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技術 ラマリンを含有する退行性脳疾患の予防または治療用組成物

出願人 コリアインスティテュートオブオーシャンサイエンスアンドテクノロジー
発明者 イムジョンハンキムイルチャンハンセジョンチョドンギュ
出願日 2014年10月24日 (5年3ヶ月経過) 出願番号 2017-540950
公開日 2017年11月9日 (2年3ヶ月経過) 公開番号 2017-533261
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 交差回数 天産物 プラスチック材質 切断カス 染色程度 硝酸塩濃度 退行性脳疾患 バートン
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図面 (11)

課題・解決手段

本発明は、ラマリンの新しい用途である退行性脳疾患治療用途に関し、より詳細にはインフラマソーム(inflammasome)およびBACE1の発現抑制活性を有するラマリンを含有する退行性脳疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明に係るラマリンは、NLRPインフラマソーム(inflammasome)タンパク質を含む炎症因子およびBACE1の発現抑制を介して認知能力を向上させる効果があって、記憶障害および退行性脳疾患の予防または治療に有用である。

概要

背景

アルツハイマー病(Alzheimer’s disease:AD)は、痴呆を引き起こす最も一般的な退行性脳疾患であり、進行型神経退行性疾患症状でニューロン損失および認知障害がある(Donev et al.,J Cell Mol Med,13:4329−48,2009)。アルツハイマー病は、細胞外アミロイドベータ(amyloid−β:Aβ)プラークおよび細胞神経線維もつれ神経病理学的特徴を示す(Querfurth et al.,N Engl J Med.362(4):329−44;LaFerla et al.,Biochem Soc Trans.38(4):993−5)。アミロイド−ベータは、BACE1(Beta−secretase 1)およびプレセニリンガンマセクレターゼ(presenilin/γ−secretase)により媒介される、アミロイド−ベータ前駆体タンパク質(amyloid−β precursor protein:APP)の連続分裂によって生成される。アミロイド−ベータの生成および凝集は、神経退化、神経線維のもつれ現象、炎症およびニューロンの損失を引き起こす複雑な病理学的誘発を触発させる重要な役割をする。

神経炎症を示す微細神経膠細胞活性化は、アルツハイマー病患者脳におけるさらに他の病理学的特性である(McGeer et al.,Neurosci Lett,79:195−200,1987)。また、微細神経膠細胞は、AD、PD(パーキンソン病:Parkinson’s disease)、HIVヒト免疫不全ウイルス:human immunodeficiency virus)、痴呆および多発性硬化症のような慢性神経変成疾患を含んで多くのCNS中枢神経系:central nervous system)疾患で潜在的な発病原の役割をする(Block et al.,Nat Rev Neurosci,8:57−69,2007)。活性化した神経膠細胞および白血球は、アナフィラトキシン補体(anaphylatoxin complement)、サイトカイン(cytokine)、ケモカイン(chemokine)およびプロスタグランジン(prostaglandin)を含む様々な炎症性媒介物質を産生する(Gelderblom et al.,Stroke 40(5):1849−57,2009;Iadecola et al.,Nature Neuroscience 14(11):1363−1368,2011)。

末梢組織におけるインフラマソーム複合体(inflammasome complex)に対する研究は、炎症性サイトカインの産生および分泌、apoptoticおよびpyroptotic細胞死滅に関するものである(Lamkanfi et al.,Annu Rev Cell Dev Biol.28:137−61)。NLRP1(NACHT,LRRand PYD domains−containing protein 1)およびNLRP3(NACHT,LRR and PYD domains−containing protein 3)インフラマソームは、NLRP1/3受容体、ASC(apoptosis−associated speck−like protein containing a caspase recruitment domain)、前駆体カスパーゼ−1(procaspase−1)、前駆体カスパーゼ−11(procaspase−11)(ヒトの前駆体カスパーゼ−4または5と相同)およびXIAP(X−linked inhibitor of apoptosis)で構成された細胞質高分子複合体である(Boyden et al.,Nat Genet 38(2):240−4,2006;Martinon et al.,Mol Cell 10(2):417−26,2002)。NLRP1およびNLRP3受容体の活性化およびホモオリゴマー化によって前駆体カスパーゼ−1が自動活性化して切断カスパーゼ−1に転換されて、NLRP1およびNLRP3インフラマソームを形成する(Lamkanfi et al.,Annu Rev Cell Dev Biol.28:137−61;Martinon et al.,Mol Cell 10(2):417−26,2002)。Aβの慢性蓄積は、アルツハイマー病で微細神経膠細胞の活性化を促進する(Goldmann et al.,Cell Res.23:595−6)。IL−1β水準の増加は、Aβの蓄積と関連があって(Lucin et al.,Neuron,64:110−22,2009)、IL−1βは、カスパーゼ−1の活性化および分泌のために非活性プロ−形態で産生されて、カスパーゼ−1活性は、インフラマソームによって調節される。NLRP3インフラマソームはAβのような炎症性結晶および凝集タンパク質感知して、慢性炎症疾患と関連がある(Halle et al.,Nat Immunol 9(8)857−65,2008;Martinon et al.,Annu Rev Immunol 27:229−65,2009;Heneka et al.,Nature 493(7434):674−8)。NLRPインフラマソームの活性化によって誘導された炎症性物質は、シナプス機能障害、認知障害および微細神経膠細胞の機能制限などを媒介する役割をする。Aβ−媒介炎症性反応で主な役割をするNLRPインフラマソームおよびインフラマソーム−由来サイトカインの活性化を抑制する治療を介してアルツハイマー病の進行を効果的に妨害することができる。

