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技術 粒子計数装置及び粒子計数方法

出願人 株式会社リコー
発明者 杣田浩紀松本貴彦和泉賢増子龍也高木大輔
出願日 2016年12月19日 (4年10ヶ月経過) 出願番号 2016-245892
公開日 2018年1月18日 (3年9ヶ月経過) 公開番号 2018-009956
状態 特許登録済
技術分野 粒子の特徴の調査
主要キーワード 総輝度値 被付着物 フィードバックユニット 個数判定 粒子計数装置 計数精度 単位パルス 補正対物レンズ
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題

吐出された液滴に含まれる粒子計数精度を向上させることができる粒子計数装置の提供。

解決手段

光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴210を吐出させる液滴吐出手段10と、液滴吐出手段10から吐出された液滴210に光を照射する光照射手段30と、光を照射された粒子からの発光L1、L2をそれぞれ受光する2以上の受光手段41、42と、2以上の受光手段41、42により受光した各発光L1、L2の情報に基づき、液滴210に含まれる粒子を計数する粒子計数手段51とを有する粒子計数装置100である。

概要

背景

近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞インクジェットにより吐出して組織体を形成する技術の開発が行われている。細胞を代表とする粒子状物質を含む液滴を吐出する際に、吐出された液滴中の粒子状の物質の数がどの程度含まれているかを受光することが重要である。

このような機能を備えた装置の一例として、液状体に含まれる粒状体個数を受光する吐出装置を提案されている(例えば、特許文献1参照)。この吐出装置では、吐出装置のキャビティノズルとの間に設けられた検出部を通過する液状体に含まれる粒子の個数を検出することができる。

概要

吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置の提供。光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴210を吐出させる液滴吐出手段10と、液滴吐出手段10から吐出された液滴210に光を照射する光照射手段30と、光を照射された粒子からの発光L1、L2をそれぞれ受光する2以上の受光手段41、42と、2以上の受光手段41、42により受光した各発光L1、L2の情報に基づき、液滴210に含まれる粒子を計数する粒子計数手段51とを有する粒子計数装置100である。

目的

本発明は、吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する2以上の受光手段と、2以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有することを特徴とする粒子計数装置

請求項2

前記受光手段が、受光面の略法線方向に受光した前記発光の輝度値及び前記発光の前記受光面における形状の情報を得て、前記粒子計数手段が、前記発光の輝度値に基づいて前記液滴に含まれる前記粒子を計数する第一の計数処理、及び、前記発光の前記受光面における形状の情報に基づいて前記液滴に含まれる前記粒子を計数する第二の計数処理の少なくともいずれかを行う請求項1に記載の粒子計数装置。

請求項3

前記粒子計数手段が、前記第一の計数処理を行い、前記粒子を計数できないと判定したとき、前記第二の計数処理を行い、前記粒子を計数する請求項2に記載の粒子計数装置。

請求項4

前記粒子計数手段が、前記発光の前記受光面における形状の情報に基づき曲率半径を算出し、所定の範囲内にある前記曲率半径を算出した際の円の中心の個数を前記粒子の個数として計数する前記第二の計数処理を行う請求項2から3のいずれかに記載の粒子計数装置。

請求項5

2以上の前記受光手段のうち少なくとも1の前記受光手段が、その受光方向が他の前記受光手段の受光方向と略直交方向に位置するように配された請求項1から4のいずれかに記載の粒子計数装置。

請求項6

前記受光手段が、その受光方向が前記液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配された請求項1から5のいずれかに記載の粒子計数装置。

請求項7

前記受光手段が、CMOS撮像素子を有するカメラである請求項1から6のいずれかに記載の粒子計数装置。

請求項8

前記粒子計数手段が、前記粒子の数が0個であると判定したとき、前記液滴吐出手段が、前記液滴を更に吐出する請求項1から7のいずれかに記載の粒子計数装置。

請求項9

前記粒子計数手段が、前記粒子の数が所定の数未満であると判定したとき、前記液滴吐出手段が、前記液滴を更に吐出する請求項1から7のいずれかに記載の粒子計数装置。

請求項10

前記粒子計数手段が、前記粒子の数が所定の数であると判定したとき、次工程に移行する請求項1から7のいずれかに記載の粒子計数装置。

請求項11

光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射工程と、前記光を照射された前記粒子からの発光を2以上の受光手段により受光する受光工程と、2以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程と、を含むことを特徴とする粒子計数方法

技術分野

0001

本発明は、吐出させた液滴に含まれる粒子計数する粒子計数装置及び粒子計数方法に関する。

背景技術

0002

近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞インクジェットにより吐出して組織体を形成する技術の開発が行われている。細胞を代表とする粒子状物質を含む液滴を吐出する際に、吐出された液滴中の粒子状の物質の数がどの程度含まれているかを受光することが重要である。

0003

このような機能を備えた装置の一例として、液状体に含まれる粒状体個数を受光する吐出装置を提案されている(例えば、特許文献1参照)。この吐出装置では、吐出装置のキャビティノズルとの間に設けられた検出部を通過する液状体に含まれる粒子の個数を検出することができる。

発明が解決しようとする課題

0004

本発明は、吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0005

上記課題を解決するための手段としての本発明の粒子計数装置は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する2以上の受光手段と、2以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段とを有する。

発明の効果

0006

本発明によると、吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置を提供することができる。

図面の簡単な説明

0007

図1は、本発明の粒子計数装置の一例を示す説明図である。
図2は、図1に示した粒子計数装置における2つの受光手段の位置関係の一例を示す説明図である。
図3は、図2に示した位置関係とした2つの受光手段により得られる発光の画像の説明図である。
図4Aは、2つの発光が重なる場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の一例を示す説明図である。
図4Bは、2つの発光が重なる場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の他の一例を示す説明図である。
図4Cは、2つの発光が重なる場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の他の一例を示す説明図である。
図5Aは、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の一例を示す説明図である。
図5Bは、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の他の一例を示す説明図である。
図6Aは、受光手段により受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の一例を示す画像である。
図6Bは、受光手段により受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の他の一例を示す画像である。
図6Cは、受光手段により受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の他の一例を示す画像である。
図7は、2以上の受光手段により受光された発光の輝度値に基づき粒子の個数を判定する検量線の一例を示すグラフである。
図8は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの一例を示すフローチャートである。
図9は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
図10は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
図11は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
図12は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
図13は、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローの他の一例を示すフローチャートである。
図14は、本発明の粒子計数装置の他の一例を示す説明図である。
図15は、本発明の粒子計数装置の更に他の一例を示す説明図である。
図16は、本発明の粒子計数装置を用いて、被付着物着弾した液滴に含まれる粒子を所定の数にするフローの一例を示すフローチャートである。
図17は、本発明の粒子計数装置を用いて、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を所定の数にするフローの他の一例を示すフローチャートである。

実施例

0008

(粒子計数装置及び粒子計数方法)
本発明の粒子計数装置は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する光照射手段と、光を照射された粒子からの発光を受光する2以上の受光手段と、2以上の受光手段により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する粒子計数手段とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
また、本発明の粒子計数装置における各手段は通信可能に接続されており、粒子計数手段が計数した粒子の数に基づいて液滴吐出手段を制御することが好ましい。更に、本発明の粒子計数装置は、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数した結果に基づいて液滴吐出手段を制御するフィードバックユニットを有することが好ましい。

