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課題・解決手段

増殖分化因子11(GDF11)タンパク質に結合することができるアプタマー;GDF11タンパク質と共にGDF11結合アプタマーを含む組成物;ならびにその作製方法及び使用方法が、本明細書に記載される。

概要

背景

増殖分化因子11(GDF11)または骨形成タンパク質11(BMP−11)は、Hox遺伝子の発現を制御することにより発達中の前後パターン形成を調整するトランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーに属する。GDF11は、心筋細胞(cardiacmyocite)増殖、腎臓器官形成膵臓発達の制御において役割を果たし、神経発生及び軟骨形成の負の制御因子として機能することが示された。

GDF11は、ミオスタチン(GDF8)と密接に関連し、これは筋成長の負の制御因子である。GDF11のように、ミオスタチンは、心筋細胞増殖の制御に関与する。GDF11とミオスタチンとの間の類似点は、同じ制御機構筋発達中及び神経発達中の両方で組織サイズを調整するために使用されるという可能性を示唆する。機構的に、GDF11の作用は、WFIKKN2というフォリスタチン免疫グロブリンプロテアーゼ阻害剤、及びNTドメインからなる大きな細胞外マルチドメインタンパク質により制御される可能性がある。WFIKKN2は、GDF11に対して高親和性を有し、これまでにミオスタチンの生物活性阻害することが見出されてきた。

GDF11及びGDF8(ミオスタチン)の両方とも、発達過程において、ならびに成体組織における細胞成長及び分化の制御において重要な役割を果たす。これらの2つのタンパク質局在化させる、及び/または測定する能力は、発達ならびに成体組織(例えば、心筋及び骨格筋)におけるそれらの寄与をさらに理解し区別するために重要である。しかしながら、それらの相同性ゆえに、現在のタンパク質結合試薬(例えば、抗体)を用いてこれらのタンパク質の存在及び/またはレベルを区別することは困難である。したがって、タンパク質GDF11とGDF8とを区別することができるタンパク質結合試薬が必要である。本開示は、GDF11タンパク質に対して結合特異性を有するアプタマーを提供することにより、このような必要性を満たす。

概要

増殖分化因子11(GDF11)タンパク質に結合することができるアプタマー;GDF11タンパク質と共にGDF11結合アプタマーを含む組成物;ならびにその作製方法及び使用方法が、本明細書に記載される。

目的

本開示は、GDF11タンパク質に対して結合特異性を有するアプタマーを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

10nM未満の親和性でGDF11と結合するアプタマーであって、同じ条件下で前記アプタマーが、GDF11に対する前記親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する、またはGDF8とは結合しない、前記アプタマー。

請求項2

前記アプタマーが、GDF11に対する前記親和性よりも少なくとも20分の1の弱い親和性で、または少なくとも30分の1の弱い親和性で、または少なくとも50分の1の弱い親和性でGDF8と結合する、請求項1に記載のアプタマー。

請求項3

前記アプタマーが、50nM超、または100nM超、または150nM超、または200nM超、または250nM超、または300nM超の親和性でGDF8と結合する、請求項1または請求項2に記載のアプタマー。

請求項4

前記アプタマーが、8nM未満、または7nM未満、または6nM未満、または5nM未満、または4nM未満、または3nM未満、または2nM未満、または1nM未満の親和性でGDF11と結合する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項5

前記アプタマーがGDF8と結合しない、請求項1に記載のアプタマー。

請求項6

親和性が、ポリアニオン性阻害剤を含む結合アッセイを使用して決定される、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項7

前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される、請求項6に記載のアプタマー。

請求項8

前記アプタマーが、配列5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGPASGC−3’(配列番号:110)または5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:151)(式中:各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;Rは、AまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である)を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項9

GDF11と結合するアプタマーであって、前記アプタマーが、前記配列5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:110)または5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:151)(式中:各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;Rは、AまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である)を含む、前記アプタマー。

請求項10

前記アプタマーが、a)5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:111);b)5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:152);c)5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:112);d)5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:153);e)5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC−3’(配列番号:113);及びf)RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGS−3’(配列番号:154)から選択される配列を含む、請求項8または請求項9に記載のアプタマー。

請求項11

RがGである場合、前記最初のWがAであり、RがAである場合、前記最初のWがCである、請求項8〜10のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項12

少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのnが0である、請求項8〜11のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項13

各nが0である、請求項8〜11のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項14

少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つのnが1である、請求項8〜11のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項15

少なくとも1つのmが0である、請求項8〜14のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項16

少なくとも1つのmが1である、請求項8〜14のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項17

前記アプタマーが、配列5’−CPPGMPPP−3’(配列番号:114)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、式中、MはCまたはAである)を含む、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項18

前記アプタマーが、配列5’−PPPAGC−3’(配列番号:115)または5’−PPPAGG−3’(配列番号:155)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンである)を含む、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項19

前記アプタマーが、配列5’−CPPGMPPPNxPPPAGC−3’(配列番号:160)または5’−CPPGMPPPNxPPPAGG−3’(配列番号:116)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、式中、xは2、3、4、または5であり、式中、MはCまたはAであり、式中、各Nは独立して、かつ各存在についてA、C、G、T、及びUから選択される)を含む、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項20

xが3または4である、請求項16に記載のアプタマー。

請求項21

Nxが、配列5’−AAG−3’または5’−ACG−3’または5’−AGG−3’を含む、請求項19または請求項20に記載のアプタマー。

請求項22

前記アプタマーが、配列5’−NNCPPGRPPPAMGPPPAGS−3’(配列番号:141)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、RはAまたはGであり;各Nは独立して、かつ各存在についてA、G、またはCであり;MはAまたはCであり;SはGまたはCである)を含む、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項23

各Pが独立して、かつ各存在について:5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PEdU)、5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−チロシルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TyrdU)、5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)、5−(N−4−フルオロベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(FBndU)、5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PPdU)、5−(N−イミジゾリルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ImdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−R−スレオニルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThrdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium))プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される、請求項8〜22のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項24

各Pが独立して、かつ各存在について:5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される、請求項8〜22のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項25

少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのPが各々、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから独立して選択される、請求項8〜22のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項26

各Pが、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから独立して選択される、請求項8〜22のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項27

前記アプタマーが、配列番号:12、13、15〜109、及び117〜140から選択される配列を含む、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項28

前記アプタマーが、配列番号:12、15、26、105〜109、及び142〜150から選択される配列を含む、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項29

前記アプタマーが、18〜200のヌクレオチド、または18〜150のヌクレオチド、または18〜100のヌクレオチド、または18〜75のヌクレオチド、または18〜50のヌクレオチド、または20〜150のヌクレオチド、または20〜100のヌクレオチド、または20〜75のヌクレオチド、または20〜50のヌクレオチドからなり、各ヌクレオチドが、独立して修飾または非修飾ヌクレオチドであってよい、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項30

前記アプタマーが検出可能な標識を含む、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項31

GDF11がヒトGDF11であり、GDF8がヒトGDF8である、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項32

GDF11が、配列番号:118の前記配列を含む成熟ヒトGDF11であり、GDF8が、配列番号:119の前記配列を含む成熟ヒトGDF8である、先行請求項のいずれか1項に記載のアプタマー。

請求項33

試料中のGDF11の検出方法であって、前記試料からのタンパク質を請求項1〜32のいずれか1項に記載のアプタマーと接触させることを含む、前記方法。

請求項34

前記アプタマーが、GDF11に対する前記親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する、またはGDF8とは結合しない、請求項33に記載の方法。

請求項35

試料がGDF11を含むかどうかの決定方法であって、前記試料からのタンパク質を請求項1〜32のいずれか1項に記載のアプタマーと接触させることを含む、前記方法。

請求項36

前記試料がGDF8を含む、請求項35に記載の方法。

請求項37

前記方法が、ストリンジェントな条件下で前記試料を前記アプタマーと接触させることを含む、請求項33〜36のいずれか1項に記載の方法。

請求項38

前記ストリンジェントな条件が、ポリアニオン性阻害剤を含む、請求項37に記載の方法。

請求項39

前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸、ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される、請求項38に記載の方法。

請求項40

前記試料がヒト由来の試料である、請求項33〜39のいずれか1項に記載の方法。

請求項41

前記試料が、血液、血清血漿唾液、尿、及び組織試料から選択される、請求項40に記載の方法。

請求項42

前記組織試料が、心筋組織骨格筋組織膵臓組織軟骨組織及び神経組織から選択される、請求項41に記載の方法。

請求項43

前記タンパク質が、前記試料の少なくとも1つのその他の成分から分離されている、請求項33〜42のいずれか1項に記載の方法。

請求項44

前記タンパク質が、前記試料のその他の成分から分離されていない、請求項33〜42のいずれか1項に記載の方法。

請求項45

請求項1〜32のいずれか1項に記載のアプタマーと試料からのタンパク質とを含む、組成物

請求項46

前記試料がGDF8を含む、請求項45に記載の組成物。

請求項47

ポリアニオン性阻害剤を含む、請求項45または請求項46に記載の組成物。

請求項48

前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸、ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される、請求項47に記載の組成物。

請求項49

前記試料がヒト由来の試料である、請求項45〜48のいずれか1項に記載の組成物。

請求項50

前記試料が、血液、血清、血漿、唾液、尿、及び組織試料から選択される、請求項49に記載の組成物。

請求項51

前記組織試料が、心筋組織、骨格筋組織、膵臓組織、軟骨組織及び神経組織から選択される、請求項50に記載の組成物。

請求項52

前記タンパク質が、前記試料の少なくとも1つのその他の成分から分離されている、請求項45〜51のいずれか1項に記載の組成物。

請求項53

前記タンパク質が、前記試料のその他の成分から分離されていない、請求項45〜51のいずれか1項に記載の組成物。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2014年11月24日出願の米国特許仮出願第62/083,592号明細書、及び2015年2月9日出願の米国特許仮出願第62/113,864号明細書の優先権の利益を主張し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。

0002

配列表
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、2015年11月23日に作成された「2015−11−23_01137−0011−00PCT_ST25.txt」と題したファイルとして提供され、サイズは122,816バイトである。配列表の電子形式における情報は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

0003

本開示は一般に核酸の分野に関し、より具体的には、増殖分化因子11(GDF11)タンパク質に結合することができるアプタマー;GDF11タンパク質と共にGDF11結合アプタマーを含む組成物;ならびにその作製方法及び使用方法に関する。

背景技術

0004

増殖分化因子11(GDF11)または骨形成タンパク質11(BMP−11)は、Hox遺伝子の発現を制御することにより発達中の前後パターン形成を調整するトランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーに属する。GDF11は、心筋細胞(cardiacmyocite)増殖、腎臓器官形成膵臓発達の制御において役割を果たし、神経発生及び軟骨形成の負の制御因子として機能することが示された。

0005

GDF11は、ミオスタチン(GDF8)と密接に関連し、これは筋成長の負の制御因子である。GDF11のように、ミオスタチンは、心筋細胞増殖の制御に関与する。GDF11とミオスタチンとの間の類似点は、同じ制御機構筋発達中及び神経発達中の両方で組織サイズを調整するために使用されるという可能性を示唆する。機構的に、GDF11の作用は、WFIKKN2というフォリスタチン免疫グロブリンプロテアーゼ阻害剤、及びNTドメインからなる大きな細胞外マルチドメインタンパク質により制御される可能性がある。WFIKKN2は、GDF11に対して高親和性を有し、これまでにミオスタチンの生物活性阻害することが見出されてきた。