ラマリンは、ヒト角質細胞および線維芽細胞細胞毒性がほとんど現れない濃度で酸化効果を示して(Paudel et al.,Phytomedicine.18(14):1285−90)、炎症反応を抑制する抗酸化剤として知られている。

本発明者等は、以前の研究で南極キングジョージ島に自生する地衣類であるラマリナテレブラタ(Ramalina terebrata)から新規化合物であるラマリンを分離して(KR10−1025612)、ラマリンの合成方法を提供した(KR10−1182334)。また、前記分離および合成したラマリンの炎症または免疫疾患予防または治療効果(KR10−1290745)および肝線維化および肝硬変の予防または治療効果(KR10−1326256)を明らかにした。しかし、ラマリンの退行性脳疾患関連予防または治療効果についてはまだ知られていない。

そこで、本発明者等は、アルツハイマー病およびアルツハイマー病類似疾患治療のための効果的な戦略を開発しようと鋭意努力した結果、ラマリンがBACE1発現およびNLRPインフラマソームタンパク質のような炎症性マーカーの発現を抑制することによって、アミロイド生成を阻害して、アルツハイマー病モデルマウス認知機能を顕著に向上させることを確認して、本発明を完成した。

概要

本発明は、ラマリンの新しい用途である退行性脳疾患治療用途に関し、より詳細にはインフラマソーム(inflammasome)およびBACE1の発現抑制活性を有するラマリンを含有する退行性脳疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明に係るラマリンは、NLRPインフラマソーム(inflammasome)タンパク質を含む炎症因子およびBACE1の発現抑制を介して認知能力を向上させる効果があって、記憶障害および退行性脳疾患の予防または治療に有用である。

目的

本発明の目的は、ラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する

効果

実績

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請求項1

下記式Iで表されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患治療または予防用薬学組成物

請求項2

前記退行性脳疾患は、アルツハイマー病パーキンソン病、ルーゲリック病、ピック病クロイツフェルトヤコブ病ハンチントン病および痴呆からなる群で選択されることを特徴とする請求項1に記載の薬学組成物

請求項3

前記退行性脳疾患は、アルツハイマー病であることを特徴とする請求項1に記載の薬学組成物。

請求項4

前記ラマリンは、BACE1およびNALPインフラマソームタンパク質発現を抑制することを特徴とする請求項1に記載の薬学組成物。

請求項5

薬学的に許容される担体賦形剤または希釈剤をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の薬学組成物。

請求項6

下記式Iで表されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用食品組成物

請求項7

前記退行性脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルーゲリック病、ピック病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病および痴呆からなる群で選択されることを特徴とする請求項6に記載の食品組成物

技術分野

0001

本発明は、ラマリン(Ramalin)の新しい用途である退行性脳疾患治療用途に関し、より詳細にはインフラマソーム(inflammasome)およびBACE1の発現抑制活性を有するラマリンを含有する退行性脳疾患の予防または治療用組成物に関する。

背景技術

0002

アルツハイマー病(Alzheimer’s disease:AD)は、痴呆を引き起こす最も一般的な退行性脳疾患であり、進行型神経退行性疾患症状でニューロン損失および認知障害がある(Donev et al.,J Cell Mol Med,13:4329−48,2009)。アルツハイマー病は、細胞外アミロイドベータ(amyloid−β:Aβ)プラークおよび細胞神経線維もつれ神経病理学的特徴を示す(Querfurth et al.,N Engl J Med.362(4):329−44;LaFerla et al.,Biochem Soc Trans.38(4):993−5)。アミロイド−ベータは、BACE1(Beta−secretase 1)およびプレセニリンガンマセクレターゼ(presenilin/γ−secretase)により媒介される、アミロイド−ベータ前駆体タンパク質(amyloid−β precursor protein:APP)の連続分裂によって生成される。アミロイド−ベータの生成および凝集は、神経退化、神経線維のもつれ現象、炎症およびニューロンの損失を引き起こす複雑な病理学的誘発を触発させる重要な役割をする。