0009

本発明の粒子計数方法は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、吐出された液滴に光を照射する光照射工程と、光を照射された粒子からの発光を2以上の受光手段により受光する受光工程と、2以上の受光手段により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する粒子計数工程とを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
また、本発明の粒子計数方法は、粒子計数工程で計数した粒子の数に基づいて液滴吐出工程における液滴の吐出を制御する第一のフィードバック工程を含むことが好ましい。更に、本発明の粒子計数方法は、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数した結果に基づいて液滴吐出工程における液滴の吐出を制御する第二のフィードバック工程を含むことが好ましい。

0010

本発明の粒子計数方法は、本発明の粒子計数装置により好適に行うことができる。
以下、本発明の粒子計数装置の説明を通して本発明の粒子計数方法の詳細についても明らかにする。

0011

本発明の粒子計数装置は、特許文献1の吐出装置では、液滴を吐出させる前、すなわち吐出ノズル開口に至る前の液滴に含まれる粒子を計数しているため、実際に吐出させた液滴に含まれる粒子の個数と必ずしも一致せず、粒子の計数精度が低下するという知見に基づくものである。

0012

また、吐出させた液滴に含まれる粒子を計数する場合、本発明の粒子計数装置のように、液滴に光を照射して粒子を発光させ、粒子からの発光に基づき粒子を計数するときには、以下の問題がある。
吐出させた液滴は大気圧などにより球体あるいは楕円体となり、粒子を受光する方向において奥行きをもつため、粒子が重なりやすい。それゆえ、粒子からの発光が重なると粒子が受光しにくくなるという問題がある。また、粒子を受光する方向において奥行きがあることから、受光手段の奥側に存在する粒子からの発光は、液滴を通過する分だけ、屈折散乱などにより発光の輝度値が減衰するため、受光手段に対する液滴の中の位置に起因して発光の輝度値がばらつきやすいという問題がある。更に、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する場合、光を照射して粒子を発光させると、粒子からの発光が液滴の球面内側に反射してぼやけやすいという問題がある。
本発明の粒子計数装置は、吐出させた液滴に含まれる粒子を計数する場合、これらの問題により、発光の輝度値に基づく検量線を明確に引くことが難しく、粒子の個数を判定することが困難になり、粒子の計数精度が低下するという本発明者らが見出した知見に基づくものである。

0013

<液滴吐出手段及び液滴吐出工程>
液滴吐出手段は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる手段である。
液滴吐出工程は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる工程であり、液滴吐出手段により好適に行うことができる。

0014

液滴吐出手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、圧電素子を用いた圧電加圧方式ヒータを用いたサーマル方式静電引力によって液を誘導する静電方式、圧電素子を用いたメンブレン振動方式等のインクジェットヘッドなどが挙げられる。これらの中でも、メンブレン振動方式のインクジェットヘッドが好ましい。
メンブレン振動方式のインクジェットヘッドは、振動による慣性力で液滴を吐出する方式であり、インクジェットヘッドの上部を大気解放することが可能であるため、特に粒子が細胞である場合、細胞に対する熱、電場、圧力などのダメージを低減できる。
メンブレン振動方式のインクジェットヘッドに用いる圧電素子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、チタン酸ジルコン酸鉛PZT)を用いた素子が好ましい。

0015

発光可能な粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光タンパク質発現する細胞、蛍光色素により染色された染色細胞、蛍光色素により染色された無機微粒子、蛍光色素により染色された有機ポリマー粒子などが挙げられる。

0016

蛍光色素により染色された有機ポリマー粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、SPHERO Fluorescent Nile Red particles(ベイバイオサイエンス株式会社製、1%(w/v)、直径10μm〜14μm)などが挙げられる。
蛍光タンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP;Green Fluorescent Protein)、赤色蛍光タンパク質(RFP;Red Fluorescent Protein)、黄色蛍光タンパク質(YFP;Yellow Fluorescent Protein)などが挙げられる。
染色細胞における蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルトラッカーレンジ、セルトラッカーレッドなどが挙げられる。

0017

なお、粒子が凝集する場合、液滴吐出手段に充填する粒子を含む懸濁液の粒子の濃度を調整することにより、懸濁液中の粒子の濃度と、懸濁液中の粒子の個数とがポアソン分布に従う理論から、懸濁液中の粒子の個数を数個以下に調整することができる。
懸濁液の液成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン交換水などが挙げられる。
液滴の直径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、25μm以上150μm以下が好ましい。液滴の直径が25μm以上であれば、液滴の径が小さくなく、内包する粒子の直径が小さいものだけになりにくく、適用できる粒子の種類が少なくなりにくい。150μm以下であれば、液滴としては問題なく、液滴を吐出するためには、インクジェットヘッドの穴径を大きくする必要もなく、液滴の吐出が不安定となりにくい。
また、液滴の直径をRとし、粒子の直径をrとすると、R>3rであることが好ましい。R>3rであると、粒子の直径が液滴の直径に対して大きくないため、液滴の縁の影響を受けにくく、粒子の計数精度が低下しにくい。

0018

<光照射手段及び光照射工程>
光照射手段は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。
光照射工程は、吐出された液滴に光を照射する工程であり、光照射手段により好適に行うことができる。

0019

光照射手段としては、液滴吐出手段による液滴の吐出に同期して光を照射できることが好ましい。これにより、液滴吐出手段から吐出された液滴に、光をより確実に照射することができる。
ここで、同期するとは、前記液滴が吐出されて所定位置に達したときに前記光照射手段が前記光を照射することを意味する。つまり、前記光照射手段は、前記液滴吐出手段による前記液滴の吐出に対して、所定時間だけ遅延して前記光を照射する。

0020

光照射手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固体レーザー半導体レーザー色素レーザーなどが挙げられる。
固体レーザーとしては、例えば、YAGレーザールビーレーザー、ガラスレーザーなどが挙げられる。
YAGレーザーの市販品としては、例えば、Explorer ONE−532−200−KEスペクトラ・フィジックス株式会社製)などが挙げられる。
これらの中でも、パルス発振によりパルス光を照射できることが好ましい。

0021

パルス光のパルス幅としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、10μs以下が好ましく、1μs以下がより好ましい。
単位パルスあたりのエネルギーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、集光の有無等の光学系に大きく依存するが、0.1μJ以上が好ましく、1μJ以上がより好ましい。

0022

<受光手段及び受光工程>
受光手段は、光を照射された粒子からの発光を受光する手段である。
受光工程は、光を照射された粒子からの発光を2以上の受光手段により受光する工程であり、受光手段により好適に行うことができる。

0023

本発明の粒子計数装置は、2以上の受光手段を有する。粒子計数装置が2以上の受光手段を有することにより、1の受光手段により発光が重なった状態を受光した場合であっても、他の受光手段により発光が重なっていない状態を受光できていれば、他の受光手段により受光された発光に基づいて、液滴に含まれる粒子を精度よく計数することができる。

0024

光を照射された粒子からの発光は、粒子から全方位に発せられる。このため、2以上の受光手段としては、発光を受光可能な位置に配されれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、それぞれの受光方向とのなす角が0°とならない位置に配されることが好ましい。発光の重なりが少ない状態の情報が得られる点で有利である。