0006

GDF11及びGDF8(ミオスタチン)の両方とも、発達過程において、ならびに成体組織における細胞成長及び分化の制御において重要な役割を果たす。これらの2つのタンパク質を局在化させる、及び/または測定する能力は、発達ならびに成体組織(例えば、心筋及び骨格筋)におけるそれらの寄与をさらに理解し区別するために重要である。しかしながら、それらの相同性ゆえに、現在のタンパク質結合試薬(例えば、抗体)を用いてこれらのタンパク質の存在及び/またはレベルを区別することは困難である。したがって、タンパク質GDF11とGDF8とを区別することができるタンパク質結合試薬が必要である。本開示は、GDF11タンパク質に対して結合特異性を有するアプタマーを提供することにより、このような必要性を満たす。

0007

本開示は、増殖分化因子11(GDF11)タンパク質に結合することができるアプタマーについて記載する。いくつかの実施形態では、100nM未満の平衡結合定数(Kd)でGDF11と結合するアプタマーが提供される。別の態様では、Kdは、約0.1nM〜約100nM(または約0.1nM〜約50nM、または約0.1nM〜約10nM、または約0.5nM〜約10nM、または約0.5nM〜約5nM)である。

0008

いくつかの実施形態では、10nM未満の親和性でGDF11と結合するアプタマーが提供される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、10nM未満の親和性でGDF11と結合し、同じ条件下でアプタマーは、GDF11に対する親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーはGDF8と結合しない。いくつかの実施形態では、アプタマーは、GDF11に対する親和性よりも少なくとも20分の1の弱い親和性で、または少なくとも30分の1の弱い親和性で、または少なくとも50分の1の弱い親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、50nM超、または100nM超、または150nM超、または200nM超、または250nM超、または300nM超の親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、8nM未満、または7nM未満、または6nM未満、または5nM未満、または4nM未満、または3nM未満、または2nM未満、または1nM未満の親和性でGDF11と結合する。いくつかの実施形態では、親和性は、ポリアニオン性阻害剤を含む結合アッセイを使用して決定される。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性阻害剤は、デキストラン硫酸ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGPASGC−3’(配列番号:110)または5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:151)(式中:
各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;
Rは、AまたはGであり;
各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;
各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;
各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;
各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;
各mは独立して、かつ各存在について0または1である)を含む。

0009

いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーが提供され、このアプタマーは、配列5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:110)または5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:151)(式中:
各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;
Rは、AまたはGであり;
各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;
各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;
各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;
各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;
各mは独立して、かつ各存在について0または1である)を含む。

0010

いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、
a)5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:111);
b)5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:152);
c)5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:112);
d)5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:153);
e)5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC−3’(配列番号:113);及び
f)RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGS−3’(配列番号:154)から選択される配列を含む。
上記配列のいくつかの実施形態では、RがGである場合、最初のWはAであってよく、RがAである場合、最初のWはCであってよい。いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのnが、0である。いくつかの実施形態では、各nは0である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つのnが、1である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのmが、0である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのmが、1である。

0011

いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、配列5’−CPPGMPPP−3’(配列番号:114)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、式中、MはCまたはAである)を含む。いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、配列5’−PPPAGC−3’(配列番号:115)または5’−PPPAGG−3’(配列番号:155)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンである)を含む。いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、配列5’−CPPGMPPPNxPPPAGC−3’(配列番号:116)または5’−CPPGMPPPNxPPPAGG−3’(配列番号:160)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、式中、xは2、3、4、または5であり、式中、MはCまたはAであり、式中、各Nは独立して、かつ各存在についてA、C、G、T、及びUから選択される)を含む。いくつかの実施形態では、xは3または4である。いくつかの実施形態では、Nxは、配列5’−AAG−3’または5’−ACG−3’または5’−AGG−3’を含む。

0012

いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、配列5’−NNCPPGRPPPAMGPPPAGS−3’(配列番号:141)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、RはAまたはGであり;各Nは独立して、かつ各存在についてA、G、またはCであり;MはAまたはCであり;SはGまたはCである)を含む。

0013

いくつかの実施形態では、各Pは独立して、かつ各存在について:
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン
5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PEdU)、
5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、
5−(N−チロシルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TyrdU)、
5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)、
5−(N−4−フルオロベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(FBndU)、
5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PPdU)、
5−(N−イミジゾリルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ImdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、
5−(N−R−スレオニルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThrdU)、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium))プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される。

0014

いくつかの実施形態では、各Pは独立して、かつ各存在について:
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのPは各々、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから独立して選択される。

0015

いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号:12、13、15〜109、及び117〜140から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号:12、15、26、105〜109、及び142〜150から選択される配列を含む。

0016

本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、18〜200のヌクレオチド、または18〜150のヌクレオチド、または18〜100のヌクレオチド、または18〜75のヌクレオチド、または18〜50のヌクレオチド、または20〜150のヌクレオチド、または20〜100のヌクレオチド、または20〜75のヌクレオチド、または20〜50のヌクレオチドからなってよく、各ヌクレオチドは、独立して修飾または非修飾ヌクレオチドであってよい。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、検出可能な標識を含んでよい。

0017

いくつかの実施形態では、GDF11はヒトGDF11であり、GDF8はヒトGDF8である。いくつかの実施形態では、GDF11は、配列番号:118の配列を含む成熟ヒトGDF11であり、GDF8は、配列番号:119の配列を含む成熟ヒトGDF8である。

0018

いくつかの実施形態では、試料中のGDF11を検出する方法が提供され、これは試料からのタンパク質を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、GDF11に対する親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーはGDF8と結合しない。

0019

いくつかの実施形態では、試料がGDF11を含むかどうかを決定する方法は、試料からのタンパク質を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、試料はGDF8を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ストリンジェントな条件下で試料をアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件は、ポリアニオン性阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性阻害剤は、デキストラン硫酸、ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される。

0020

いくつかの実施形態では、試料は、ヒト由来の試料である。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清血漿唾液、尿、及び組織試料から選択される。いくつかの実施形態では、組織試料は、心筋組織骨格筋組織膵臓組織軟骨組織及び神経組織から選択される。

0021

いくつかの実施形態では、タンパク質は、試料の少なくとも1つのその他の成分から分離されている。いくつかの実施形態では、タンパク質は、試料のその他の成分から分離されていない。

0022

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアプタマー及び試料からのタンパク質を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、試料はGDF8を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリアニオン性阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性阻害剤は、デキストラン硫酸、ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト由来の試料である。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、及び組織試料から選択される。いくつかの実施形態では、組織試料は、心筋組織、骨格筋組織、膵臓組織、軟骨組織及び神経組織から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、試料の少なくとも1つのその他の成分から分離されている。いくつかの実施形態では、タンパク質は、試料のその他の成分から分離されていない。

0023

別の態様では、アプタマーは、少なくとも25のヌクレオチド長である。別の態様では、アプタマーは、少なくとも30のヌクレオチド長である。別の態様では、アプタマーは、少なくとも40のヌクレオチド長である。別の態様では、アプタマーは、約40〜約100のヌクレオチド長(または40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100のヌクレオチド長)である。

0024

本開示は、アプタマー及びGDF11タンパク質を含む組成物をさらに提供し、このアプタマー及びGDF11タンパク質は、非共有結合性相互作用により結合される。

0025

本発明の前述の及びその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細説明からさらに明らかとなり、これは添付の図面に関連する。

図面の簡単な説明

0026

ポリアニオン性阻害剤(Z−ブロック)の存在下または不存在下における、ヒトGDF11タンパク質及びヒトミオスタチン(GDF8)タンパク質に対するアプタマークローン12060−28_3の結合親和性の比較を示す。x軸は各タンパク質の濃度を示し、y軸はタンパク質に結合したアプタマーのパーセント(1.0は100%である)を示す。
ポリアニオン性阻害剤(Z−ブロック)の存在下または不存在下における、ヒトGDF11タンパク質及びヒトミオスタチン(GDF8)タンパク質に対するアプタマー12058−6_3の結合親和性の比較を示す。x軸は各タンパク質の濃度を示し、y軸はタンパク質に結合したアプタマークローンのパーセント(1.0は100%である)を示す。
アプタマークローン12060−28_3(50mer配列)の切断分析及びGDF11に対する各配列の結合親和性を示す。

0027

I.用語及び方法
本発明は、ある種の代表的な実施形態に関連して記載されるだろうが、本発明は特許請求の範囲により定義され、それらの実施形態に限定されないことが理解されるだろう。

0028

業者は、本明細書に記載されるものと類似の、または同等の多くの方法及び材料が、本発明の実施において使用されてよいことを認識するだろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されない。

0029

別段の規定がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。分子生物学における共通用語の定義は、Oxford University Pressにより出版されたBenjamin Lewin、Genes V、1994(ISBN 0−19−854287−9);Blackwell Science Ltd.により出版されたKendrew et al.(eds.)、The Encyclopedia of Molecular Biology、1994(ISBN 0−632−02182−9);及びVCH Publishers,Inc.により出版されたRobert A.Meyers(ed.)、Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference、1995(ISBN 1−56081−569−8)に見出されてよい。本明細書に記載されるものと類似の、または同等の任意の方法、デバイス、及び材料が、本発明の実施において使用され得るが、ある種の方法、デバイス、及び材料が本明細書に記載される。

0030

本明細書で引用される全ての刊行物公開特許文献、及び特許出願は、個々の刊行物、公開特許文献、または特許出願が、参照によって組み込まれていると具体的かつ個別に示された場合と同程度に参照によって本明細書に組み込まれる。

0031

添付の特許請求の範囲を含む、本出願で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数を含み、「at least one(少なくとも1つ)」及び「one or more(1つ以上)」と同じ意味で使用されてよい。したがって、「an aptamer(アプタマー)」への言及にはアプタマーの混合物を含み、「a probe(プローブ)」への言及にはプローブの混合物を含むなどである。

0032

本明細書で使用される場合、「comprises(含む)」、「comprising(含む)」、「includes(含める)」、「including(含める)」、「contains(含有する)」、「containing(含有する)」という用語、及びその任意の変化形は、非排他的包含を含むことを意図し、結果として、要素または要素の一覧を含む、それらを含める、またはそれらを含有するプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または物質組成は、明示的に列挙されていないその他の要素を含んでよい。

0033

核酸またはポリペプチドに付与される全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び全ての分子量値または分子質量値は概算であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。

0034

本開示における様々な実施形態の確認を容易にするために、特定の用語に関する以下の説明が提供される:

0035

アプタマー:本明細書で使用される場合、「アプタマー」は、標的分子に対して特異的結合親和性を有する核酸を指す。親和性相互作用は、程度の問題であることが認識されるが、これに関連して、その標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」は、アプタマーが試験試料中のその他の成分に結合するよりも、一般にはるかに高い度合いの親和性でアプタマーがその標的に結合することを意味する。「アプタマー(単数)」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の1つの種類または種のコピーの1セットである。アプタマーは、任意の数の化学修飾ヌクレオチドを含む、任意の好適な数のヌクレオチドを含み得る。「アプタマー(複数)」は、2つ以上のこのような分子のセットを指す。異なるアプタマーは、同数または異なる数のいずれかのヌクレオチドを有し得る。アプタマーは、DNAまたはRNAまたは化学修飾核酸であり得、一本鎖二本鎖であり得、または二本鎖領域を含有し得、より高度な秩序構造を含み得る。アプタマーは光アプタマーでもあり得、光反応性または化学反応性官能基がアプタマー中に含まれて、アプタマーがその対応する標的に共有結合されるのを可能にする。本明細書に開示されるアプタマー方法のいずれも、同じ標的分子と特異的に結合する2つ以上のアプタマーの使用を含み得る。以下でさらに記載されるように、アプタマーはタグを含んでよい。アプタマーがタグを含む場合、アプタマーの全てのコピーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーの各々がタグを含む場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれかを有し得る。

