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課題

生物学的ペースメーカーの生成のための方法および組成物を提供すること。

解決手段

一部の実施形態において、方法は、非ペースメーカー細胞を1つ以上の転写因子と接触させることと(インビボまたはインビトロで)、その細胞においてペースメーカーの機能性を誘導することと、を含む。本出願のいくつかの実施形態は、概して、ペースメーカー細胞(例えば、規則的、律動的な電気活動を有する心臓細胞)の生成のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明の一部の実施形態は、転写因子を使用してペースメーカー細胞を生成するための遺伝子および細胞治療方法(および付随する組成物)に関する。

概要

背景

本出願のいくつかの実施形態は、概して、ペースメーカー細胞(例えば、規則的、律動的な電気活動を有する心臓細胞)の生成のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明の一部の実施形態は、転写因子を使用してペースメーカー細胞を生成するための遺伝子および細胞治療方法(および付随する組成物)に関する。
関連技術の説明

心発生の間、心筋細胞は、心室心房、またはペースメーカー特性のいずれかを示すように特殊化される。心臓の主要なペースメーカー領域である洞房結節(SAN)は、SANにおいて収縮を開始するように機能する10,000個未満のペースメーカー細胞を含む高度に特殊化した構造である。これらのSAN収縮は、次いで、残りの興奮性心臓組織伝播し、心拍をもたらす。興奮性心臓組織の不規則性および/またはペースメーカー細胞の不規則性は、心臓調律の異常を引き起こし得る。多くの心臓の異常は、典型的に、心拍不整頻脈心拍数が高すぎる場合)、または徐脈(心拍数が遅すぎる場合)に関与する。これらの異常は、まとめて不整脈として知られている。

心不整脈の現在の治療法は、典型的に、薬物療法アブレーション電子ペースメーカー装置、またはそれらの組み合わせを利用する。しかしながら、これらの治療法のそれぞれの実用性は、限定的であり、ばらつきのある成功を有した。抗不整脈薬剤が広く処方され、使用されているが、これらはある特定の患者集団に有害な全身性副作用をもたらし得る。さらに、多くの薬物は、新たな不整脈性現象を誘発する傾向があり、これは病的状態の増加を引き起こし得る。不整脈の一部の治療において、高周波アブレーションが使用される。アブレーションは、不整脈の維持の原因として識別されるか、または不整脈の維持に対して極めて重要である、組織永続的な除去に関与する。この方法は、房室結節リエントリー頻拍副伝導路の頻脈、および心房粗動の治療において、いくつかの成功が見られたが、他の不整脈においては、限定的な成功しか見られなかった。例えば、カテーテルアブレーションは、心房細動AF)または心室頻脈(VT)等のより複雑なケースの治療において、あまり成功しない。その上、カテーテルアブレーションは、徐脈の治療において有用ではない。電子ペースメーカー装置は、心拍数を維持するか、または頻脈を終えるためのショック送達することができる。しかしながら、高価な装置、ならびに肺虚脱出血細菌感染症、およびリードジェネレーター障害、または他の種類の機能不全等の合併症が、技術の限界を示す。

概要

生物学的ペースメーカーの生成のための方法および組成物を提供すること。一部の実施形態において、方法は、非ペースメーカー細胞を1つ以上の転写因子と接触させることと(インビボまたはインビトロで)、その細胞においてペースメーカーの機能性を誘導することと、を含む。本出願のいくつかの実施形態は、概して、ペースメーカー細胞(例えば、規則的、律動的な電気活動を有する心臓細胞)の生成のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明の一部の実施形態は、転写因子を使用してペースメーカー細胞を生成するための遺伝子および細胞治療方法(および付随する組成物)に関する。C

目的

さらなる実施形態において、1つ以上の転写因子は、そのような発生または分化経路上に、正または負の制御入力を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

複数の細胞を含む細胞集団であって、前記細胞が、1つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むDNA送達系と接触しており、前記1つ以上の転写因子が、前記細胞の自発的で反復的な電気活動の増加を誘導し、前記細胞の自発的で反復的な電気活動の前記増加が、前記細胞の異所性収縮を生成することができ、前記1つ以上の転写因子が、(a)Tbx18、または(b)Tbx18と、Shox−2、Tbx3、およびTbx5から成る群から選択される1つ以上の転写因子と、を含む、細胞集団。

請求項2

複数の細胞を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための細胞集団であって、前記細胞が、1つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むDNA送達系と接触しており、前記1つ以上の転写因子が、前記細胞の自発的で反復的な電気活動の増加を誘導し、前記細胞の自発的で反復的な電気活動の前記増加が、前記細胞の異所性収縮を生成することができ、前記細胞が、生物学的ペースメーカー機能を必要とする対象への投与に適しており、前記1つ以上の転写因子が、(a)Tbx18、または(b)Tbx18と、Shox−2、Tbx3、およびTbx5から成る群から選択される1つ以上の転写因子と、を含む、細胞集団。

請求項3

前記細胞が心筋細胞を含む、請求項1または2に記載の細胞集団。

請求項4

前記細胞が幹細胞を含む、請求項1に記載の細胞集団。

請求項5

前記幹細胞が、胚性幹細胞非胚性幹細胞骨髄由来幹細胞脂肪由来幹細胞誘導多能性幹細胞、および心臓幹細胞から成る群から選択される、請求項4に記載の細胞集団。

請求項6

DNA送達系を含む組成物であって、前記DNA送達系が、Tbx18をコードするウイルスベクターと、真核生物プロモーターと、を含む、組成物。

請求項7

前記ウイルスベクターが、Shox−2、Tbx3、Tbx5、またはそれらの組み合わせをさらにコードする、請求項6に記載の組成物。

請求項8

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項6または7に記載の組成物。

請求項9

前記アデノウイルスベクターが、配列中に以下の操作可能に連結される成分、第1の逆方向末端反復配列(ITR)、第1のloxP部位パッケージング部位(ψ、psi)、サイトメガロウイルスプロモーター、Tbx18をコードする配列、配列内リボソーム進入部位(IRES)、ポリアデニル化シグナル(An)、第2のloxP部位、前記アデノウイルス初期領域2および初期領域4遺伝子をコードする配列、および第2の逆方向反復配列(ITR)をさらに含む、請求項8に記載の組成物。

請求項10

前記アデノウイルスベクターが、配列中に以下の操作可能に連結される成分、第1の逆方向末端反復配列(ITR)、第1のloxP部位、パッケージング部位(ψ、psi)、サイトメガロウイルスプロモーター、Tbx18およびShox2をコードする配列、配列内リボソーム進入部位(IRES)、ポリアデニル化シグナル(An)、第2のloxP部位、前記アデノウイルス初期領域2および初期領域4遺伝子をコードする配列、および第2の逆方向反復配列(ITR)をさらに含む、請求項8に記載の組成物。

請求項11

(a)細胞集団と、(b)Tbx18をコードするウイルスベクターおよび真核生物プロモーターを含むDNA送達系とを含む、生物学的ペースメーカーの生成のためのキット

請求項12

前記細胞集団が幹細胞を含む、請求項11に記載のキット。

請求項13

前記細胞集団が心筋細胞を含む、請求項11に記載のキット。

請求項14

(a)細胞集団と、(b)Tbx18とを含む、生物学的ペースメーカーの生成のためのキット。

請求項15

前記細胞集団が幹細胞を含む、請求項14に記載のキット。

請求項16

前記細胞集団が心筋細胞を含む、請求項14に記載のキット。

請求項17

前記ウイルスベクターが、Shox−2、Tbx3、Tbx5、またはそれらの組み合わせをさらにコードする、請求項11〜13のいずれか一項に記載のキット。

請求項18

前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項11〜13のいずれか一項に記載のキット。

請求項19

前記アデノウイルスベクターが、配列中に以下の操作可能に連結される成分、第1の逆方向末端反復配列(ITR)、第1のloxP部位、パッケージング部位(ψ、psi)、サイトメガロウイルスプロモーター、Tbx18をコードする配列、配列内リボソーム進入部位(IRES)、ポリアデニル化シグナル(An)、第2のloxP部位、前記アデノウイルス初期領域2および初期領域4遺伝子をコードする配列、および第2の逆方向反復配列(ITR)をさらに含む、請求項18に記載のキット。

請求項20

前記アデノウイルスベクターが、配列中に以下の操作可能に連結される成分、第1の逆方向末端反復配列(ITR)、第1のloxP部位、パッケージング部位(ψ、psi)、サイトメガロウイルスプロモーター、Tbx18およびShox2をコードする配列、配列内リボソーム進入部位(IRES)、ポリアデニル化シグナル(An)、第2のloxP部位、前記アデノウイルス初期領域2および初期領域4遺伝子をコードする配列、および第2の逆方向反復配列(ITR)をさらに含む、請求項18に記載のキット。

請求項21

前記幹細胞が、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、および心臓幹細胞から成る群から選択される、請求項12または15に記載のキット。

請求項22

前記キットが、Shox−2、Tbx3、Tbx5、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載のキット。

技術分野

0001

関連出願
本出願は、2011年11月9日出願の米国仮特許出願第61/557,812号の利益を主張するものであり、その開示は参照により明示的に本明細書に組み込まれる。

背景技術

0002

本出願のいくつかの実施形態は、概して、ペースメーカー細胞(例えば、規則的、律動的な電気活動を有する心臓細胞)の生成のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明の一部の実施形態は、転写因子を使用してペースメーカー細胞を生成するための遺伝子および細胞治療方法(および付随する組成物)に関する。
関連技術の説明

0003

心発生の間、心筋細胞は、心室心房、またはペースメーカー特性のいずれかを示すように特殊化される。心臓の主要なペースメーカー領域である洞房結節(SAN)は、SANにおいて収縮を開始するように機能する10,000個未満のペースメーカー細胞を含む高度に特殊化した構造である。これらのSAN収縮は、次いで、残りの興奮性心臓組織伝播し、心拍をもたらす。興奮性心臓組織の不規則性および/またはペースメーカー細胞の不規則性は、心臓調律の異常を引き起こし得る。多くの心臓の異常は、典型的に、心拍不整頻脈心拍数が高すぎる場合)、または徐脈(心拍数が遅すぎる場合)に関与する。これらの異常は、まとめて不整脈として知られている。

0004

心不整脈の現在の治療法は、典型的に、薬物療法アブレーション電子ペースメーカー装置、またはそれらの組み合わせを利用する。しかしながら、これらの治療法のそれぞれの実用性は、限定的であり、ばらつきのある成功を有した。抗不整脈薬剤が広く処方され、使用されているが、これらはある特定の患者集団に有害な全身性副作用をもたらし得る。さらに、多くの薬物は、新たな不整脈性現象を誘発する傾向があり、これは病的状態の増加を引き起こし得る。不整脈の一部の治療において、高周波アブレーションが使用される。アブレーションは、不整脈の維持の原因として識別されるか、または不整脈の維持に対して極めて重要である、組織永続的な除去に関与する。この方法は、房室結節リエントリー頻拍副伝導路の頻脈、および心房粗動の治療において、いくつかの成功が見られたが、他の不整脈においては、限定的な成功しか見られなかった。例えば、カテーテルアブレーションは、心房細動AF)または心室頻脈(VT)等のより複雑なケースの治療において、あまり成功しない。その上、カテーテルアブレーションは、徐脈の治療において有用ではない。電子ペースメーカー装置は、心拍数を維持するか、または頻脈を終えるためのショック送達することができる。しかしながら、高価な装置、ならびに肺虚脱出血細菌感染症、およびリードジェネレーター障害、または他の種類の機能不全等の合併症が、技術の限界を示す。

課題を解決するための手段

0005

心臓ペーシング機能障害および不整脈の従来の治療法に関連する限界を踏まえて、心不整脈(単純および複雑な両方の種類)を治療する、心不全(電子ペースメーカーの心臓再同期用途などにおいて)を治療する、および/または電動ペースメーカーの必要性を補う、もしくは除去するように心臓ペーシングおよび調律を調節するために使用され得る代替的方法および組成物の必要性が存在する。

0006

現在、生物学的ペースメーカーは、典型的に、変異イオンチャネルタンパク質転写するヌクレオチド遺伝子送達を通して、その効果を誘発する。対照的に、本発明のいくつかの実施形態は、直接的な体細胞から体細胞へのリプログラミング(例えば、非ペースメーカー細胞がペースメーカー細胞にリプログラムされるか、または機能不全のペースメーカー細胞が機能的ペースメーカー細胞にリプログラムされる)を可能にする1つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチド細胞への送達を通して操作される。このため、いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞は、イオンチャネルタンパク質の誘導される変質発現を伴わずに生成される。さらなる実施形態は、幹細胞、または一部の実施形態においては、心筋細胞もしくは幹細胞および心筋細胞の組み合わせを、インビトロの生物学的ペースメーカー細胞に変換させ(例えば、本明細書に開示される1つ以上の転写因子の投与によって)、その後の変換された細胞の植え込みが続くことに関与する。このため、転写因子またはそれらの転写因子によって変換される細胞の送達は、様々な心臓調律の異常を治療する、および/または従来の治療法の必要性を減らすもしくは除去する。

0007

このため、いくつかの実施形態において、対象の心臓組織の電気活動を修正するために、転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成するための方法が提供され、方法は、異常な電気活動を示す心臓組織を有する対象を識別することであって、対象が静止細胞を含む心臓組織を有し、静止細胞が心筋細胞および幹細胞のうちの1つ以上を含み、静止細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、処置細胞を生成するために1つ以上の転写因子を静止細胞に投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、対象の心臓組織の電気活動を修正する。

0008

いくつかの実施形態において、異常な心臓の電気活動は、心不整脈によるものである。しかしながら、心臓の電気活動、シグナル伝達、または機能における他の異常は、本明細書に開示される方法を用いて対処され得る。例えば、いくつかの実施形態において、対象は、洞不全症候群、洞性徐脈、頻脈徐脈症候群、心房細動、房室ブロック、変時不全、QT延長症候群、および心不全からなる群から選択される状態に苦しむ

0009

いくつかの実施形態において、投与は、インビトロで生じ、方法は、処置細胞を対象に投与することをさらに含む。しかしながら、有利に、本明細書に開示される方法は、投与をインビボで生じさせる。

0010

幹細胞の集団を得ることと、インビトロで幹細胞を培養することであって、培養された幹細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含む、培養することと、変換された細胞を生成するために、1つ以上の転写因子を前記静止細胞に送達することであって、変換された細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、送達することと、を含み、それによって、幹細胞を、生物学的ペースメーカーを生成することができる細胞に変換する、幹細胞の集団を転写因子の使用を通して生物学的ペースメーカーの生成に適した細胞に変換する方法もまた提供される。

0011

心不整脈を患っている対象を識別することであって、対象が静止細胞を含む心臓組織を有し、静止細胞が心筋細胞および幹細胞のうちの1つ以上を含み、静止細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、処置細胞を生成するためにTbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上を静止細胞に投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、心不整脈を治療する、転写因子を使用して心不整脈を治療する方法がさらに提供される。

0012

心不整脈を患っている対象を識別することと、変換された幹細胞の集団を得ることであって、変換の前に、幹細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含み、自発的で反復的な電気活動を示す変換された細胞を生成するために、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上が、静止細胞に投与された、得ることと、変換された細胞を対象に投与することであって、投与される変換された細胞を対象の心臓組織に移植し、自発的で反復的な電気活動を示し続ける、投与することと、を含み、それによって生物学的ペースメーカーを生成し、心不整脈を治療する、転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成することによって心不整脈を治療する方法がまた提供される。

0013

いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、の洞房結節発生の制御因子であり、および/または洞房結節細胞への新規細胞分化を促進する。いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、発生の間に静脈洞を定義する。いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、静脈洞におけるNkx2.5の負の制御因子である。

0014

いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、Tbx−18を含む。いくつかの実施形態において、Tbx18(または、他のTbox因子)を使用して、自発的な電気活動を生成するための筋細胞をもたらす。いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、Shox−2を含む。一部の実施形態において、Shox−2を使用して、幹細胞を自発的な電気活動を生成する細胞に変換する。しかしながら、さらなる実施形態において、任意に、Shox−2を使用して、筋細胞をペースメーカー細胞に変換してもよく、および/またはTbx18を使用して、幹細胞をペースメーカー細胞に変換してもよい。

0015

いくつかの実施形態において、転写因子の投与は、インビボであり、心尖部、ヒス束右脚、ヒス束の左脚プルキンエ線維心室間中隔右心室自由壁、左心室自由壁、SA結節AV結節からなる群から選択される部位に対してである。いくつかの実施形態において、投与部位は、右心室を介して、右心房を介して、または心臓に直接アクセスすることによって、アクセスされる。いくつかの実施形態において、直接的なアクセスは、マップ誘導カテーテル注入システムによって、蛍光透視誘導によって、X線誘導によって、心エコー誘導によって、磁気共鳴映像法を介する誘導によって、またはそれらの組み合わせによって達成される。各特定の対象は、症状または他の関連する医療課題を示してもよく、それは、最適な投与経路を決定する。

0016

いくつかの実施形態において、転写因子の投与は、標的組織に1つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むDNA送達系を送達することによって、達成される。いくつかの実施形態において、DNA送達系は、ウイルスベクターを含む。実施形態によって、例えば、アデノウイルスアデノ随伴ウイルスレンチウイルスレトロウイルス、HJV、HIV、および/またはHSV等の種々のウイルスベクターが使用される。1つを超える転写因子が投与される実施形態において、転写因子は、任意に異なるウイルスベクターにパックされてもよい。あるいは、一部の実施形態において、複数の転写因子が、単一のウイルスベクターにパッケージ化されてもよい。

0017

いくつかの実施形態において、しかしながら、DNA送達系は、非ウイルスベクターを含む。実施形態によって、例えば、リポソームベクターカチオンポリマー、および/またはDNA結合ポリマー等の種々の非ウイルスベクターが使用され得る。いくつかの実施形態において、DNA送達系は、のDNAを含む。いくつかの実施形態において、免疫抑制であるか、またはさもなければ不十分な免疫機能を有する患者が、非ウイルス送達系から利益を得てもよい。

0018

いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞のように機能することに加え、処置細胞は、自然のペースメーカー細胞と類似のものである特徴を示す。しかしながら、ある一部のこれらの特徴は、ペースメーカー細胞としての処置細胞機能を有するために存在する必要がない。いくつかの実施形態において、処置細胞は、天然のSAN細胞の長さ/幅形態に実質的に類似する長さ/幅形態を示す。いくつかの実施形態において、この長さ/幅比は、少なくとも約10である。いくつかの実施形態において、処置細胞は、自発的な細胞内Ca++変動の増加を示す。いくつかの実施形態において、自発的で反復的な電気活動は、β−アドレナリン刺激応答して増加する。いくつかの実施形態において、変換された細胞は、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)または骨格αアクチン(αSkA)を発現しない。

0019

いくつかの実施形態において、対象は、心臓組織の電気活動を修正する電子ペースメーカーを有し、それは、一部の患者において対象内に植え込まれ得る。いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、電子ペースメーカーの機能を補う(例えば、電子ペースメーカーの作業負荷を、生物学的ペースメーカーの生成によって減少する)。いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞の生成は、置換、または代替の電子ペースメーカーが対象内に植え込まれ得るまでの一時的なブリッジとして役立つ。いくつかの実施形態において、しかしながら、生物学的ペースメーカーの生成は、電子ペースメーカーを機能的に置き換える。いくつかの実施形態において、この機能的置換は、電子ペースメーカーの短期中期、長期、およびさらには永続的な停止(または、外植)を可能にする。