0025

2以上の受光手段のうち少なくとも1の受光手段は、その受光方向が他の受光手段の受光方向と略直交方向に位置するように配されることが好ましい。これにより、1の受光手段及び他の受光手段を用いた場合、1の受光手段及び他の受光手段により受光した情報のうち、いずれかの情報を選択する際に、発光の重なりが少ない状態の情報を選択できる。なお、略直交とは、80°以上100°以下を意味する。

0026

上記の2の受光手段以外の受光手段における受光方向としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。受光手段が2以上の場合、2以上の受光手段を同一平面上に位置するように配されるとき、隣り合う受光手段の受光方向がなす角を、360°を受光手段の個数で等分した角度になるようにすることが好ましい。例えば、3の受光手段を同一平面上に位置するように配されるときは、隣り合う受光手段の受光方向をそれぞれ120°となる位置するように配されることが好ましい。

0027

受光手段は、その受光方向が液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配されることが好ましく、すべての受光手段がその受光方向が液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配されることがより好ましい。これにより、受光手段の位置を調整しやすくすることができ、粒子計数装置の構造が複雑にならない点で有利である。
なお、コントラストを向上するため、光照射手段から出射される光が直接入射しない位置に受光手段を配置することが好ましい。

0028

受光手段としては、受光面の略法線方向に受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を得ることが好ましい。これにより、粒子計数手段は、発光の輝度値に基づいて液滴に含まれる粒子を計数する第一の計数処理、及び、発光の受光面における形状の情報に基づいて液滴に含まれる粒子を計数する第二の計数処理の少なくともいずれかを行うことができるため、粒子の計数精度を向上させることができる。

0029

受光手段としては、液滴吐出手段による液滴の吐出に同期して発光を受光できることが好ましい。これにより、液滴吐出手段から吐出された液滴に、光照射手段から光が照射され、粒子からの発光をより確実に受光することができる。
なお、ここで、同期するとは、例えば、液滴が吐出されて所定位置に達したときに液滴に光が照射され、粒子が発光するタイミングで、受光手段が発光を受光することを意味する。つまり、受光手段は、液滴吐出手段による液滴の吐出、及び光照射手段による光の照射に対して、それぞれ所定時間だけ遅延して発光を検出する。

0030

受光手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、1次元素子、2次元素子等を有するカメラなどが挙げられる。これらの中でも、2次元素子を有するカメラが好ましい。受光手段が2次元素子を有するカメラであると、発光の輝度値のみならず、発光の受光面における形状を得やすい点で有利である。

0031

1次元素子としては、例えば、フォトダイオードフォトセンサなどが挙げられる。これらの中でも、光電子増倍管アバランシェフォトダイオードが好ましい。1次元素子が光電子増倍管、アバランシェフォトダイオードであると、高感度な測定が可能となる。
2次元素子としては、例えば、CCD(Charge Coupled Device)、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)撮像素子ゲートCCDなどが挙げられる。
受光手段としては、CMOS撮像素子を有するカメラが好ましい。
CMOS撮像素子を有するカメラの市販品としては、高感度カメラ(pco.edge、sCMOS、株式会社東京インスツルメンツ製)が好ましい。

0032

なお、光照射手段が照射する光と比較して粒子からの発光が弱い場合、受光手段の受光面側に光の波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。フィルタを設置することにより、ノイズの少ない状態で受光手段が発光を受光できる。
フィルタとしては、例えば、光の波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタなどが挙げられる。

0033

前述のように、光照射手段から照射される光は、パルス光が好ましいが、連続発振させた光としてもよい。この場合、吐出された飛翔中の液滴に連続発振させた光が照射されるタイミングで受光手段が発光を受光可能となるように制御することが好ましい。

0034

<粒子計数手段及び粒子計数工程>
粒子計数手段は、2以上の受光手段により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する手段である。
粒子計数工程は、2以上の受光手段により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する工程であり、粒子計数手段により好適に行うことができる。

0035

粒子計数手段は、発光の輝度値に基づいて液滴に含まれる粒子を計数する第一の計数処理、及び、発光の受光面における形状の情報に基づいて液滴に含まれる粒子を計数する第二の計数処理の少なくともいずれかを行うことが好ましい。
次に、粒子計数手段が行う第一の計数処理及び第二の計数処理について説明する。

0036

[発光の輝度値に基づいて粒子を計数する第一の計数処理]
発光の輝度値に基づいて粒子を計数する第一の計数処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、(1)少なくとも2の受光手段が受光した発光の輝度値に基づき、あらかじめ取得した検量線を用いて粒子の個数を判定する処理、(2)受光手段が受光した発光の個数のうち最も多い発光の個数を粒子の個数として計数する処理などが挙げられる。

0037

上記(1)の処理では、発光が透過可能な粒子であれば、発光が重なる場合でも、発光の総輝度値により検量線を用いて粒子の個数を判定することができる。発光が透過しない粒子であっても、2以上の受光手段から発光の輝度値を得るため、発光が重なっていない、あるいは発光の重なりが少ない発光の輝度値に基づいて、粒子を計数することができる。

0038

上記(2)の処理では、それぞれの受光手段が受光した発光の輝度値に基づいて、輝度値が所定の範囲内にある発光の個数をそれぞれ求め、求めた発光の個数のうち最も多い発光の個数を粒子の個数として計数することができる。

0039

これらの中でも、上記(1)の処理が好ましい。第一の計数処理が上記(1)の処理であると、粒子の個数を計数する精度が高まる点で有利である。
第一の計数処理を行う場合、受光手段としては、1次元素子を用いてもよく、2次元素子を用いてもよい。

0040

[発光の受光面における形状の情報に基づいて粒子を計数する第二の計数処理]
発光の受光面における形状の情報に基づいて粒子を計数する第二の計数処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、(3)発光の受光面における形状の曲率半径を求め、求めた曲率半径のうち所定の範囲内にある曲率半径の中心の個数を粒子の個数として計数する処理、(4)発光の受光面における形状の外周の長さが所定の範囲内にある発光の個数を計数する処理、(5)発光の受光面における形状の外周の変曲点の個数を粒子の個数として計数する処理、(6)発光の受光面における形状の外周の接線の傾きの符号が変わる回数を粒子の個数として計数する処理などが挙げられる。

0041

上記(3)の処理では、曲率半径が所定の範囲より小さい場合、粒子からの発光以外の屈折した光や散乱した光などが受光されているため、曲率半径が所定の範囲より小さい発光は除外する。また、曲率半径が所定の範囲より大きい場合、粒子が液滴の外辺部近傍に存在しているとき、光を照射して粒子を発光させると、粒子からの発光が液滴の球面内側に反射する現象により、液滴の外辺部が発光して見えるため、粒子からの発光ではないと判定して除外する。発光の受光面における形状の情報に基づき算出した曲率半径のうち所定の範囲内にある曲率半径を算出した際の円の中心の個数を粒子の個数として計数することができる。