0003

神経炎症を示す微細神経膠細胞活性化は、アルツハイマー病患者脳におけるさらに他の病理学的特性である(McGeer et al.,Neurosci Lett,79:195−200,1987)。また、微細神経膠細胞は、AD、PD(パーキンソン病:Parkinson’s disease)、HIVヒト免疫不全ウイルス:human immunodeficiency virus)、痴呆および多発性硬化症のような慢性神経変成疾患を含んで多くのCNS中枢神経系:central nervous system)疾患で潜在的な発病原の役割をする(Block et al.,Nat Rev Neurosci,8:57−69,2007)。活性化した神経膠細胞および白血球は、アナフィラトキシン補体(anaphylatoxin complement)、サイトカイン(cytokine)、ケモカイン(chemokine)およびプロスタグランジン(prostaglandin)を含む様々な炎症性媒介物質を産生する(Gelderblom et al.,Stroke 40(5):1849−57,2009;Iadecola et al.,Nature Neuroscience 14(11):1363−1368,2011)。

0004

末梢組織におけるインフラマソーム複合体(inflammasome complex)に対する研究は、炎症性サイトカインの産生および分泌、apoptoticおよびpyroptotic細胞死滅に関するものである(Lamkanfi et al.,Annu Rev Cell Dev Biol.28:137−61)。NLRP1(NACHT,LRRand PYD domains−containing protein 1)およびNLRP3(NACHT,LRR and PYD domains−containing protein 3)インフラマソームは、NLRP1/3受容体、ASC(apoptosis−associated speck−like protein containing a caspase recruitment domain)、前駆体カスパーゼ−1(procaspase−1)、前駆体カスパーゼ−11(procaspase−11)(ヒトの前駆体カスパーゼ−4または5と相同)およびXIAP(X−linked inhibitor of apoptosis)で構成された細胞質高分子複合体である(Boyden et al.,Nat Genet 38(2):240−4,2006;Martinon et al.,Mol Cell 10(2):417−26,2002)。NLRP1およびNLRP3受容体の活性化およびホモオリゴマー化によって前駆体カスパーゼ−1が自動活性化して切断カスパーゼ−1に転換されて、NLRP1およびNLRP3インフラマソームを形成する(Lamkanfi et al.,Annu Rev Cell Dev Biol.28:137−61;Martinon et al.,Mol Cell 10(2):417−26,2002)。Aβの慢性蓄積は、アルツハイマー病で微細神経膠細胞の活性化を促進する(Goldmann et al.,Cell Res.23:595−6)。IL−1β水準の増加は、Aβの蓄積と関連があって(Lucin et al.,Neuron,64:110−22,2009)、IL−1βは、カスパーゼ−1の活性化および分泌のために非活性プロ−形態で産生されて、カスパーゼ−1活性は、インフラマソームによって調節される。NLRP3インフラマソームはAβのような炎症性結晶および凝集タンパク質感知して、慢性炎症疾患と関連がある(Halle et al.,Nat Immunol 9(8)857−65,2008;Martinon et al.,Annu Rev Immunol 27:229−65,2009;Heneka et al.,Nature 493(7434):674−8)。NLRPインフラマソームの活性化によって誘導された炎症性物質は、シナプス機能障害、認知障害および微細神経膠細胞の機能制限などを媒介する役割をする。Aβ−媒介炎症性反応で主な役割をするNLRPインフラマソームおよびインフラマソーム−由来サイトカインの活性化を抑制する治療を介してアルツハイマー病の進行を効果的に妨害することができる。

0005

ラマリンは、ヒト角質細胞および線維芽細胞細胞毒性がほとんど現れない濃度で酸化効果を示して(Paudel et al.,Phytomedicine.18(14):1285−90)、炎症反応を抑制する抗酸化剤として知られている。

0006

本発明者等は、以前の研究で南極キングジョージ島に自生する地衣類であるラマリナテレブラタ(Ramalina terebrata)から新規化合物であるラマリンを分離して(KR10−1025612)、ラマリンの合成方法を提供した(KR10−1182334)。また、前記分離および合成したラマリンの炎症または免疫疾患予防または治療効果(KR10−1290745)および肝線維化および肝硬変の予防または治療効果(KR10−1326256)を明らかにした。しかし、ラマリンの退行性脳疾患関連予防または治療効果についてはまだ知られていない。