0036

アプタマーは、SELEX法を含む、任意の既知の方法を使用して同定され得る。一旦同定されたら、アプタマーは、化学合成方法及び酵素合成方法を含む、任意の既知の方法に従って調製または合成され得る。

0037

GDF11アプタマー:GDF11アプタマーは、本明細書で使用される場合、成熟GDF11タンパク質に結合することができるアプタマーを指す。非限定的で例示的な成熟ヒトGDF11タンパク質は、以下に示される(UniProtKB/Swiss−Prot:O95390.1のアミノ酸299〜407):
L GLDCDEHSSE SRCCRPLTVDFAFGWDWI IAPKRYKANYCSGQCEYMFM QKYPHTHLVQQANPRGSAGPCCTPTKMSPI NMLYFNDKQQ IIYGKIPGMV VDRCGCS(配列番号:118)。
いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、GDF11に対する親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、GDF8と結合しない。非限定的で例示的な成熟ヒトGDF8タンパク質は、以下に示される(UniProtKB/Swiss−Prot:O14793.1のアミノ酸267〜375):
FGL DCDEHSTESRCCRYPLTVDF EAFGWDWIIAPKRYKANYCS GECEFVFLQK YPHTHLVHQA NPRGSAGPCCTPTKMSPINM LYFNGKEQII YGKIPAMVVD RCGCS(配列番号:119)。

0038

阻害する:阻害するという用語は、本明細書で使用される場合、ペプチドもしくはポリペプチドが測定可能活性もしくは生物活性をもはや有しない程度までペプチドもしくはポリペプチドの発現を防止する、もしくは減少させること;またはペプチドもしくはポリペプチドが測定可能な活性もしくは生物活性をもはや有しない程度までペプチドもしくはポリペプチドの安定性を減少させること、及び/もしくはその活性を減少させる、もしくは防止することを意味する。本明細書に記載されるように、阻害されてよいタンパク質は、GDF11である。

0039

核酸:本明細書で使用される場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、同じ意味で使用されてヌクレオチドのポリマーを指し、これらとしてはDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドならびにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾物が挙げられ、様々な実体または部分が任意の位置のヌクレオチド単位に結合することが含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、二本鎖または一本鎖分子に加えて三重らせん分子も含む。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語の上位語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。

0040

修飾された:本明細書で使用される場合、「修飾する」、「修飾された」、「修飾」という用語、及びその任意の変化形は、オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、オリゴヌクレオチドの4つの構成ヌクレオチド塩基(すなわち、A、G、T/U、及びC)の少なくとも1つが、天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アプタマーとタンパク質標的との疎水性相互作用を主に引き起こし、高い結合効率及び安定した共結晶複合体をもたらす。C−5位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの一例である。修飾としては、骨格修飾、メチル化珍しい塩基対合の組み合わせ、例えばイソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどを挙げることができる。修飾としては、キャッピングなどの3’及び5’修飾も挙げることができる。その他の修飾としては、天然に存在するヌクレオチドのうち1つ以上と類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えば、メチルホスホネートホスホトリエステル、ホスホアミデートカルバメートなど)による修飾及び荷電連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)による修飾、インターカレーター(例えば、アクリジンソラレンなど)による修飾、キレート剤(例えば、金属、放射性金属ホウ素、酸化金属など)を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、ならびに修飾連結(例えば、アルファアノマー核酸など)による修飾などを挙げることができる。さらに、通常はヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれも、ホスホネート基もしくはリン酸基によって置き換えられてよい;標準的な保護基によって保護されてよい;または追加のヌクレオチドもしくは固体支持体への追加の連結を調製するために活性化されてよい。5’末端及び3’末端のOH基リン酸化され得る、またはアミン、約1〜約20の炭素原子有機キャッピング基部分、いくつかの実施形態では、約10〜約80kDaの範囲のポリエチレングリコール(PEG)ポリマー、いくつかの実施形態では、約20〜約60kDaの範囲のPEGポリマー、もしくはその他の親水性もしくは疎水性生体ポリマーもしくは合成ポリマーで置換され得る。一実施形態では、修飾は、ピリミジンのC−5位のものである。これらの修飾は、C−5位に直接アミド連結することにより、またはその他の種類の連結により作製され得る。

0041

ポリヌクレオチドはまた、一般に当該技術分野において既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有し、2’−O−メチル−、2’−O−アリル、2’−フルオロ−または2’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノースキシロースまたはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース非環式類似体及び脱塩ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドなどを含み得る。上述の通り、1つ以上のホスホジエステル連結が、代替連結基によって置き換えられてよい。これらの代替連結基としては、リン酸がP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COまたはCH2(「ホルムアセタール」)(式中、各RまたはR’は独立してHである、またはエーテル(−O−)連結を場合により含有する置換もしくは非置換アルキル(1〜20のC)、アリールアルケニルシクロアルキルシクロアルケニルもしくはアラルジルである)によって置き換えられる実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替骨格構造のように、最終生成物の設計に有利であり得る。

0042

ヌクレアーゼ:本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット間ホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指す。本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチド内の部位でホスホジエステル結合(複数可)を切断する酵素を指す。本明細書で使用される場合、「エキソヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合(複数可)を切断する酵素を指す。生体液は、典型的にはエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの両方の混合物を含有する。

0043

本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性の」及び「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの基質として機能するオリゴヌクレオチドの能力の減少を指し、したがって、このような酵素と接触した場合に、オリゴヌクレオチドが分解されない、または非修飾ヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドよりもさらにゆっくりと分解されるかのいずれかである。

0044

C−5修飾ピリミジン:本明細書で使用される場合、「C−5修飾ピリミジン」という用語は、C−5位に修飾を有するピリミジンを指し、本明細書に示されるこれらの部分を含むが、これらに限定されない。C−5修飾ピリミジンの例としては、米国特許第5,719,273号明細書及び第5,945,527号明細書に記載されているものが挙げられる。C−5修飾の例としては、デオキシウリジンのC−5位での、すぐ下で示されるようなベンジルカルボキシアミド(あるいはベンジルアミノカルボニル)(Bn)、ナフチルメチルカルボキシアミド(あるいはナフチルメチルアミノカルボニル)(Nap)、トリプタミノカルボキシアミド(あるいはトリプタミノカルボニル)(Trp)、フェネチルカルボキシアミド(あるいはフェネチルアミノカルボニル)(Pe)、チオフェニルメチルカルボキシアミド(あるいはチオフェニルメチルアミノカルボニル)(Th)及びイソブチルカルボキシアミド(あるいはイソブチルアミノカルボニル)(iBu)から独立して選択される置換基による置換が挙げられる。

0045

C−5修飾ピリミジンの化学修飾はまた、2’−位の糖修飾環外アミンにおける修飾、及び4−チオウリジンの置換などと、単独でまたは任意の組み合わせで組み合わされ得る。

0046

代表的なC−5修飾ピリミジンとしては、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PedU)、5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium))プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンまたは5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)が挙げられる。

0047

ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成前または合成後のいずれかに修飾され得る。オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列は、1つ以上の非ヌクレオチド成分により割り込まれてよい。修飾オリゴヌクレオチドは、重合後、例えば任意の好適な標識化成分との複合化などによりさらに修飾されてよい。

0048

本明細書で使用される場合、「少なくとも1つのピリミジン」という用語は、核酸の修飾を指す場合に、核酸中の1つの、いくつかの、または全てのピリミジンを指し、核酸中のいずれかまたは全てのC、T、またはUのいずれかまたは全ての存在が修飾されてよい、または修飾されなくともよいことを示す。

0049

調節する:調節するという用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド、タンパク質もしくはポリペプチドの発現レベルを、参照発現レベルと比較してその発現レベルを増加もしくは減少させることにより変更すること、ならびに/またはペプチド、タンパク質もしくはポリペプチドの安定性及び/もしくは活性を、参照安定性及び/もしくは活性レベルと比較してその安定性及び/もしくは活性レベルを増加もしくは減少させることにより変更することを意味する。

0050

薬学的に許容される:薬学的に許容されるとは、本明細書で使用される場合、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されていること、または動物での、より具体的にはヒトでの使用について米国薬局方もしくはその他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。

0051

薬学的に許容される塩:化合物(例えば、アプタマー)の薬学的に許容される塩または塩は、本明細書で使用される場合、イオン結合を含有し、典型的には化合物と、個体への投与に好適な酸または塩基のいずれかとを反応させることにより作製される生成物を指す。薬学的に許容される塩としては、塩酸塩臭化水素酸塩リン酸塩硫酸塩、硫酸水素塩アルキルスルホン酸塩アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩安息香酸塩クエン酸塩マレイン酸塩フマル酸塩コハク酸塩乳酸塩、及び酒石酸塩を含む酸付加塩;Li、Na、Kなどのアルカリ金属カチオン、MgもしくはCaなどのアルカリ土類金属塩、または有機アミン塩を挙げることができるが、これらに限定されない。

0052

医薬組成物:医薬組成物は、本明細書で使用される場合、個体への投与に好適な形態でGDF11アプタマーを含む製剤を指す。医薬組成物は、典型的にはその意図される投与経路適合するように製剤化される。投与経路の例としては、経口及び非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、吸入局所経皮、経粘膜、及び直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない。

0053

SELEX:「SELEX」及び「SELEX法」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、一般に(1)所望の様式で、例えばタンパク質に高い親和性で結合する様式で標的分子と相互作用するアプタマーの選択と、(2)それらの選択された核酸の増幅との組み合わせを指す。SELEX法は、特定の標的またはバイオマーカーに対して高親和性を有するアプタマーを同定するために使用され得る。

0054

配列同一性:配列同一性は、本明細書で使用される場合、2つ以上の核酸配列との関連において、配列により共有される同一ヌクレオチド位置の数の関数(すなわち、%同一性=同一位置の数/位置の総数×100)であり、2つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入される必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較及び2つ以上の配列間におけるパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズム、例えばBLAST及びギャップ付きBLASTプログラムなどをそれらのデフォルトパラメータで使用して達成され得る(例えば、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403,1990;www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTにおけるBLASTNも参照のこと)。配列比較のために、典型的には1つの配列が試験配列を比較する参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定プログラムパラメータに基づき、参照配列と比較して試験配列(複数可)のパーセント配列同一性を算出する。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith及びWaterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman及びWunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson及びLipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988の類似法の検索により、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、サイエンス通り575、マディソンウィスコシン州のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)のコンピュータによる実行により、または目視検査(概して、Greene Publishing Assoc.及びWiley−Interscienceにより出版されたAusubel,F.M.et al.、Current Protocols in Molecular Biology(1987)を参照のこと)により実施され得る。本明細書で使用される場合、GDF11アプタマーなどの核酸のパーセント同一性について記載し、その配列が参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば約95%同一である場合、核酸配列が、参照核酸配列の各100ヌクレオチド当たり最大5つの点変異を含む可能性があること以外、核酸配列が参照配列と同一であることを意図する。換言すれば、核酸配列が参照核酸配列と少なくとも約95%同一である所望の核酸配列を得るためには、参照配列中のヌクレオチドの最大5%が欠失されてよい、もしくは別のヌクレオチドで置換されてよい、または参照配列中のヌクレオチド総数の最大5%に相当する、ある数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい(本明細書では挿入と称される)。所望の配列を生成するための参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5’末端もしくは3’末端位置で行われてよい、またはこれらの末端位置間のどこにでも、参照配列のヌクレオチド中に個々に散在させるか、もしくは参照配列内に1つ以上の連続した群で散在させるかのいずれかであってよい。