0042

上記(4)の処理は、上記(3)の処理における曲率半径を発光の受光面における形状の外周の長さに置き換えたものである。

0043

上記(5)の処理では、例えば、2つの発光が重なったときには変曲点の個数が2個になり、3つの発光が重なったときには変曲点の個数が3個になるため、変曲点の個数を粒子の個数として計数することができる。

0044

上記(6)の処理では、例えば、2つの発光が重なったときには接線の傾きの符号が2回変わり、3つの発光が重なったときには接線の傾きの符号が3回変わるため、接線の傾きの符号が変わる回数を粒子の個数として計数することができる。

0045

これらの中でも、上記(3)の処理が好ましい。すなわち、粒子計数手段が、発光の受光面における形状の情報に基づき曲率半径を算出し、所定の範囲内にある曲率半径を算出した際の円の中心の個数を粒子の個数として計数する第二の計数処理を行うことがより好ましい。第二の計数処理が上記(3)の処理であると、粒子が複数であっても計数が容易となり、粒子を計数する精度が高まる点で有利である。

0046

第二の計数処理を行う場合、受光手段としては、2次元素子を用いることが好ましい。受光手段が2次元素子であれば、2次元画像を得やすい点で有利である。
受光手段から得られた2次元画像に基づいて、発光の受光面における形状に基づいて曲率半径を算出するための画像処理を行うソフトウェアを用いてもよい。
画像処理を行うソフトウェアとしては、例えば、ImageJ(アメリカ国立衛生研究所製、オープンソース)などが挙げられる。

0047

[第一の計数処理と第二の計数処理の順序
第一の計数処理と第二の計数処理の順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、粒子計数手段が、第一の計数処理を行い、粒子を計数できないと判定したとき、第二の計数処理を行い、粒子を計数することが好ましい。
第一の計数処理のほうが第二の計数処理よりも処理速度が速いため、第一の計数処理を先に行う。第一の計数処理の際に、例えば、粒子からの発光が液滴の球面内側に反射する現象のため、発光の輝度値に基づいて検量線により粒子を計数することが困難な場合がある。この場合、あらかじめ検量線に判定不可領域を設けておくことにより、第一の計数処理では粒子を計数できないと判定し、第二の計数処理に切り換えることにより、液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる。

0048

[粒子計数手段による第一のフィードバック工程]
第一のフィードバック工程では、被付着物としてのウェル内に着弾した液滴に含まれる粒子の数を1個にしたい場合、粒子計数手段が、飛翔液滴に含まれる粒子の数が0個であると判定したとき、液滴吐出手段に液滴を更に吐出させるように制御することが好ましい。また、粒子の数が1個ではないと判定した飛翔液滴を被付着物に付着させないようにすることがより好ましい。これにより、被付着物の汚損を防止することができる。更に、粒子の個数が1個以上であると判定した飛翔液滴が被付着物に着弾した後、被付着物に着弾した位置とは別の位置に次の液滴を着弾させるなどの次工程に移行するようにしてもよい。

0049

また、第一のフィードバック工程では、ウェル内に着弾させる液滴に含まれる粒子の数を所定の数にしたい場合、粒子計数手段が、飛翔液滴に含まれる粒子の数が所定の数未満であると判定したとき、液滴吐出手段に液滴を更に吐出させるように制御することが好ましい。また、飛翔液滴に含まれる粒子の数が0個又は所定の数以上であると粒子計数手段が判定したとき、飛翔液滴を被付着物に着弾させないようにすることが好ましい。この点、飛翔液滴に含まれる粒子を計数して液滴吐出手段にフィードバックする工程のほうが、後述する、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数して液滴吐出手段にフィードバックする工程よりも生産性の面で有利である。
なお、液滴吐出手段により所定の回数の液滴を吐出した後に、後述する記憶手段に記憶した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を読み出し、吐出させた各々の液滴に含まれる粒子を計数するようにしてもよい。

0050

粒子計数手段は、本発明の粒子計数装置の各動作を制御するCPU(Central Processing Unit)、ROM(Read Only Memory)、RAM(Random Access Memory)、メインメモリなどを有し、粒子計数装置全体の動作を制御するための制御プログラムに基づいて各種処理を実行する。

0051

<フィードバックユニット>
フィードバックユニットは、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数することができ、また、計数した粒子の数に基づいて液滴吐出手段をフィードバック制御することができる。
フィードバックユニットは、撮像手段と、粒子計数手段とを有する。
以下、フィードバックユニットの粒子計数手段と、本発明の粒子計数装置の粒子計数手段とを識別するため、前述の粒子計数装置の粒子計数手段を「第一の粒子計数手段」と称し、フィードバックユニットの粒子計数手段を「第二の粒子計数手段」と称することがある。

0052

撮像手段としては、光照射手段と、ダイクロイックミラーと、対物レンズと、撮像素子と、スキャン部とを有する。
以下、フィードバックユニットの光照射手段と、本発明の粒子計数装置の光照射手段とを識別するため、前述の粒子計数装置の光照射手段を「第一の光照射手段」と称し、フィードバックユニットの光照射手段を「第二の光照射手段」と称することがある。

0053

撮像手段には、着弾した液滴を観察可能な位置に対物レンズが設置されている。撮像手段の第二の光照射手段から発せられたレーザー光は、ダイクロイックミラーを介して対物レンズを通過し、被付着物としてのウェル内の蛍光粒子に照射される。蛍光粒子から発せられた蛍光は、対物レンズを通過して撮像素子に入射することにより画像情報が取得できる。

0054

第二の光照射手段としては、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー、LEDなどが挙げられる。光照射手段のレーザー光を、ウェル内に着弾した液滴内に存在する蛍光粒子に照射すると、蛍光粒子が発光するため、粒子の計数精度が向上する。

0055

対物レンズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高倍率レンズを用いると計数精度が向上するが、視野が狭くなるため、視野外に液滴が着弾しやすくなり、カウントエラー頻度が高くなりやすい。一方、低倍率のレンズを用いると視野が広がるためカウントエラー頻度を下げることができるが、10μm以下の細胞を捉えにくくなる。
対物レンズで10μm以下の細胞を捉える場合、液滴吐出手段の着弾位置精度から、0.5mm角程度の視野の対物レンズを用いることが好ましい。市販品としては、例えば、無限補正対物レンズM−PLANAPO 5X(株式会社ミツトヨ製)などが挙げられる。

0056

撮像素子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、粒子の画像を取得する場合には、例えば、CCD、CMOS、ゲートCCD等の2次元素子などが挙げられる。また、発光の輝度値に基づき粒子数を判定する場合には、撮像素子として、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の1次元素子を用いてもよい。高感度の撮像素子が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードなどを用いることが好ましい。
第二の光照射手段を用いない場合、被付着物に着弾した液滴内の蛍光粒子は液滴周縁部の影に隠れてしまい、図5Bに示すように粒子の計数が困難になってしまう。このため、液滴が着弾した後、乾燥するまでの間に撮像するようにタイムディレイを設けることが好ましい。第二の光照射手段を用いる場合、液滴内の蛍光粒子が蛍光を発することにより、蛍光粒子の確認が容易になるため、液滴が乾燥する前に撮像することが可能である。
なお、第二の光照射手段が発するレーザー光と比較すると蛍光粒子が発する蛍光が弱いため、撮像素子の前段(受光面側)にレーザー光の波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、撮像素子において、非常にコントラストの高い蛍光粒子の画像を得やすくなる。フィルタとしては、例えば、レーザー光の波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタなどが挙げられる。