0007

そこで、本発明者等は、アルツハイマー病およびアルツハイマー病類似疾患治療のための効果的な戦略を開発しようと鋭意努力した結果、ラマリンがBACE1発現およびNLRPインフラマソームタンパク質のような炎症性マーカーの発現を抑制することによって、アミロイド生成を阻害して、アルツハイマー病モデルマウス認知機能を顕著に向上させることを確認して、本発明を完成した。

発明が解決しようとする課題

0008

本発明の目的は、ラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の治療または予防用薬学組成物を提供するところにある。
本発明の他の目的は、ラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用食品組成物を提供するところにある。

課題を解決するための手段

0009

前記目的を達成するために、本発明は、下記式Iで表されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する。

0010

本発明はまた、前記式Iで表示されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

図面の簡単な説明

0011

(A)ラマリンの化学構造に対する模式図および(B)ラマリン処理後行動機検査のための動物実験計画の模式図である。
アルツハイマー病動物モデルであるAPP/PS1形質転換マウスを対象にラマリン投与による学習および記憶障害予防効果を示した結果である。(A)ラマリンが4週間投与された実験群では、水面下のプラットホーム対照群(vehicle)に比べて速く探して行く;(B)水迷路試験開始後、6日目に実行されたプローブテスト結果、ラマリンは痴呆動物モデルの記憶維持能の改善効果を示す;(C)実験動物群の水泳速度を測定した結果、実験群間の差がない;(D)空間記憶能力を評価するために、Y−maze testを実施した結果、ラマリン(20mg/kg)が4週間投与された実験群で変更行動力が大きく増加する。
アルツハイマー病動物モデルであるAPP/PS1形質転換マウスでラマリン投与後、神経班(neuritic plaque)形成およびAβ生成が顕著に減少することを示す結果である。(A)皮質海馬でAβ染色程度がラマリン投与動物で減少したことを顕微鏡写真で観察する;(B)皮質と海馬共にラマリン投与によってAβ老人班の数字も減少したことをイメージ分析定量で確認する;(C)酵素免疫測定法ELISA)を利用した水溶性Aβ測定結果、ラマリン投与群でAβ40とAβ42共に減少したことを確認する。
ラマリン投与後、アルツハイマー病動物モデルAPP/PS1形質転換マウスでBACE1レベル抑制を確認した結果で、ラマリンが脳内BACE1のトランスクリプトームおよびタンパク質の量を減少させる効能があって、これによって痴呆原因物質であるAβの産性が減少することを意味する結果である。(A)ラマリン投与後動物の皮質でAβを産生する酵素であるBACE1に特異的な抗体を利用した免疫化学染色法を介してBACE1の発現がラマリン投与によって減っていることを確認する;(B)ラマリン投与後、動物の海馬でAβを産生する酵素であるBACE1に特異的な抗体を利用した免疫化学染色法を介してBACE1の発現がラマリン投与によって減少することを確認する;(C)ウェスタンブロット(Western blotting)法によってタンパク質の量を測定した時ラマリン投与動物の脳組織でBACE1とAβ前駆体でありながらBACE1の基質であるC99も減少したことを確認する;(D)ウェスタンブロット(Western blotting)法によってタンパク質の量を測定を統計処理した値を示したものと;(E)ラマリン投与によって痴呆動物の脳組織でBACE1のトランスクリプトーム(mRNA)発現が減少したことを確認する。
ラマリン投与後、アルツハイマー病動物モデルAPP/PS1形質転換マウス脳のiNOSおよびCOX−2発現抑制効果を確認した結果である。(A)ラマリン投与によって痴呆動物の脳組織でiNOSとCOX−2のタンパク質量が減少したことを確認する;(B)ウェスタンブロット(Western blotting)法によってタンパク質の量の測定を統計処理した値である。
ラマリン投与後、アルツハイマー病動物モデルAPP/PS1形質転換マウス脳でのMAP信号伝達経路タンパク質に対する影響を確認した結果である。(A)痴呆動物の脳組織でリン酸化されたストレスキナーゼ(p38、JNKおよびERK)の量がラマリン投与によって大きく減少する;(B)ウェスタンブロット(Western blotting)法によってp38、JNKおよびERKタンパク質の量を測定を統計処理した値である。
ラマリン投与後、アルツハイマー病動物モデルAPP/PS1形質転換マウス脳でのインフラマソーム(inflammasome)タンパク質に対する影響を確認した結果である。(A)痴呆動物の脳組織でインフラマソーム構成タンパク質NALP1、NALP3、caspase−1、IL−1β、TLR4およびXIAP)の量がラマリン投与によって大きく減少する;(B)ウェスタンブロット(Western blotting)法によってNALP1、NALP3、caspase−1、IL−1β、TLR4およびXIAPタンパク質の量を測定を統計処理した値である。
LPSによって誘導される炎症に対するラマリンの影響を微細神経膠細胞で確認した結果である。(A)微細神経膠細胞にLPSを処理して炎症反応を誘導すると大きく増加するNOがラマリン処理によって完全に抑制される結果を確認する;(B)ウェスタンブロットを介して微細神経膠細胞でLPSによって増加する炎症信号伝達の主な因子(iNOS、COX−2)の発現がラマリンによって完全に抑制される結果を確認する;(C)ウェスタンブロット(Western blotting)法によってiNOSの量を測定を統計処理した値である;(D)ウェスタンブロット(Western blotting)法によってCOX−2の量を測定を統計処理した値である。
LPSによって誘導されるNF−κBおよびMAPKの活性に対するラマリンの影響を微細神経膠細胞で確認した結果である。(A)微細神経膠細胞でLPSによって抑制されるNF−κB(リン酸化されたp65)がラマリン処理によって減少する結果を確認する;(B)微細神経膠細胞でLPSによって抑制されるNF−κB(リン酸化されたp65)を統計処理した値である;(C)LPSが処理された微細神経膠細胞で活性化するストレスキナーゼ(p38、JNK、ERK)がラマリン処理によって抑制される結果を確認する;(D)微細神経膠細胞でLPSによって抑制されるストレスキナーゼを統計処理した値である。
LPSによって誘導されるインフラマソーム(inflammasome)、IL−1β、TLR4およびBACE1の発現に対するラマリンの影響を微細神経膠細胞で確認した結果である。(A)ウェスタンブロット(Western blotting)法を介して微細神経膠細胞でLPSによって増加するインフラマソーム構成分子(NALP3、NALP3、Caspase−1)と先天性免疫受容体であるTLR4およびAβ産生酵素であるBACE1の発現がラマリン処理によって抑制される結果を確認する;(B)ウェスタンブロット(Western blotting)法によってインフラマソーム構成分子および先天性免疫受容体の量を測定して統計処理した値である。