0055

SOMAmer:SOMAmerという用語は、本明細書で使用される場合、改善されたオフ速度特性を有するアプタマーを指す。SOMAmerは、あるいは遅いオフ速度修飾アプタマーとも称され、その全体が参照によって組み込まれる、「Method for Generating Aptamers with Improved Off−Rates」と題した米国特許出願公開第20090004667号明細書に記載される、改善されたSELEX方法により選択されてよい。いくつかの実施形態では、遅いオフ速度アプタマー(疎水性修飾を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含むアプタマーを含む)は、≧2分、≧4分、≧5分、≧8分、≧10分、≧15分≧30分、≧60分、≧90分、≧120分、≧150分、≧180分、≧210分、または≧240分のオフ速度(t1/2)を有する。

0056

標的分子:「標的」、「標的分子」、及び「アナライト」は、本明細書において同じ意味で使用され、試料中に存在する可能性のある関心対象の任意の分子を指す。この用語には、特定の分子に関する任意のわずかな変形、例えばタンパク質の場合、例えばアミノ酸配列のわずかな変形、ジスルフィド結合形成グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化など、または任意のその他の操作もしくは修飾、例えば分子の同一性を実質的に変更しない標識化成分との複合化などを含む。「標的分子(単数)」、「標的(単数)」、または「アナライト(単数)」は、分子または多分子構造の1つの種類または種のコピーの1セットを指す。「標的分子(複数)」、「標的(複数)」、及び「アナライト(複数)」は、分子または多分子構造の2つ以上の種類または種を指す。例示的な標的分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖糖タンパク質ホルモン受容体抗原、抗体、アフィボディ抗体模倣体ウイルス病原体有害物質、基質、代謝産物遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、染料栄養素増殖因子細胞、組織、及び前述したもののいずれかの任意の断片または部分が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的分子はタンパク質であり、その場合に標的分子は、「標的タンパク質」と称されてよい。

0057

ポリアニオン性阻害剤:ポリアニオン性阻害剤は、核酸分子のポリアニオン性リン酸骨格を含む、または模倣する阻害剤分子である。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性阻害剤は、結合条件ストリンジェンシーを高めるためにアプタマーとの結合反応物中に含まれる。非限定的で例示的なポリアニオン性阻害剤としては、デキストラン硫酸、ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、dNTPなどが挙げられる。

0058

Z−ブロック:Z−ブロックは、本明細書で使用される場合、配列5’−(AC−BndU−BndU)7−AC−3’(式中、BndUは、ベンジル置換デオキシウリジン残基を示す)の一本鎖オリゴヌクレオチドである。Z−ブロックは、従来のホスホロアミダイト化学を使用して合成されてよい。

0059

本明細書で提供される範囲は、その範囲内の値全ての省略表現であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲(加えて、その内容に別段の明確な指示がない限り、その分数)を含むと理解される。いずれの濃度範囲パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲も、別段の指示がない限り、列挙される範囲内のいずれの整数、ならびに適切な場合、その分数(整数の10分の1及び100分の1など)の値も含むと理解されるだろう。また、任意の物理的特徴、例えばポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどに関する、本明細書で列挙される数値範囲のいずれも、別段の指示がない限り、列挙される範囲内のいずれの整数も含むと理解されるだろう。本明細書で使用される場合、「about(約)」または「consisting essentially of(から本質的になる)は、別段の指示がない限り、示される範囲、値、または構造の±20%を意味する。本明細書で使用される場合、「include(含める)」及び「comprise(含む)」という用語はオープンエンド形式であり、同義語として使用される。「a」及び「an」という用語は、本明細書で使用される場合、列挙される成分のうち「one or more(1つ以上)」を指すと理解されるべきである。代替物の使用(例えば、「or(または)」)は、代替物のうち1つ、両方、またはその任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。

0060

II.概要
A.増殖分化因子11(GDF11)及びミオスタチン(GDF8)タンパク質
GDF11及びミオスタチンの天然成熟型はホモ二量体であり、配列アラインメントにより約90%同一であり、109のアミノ酸残基のうち98がマッチングする。GDF11(タンパク質ID095390;アミノ酸1〜407;配列番号:4)及びミオスタチン(タンパク質ID014793;アミノ酸1〜375;配列番号:5)のアミノ酸配列アラインメント、灰色のバーで示される成熟型を参照のこと。GDF11及びミオスタチンプレプロペプチドのアミノ酸配列のアラインメントは、以下に示される。成熟タンパク質部分は、灰色のバーで強調表示される。

0061

0062

GDF11及びGDF8は、共通祖先及び共通の制御機構を共有すると考えられているが、それらの組織特異性(それぞれ、主として心臓及び筋肉)に関して分岐している。

0063

成熟GDF11は、ヒトとマウスとでは100%同一であり、ラットでは99%同一である。ヒト、マウス及びラットGDF11タンパク質(成熟)のアミノ酸配列アラインメントは、以下に示される。ヒトGDF11タンパク質IDは、O95390であり;例示的なヒト成熟GDF11は、以下に示される;配列番号:6)。マウスGDF11タンパク質IDは、Q9Z1W4であり;例示的なマウス成熟GDF8は、以下に示される;配列番号:7)。ラットGDF11タンパク質IDは、Q9Z217であり;例示的なラット成熟GDF8は、以下に示される;配列番号:8)。

0064

0065

ミオスタチン(GDF8)は、ヒト、マウス、及びラットとでは100%同一である。ヒト、マウス及びラットミオスタチンタンパク質(成熟)のアミノ酸配列アラインメントは、以下に示される。ヒトミオスタチン(GDF8)タンパク質IDは、O14793であり;例示的なヒト成熟GDF8は、以下に示される;配列番号:9)。マウスGDF8タンパク質IDは、O08689であり;例示的なマウス成熟GDF8は、以下に示される;配列番号:10)。ラットGDF11タンパク質IDは、O35312であり;例示的なラット成熟GDF8は、以下に示される;配列番号:11)。

0066

0067

B.SELEX
SELEXは一般に、核酸の候補混合物を調製すること、この候補混合物と所望の標的分子とを結合させて親和性複合体を形成すること、この親和性複合体を非結合候補核酸から分離すること、核酸を親和性複合体から分離及び単離すること、この核酸を精製すること、ならびに特異的アプタマー配列を同定することを含む。このプロセスは、選択されたアプタマーの親和性をさらに改良するために複数のラウンドを含んでよい。このプロセスは、プロセス中に1回以上の時点で増幅ステップを含み得る。例えば、「Nucleic Acid Ligands」と題した米国特許第5,475,096号明細書を参照のこと。SELEX法は、その標的と非共有結合するアプタマーに加えて、その標的と共有結合するアプタマーを生成するために使用され得る。例えば、「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi−SELEX」と題した米国特許第5,705,337号明細書を参照のこと。

0068

SELEX法は、改善された特性、例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達特性などをアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを同定するために使用され得る。このような修飾の例としては、リボース位置及び/またはリン酸位置及び/または塩基位置での化学的置換が挙げられる。SELEX法で同定される、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、「High Affinity Nucleic Acid LigandsContaining Modified Nucleotides」と題した米国特許第5,660,985号明細書に記載され、これはピリミジンの5’位及び2’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載している。米国特許第5,580,737号明細書(上記を参照のこと)は、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、及び/または2’−O−メチル(2’−OMe)で修飾された1つ以上のヌクレオチドを含有する非常に特異的なアプタマーについて記載している。「SELEX and PHOTOSELEX」と題した米国特許出願公開第20090098549号明細書も参照し、これは拡張された物理的及び化学的特質を有する核酸ライブラリーならびにSELEX及び光SELEXにおけるそれらの使用について記載している。

0069

SELEXはまた、望ましいオフ速度特性を有するアプタマーを同定するために使用され得る。「Method for Generating Aptamers with Improved Off−Rates」と題した米国特許出願公開第20090004667号明細書を参照し、これは標的分子に結合し得るアプタマーを生成する改善されたSELEX方法について記載している。前述のように、これらの遅いオフ速度アプタマーは、「SOMAmer」として知られている。それらの各標的分子からの解離速度がより遅いアプタマーまたはSOMAmer及び光アプタマーまたはSOMAmerを作製する方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させること、核酸−標的複合体の形成を発生させること、及び遅いオフ速度濃縮プロセスを実施することを含み、解離速度が速い核酸−標的複合体は解離して再形成されないだろうが、解離速度が遅い複合体はインタクトなままであるだろう。さらに、この方法は、改善されたオフ速度性能を有するアプタマーまたはSOMAmerを生成するための、候補核酸混合物の作製における修飾ヌクレオチドの使用を含む。

0070

このアッセイ変形形態は、アプタマーがそれらの標的分子と共有結合する、または「光架橋する」ことを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを用いる。例えば、「Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip」と題した米国特許第6,544,776号明細書を参照のこと。これらの光反応性アプタマーは、光アプタマーとも称される。例えば、その各々が「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligandsby Exponential Enrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX」と題される米国特許第5,763,177号明細書、米国特許第6,001,577号明細書、及び米国特許第6,291,184号明細書を参照のこと;また例えば、「Photoselection of Nucleic Acid Ligands」と題した米国特許第6,458,539号明細書も参照のこと。マイクロアレイを試料と接触させ、光アプタマーがそれらの標的分子と結合する機会を得た後、光アプタマーを光活性化し、固体支持体を洗浄して非特異的結合分子をいずれも除去する。激しい洗浄条件が使用されてよく、その理由としては、光アプタマーに結合する標的分子は、光アプタマー上の光活性化官能基(複数可)により作製される共有結合ゆえに一般に除去されないからである。

0071

これらのアッセイ形式の両方で、アプタマーまたはSOMAmerは、試料と接触させる前に固体支持体上に固定化される。しかしながら、ある種の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーまたはSOMAmerの固定化は、最適なアッセイを提供しない場合がある。例えば、アプタマーまたはSOMAmerをあらかじめ固定化すると、固体支持体表面上でのアプタマーまたはSOMAmerと標的分子との混合が非効率的となる場合があり、これがおそらく反応時間の長期化につながり、それゆえ、アプタマーまたはSOMAmerとそれらの標的分子との効率的な結合を可能にするためにインキュベーション時間の延長につながる。さらに、光アプタマーまたは光SOMAmerがアッセイで用いられる場合、固体支持体として利用される材料に応じて、固体支持体は、光アプタマーまたは光SOMAmerとそれらの標的分子との間に共有結合の形成をもたらすために使用される光を散乱させる、または吸収する傾向がある場合もある。さらに、用いられる方法に応じて、それらのアプタマーまたは光SOMAmerに結合した標的分子の検出は、固体支持体表面が、使用されるいずれの標識化剤にも曝露されてこれらの影響を受ける場合もあるため、不正確になりやすい可能性がある。最後に、固体支持体上でのアプタマーまたはSOMAmerの固定化は、一般に試料へのアプタマーまたはSOMAmerの曝露前にアプタマーまたはSOMAmer調製ステップ(すなわち、固定化)を含み、この調製ステップは、アプタマーまたはSOMAmerの活性または官能性に影響を及ぼす場合がある。