0020

いくつかの実施形態において、心不整脈を患っている対象を識別することであって、対象が静止細胞を含む心臓組織を有し、静止細胞が心筋細胞および幹細胞のうちの1つ以上を含み、静止細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、処置細胞を生成するために1つ以上の転写因子を静止細胞に投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって心不整脈を治療する、心不整脈を治療するために転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成する方法がまた提供される。

0021

いくつかの実施形態において、対象は哺乳類であり、いくつかの実施形態においては、ヒトである。いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞に変換される幹細胞は、胚性幹細胞であるが、さらなる実施形態において、それらは、成体幹細胞、誘導幹細胞、または常在幹細胞である。

0022

本明細書に開示される方法に従って、ペースメーカー細胞に変換される細胞を得ることと、変換された細胞を心臓の電気活動の機能障害を患っている対象に投与することであって、変換された細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって心臓の電気活動の機能障害を治療する、心臓の電気活動の機能障害を治療する方法がまた本明細書に提供される。

0023

いくつかの実施形態において、心臓の電気活動の機能障害は、心不整脈を含む。いくつかの実施形態において、方法は、投与の前に変換された細胞を単離することをさらに含む。

0024

いくつかの実施形態において、自発的で反復的な電気活動は、ペースメーカー細胞の正常活動の約65%〜約100%の範囲である。いくつかの実施形態において、転写因子の投与は、対象の心臓の調律に変化をもたらす。いくつかの実施形態において、心臓の変化した調律は、正常な心拍数の約25%〜約35%の範囲内の新たな心拍数に対応する。

0025

Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせをコードするウイルスベクター、および真核生物プロモーターを含む、DNA送達系を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための組成物がさらに提供される。

0026

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、配列中に以下の操作可能に連結される成分、第1の逆方向末端反復配列(ITR)、第1のloxP部位パッケージング部位(ψ、psi)、サイトメガロウイルスプロモーター、Tbx18、Shox2、またはそれらの組み合わせをコードする配列、配列内リボソーム進入部位(IRES)、ポリアデニル化シグナル(An)、第2のloxP部位、アデノウイルス初期領域2および初期領域4遺伝子をコードする配列、および第2の逆方向反復配列(ITR)をさらに含む。

0027

本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、幹細胞が、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1つ以上の転写因子と接触しており、1つ以上の転写因子が、細胞の前記自発的で反復的な電気活動の増加を誘導し、細胞の自発的で反復的な電気活動の増加が、細胞の異所性収縮を生成することができ、幹細胞が、生物学的ペースメーカー機能を必要とする対象への投与に適している、複数の幹細胞を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための細胞集団に関する。

0028

いくつかの実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞骨髄由来幹細胞脂肪由来幹細胞誘導多能性幹細胞、および心臓幹細胞からなる群から選択される。

0029

自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を自発的で反復的な電気活動を示すペースメーカー細胞に変換するための、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子の使用がまた本明細書に提供される。

0030

いくつかの実施形態において、自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含む心臓組織を有する対象を識別することと、処置細胞を生成するために1つ以上の転写因子を静止細胞に投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって心不整脈を治療する、転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、対象は、以前に心不整脈を患っていた。

0031

いくつかの実施形態において、静止細胞を含む心臓組織を有する対象を識別することであって、その対象が心不整脈を患っており、静止細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、処置細胞を生成するために、静止細胞にTbx18および/またはShox2(またはそれらの断片)のうちの1つ以上を投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって心不整脈を治療する、心不整脈を治療するための方法がまた提供される。

0032

いくつかの実施形態において、静止細胞は、心筋細胞を含む。他の実施形態において、静止細胞は、幹細胞を含む。なおさらなる実施形態において、静止細胞は、機能不全洞房結節細胞(例えば、正常に機能するペースメーカー細胞に対して速すぎるまたは遅すぎる水準シグナルする洞房結節細胞)を含む。他の実施形態において、静止細胞は、心臓で発見される他の細胞および/または心臓では発見されない他の体細胞を含む。

0033

いくつかの実施形態において、幹細胞の集団を生物学的ペースメーカーの生成に適した細胞に変換する方法がまた提供され、方法は、幹細胞の集団を得ることと、インビトロで幹細胞を培養することであって、培養された幹細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含む、培養することと、変換された細胞を生成するために1つ以上の転写因子を静止細胞に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、変換された細胞は、自発的で反復的な電気活動を示し、このため、インビボで生物学的ペースメーカーを生成することができる。いくつかの実施形態において、幹細胞は、心臓幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、インビトロ変換は、心筋細胞、心臓で発見される他の細胞、および/または心臓では発見されない他の体細胞上で実施され得る。

0034

いくつかの実施形態において、転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成することによって心不整脈を治療する方法がまた提供され、方法は、心不整脈を患っている対象を識別することと、変換された幹細胞の集団を得ることであって、変換の前に、幹細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含み、変換された細胞を生成するために、Tbx18、Shox−2(またはそれらの断片)のうちの1つ以上が静止細胞に投与され、変換された細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、得ることと、変換された細胞を対象に投与することであって、変換された細胞を対象の心臓組織に移植し、自発的で反復的な電気活動を示し続ける、投与することと、を含み、それによって、生物学的ペースメーカーを生成し、心不整脈を治療する。いくつかの実施形態において、変換された細胞は、対象への投与の前に、単離される、精製される、選択される、またはさもなければ、濃縮される。上記で考察されるように、いくつかの実施形態において、幹細胞の代わりに、または幹細胞と併せて、他の静止細胞の種類が、ペースメーカー細胞に変換される。いくつかの実施形態において、インビトロで自発的で反復的な電気活動を示す細胞に変換される細胞には、心筋細胞が挙げられる。

0035

いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、哺乳類対象を治療するために哺乳類幹細胞を利用する。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。

0036

いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、胚の洞房結節発生の制御因子である。いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、洞房結節細胞への新規細胞分化を促進する。なおさらなる実施形態において、1つ以上の転写因子は、胚の洞房結節発生を制御するだけではなく、洞房結節細胞への前駆細胞の新規細胞分化を促進する。さらなる実施形態において、1つ以上の転写因子は、そのような発生または分化経路上に、正または負の制御入力を提供する。いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、心臓の発生の間に、静脈洞を定義する。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子は、静脈洞(または発生する心臓の他の領域)におけるNkx2.5の負の制御因子である。例えば、1つ以上の転写因子は、Nkx2.5シグナル伝達が含まれる経路を負に制御し得る。さらに、もう1つの転写因子は、(RNAまたはタンパク質レベルのいずれかで)Nkx2.5の発現を負に制御し得る。その上、1つ以上の転写因子は、Nkx2.5、またはそこに関連するシグナル伝達経路間接的に制御し得る(例えば、1つ以上の転写因子は、その後、Nkx2.5を負に制御し得る経路を制御する)。

0037

いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、Tbx18、Shox2、Tbx3、Tbx5、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Tbx18、Shox2、Tbx3、Tbx5の変異体は、単独で、または組み合わせて使用される。一部の実施形態において、Tbx18、Shox2、Tbx3、Tbx5の機能的断片は、単独で、または組み合わせのいずれかで使用される。さらなる実施形態において、これらの転写因子の関連するファミリーメンバーがまた、使用される。一部の実施形態において、ヒト転写因子が使用され、一方他の実施形態においては、異なる種からの相同体が使用される(ヒト転写因子(複数可)の代わりに、またはそれと併せてのいずれかで)。さらなる実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成または幹細胞の変換において1つ以上の転写因子の効果を強化するために、1つ以上の転写因子の前に、それと同時に、またはその後に、さらなる転写因子、タンパク質生物学的分子、または薬理剤が投与される。一部の実施形態において、生成される生物学的ペースメーカーが、対象中で完全な機能効果を可能にする短期のブリッジを提供するために、例えば、心不整脈を治療するために使用される従来の薬理剤が、1つ以上の転写因子と同時に投与される。いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子は、Tbx18を含み、一方一部の実施形態において、1つ以上の転写因子は、Shox−2を含む。なおさらなる実施形態において、Tbx18およびShox2は、両方使用される。しかしながら、一部の実施形態において、これら2つの転写因子は、(一部の実施形態において、任意に重複する)別々の時間枠で投与される。加えて、Tbx18およびShox2は、一部の実施形態において別々に投与される(例えば、異なる送達系が使用される)。いくつかの実施形態において、1つの転写因子の機能的断片は、1つ(またはそれ以上)の完全長の転写因子と併せて使用される。なおさらなる実施形態において、転写因子の機能的断片の組み合わせが使用される。

0038

一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、1つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むDNA送達系の投与を含む。いくつかの実施形態において、DNA送達系は、ウイルスベクターを含む。実施形態によって、変数の中でもとりわけ、送達される転写因子(複数可)、ポリヌクレオチド(複数可)の大きさ、投与経路、および患者の一般的な健康状態に基づいて、様々な異なるウイルスベクターが使用される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、HJV、HIV、およびHSVからなる群から選択される。上記で考察されるように、ある特定の実施形態において、単一を超える転写因子が、投与される。一部の実施形態において、送達される転写因子のそれぞれは、同じ種類のウイルスに送達される。一部の実施形態において、しかしながら、第1の転写因子は、第1の種類のウイルスに送達され、一方第2の転写因子は、第2の種類のウイルスにおいて送達される。このように、転写因子のそれぞれの所望の発現プロファイルは、選択されるウイルスの特徴に基づいて生成され得る(例えば、ウイルスの感染からウイルスによって輸送される導入遺伝子の発現までの時間)。例えば、ある特定のウイルスは、他のウイルスと比較してそれらが達するポリヌクレオチドの長期発現を提供する。なお他の実施形態において、1つを超えるウイルスベクターを使用して単一の転写因子を送達することができる。

0039

あるいは、いくつかの実施形態において、DNA送達系は、非ウイルスベクターを含む。一部の実施形態において、非ウイルスベクターは、リポソームベクター、カチオンポリマー、および/またはDNA結合ポリマーから選択される。さらなる実施形態において、1つ以上の転写因子をコードする裸のDNAが送達される。1つを超える転写因子が投与されるなおさらなる実施形態において、ウイルスおよび非ウイルス送達系の組み合わせが使用されてもよい。

0040

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、自発的で反復的な電気活動を示す細胞の生成をもたらす。一部の実施形態において、自発的で反復的な電気活動は、健常なペースメーカー細胞の正常活動の約50%〜約100%の間である。一部の実施形態において、生物学的ペースメーカーは、生成される細胞が、健常なペースメーカー細胞の正常活動の約5%〜約50%の間である自発的で反復的な電気活動を示す場合であっても、生成され得る。このため、本明細書に開示される方法は、生成される細胞が、健常なペースメーカー細胞の正常活動の約5%〜約15%、約15%〜約25%、約25%〜約35%、約35%〜約45%、約45%〜約55%、約55%〜約65%、約65%〜約75%、約75%〜約85%、約85%〜約95%、または約95%〜約100%の間の自発的で反復的な電気活動を示す場合、生物学的ペースメーカーの生成に適している。いくつかの実施形態において、生成される細胞は、健常なペースメーカー細胞の正常活動の100%を超える自発的で反復的な電気活動を示す。

0041

標的細胞の電気活動の変化に加えて、いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子(または生物学的ペースメーカー細胞に変換される細胞)の投与は、心臓の調律におけるその後の変化をもたらす。いくつかの実施形態において、結果として得られる心臓調律は、(特定の患者の年齢および健康歴を考慮して)正常な心臓調律の約5%〜約15%、約15%〜約25%、約25%〜約35%、約35%〜約45%、約45%〜約55%、約55%〜約65%、約65%〜約75%、約75%〜約85%、約85%〜約95%、または約95%〜約100%内である。いくつかの実施形態において、100%を超える心臓調律の上昇が達成される。

0042

いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子(または、生物学的ペースメーカー細胞へ変換される細胞)の投与は、植え込み電子ペースメーカーを有する対象に対するものである。一部の実施形態において、設定された投与による生物学的ペースメーカーの生成が、対象の植え込み電子ペースメーカーへの依存を低減する。一部の実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、電子ペースメーカーのすべてまたは一部が、置換えられる間(例えば、電子ペースメーカーの一部が感染される場合)、ブリッジ治療を提供するためである。なおさらなる実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、植え込み電子ペースメーカーの必要性を除去し、したがって、植え込み電子ペースメーカーは、対象から永久的に取り除かれ得る。さらなる実施形態において、電子ペースメーカーは、電子ペースメーカーへの依存が低減されるように、1つ以上の転写因子(または変換された生物学的ペースメーカー細胞)の投与と併せて植え込まれ得る。

0043

複数の投与経路が、実施形態によって、任意に使用され得る。種々の因子は、本明細書に開示される方法を使用して、機能不全のペースメーカー細胞を再機能させる場合、1つ以上の転写因子が投与されるべき場合、または変換された細胞が投与されるべき場合、健常組織が生物学的ペースメーカーを生成することができる場所を含むが、これらに限定されない、何の標的部位が使用されるかを決定する。一部の実施形態において、投与は、心尖部内にである。一部の実施形態において、投与は、心室間中隔に対してである。一部の実施形態において、投与は、右心室自由壁に対してである。一部の実施形態において、投与は、左心室自由壁に対してである。一部の実施形態において、投与は、右心室を介してである。一部の実施形態において、投与は、右心房を介してである。いくつかのそのような実施形態において、右側のアプローチは、有利に、塞栓症および/または脳卒中の危険性を減少させる。一部の実施形態において、投与は、同時または異なる時間のいずれかで、上記経路の2つ以上を介して行われる。

0044

上記で考察されるように、一部の実施形態において、本明細書に開示される方法を使用して、存在するペースメーカー細胞または心臓伝導系内の細胞の機能を(部分的にまたは完全にのいずれかで)回復する。一部の実施形態において、投与は、ヒス束の右脚または左脚に対してである。一部の実施形態において、投与は、プルキンエ線維に対してである。なおさらなる実施形態において、投与は、SA結節に対して、および/またはAV結節に対してである。

0045

変換された細胞が送達されるある特定の実施形態において、静脈内投与が使用される。一部の実施形態において、冠動脈内投与が使用される。

0046

状況次第で、一部の実施形態において、(1つ以上の転写因子の、または変換された生物学的ペースメーカー細胞の)投与は、心臓に直接アクセスすることによって行われる(例えば、電子ペースメーカーを除去する間に注入)。一部の実施形態において、カテーテルが、投与に使用される。一部の実施形態において、カテーテルは、マップ誘導カテーテル注入システムを含む。一部の実施形態において、蛍光透視誘導を使用して、カテーテル(または他の投与システム)を心臓内の標的組織に導く。一部の実施形態において、X線誘導が使用される。さらなる実施形態において、心エコー誘導が使用され、ある特定の実施形態において、同様に磁気共鳴映像法が使用される。一部の実施形態において、上記モードの誘導媒体(guidance vehicle)の2つ以上が、同時にまたは投与中の異なる時間に使用される。

0047

上記で開示される方法に加えて、Tbx18、Shox2、またはそれらの組み合わせをコードするウイルスベクター、および真核生物プロモーターを含む、DNA送達系を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための組成物がまた本明細書に提供される。1つの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであるが、しかしながら、上記で考察されるように、実施形態によって、様々な異なるウイルスベクターもまた使用され得る。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、配列中に以下の操作可能に連結される成分、第1の逆方向末端反復配列(ITR)、第1のloxP部位、パッケージング部位(ψ、psi)、サイトメガロウイルスプロモーター、Tbx18、Shox2、またはそれらの組み合わせをコードする配列、配列内リボソーム進入部位(IRES)、ポリアデニル化シグナル(An)、第2のloxP部位、アデノウイルス初期領域2および初期領域4遺伝子をコードする配列、および第2の逆方向反復配列(ITR)をさらに含む。

0048

いくつかの実施形態において、投与されるウイルス構築物の用量は、ウイルスに関する学問(viral arts)において、確立した測定単位であるプラーク形成単位に基づく。一部の実施形態において、約1×108〜1×1010pfu(体積で50〜200マイクロリットルの範囲)の用量が、使用される。生物学的ペースメーカー細胞に変換される細胞の送達に関しては、細胞の用量は、1×105〜1×108細胞の範囲にわたる。(他の要因の中でもとりわけ)対象の心不整脈の重症度、電子ペースメーカーの有無、および/または対象の心臓の大きさによって、より高いまたはより低い用量が使用され得る。

0049

幹細胞がTbx18、Shox2、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1つ以上の転写因子と接触しており、1つ以上の転写因子が細胞の自発的で反復的な電気活動の増加を誘導し、細胞の自発的で反復的な電気活動の増加が自発的で反復的な異所性収縮を生成し、幹細胞が生物学的ペースメーカー機能を必要とする対象への投与に適している、複数の幹細胞を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための細胞集団がまた本明細書に提供される。

0050

いくつかの実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、および心臓幹細胞からなる群から選択される。1つの実施形態において、細胞集団は、生物学的ペースメーカーの表現型を有する細胞に変換されている収集された成人心臓幹細胞を含む。

0051

自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を自発的で反復的な電気活動を示すペースメーカー細胞に変換するための、Tbx18およびShox2からなる群から選択される1つ以上の転写因子の使用がまた本明細書に提供される。
一つの実施形態において、本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
対象の心臓組織の電気活動を修正するための転写因子を使用して、生物学的ペースメーカーを生成する方法であって、
異常な電気活動を示す心臓組織を有する対象を識別することであって、
前記対象が、静止細胞を含む心臓組織を有し、
前記静止細胞が、心筋細胞および幹細胞のうちの1つ以上を含み、
前記静止細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、
処置細胞を生成するために、前記静止細胞に1つ以上の転写因子を投与することであって、
前記処置細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、前記対象の前記心臓組織の電気活動を修正する、方法。
(項目2)
前記対象が、洞不全症候群、洞性徐脈、頻脈徐脈症候群、心房細動、房室ブロック、変時不全、QT延長症候群、および心不全から成る群から選択される状態に苦しむ、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記異常な心臓の電気活動が、心不整脈によるものである、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記投与が、インビトロで生じ、前記方法が、前記対象に前記処置細胞を投与することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記投与が、インビボで生じる、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記1つ以上の転写因子が、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記1つ以上の転写因子が、Tbx−18を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記1つ以上の転写因子が、Shox−2を含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記投与が、心尖部、ヒス束の右脚、ヒス束の左脚、プルキンエ線維、心室間中隔、右心室自由壁、左心室自由壁、SA結節、AV結節から成る群から選択される部位に対してである、項目5〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記投与部位が、右心室を介してアクセスされる、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記投与部位が、右心房を介してアクセスされる、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記投与部位が、心臓に直接アクセスすることによってアクセスされる、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記アクセスすることが、マップ誘導カテーテル注入システムによって達成される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記アクセスすることが、蛍光透視誘導によって達成される、項目12に記載の方法。(項目15)
前記アクセスすることが、X線誘導によって達成される、項目12に記載の方法。
(項目16)
前記アクセスすることが、心エコー誘導によって達成される、項目12に記載の方法。(項目17)
前記アクセスすることが、磁気共鳴映像法を介する誘導によって達成される、項目12に記載の方法。
(項目18)
前記投与が、前記1つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むDNA送達系を送達することを含む、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記DNA送達系が、ウイルスベクターを含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、HJV、HIV、およびHSVから成る群から選択される、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記DNA送達系が、非ウイルスベクターを含む、項目18に記載の方法。
(項目22)
前記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、カチオンポリマー、および/またはDNA結合ポリマーのうちの1つ以上である、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記DNA送達系が、裸のDNAを含む、項目18に記載の方法。
(項目24)
前記処置細胞が、天然のSAN細胞の長さ/幅形態に実質的に類似する長さ/幅形態を示す、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記処置細胞が、少なくとも約10の長さ/幅比を有する、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記処置細胞が、自発的な細胞内Ca2+変動の増加を示す、項目1に記載の方法。
(項目27)
前記自発的で反復的な電気活動が、β−アドレナリン刺激に応答して増加する、項目1に記載の方法。
(項目28)
変換された細胞が、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)または骨格αアクチン(αSkA)を発現しない、項目1に記載の方法。
(項目29)
前記対象が、前記心臓組織の前記電気活動を修正する電子ペースメーカーを有する、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記生物学的ペースメーカーの前記生成が、前記電子ペースメーカーの機能を補う、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記生物学的ペースメーカーの前記生成が、前記電子ペースメーカーを機能的に置き換える、項目29に記載の方法。
(項目32)
心不整脈を治療するための転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成する方法であって、
心不整脈を患っている対象を識別することであって、
前記対象が、静止細胞を含む心臓組織を有し、
前記静止細胞が、心筋細胞および幹細胞のうちの1つ以上を含み、
前記静止細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、
処置細胞を生成するために、前記静止細胞に1つ以上の転写因子を投与することであって、
前記処置細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、前記心不整脈を治療する、方法。