0057

スキャン部は、対物レンズの焦点位置を移動させ、蛍光粒子をスキャンして撮像するためのものである。蛍光粒子に対する焦点位置がずれると画像のコントラストが悪化し、取得した画像から粒子数を正確に計数することが困難となりやすい。このため、ウェル内に液滴が着弾した後、スキャン部により複数枚の画像を取得することにより、コントラストの高い画像を選択して取得することが可能となる。

0058

フィードバックユニットは、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数することができ、また、得られた計数値と、第一の粒子計数手段により得られた計数値とを比較した結果を液滴吐出手段にフィードバックすることができる。
被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を計数する方法としては、前述した、第一の計数処理、第二の計数処理などの方法を適用することができる。

0059

フィードバックユニットは、撮像素子として2次元素子を用いた場合、画像処理により蛍光粒子の発光している箇所の面積値を算出し、予め設定された閾値と比較することにより、液滴に含まれる粒子を計数することができる。この場合、フィードバックユニットは、画像の形状に基づく個数判定アルゴリズムを有することが好ましい。
また、フィードバックユニットは、撮像素子として1次元素子を用いた場合、得られた発光の輝度値に基づき、予め設定された閾値と比較することにより、液滴に含まれる粒子を計数することができる。

0060

なお、本発明の粒子計数装置は、飛翔中の液滴に含まれる粒子を計数することに限定するものではなく、飛翔中の液滴に含まれる粒子を計数せずに、フィードバックユニットを用いて、被付着物に着弾した後の液滴に含まれる粒子を計数してもよい。

0061

[第二の粒子計数手段による第二のフィードバック工程]
第二のフィードバック工程では、被付着物としてのウェル内に着弾した液滴に含まれる粒子の数を1個にしたい場合、第二の粒子計数手段が、着弾した液滴に含まれる粒子の数が0個であると判定したとき、液滴吐出手段に液滴を更に吐出させるように制御することが好ましい。更に、第二の粒子計数手段が、着弾した液滴に含まれる粒子の数が1個以上であると判定したとき、着弾した位置とは別の位置に着弾させるなどの次工程に移行するようにしてもよい。

0062

また、第二のフィードバック工程では、着弾した液滴に含まれる粒子の数を所定の数にしたい場合、第二の粒子計数手段が、着弾した液滴に含まれる粒子の数が所定の数未満であると判定したとき、液滴吐出手段に液滴を更に吐出させるように制御することが好ましい。また、着弾した液滴に含まれる粒子の数が所定の数を超えたと第二の粒子計数手段が判定したとき、被付着物に着弾した位置とは別の位置に次の液滴を着弾させるなどの次工程に移行するようにしてもよい。
なお、液滴吐出手段より所定の回数の液滴を吐出した後に、後述する記憶手段に記憶した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を読み出し、吐出させた各々の液滴に含まれる粒子を計数するようにしてもよい。

0063

以上のように、フィードバック工程は、第一又は第二の粒子計数手段が液滴吐出手段にフィードバックする工程であり、フィードバックユニットにより好適に行うことができる。

0064

<その他の手段及びその他の工程>
その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、光学系、駆動手段、記憶手段、被付着物を有することが好ましい。
その他の工程としては、その他の手段により好適に行われる。

0065

光学系としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、光照射手段から出射された光を液滴に集光させるためのレンズ、光をフィルタリングして受光手段が発光を受光しやすくするためのフィルタなどが挙げられる。

0066

駆動手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液滴吐出手段が圧電加圧方式によるインクジェットヘッドである場合、液滴吐出手段に駆動電圧を入力する手段などが挙げられる。この場合、駆動手段が圧電素子を変形させることにより微小な液滴を吐出させることができる。

0067

記憶手段としては、受光手段により受光された発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を記憶できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、RAMなどが挙げられる。

0068

吐出された液滴が付着する被付着物は、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、粒子が細胞である場合、ウェルなどが挙げられる。

0069

ここで、本発明における粒子計数装置の一例について図面を参照して説明する。
なお、各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。また、下記構成部材の数、位置、形状等は本実施の形態に限定されず、本発明を実施する上で好ましい数、位置、形状等にすることができる。

0070

図1は、本発明の粒子計数装置の一例を示す説明図である。
図1に示すように、粒子計数装置100は、液滴吐出手段10と、駆動手段20と、光照射手段30と、受光手段41及び42と、粒子計数手段51とを有する。

0071

液滴吐出手段10は、キャビティ11に蛍光粒子201を含む蛍光粒子懸濁液200を収容し、キャビティ11に配置された図示しない圧電素子の変形により、蛍光粒子201を含んだ球体あるいは楕円体の液滴210を、図3中のD3で示す吐出方向にノズル12から吐出することができる。

0072

駆動手段20は、液滴吐出手段10の圧電素子と電気的に接続されており、圧電素子に駆動電圧を印加し、圧電素子を変形させることにより液滴210を吐出させる。

0073

光照射手段30は、駆動手段20と電気的に接続されており、駆動手段20から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段30は、液滴吐出手段10による液滴210の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Lを液滴210に照射する。

0074

2つの受光手段41及び42は、いずれも光照射手段30を介して駆動手段20と電気的に接続されており、駆動手段20から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段41及び42は、光照射手段30のレーザー光Lにより蛍光粒子201が発光するタイミングに合わせて、発光L1及び発光L2を受光する。これにより、受光手段41及び42は、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報をそれぞれ得る。

0075

粒子計数手段51は、2つの受光手段41及び42により受光した発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報に基づき、液滴210に含まれる蛍光粒子201を計数する。

0076

図2は、図1に示した粒子計数装置における2つの受光手段の位置関係の一例を示す説明図である。なお、図2では、液滴の吐出方向を紙面奥行き方向としており、ノズル12の直下には、被付着物300が配置されている。
図2に示すように、光照射手段30、ミラー60、及びレンズ70は、光照射手段30により照射されたレーザー光Lがミラー60に反射してレンズ70を介して吐出方向に吐出された液滴(図2中のノズル12の位置)に集光されるように配置されている。
2つの受光手段41及び42は、吐出方向を法線とする平面上に、受光手段41の受光方向D1と、受光手段42の受光方向D2とがなす角を90°として配置されている。

0077

図3は、図2に示した位置関係とした2つの受光手段により得られる発光の画像の説明図である。図3では、受光手段41が受光した発光の輝度及び発光の受光面における形状を1つの画像P1に示し、受光手段42が受光した発光の輝度及び発光の受光面における形状を1つの画像P2に示している。
図3に示すように、画像P1では発光が重なっていないが、画像P2では発光が重なっている。
画像P1及び画像P2から発光の輝度に基づいて蛍光粒子201を計数するとき、上記(1)又は(2)の処理のいずれかを行い、蛍光粒子201の個数を計数してもよい。
画像P1及び画像P2から発光の受光面における形状に基づいて粒子201を計数するとき、上記(3)〜(6)の処理のいずれかを行い、蛍光粒子201の個数を計数してもよい。