0072

SOMAmerが溶液中でその標的を捕捉することを可能にし、次いで検出前にSOMAmer−標的混合物の特定の成分を除去するように設計された分離ステップを用いるSOMAmerアッセイもまた、記載されている(「Multiplexed Analyses of Test Samples」と題した、米国特許出願公開第20090042206号明細書を参照のこと)。記載されているSOMAmerアッセイ方法は、核酸(すなわち、SOMAmer)を検出及び定量化することにより、試験試料中における非核酸標的(例えば、タンパク質標的)の検出及び定量化を可能にする。記載されている方法は、非核酸標的を検出及び定量化するための核酸代用物(すなわち、SOMAmer)を作製し、それにより増幅を含む多種多様な核酸技術が、タンパク質標的を含む、より広範囲な所望の標的に適用されることを可能にする。

0073

標的がペプチドであるSELEX法の実施形態は、「Modified SELEX Processes Without Purified Protein」と題した米国特許第6,376,190号明細書に記載されている。本明細書の場合、標的はGDF11タンパク質である。

0074

C.化学修飾アプタマー
アプタマーは、その特質及び特性を改善する修飾ヌクレオチドを含有してよい。このような改善の非限定的例としては、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び/または送達特性の改善が挙げられる。

0075

このような修飾の例としては、ヌクレオチドのリボース位置及び/またはリン酸位置及び/または塩基位置での化学的置換が挙げられる。SELEX法で同定される、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、「High Affinity Nucleic Acid LigandsContaining Modified Nucleotides」と題した米国特許第5,660,985号明細書に記載され、これはピリミジンの5’位及び2’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載している。米国特許第5,580,737号明細書(上記を参照のこと)は、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、及び/または2’−O−メチル(2’−OMe)で修飾された1つ以上のヌクレオチドを含有する非常に特異的なアプタマーについて記載している。「SELEX and PHOTOSELEX」と題した米国特許出願公開第20090098549号明細書も参照し、これは拡張された物理的及び化学的特質を有する核酸ライブラリーならびにSELEX及び光SELEXにおけるそれらの使用について記載している。

0076

C−5修飾の具体例としては、デオキシウリジンのC−5位での、すぐ下で示されるようなベンジルカルボキシアミド(あるいはベンジルアミノカルボニル)(Bn)、ナフチルメチルカルボキシアミド(あるいはナフチルメチルアミノカルボニル)(Nap)、トリプタミノカルボキシアミド(あるいはトリプタミノカルボニル)(Trp)、及びイソブチルカルボキシアミド(あるいはイソブチルアミノカルボニル)(iBu)から独立して選択される置換基による置換が挙げられる。

0077

0078

C−5修飾ピリミジンの化学修飾はまた、2’−位の糖修飾、環外アミンにおける修飾、及び4−チオウリジンの置換などと、単独でまたは任意の組み合わせで組み合わされ得る。

0079

代表的なC−5修飾ピリミジンとしては、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−0−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−0−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−0−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium))プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−0−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンまたは5−(N−[l−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)が挙げられる。

0080

存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドの組み立て前または組み立て後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合後、例えば標識化成分との複合化などによりさらに修飾され得る。

0081

本開示の核酸配列に組み込まれてよい修飾ヌクレオチド(例えば、C−5修飾ピリミジン)の追加の非限定的例としては、以下のものが挙げられる:

0082

R’は、以下の通りに定義される:

0083

また、R’’、R’’’及びR’’’’は、以下の通りに定義される:
式中、
R’’’’は、分岐鎖または直鎖低級アルキル(C1〜C20);ハロゲン(F、Cl、Br、I);ニトリル(CN);ボロン酸(BO2H2);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’);一級アミド(CONH2);二級アミド(CONHR’’);三級アミド(CONR’’R’’’);スルホンアミド(SO2NH2);N−アルキルスルホンアミド(SONHR’’)からなる群から選択される。
式中、
R’’、R’’’は、分岐鎖または直鎖低級アルキル(C1〜C2));フェニル(C6H5);R’’’’置換フェニル環(R’’’’C6H4)(式中、R’’’’は上で定義される);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’’’’)(式中、R’’’’’は分岐鎖または直鎖低級アルキル(C1〜C20)である);及びシクロアルキルからなる群から独立して選択され、式中、R’’=R’’’=(CH2)nであり;式中、n=2〜10である。

0084

さらなるC−5修飾ピリミジンヌクレオチドとしては、以下のものが挙げられる:

0085

0086

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アプタマーにヌクレアーゼ耐性を付与する。C−5位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの一例である。修飾としては、骨格修飾、メチル化、珍しい塩基対合の組み合わせ、例えばイソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどを挙げることができる。修飾としては、キャッピングなどの3’及び5’修飾も挙げることができる。その他の修飾としては、天然に存在するヌクレオチドのうち1つ以上と類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)による修飾及び荷電連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)による修飾、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレンなど)による修飾、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、ならびに修飾連結(例えば、アルファアノマー核酸など)による修飾などを挙げることができる。さらに、通常はヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれも、ホスホネート基もしくはリン酸基によって置き換えられてよい;標準的な保護基によって保護されてよい;または追加のヌクレオチドもしくは固体支持体への追加の連結を調製するために活性化されてよい。5’末端及び3’末端のOH基はリン酸化され得る、またはアミン、約1〜約20の炭素原子の有機キャッピング基部分、一実施形態では、約10〜約80kDaの範囲のポリエチレングリコール(PEG)ポリマー、別の実施形態では、約20〜約60kDaの範囲のPEGポリマー、もしくはその他の親水性もしくは疎水性生体ポリマーもしくは合成ポリマーで置換され得る。一実施形態では、修飾は、ピリミジンのC−5位のものである。これらの修飾は、C−5位に直接アミド連結することにより、またはその他の種類の連結により作製され得る。

0087

アプタマーはまた、一般に当該技術分野において既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有し、2’−0−メチル−、2’−0−アリル、2’−フルオロ−または2’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、a−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドなどを含み得る。上述の通り、1つ以上のホスホジエステル連結が、代替連結基によって置き換えられてよい。これらの代替連結基としては、リン酸がP(0)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(0)NR2(「アミデート」)、P(0)R、P(0)OR’、COまたはCH2(「ホルムアセタール」)(式中、各RまたはR’は独立してHである、またはエーテル(−0−)連結を場合により含有する置換もしくは非置換アルキル(1〜20のC)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルである)によって置き換えられる実施形態が挙げられる。アプタマー中の全ての連結が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替骨格構造のように、最終生成物の設計に有利であり得る。

0088

アプタマー中に含まれてよい、または組み込まれてよいC−5修飾ピリミジンの具体例としては、本明細書の構造が挙げられるが、これらに限定されない。構造に使用される命名規則は、Xが−H(すなわち、DNA)であることを前提としているが、それらはまた、Xが−OH(RNA)、または本明細書に記載されるその他の置換基(例えば、−OCH3;−O−アリル;−F、−OEt;−OPr、−NH2;−アジドもしくは−OCH2CH2OCH3)であってよく、R’は、−H;−OAc;−OBz;−OCH2CH2OCH3及び−OSiMe2tBuであってよく、R’’は、−H;DMT及び三リン酸(−P(O)(OH)−O−P(O)(OH)−O−P(O)(OH)2)、ならびにそれらの塩であってよい構造を包含する。

0089

例示的なNapdU構造(5−[N−(1−ナフチルメチル)カルボキサミド]−2’−デオキシウリジン):

0090

0091

例示的な2NapdU構造(5−[N−(2−ナフチルメチル)カルボキサミド]−2’−デオキシウリジン):

0092

0093

例示的なPPdU構造(5−[N−(フェニル−3−プロピル)カルボキサミド]−2’−デオキシウリジン):

0094

0095

例示的なTrpdU構造(5−[N−(3−インドール−2−エチル)カルボキサミド]−2’−デオキシウリジン):

0096

0097

例示的な2NEdU構造5−[N−(2−ナフチル−2−エチル)カルボキサミド]−2’−デオキシウリジン):

0098

0099

以下の実施例は、ある種の特定の特徴及び/または実施形態を示すために提供される。これらの実施例は、本開示を記載される特定の特徴または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。

0100

D.例示的なGDF11アプタマー
GDF11と結合するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、10nM未満の親和性でGDF11と結合する。いくつかのこのような実施形態では、アプタマーは、両方の親和性が同じ結合条件下で測定される場合、GDF11に対する親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、0.5nM〜10nMの親和性でGDF11と結合し、50nM超、または100nM超、または150nM超、または200nM超、または300nM超の親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、アプタマーが10nM未満の親和性でGDF11と結合する場合と同じ条件下でGDF8と結合しない。いくつかの実施形態では、アプタマーは、8nM未満、もしくは7nM未満、もしくは6nM未満、もしくは5nM未満、もしくは4nM未満、もしくは3nM未満、もしくは2nM未満、もしくは1nM未満;または0.1nM〜10nM、0.1nM〜8nM、もしくは0.1nM〜5nMの親和性でGDF11と結合する。

0101

いくつかの実施形態では、親和性は、本明細書に記載されるアッセイを使用して決定される。いくつかの実施形態では、親和性は、ポリアニオン性阻害剤の存在下で決定される。非限定的で例示的なポリアニオン性阻害剤は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、親和性は、Zブロックの存在下で決定される。
いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、配列:
5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC− 3’(配列番号:110)(式中:
各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;
Rは、AまたはGであり;
各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;
各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;
Sは、GまたはCであり;
各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;
各mは独立して、かつ各存在について0または1である)を含む。

0102

いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、
a)5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:111);
b)5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:112);及び
c)5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC−3’(配列番号:113)
(式中、R、W、P、M、S、n、及びmは、上記の通りに定義される)から選択される配列を含む。

0103

いくつかの実施形態では、RがGである場合、最初のWはAである;またはRがAである場合、最初のWはCである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのnが、0である。いくつかの実施形態では、各nは0である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つのnが、1である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのmが、1である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのmが、0である。

0104

いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーが提供され、このアプタマーは、配列5’−CPPGMPPP−3’(配列番号:114)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、式中、MはCまたはAである)を含む。いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーが提供され、このアプタマーは、配列5’−PPPAGC−3’(配列番号:115)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンである)を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列5’−CPPGMPPPNxPPPAGC−3’(配列番号:116)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、式中、xは2、3、4、または5であり、式中、MはCまたはAであり、式中、各Nは独立して、かつ各存在についてA、C、G、T、及びUから選択される)を含む。いくつかのこのような実施形態では、xは3または4である。いくつかの実施形態では、Nxは、配列5’−AAG−3’または5’−ACG−3’または5’−AGG−3’を含む。

0105

いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、配列5’−NNCPPGRPPPAMGPPPAGS−3’(配列番号:141)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり、RはAまたはGであり;各Nは独立して、かつ各存在についてA、G、またはCであり;MはAまたはCであり;SはGまたはCである)を含む。

0106

本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、各Pは、本明細書に記載されるC−5修飾ピリミジンから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Pは、 5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのPは各々、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから独立して選択される。

0107

いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、配列番号:12、13、15〜109、及び117〜140から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、配列番号:12、15、26、105〜109、及び142〜150から選択される配列を含む。