(項目33)
転写因子の使用を通して幹細胞の集団を生物学的ペースメーカーの生成に適した細胞に変換する方法であって、
幹細胞の集団を得ることと、
インビトロで前記幹細胞を培養することであって、
前記培養された幹細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含む、培養することと、
変換された細胞を生成するために、1つ以上の転写因子を前記静止細胞に送達することであって、
前記変換された細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、送達することと、を含み、それによって、前記幹細胞を、生物学的ペースメーカーを生成することができる細胞に変換する、方法。
(項目34)
前記1つ以上の転写因子が、胚の洞房結節発生の制御因子であり、および/または洞房結節細胞への新規細胞分化を促進する、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記1つ以上の転写因子が、発生の間に静脈洞を定義する、項目33〜34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記1つ以上の転写因子が、前記静脈洞においてNkx2.5の負の制御因子である、項目33〜34のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記1つ以上の転写因子が、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、項目33〜34のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記1つ以上の転写因子が、Tbx18を含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記1つ以上の転写因子が、Shox−2を含む、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記送達が、前記静止細胞に前記1つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むDNA送達系を送達することを含む、項目33〜39のいずれか一項に記載の方法。(項目41)
前記DNA送達系が、ウイルスベクターを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、HJV、HIV、およびHSVから成る群から選択される、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記DNA送達系が、非ウイルスベクターを含む、項目40に記載の方法。
(項目44)
前記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、カチオンポリマー、および/またはDNA結合ポリマーのうちの1つ以上である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記DNA送達系が、裸のDNAを含む、項目40に記載の方法。
(項目46)
前記対象および/または前記幹細胞が、哺乳類である、項目33〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目46に記載の方法。
(項目48)
心臓の電気活動の機能障害を治療する方法であって、
項目33〜47のいずれか一項に記載の方法に従って、変換された細胞を得ることと、
前記変換された細胞を心臓の電気活動の機能障害を患っている対象に投与することであって、前記変換された細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、心臓の電気活動の前記機能障害を治療する、方法。
(項目49)
心臓の電気活動の前記機能障害が、心不整脈を含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記投与の前に前記変換された細胞を単離することをさらに含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記自発的で反復的な電気活動が、ペースメーカー細胞の正常活動の約65%〜約100%の範囲内である、項目48〜50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記投与が、心臓の調律に変化をもたらす、項目48〜51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
心臓の前記変化した調律が、正常な心拍数の約25%〜約35%の範囲内の新たな心拍数に対応する、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記投与が、植え込みペースメーカーを有する対象に対するものである、項目48〜53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記投与が、前記対象の前記植え込みペースメーカーへの依存を低減する、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記低減された依存が、前記植え込みペースメーカーの外植または置換を可能にするのに十分である、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記投与が、心尖部内にである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記投与が、ヒス束の右脚に対してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記投与が、ヒス束の左脚に対してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記投与が、プルキンエ線維に対してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記投与が、心室間中隔に対してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記投与が、右心室自由壁に対してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記投与が、左心室自由壁に対してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記投与が、SA結節に対してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。(項目65)
前記投与が、AV結節に対してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。(項目66)
前記投与が、右心室を介してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
前記投与が、右心房を介してである、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記投与が、心臓に直接アクセスすることによって行われる、項目48〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記アクセスすることが、マップ誘導カテーテル注入システム、蛍光透視誘導、X線誘導、心エコー誘導、および磁気共鳴映像法を介する誘導のうちの1つ以上の使用によって促進される、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記生物学的ペースメーカーの生成のための組成物であって、
Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせをコードするウイルスベクターと、
真核生物プロモーターと、を含む、DNA送達系を含む、組成物。
(項目71)
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、項目70に記載の組成物。(項目72)
前記アデノウイルスベクターが、配列中に以下の操作可能に連結される成分、
第1の逆方向末端反復配列(ITR)、
第1のloxP部位、
パッケージング部位(ψ、psi)、
サイトメガロウイルスプロモーター、
Tbx18、Shox2、またはそれらの組み合わせをコードする配列、
配列内リボソーム進入部位(IRES)、
ポリアデニル化シグナル(An)、
第2のloxP部位、
前記アデノウイルス初期領域2および初期領域4遺伝子をコードする配列、および
第2の逆方向反復配列(ITR)をさらに含む、項目71に記載の組成物。
(項目73)
前記生物学的ペースメーカーの生成のための細胞集団であって、
幹細胞が、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1つ以上の転写因子と接触しており、
前記1つ以上の転写因子が、前記細胞の前記自発的で反復的な電気活動の増加を誘導し、
前記細胞の前記自発的で反復的な電気活動の前記増加が、前記細胞の異所性収縮を生成することができ、
前記幹細胞が、生物学的ペースメーカー機能を必要とする対象への投与に適している、複数の幹細胞を含む、細胞集団。
(項目74)
前記幹細胞が、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、および心臓幹細胞から成る群から選択される、項目73に記載の細胞集団。(項目75)
自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を自発的で反復的な電気活動を示すペースメーカー細胞に変換するための、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1つ以上の転写因子の使用。
(項目76)
転写因子を使用して心不整脈を治療する方法であって、
心不整脈を患っている対象を識別することであって、
前記対象が、静止細胞を含む心臓組織を有し、
前記静止細胞が、心筋細胞および幹細胞のうちの1つ以上を含み、
前記静止細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、
処置細胞を生成するために、前記静止細胞にTbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上を投与することであって、
前記処置細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、前記心不整脈を治療する、方法。
(項目77)
転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成することによって心不整脈を治療する方法であって、
心不整脈を患っている対象を識別することと、
変換された幹細胞の集団を得ることであって、
前記変換の前に、前記幹細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含み、
自発的で反復的な電気活動を示す変換された細胞を生成するために、Tbx18、Shox−2、Tbx3、Tbx5、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上が、前記静止細胞に投与された、得ることと、
前記変換された細胞を前記対象に投与することであって、前記投与される変換された細胞を前記対象の前記心臓組織に移植し、自発的で反復的な電気活動を示し続ける、投与することと、を含み、それによって生物学的ペースメーカーを生成し、前記心不整脈を治療する、方法。