0012

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

0013

本発明では、南極地衣類ラマリナ・テレブラタから分離した分子式C11H16N3O4の化合物ラマリン(γ−glutamyl−N’(2−hydroxyphenyl)hydrazide)の新規な学習および記憶障害予防効果を解明した。

0014

従って、一観点において、本発明は、下記式Iで表されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の治療または予防用薬学組成物に関する。

0015

本発明において、前記退行性脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルーゲリック病、ピック病クロイツフェルトヤコブ病ハンチントン病および痴呆からなる群で選択されることを特徴とし、アルツハイマー病であることが好ましいか、これに限定されない。

0016

本発明において、前記ラマリンは、BACE1およびNALPインフラマソームタンパク質の発現を抑制することを特徴とする。また、炎症媒介因子iNOS、COX−2、MAPK信号伝達経路タンパク質の発現を抑制することを特徴とする。

0017

発明のラマリンを含有する組成物は、各々通常の方法による適切な担体賦形剤または、希釈剤をさらに含んでもよい。化合物を含む組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトースデキストローススクロースソルビトールマンニトールキシリトールエリスリトールマルチトール澱粉アカシアゴムアルギン酸塩ゼラチンカルシウムホスフェートカルシウムシリケートセルロースメチルセルロース微晶質セルロースポリビニールピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピルタルクマグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。

0018

発明のラマリンを含有する組成物は、各々通常の方法により散剤丸剤顆粒剤カプセル剤、懸濁液、内用液剤乳剤シロップ剤滅菌された水溶液非水性溶剤凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有してもよい。

0019

製剤化する場合には、通常用いる充鎮剤、増量剤結合剤湿潤剤崩壊剤界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート(calcium carbonate)、スクロース(sucrose)またはラクトース(lactose)、ゼラチン等を混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤内容液剤、油剤、シロップ剤等が該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味制、芳香剤保存剤等が含まれる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール(propylene glycol)、ポリエチレングリコールオリーブ油のような植物性油エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。座薬の基剤としては、ウィテプゾール(witepsol)、マクロゴールツイン(tween)60、カカオ脂ラウリン脂クリセロゼラチン等が用いられる。

0020

本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬品形態投与経路及び期間により異なるが、当業者によって適宜選択される。しかし、好ましい効果を得るために、本発明の組成物は、1日0.001mg/kg〜100g/kgで、好ましくは0.01mg/kg〜10g/kgで投与した方が良い。投与は一日一回投与してもよく、数回に分けて経口投与してもよい。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。

0021

他の観点において、本発明は、下記式Iで表されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用食品組成物に関する。