0108

いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、最大約100のヌクレオチド、最大約95のヌクレオチド、最大約90のヌクレオチド、最大約85のヌクレオチド、最大約80のヌクレオチド、最大約75のヌクレオチド、最大約70のヌクレオチド、最大約65のヌクレオチド、最大約60のヌクレオチド、最大約55のヌクレオチド、最大約50のヌクレオチド、最大約45のヌクレオチド、最大約40のヌクレオチド、最大約35のヌクレオチド、最大約30のヌクレオチド、最大約25のヌクレオチド、及び最大約20のヌクレオチドを含んでよい。

0109

本開示の別の態様では、GDF11アプタマーは、配列番号:1または2のいずれかと少なくとも約95%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約80%同一、または少なくとも約75%同一であってよい。別の実施形態では、GDF11アプタマーは、配列番号:1または2のいずれかの配列、及びその断片を含む。関連の態様では、その断片は、約25〜49のヌクレオチド長(または約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48もしくは49のヌクレオチド長)である。

0110

本開示の別の態様では、GDF11アプタマーは、約10nM以下のGDF11に対する解離定数(Kd)を有する。別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約15nM以下のGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。さらに別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約20nM以下のGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。さらに別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約25nM以下のGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。さらに別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約30nM以下のGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。さらに別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約35nM以下のGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。さらに別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約40nM以下のGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。さらに別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約45nM以下のGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。さらに別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約50nM以下のGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。さらに別の例示的実施形態では、GDF11アプタマーは、約3〜10nMの範囲(または3、4、5、6、7、8、9もしくは10nMのGDF11タンパク質に対する解離定数(Kd)を有する。好適な解離定数は、マルチポイント滴定を使用し、本明細書に記載されるような式y=(最大−最小)(タンパク質)/(Kd+タンパク質)+最小にフィッティングする結合アッセイを用いて決定され得る。その他の実施形態では、GDF11アプタマーは、配列番号:12の配列を含むアプタマーのKd以下のKdを有するアプタマーである。

0111

いくつかの実施形態では、アプタマーは、検出可能な標識を含む。

0112

GDF11を検出する方法
いくつかの実施形態では、試料中のGDF11を検出する方法が提供され、これは試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、GDF8の存在下でGDF11を検出または定量化する方法が提供され、これはGDF11とGDF8の両方を含有すると推測される試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、試料中のGDF11をGDF8と区別する方法が提供され、これは試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ポリアニオン性阻害剤の存在下で試料を本明細書に記載されるGDF11アプタマーと接触させることを含む。

0113

GDF11アプタマーが結合したGDF11を検出及び/または定量化することは、当該技術分野における方法及び/または本明細書に記載される方法を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、固体支持体に結合される、または固体支持体上に捕捉されてよい結合対メンバーを含む(例えば、ビオチン化アプタマーが、ストレプトアビジンを含む固体支持体に結合されてよい)。

0114

GDF11アプタマー組成物を含むキット
本開示は、本明細書に記載されるGDF11アプタマーのいずれかを含むキットを提供する。このようなキットは、例えば、(1)少なくとも1種のGDF11アプタマー;及び(2)少なくとも1種の薬学的に許容される担体、例えば溶媒または溶液などを含み得る。追加のキット成分は、例えば:(1)本明細書で同定される薬学的に許容される賦形剤、例えば安定剤、緩衝剤などのいずれか、(2)キット成分を保持及び/または混合するための少なくとも1種の容器バイアルまたは類似の装置;ならびに(3)送達装置を場合により含み得る。

0115

実施例1:GDF11結合特異性を有するアプタマーの選択及び同定
本実施例は、成熟GDF11タンパク質と結合するアプタマーの選択及び作製の代表的な方法を提供する。

0116

GDF11に対して特異性を有するアプタマーを選択するという以前の試みは、困難であった。SELEX法を使用して選択したいくつかのアプタマーの、GDF11及びミオスタチン(GDF8)に対するタンパク質結合親和性の比較を、以下の表1に示す。

0117

0118

表1に示すように、GDF11と結合するよう選択したアプタマーは一般に、ミオスタチンに対する親和性も有した。各アプタマーについてのGDF11対ミオスタチンの結合親和性比も表1に示す。比は、1(1)未満(すなわち、アプタマーは、GDF11と比較してミオスタチンにより高い親和性を有した)から、約1.6〜約6.3の比(すなわち、アプタマーは、ミオスタチンと比較してGDF11により高い親和性を有した)まで変動している。しかしながら、これらの親和性の差は、タンパク質結合アッセイにおいてGDF11とミオスタチンとを判別するのに十分ではない。結果として、GDF11及びGDF8の存在及び/またはレベルを区別することはできない。GDF11とミオスタチンとを判別することができるGDF11アプタマーを同定することの問題を考慮して、対抗選択戦略をSELEX法に導入した。

0119

遅いオフ速度濃縮プロセスを用いたアプタマー選択
GDF11を用いるSELEXを、本明細書に記載されるSELEX方法を使用して実施した。加えて、異なる2種類の対抗選択を含むプロトコール変更を、ミオスタチンと結合しない、またはミオスタチンよりもGDF11に対してより高い親和性を有するGDF11アプタマーを選択するために適用した:すなわち、受動的対抗選択及び能動的対抗選択。

0120

受動的対抗選択をタグ無し型の望ましくない標的(ミオスタチン)を用いて、選択中にその標的をPCB(プロトロンビンカゼイン及びアルブミンを含有するタンパク質競合緩衝剤)に添加することにより行い、ミオスタチンよりもGDF11への選好欠く配列を除去した。ミオスタチン対GDF11の比は、第1ラウンドで1:1(各100pmol)、第2ラウンドで2:1(20pmolのミオスタチン及び10pmolのGDF11)であって、GDF11標的濃度が減少したため、SELEXのその後のラウンドで増加した(20pmolのミオスタチン及び0.3pmolのGDF11または約67:1)。

0121

能動的対抗選択を、ストレプトアビジン(SA)ビーズ上に固定化したビオチン化ミオスタチンを用いて行った。SELEXの各ラウンド前に、ライブラリーを37℃で振盪しながら10分間対抗選択ビーズでインキュベートした。次いで、上清回収してGDF11を含む選択物に移し、ビーズ上にミオスタチンと結合する配列を残した。第1ラウンドでは、1000pmolのライブラリーを対抗選択するために100pmolのミオスタチンを使用し、その後の各ラウンドでは、およそ20〜50pmolのライブラリーを対抗選択するために20pmolのミオスタチンを使用した。

0122

候補混合物の調製
部分的にランダム化したssDNAオリゴヌクレオチドの候補混合物を、ビオチン化ssDNA鋳型アニーリングしたDNAプライマーポリメラーゼ伸長により調製した(以下の表2に示す)。候補混合物は、dATP、dGTP、dCTP及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン三リン酸(NapdUTP)を含有する40ヌクレオチドのランダム化カセットを含有した。

0123

0124

ミリリットルのStreptavidin Plus UltraLink樹脂(PIERCE)の50%スラリーを、2.5mLの20mMのNaOHで1回、2.5mLのSB18T0.05(NaOHでpH7.5に調整した40mMのHEPES(4−(2−ヒドロキシエチルピペラジン−1−エタンスルホン酸緩衝液、102mMのNaCl、5mMのKCl、5mMのMgCl2及び0.05%のTWEEN20)で2回、ならびに2.5mLの16mMのNaClで2回洗浄した。2つのビオチン残基(配列中でB’として示される)及び40のランダム化位置(配列中でN40として示される)を有する、80ナノモルの鋳型1(配列番号:1)を、洗浄したUltraLink SAビーズに添加し、37℃で2.5時間回転させた。次いで、ビーズを16mMのNaClで3回洗浄した。各洗浄の合間に、ビーズを遠心分離により回収した。その時点で捕捉した鋳型を含有するビーズを、80nmolのプライマー(配列番号:2)、1倍SQ20緩衝液(120mMのTris−HCl、pH7.8、10mMのKCl、7mMのMgSO4、6mMの(NH4)2SO4、0.001%のBSA及び0.1%のTriton X−100)、470単位のKODXL DNA Polymerase(EMMILLIPORE)、ならびに各々1mMのdATP、dCTP、dGTP及びNapdUTPを含有する、3.75mLの伸長反応緩衝液中に懸濁した。ビーズを回転させながら68℃で2時間放置してインキュベートした。次いで、ビーズをSB18T0.01(上記のようなSB18であるが、0.01%のTWEEN−20を用いる)で1回、16mMのNaClで2回洗浄した。アプタマーライブラリーを、2.5mLの40mMのNaOHでビーズから溶出した。溶出したライブラリーを、50μLの中和剤(700mMのHCl、180mMのHEPES、0.45%のTWEEN−20)で直ちに中和した。溶出をさらに2回繰り返し、溶出液プールした。ライブラリーを、AMICON Ultracel YM−10フィルターでおよそ0.4mLまで濃縮し、ライブラリーの濃度を紫外吸光分光法により決定した。

0125

ヒトGDF11のビオチン標識
E.coli中での過剰発現後、ホモ二量体型に精製したタグ無し組換えヒトGDF11タンパク質(Peprotech、カタログ番号120−11)を、NHS−PEO4−ビオチン(PIERCE、EZ−Link NHS−PEG4−ビオチン)と、一級アミンを含有する残基との共有結合によりビオチン化した。タンパク質(80μL中に1600pmol)を4倍モル過剰のNHS−PEG4−ビオチンと混合し、反応物を20℃で1時間放置してインキュベートした。反応が完了した後、未反応のNHS−PEG4−ビオチンを、緩衝液をSB18T0.05に交換してからZeba(商標スピン脱塩カラム(PIERCE)を使用して除去した。

0126

ヒトミオスタチンのビオチン標識化
E.coli中での過剰発現後、ホモ二量体型に精製したタグ無し組換えヒトミオスタチンタンパク質(Peprotech、カタログ番号120−00)を、上に記載の通りにビオチン化した。

0127

ミオスタチンの固定化
MYONE−SA常磁性ビーズ(MYONE SA、INVITROGEN、または以後SAビーズと称する)を、14mLの20mMのNaOHで1回、14mLのSB18T0.05で2回ビーズを洗浄することにより調製した。最後に、SAビーズをSB18T0.05中に10mg/mLで懸濁し、使用するまで4℃で保存した。ビオチン標識ミオスタチンタンパク質(500pmol)を、SELEXの全てのラウンドのために固定化した。これは、SAビーズ(5mg)をビオチン標識ミオスタチン(500pmol)と30分間振盪しながら混合し、続いてSB18T0.05で3回洗浄することにより達成した。SA−ミオスタチンビーズを0.5mLのSB18T0.05中に再懸濁し(1μMのミオスタチンが結合した10mg/mLのビーズ)、使用するまで4℃で保存した。

0128

遅いオフ速度濃縮プロセスを用いたアプタマー選択
合計で11ラウンドのSELEX法を、親和性及び遅いオフ速度についての選択により完了した。各ラウンド前に、対抗選択を実施してバックグラウンドを減少させ、タンパク質に非特異的に結合するアプタマーを得る可能性を減少させた。加えて、異なる種類の対抗選択を適用し、密接に関連した90%同一のタンパク質ミオスタチンと結合しないGDF11アプタマーの選択を進めた。対抗選択を以下の通りに実施した。