図面の簡単な説明

0052

新生(1A)および成体(1B)ラットの心臓のSAN細胞の免疫組織化学を示す。SANは、HCN4共染色によって境界画定され、周囲の心房から分離される。スケールバー:50μm。
新生(1A)および成体(1B)ラットの心臓のSAN細胞の免疫組織化学を示す。SANは、HCN4共染色によって境界を画定され、周囲の心房から分離される。スケールバー:50μm。
新生ラット心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
新生ラットの心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位(AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能の指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAレベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
新生ラットの心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位(AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能の指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAレベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
新生ラットの心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位(AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能の指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAレベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
新生ラットの心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位(AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能の指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAレベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
新生ラットの心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位(AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能の指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAレベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
新生ラットの心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位(AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能の指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAレベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
新生ラットの心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位(AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能の指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAレベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
新生ラットの心室筋細胞(NRVM)へのTbx18形質導入の効果を示す。図2Aは、自発的に拍動するNRVM培養の数の著しい増加を示す。各「n」は、24ウェルプレートの1ウェルを表す。図2Bは、GFP−(2B左)およびTbx18−NRVM(2B右)からの代表的な活動電位(AP)記録を示す。図2Cは、最大拡張期電位(左)、自動能の指標(中央)、および自発的変動(spontaneously−oscillating)Ca2+トランジェントの全細胞数(右)が要約されることを示す。図2Dは、左に代表的なIK1密度の未加工記録を、および右に−140mVでの要約されたIK1密度を示す。図2Eは、GFP−(左)またはTbx18−NRVM(中央)におけるHCN4免疫染色(HCN4−白色、核−青色)を示す。要約データが、右に示される。図2F(左)は、Tbx18形質導入が、HCN4を発現するNVRMの数の3.8倍の増加をもたらすことを示し、一方2F(右)は、Tbx18−NVRMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加を示す。図2Gは、Tbx18−形質導入細胞が、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)で、Ifを示したことを示す。図2Hおよび2Iは、GFP−NRVMに正規化されるTbx18−NRVM(左)およびLV正規化されるSAN(右)と比較して、選択される遺伝子の関連するmRNAレベルの変化を示す。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダム分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PK阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
NRVMにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのTbx18発現の効果を示す。図3Aは、Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(10個の細胞からn=8)に先立つ局所的Ca2+放出現象(LCR)を解像したことを示す。図3Bは、対照細胞中のLCRを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図3Cは、LCRが、サイクル長の72±1%の平均期間を有したことを示す。図3Dは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘発性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示すCa2+濃度の変化の空間平均されたdF/F0プロットを示す。図3Eは、自発的なCa2+トランジェントが、対照におけるわずか12±2%の抑制と比較して、Tbx18−NRVMにおいて、RyR遮断薬であるリアノジン(10μM)による灌流上で47±6%抑制されることを示す。図3Fは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示したことを示す。図3Gは、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。ウサギのSAN対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx18−とGFP−NRVM(図3G)との間において検出されなかった。図3Hは、GFP−NVRM(白バー)およびTbx18−NVRM(斜線格子柄のバー)の細胞内cAMPレベルに関するデータを示す。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて著しく高く、これは、ウサギのSANと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図3Iは、GFP−またはTbx18NVRMにおけるCa2+トランジェントに関するデータを示す。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞のCa2+トランジェントの休止を引き起こしたが、GFP−NRVM上では効果がなかった。図3Jは、最大半量の持続時間での全幅(FWHD、左パネル)、および最大半量の幅での全持続時間(FDHW、左パネル)として測定された、Tbx18−NRVMからのLCRが、GFP−NRVMからの自発的なCa2+放出現象よりも長く、広いことを示す。Ca2+シグナルの振幅(F/Foの任意の単位で測定される、右パネル)は、2つのグループ間に類似している。
Tbx−18形質導入後の種々の心臓タンパク質の発現、機能、およびチャネル発現に関するデータを示す。図4Aは、HCN4発現(上段、中央)によって境界を画定される新生ラットのSANを示し、それは、より弱く、不定形筋節α−アクチニン(α−SA)発現(上段パネル)を示す。下段左:上段左内の囲まれた範囲の拡大画像図4Bは、対照と比較して、Tbx18−NRVMの膜容量において細胞範囲の28%の減少および33%の減少(それぞれ、左および右)を示す。図4C:H3K27上のトリメチル化レベル(左)は、対照に正規化されるHCN4プロモーター上のその抑圧的後成的圧力を解放する一方、Tbx18が、Cx43、Kir2.1、およびα−SAプロモーターの不活性を増加したことを示す。H3K4me3レベル(右)は、Cx43、Kir2.1、およびa−SAの転写的活性プロモーター領域が、Tbx18発現に応じて減少した一方、活性HCN4プロモーター領域の割合が、Tbx18発現に応じて増加したことを示す。
Tbx−18形質導入後の種々の心臓タンパク質の発現、機能、およびチャネル発現に関するデータを示す。図4Aは、HCN4発現(上段、中央)によって境界を画定される新生ラットのSANを示し、それは、より弱く、不定形の筋節α−アクチニン(α−SA)発現(上段パネル)を示す。下段左:上段左内の囲まれた範囲の拡大画像。図4Bは、対照と比較して、Tbx18−NRVMの膜容量において細胞範囲の28%の減少および33%の減少(それぞれ、左および右)を示す。図4C:H3K27上のトリメチル化レベル(左)は、対照に正規化されるHCN4プロモーター上のその抑圧的な後成的圧力を解放する一方、Tbx18が、Cx43、Kir2.1、およびα−SAプロモーターの不活性を増加したことを示す。H3K4me3レベル(右)は、Cx43、Kir2.1、およびa−SAの転写的活性プロモーター領域が、Tbx18発現に応じて減少した一方、活性HCN4プロモーター領域の割合が、Tbx18発現に応じて増加したことを示す。
Tbx−18形質導入後の種々の心臓タンパク質の発現、機能、およびチャネル発現に関するデータを示す。図4Aは、HCN4発現(上段、中央)によって境界を画定される新生ラットのSANを示し、それは、より弱く、不定形の筋節α−アクチニン(α−SA)発現(上段パネル)を示す。下段左:上段左内の囲まれた範囲の拡大画像。図4Bは、対照と比較して、Tbx18−NRVMの膜容量において細胞範囲の28%の減少および33%の減少(それぞれ、左および右)を示す。図4C:H3K27上のトリメチル化レベル(左)は、対照に正規化されるHCN4プロモーター上のその抑圧的な後成的圧力を解放する一方、Tbx18が、Cx43、Kir2.1、およびα−SAプロモーターの不活性を増加したことを示す。H3K4me3レベル(右)は、Cx43、Kir2.1、およびa−SAの転写的活性プロモーター領域が、Tbx18発現に応じて減少した一方、活性HCN4プロモーター領域の割合が、Tbx18発現に応じて増加したことを示す。
胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生胎児状態への脱分化ではなく、Tbx18に誘導される特異的再操作を支持する。図5A〜5Bは、エンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導されるNRVM中の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現を示す。GFPは効果がなかった(A、下段パネル)が、一方ANP発現は、Tbx18発現によって抑制された(B、下段パネル)。図5Cは、Tbx18−NRVM中の骨格αアクチン(αSkA)の発現を示す。図5Dは、ホスホヒストン3(H3P、有糸分裂的活性細胞マーカー)の発現ならびにEdU(BrdUの類似体有糸分裂および新生DNA合成のマーカー)のGFP−およびTbx18−NRVMへの取り込みを示す(n=3)。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのTbx18−およびGFP−NRVM中への取り込みは同等であり、Tbx18−NRVMは、胎生/胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図5Eおよび5Gは、クロマチンリモデリングに関する84個の遺伝子の発現の比較において、Tbx18−とGFP−NRVMとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図5Fおよび5Hは、iPS細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生/胎児状態への脱分化ではなく、Tbx18に誘導される特異的再操作を支持する。図5A〜5Bは、エンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導されるNRVM中の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現を示す。GFPは効果がなかった(A、下段パネル)が、一方ANP発現は、Tbx18発現によって抑制された(B、下段パネル)。図5Cは、Tbx18−NRVM中の骨格αアクチン(αSkA)の発現を示す。図5Dは、ホスホヒストン3(H3P、有糸分裂的活性細胞マーカー)の発現ならびにEdU(BrdUの類似体、有糸分裂および新生DNA合成のマーカー)のGFP−およびTbx18−NRVMへの取り込みを示す(n=3)。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのTbx18−およびGFP−NRVM中への取り込みは同等であり、Tbx18−NRVMは、胎生/胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図5Eおよび5Gは、クロマチンリモデリングに関する84個の遺伝子の発現の比較において、Tbx18−とGFP−NRVMとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図5Fおよび5Hは、iPS細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生/胎児状態への脱分化ではなく、Tbx18に誘導される特異的再操作を支持する。図5A〜5Bは、エンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導されるNRVM中の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現を示す。GFPは効果がなかった(A、下段パネル)が、一方ANP発現は、Tbx18発現によって抑制された(B、下段パネル)。図5Cは、Tbx18−NRVM中の骨格αアクチン(αSkA)の発現を示す。図5Dは、ホスホヒストン3(H3P、有糸分裂的活性細胞マーカー)の発現ならびにEdU(BrdUの類似体、有糸分裂および新生DNA合成のマーカー)のGFP−およびTbx18−NRVMへの取り込みを示す(n=3)。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのTbx18−およびGFP−NRVM中への取り込みは同等であり、Tbx18−NRVMは、胎生/胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図5Eおよび5Gは、クロマチンリモデリングに関する84個の遺伝子の発現の比較において、Tbx18−とGFP−NRVMとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図5Fおよび5Hは、iPS細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生/胎児状態への脱分化ではなく、Tbx18に誘導される特異的再操作を支持する。図5A〜5Bは、エンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導されるNRVM中の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現を示す。GFPは効果がなかった(A、下段パネル)が、一方ANP発現は、Tbx18発現によって抑制された(B、下段パネル)。図5Cは、Tbx18−NRVM中の骨格αアクチン(αSkA)の発現を示す。図5Dは、ホスホヒストン3(H3P、有糸分裂的活性細胞マーカー)の発現ならびにEdU(BrdUの類似体、有糸分裂および新生DNA合成のマーカー)のGFP−およびTbx18−NRVMへの取り込みを示す(n=3)。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのTbx18−およびGFP−NRVM中への取り込みは同等であり、Tbx18−NRVMは、胎生/胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図5Eおよび5Gは、クロマチンリモデリングに関する84個の遺伝子の発現の比較において、Tbx18−とGFP−NRVMとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図5Fおよび5Hは、iPS細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生/胎児状態への脱分化ではなく、Tbx18に誘導される特異的再操作を支持する。図5A〜5Bは、エンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導されるNRVM中の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現を示す。GFPは効果がなかった(A、下段パネル)が、一方ANP発現は、Tbx18発現によって抑制された(B、下段パネル)。図5Cは、Tbx18−NRVM中の骨格αアクチン(αSkA)の発現を示す。図5Dは、ホスホヒストン3(H3P、有糸分裂的活性細胞マーカー)の発現ならびにEdU(BrdUの類似体、有糸分裂および新生DNA合成のマーカー)のGFP−およびTbx18−NRVMへの取り込みを示す(n=3)。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのTbx18−およびGFP−NRVM中への取り込みは同等であり、Tbx18−NRVMは、胎生/胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図5Eおよび5Gは、クロマチンリモデリングに関する84個の遺伝子の発現の比較において、Tbx18−とGFP−NRVMとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図5Fおよび5Hは、iPS細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生/胎児状態への脱分化ではなく、Tbx18に誘導される特異的再操作を支持する。図5A〜5Bは、エンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導されるNRVM中の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現を示す。GFPは効果がなかった(A、下段パネル)が、一方ANP発現は、Tbx18発現によって抑制された(B、下段パネル)。図5Cは、Tbx18−NRVM中の骨格αアクチン(αSkA)の発現を示す。図5Dは、ホスホヒストン3(H3P、有糸分裂的活性細胞マーカー)の発現ならびにEdU(BrdUの類似体、有糸分裂および新生DNA合成のマーカー)のGFP−およびTbx18−NRVMへの取り込みを示す(n=3)。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのTbx18−およびGFP−NRVM中への取り込みは同等であり、Tbx18−NRVMは、胎生/胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図5Eおよび5Gは、クロマチンリモデリングに関する84個の遺伝子の発現の比較において、Tbx18−とGFP−NRVMとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図5Fおよび5Hは、iPS細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生/胎児状態への脱分化ではなく、Tbx18に誘導される特異的再操作を支持する。図5A〜5Bは、エンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導されるNRVM中の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現を示す。GFPは効果がなかった(A、下段パネル)が、一方ANP発現は、Tbx18発現によって抑制された(B、下段パネル)。図5Cは、Tbx18−NRVM中の骨格αアクチン(αSkA)の発現を示す。図5Dは、ホスホヒストン3(H3P、有糸分裂的活性細胞マーカー)の発現ならびにEdU(BrdUの類似体、有糸分裂および新生DNA合成のマーカー)のGFP−およびTbx18−NRVMへの取り込みを示す(n=3)。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのTbx18−およびGFP−NRVM中への取り込みは同等であり、Tbx18−NRVMは、胎生/胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図5Eおよび5Gは、クロマチンリモデリングに関する84個の遺伝子の発現の比較において、Tbx18−とGFP−NRVMとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図5Fおよび5Hは、iPS細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生/胎児状態への脱分化ではなく、Tbx18に誘導される特異的再操作を支持する。図5A〜5Bは、エンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導されるNRVM中の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現を示す。GFPは効果がなかった(A、下段パネル)が、一方ANP発現は、Tbx18発現によって抑制された(B、下段パネル)。図5Cは、Tbx18−NRVM中の骨格αアクチン(αSkA)の発現を示す。図5Dは、ホスホヒストン3(H3P、有糸分裂的活性細胞マーカー)の発現ならびにEdU(BrdUの類似体、有糸分裂および新生DNA合成のマーカー)のGFP−およびTbx18−NRVMへの取り込みを示す(n=3)。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのTbx18−およびGFP−NRVM中への取り込みは同等であり、Tbx18−NRVMは、胎生/胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図5Eおよび5Gは、クロマチンリモデリングに関する84個の遺伝子の発現の比較において、Tbx18−とGFP−NRVMとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図5Fおよび5Hは、iPS細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
心室異所性拍動に関するデータを示す。図6Aは、インビボでモルモットの心臓の心尖部におけるTbx18の局所的発現が、GFP(左パネル)と比較して異所性心室拍動(右パネル)を引き起こしたことを示す。図6Bは、遺伝子送達後3〜5日間のTbx18−注入動物における異所性心室拍動の速度が、対照よりも著しく速いことを示す。
心室異所性拍動に関するデータを示す。図6Aは、インビボでモルモットの心臓の心尖部におけるTbx18の局所的発現が、GFP(左パネル)と比較して異所性の心室拍動(右パネル)を引き起こしたことを示す。図6Bは、遺伝子送達後3〜5日間のTbx18−注入動物における異所性心室拍動の速度が、対照よりも著しく速いことを示す。
インビボでのモルモットの心臓の心尖部におけるTbx18(7A)の局所的発現が、(GFP対照(7B)と比較して)異所性心室拍動を引き起こしたことを示す。これらのデータはまた、TBX18動物(7C)およびGFP対照(7D)からのEKG記録においても表される。
インビボでのモルモットの心臓の心尖部におけるTbx18(7A)の局所的発現が、(GFP対照(7B)と比較して)異所性心室拍動を引き起こしたことを示す。これらのデータはまた、TBX18動物(7C)およびGFP対照(7D)からのEKG記録においても表される。
インビボでのモルモットの心臓の心尖部におけるTbx18(7A)の局所的発現が、(GFP対照(7B)と比較して)異所性心室拍動を引き起こしたことを示す。これらのデータはまた、TBX18動物(7C)およびGFP対照(7D)からのEKG記録においても表される。
インビボでのモルモットの心臓の心尖部におけるTbx18(7A)の局所的発現が、(GFP対照(7B)と比較して)異所性心室拍動を引き起こしたことを示す。これらのデータはまた、TBX18動物(7C)およびGFP対照(7D)からのEKG記録においても表される。
単一の筋細胞が注入の5日間後に単離されるTbx18−注入成体モルモットの心臓を示す。誘導SANペースメーカー細胞は、Tbx18体細胞リプログラミングによって作成される(下の右パネル)。
Tbx18を形質導入された心室筋細胞およびGFPを形質導入された心室筋細胞(VM)の種々の特徴を示す。図9Aは、Tbx18を形質導入された誘導SAN(iSAN)細胞(GFP−陽性細胞、上段写真)対天然の細胞(下段)を示す。図9Bは、Tbx18−VMおよびGFP−VMと比較したSAN筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−SAに対する免疫染色は、天然のSAN筋細胞のものに類似しているTbx18−VM中の無秩序筋原線維構造を明らかにした。図9Cは、新たに単離された、生SAN筋細胞、Tbx18−VM(GFP発現によって報告される)、およびGFP−VM(上段パネル)、ならびに免疫染色された固定筋細胞(下段パネル)の代表的な明視野画像を示す。図9Dは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ/幅比および全細胞容量の分析を示す。Tbx18−VMは、GFP−VM(Tbx18−VMに対してn=53、ならびにGFB−VMおよび非形質導入VMに対して80、p<0.01)と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のSAN筋細胞(n=24)と類似している。図9Eは、穿孔処理パッチ電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のTbx18−VM(n=5、中央のパネル)から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Tbx18が、天然のSAN筋細胞(左パネル)と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なAPを表すことを示す。同じ記録が、Tbx18−VMおよび天然のSAN筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するGFP−VMを示す。図9Fは、Tbx18−VM(n=5)の活動電位パラメータが、GFP−VM(n=6)よりも天然のSAN筋細胞(n=6)に近かったことを示す。図9Gは、天然のSAN筋細胞、1週間のGFP−VM、およびウイルスなしの対照と比較して、1週間、3週間、および6週間のTbx18−VMの長さ/幅比を示す。
Tbx18を形質導入された心室筋細胞およびGFPを形質導入された心室筋細胞(VM)の種々の特徴を示す。図9Aは、Tbx18を形質導入された誘導SAN(iSAN)細胞(GFP−陽性細胞、上段写真)対天然の細胞(下段)を示す。図9Bは、Tbx18−VMおよびGFP−VMと比較したSAN筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−SAに対する免疫染色は、天然のSAN筋細胞のものに類似しているTbx18−VM中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図9Cは、新たに単離された、生SAN筋細胞、Tbx18−VM(GFP発現によって報告される)、およびGFP−VM(上段パネル)、ならびに免疫染色された固定筋細胞(下段パネル)の代表的な明視野画像を示す。図9Dは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ/幅比および全細胞容量の分析を示す。Tbx18−VMは、GFP−VM(Tbx18−VMに対してn=53、ならびにGFB−VMおよび非形質導入VMに対して80、p<0.01)と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のSAN筋細胞(n=24)と類似している。図9Eは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のTbx18−VM(n=5、中央のパネル)から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Tbx18が、天然のSAN筋細胞(左パネル)と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なAPを表すことを示す。同じ記録が、Tbx18−VMおよび天然のSAN筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するGFP−VMを示す。図9Fは、Tbx18−VM(n=5)の活動電位パラメータが、GFP−VM(n=6)よりも天然のSAN筋細胞(n=6)に近かったことを示す。図9Gは、天然のSAN筋細胞、1週間のGFP−VM、およびウイルスなしの対照と比較して、1週間、3週間、および6週間のTbx18−VMの長さ/幅比を示す。
Tbx18を形質導入された心室筋細胞およびGFPを形質導入された心室筋細胞(VM)の種々の特徴を示す。図9Aは、Tbx18を形質導入された誘導SAN(iSAN)細胞(GFP−陽性細胞、上段写真)対天然の細胞(下段)を示す。図9Bは、Tbx18−VMおよびGFP−VMと比較したSAN筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−SAに対する免疫染色は、天然のSAN筋細胞のものに類似しているTbx18−VM中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図9Cは、新たに単離された、生SAN筋細胞、Tbx18−VM(GFP発現によって報告される)、およびGFP−VM(上段パネル)、ならびに免疫染色された固定筋細胞(下段パネル)の代表的な明視野画像を示す。図9Dは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ/幅比および全細胞容量の分析を示す。Tbx18−VMは、GFP−VM(Tbx18−VMに対してn=53、ならびにGFB−VMおよび非形質導入VMに対して80、p<0.01)と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のSAN筋細胞(n=24)と類似している。図9Eは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のTbx18−VM(n=5、中央のパネル)から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Tbx18が、天然のSAN筋細胞(左パネル)と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なAPを表すことを示す。同じ記録が、Tbx18−VMおよび天然のSAN筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するGFP−VMを示す。図9Fは、Tbx18−VM(n=5)の活動電位パラメータが、GFP−VM(n=6)よりも天然のSAN筋細胞(n=6)に近かったことを示す。図9Gは、天然のSAN筋細胞、1週間のGFP−VM、およびウイルスなしの対照と比較して、1週間、3週間、および6週間のTbx18−VMの長さ/幅比を示す。
Tbx18を形質導入された心室筋細胞およびGFPを形質導入された心室筋細胞(VM)の種々の特徴を示す。図9Aは、Tbx18を形質導入された誘導SAN(iSAN)細胞(GFP−陽性細胞、上段写真)対天然の細胞(下段)を示す。図9Bは、Tbx18−VMおよびGFP−VMと比較したSAN筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−SAに対する免疫染色は、天然のSAN筋細胞のものに類似しているTbx18−VM中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図9Cは、新たに単離された、生SAN筋細胞、Tbx18−VM(GFP発現によって報告される)、およびGFP−VM(上段パネル)、ならびに免疫染色された固定筋細胞(下段パネル)の代表的な明視野画像を示す。図9Dは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ/幅比および全細胞容量の分析を示す。Tbx18−VMは、GFP−VM(Tbx18−VMに対してn=53、ならびにGFB−VMおよび非形質導入VMに対して80、p<0.01)と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のSAN筋細胞(n=24)と類似している。図9Eは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のTbx18−VM(n=5、中央のパネル)から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Tbx18が、天然のSAN筋細胞(左パネル)と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なAPを表すことを示す。同じ記録が、Tbx18−VMおよび天然のSAN筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するGFP−VMを示す。図9Fは、Tbx18−VM(n=5)の活動電位パラメータが、GFP−VM(n=6)よりも天然のSAN筋細胞(n=6)に近かったことを示す。図9Gは、天然のSAN筋細胞、1週間のGFP−VM、およびウイルスなしの対照と比較して、1週間、3週間、および6週間のTbx18−VMの長さ/幅比を示す。
Tbx18を形質導入された心室筋細胞およびGFPを形質導入された心室筋細胞(VM)の種々の特徴を示す。図9Aは、Tbx18を形質導入された誘導SAN(iSAN)細胞(GFP−陽性細胞、上段写真)対天然の細胞(下段)を示す。図9Bは、Tbx18−VMおよびGFP−VMと比較したSAN筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−SAに対する免疫染色は、天然のSAN筋細胞のものに類似しているTbx18−VM中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図9Cは、新たに単離された、生SAN筋細胞、Tbx18−VM(GFP発現によって報告される)、およびGFP−VM(上段パネル)、ならびに免疫染色された固定筋細胞(下段パネル)の代表的な明視野画像を示す。図9Dは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ/幅比および全細胞容量の分析を示す。Tbx18−VMは、GFP−VM(Tbx18−VMに対してn=53、ならびにGFB−VMおよび非形質導入VMに対して80、p<0.01)と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のSAN筋細胞(n=24)と類似している。図9Eは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のTbx18−VM(n=5、中央のパネル)から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Tbx18が、天然のSAN筋細胞(左パネル)と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なAPを表すことを示す。同じ記録が、Tbx18−VMおよび天然のSAN筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するGFP−VMを示す。図9Fは、Tbx18−VM(n=5)の活動電位パラメータが、GFP−VM(n=6)よりも天然のSAN筋細胞(n=6)に近かったことを示す。図9Gは、天然のSAN筋細胞、1週間のGFP−VM、およびウイルスなしの対照と比較して、1週間、3週間、および6週間のTbx18−VMの長さ/幅比を示す。
Tbx18を形質導入された心室筋細胞およびGFPを形質導入された心室筋細胞(VM)の種々の特徴を示す。図9Aは、Tbx18を形質導入された誘導SAN(iSAN)細胞(GFP−陽性細胞、上段写真)対天然の細胞(下段)を示す。図9Bは、Tbx18−VMおよびGFP−VMと比較したSAN筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−SAに対する免疫染色は、天然のSAN筋細胞のものに類似しているTbx18−VM中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図9Cは、新たに単離された、生SAN筋細胞、Tbx18−VM(GFP発現によって報告される)、およびGFP−VM(上段パネル)、ならびに免疫染色された固定筋細胞(下段パネル)の代表的な明視野画像を示す。図9Dは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ/幅比および全細胞容量の分析を示す。Tbx18−VMは、GFP−VM(Tbx18−VMに対してn=53、ならびにGFB−VMおよび非形質導入VMに対して80、p<0.01)と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のSAN筋細胞(n=24)と類似している。図9Eは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のTbx18−VM(n=5、中央のパネル)から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Tbx18が、天然のSAN筋細胞(左パネル)と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なAPを表すことを示す。同じ記録が、Tbx18−VMおよび天然のSAN筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するGFP−VMを示す。図9Fは、Tbx18−VM(n=5)の活動電位パラメータが、GFP−VM(n=6)よりも天然のSAN筋細胞(n=6)に近かったことを示す。図9Gは、天然のSAN筋細胞、1週間のGFP−VM、およびウイルスなしの対照と比較して、1週間、3週間、および6週間のTbx18−VMの長さ/幅比を示す。
Tbx18を形質導入された心室筋細胞およびGFPを形質導入された心室筋細胞(VM)の種々の特徴を示す。図9Aは、Tbx18を形質導入された誘導SAN(iSAN)細胞(GFP−陽性細胞、上段写真)対天然の細胞(下段)を示す。図9Bは、Tbx18−VMおよびGFP−VMと比較したSAN筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−SAに対する免疫染色は、天然のSAN筋細胞のものに類似しているTbx18−VM中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図9Cは、新たに単離された、生SAN筋細胞、Tbx18−VM(GFP発現によって報告される)、およびGFP−VM(上段パネル)、ならびに免疫染色された固定筋細胞(下段パネル)の代表的な明視野画像を示す。図9Dは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ/幅比および全細胞容量の分析を示す。Tbx18−VMは、GFP−VM(Tbx18−VMに対してn=53、ならびにGFB−VMおよび非形質導入VMに対して80、p<0.01)と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のSAN筋細胞(n=24)と類似している。図9Eは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のTbx18−VM(n=5、中央のパネル)から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Tbx18が、天然のSAN筋細胞(左パネル)と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なAPを表すことを示す。同じ記録が、Tbx18−VMおよび天然のSAN筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するGFP−VMを示す。図9Fは、Tbx18−VM(n=5)の活動電位パラメータが、GFP−VM(n=6)よりも天然のSAN筋細胞(n=6)に近かったことを示す。図9Gは、天然のSAN筋細胞、1週間のGFP−VM、およびウイルスなしの対照と比較して、1週間、3週間、および6週間のTbx18−VMの長さ/幅比を示す。
Tbx−18形質導入細胞の幹細胞性に関するデータを示す。図10Aおよび10Bは、それぞれ、Tbx18−NVRM対GFP−NVRM、およびiPS細胞対親の線維芽細胞(Fibs)の散布図を示す。散布図は、対照と比較して、Tbx18−NRVMの幹細胞性に関する転写レベルに対して識別可能な変化がないことを示す。図10Cおよび10Dは、幹細胞の識別、増殖、および分化に関する84個の遺伝子転写物RTPCR配列を示す。
Tbx−18形質導入細胞の幹細胞性に関するデータを示す。図10Aおよび10Bは、それぞれ、Tbx18−NVRM対GFP−NVRM、およびiPS細胞対親の線維芽細胞(Fibs)の散布図を示す。散布図は、対照と比較して、Tbx18−NRVMの幹細胞性に関する転写レベルに対して識別可能な変化がないことを示す。図10Cおよび10Dは、幹細胞の識別、増殖、および分化に関する84個の遺伝子転写物のRT−PCR配列を示す。
Tbx−18形質導入細胞の幹細胞性に関するデータを示す。図10Aおよび10Bは、それぞれ、Tbx18−NVRM対GFP−NVRM、およびiPS細胞対親の線維芽細胞(Fibs)の散布図を示す。散布図は、対照と比較して、Tbx18−NRVMの幹細胞性に関する転写レベルに対して識別可能な変化がないことを示す。図10Cおよび10Dは、幹細胞の識別、増殖、および分化に関する84個の遺伝子転写物のRT−PCR配列を示す。
Tbx−18形質導入細胞の幹細胞性に関するデータを示す。図10Aおよび10Bは、それぞれ、Tbx18−NVRM対GFP−NVRM、およびiPS細胞対親の線維芽細胞(Fibs)の散布図を示す。散布図は、対照と比較して、Tbx18−NRVMの幹細胞性に関する転写レベルに対して識別可能な変化がないことを示す。図10Cおよび10Dは、幹細胞の識別、増殖、および分化に関する84個の遺伝子転写物のRT−PCR配列を示す。
胚様体(EB)の増殖に由来する細胞の概略図を示す。
胚様体(EB)EB増殖の概略図を示す。3日目に、吊るされたEBを懸濁液中で培養した。6日目に、EBを組織培養プレート中に蒔いた。
EBの増殖中の対照マウスの胚性幹細胞(mESC)に対するTbx18(A)およびTbx3(B)の内因性発現を示す。
EBの増殖中の対照マウスの胚性幹細胞(mESC)に対するTbx18(A)およびTbx3(B)の内因性発現を示す。
Shox2を用いた細胞の治療予定を示す。Shox2遺伝子を運搬するベクターを用いた治療は、(この一般手順において)3日目に、次いで、6日目に2回生じる。
形質導入後の異なる時点における内因性Shox2のmRNA発現を示す。
GFPでのみ処置された対照に対するShox2を形質導入された拍動EBのパーセンテージを示す。
拍動EBあたりの拍動のフォーカスの数を示す。
GFPで処置された細胞に対するShox2発現因子で処置された細胞のHCN4のmRNA発現の増加を示す。
図15Aにおける対応する時点のウエスタンブロット分析を示す。
GFP対照(A)と比較してShox2を形質導入されたmESC由来心筋細胞(B)中のトロポニンIとHCN4の同時発現を示す。
6+7日目(形質導入後)のShox2形質導入細胞対GFP対照中のNCX1のmRNA(A)およびタンパク質レベル(B)を示す。
6+7日目(形質導入後)のShox2形質導入細胞対GFP対照中のNCX1のmRNA(A)およびタンパク質レベル(B)を示す。
6+14日目(形質導入後)のShox2形質導入細胞対GFP対照中のNCX1のmRNA(A)およびタンパク質レベル(B)を示す。
6+14日目(形質導入後)のShox2形質導入細胞対GFP対照中のNCX1のmRNA(A)およびタンパク質レベル(B)を示す。
6+14日目(形質導入後)のShox2形質導入細胞対GFP対照中のCx45のmRNA(A)およびタンパク質レベル(B)を示す。
6+14日目(形質導入後)のShox2形質導入細胞対GFP対照中のCx45のmRNA(A)およびタンパク質レベル(B)を示す。
6+14日目(形質導入後)のShox2形質導入細胞対GFP対照中のCx43のmRNA(A)およびタンパク質レベル(B)を示す。
6+14日目(形質導入後)のShox2形質導入細胞対GFP対照中のCx43のmRNA(A)およびタンパク質レベル(B)を示す。
Shox2形質導入細胞対GFP対照中のCx43のmRNA倍率変化を示す。
Shox2形質導入細胞対GFP対照中のCx45のmRNA倍率変化を示す。
Shox2を形質導入されたmESC由来心筋細胞におけるHCN4およびCx45発現を示す。
内因性マウスShox2のmRNAが、外因性Shox2を用いたESC由来心筋細胞の形質導入に関して上方制御されることを示す。
内因性ヒトShox2のmRNAが、外因性Shox2を用いたESC由来心筋細胞の形質導入に関して上方制御されることを示す。
ヒドロキシメチルビラシンターゼ(HMBS)に対するTbx18のmRNAレベルを示す。
HMBSに対するTbx3のmRNAレベルを示す。
自律神経制御(autonomic regulation)に応答する新規の自動能を示す。図25Aは、6ウェル多電極アレイMEA、左パネル)の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるNRVMの代表的な画像を示す。図25Bは、対照におけるものと比較してTbx18−NRVMにおける著しく速いベースライン変時性を示すMEAから記録された平均発火頻度を示す。Tbx18−NRVMの発火頻度は、1μMのイソプロテレノール(ISO)を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の1μMのアセチルコリン(ACh)を用いたコリン作動薬負荷は、Tbx18−NRVMの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、GFP−NRVMの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図25Cは、Tbx18−NRVMを蒔いた6ウェルMEAの電極からの代表的な未加工記録を示す。図25Dは、β−アドレナリン受容体およびM2ムスカリン受容体の強い発現を示すTbx18−NRVM(GFP+細胞)上の免疫染色を示す。図25Eおよび25Fは、インビボで心尖部にTbx18を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後7日間、心臓は、AV接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた(cryoablated)。異所性拍動図25E、左パネル)の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの(図25E、右パネル)と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓(7/10)は、心尖部における電極ペースの拍動のもの(図25F、右パネル)と極性および形態が反対である狭いQRSの接合部性補充調律(図25F、左パネル)を示した。図25Gは、灌流液(通常のタイロード液)をβ−アドレナリン刺激のための1μMのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための1μMのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるTbx18−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
自律神経制御(autonomic regulation)に応答する新規の自動能を示す。図25Aは、6ウェル多電極アレイ(MEA、左パネル)の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるNRVMの代表的な画像を示す。図25Bは、対照におけるものと比較してTbx18−NRVMにおける著しく速いベースラインの変時性を示すMEAから記録された平均発火頻度を示す。Tbx18−NRVMの発火頻度は、1μMのイソプロテレノール(ISO)を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の1μMのアセチルコリン(ACh)を用いたコリン作動薬負荷は、Tbx18−NRVMの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、GFP−NRVMの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図25Cは、Tbx18−NRVMを蒔いた6ウェルMEAの電極からの代表的な未加工記録を示す。図25Dは、β−アドレナリン受容体およびM2ムスカリン受容体の強い発現を示すTbx18−NRVM(GFP+細胞)上の免疫染色を示す。図25Eおよび25Fは、インビボで心尖部にTbx18を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後7日間、心臓は、AV接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた(cryoablated)。異所性拍動(図25E、左パネル)の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの(図25E、右パネル)と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓(7/10)は、心尖部における電極ペースの拍動のもの(図25F、右パネル)と極性および形態が反対である狭いQRSの接合部性補充調律(図25F、左パネル)を示した。図25Gは、灌流液(通常のタイロード液)をβ−アドレナリン刺激のための1μMのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための1μMのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるTbx18−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
自律神経制御(autonomic regulation)に応答する新規の自動能を示す。図25Aは、6ウェル多電極アレイ(MEA、左パネル)の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるNRVMの代表的な画像を示す。図25Bは、対照におけるものと比較してTbx18−NRVMにおける著しく速いベースラインの変時性を示すMEAから記録された平均発火頻度を示す。Tbx18−NRVMの発火頻度は、1μMのイソプロテレノール(ISO)を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の1μMのアセチルコリン(ACh)を用いたコリン作動薬負荷は、Tbx18−NRVMの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、GFP−NRVMの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図25Cは、Tbx18−NRVMを蒔いた6ウェルMEAの電極からの代表的な未加工記録を示す。図25Dは、β−アドレナリン受容体およびM2ムスカリン受容体の強い発現を示すTbx18−NRVM(GFP+細胞)上の免疫染色を示す。図25Eおよび25Fは、インビボで心尖部にTbx18を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後7日間、心臓は、AV接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた(cryoablated)。異所性拍動(図25E、左パネル)の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの(図25E、右パネル)と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓(7/10)は、心尖部における電極ペースの拍動のもの(図25F、右パネル)と極性および形態が反対である狭いQRSの接合部性補充調律(図25F、左パネル)を示した。図25Gは、灌流液(通常のタイロード液)をβ−アドレナリン刺激のための1μMのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための1μMのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるTbx18−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
自律神経制御(autonomic regulation)に応答する新規の自動能を示す。図25Aは、6ウェル多電極アレイ(MEA、左パネル)の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるNRVMの代表的な画像を示す。図25Bは、対照におけるものと比較してTbx18−NRVMにおける著しく速いベースラインの変時性を示すMEAから記録された平均発火頻度を示す。Tbx18−NRVMの発火頻度は、1μMのイソプロテレノール(ISO)を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の1μMのアセチルコリン(ACh)を用いたコリン作動薬負荷は、Tbx18−NRVMの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、GFP−NRVMの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図25Cは、Tbx18−NRVMを蒔いた6ウェルMEAの電極からの代表的な未加工記録を示す。図25Dは、β−アドレナリン受容体およびM2ムスカリン受容体の強い発現を示すTbx18−NRVM(GFP+細胞)上の免疫染色を示す。図25Eおよび25Fは、インビボで心尖部にTbx18を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後7日間、心臓は、AV接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた(cryoablated)。異所性拍動(図25E、左パネル)の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの(図25E、右パネル)と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓(7/10)は、心尖部における電極ペースの拍動のもの(図25F、右パネル)と極性および形態が反対である狭いQRSの接合部性補充調律(図25F、左パネル)を示した。図25Gは、灌流液(通常のタイロード液)をβ−アドレナリン刺激のための1μMのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための1μMのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるTbx18−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
自律神経制御(autonomic regulation)に応答する新規の自動能を示す。図25Aは、6ウェル多電極アレイ(MEA、左パネル)の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるNRVMの代表的な画像を示す。図25Bは、対照におけるものと比較してTbx18−NRVMにおける著しく速いベースラインの変時性を示すMEAから記録された平均発火頻度を示す。Tbx18−NRVMの発火頻度は、1μMのイソプロテレノール(ISO)を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の1μMのアセチルコリン(ACh)を用いたコリン作動薬負荷は、Tbx18−NRVMの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、GFP−NRVMの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図25Cは、Tbx18−NRVMを蒔いた6ウェルMEAの電極からの代表的な未加工記録を示す。図25Dは、β−アドレナリン受容体およびM2ムスカリン受容体の強い発現を示すTbx18−NRVM(GFP+細胞)上の免疫染色を示す。図25Eおよび25Fは、インビボで心尖部にTbx18を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後7日間、心臓は、AV接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた(cryoablated)。異所性拍動(図25E、左パネル)の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの(図25E、右パネル)と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓(7/10)は、心尖部における電極ペースの拍動のもの(図25F、右パネル)と極性および形態が反対である狭いQRSの接合部性補充調律(図25F、左パネル)を示した。図25Gは、灌流液(通常のタイロード液)をβ−アドレナリン刺激のための1μMのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための1μMのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるTbx18−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
自律神経制御(autonomic regulation)に応答する新規の自動能を示す。図25Aは、6ウェル多電極アレイ(MEA、左パネル)の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるNRVMの代表的な画像を示す。図25Bは、対照におけるものと比較してTbx18−NRVMにおける著しく速いベースラインの変時性を示すMEAから記録された平均発火頻度を示す。Tbx18−NRVMの発火頻度は、1μMのイソプロテレノール(ISO)を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の1μMのアセチルコリン(ACh)を用いたコリン作動薬負荷は、Tbx18−NRVMの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、GFP−NRVMの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図25Cは、Tbx18−NRVMを蒔いた6ウェルMEAの電極からの代表的な未加工記録を示す。図25Dは、β−アドレナリン受容体およびM2ムスカリン受容体の強い発現を示すTbx18−NRVM(GFP+細胞)上の免疫染色を示す。図25Eおよび25Fは、インビボで心尖部にTbx18を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後7日間、心臓は、AV接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた(cryoablated)。異所性拍動(図25E、左パネル)の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの(図25E、右パネル)と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓(7/10)は、心尖部における電極ペースの拍動のもの(図25F、右パネル)と極性および形態が反対である狭いQRSの接合部性補充調律(図25F、左パネル)を示した。図25Gは、灌流液(通常のタイロード液)をβ−アドレナリン刺激のための1μMのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための1μMのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるTbx18−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
自律神経制御(autonomic regulation)に応答する新規の自動能を示す。図25Aは、6ウェル多電極アレイ(MEA、左パネル)の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるNRVMの代表的な画像を示す。図25Bは、対照におけるものと比較してTbx18−NRVMにおける著しく速いベースラインの変時性を示すMEAから記録された平均発火頻度を示す。Tbx18−NRVMの発火頻度は、1μMのイソプロテレノール(ISO)を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の1μMのアセチルコリン(ACh)を用いたコリン作動薬負荷は、Tbx18−NRVMの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、GFP−NRVMの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図25Cは、Tbx18−NRVMを蒔いた6ウェルMEAの電極からの代表的な未加工記録を示す。図25Dは、β−アドレナリン受容体およびM2ムスカリン受容体の強い発現を示すTbx18−NRVM(GFP+細胞)上の免疫染色を示す。図25Eおよび25Fは、インビボで心尖部にTbx18を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後7日間、心臓は、AV接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた(cryoablated)。異所性拍動(図25E、左パネル)の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの(図25E、右パネル)と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓(7/10)は、心尖部における電極ペースの拍動のもの(図25F、右パネル)と極性および形態が反対である狭いQRSの接合部性補充調律(図25F、左パネル)を示した。図25Gは、灌流液(通常のタイロード液)をβ−アドレナリン刺激のための1μMのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための1μMのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるTbx18−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
長期のTbx18−VMの単細胞、定量RT−PCRの結果を示す。データは、Tbx18発現が衰退した後であっても、持続性自動能を示す。図26Aは、RT−qPCRによって単細胞転写検出の感受性を検証するために、インビボでの遺伝子導入後3日間アッセイされたTbx18−形質導入心室筋細胞を示す。データは、Tbx18転写レベルが、超低(GAPDHの2.6%、細胞1)から超高(GAPDHの168%、細胞8)までの広い範囲にわたって正確に検出されたことを示す。図26Bは、インビボでの遺伝子導入後6〜8週間のモルモットから新たに単離されたVMの結果であるRT−qPCRを示し、自発的な拍動細胞中のTbx18の転写レベルが、小さい(細胞1および2)または取るに足らない(細胞3および4)もののいずれかであったことを示す。強いGFPシグナルを有するTbx18−Vm(細胞5)は、Tbx18のより大きい相対量を示した。図26Cは、陰性対照を示す(GFPを単独で発現するVMが、Tbx18に対してアッセイされた)。
長期のTbx18−VMの単細胞、定量RT−PCRの結果を示す。データは、Tbx18発現が衰退した後であっても、持続性自動能を示す。図26Aは、RT−qPCRによって単細胞転写検出の感受性を検証するために、インビボでの遺伝子導入後3日間アッセイされたTbx18−形質導入心室筋細胞を示す。データは、Tbx18転写レベルが、超低(GAPDHの2.6%、細胞1)から超高(GAPDHの168%、細胞8)までの広い範囲にわたって正確に検出されたことを示す。図26Bは、インビボでの遺伝子導入後6〜8週間のモルモットから新たに単離されたVMの結果であるRT−qPCRを示し、自発的な拍動細胞中のTbx18の転写レベルが、小さい(細胞1および2)または取るに足らない(細胞3および4)もののいずれかであったことを示す。強いGFPシグナルを有するTbx18−Vm(細胞5)は、Tbx18のより大きい相対量を示した。図26Cは、陰性対照を示す(GFPを単独で発現するVMが、Tbx18に対してアッセイされた)。
長期のTbx18−VMの単細胞、定量RT−PCRの結果を示す。データは、Tbx18発現が衰退した後であっても、持続性自動能を示す。図26Aは、RT−qPCRによって単細胞転写検出の感受性を検証するために、インビボでの遺伝子導入後3日間アッセイされたTbx18−形質導入心室筋細胞を示す。データは、Tbx18転写レベルが、超低(GAPDHの2.6%、細胞1)から超高(GAPDHの168%、細胞8)までの広い範囲にわたって正確に検出されたことを示す。図26Bは、インビボでの遺伝子導入後6〜8週間のモルモットから新たに単離されたVMの結果であるRT−qPCRを示し、自発的な拍動細胞中のTbx18の転写レベルが、小さい(細胞1および2)または取るに足らない(細胞3および4)もののいずれかであったことを示す。強いGFPシグナルを有するTbx18−Vm(細胞5)は、Tbx18のより大きい相対量を示した。図26Cは、陰性対照を示す(GFPを単独で発現するVMが、Tbx18に対してアッセイされた)。
注入領域において強く、局所的なTbx18形質導入を示すTbx18−注入モルモット心臓からの組織学切片を示す。
注入領域において強く、局所的なTbx18形質導入を示すTbx18−注入モルモット心臓からの組織学的切片を示す。
エクスビボでの無処置の全心臓ECG記録におけるリードの配置を示す。心臓は、36℃で酸素化したタイロード液を用いて、60mmHgの大動脈を介して逆行性灌流された。灌流された心臓は、温かいタイロード液が充填された、シルガード(sylgard)で被覆されたプレートに配置された。ECGリードは、リードIおよびIIを記録するために適切な部位に配置された。
エクスビボでの無処置の全心臓ECG記録におけるリードの配置を示す。心臓は、36℃で酸素化したタイロード液を用いて、60mmHgの大動脈を介して逆行性灌流された。灌流された心臓は、温かいタイロード液が充填された、シルガード(sylgard)で被覆されたプレートに配置された。ECGリードは、リードIおよびIIを記録するために適切な部位に配置された。
遺伝子導入3〜4週間後のTbx18−注入心臓の心電図を示す。図29Aは、165±14bpm(n=3/3)での異所性の固有心室調律を示す。図29Bは、Tbx18注入部位からの生物学的ペーシングと一致する心電図を示す。図29Cは、短期のTbx18−注入心臓(図25G)に類似した手法における自律神経制御に応答した心臓を示す。
遺伝子導入3〜4週間後のTbx18−注入心臓の心電図を示す。図29Aは、165±14bpm(n=3/3)での異所性の固有心室調律を示す。図29Bは、Tbx18注入部位からの生物学的ペーシングと一致する心電図を示す。図29Cは、短期のTbx18−注入心臓(図25G)に類似した手法における自律神経制御に応答した心臓を示す。
遺伝子導入3〜4週間後のTbx18−注入心臓の心電図を示す。図29Aは、165±14bpm(n=3/3)での異所性の固有心室調律を示す。図29Bは、Tbx18注入部位からの生物学的ペーシングと一致する心電図を示す。図29Cは、短期のTbx18−注入心臓(図25G)に類似した手法における自律神経制御に応答した心臓を示す。
個々の筋細胞におけるTbx18のmRNAレベルを検査するためのリアルタイムPCRの結果を示す。3つのプライマーセットのそれぞれに対する標準曲線は、入力DNAテンプレート段階希釈を用いて構築され、匹敵する増幅効率が検証された(曲線勾配:−3.32〜−3.64)。ヒトTbx18、モルモットGAPDH、およびモルモットTnnT2の関連mRNAレベルは、各プライマーセットに対する標準曲線の勾配を用いたCt値外挿によって得られた。各細胞中のTbx18のmRNA量を、次いで、GAPDHまたはTnnT2レベルに正規化した。
個々の筋細胞におけるTbx18のmRNAレベルを検査するためのリアルタイムPCRの結果を示す。3つのプライマーセットのそれぞれに対する標準曲線は、入力DNAテンプレートの段階希釈を用いて構築され、匹敵する増幅効率が検証された(曲線勾配:−3.32〜−3.64)。ヒトTbx18、モルモットGAPDH、およびモルモットTnnT2の関連mRNAレベルは、各プライマーセットに対する標準曲線の勾配を用いたCt値の外挿によって得られた。各細胞中のTbx18のmRNA量を、次いで、GAPDHまたはTnnT2レベルに正規化した。