0078

図4A図4Cは、2つの発光が重なる場合における発光の輝度値及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の一例を示す説明図である。図4A図4Cでは、発光が透過可能な粒子を想定しており、画像の濃淡が発光の輝度を示し、淡色であるほど発光の輝度が高いことを示している。

0079

図4Aに示すように、粒子からの発光の重なり程度であれば、発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定できる。
図4Bに示すように、粒子からの発光の重なり程度である場合、発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定できないとき、発光の受光面における形状に基づいて発光の受光面における形状の曲率半径を算出し、算出した曲率半径の中心の個数を粒子の個数として判定する。
図4Cに示すように、粒子からの発光が完全に重なった場合でも、輝度が高いほど重なっている粒子の個数が多いと判定できるため、検量線を用いて粒子の個数を判定することができる。
なお、発光が透過しない粒子であっても、2以上の受光手段を有することにより、いずれかの受光手段により発光が重なっていない状態を受光できていれば、粒子同士が接触した重なりでない限り、発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定できる。

0080

図5A及び図5Bは、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する場合における発光の輝度及び発光の受光面における形状のシミュレーション画像の一例を示す説明図である。図5A及び図5Bでは、図4A図4Cと同様に、画像の濃淡が発光の輝度を示し、淡色であるほど発光の輝度が高いことを示している。ただし、液滴の中に粒子が1個含まれており、粒子が液滴の外辺部近傍に存在する点で図4A図4Cと異なる。
図5Aに示すように、液滴の外辺部が発光しており、発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定しようとすると、粒子が1個であるか2個であるかの判定が困難であるが、発光の受光面における形状に基づいて粒子の個数を判定すると、液滴の外辺部の発光における曲率半径が大きいため除外することができる。
図5Bに示すように、図5Aの場合と同様に、記発光の輝度値に基づいて粒子の個数を判定しようとすると、粒子が1個であるか2個であるかの判定が困難であるが、発光の受光面における形状に基づいて粒子の個数を判定すると、発光の曲率半径から1個であると判定できる。

0081

図6A図6Cは、受光手段により受光した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の一例を示す画像である。図6A図6Cは、粒子としてSPHERO Fluorescent Nile Red particles(ベイバイオサイエンス株式会社製、1%(w/v)、直径10μm〜14μm)、懸濁液の液成分としてイオン交換水を用いて、圧電素子を用いたメンブレン振動方式のインクジェットヘッドを正弦波電圧(20,000Hz、1周期、4.6V)で圧電素子を駆動させ、粒子を含む液滴を直径80μmの球体になるように吐出させ、受光手段として高感度カメラ(pco.edge、株式会社東京インスツルメンツ製)の露光時間を10msに設定し、吐出させた液滴に光照射手段としてのYAGレーザー(Explorer ONE−532−200−KE、スペクトラ・フィジックス株式会社製)が出射したレーザービーム(10kHzで100μJ)を照射して粒子を発光させた状態の画像である。なお、インクジェットヘッド、YAGレーザー、及び高感度カメラを同期させ、YAGレーザーのみを遅れさせるようにディレイ時間を0.1msとした。ただし、上記の条件は、画像が得られる条件であれば、特に制限はなく、用いる機器や吐出する液の物性及び蛍光粒子などにより、適宜選択することができる。

0082

図6Aは、奥行きがある球体あるいは楕円体の液滴の中に粒子が2つ存在し、粒子の1つは液滴の中の紙面手前側に存在し、もう1つの粒子は液滴の中の紙面奥側に存在するような受光方向から受光されたときの画像である。
図6Aに示すように、液滴の中の紙面奥側に存在する粒子からの発光は、液滴を通過する分だけ、屈折や散乱などにより発光の輝度値が減衰するため、受光手段に対する液滴の中の位置に起因して発光の輝度値がばらつくときがある。

0083

図6Bは、奥行きがある球体あるいは楕円体の液滴の中に粒子が3つ存在し、粒子の1つが液滴の外辺部近傍に存在するような受光方向から受光されたときの画像である。
図6Bに示すように、液滴の外辺部近傍に存在する粒子からの発光は、液滴の球面内側に反射するときがある。

0084

図6Cは、奥行きがある球体あるいは楕円体の液滴の中に粒子が1つ存在し、粒子が紙面奥側における液滴の外辺部近傍に存在するような受光方向から受光されたときの画像である。
図6Cに示すように、粒子が紙面奥側における液滴の外辺部近傍に存在する場合の粒子からの発光は、輝度値が低く、受光面における形状が不明瞭となるときがある。

0085

図7は、2以上の受光手段により受光された発光の輝度値に基づき粒子の個数を判定する検量線の一例を示すグラフである。
図7に示すように、発光の輝度値に基づき粒子の個数を判定する検量線を用いることにより、第一の受光手段により受光された発光の輝度値1と、撮像手段により受光された発光の輝度値2に基づいて、粒子の個数を判定することができる。
また、図6A図6Cに示したように、発光の輝度値が不明確となり、検量線を求めることができない場合があるため、この場合、境界線近傍の所定の領域において粒子の個数を判定できない領域を判定不可領域として設けるようにする。2つの受光手段により受光された輝度値に基づき判定不可領域にプロットされる場合、輝度値だけでは粒子を計数できないと判定して、発光の受光面における形状の情報に基づき粒子を計数するようにすることが好ましい。
なお、検量線のデータは、粒子の種類や発光条件などに応じてあらかじめ取得し、記憶手段などに記憶させておく。

0086

次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図8に示すフローチャートの図中Sで表すステップにしたがって図1などを参照しながら説明する。
本フローチャートは、発光が重なることがない場合、あるいは発光が液滴の球面内側に反射して不明確になることがない場合に用いられる手順である。

0087

S101では、駆動手段20から駆動電圧を印加された液滴吐出手段10により、蛍光粒子201を含んだ液滴210を、図1中のD3で示す吐出方向にノズル12から吐出する。また、駆動手段20は、液滴吐出手段10に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段30及び2つの受光手段41及び42に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段51は、処理をS102に移行させる。

0088

S102では、駆動手段20から同期信号を入力された液滴吐出手段10は、液滴210の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Lを液滴210に照射する。また、同期信号を入力された受光手段41及び42は、光照射手段30のレーザー光Lにより蛍光粒子201が発光するタイミングに合わせて、発光L1及び発光L2を受光する。これにより、受光手段41及び42は、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段51は、処理をS103に移行させる。

0089

S103では、粒子計数手段51は、2つの受光手段41及び42により受光した、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報に基づき、図7に示した検量線を用いて液滴210に含まれる蛍光粒子201を計数して、本処理を終了する。

0090

次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図9に示すフローチャートの図中Sで表すステップにしたがって図1などを参照しながら説明する。
本フローチャートは、例えば、液滴吐出手段10により吐出させる液滴210に含まれる蛍光粒子201の個数が吐出毎にばらつく場合に用いられる手順である。すなわち、蛍光粒子201の個数のばらつき程度を確認するため、吐出する毎に蛍光粒子201からの発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報を得て、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値のみに基づき、蛍光粒子201の計数を行う手順である。