0129

ラウンド1では、SB18T0.05中の、およそ1nモルのDNAを含有する100μLのDNA候補混合物を95℃で5分間加熱し、次いで70℃まで5分間冷却し、次いで48℃まで5分間冷却して、次いで37℃のブロックに5分間移した。次いで、試料を10μLのタンパク質競合混合物及び1mg(100μL)の対抗選択ビーズと混合し、混合しながら37℃で10分間インキュベートした。ビーズを磁気分離により除去した。タンパク質競合混合物及び対抗選択ビーズを、以下の通りに構成した。標準的なSELEXでは、10μLの標準的なタンパク質競合混合物(SB18T0.05中に0.1%のHSA、10μMのカゼイン、及び10μMのプロトロンビン)、ならびに1mg(100μL)のSAビーズを使用した。受動的対抗選択を用いるSELEXでは、10μLの変更タンパク質競合混合物(SB18T0.05中に0.1%のHSA、10μMのカゼイン、10μMのプロトロンビン、及び10μMの非標識ミオスタチン)ならびに1mg(100μL)のSAビーズを使用した。能動的対抗選択を用いるSELEXでは、10μLの標準的なタンパク質競合混合物(SB18T0.05中に0.1%のHSA、10μMのカゼイン、及び10μMのプロトロンビン)、ならびに1mg(100μL)のSA−ミオスタチンビーズ(1μMのミオスタチンが結合したSAビーズ)を使用した。

0130

ラウンド2〜11では、前のラウンドから得られた68μLアリコートのDNA候補混合物(前のラウンドから得られたeDNAの68%)を、13μLの5倍SB18T0.05と混合した。試料を95℃まで3分間加熱し、0.1℃/秒の速度で37℃まで冷却した。次いで、試料を9μLのタンパク質競合混合物(SB18T0.05中に0.1%のHSA、10μMのカゼイン、及び10μMのプロトロンビン)、ならびに0.1mg(10μL)のSAビーズと混合し、混合しながら37℃で10分間インキュベートした(標準的なSELEX)。ラウンド1におけるように、タンパク質競合混合物に10μMの非標識ミオスタチンを補充し(受動的対抗選択を用いるSELEX)、SA−ミオスタチンビーズ(1μMのミオスタチンが結合したSAビーズ)をSAビーズの代わりに使用した(能動的対抗選択を用いるSELEX)。ビーズを磁気分離により除去した。

0131

最初の対抗選択後、標的タンパク質をラウンド1選択プロセスのためにSAビーズ上にあらかじめ固定化した。これを達成するために、0.5mgのSAビーズを50pモルのビオチン標識標的タンパク質(GDF11ホモ二量体)と混合し、振盪しながら30分間37℃でインキュベートした。非結合標的を、ビーズをSB18T0.05で2回洗浄することにより除去した。対抗選択したDNA候補混合物(100μL)をビーズに添加し、混合しながら37℃で60分間インキュベートした。第1ラウンドでは、遅いオフ速度濃縮プロセスを用いずに、ビーズを100μLのSB18T0.05で2分間ずつ5回簡単に洗浄した。洗浄後、結合したアプタマーを、45μLの8mMのNaOHを添加して混合しながら37℃で5分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。アプタマー含有溶出液(40μL)を、ビーズの磁気分離後に新しいチューブに移した。溶出を、45μLの8mMのNaOHを用いて混合しながら37℃で5分間インキュベートしてもう一度繰り返した。溶出液を混合し(80uL)、溶液を20μLの32mMのHCl及び2μLのTris−HCl、pH7.5を添加することにより中和した。

0132

ラウンド2〜11では、選択を以下に記載されるようにDNA候補混合物及び標的タンパク質を用いて実施したが、並行して同一の選択を、DNA候補混合物は用いたが標的タンパク質は用いることなく実施した。標的タンパク質を含む試料(シグナルS)及び標的タンパク質を含まない試料(バックグラウンドB)についてPCRから得られたCt値の比較を目安として使用し、次のラウンドの標的濃度を減少させた。デルタCt値が4超であるが、8未満であった場合、標的タンパク質を次のラウンドでは3分の1に減少させた。デルタCt値が8超であった場合、標的を次のラウンドでは10分の1に減少させた。

0133

これらのスキーム後、標準的なSELEXラウンド後のGDF11濃度の減少は、3分の1(ラウンド5〜6)、10分の1(ラウンド7〜8)、30分の1(ラウンド9〜10)、及び100分の1(ラウンド11)であった。受動的対抗選択を用いる選択では、標的濃度の減少は、3分の1(ラウンド5〜6)、10分の1(ラウンド7〜10)、及び30分の1(ラウンド11)であった。能動的対抗選択を用いる選択では、標的濃度の減少は、3分の1(ラウンド5〜6)、10分の1(ラウンド7)、30分の1(ラウンド8〜10)、及び100分の1(ラウンド11)であった。「RX」(式中、Xは数値)は、SELEXのラウンド数を表す(例えば、R3は、SELEXのラウンド3を示す)。

0134

0135

ラウンド2では、標識標的タンパク質(10μL中に5pモルのGDF11ホモ二量体)を40μLの対抗選択したDNA候補混合物と混合し、37℃で15分間インキュベートした。遅いオフ速度濃縮プロセスを、50μLの10mMのデキストラン硫酸を添加し、続いて直ちに0.1mgのSAビーズを添加することにより開始した。これを、混合しながら15分間37℃で放置してインキュベートした。次いで、ビーズを100μLのSB18T0.05で5回洗浄した。アプタマー鎖を、105μLの過塩素酸ナトリウム溶出緩衝液(1.8MのNaClO4、40mMのPIPES、pH6.8、1mMのEDTA、0.05%のTriton X−100)を添加し、混合しながら37℃で10分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。ビーズを磁気分離により除去し、100μLのアプタマー溶出液を、プライマー捕捉ビーズ(12.5pmolのプライマー2(配列番号:2)が結合した25μLの2.5mg/mLのSAビーズ)を含有する新しいチューブに移し、混合しながら30分間50℃で放置してインキュベートした。次いで、ビーズを100μLのSB18T0.05で3回洗浄した。アプタマー鎖を、85μLの40mMのNaOHを添加することによりビーズから溶出し、溶出液(80μL)を20μLの160mMのHCl及び2μLの500mMのTris−HCl、pH7.5で中和した。

0136

ラウンド3〜11選択は、ビーズの添加前にデキストラン硫酸を15分(ラウンド3〜4)、30分(ラウンド5)、45分(ラウンド6)、60分(ラウンド7)、75分(ラウンド8)、または90分(ラウンド9〜11)添加した以外は、ラウンド2に記載されるように実施した。分割を、0.1mgのNeutravidin Coated Sera−Mag SpeedBeads(Fisher Scientific、カタログ番号09−981−155、もしくは以後NAビーズと称する、ラウンド3、5、7、9、11)を用いて、または0.1mgのSAビーズ(ラウンド4、6、8、10)を用いて行った。

0137

SELEXの11ラウンド後に得られたプールは、Ion Torrent ePCR及び配列決定保証する良好な活性を示した(表3)。各プールから、384の配列を比較配列分析、続く主要候補の結合アッセイのために得た。

0138

0139

アプタマー増幅及び精製
各ラウンドからの選択したアプタマーDNAをQPCRにより増幅し、定量化した。48μLのDNAを、12μLのQPCR混合物(5倍に希釈した10倍KODDNA Polymerase緩衝液;Novagen番号71157、25mMのMgCl2、10μMのフォワードPCRプライマー(プライマー1、配列番号:2)、10μMのビオチン化リバースPCRプライマー(プライマー2、配列番号:3)、5倍SYBR Green I、0.075U/μLのKOD XL DNA Polymerase、ならびに各々1mMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP)に添加し、BIO−RADMyIQPCR機器において次のプロトコール:96℃で15秒間、55℃で10秒間、及び68℃で30分間を1サイクル;続いて、96℃で15秒間、68℃で1分間を30サイクルで熱サイクルを行った。定量化を機器ソフトウェアで行い、標的タンパク質の有無にかかわらず、選択したDNAのコピー数を比較してシグナル/バックグラウンド比を決定した。

0140

増幅後、PCR産物をビオチン化アンチセンス鎖によりSAビーズ上で捕捉した。1.25mLのSAビーズ(10mg/mL)を14mLの20mMのNaOHで1回、14mLのSB18T0.05で2回洗浄し、1.25mLの3MのNaCl+0.05%のTWEEN中に再懸濁して4℃で保存した。25μLのSAビーズ(3MのNaCl中に10mg/mL)を50μLの二本鎖QPCR産物に添加し、混合しながら25℃で5分間インキュベートした。「センス」鎖を、100μLの40mMのNaOHを添加し、混合しながら37℃で5分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。溶出した鎖を廃棄し、ビーズをSB18Tで2回、16mMのNaClで1回洗浄した。

0141

NapdUTPを含有するアプタマーセンス鎖を、固定化アンチセンス鎖からのプライマー伸長により調製した。ビーズを40μLのプライマー伸長反応混合物(1倍プライマー伸長緩衝液(120mMのTris−HCl、pH7.8、10mMのKCl、7mMのMgSO4、6mMの(NH4)2SO4、0.1%のTRITON X−100及び0.001%のウシ血清アルブミン)、2.5μMのフォワードプライマー(プライマー1、配列番号:2)、各々0.5mMのdATP、dCTP、dGTP、及びNapdUTP、ならびに0.015U/μLのKODXL DNA Polymerase)に懸濁し、混合しながら68℃で60分間インキュベートした。ビーズをSB18T0.05で3回洗浄し、アプタマー鎖を、45μLの40mMのNaOHを添加し、混合しながら37℃で5分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。磁気分離後に40μLのアプタマー溶出液を新しいチューブに移し、溶出を、45μLの40mMのNaOHを用いて混合しながら37℃で5分間インキュベートしてもう一度繰り返した。溶出液を混合し(80uL)、溶液を20μLの160mMのHClで中和して、10μLの0.1MのHEPES、pH7.5で緩衝した。

0142

選択ストリンジェンシー及びフィードバック
選択ステップの標的タンパク質相対濃度を、以下の規則に従いQPCRシグナル(ΔCt)に応答して各ラウンドで低下させた。
ΔCt<4の場合、[P](i+1)=[P](i)
4≦ΔCt<8の場合、[P](i+1)=[P](i)/3.2
ΔCt≧8の場合、[P](i+1)=[P](i)/10
式中、[P]=タンパク質濃度、i=現ラウンド数。

0143

選択ラウンド後、濃縮DNA混合物の収束状態を決定した。10μLの二本鎖QPCR産物を1倍SYBR Green Iを含有する4mMのMgCl2で200μLまで希釈した。試料を、二本鎖オリゴヌクレオチド複合混合物ハイブリダイゼーション時間を測定するC0t分析を使用して収束について分析した。試料を、次のプロトコール:98℃で1分間、85℃で1分間を3サイクル;98℃で1分間、次いで85℃で30分間を2サイクルで熱サイクルを行った。85℃で30分の間に、蛍光画像を5秒間隔で測定した。蛍光強度を時間対数の関数としてプロットし、配列収束を示す、各SELEXラウンドでのハイブリダイゼーション速度の上昇を観察した。