0053

背景技術
興奮性組織の異常
心不整脈は、心臓内における異常な電気活動が来たされる、一連の不均一な状態の1つである。不整脈の結果として、心拍数が、速すぎる、遅すぎることがあり、および/または規則的もしくは不規則であり得る。心臓の正常な電気活動は、心臓の右心房、より具体的には、洞結節(洞房結節、SA結節、および/またはSANとも称される)から起こる電気インパルスから生じる。このインパルスは、両心房の収縮を誘導する。インパルスは、次いで、房室(またはAV)結節を通して、ならびにヒス束およびプルキンエ線維を介する両心室を通して、通過する。その結果が、心筋の同調収縮、およびしたがって、血流である。正常な成人の心拍数は、1分間に60〜80拍動の範囲であるが、小児における安静時心拍数は、典型的にずっと速い。

0054

徐脈(60bpm未満の心拍数)は、可能性がある複数の病因、すなわち、洞結節(洞性徐脈)からの緩徐なシグナル、洞結節の正常活動の休止(洞停止)、または心房から心室への電気インパルスの妨害(AVブロック)を有する。頻脈(100bpmを超える安静時心拍数)は、単なる動悸(対象が彼らの心拍動の異常を認識するようになる)を引き起こすことがあり、単純に、例えば、運動または身体的ストレスの間の洞結節の交感神経系刺激(洞性頻脈として知られる)の結果であり得る。洞性頻脈ではない頻脈は、正常な心周期に加えて、異常なインパルスに起因し得る。異常なインパルスは、自動能、リエントリー、または撃発活動の3つの機構のうちの1つによって始まり得る。

0055

ある特定の心臓組織は、それら自ら電気インパルスを開始することができ、それは自動能として知られている。通常、そのような自動細胞は、心臓の伝導系(SA結節、AV結節、ヒス束、およびプルキンエ線維)内に位置する。洞房結節は、残りの心臓よりも高い自動能(より速いペースメーカー)を有する心房内の単一の特殊化された位置であり、したがって、通常、心拍数の設定および各心拍の開始に関与する。

0056

リエントリー性不整脈は、電気インパルスが、心房から心室に伝播するよりもむしろ、心臓の小さな領域を通して反回性循環するときに生じる。例えば、損傷した、または疾患の心臓組織によって、伝導が心臓の一部の範囲において異常に遅い場合、インパルス伝播時間は変化し、ある特定のインパルスは、完全に新しいインパルスとして潜在的に処理され得る。そのようなばらばらのインパルス伝播は、持続した異常な回路調律(circuit rhythm)を生成することがあり、それは、心房粗動、ほとんどの発作性上室性頻脈、および危険な心室頻脈の原因となる。

0057

心臓の全体の腔が、複数のリエントリー回路を有する場合、腔は、滑らかに収縮し、血液を送達するというよりもむしろ、細動および無秩序な電気刺激によって震えていると考えられる。滑らかで持続した血液の欠如および無秩序な収縮は、心原性ショック、効果的な血液循環の休止、および突発性の心臓死をもたらし得る。細動は、心房(心房細動)または心室(心室細動)に影響することがあり、心室細動は、切迫した命に関わるものである。
興奮性組織の異常のための従来の治療