0022

本発明の食品組成物は、機能性食品(functional food)、栄養補助剤(nutritional supplement)、健康食品(health food)および食品添加剤(food additives)等のすべての形態を含む。前記類型の健康機能食品は、当業界に公示された通常の方法により様々な形態で製造することができる。例えば、健康食品としては、本発明のラマリンをジュースおよびドリンクの形態で製造して飲用するようにしたり、顆粒化カプセル化および粉末化して摂取することができる。また、機能性食品としては、飲み物アルコール性飲み物を含む)、果実およびその加工食品(例:果物缶詰め、瓶詰ジャム、ママレードなど)、魚類肉類およびその加工食品(例:ハムソーセージコンビーフなど)、パン類および麺類(例:ウドン、ザルソバラーメンスパゲッティマカロニなど)、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品(例:バターチーズなど)、食用植物油脂マーガリン植物性タンパク質レトルト食品冷凍食品、各種調味料(例:味噌醤油ソースなど)等に本発明のラマリンを添加して製造することができる。

0023

前記健康機能食品また、食品組成物として、機能性食品、栄養補助剤、健康食品、食品添加剤等の様々な形態を含み、当業界に公示された通常の方法により様々な形態、例えば、先述したラマリンを茶、ジュースおよびドリンクの形態で製造するか、顆粒化、カプセル化および粉末化するか、このような化合物または抽出物を飲み物、果実およびその加工食品、魚類、肉類およびその加工食品、パン類、麺類、調味料等各種食品に添加して製造することにより提供されることができる。

0024

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

0025

実施例1:ラマリンの分離/合成および動物モデルデザイン
本発明の下記の実施例では2008年1月、南極キングジョージ島のバートン半島(S62°13.1、W58°47.0)で採集したラマリナ・テレブラタ(Ramalina terebrata)からメタノールを利用した分離方法でラマリンを分離(KR10−1025612)して使用するか、また天産物由来のラマリンと同じ効能を示す安定したラマリンを合成(KR10−1182334)して使用した(図1A)。

0026

C57BL/6J種の反接合性形質転換マウスAPP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)を12時間−明(light)、12時間−暗(dark)で維持しながら実験を実施した。7カ月齢、雌APP/PS1マウスグループ当たり6匹ずつ、三つのグループ(対照群、10mg/kgラマリン、20mg/kgラマリン)に分けて、ラマリンを38日間一日に一回ずつ口腔投与した。

0027

リス水迷路試験は31日目から35日目まで実施して、36日目記憶力維持検査および38日目Y迷路試験を実施した。40日目にはマウスを犠牲させた後、脳組織を−70℃に保管した(図1B)。

0028

実施例2:モリス水迷路試験
APP/PS1形質転換マウスに対するラマリンの記憶力向上効果を確認するために、既に知られたモリス法を若干変形して実施した。水槽は、高さ35cm、径100cmの原形で、無毒性の水溶性の黒の染料を入れて、水温を20℃に維持した。水槽を4等分して、その中一つの中間に水面から1cm程度下方に黒のプラットホーム(高さ10cm、径8cm)を位置させた。様々な空間手がかりを入れた水槽のプラットホームで水泳を開始させたマウスをビデオシステム(Ethovirion system Noldus,Wageningen,Netherlands)で観察した。水中迷路教育は、マウスが60秒間プラットホームを探すことができなければ、一日に2回の機会をさらに与えた。各試みは15分の休息時間を設けた後実施して、4日連続実施した。各マウスが、各実験での示す時間を測定して平均値を得た。マウスがプラットホームを探せば、10秒間留まるようにして、もしマウスが120秒内にプラットホームを探すことができなければ、実験者がプラットホームに10秒間いるように誘導した。6日目には水槽でプラットホームを除去した後、60秒間プローブテストを行った。

0029

APP/PS1形質転換マウスに4週間ラマリンを投与して、海馬機能を向上させた後、モリス水迷路実験を実施して、テストを実施する1週間もラマリンを投与した。その結果、プラットホームの位置について教育を受けた後、向上した記憶力によってプラットホームに到着する時間が短くなることを確認した。ラマリン(10および20mg/kg)投与群で4日目プラットホームに到着する時間が短縮された(図2A)。また、最終日プラットホームを除去後、目標象限に留まる時間を測定した時、ラマリン(10および20mg/kg)濃度に依存的に増加した(図2B)。ラマリン投与群と対照群で水泳速度には差がなかった(図2C)。