0144

濃縮プール配列決定及びアプタマー同定
SELEXの11ラウンド後、収束したプールを配列決定した。配列調製を以下の通りに実施した。プールを、特有バーコードインデックス配列(各プールについての特有の配列識別子)を含有するSELEXライブラリー特異的プライマーを使用して、PCRにより増幅した。個々のPCR産物をQuant−iT(商標)PicoGreen(登録商標)dsDNA Reagent(LIFE TECHNOLOGIES)アッセイを使用して定量化し、等モル濃度で混合して、AMICON Ultra−0.5遠心式フィルターデバイス(MILLIPORE)を使用して濃縮/緩衝液交換を行った。次いで、混合物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により精製し、溶出液を、Amicon Ultra−0.5遠心式フィルターデバイスを使用して濃縮し、最終混合物のサイズ、純度及び収率を確認するためにPAGEで可視化した。試料を、Ion TorrentPGM配列決定のためにSeqWright Genomic Services(GEHEALTHCARE、ヒュストン、テキサス州)に提出した。40,000超の配列を含有する配列プールから、384をランダムに選択し、配列数/コピー数を決定し、かつローカルアラインメントアルゴリズムを使用して共通収束パターンを同定するカスタムソフトウェアを使用して収束について分析した。プール内最高表示/コピー数を有する配列及び全ての収束パターンから少なくとも1つの配列を、さらなる特徴付けのために選択した。留意することとして、「低い」配列クオリティスコア(すなわち、20以下のPhredクオリティスコア)を有した、SELEXアプタマープールからのこれらの配列読み取り結果は、配列分析及びモチーフ同定から除去した。

0145

機能アッセイによる及び減算配列分析によるアプタマー同定
収束パターン1を、GDF11及びミオスタチンを用いる比較結合アッセイにより配列12060−28_3(配列番号:12)及び12060−16_3(配列番号:13)から最初に同定した(実施例2を参照のこと)。配列中の「P」という文字は、NapdUを示す。
アプタマーID 12060−28_3:
5’−ccctgCGCCPPCGGACPPGCPPPAAGPPPAGCCGCPPGCPCACAPcacaa−3’(配列番号:12)
アプタマーID 12060−16_3:
5’−ccctgPGAGACPPGAPPPACGPPPAGCPGCPAACAPGGGGAACCAcacaa−3’(配列番号:13)

0146

並行して、収束パターン1を、異なるSELEX変形形態を用いて得られたプールからの配列の比較及び減算配列分析によりインシリコで同定した。これらは、プール12058(GDF11の標準的なSELEX)から768の配列、プール12060(受動的対抗選択を用いたGDF11 SELEX)から384の配列、プール12061(能動的対抗選択を用いたGDF11 SELEX)から384の配列、及びプール12059(ミオスタチンの標準的なSELEX)から384の配列を含んだ。これらの混合プール中における全ての配列の分析及びアラインメントを使用して、GDF11及びミオスタチンの無差別結合を示している、全てのプール中に存在する共通パターンを有する配列の優先度下げた(表4を参照のこと)。収束パターン1は、受動的対抗選択を用いたGDF11 SELEXからのプール12060中で高度に濃縮され(15%)、GDF11の標準的なSELEXからのプール12058中ではより低い存在量を有し(3%)、ミオスタチンの標準的なSELEXからのプール12059中には存在せず、これはGDF11特異性を示していた。

0147

0148

実施例2:GDF11と結合するアプタマーのサンドイッチSELEX
サンドイッチSELEXアッセイを使用し、GDF11と結合する2NEdU含有アプタマーを使用して追加のGDF11特異的アプタマーを同定した。サンドイッチSELEXは、WO2015/048084に記載されている。簡潔に述べると、SELEXを標的−アプタマー複合体(すなわち、2NEdU含有アプタマーと複合化したGDF11)を使用して実施する。サンドイッチSELEXを使用してスクリーニングしたNapdUプール中で同定したアプタマーのいくつかが、アプタマー12060−28と類似していることを見出した。これらのクローンを以下でさらに考察する。

0149

実施例3:GDF11タンパク質対ミオスタチンに対するアプタマーの平衡結合定数(Kd)
本実施例は、アプタマー−GDF11及びアプタマー−ミオスタチンタンパク質のタンパク質結合親和性(Kd)、ならびにミオスタチンよりもGDF11と選択的に結合するアプタマーの同定を提供する。

0150

本明細書に記載される対抗選択SELEX方法により、及びサンドイッチSELEX方法により選択したいくつかのアプタマークローンをさらに特徴付けし、ミオスタチンよりもGDF11への選択的結合のために選択した(表5を参照のこと)。結合アッセイを、非特異的競合物として1μMのZ−ブロック(ランダムオリゴヌクレオチド配列)の不存在下で及びその存在下で行った。C−5修飾ピリミジンとしてBndUを有するアプタマー(BndU GDF11アプタマー)を、対抗選択ステップを用いないSELEXによりあらかじめ選択し、これをGDF11とミオスタチンの両方に対する結合の対照として使用した。BndU GDF11アプタマーを用いた以前の結合実験では、これは一般にGDF11及びミオスタチンに対して無差別的であることを示した。

0151

0152

受動的対抗選択を用いたSELEXにより得られたアプタマープール12060(NapdUアプタマー)は、GDF11に対する親和性、及び異なる程度の選択性を有するいくつかのヌクレオチド配列を含有していた(Kd比を参照し、より大きな数値が、ミオスタチンよりもGDF11により高い特異性を示している)。特に、アプタマークローン12060−16_3(NapdU)は、1μMのZ−ブロックの存在下で試験した場合、ミオスタチンよりもGDF11に対して約50倍示差的なKd(すなわち、6.52nM対>320nMのKd)を示し、ヌクレオチド配列の12060アプタマープールの9%を構成した12060−28_3(NapdU)は、1μMのZ−ブロックの存在下で試験した場合、ミオスタチンよりもGDF11に対して約100倍示差的なKd(すなわち、1.74nM対>320nMのKd)を示した(図1を参照のこと)。サンドイッチSELEXにより得られたアプタマープール16139(NapdU)も、GDF11に対して高親和性及び特異性を有するいくつかのヌクレオチド配列を含有していた。

0153

表5のその他のアプタマークローンは、ミオスタチンに対する親和性の範囲でGDF11に対する親和性を示した。例えば、標準的なSELEXからのアプタマープール12058(NapdU)では、配列12058−6(17%)が優位を占めた。このアプタマークローンは、GDF11に対して0.09nMのKdを有し、ミオスタチンに対しても0.12nMのKdを有した(図2)。

0154

実施例4:GDF11アプタマー12060−28のSELEX後の切断及び分析
本実施例は、SELEX後の、12060−28_3アプタマーの切断配列に対するGDF11結合親和性及びGDF11に結合することができるコア小配列長の同定を提供する。

0155

アプタマー12060−28(NapdU)切断は、20merの配列5’−GACPPGCPPPAAGPPPAGCC−3’(アプタマー12060−28_37;配列番号:156)が、GDF11と結合することができたことを示した。しかしながら、21merの配列5’−GGACPPGCPPPAAGPPPAGCC−3’(アプタマークローン12060−28_36;配列番号:157)の活性は、GDF11に対して比較的良好な結合を示した(4.43E−10のKd)(図3を参照のこと)。このことは、12060−28に関連する活性クローンのファミリーに見られる保存モチーフCPPGCPPPANGPPPAGC(配列番号:105)と合致する、すなわち、40merの中央領域(モチーフ配列)の12〜24位内のNapdU残基のみが、結合に必要であると思われる。

0156

実施例5:特異的GDF11アプタマー配列
本実施例は、SELEX法により選択したその他のアプタマー配列を有する主要なGDF11選択的アプタマーバインダー(12060−28_3)の配列アラインメントを提供する。これは、SELEXにより選択した配列プール中における複数の配列中のモチーフ配列の同定をもたらした。選択した配列についての親和性データをさらに提供する。配列(50mer)のアラインメント及び結合親和性については表6を参照のこと。表7は、アプタマープール12060及び12058からの追加の配列ならびにそれらのアラインメントを提供する。表7の配列は、配列(40mer)の5’末端及び3’末端の各々で5つ(5)のヌクレオチドを除去したものを示す。表6及び表7の両方とも、配列中で共有される「コア配列」モチーフの基礎を提供する。この配列は、GACPPGAPPPACGPPPAGC(配列番号:106);GACPPGAPPPAAGPPPAGC(配列番号:107);GACPPGCPPPAAGPPPAGC(配列番号:108);GACPPGCPPPACGPPPAGC(配列番号:109);GCCPPGAPPPACGPPPAGC(配列番号:142);CACPPGAPPPACGPPPAGG(配列番号:143);GACPPGGPPPACGPPPAGC(配列番号:144);GCCPPGCPPPACGPPPAGC(配列番号:145);GCAPPGAPPPACGPPPAGC(配列番号:146);GGCPPGCPPPACGPPPAGA(配列番号:147);CGCPPGAPPPAAGPPPAGG(配列番号:148);AACPPGAPPPAAGPPPAGG(配列番号:149);またはGACPPGAPPPAGGPPPAGC(配列番号:150)(式中、各場合においてPはNapdUである)であってよい。いくつかの実施形態では、保存モチーフは、NNCPPGRPPPAMGPPPAGS(配列番号:141)(式中、各場合においてPはNapdUであり、RはAまたはGであり;各Nは独立して、かつ各存在についてA、G、またはCであり;MはAまたはCであり;SはGまたはCである)である。表6の配列12060−209_3は、12060−28中の1つの保存NapdUの代わりにシトシンを含有し、GDF11と結合しないことを見出した。

0157

0158

0159

0160

0161

実施例6:GDF11アプタマー配列
本実施例は、主要なGDF11選択的アプタマーバインダー配列(12060−28_3)を使用した、SELEXアプタマープールのBLAST分析結果を提供する。この分析は、実施例5で実施したアラインメントよりも低ストリンジェントであって、共通モチーフまたはコアモチーフをさらに含有した追加のアプタマー配列の同定をもたらした。配列のアラインメントについては表8を参照のこと。

0162

表8の配列アラインメントから、いくつかのモチーフ配列を誘導してよく、各モチーフは、実施例3及び実施例4の102060−28_3アプタマー配列のアラインメントから同定したモチーフ(または共通配列)との重複を維持する。

0163

第1モチーフは、以下の通りに定義されてよい:
5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:110)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;RはAまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;SはGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である)。

0164

第2モチーフは、以下の通りに定義されてよい:
5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:111)。第3モチーフは、以下の通りであってよい:5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:112)。第4モチーフは、以下の通りであってよい:5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC−3’(配列番号:113)。第2、第3及び第4モチーフの各々において、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;RはAまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;SはGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である。

0165

第1モチーフは、以下の通りに定義されてよい:
5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:151)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;RはAまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である)。

0166

第2モチーフは、以下の通りに定義されてよい:
5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:152)。第3モチーフは、以下の通りであってよい:5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:153)。第4モチーフは、以下の通りであってよい:5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGS−3’(配列番号:154)。第2、第3及び第4モチーフの各々において、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;RはAまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である。

実施例

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  • 国立大学法人東京医科歯科大学の「 生体ガス計測装置」が 公開されました。( 2021/03/18)

    【課題・解決手段】生体ガスを連続的に採取するとともに、採取した生体ガスからの対象物質の測定を即時に、かつ、経時的に行うことの可能な生体ガス計測装置を提供する。身体に対向する側に開口部11を有するととも... 詳細

  • 森永乳業株式会社の「 生菌数の測定方法」が 公開されました。( 2021/03/18)

    【課題・解決手段】1種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、簡便でありながら精度のよい特定のビフィズス菌の生菌数の測定方法を提供すること。1種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・... 詳細

  • 積水メディカル株式会社の「 リアルタイムPCRによる核酸検出方法」が 公開されました。( 2021/03/18)

    【課題】本発明は、ろ紙に血液を含ませた後乾燥させたろ紙血の紙片中に含まれる標的核酸を、核酸増幅反応を利用して増幅した産物をリアルタイムPCRにより光学的に検出する方法及び定量する方法、さらにはこれらの... 詳細

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