約75個のアミノ酸、約6〜約50個のアミノ酸、約6〜約25個のアミノ酸、約25〜約100個のアミノ酸、約50〜約100個のアミノ酸、または約75〜約100個のアミノ酸からなる。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、約15〜約45個のアミノ酸からなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、実質的にカチオン性である。

0128

いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、実質的に両親媒性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、実質的にカチオン性および両親媒性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陰性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陰性細菌に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞傷害性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍および/または癌細胞)に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍および/または癌細胞)に対して細胞増殖抑制性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍または癌細胞)に対して細胞傷害性および細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、分泌ポリペプチドであり得る。

0129

いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、デフェンシンを含むか、またはそれからなる。例示のデフェンシンには、α−デフェンシン(例えば、好中球デフェンシ
ン1、デフェンシンα1、好中球デフェンシン3、好中球デフェンシン4、デフェンシン5、デフェンシン6)、β−デフェンシン(例えば、β−デフェンシン1、β−デフェンシン2、β−デフェンシン103、β−デフェンシン107、β−デフェンシン110、β−デフェンシン136)、およびθ−デフェンシンが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、カテリシジン(例えば、hCAP18)を含むか、またはそれからなる。

0130

抗ウイルス性ポリペプチド
抗ウイルス性ポリペプチド(AVP)は、様々なウイルスに対して広域活性を有する可変長、可変配列、および可変構造の小ペプチドである。例えば、Zaiou,J Mol
Med,2007;85:317を参照されたい。AVP広範囲の迅速に発生する殺活性を有し、低レベルの誘導耐性および同時に起こる広範囲の抗炎症作用を有する可能性があることが示されている。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、10kDa未満、例えば、8kDa、6kDa、4kDa、2kDa、または1kDa未満である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、約6〜約100個のアミノ酸、例えば、約6〜約75個のアミノ酸、約6〜約50個のアミノ酸、約6〜約25個のアミノ酸、約25〜約100個のアミノ酸、約50〜約100個のアミノ酸、または約75〜約100個のアミノ酸を含むか、またはこれらからなる。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、約15〜約45個のアミノ酸を含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的に両親媒性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性および両親媒性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞傷害性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)に対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)に対して細胞増殖抑制性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)細胞傷害性およびに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。

0131

細胞傷害性ヌクレオシド
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1個以上の細胞傷害性ヌクレオシドを組み込み得る。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA、例えば、二機能性修飾RNAまたはmRNAに組み込まれ得る。細胞傷害性ヌクレオシド抗癌剤には、アデノシンアラビノシドシタラビン、シトシンアラビノシド、5−フルオロウラシルフルダラビンフロキシウリジン、FTORAFUR(登録商標)(テガフールおよびウラシルの組み合わせ)、テガフール((RS)−5−フルオロ−1−(テトラヒドロフラン−2−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン)、および6−メルカプトプリンが含まれるが、これらに限定されない。

0132

いくつかの細胞傷害性ヌクレオシド類似体は、臨床で用いられているか、または抗癌剤として臨床試験の対象になっている。そのような類似体の例には、シタラビン、ゲムシタビントロキサシタビンデシタビンテザシタビン、2’−デオキシ−2’−メチリデンシチジンDMDC)、クラドリビンクロファラビン、5−アザシチジン、4’−チオ−アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、および1−(2−C−シアノ−2−デオキシ−β−D−アラビノペントフラノシル)−シトシンが含まれるが、これらに限定されない。そのような化合物の別の例には、リン酸フルダラビンがある。これらの化合物は、全身投与され得、正常細胞の増殖時の腫瘍細胞に対する特異性がほとんどまたは全くないといった副作用等であるが、これに限定されない細胞傷害性薬剤の典型的な副作用を有し得る。

0133

細胞傷害性ヌクレオシド類似体のいくつかのプロドラッグも当技術分野において報告されている。例には、N4−ベヘノイル−1−β−D−アラビノフラノシルシトシン、N4−オクタデシル−1−β−D−アラビノフラノシルシトシン、N4−パルミトイル−1−(2−C−シアノ−2−デオキシ−β−D−アラビノ−ペントフラノシル)シトシン、およびP−4055(シタラビン5’−エライジン酸エステル)が含まれるが、これらに限定されない。概して、これらのプロドラッグは、主に肝臓および体循環において活性薬物に変換され、腫瘍組織における活性薬物の選択的放出をほとんどまたは全く呈しない。例えば、5’−デオキシ−5−フルオロシチジン(最終的に、5−フルオロウラシル)のプロドラッグであるカペシタビンは、肝臓および腫瘍組織で代謝される。「生理学的条件下で容易に加水分解可能なラジカル」を含有する一連のカペシタビン類似体は、Fujiuら(米国特許第4,966,891号)によって特許請求されており、参照により本明細書に組み込まれる。Fujiuによって説明されるこの一連のカペシタビン類似体は、5’−デオキシ−5−フルオロシチジンのN4アルキルおよびアラルキルカルバミン酸塩を含み、これらの化合物が正常な生理学的条件下で加水分解によって活性化されて、5’−デオキシ−5−フルオロシチジンをもたらすことを暗示する。