0091

S201では、駆動手段20から駆動電圧を印加された液滴吐出手段10により、蛍光粒子201を含んだ液滴210を、図1中のD3で示す吐出方向にノズル12から吐出する。また、駆動手段20は、液滴吐出手段10に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段30及び2つの受光手段41及び42に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段51は、処理をS202に移行する。

0092

S202では、駆動手段20から同期信号を入力された液滴吐出手段10は、液滴210の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Lを液滴210に照射する。また、同期信号を入力された受光手段41及び42は、光照射手段30のレーザー光Lにより蛍光粒子201が発光するタイミングに合わせて、発光L1及び発光L2を受光する。これにより、受光手段41及び42は、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段51は、処理をS203に移行する。

0093

S203では、粒子計数手段51は、2つの受光手段41及び42により受光した発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値に基づき、図7に示した検量線を用いて液滴210に含まれる蛍光粒子201を計数する。その後、粒子計数手段51は、処理をS204に移行する。

0094

S204では、液滴210に含まれる蛍光粒子201を計数した粒子計数手段51は、液滴吐出手段10が所定の回数の液滴210を吐出したか否かを判定する。粒子計数手段51は、液滴吐出手段10により液滴210を所定の回数吐出したと判定すると、本処理を終了する。粒子計数手段51は、液滴吐出手段10により液滴210を所定の回数吐出していないと判定すると、処理をS201に戻す。

0095

次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図10に示すフローチャートの図中Sで表すステップにしたがって図1などを参照しながら説明する。
本フローチャートは、例えば、液滴吐出手段10により液滴210を連続して吐出させた後、連続して吐出させた液滴210に蛍光粒子201がどのくらい含まれたのか確認したい場合に用いられる手順である。

0096

S301では、駆動手段20から駆動電圧を印加された液滴吐出手段10により、蛍光粒子201を含んだ液滴210を、図1中のD3で示す吐出方向にノズル12から吐出する。また、駆動手段20は、液滴吐出手段10に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段30及び2つの受光手段41及び42に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段51は、処理をS302に移行する。

0097

S302では、駆動手段20から同期信号を入力された液滴吐出手段10は、液滴210の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Lを液滴210に照射する。また、同期信号を入力された受光手段41及び42は、光照射手段30のレーザー光Lにより蛍光粒子201が発光するタイミングに合わせて、発光L1及び発光L2を受光する。これにより、受光手段41及び42は、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報を得る。粒子計数手段51は、液滴210毎に発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報を図示しない記憶手段に記憶し、処理をS303に移行する。

0098

S303では、液滴210に含まれる蛍光粒子201を計数した粒子計数手段51は、液滴吐出手段10が所定の回数の液滴210を吐出したか否かを判定する。粒子計数手段51は、液滴吐出手段10により液滴210を所定の回数吐出したと判定すると、処理をS304に移行する。粒子計数手段51は、液滴吐出手段10により液滴210を所定の回数吐出していないと判定すると、処理をS301に戻す。

0099

S304では、液滴210を所定の回数吐出したと判定した粒子計数手段51は、記憶手段に記憶した発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報に基づき、図7に示した検量線を用いて液滴210毎に蛍光粒子201を計数して、本処理を終了する。

0100

次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図11に示すフローチャートの図中Sで表すステップにしたがって図1などを参照しながら説明する。
本フローチャートは、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値のみに基づいて蛍光粒子201の個数を計数できないと判定した場合、発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状に基づいて蛍光粒子201の個数を判定する手順である。

0101

S401では、駆動手段20から駆動電圧を印加された液滴吐出手段10により、蛍光粒子201を含んだ液滴210を、図1中のD3で示す吐出方向にノズル12から吐出する。また、駆動手段20は、液滴吐出手段10に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段30及び2つの受光手段41及び42に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段51は、処理をS402に移行する。

0102

S402では、駆動手段20から同期信号を入力された液滴吐出手段10は、液滴210の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Lを液滴210に照射する。また、同期信号を入力された受光手段41及び42は、光照射手段30のレーザー光Lにより蛍光粒子201が発光するタイミングに合わせて、発光L1及び発光L2を受光する。これにより、受光手段41及び42は、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段51は、処理をS403に移行する。

0103

S403では、粒子計数手段51は、2つの受光手段41及び42により受光した発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値に基づき、図7に示した検量線を用いて液滴210毎に蛍光粒子201の個数を判定する。このとき、粒子計数手段51は、受光した発光L2の輝度値が図7に示した判定不可領域に含まれないと判定すると、処理をS404に移行する。粒子計数手段51は、判定不可領域に含まれると判定すると、処理をS405に移行する。

0104

S404では、判定不可領域に含まれないと判定した粒子計数手段51は、2つの受光手段41及び42により受光した発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値に基づき、図7に示した検量線を用いて液滴210に含まれる蛍光粒子201を計数して、本処理を終了する。

0105

S405では、判定不可領域に含まれると判定した粒子計数手段51は、2つの受光手段41及び42により受光した発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報、即ち形状データに基づき、曲率半径を求める。
次に、粒子計数手段51は、求めた曲率半径が所定の範囲内であるか否かを判定する。粒子計数手段51は、求めたすべての曲率半径が所定の範囲内であると判定すると、処理をS406に移行し、求めた曲率半径が1つでも所定の範囲内にないと判定すると、処理をS404に移行する。

0106

S406では、すべての曲率半径が所定の範囲内であると判定した粒子計数手段51は、求めた曲率半径の中心の個数を液滴210に含まれる蛍光粒子201の個数として計数し、本処理を終了する。

0107

次に、本発明の粒子計数装置を用いて、液滴吐出手段から吐出された液滴に含まれる粒子を計数するフローを、図12に示すフローチャートの図中Sで表すステップにしたがって図1を参照しながら説明する。

0108

S501では、駆動手段20から駆動電圧を印加された液滴吐出手段10により、蛍光粒子201を含んだ液滴210を、図1中のD3で示す吐出方向にノズル12から吐出する。また、駆動手段20は、液滴吐出手段10に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段30及び2つの受光手段41及び42に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段51は、処理をS502に移行する。

0109

S502では、駆動手段20から同期信号を入力された液滴吐出手段10は、液滴210の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Lを液滴210に照射する。また、同期信号を入力された受光手段41及び42は、光照射手段30のレーザー光Lにより蛍光粒子201が発光するタイミングに合わせて、発光L1及び発光L2を受光する。これにより、受光手段41及び42は、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段51は、処理をS503に移行する。

0110

S503では、粒子計数手段51は、2つの受光手段41及び42により受光した発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値に基づき、図7に示した検量線を用いて液滴210に含まれる蛍光粒子201を計数する。その後、粒子計数手段51は、処理をS504に移行する。

0111

S504では、粒子計数手段51は、計数した蛍光粒子201が0個であるか否かを判定する。粒子計数手段51は、計数した蛍光粒子201が0個であると判定すると、処理をS501に移行する。粒子計数手段51は、計数した蛍光粒子201が0個でないと判定すると、本処理を終了する。

0112

次に、本発明の粒子計数装置を用いて、粒子計数手段が、吐出させた液滴に含まれる粒子は0個であると判定した場合、液滴吐出手段により液滴を再度吐出させ、蛍光粒子201が計数されるまで繰り返すフローを、図13に示すフローチャートの図中Sで表すステップにしたがって図1を参照しながら説明する。