0058

従来の不整脈治療には、薬物治療、電子ペースメーカー、植え込み型心臓除細動器ICD)、アブレーション、およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらの従来の治療が、種々の種類の心不整脈の治療に従来から使用されてきたが、これらの手法は、いくつかの欠点を有する。植え込みペースメーカーおよびICDは、装置の植え込み、機能不全、または機器感染から合併症を生じ得る。薬物治療は、一部の患者において許容し難い場合があり、治療中、さらなる不整脈を誘導する可能性を有する。このため、心臓の収縮力および/またはコンダクタンスを調節する薬物治療および植え込み型装置の代わりとなる、または補足する必要性が存在する。

0059

本明細書に開示されるものとは異なる生物学的ペースメーカーを生成する種々の手法が存在し、いくつかのかかる方法は、イオンチャネルまたはイオンチャネルのサブユニットの心臓細胞への送達を用いる。特に、ドミナントネガティブなイオンチャネル(またはそれらのサブユニット)が、研究されてきた。概して、心臓細胞中のドミナントネガティブなイオンチャネルの発現の結果として、細胞膜を横切るイオン電流が変化し、それによって、これらの細胞中でペースメーカーのような発火をもたらす。このような方法は、概して、ある特定のイオンの伝導に対する細胞の能力を変化させることによって処置細胞の機能を効果的に操作する遺伝子の送達を利用する。言い換えると、そのような手法は、典型的に、既存の細胞を採り、その機能を変化するために、その既存の構造(例えば、イオンチャネル)を増強するか、または変化させる。

0060

対照的に、本発明のいくつかの実施形態は、生物学的ペースメーカー細胞になるようにリプログラムされる静止細胞をもたらす。本発明のいくつかの実施形態は、静止細胞のリプログラミングが、細胞構造中に自然に存在しない遺伝子配列を用いて細胞を治療するよりもむしろ、細胞をそれらの自然状態に変換するため、特に有利である。例えば、いくつかの実施形態は、(例えば、イオンチャネルを用いるのではなく)転写因子を用いた静止細胞のリプログラミングが、リプログラムされる細胞中に誘導される異常の危険性を低減するため、有利である。一部の実施形態において、転写因子は、嵩張らず(例えば、より小さい遺伝子配列が使用され得る)、それは、ロジスティックな合併症を低減し、さらなる送達の選択肢をもたらす。本発明の一部の実施形態は、細胞を自然の(または天然の)ペースメーカー状態に変換するため、特に有益であり、その細胞は、適切なペースメーカー調律の生成および維持において成功する可能性が高く、他の手法によって生じ得る副作用(例えば、治療自体による不整脈の誘発)の低減された可能性を有する。さらに、本発明のいくつかの実施形態は、細胞を自然のペースメーカー状態へ変換することが、自然に定義され、そのため、平衡された頻度で細胞が作動することを可能にするため、それらが、所望の効果の「微調整」の必要性(例えば、特定の結果を達成するために増加された用量または数の治療を必要とする)を低減するという点において、有益である。結果として、本方法のいくつかの実施形態は、心臓内に新たなペースメーカーを生成するための十分な数の細胞の変換を達成するために、組成物のより少ない投与(または用量)を必要とする。このため、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、患者に対して低侵襲性であってもよく、より少ない投与手順を必要とし、それによって患者に対するより少ない危険性を示し、治療自体による罹患(病的状態)を低下させる。

0061

さらに、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態は、それらが、既存の心臓細胞の複雑な機能単位(例えば、イオンチャネル)の(「非天然の」配列による)修正を必要とせず、それどころか、細胞のペースメーカー状態への変換が、機能的内因性ペースメーカーチャネルの完全な補体の生成をもたらすという点において有利である。既存のチャネルの修正への低減された必要性は、有害な結果を生じる可能性を低減する(例えば、チャネルの誤形成、または予測されたよりも大きいもしくは小さい機能への衝撃を生成するチャネルの形成)。

0062

加えて、いくつかの実施形態は、細胞が外因的に操作される単流を有するよりもむしろ、本明細書の方法によってペースメーカーに変換される細胞が、完全に機能的に均衡したイオン電流(およびしたがって電気活動)の補体を有するため、細胞中の不均衡な電気活動による望ましくない副作用の危険性を有利に低減する。

0063

本明細書に開示されるように、(発生の完了後、発現が低減される)ペースメーカー細胞の早期の自然発生に関与する転写因子の送達は、非ペースメーカー細胞をペースメーカー細胞に予想外にリプログラムすることができる。これらの手法は、心臓細胞の一般的な見解は、それらが最終的に分化する(例えば、一旦収縮性細胞になると、常に収縮性細胞)というものであるため、予想外である。しかしながら、本方法のいくつかの実施形態は、それらのイオンチャネルの直接的外因性変化を伴わずに、これらの細胞のリプログラミングを可能にする。このため、非ペースメーカー細胞の機能単位(イオンチャネル)を操作するよりもむしろ、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態は、細胞の機能的運命(functional fate)および機能同一性をペースメーカー細胞に変化させる。したがって、本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、そのような従来の薬物治療、アブレーション、または人工ペースメーカーの必要性を減らす、または除去するリプログラムされる生物学的ペースメーカーの生成をもたらす。
生物学的ペースメーカーを生成するための転写因子

0064

転写因子に基づく生物学的ペースメーカーの使用は、従来の不整脈治療の必要性を低減するか、および/または除去する。いくつかの実施形態では、生物学的ペースメーカーの生成を使用して、徐脈または他の不整脈に対する従来の治療を補う。いくつかの実施形態では、生物学的ペースメーカーの生成は、従来の治療への依存を低減する(例えば、患者はそこから引き離される)。いくつかの実施形態において、心不整脈は、対象が治療されていない、または非生物学的治療(例えば、医薬品または電子ペースメーカー治療)を用いて治療される場合には不可能である正常なまたは実質的に正常な調律で心臓を動作させる生物学的ペースメーカーの生成によって治療される。いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、ブリッジ治療(例えば、移植を必要とするのに十分な心臓の損傷を有する患者のためのもの)として使用される。

0065

いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、細胞への転写因子の伝達によって(伝達は、例えば、本明細書に開示される転写因子のうちの1つ以上をコードするポリヌクレオチドを送達するために使用される遺伝子送達技術の使用を通して生じ得る)、静止心臓細胞のペースメーカー細胞への変換を誘導することを含む。本明細書で使用される場合、用語「静止心臓細胞」は、その通常の意味を与えるものとし、また、発火頻度を示さない、ほとんど示さない、もしくは不適当な発火頻度である心臓細胞および/または自発的に活性しない心臓細胞を指すものとする。静止心臓細胞の識別は、一部の実施形態において、標的とされる細胞型に左右されることが理解されるべきである。例えば、心室および/または心房心筋は、通常、ペースメーカー細胞によって生成される電気信号に応答し、このため、典型的に、正常なペースメーカー細胞と比較して低い自発的発火頻度を有する。このため、発火頻度がほとんどない心室および/または心房心筋静止細胞を標的とする場合、一部の実施形態において、正常なペースメーカー細胞と比較して、約20%未満、約15%未満、もしくは約10%未満の自発的な発火を有する細胞を含む。あるいは、本明細書に開示されるある特定の実施形態は、心臓の伝導系の機能不全領域(または複数の領域)を標的とする。例えば、いくつかの実施形態では、例えば、洞不全症候群において、洞房結節の機能不全領域が標的である。さらなる実施形態では、例えば、AVブロックを有する患者において、房室(AV)結節が標的とされる。なおさらなる実施形態において、心臓の二次伝導経路(例えば、ヒスプルキンエ系および/またはヒス束)が、標的とされる。通常、自発的で反復的な電気活動を示すそのような組織において、静止細胞は、心臓のその領域における正常な細胞と比較して減少された頻度で発火するものであり、減少された頻度は、適切な心臓の発火頻度および/または心拍出量を維持するのに不十分である。このため、静止細胞は、一部の実施形態において、心臓の電気活動の動作に関与する場合、心血管系にわたって適切な血流を維持するのに不十分な電気的発火のレベルそれを行う細胞(例えば、血行力学的に持続不可能な頻度で発火する細胞)として認識される。

0066

いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、インビボでの心臓組織への転写因子の送達によって生じ、静止心筋細胞、内因性心臓幹細胞、またはそれらの組み合わせのペースメーカー細胞への変換をもたらす。いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、インビトロでの転写因子の送達によって実施され、培養された体細胞、心筋細胞、幹細胞(胚性、誘導多能性、多能性、複能性、単能性、および/または成体幹細胞を含む)、またはそれらの組み合わせのペースメーカー細胞への変換をもたらす。いくつかの実施形態において、これらの生成されるペースメーカー細胞は、その後、心臓調律の異常を治療するためにインビボで植え込まれ得る。

0067

いくつかの実施形態において、体細胞、心筋細胞、および/または幹細胞のペースメーカー細胞への変換は、胚の洞房結節(SAN)発生の制御因子である転写因子を使用して実現される。胚のSAN発生の制御因子である潜在的転写因子には、Tbx18、Shox2、Tbx3、および/またはTbx5が挙げられるが、これらに限定されない。Tbx18は、頭部範囲の胚のSAN発生に必要とされる転写因子であるが、以下でより詳細に考察されるように、典型的に、出生によって検出不能となり、成人期において検出不能なままである(図1)。Shox2は、静脈洞におけるNkx2.5の負の制御因子である。このタンパク質は、組織分化にとって極めて重要である。さらに、Shox2欠乏性マウスおよびゼブラフィッシュ胚は、徐脈を呈する。Tbx3は、欠乏性または異所性の発現のいずれかから生じる発生エラーを有するSAN特殊分化の強力な制御因子である。ホルト・オーラム症候群においてその投薬量と異常な心臓形態形成の逆相関を示すTbx5は、Shox2およびTbx3の正の制御因子である。

0068

上述のように、生物学的ペースメーカー生成のいくつかの実施形態は、インビボ治療に基づく。いくつかの実施形態において、Shox2、Tbx18、またはそれらの組み合わせは、非ペースメーカー体細胞、心筋細胞、内因性幹細胞、またはその3つの組み合わせにおいて異所性のペースメーカー活動を誘導するように、インビボで送達される。いくつかの実施形態において、SANを制御する転写因子(または心臓の発生に関係するが、SAN制御に特異的ではない転写因子)の他の組み合わせが、Shox2およびTbx18もしくは個々のShox2およびTbx18を伴ってまたは伴わずに、インビボで細胞をペースメーカー細胞に変換するために使用されてもよい。それらの他の転写因子には、Tbx3およびTbx5が挙げられるが、これらに限定されない。Tbx3、Tbx5、Tbx18、Shox2、およびそれらの変異体の配列は、それぞれ、添付物A、B、C、およびDに示される。

0069

いくつかの実施形態において、Tbx18、Shox2、またはTbx−18およびShox2の組み合わせは、インビトロで心筋細胞または幹細胞に送達され、それは、以下で考察されるように、培養されるペースメーカー細胞を産生する。これらの細胞は、その後、生物学的ペースメーカー生成のための細胞治療として患者に投与され得る。いくつかの実施形態において、投与は、対象の心臓への細胞の直接投与を含む(例えば、注入)。本明細書に開示される他の投与経路が使用される。例えば、一部の実施形態において、カテーテルベースの投与が用いられる。さらなる実施形態において、生成されるペースメーカー細胞は、心臓内の標的部位で細胞保持を補助する、基質移植片、または他の生体材料の中に取り込まれる。インビトロで生物学的ペースメーカーの生成に使用される細胞は、一部の実施形態において、それらが移植される患者の健常な組織から収集される(例えば、誘導ペースメーカー細胞の自家移植片)。次いで、これらの細胞は、インビトロで転写因子によってペースメーカー細胞に変換されることができ、不整脈の治療のために同じ患者に再挿入され得る。他の実施形態において、誘導ペースメーカー細胞の同種移植片が実施される(例えば、細胞は、第1の対象から収集され、インビトロで培養され、本明細書に開示される転写因子のうちの1つ以上と接触させ、次いで、第2の対象に移植される)。いくつかの実施形態において、インビトロで細胞をペースメーカー細胞に変換するために、他のSAN制御転写因子またはそのような転写因子の組み合わせが使用される(例えば、Tbx18、Shox2、および/またはTbx−18+Shox2に加えて、またはその代わりの転写因子)。それらの他の転写因子には、Tbx3およびTbx5が挙げられるが、これらに限定されない。

0070

本明細書に開示される方法を用いて治療され得る興奮性組織の異常を有する患者には、哺乳動物、および特にヒトが挙げられる。患者には、本明細書に開示される心臓状態、または心臓活動、伝導率、調律等に影響することが当分野で知られている他の状態のうちの1つ以上を患っているか、または診断されるものが挙げられる。
遺伝子送達ベクター

0071

リプログラミング心筋細胞は、本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、外因性遺伝物質を体細胞、心筋細胞、幹細胞、またはそれらの組み合わせに送達する手段として遺伝子送達を使用して、達成される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが、核酸送達系において投与される。いくつかの実施形態において、核酸送達系は、ポリヌクレオチドに結び付けられる非ウイルスベクターを含む。そのような非ウイルスベクターの例には、ポリヌクレオチド単独(例えば、裸のDNA)または好適なタンパク質、ポリサッカライド、もしくは脂質製剤と組み合わせたポリヌクレオチドが挙げられる。

0072

いくつかの実施形態において、核酸送達系は、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)、ヘルパー依存型アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはセンダイウイルスリポソームHVJ複合体が挙げられるが、これらに限定されない1つ以上のウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスおよび/またはAAVの種々の血清型がまた使用される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、真核生物プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターが使用される。組織特異的プロモーターを含む他のプロモーターが、当分野に置いて確立しており、ある特定の実施形態において、使用され得る。さらなるベクターには、モロニーマウス白血病ウイルスおよびHIVベースのウイルス等のレトロウイルスベクターが挙げられる。1つの実施形態において、HIVベースのウイルスベクターは、少なくとも2つのベクターを含み、gagおよびpol遺伝子はHIVゲノム由来であり、env遺伝子は別のウイルス由来である。一部の実施形態において、オルソポックスもしくはトリポックスベクター等のポックスベクター、単純ヘルペスIウイルス(HSV)ベクター等のヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない、DNAウイルスベクターが使用される。

0073

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド(例えば、1つ以上の転写因子をコードするもの)が、細胞(幹細胞、心筋細胞、および/または体細胞)をペースメーカー細胞に変換するために、インビボおよび/またはインビトロで投与される。一部の実施形態において、転写因子の機能的断片をコードするポリヌクレオチドが、全転写因子に加えて、またはその代わりに送達される。本明細書で使用される場合、用語「断片」、「機能的断片」、または類似の用語は、それらの通常の意味を与えるものとし、対応する完全長アミノ酸配列(またはその配列をコードするポリヌクレオチド)の機能の少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、または99%を有するアミノ酸配列(またはその配列をコードするポリヌクレオチド)の一部を指すものとする。そのような断片の機能性を検出および定量化する方法は、当分野において確立されている。
送達方法

0074

いくつかの実施形態において、心臓の電気活動を調節するための本明細書に開示される組成物(転写因子または細胞である)の投与は、(例えば、電子ペースメーカーの植え込みまたは外植中の)直接的な心臓注入を介するものである。一部の実施形態において、全身注入が使用される。一部の実施形態において、冠内注入が使用される。なおさらなる実施形態において、カテーテル指向性(catheter−directed)投与が使用される。一部の実施形態において、組成物を局所的に投与するために、マップ誘導カテーテルシステム(例えば、NOGA(登録商標))が使用される。一部の実施形態において、他のマッピングまたは誘導技術が使用される。例えば、いくつかの実施形態において、蛍光透視ベースの誘導が使用される。一部の実施形態において、エレクトロアナトミカル(Electroanatomical)誘導がまた使用される。一部の実施形態において、心臓内電位図による、特異的構造のマッピング(ヒス束、束の右または左部分、プルキンエ線維等が挙げられるが、これらに限定されない)がまた使用される。さらに、一部の実施形態において、カテーテル、針、または他の送達装置(複数可)の所望の標的位置への送達を誘導するために、X線または磁気カテーテルがまた使用される。

0075

いくつかの実施形態において、局所的送達手法は、活性生物学的ペースメーカーを生成する時間を有利に減少させる。一部の実施形態において、本明細書に開示されるいくつかの構成物の組織特異的(または細胞型特異的)送達は、その構成物が内因性組織の発現プロファイルに基づく生物学的ペースメーカーの生成の促進に特に適しているという点において有利である。一部のそのような実施形態において、転写因子の組み合わせが同じ標的部位に送達される一方、他の実施形態において、個々の構成が別個の標的部位に送達され、全体の効果は、生物学的ペースメーカーの生成をもたらす。

0076

いくつかの実施形態において、形質導入は、心尖部への局所的注入によって達成される。いくつかの実施形態において、形質導入は、左心室の心尖部への局所的注入によって達成される。いくつかの実施形態において、脳卒中または他の塞栓症の危険性を低減するために、右側(例えば、心房、または心室のいずれかの心臓の右側)のアプローチが使用される。しかしながら、いくつかの実施形態において、左側のアプローチが使用される。いくつかの実施形態において、上部からヒス束またはAV結節にアクセスするために、注入カテーテルは、(右心室ではなく)右心房を介して導入される。いくつかの実施形態において、動脈アクセスを必要とすることなく注入カテーテルを左心房または左心室に導入するために、経中隔カテーテル法が使用され、それによって、脳卒中の危険性を低減する。なおさらなる実施形態において、注入カテーテルの導入は、本明細書に開示されるような生物学的製剤を心室の種々の標的に注入するためのバルサルバ洞を介した心静脈を経由したものである。そのようなアプローチは、心臓再同期治療においてペースメーカーリードの配置のために使用されるものと類似している。

0077

このため、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、1つ以上の転写因子(または事前に転写因子と接触させた細胞)を、右心房、右心室、SA結節、AV結節、ヒス束、ならびに/または束の左脚および右脚のいずれかに送達するために使用され得る。さらに、いくつかの実施形態において、冠静脈洞およびその静脈枝のカニューレ挿入を通して、複数の左心室部位への送達が達成される。有利に、好ましくない冠静脈解剖所見を有する患者において、いくつかの実施形態において、動脈アクセスを必要とすることなく左側の構造に直接アクセスすることを可能にする経中隔穿刺を通して右側から、左側へのアクセスが達成される。

0078

いくつかの実施形態において、追加の方法が使用され、心臓組織の毛細血管透過性を増加するための化合物の投与を含む。好適な血管透過性薬剤遺伝子導入ベクター投与前に、その間に、またはその後に投与される)は、約500マイクロモル濃度未満のカルシウムを有する溶液物質Pヒスタミン、アセチルコリン、アデノシンヌクレオチドアラキドン酸ブラジキニン、エンドセリン、エンドトキシンインターロイキン2、ニトログリセリン一酸化窒素ニトロプルシドロイコトリエン酸素ラジカルホスホリパーゼ血小板活性化因子プロタミンセロトニン腫瘍壊死因子血管内皮増殖因子毒液血管作用性アミン、または一酸化窒素合成阻害剤、セロトニン、血管内皮増殖因子(VEGF)もしくは機能性VEGF断片を含む。
組織上の生物学的ペースメーカーの効果