0030

実施例3:Y迷路試験
Y迷路は三つの通路(arm)がY字型に延びて、各通路は長さ40cm、高さ12cm、幅3cmとそれぞれ120°の角度で位置する。迷路底と壁は、不透明な暗色のポリビニールプラスチック材質であり、マウスは最初一つの通路で順に位置(i.e.,ABCAB etc.)させた後、8分間通路を通過することを記録した。マウスの動き交差回数で示し、連続的に三つの通路を通過した場合だけ一回交差したと定義した(i.e.,ABC、CAB、またはBCA、しかしBABではない)。迷路の通路は、臭いをきれいに除去して掃除して、最後のラマリンを投与(10および20mg/kg)してから、一時間後にラマリンによる記憶損傷抑制を測定した。交差比率は下記の通り定義される。
%交差=[(交差回数)/(総通路通過回数)]×100
その結果、ラマリン濃度20mg/kg投与群で記憶力が増進されたことを確認することができた(図2D)。

0031

実施例4:APP/PS1マウス脳のAβ生成と神経班(neuritic plaque)形成
APP/PS1マウス脳のアミロイド蓄積に対するラマリンの影響を調べるために、ラマリン投与群と対照群のAβ40、Aβ42およびAβプラーク形成分析した。ラマリン処理に対するAβプラーク蓄積は脳を免疫染色して確認した。

0032

マウスの脳組織は、4%パラホルムアルデヒドで固定して、30%スクロースで4℃で48時間凍結させて45um厚さに切断した。抗−Aβ抗体(400:1,4G8,Covance)を使用して、DAB染色でプラーク形成を確認した。その結果、ラマリン投与群の脳皮質と海馬でプラーク形成が顕著に減少した(図3B)。

0033

また、Aβを固相サンドイッチELISAシステム(IBL、27713および27711)で定量した。脳組織を1xプロテアーゼカクテル(Calbiochem)が含まれたPBS均質化した後、4℃で13,000rpmで10分間遠心分離して、well当たり100μgの標準Aβおよび試料を入れてAβ抗体と4℃でO/N反応させた後、antimouseIgG−HRPと常温で1時間反応させて、洗浄してwell当たり100ulの安定化されたクロモゲンを添加して常温で30分間暗反応させた後、停止溶液を添加して450nmで分析した。その結果、ラマリン処理によってAPP/PS1マウス脳組織でAβ40およびAβ42等が顕著に減少したことを確認した(図3C)。

0034

実施例5:ラマリン処理されたAPP/PS1マウス脳のBACE1発現減少
APP/PS1マウス脳のBACE1発現に対するラマリンの影響を調べるために、ラマリン投与群と対照群のBACE1レベルを免疫蛍光染色法およびウェスタンブロットで分析した。また、リアルタイム重合酵素連鎖反応でBACE1mRNAレベルを分析した。
免疫蛍光染色法は、実施例4の方法と同じで、BACE1抗体(400:1,R&D system)を使用して分析した。

0035

ウェスタンブロットを行うために、APP/PS1マウス脳組織でT−per(Pierce)抽出バッファーとComplete Mini Protease Inhibitor Tablets(Roche)を使用してタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質は、8−17% SDS−PAGEで電気泳動した後、0.45μMPVDFトランスファーした後、BACE1抗体(Cell Signaling)で確認した。

0036

リアルタイム重合酵素連鎖反応は、Ribospin RNA purification system(GeanAll)で全てのRNAを抽出して、iScript systemcDNA合成キット(Bio−Rad)を利用して1μgのRNAでRTを実施した。リアルタイム重合酵素連鎖反応は、CFX96TM system(Bio−Rad)を使用して行って、PCR増幅は、SYBR Premix EX TaqTMII(TaKaRa Bio Inc.)を使用して、2−ΔΔct方法で相対的定量をした。各遺伝子に対するプライマーは下記のとおりである。
BACE1:forward 5’−ATGTGGAGATGACCGTAGGC−3’(配列番号1)
reverse 5’−TACACACCCTTTCGGAGGTC−3’(配列番号2)
APDH:forward 5’−GACATCAAGAAGGTGGTGAA−3’(配列番号3)
reverse 5’−TGTCATACCAGGAAATAGGC−3’(配列番号4)

0037

BACE1発現レベルは、GAPDH発現レベルに対する%で表示した。
その結果、免疫蛍光染色でラマリン投与群の脳皮質と海馬でBACE1免疫反応が減少したことを確認した(図4A)。その次に、ラマリン処理したAPP/PS1マウス脳でBACE1、C99およびC83のタンパク質発現を測定した。その結果、1ヶ月の間ラマリン処理条件でBACE1発現が顕著に減少したことを確認した(図4D)。また、ラマリン処理は、BACE1のmRNAレベルも減少させることをリアルタイム重合酵素連鎖反応分析で確認した(図4E)。