0113

S601では、駆動手段20から駆動電圧を印加された液滴吐出手段10により、蛍光粒子201を含んだ液滴210を、図1中のD3で示す吐出方向にノズル12から吐出する。また、駆動手段20は、液滴吐出手段10に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段30及び2つの受光手段41及び42に同期信号を出力する。その後、粒子計数手段51は、処理をS602に移行する。

0114

S602では、駆動手段20から同期信号を入力された液滴吐出手段10は、液滴210の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光Lを液滴210に照射する。また、同期信号を入力された受光手段41及び42は、光照射手段30のレーザー光Lにより蛍光粒子201が発光するタイミングに合わせて、発光L1及び発光L2を受光する。これにより、受光手段41及び42は、発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値、並びに発光L1の受光面における形状及び発光L2の受光面における形状の情報を得る。その後、粒子計数手段51は、処理をS603に移行する。

0115

S603では、粒子計数手段51は、2つの受光手段41及び42により受光した発光L1の輝度値及び発光L2の輝度値に基づき、図7に示した検量線を用いて液滴210に含まれる蛍光粒子201を計数する。その後、粒子計数手段51は、処理をS604に移行する。

0116

S604では、蛍光粒子201を計数した粒子計数手段51は、計数した光粒子201が0個であるか否かを判定する。粒子計数手段51は、計数した光粒子201が0個であると判定すると、処理をS605に移行する。粒子計数手段51は、計数した光粒子201が0個でないと判定すると、本処理を終了する。

0117

S605では、粒子計数手段51は、蛍光粒子201が0個であると判定した液滴210を被付着物に付着させないように排出して、処理をS601に戻す。

0118

図14及び図15は、上述した本発明の粒子計数装置の実施態様とは別の実施態様を示す説明図である。

0119

図14は、本発明の粒子計数装置の他の一例を示す説明図である。図14に示すように、図1に示した粒子計数装置と同様に、液滴210を吐出し被付着物71へ着弾させるが、被付着物71に着弾した蛍光粒子201を被付着物71の下から第二の粒子計数手段52により計数し、その結果を液滴吐出手段10にフィードバックする点で相違する。
なお、撮像手段80には、着弾した液滴を観察可能な位置に対物レンズ83が設置されている。撮像手段80の第二の光照射手段81から発せられたレーザー光Lは、ダイクロイックミラー83を介して対物レンズ83を通過し、被付着物としてのウェル内の蛍光粒子に照射される。蛍光粒子から発せられた蛍光L3は、対物レンズ63を通過して撮像素子65に入射することにより画像情報が取得できる。

0120

図15は、本発明の粒子計数装置の更に他の一例を示す説明図である。図15に示すように、図1に示した粒子計数装置と同様に、液滴を吐出し被付着物71へ着弾させるが、被付着物71の所定の位置に蛍光粒子201を含む液滴210を着弾させた後、着弾した液滴を観察可能なように、撮像手段80の対物レンズ83が設置されている場所まで被付着物71をステージ72で移動させ、被付着物71に着弾した蛍光粒子201を被付着物71の上から粒子数計数手段52により計数し、その結果を液滴吐出手段10にフィードバックする点で相違する。

0121

図16は、本発明の粒子計数装置を用いて、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を所定の数にするフローの一例を示すフローチャートである。図16に示すように、図12と同様なフローであるが、図12のステップS504における「粒子の数が0個であるか否かの判定」を、「粒子の数が所定の数であるか否かの判定」に変え、所定の数の粒子を被付着物に着弾させる場合のフローチャートを示している。

0122

図17は、本発明の粒子計数装置を用いて、被付着物に着弾した液滴に含まれる粒子を所定の数にするフローの他の一例を示すフローチャートである。図16と同様に所定の数を被付着物に着弾させる場合のフロー図を示しており、更に粒子の数が所定の数以上となる場合に液滴を排出する場合のフローチャートを示している。

0123

本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
<1> 光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、 前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する2以上の受光手段と、2以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段とを有することを特徴とする粒子計数装置である。
<2> 前記受光手段が、受光面の略法線方向に受光した前記発光の輝度値及び前記発光の前記受光面における形状の情報を得て、前記粒子計数手段が、前記発光の輝度値に基づいて前記液滴に含まれる前記粒子を計数する第一の計数処理、及び、前記発光の前記受光面における形状の情報に基づいて前記液滴に含まれる前記粒子を計数する第二の計数処理の少なくともいずれかを行う前記<1>に記載の粒子計数装置である。
<3> 前記粒子計数手段が、前記第一の計数処理を行い、前記粒子を計数できないと判定したとき、前記第二の計数処理を行い、前記粒子を計数する前記<2>に記載の粒子計数装置。
<4> 前記粒子計数手段が、前記発光の受光面における形状の情報に基づき曲率半径を算出し、所定の範囲内にある前記曲率半径を算出した際の円の中心の個数を前記粒子の個数として計数する前記第二の計数処理を行う前記<2>から<3>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<5> 2以上の前記受光手段のうち少なくとも1の前記受光手段が、その受光方向が他の前記受光手段の受光方向と略直交方向に位置するように配された前記<1>から<4>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<6> 前記受光手段が、その受光方向が前記液滴の吐出方向と略直交方向に位置するように配された前記<1>から<5>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<7> 前記受光手段が、CMOS撮像素子を有するカメラである前記<1>から<6>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<8> 前記粒子計数手段が、前記粒子の数が0個であると判定したとき、前記液滴吐出手段が、前記液滴を更に吐出する前記<1>から<7>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<9> 前記粒子計数手段が、前記粒子の数が所定の数未満であると判定したとき、前記液滴吐出手段が、前記液滴を更に吐出する前記<1>から<7>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<10> 前記粒子計数手段が、前記粒子の数が所定の数であると判定したとき、次工程に移行する前記<1>から<7>のいずれかに記載の粒子計数装置。
<11> 前記液滴吐出手段が、圧電素子を用いた圧電加圧方式によるインクジェットヘッドである前記<1>から<10>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<12> 前記圧電素子が、チタン酸ジルコン酸鉛を用いた素子である前記<11>に記載の粒子計数装置である。
<13> 前記光照射手段が、固体レーザーである前記<1>から<12>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<14> 前記光が、パルス光である前記<1>から<13>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<15> 前記パルス光のパルス幅が、10μs以下である前記<14>に記載の粒子計数装置である。
<16> 前記パルス光における単位パルスあたりのエネルギーが、0.1μJ以上である前記<14>から<15>のいずれかに記載の粒子計数装置である。
<17> 光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射工程と、前記光を照射された前記粒子からの発光を2以上の受光手段により受光する受光工程と、2以上の前記受光手段により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程とを含むことを特徴とする粒子計数方法である。

0124

前記<1>から<16>のいずれかに記載の粒子計数装置、及び前記<17>に記載の粒子計数方法は、従来における上記諸問題を解決し、本発明の目的を達成することができる。

0125

10液滴吐出手段
20 駆動手段
30、81光照射手段
41、42受光手段
51粒子計数手段
52 第二の粒子計数手段
71被付着物
80撮像手段
100粒子計数装置
201蛍光粒子
210 液滴

先行技術

0126

特許第5716213号公報

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