0079

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される転写因子(またはインビトロでそれらの転写因子と接触させた細胞)の投与は、そのような信号に先に応答したが、それらを生成しなかった細胞中で、自発的で反復的な電気信号を誘導するか、またはさもなければ、それを生成させる。例えば、発火頻度をほとんど示さなかった、または示さなかった処置された心筋細胞(例えば、約40%〜約30%、約30%〜約20%、約20%〜約10%、または約10%〜約0%、またはそれらの範囲に重複する自動能の指標)に関して、投与前の細胞と比較して、投与後、発火頻度または電気信号出力の増加した回数を示す(例えば、約5%〜約15%、約15%〜約25%、約25%〜約35%、約35%〜約45%、約45%〜約55%、約55%〜約65%、約65%〜約75%、約75%〜約85%、約85%〜約95%、約95%〜約100%以上の自動能の指標)。

0080

本明細書に開示される方法によって、結果として得られる心臓収縮の変化および/または変換されるペースメーカー細胞の電気的特性は、いくつかの実施形態において、心臓調律を調節する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物は、臨床的に所望の心拍数の約25%以内、約20%以内、約15%以内、約10%以内、約5%以内、約2%以内、または約1%以内の心拍数を実現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、心臓に関係する失神(例えば、ストークスアダムス失神)、持続性洞性徐脈等の洞結節機能の異常、S−Aウェケバッハを呈する洞房(S−A)ブロック、完全なS−Aブロックもしくは洞停止、および高度房室ブロック、または徐脈頻脈症候群もしくは他の徐脈関連状態等の疾病または疾患を患っているか、またはそれらの影響を受けやすい対象を治療する。いくつかの実施形態において、植え込みペースメーカーの機能を上昇するか、または鈍化するための調節が使用される(例えば、植え込みペースメーカーが、それ自体で提供することができない所望の心拍数を達成するために)。
転写因子の投与の結果としての細胞の変化

0081

いくつかの実施形態において、Tbx18、Shox2、またはそれらの組み合わせの投与は、上記で考察された自発的で反復的な電気信号の生成に加えて、またはそれとは別に、接触した細胞にいくつかの生理学的変化を生じる。一部の実施形態において、これらの生理学的変化は、最初にインビトロで見られたとしても、インビボでも検出可能であり、それらは、生物学的ペースメーカー生成の有効性の追加のマーカーとして機能し得る(例えば、それらがペースメーカー細胞の特徴または特質として認識される)。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、対照と比較して、自発的に拍動する単層培養の増加したパーセンテージをもたらす。いくつかの実施形態において、自発的な拍動の存在または量は、移植する前に機能性に関して培養を選別するために、またはインビトロのペースメーカー細胞の生成におけるそれらの有用性のための転写因子の他の組み合わせを評価するために、使用される。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、投与される心筋細胞の自発的な細胞内Ca2+変動をもたらす。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、段階的第4相脱分極をもたらす。一部の実施形態において、本明細書に開示される1つ以上の転写因子の送達は、細胞内のHCN4の発現を増加または減少する。カルシウムフラックスが、心臓の電気的シグナル伝達の主要成分であり、HCN4発現が、ペースメーカー細胞機能において重要であるため、これらのエンドポイントの変化は、一部の実施形態において、誘導される生物学的ペースメーカー細胞において、よりSANのような挙動に対応する。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、筋細胞膜下の自発的な局所的Ca2+放出現象の調節をもたらす。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、細胞内cAMPレベルの調節をもたらす。このため、上記の種類の転写因子のうちの1つ以上の投与の結果として、心臓の電気活動が調節され、興奮性心臓組織の異常が治療され得る。

0082

いくつかの実施形態において、Tbx18、Shox2、またはそれらの組み合わせの投与は、自発的で反復的な電気信号の生成に加えて、またはそれとは別に、接触した細胞の新たな表現型の細胞をもたらす。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、形質導入細胞において、無秩序な著しく低い筋節α−アクチン発現をもたらし、それはペースメーカー細胞を示している。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、細胞の大きさの変化をもたらす。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、クロマチン状態の変化をもたらす。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、クロマチン修正をもたらし、以下の遺伝子、Cx43、Kir2.1、Actc2、およびHCN4のうちの1つ以上のより低いもしくはより高い発現または活性を生じる。これらの表現型の変化は、自然のSAN細胞のものに酷似しており、これらの転写因子のうちの1つ以上の投与の結果として、いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカー細胞の生成を評価するための追加の手法として使用され得る。

0083

いくつかの実施形態において、1つ以上の転写因子の心臓への投与は、標的化されるペースメーカー活性の生成をもたらす遺伝子注入の部位から高頻度の異所性心室拍動をもたらす。一部の実施形態において、1つ以上の転写因子の投与は、細胞および新規のペースメーカー活性において遺伝子関連の後成的変化をもたらす。このペースメーカー活性は、一部の実施形態において、体細胞のリプログラミングの結果であり、前駆体状態への脱分化によるものではない。体細胞から体細胞への分化転換は、形質導入細胞からの腫瘍脅威を低下させる(例えば、奇形腫形成を低減させる)。他の実施形態において、しかしながら、1つ以上の転写因子の投与は、前駆体状態への脱分化をもたらし得る。ある特定のそのような実施形態において、ペースメーカー細胞への分化は、本明細書に開示される転写因子のうちの1つ以上を使用して誘導される。そのような方法を使用して、生物学的ペースメーカー細胞は、多種多様な細胞から、安全に、効率的に作られることができる。

0084

以下に提供される実施例は、本発明の実施形態の非限定的なものとして意図される。
方法:
NRVMの異種形質導入

0085

C末端myc/FLAGタグを有するヒトTbx18遺伝子をFseIおよびSalIによる消化によってpCMV6−Tbx18(Origene,Rockville,MD)から切除した。Tbx18遺伝子を、次いで、所望のレポーター遺伝子であるpLVX−IRES−ZsGreenl(Clontech,Mountain View,CA)を用いて、NotIおよびXhoI消化レンチウイルス発現ベクターサブクローン化し、これにより、pLV−Tbx18−IRES−ZsGreen1(約10.1kb)ベクターを生成した。ZsGreenlを、通常使用されるGFPとの、その類似のスペクトル特徴のため、Tbx18−形質導入心筋細胞に対してレポータータンパク質として使用した。このため、本開示全体を通して、用語ZsGreenlおよびGFPは、同様の意味で用いられる。組換え標的遺伝子を、次いで、ゲートウェイ適応ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用するゲートウェイ組換えクローン化によってアデノウイルスベクター主鎖に導入した。所望のアデノウイルス発現構成物、pAd−CMV−TBX18−IRES−GFP(約39.8kb)を生成するために、LR組換え反応エントリークローン目的ベクター(destination vector)pAd/CMV/V5−DEST(約36.7kb)との間で実施した。陽性の構成物をDNA配列決定によって正確な標的遺伝子を有するように検証した(Laragen,Los Angeles,CA)。
電気生理学

0086

全細胞電気生理の記録を以下に記載されるように実施した。Axopatch 200B増幅器(Axon instruments)により、20kHzのサンプリングレートおよび5kHzでの低域ベッセルフィルターで、標準的な微小電極ホールセルパッチクランプ技術を用いて実験を行った。実験はすべて室温で実施した。NaCl 138、KCl 5、CaCl2 2、グルコース10、MgCl2 0.5、およびHEPES10(mmol/L)を含有する、pH 7.4の通常のタイロード液で細胞を洗浄した。マイクロピペット電極溶液は、K−グルタミン酸130、KCl 9、NaCl 8、MgCl2 0.5、HEPES 10、EGTA 2、およびMg−ATP5(mmol/L);pH 7.2で構成された。内部記録溶液で満たした場合、微小電極は2〜4MΩの先端抵抗を有した。2.5秒のエピソード間の間隔で、電位クランプ実験を実施した。活動電位は、GFP−NRVM上で短い脱分極電流パルス(2〜3ms、500〜800pA)によって開始されるか、またはTbx18−NRVM上でI=0モードで記録されるかのいずれかであった。測定された液体接合部電位(−mV)に関するデータを収集した。キセノンアークランプを用いて、488/530nm(励起/放出)でGFP蛍光を見た。
アデノウイルスの構成および精製

0087

293A細胞に遺伝子導入する前に逆方向末端反復露出するために、上記で考察される発現構成をPacIで消化し、その後の導入遺伝子発現の発現に使用するためのアデノウイルスのストックを産生した。アデノウイルスをプラーク精製し、増幅し、アデノピュア(Adenopure)キット(Puresyn,Inc)を使用してアフィニティーカラム精製し、−80℃で保管した。
筋細胞の単離および形質導入

0088

生後1〜2日の子ラットからNRVMを単離し、確立した培養方法を使用して単層として培養した。房室結節細胞の汚染を最小化するために、心臓の下3分の1のみ(心尖部から正中)を切除した。一部の実施形態において、内因性ペースメーカー細胞を選択的に除去する、下部3分の1、中央3分の1、およびこれらの部分の組み合わせを含む心臓の他の部分、または全心臓(もしくはそれらの部分)を使用する、一部の実施形態において、非ペースメーカー組織)を得るために、生検(例えば、誘導生検)を使用する。細胞単離の1日後、Ad−Tbx18−IRES−GFPまたはAd−GFPのいずれかでNRVMの単層を形質導入し(対照ベクター;moi=1〜10)、2〜5日間培養された。非特異的な胚性転写因子関連効果を制御するために、心臓腔の分化に極めて重要であると知られているTbx20を用いた。

SA筋細胞の単離

0089

成体Sprague−Dawley系ラットからSA結節筋細胞を単離した。動物は、イソフルラン麻酔かけられた。心臓を素早く除去し、心室から心房を分離し、140
NaCl、5.4 KCl、1.2 KH2PO4、5HEPES、5.55グルコース、1 MgCl2、1.8 CaCl2(mM)(pHはNaOHで7.4に調整される)から成るタイロード液中で洞房結節領域を解剖した。分界稜心房中隔、ならびに上および下大静脈の境界でラットの洞房結節領域を画定した。
胚性幹細胞の形質導入

0090

マウスの胚性幹細胞にShox2または対照遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを遺伝子導入した。確立された胚様体法を使用して分化した。統合データは、すべての報告された差異において、n≧3およびp<0.05である。
細胞内カルシウム記録および分析

0091

細胞内Ca2+変動の測定において、2x106NRVMを35mmのガラス培養皿(MatTek Cultureware)または22mmのフィブロネクチンをコートしたカバーガラスに蒔き、形質導入し、形質導入後4日間分析した。細胞に18分間Rhod2−AM(2μmol/L)(Molecular Probes)をロードし、次いで1度洗浄し、その後、2mmol/Lのカルシウムを含む通常のタイロード液中に配置した。Ad−Tbx18IS−IRES−GFPおよびAd−GFP形質導入NRVMからカルシウムトランジェントを37℃で記録した。倒立共焦点レーザー走査顕微鏡(Perkin Elmer/Nikon)またはLeica SP5共焦点顕微鏡上で画像を得た。Ultraview(Perkin Elmer)およびImageJを使用して、オフライン分析を実施した。個々の細胞の信号を平均することによって単一のNRVMを通した共焦点ライン走査画像から、全細胞Ca2+トランジェントを得た。Ca2+トランジェントは、バックグラウンド除去され、正規化された蛍光(F/F0)として示される。2−D共焦点Ca2+イメージングに関して、全体の細胞を通る信号を平均することによって、カルシウムトランジェントを得た。
免疫染色

0092

アデノウイルス形質導入後4日の、新生ラットの洞房結節およびNRVMの凍結切片を4%のパラホルムアルデヒドで固定し、0.1%のトリトンX100で透過処理し、次いで、適切な一次抗体:筋節α−アクチニン(Sigma−Aldrich;A5044;1:800)、ANP(AbCam;ab−14348;1:1000)、HCN4(Abcam;ab85023;1:500)、およびAlexa Fluor−結合型二次抗体(Invitrogen)でインキュベートした。
免疫ブロット

0093

Cx43(Sigma−Aldrich,C6219;1:1000)、PLN(Alomone;A010−14:1:5000)、p−PLB(Alomone;A010−12:1:5000)、HCN4(AbCam;ab85023;1:500)に対して特異的な抗体を使用して、ウエスタンブロットを実施した。簡潔に、Ad−Tbx18、Ad−GFP形質導入NRVM、ラットのSAN、および左心室を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)を含有するRIP A緩衝液中でホモジナイズした。BCAアッセイによってタンパク質含有量数量化し、細胞ライセートレーンあたり15μg)を12%のSDS−PAGEゲル上に流し、PVDF膜上に移した。次いで、移された膜を4℃で一晩、一次抗体でインキュベートし、ペルオキシダーゼ結合型二次抗体での1時間のインキュベーションが続く。化学発光ECLウエスタンブロッティング分析システム、Amersham)によって免疫活性を検出した。モノクローナル抗GAPDH抗体(Abeam;ab9482;1:10000)または抗βアクチン(Sigma−Aldrich;A3848:1:25000)で膜を再検出することによって、ゲルの同等のタンパク質負荷を評価した。
インビボ遺伝子導入

0094

モルモットの左心室心尖部にアデノウイルスを注入した。成体雌性モルモット(体重 250〜300g;Charles River)に4%のイソフルランで麻酔をかけ、挿管し、1.5%〜2%のイソフルランを供給する気化器を伴う人工呼吸器の上に置いた。外側開胸後、30ゲージの針を左心室の自由壁心尖部に挿入した。1x109プラーク形成単位のAd−Tbx18−IRES−GFPまたはAd−GFP(対照群)を含有する100μlのアデノウイルスを左心室心尖部に注入した。上記で考察されるように、一部の実施形態において、他の送達経路が使用される。
インビボおよびエクスビボ心電計(ECG)

0095

全身麻酔(2%のイソフルラン、98%のO2)下でのECG記録の前に動物の洞調律を緩徐にするために、頸静脈を介してメタコリン生理食塩水中の体重1kgあたり0.1〜0.5mg、Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を送達した。2kHzで2リードのデジタルECGシステム(リードIおよびリード3、BIOPAC
Systems,Goleta,CA)を使用してECGを記録し、Acqknowlege3.7.3ソフトウェア(BIOPAC Systems,Goleta,CA)を使用してアイントホーフェン三角形によってリード2をオフラインで算出した。すべての動物において、完全な心臓ブロックが達成されるまでメタコリンを投与した。心臓ブロックは、100bpm未満の動物の洞調律の減少を伴った。Tbx18注入モルモットのほとんどにおいて、洞調律が100bpmに達する前に、異所性の心室調律が明らかになった(図3D、右パネル)。対照的に、対照動物は、洞調律が100bpm未満に導かれる場合であっても、そのような異所性の心室拍動の証拠がないことを示した(図3D、左パネル)。図3Dは、Tbx18注入動物と比較してとても遅い補充速度(escape rate)であっても、対照動物中の任意の異所性の心室調律の欠如を強調する。

0096

エクスビボでの無処置の全心臓ECG記録のため、36℃で酸素化したタイロード液を用いて60mmHgの大動脈を介して心臓を逆行性灌流した。灌流された心臓を、温かいタイロード液が充填された、シルガードで被覆されたプレートに配置した。リードIおよびIIを記録するために適切な部位にECGリードを配置した(図28)。20分間の平衡化時間の後、液体N2が充填されたcryogun(Brymill Cryogenic Systems,Ellington,CT)で房室結節の領域を切断した。隔離されたパルス刺激装置(Model 2100,A−M Systems,Carlsborg,WA)に接続された白金電極を用いて、導入遺伝子注入の部位(前側の左心室心尖部)で、200ms間隔で電極ペーシングを実施した。
遺伝子配列のRT−PCR

0097

ラットの洞房結節、左心室、ならびにTbx18およびGFP形質導入NRVM(形質導入後4日)を収集し、mRNAを抽出した(Qiagen mRNA単離キット)。RT2第1ストランドキット(SA Biosciences)を使用して、mRNAサンプルを第1ストランドcDNAに変換した。次いで、cDNAテンプレートをRT2 qPCRマスターミックスと混合し、その混合物を事前に分配される遺伝子特異的プライマーセットを含む、同じプレートの各ウェルに分注した。7900HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems/Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)上でPCRを実施し、遺伝子の相対的発現を算出した。
cAMPアッセイ

0098

CyclicAMPElisaアッセイキットカタログ番号STA−501;Cell Biolabs,INC)を使用して、Ad−Tbx18またはAd−GFPを形質導入されたNRVMにおけるcAMPレベルを判定した。簡潔に、ヤギ抗ウサギ抗体被覆プレート(Goat Anti−Rabbit Antibody Coated Plate)の96ウェルプレートに、50μlのTbx18およびGFP−NRVM細胞ライセートを添加した。25μlの希釈されたペルオキシダーゼcAMPトレーサー複合体を各被験ウェルに添加した。次いで、各被験ウェルに50μlの希釈されたウサギ抗cAMPポリクローナル抗体を添加し、振盪しながら室温で30分間プレートをインキュベートした。洗浄後、各ウェルに100μlの化学発光試薬を添加した。オービタルシェーカー上での室温で5分間のインキュベーション後、各マイクロウェル発光に対してプレートをプレートルミノメーター上で読み取った。光放出(RLU)の測定は、サンプル中のcAMPの量の算出を可能にし、それは次いで、サンプルの比較のためにβ−アクチンに正規化された。
溶液

0099

NaCl 140、KCl 5.4、CaCl2 1.5、MgCl2 1.5、グルコース10、およびHepes 5(mm);(pHはNaOHで7.38に調整される)を含有するタイロード液。リアノジンおよびタンパク質キナーゼI(PKI)をTocris biosciencesから購入し、カフェインをSigmaから購入した。Rhod−2/AMをInvitrogenから購入した。
クロマチン免疫沈降

0100

室温で8分間、10%のホルムアルデヒドを用いたウイルスベクター形質導入の後2〜4日に、Tbx18またはGFPのいずれかを形質導入されたNRVMを固定した。各20秒間の10回のパルスで、各パルス間に上で30秒静止するソニケーターを使用して、細胞を剪断した。製造業者手順書に従って、ChIP−IT(登録商標)Expressクロマチン免疫沈降キット(Active Motif,Carlsbad,CA)を使用してクロマチン免疫沈降を実施した。H3K4me3およびH3K27me3の一次抗体をActive Motifから購入した。
クロマチン免疫沈降後のqPCR

0101

既にラット中でqPCRを検証された遺伝子特異型(Cx43、Kir2.1、α−SA、HCN4)プライマーをSA Biosciencesから購入した。各遺伝子に関して、転写開始部位の−2kb(上流)、−lkb、および+lkb(下流)に対応する3セットのプライマーを用いた。3つのタイルからのΔCt値をデータ分析のために各実験から平均化した。
単細胞の定量的リアルタイムPCR

0102

広開口のパッチピペットを用いてPBS中で単一の筋細胞を収集し、ドライアイス上に配置し、次いで、−80℃で保管した。製造業者の取扱説明書に従って、Ambion(登録商標)Single Cell−to−CT(商標)キット(Life Technologies)を用いて、定量的リアルタイムPCRによって個々の筋細胞中のTbx18のmRNAレベルを検査した。簡潔に、室温で5分間、単細胞を細胞溶解液およびDNaseIで処置した。SupersScriptRTおよびVILO RTの混合物の添加後、25℃で10分間、42℃で60分間、および85℃で5分間逆転写を実施した。PreAmp混合物ならびにヒトTbx18(アッセイID:Hs01385457_m1)、モルモットGAPDH(アッセイID:Cp03755742_g1)、およびモルモットTnnT2(アッセイID:Cp04182357_g1)のプライマーを含有する0.2xTaqMan遺伝子発現アッセイの添加により、前置増幅を95℃で15秒間および60℃で4分間の14サイクル実施した。Applied Biosystems(Carlsbad,CA)によって、カスタムプライマーを合成した。Applied Biosystemsの7900HT高速リアルタイムPCRシステムを使用して、TaqMan遺伝子発現アッセイを用いたリアルタイムPCRに前置増幅生成物(1:20希釈)を使用した。3つのプライマーセットのそれぞれに対する標準曲線は、入力DNAテンプレートの段階希釈を用いて構築され(図30)、匹敵する増幅効率が検証された(曲線勾配:−3.32〜−3.64)。Tbx18、GAPDH、およびTnnT2の関連mRNAレベルは、各プライマーセットに対する標準曲線の勾配を用いたCt値の外挿によって得られた。各細胞中のTbx18のmRNA発現を、次いで、GAPDHまたはTnnT2レベルに正規化した。
統計分析