0134

一連のシタラビンN4−カルバミン酸塩が、Fadlら(参照により本明細書に組み込まれる、Pharmazie.1995,50,382−7)によって報告されており、そこで、化合物は、肝臓および血漿においてシタラビンに変換するように設計された。参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2004/041203号は、ゲムシタビンのプロドラッグを開示しており、そこで、プロドラッグのうちのいくつかは、N4−カルバミン酸塩である。これらの化合物は、ゲムシタビンの胃腸毒性を克服するように設計されており、無傷プロドラッグを胃腸管から吸収した後に、肝臓および血漿における加水分解放出によってゲムシタビンを提供するよう意図された。Nomuraら(参照により本明細書に組み込まれる、Bioorg Med.Chem.2003,11,2453−61)は、生体内還元時に酸性条件下でさらなる加水分解を必要とした中間体を産生して、細胞傷害性ヌクレオシド化合物を産生した1−(3−C−エチニル−β−D−リボ−ペントファラノシル)シトシンのアセタール誘導体を説明している。

0135

化学療法薬であり得る細胞傷害性ヌクレオチドには、ピラゾロ[3,4−D]−ピリミジン、アロプリノールアザチオプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メルカプトプリン、6−チオグアニンアシクロビル、アラ−アデノシン、リバビリン、7−デアザ−アデノシン、7−デアザ−グアノシン、6−アザ−ウラシル、6−アザ−シチジン、チミジンリボヌクレオチド5−ブロモデオキシウリジン、2−クロロ−プリン、およびイノシン、またはこれらの組み合わせも含まれるが、これらに限定されない。

0136

隣接領域:非翻訳領域(UTR)
遺伝子の非翻訳領域(UTR)は、転写されるが、翻訳されない。5’UTRが転写開
始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、3’UTRは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性においてUTRが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。UTRの制御特徴は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された下方制御を確保することができる。

0137

5’UTRおよび翻訳開始
天然5’UTRは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のような特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGGを有し、式中、Rは、開始コドン(AUG)の3塩基上流のプリン(アデニンまたはグアニン)であり、この後に別の「G」が続く。5’UTRは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。

0138

特定の標的器官の多量に発現した遺伝子において典型的に見られる特徴を操作することによって、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの安定性およびタンパク質産生を高めることができる。例えば、アルブミン血清アミロイドAアポリポタンパク質A/B/E、トランスフェリン、αフェトタンパク質、エリスロポエチン、または第VIII因子等の肝臓で発現したmRNAの5’UTR導入を用いて、肝細胞株または肝臓でのmmRNA等の核酸分子の発現を高めることができる。同様に、他の組織特異的mRNAからの5’UTRを用いてその組織での発現を高めることは、筋肉(MyoD、ミオシンミオグロビンミオゲニン、ヘルクリン(Herculin))、内皮細胞(Tie−1、CD36)、骨髄細胞(C/EBP、AML1、G−CSF、GM−CSF、CD11b、MSR、Fr−1、i−NOS)、白血球(CD45、CD18)、脂肪組織(CD36、GLUT4、ACRP30、アディポネクチン)、および肺上皮細胞(SP−A/B/C/D)において可能である。

0139

他の非UTR配列が、5’UTR(または3’UTR)に組み込まれ得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの隣接領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生、ならびにmRNAレベルを増加させ得る。

0140

3’UTRおよびAU豊富な要素
3’UTRは、それらに包理される一続きのアデノシン(Adenosine)およびウリジン(Uridine)を有することで知られている。これらのAU豊富な特徴は、特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、AU豊富な要素(ARE)は、3つのクラスに分類され得る(Chen et al,1995):クラスIのAREは、U豊富な領域内にAUUUAモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。C−MycおよびMyoDは、クラスIのAREを含有する。クラスIIのAREは、2個以上の重複したUUAUUUA(U/A)(U/A)九量体を有する。この種のAREを含有する分子は、GM−CSFおよびTNF−aを含む。クラスIIIのAREは、あまり明確にされていない。これらのU豊富な領域は、AUUUAモチーフを含有しない。C−Junおよびミオゲニンが、十分に研究されたこのクラスの例の2つである。AREに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られているが、ELAVファミリーメンバー、中でも注目すべきHuRがmRNAの安定性を向上させることが実証されている。HuRは、これら3つのクラスのAREに結合する。HuR特異的結合部位を操作して核酸分子の3’UTRに入れることで、HuR結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。

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