0038

実施例6:ラマリン処理がAPP/PS1マウス脳でiNOS、COX−2、MAPKおよびインフラマソームに及ぼす効果
ラマリンは良く知られている抗炎症化合物で、酸化窒素生成を抑制して神経保護作用を増加させる。したがって、酸化窒素生成を介してラマリンの抗炎症効果およびADモデルであるAPP/PS1マウスでラマリンの神経炎症に対する効果を確認した。

0039

その結果、ラマリン処理によってAPP/PS1マウス脳でiNOSおよびCOX−2の発現が顕著に抑制されたことを確認することができた(図5)。また、ラマリン処理によるMAPK(Mitogen−activated protein kinases)およびNALPインフラマソームタンパク質(NALP inflammasome protein)発現に対する効果を分析した。p38、JNK、ERK、NALP3、NALP1、Caspase1およびXIAPのタンパク質発現をウェスタンブロットで確認した。

0040

その結果、p−p38、p−JNK、P−ERK、NALP1、NALP3、pre−caspase1、cleaved−caspase1およびTLR4はラマリン処理によって発現が減少したが、t−p38、t−JNK、t−ERK、pre−IL−1βおよびXIAPは大きいな差を示さなかった(図6および7)。

0041

実施例7:LPSによって誘導されたNO、iNOSおよびCOX−2に対するラマリンの影響
HT−22海馬細胞とBV−2微細神経膠細胞は、10% FBSおよび1% pen/strep(Gibco,USA)が含まれたDMEM(Hyclone,USA)で37℃でCO2培養器で培養した。ラマリンは0.1%(v/v)の濃度で蒸溜水に溶かして使用して、すべての実験の細胞はLPS(1μg/ml)が存在するか、存在しない無血清DMEM培地に各濃度のラマリンを処理して培養した。

0042

NO測定は、培養培地をGriess反応で行って、BV−2微細神経膠細胞(2.5×105cell/well in 24 well plate)にラマをリンを前処理した後、LPS(1μg/ml)24時間処理して培養液を分析した。各サンプル50ul培養液を同量のGriess試薬[0.1%N−(1−naphthyl)−ethylenediamine dihydrochlorideおよび1%sulfanilamideが含まれた5%phosphoric acid]と混合して96well plateで10分間暗反応した。硝酸塩濃度は、培養液の硝酸ナトリウム標準溶液で分析して、540nmで測定した。

0043

その結果、BV−2微細神経膠細胞で1μg/mlLPS処理によるNO生成は、18.52μMであり、1μg/mlラマリン処理によって15.17μMおよび10μg/mlラマリン処理によって5.64μMとNO生成が減少した。また、100μg/mlラマリン処理によって0.53μMとNO生成が顕著に抑制された(図8A)。

0044

1μg/mlLPS処理後、ウェスタンブロットで分析したiNOSおよびCOX−2タンパク質レベルは、対照群に比べて48%程度増加したが、10μg/mlラマリン処理によって再び46.67%および55.33%増加が抑制された。また、100μg/mlラマリン処理によってiNOSおよびCOX−2タンパク質レベルは126.3%および232%の顕著な増加抑制が示された(図8C、D)。

0045

実施例8:LPSによって誘導されたp38、JNK、ERKおよびNF−κBのリン酸化およびインフラマソームタンパク質に対するラマリンの影響
図8に示された通り、BV−2微細神経膠細胞に1μg/ml LPS処理は、p38、JNK、ERKMAPKおよびNF−κB p65を対照群と比較して503.7%、99%、58%および89%の割合で速くリン酸化させるのに対して、10および100μg/mlラマリン処理は、NF−κBを41.67%および131%減少させて、100μg/mlラマリン処理はp38、JNKおよびERK MAPKのリン酸化を516.5%、116%および42%減少させて、LPSを処理した微細神経膠細胞でラマリンが増加するNF−κB(リン酸化されたp65)を減少させて、LPSが処理された微細神経膠細胞で活性化するストレスキナーゼ(p38、JNK、ERK)がラマリン処理によって抑制されることが明らかにされた(図9)。

実施例

0046

また、BV−2微細神経膠細胞でLPSによって増加するインフラマソーム構成分子(NALP3、NALP3、Caspase−1)と先天性免疫受容体であるTLR4およびAβ産生酵素であるBACE1発現がラマリン処理によって顕著に抑制されることが明らかにされた(図10)。

0047

本発明に係るラマリンは、NLRPインフラマソーム(inflammasome)タンパク質を含む炎症因子およびBACE1の発現抑制を介して認知能力を向上させる効果があって、記憶障害および退行性脳疾患の予防または治療に有用である。

0048

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

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