0103

平均値標準偏差、および平均値の標準誤差(SEM)に関してデータを分析した。この作業における定量的な数値は、平均値±SEMを表す。独立t検定を使用して、データセット統計学的に評価した。別途示されない限り、p<0.05は、有意であると見なされた。
実施例1−NVRMへの遺伝子送達によって作成されたペースメーカー細胞

0104

上記で考察されるように、興奮性組織の異常によって引き起こされる心不整脈の現在の治療法は、主として薬物療法、高周波アブレーション、植え込み型装置、および他のそのような関連する手法を用いる。これらの方法は、不整脈の一部の形態の治療に有用であるが、制限を有する(上記で考察されるように)。生物学的ペースメーカーは、従来のペースメーカーの使用に優る利点を提供し、従来のペースメーカーの代わりに、または組み合わせて使用することができる。現在の研究は、生物学的ペースメーカーの生成のための薬剤を誘導する転写因子の使用を評価した。

0105

転写因子の心臓細胞への形質導入が生物学的ペースメーカーを生成することを示すために、バイシストニックアデノウイルスベクターにおいて選択された転写因子の特異な異種の形質導入を新たに単離されるNRVMにおいて実施した。最初のスクリーンとして、形質導入36〜48時間後の自発的に拍動する培養の数を分析した。Tbx18遺伝子導入したNRVM(Tbx18−NRVM)は、対照および選別される他の転写因子と比較して、自発的に拍動する単層培養の増加したパーセンテージを示した(群あたり最低5つの異なる細胞単離、図2A)。培養の2日間を超えて、TbxによるCx43(しかしCx45またはCx40ではない)の下方制御から予想されるように、複数の自発的に拍動するフォーカスが、個々のTbx−NRVM単層内で観察された。したがって、心室の心筋細胞をペースメーカー細胞に変換するための候補としてTbxを選択した。このため、いくつかの実施形態において、Tbx18を使用して、生物学的ペースメーカーを作る。しかしながら、いくつかの実施形態において、現在の実験において選別されるもののうちの1つ以上を含む他の転写因子が使用される。いくつかの実施形態において、2つ以上の転写因子の組み合わせが使用される。いくつかの実施形態において、これらの結果を達成するために、Tbx18と組み合わせてShox2が使用される。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Tbx18、Shox2、Tbx3、およびTbx5のうちの1つ以上が、使用するために選択される。

0106

単層として培養される場合、NRVMは自発的なシンシチウム収縮(syncytial contraction)を示すが、そのような現象は、比較的少ない数の自律的に拍動する細胞によって動かされる。図2Bは、代表的な活動電位(AP)記録を示す。所与の細胞が、隣接する細胞と物理的に接触する可能性がないように、約4NRVM/mm2の密度で低密度に蒔かれるとき、刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火する対照(GFP)心室筋細胞の大多数は、静止状態であった(9個中7個)(図2B,左)。Tbx18発現は、電気的な表現型をSAN細胞のものに形質転換した。ほとんどのTbx18−NRVM(9個中7個)は、自律的および自発的に拍動する(図2B、右)。いくつかの実施形態において、Shox2が、Tbx18の代わりに、またはそれと併せて使用され得ることが理解されよう。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Tbx18、Shox2、Tbx3、およびTbx5のうちの1つ以上が、使用するために選択される。Tbx18−NRVMは、顕著な段階的第4相脱分極を有する自発的なAPを示した。段階的第4相脱分極は、SANペースメーカー細胞中の自動能の根底にあり、Tbx−NRVM(図2B)において顕著である。この自律的拍動の増加および段階的脱分極は、これらの細胞が自然の洞房結節細胞と一致する方法で機能することを示し、これはTbx18(単独または他の転写因子と組み合わせて)がペースメーカー細胞を生成することを示唆する。一部の実施形態において、同様の機能が幹細胞において検出され、それによって、その細胞が、生物学的ペースメーカーの生成および不整脈の治療において有用であることを示す。

0107

GFP−NRVM(n=5、図2C、左)における−73±6mVの静止膜電位(RMP)と比べて、Tbx18−NRVMにおける−47±10mV(n=6)の最大拡張期電位(MDP)が脱分極された。これは、Tbx−18形質導入細胞が、ペースメーカー細胞がそうであると予期されるように、対照細胞よりもより頻繁に発火することを示唆する。GFPおよびTbx18群は、提示されるデータ全体を通して、それぞれ白および斜交平行模様のバーによって示される。本明細書で使用される場合、用語「自動能の指標」は、その通常の意味を与えるものとし、また、対照(l3±4%bpm、図2C、中央)と比較してTbx−NRVM(70±16%bpm)においてはるかに大きかった、それらの細胞における活動電位(AP)変動の頻度を乗じる自律的に拍動する細胞のパーセンテージとして定義されるものとする。図2Cの中央に示されるように、自動能は、GFP対照に比べて約60%増加した。一部の実施形態において、自動能の指標における増加は、正常なペースメーカー細胞の自動能と比較して、5%〜約15%、約15%〜約25%、約25%〜約35%、約35%〜約45%、約45%〜約55%、約55%〜約65%、約65%〜約75%、約75%〜約85%、約85%〜約95%、約95%〜約100%、およびそれらの重複する範囲である。自発的なCa2+変動を有する細胞の数もまた、対照と比べて増加した(図2C、右)。自発的な細胞内Ca2+変動を示すTbx18−NRVMの数は、対照に比べて約6倍高かった(図2C、右)。Ca2+が、ペースメーカー細胞の活動電位の生成に必須であるため、これらのデータはまた、細胞のTbx18(単独または他の転写因子との組み合わせ)の形質導入が、ペースメーカー細胞の生成に成功裏に使用され得ることを示す。

0108

拡張期電位、自動能、およびCa2+変動の変化は、Tbx18−NRVMにおけるIK1密度の78%減少によって補完された(図2D)。左:−140〜−20mVのランププロトコルによって誘発された代表的なIK1の未加工記録を示す。−140mVで要約されたIK1密度が、2Dの右に示される。いくつかの実施形態において、IK1密度の減少は、約5%〜約15%、約15%〜約25%、約25%〜約35%、約35%〜約45%、約45%〜約55%、約55%〜約65%、約65%〜約75%、約75%〜約85%、約85%〜約95%、約95%〜約100%、およびそれらの重複する範囲である。IK1密度の減少はまた、形質導入細胞が非処置細胞(例えば、非ペースメーカー細胞)と比較してより高い頻度で発火することを示す。この発火の増加は、これらの形質導入細胞が、ペースメーカー細胞として機能することを示す。このため、これらの細胞を生成するために使用される方法、または幹細胞からペースメーカー細胞を生成するために使用される方法が、心不整脈、または妨害される心臓細胞の発火頻度に関連する他の疾患の治療において使用され得る。

0109

HCN4は、SAN中のペースメーカー活性に寄与する過分極活性化電流Ifの分子相関物である。Tbx18の形質導入は、HCN4を発現する細胞の数の3.8倍の増加をもたらした(図2E)。GFPまたはTbx18−NRVMのHCN4免疫染色画像(HCN4−白、核−青)は、それぞれ、左および中央に示される。スケールバー:200μm。右パネル:GFPまたはTbx18−形質導入細胞あたりのパーセントHCN4−陽性細胞の要約。Tbx18発現はまた、Tbx18−NRVMにおけるHCN4タンパク質レベルの1.4倍の増加(図2F)をもたらした。そのような細胞はまた、ウサギのSAN細胞において報告されるものと一致する密度(−140mVで−5.2±1.3pA/pF、n=3)でIf(図2G)を示した。ウエスタンブロットは、成体ラットのSAN(右)において観察されるレベルのHCN4に匹敵する、対照(左)と比較して、Tbx18−NRVMにおいてより高いHCN4タンパク質レベルを示す。Ca2+サイクリング事象は、自動能を生成する筋細胞膜のイオン電流を補完し、それと共役する。電位およびカルシウム依存性機構の選択される成分の転写レベルの比較は、ここで陽性対照として使用される天然のSANと心室心筋との間でそれらを綿密に再現する、Tbx18対GFP−NRVMにおける差異を明らかにした(図2H)。GFP−NRVMに正規化されたTbx18−NRVMと(左)、LVに正規化されたSAN(右)とを比較する、選択される遺伝子の関連mRNAレベルの変化。SANおよびTbx18−NRVMは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。このため、いくつかの実施形態において、Tbx18はまた、生物学的ペースメーカー形成に関連する遺伝子およびタンパク質発現の変化を誘発する。

0110

図2Bは、Tbx18細胞が、(緩徐な脱分極を伴う)天然のSAN細胞のものと同様の方法において、さらに発火する可能性が高かったことを示す。図2Cが、Tbx18細胞が、自動能のより高い指標(中央)およびより自発的なCa2+の全細胞変動(左)をもたらすより低い拡張期電位(中央)を有することを示す。図2Dは、Tbx18細胞の電流密度が、より短い再分極時間、およびこのため、発火のより大きな可能性を有することを示す。これらのデータは共に、一部の実施形態において、Tbx18が、細胞の電気特性を変化させ、それらをSANのようにしたことを示す。これらの結果のそれぞれは、生体心臓に植え込まれるか、またはその中に生成されるとき、これらの細胞が自動的に発火するより高い可能性を示す。このため、いくつかの実施形態において、これらの誘導ペースメーカー細胞は、拍動することができ、心不整脈または異常な心臓調律に関連する他の疾患を治療するために、心臓調律を調節することができる。

0111

限局性の電気生理経路は歩調取りに寄与するが、SAN細胞は、細かく組織化された特徴的な細胞内Ca2+サイクリング事象によって、律動的に発火するように誘起される。筋細胞膜下の、自発的な局所的Ca2+放出現象(LCR)は、洞房結節細胞における自動能の特質である。後期拡張期中、LCRは、Na+−Ca2+交換体電流(INCX)を作動し、それは次いで、第4相脱分極の対数期に寄与する。それらのCa2+サイクリングプロファイル特徴付けるために、Tbx18−NRVM上でLCR測定を実施した。

0112

後期拡張期中、LCRは、Na+−Ca2+交換体電流(INCX)を作動し、それは次いで、第4相脱分極の対数期に寄与する。Tbx18−NRVMの線走査共焦点イメージングが、天然のSANペースメーカー中で観察されるLCRを再現する、各全細胞Ca2+トランジェント(図3A、n=10個の細胞中8個)に先立つLCRを解像した。形質導入後4日で、Rhod2/AMをロードされたTbx18−NRVM(図3A)およびGFP−NRVM(図3B)における[Ca2+]iの変化の代表的な共焦点線走査画像は、Tbx18−NRVM中でのみ全細胞Ca2+トランジェントに先立つLCRを示すが、時折、Ca2+スパークがGFP−NRVM中で検出され得る。LCR期間は、Ca2+トランジェントの開始からその後のLCRの初めまでの間の期間として定義される。サイクル長は、全細胞Ca2+トランジェントの開始からその後のCa2+トランジェントの開始までの間の期間として定義される。LCRは、サイクル長の72±1%の平均期間をもつ周期性を示した(図3C)。このため、Tbx18は、単独でまたは他の転写因子とともに、心筋細胞をペースメーカーのようなCa2+活性を有する細胞に機能的に変換する。

0113

Tbx18−NRVMにおけるLCRは、343±8msの平均期間で生じ、全細胞Ca2+トランジェントサイクル長の72±1%であった(474±7ms、図3D)。一部の実施形態において、LCRは、全細胞Ca2+トランジェントサイクル長の約5%〜約15%、約15%〜約25%、約25%〜約35%、約35%〜約45%、約45%〜約55%、約55%〜約65%、約65%〜約75%、約75%〜約85%、約85%〜約95%、約95%〜約100%であり、およびそれらの重複する範囲で生じる。[Ca2+]iにおける変化の空間平均されたF/F0プロットは、対照と比較してTbx−NRVMにおいてカフェイン(20mM)誘導性Ca2+トランジェントの2.3倍の増加を示した。対照的に、LCRは、対照細胞中(n、12個の細胞中約12個、図3D)では検出されなかったが、時折ランダムに分布したスパークが観察された(例えば、図3B)。筋小胞体(SR)中のより大きいCa2+ストアは、自動能を促進する可能性がある。カフェイン誘発性Ca2+トランジェントの振幅は、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて2.3倍大きかった(図3D)。

0114

ウエスタンブロット実験は、成体ラットのSANに類似している全PLBレベルの減少およびリン酸化PLB(se16)の増加を示した(図3F)。対照と比較してTbx18−NRVMにおいて、SERCA2A、NCXI、およびRyRのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかった(図3G)。Ca2+遊離チャネル遮断薬であるリアノジン(10μM)は、自発的なCa2+トランジェントの比率をTbx−NRVMにおいて47±6%抑制したが、対照においては、わずかl2±2%であった(図3E)。これらの結果は、Tbx18(単独または他の転写因子と組み合わせて)の形質導入が、いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーを生成するために使用され得るか、または一部の実施形態において、生体ペースメーカーとして機能するように、その後植え込まれ得る細胞を生成するために使用され得ることを示す。

0115

ホスホランバン(PLN)は、その非リン酸化状態において、筋小胞体Ca2+−ATPアーゼ2a(SERCA2a)を阻害し、それによって、内部ストアによるCa2+の再取り込みを抑制する。そのような阻害は、タンパク質のリン酸化(P−PLB)に応じて軽減される。関連p−PLB(Ser16)レベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx−NRVMにおいて65倍高く(図3F、左パネル)、心室心筋内のものと比較して、SANにおいて見られるpPLNの増大を模倣した(図3F、右パネル)。一方、ウサギ洞房結節対左心室における所見と一致して、SERCA2a、NCXl、およびリアノジン受容体(RyR)のタンパク質レベルにおける差異は、Thx−とGFP−NRVMとの間において検出されなかった(図3G)。細胞内cAMPレベルは、GFP−NRVMと比較して、Tbx18−NRVMにおいて1.7倍高く(図3H)、当分野で既知の心室心筋と比較して、ウサギのSANにおいて観察されるより高い[cAMP]iを再現した。PKA阻害剤(PKI、15μM)の適用は、Tbx−NRVMにおける自発的な全細胞Ca2+トランジェントの休止をもたらしたが、GFP−NRVM(図3I)上で効果はなかった。このため、NRVMにおけるTbx18発現は、洞房結節ペースメーカー細胞の主要特徴を再現する主要Ca2+サイクリング成分の変化を生成し、それによって、いくつかの実施形態において、細胞のTbx18(実施形態によって、単独または他の転写因子と組み合わせて)の形質導入が、心不整脈を治療するための治療法において使用されることを可能にした。
リプログラムされた細胞の表現型の変化

0116

電気生理学的変化に加えて、細胞のリプログラミングは、ペースメーカー組織における細胞構造の主要特徴を再現する。天然の洞房結節ペースメーカー細胞は、それらの形態において特徴的であり、機能している心筋細胞よりも小さく、秩序のない筋原線維を示す。Tbx18−NRVMが表現型の変化を有するかどうかを試験するために、細胞の形態を研究した。

0117

新生ラットの心臓の切片は、心臓筋節α−アクチニン(α−SA)発現が、隣接する右心房と比較して、洞房結節でより顕著に低く、無秩序であることを示す(RA、図4A、上部左および下部左)。Tbx18−NRVMは、筋原線維の組織崩壊およびa−SAの弱い発現(図4A、下部右)を伴うそれらの形態において、天然の洞房結節細胞に似ていた。HCN4発現(上部中央)によって境界を画定される新生ラットの洞房結節は、より弱く、不定形の筋節α−アクチニン(α−SA)発現(上部パネル)を示す。下段左:上段左内の囲まれた領域の拡大画像。パターンは、Tbx18−NRVMにおいて、GFP−NRVMと比較して、正確に再現される(それぞれ、下部右および中央)。スケールバー:30μm。データは、Tbx18−NRVMにおけるα−SA転写レベルの観察される下方制御によって実証される(図2H)。2つの補完的方法によって測定される細胞の大きさは、対照NRVMにおけるものよりもTbx18−NRVMにおいて28−33%小さく(図4B)、機能している心筋細胞と比較してより小さい大きさのSAN細胞を再現する。このため、Tbx18−NRVMは、構造的形態学)ならびに機能的(電気生理学)リプログラミングの両方を経た。

0118

洞房結節様表現型への変化がTbx18−NRVMにおける洞房結節様クロマチン状態に関連するかどうかを次いで研究した。ヒストン3(H3K27me3)におけるリジン27のトリメチル化は、遺伝子発現抑制のためのポリコーム群タンパク質の動員を促進するヘテロクロマチンマークである。反対に、リジン4(H3K4me3)のトリメチル化は、遺伝子転写的活性をマークする。4つの遺伝子、Cx43、Kir2.1、Actc2、およびHCN4のプロモーター領域中のヒストン修正プロファイルを次いで研究した。Tbx18は、洞房結節頭部範囲の胚発生に必要とされる転写因子である。Shox2は、静脈洞におけるNkx2.5の負の制御因子である(上記で考察されるように)。Tbx3は、欠乏性または異所性の発現のいずれかから生じる発生エラーを有する洞房結節特殊分化の強力な制御因子である。Tbx5は、Shox2およびTbx3の正の制御因子である。これらの遺伝子は、Tbx18−NRVMにおける関連分子および機能的変化を示す。H3K27上のトリメチル化レベルは、対照に正規化されるHCN4プロモーター上のその抑圧的な後成的圧力を解放する一方、Tbx18が、Cx43、Kir2.1、およびa−SAプロモーターの不活性を増加したことを示す。qPCRが続くクロマチン免疫沈降によってこれらの結果を測定した。一方、H3K4me3(図4C右)レベルは、Cx43、Kir2.1、およびa−SAの転写的活性プロモーター領域が、Tbx18発現に応じて減少した一方、活性HCN4プロモーター領域の割合が、Tbx18発現に応じて増加したことを示す。Cx43、Kir2.1、およびActc2は、対照と比較してTbx18−NRVMにおいて後成的に不活性になった(より高いH3K27me3およびより低いH3K4me3)(図4C)。結果として、これらのデータは、Tbx18発現が、Cx43、Kir2.1、およびa−SA発現のうちの1つ以上を低減し得る一方、HCN4が上方制御され得ることを示唆する。HCN4が反復信号に関与するので、これらのデータは生物学的ペースメーカーの形成と一致する。さらに、クロマチンヒストン修正は、トランジェント機能的再操作ではなく、恒久的な後成的リプログラミングと一致する。

0119

図5において、NRVMにおける心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の発現は、血管収縮剤であるエンドセリン−I(100nM)を用いた24時間の刺激によって誘導された。しかしながら、誘導されるANP発現は、Tbx18発現によって抑制されたが(5B、下部パネル)、GFPには効果がなかった(5A、下部パネル)。スケールバー:20μm。これらの表現型の変化のそれぞれは、Tbx18−形質導入細胞が、処置されない心筋細胞よりも洞房結節のように見えることを示す。これは、構造的ならびに生理学的である細胞のリプログラミングを反映し、このため、洞房結節細胞に類似する生物学的ペースメーカー細胞を生成する。

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