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技術 HAO1(ヒドロキシ酸オキシダーゼ1(グリコール酸オキシダーゼ))遺伝子の発現の阻害のための組成物および方法

出願人 アルナイラムファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド
発明者 ウィリアム・クアーベスケビン・フィッツジェラルドブライアン・ベッテンコートアビゲイル・リーボウデイビッド・ブイ・アーブ
出願日 2015年10月9日 (4年4ヶ月経過) 出願番号 2017-518946
公開日 2017年11月2日 (2年3ヶ月経過) 公開番号 2017-532038
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 不混和液体 自己付加 水中体 タクソン 植え込み装置 界面活性剤膜 アルカリ金属アルキル硫酸塩 凝縮反応
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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、HAO1遺伝子を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤、およびこのようなRNAi剤を用いてHAO1の発現阻害する方法、および例えば、PH1を有する対象を処置する方法に関する。本明細書には、細胞、例えば、対象、例えば、哺乳動物、例えば、HAO1関連障害を有するヒトの体内の細胞でのHAO1遺伝子の発現を阻害する二本鎖RNAi剤、およびこのような二本鎖RNAi剤の使用が記載されている。本発明の特定の態様では、本発明のiRNAの実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。

概要

背景

発明の背景
原発性シュウ酸尿症1型(PH1)は、グリオキシル酸代謝の常染色体劣性障害である。肝臓グリオキシル酸の解毒が、AGXT遺伝子の変異によって妨げられ、このAGXT遺伝子は、肝臓ペルオキシソームアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(AGT酵素をコードする。AGT1は、ヒドロキシプロリンの代謝分解における最終酵素である。中間代謝産物グリオキシル酸をグリシンに変換するAGT機能の喪失により、グリオキシル酸が蓄積し、グリオキシル酸は、ヒドロキシ酸オキシダーゼHAO1)としても知られる酵素グリコール酸オキシダーゼ(GO)によってシュウ酸塩酸化されるグリコール酸に還元される。

グリオキシル酸塩、シュウ酸塩の重要な前駆体の調節が、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、およびサイトゾルを含む多数の細胞内の部位で生じる。PH1患者における過剰なシュウ酸塩は、腎臓によって十分に排出することができないため、シュウ酸カルシウム結晶が形成され、腎臓および尿路に蓄積する。シュウ酸による尿細管毒性、腎石灰沈着、および石による腎臓の閉塞の組み合わせによって腎障害が引き起こされる。30%を超える患者が、末期腎不全ESRD)に進行する。

HAO1遺伝子は、グリコール酸オキシダーゼ(「GO」)としても知られる酵素ヒドロキシ酸オキシダーゼ1をコードする。HAO1タンパク質は、主に肝臓で発現され、かつグリコール酸に対して最も活性が高い2−ヒドロキシ酸オキシダーゼである。

AGT1遺伝子が欠失されたPH1のマウスモデルでは、HAO1遺伝子が欠失された場合に尿中シュウ酸塩のレベルが低下する。

PH1、AGXT、およびHAO1は、非特許文献1〜4に記載されている。

概要

本発明は、HAO1遺伝子を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤、およびこのようなRNAi剤を用いてHAO1の発現を阻害する方法、および例えば、PH1を有する対象を処置する方法に関する。本明細書には、細胞、例えば、対象、例えば、哺乳動物、例えば、HAO1関連障害を有するヒトの体内の細胞でのHAO1遺伝子の発現を阻害する二本鎖RNAi剤、およびこのような二本鎖RNAi剤の使用が記載されている。本発明の特定の態様では、本発明のiRNAの実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。

目的

本発明は、HAO1を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖iRNA剤を含む組成物を提供する

効果

実績

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- 件
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請求項1

細胞でのHAO1の発現阻害することができる二本鎖RNAi剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号1、配列番号2、配列番号5、または配列番号6のヌクレオチド配列のいずれか1つと3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号3、配列番号4、配列番号7、または配列番号8のヌクレオチド配列のいずれか1つと3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15の連続したヌクレオチドを含み;前記センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであり、かつ前記センス鎖が、3’末端に付着したリガンドコンジュゲートされている、二本鎖RNAi剤。

請求項2

前記センス鎖の全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項3

前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、表2に列記されたアンチセンス配列のいずれか1つと3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む相補性領域を含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項4

前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、3’末端デオキシチミン(dT)ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ−修飾ヌクレオチド、2’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、5’リン酸塩または5’リン酸塩模倣物を含むヌクレオチド、およびコレステロール誘導体またはドデンカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項5

少なくとも1つの鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項6

少なくとも1つの鎖が、少なくとも2つのヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項7

細胞でのHAO1(ヒドロキシ酸オキシダーゼ1)の発現を阻害することができる二本鎖RNAi剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、HAO1をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III)で表され:センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)式中:i、j、k、およびlが、それぞれ独立に0または1であり;p、p’、q、およびq’が、それぞれ独立に0〜6であり;各NaおよびNa’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜25のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各NbおよびNb’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜10のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;各np、np’、nq、およびnq’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、およびZ’Z’Z’がそれぞれ独立に、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表し;Nbの修飾が、Yの修飾とは異なり、Nb’の修飾が、Y’の修飾とは異なり;かつ前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖RNAi剤。

請求項8

iが0である;jが0である;iが1である;jが1である;iおよびjの両方が0である;またはiおよびjの両方が1である、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項9

kが0である;lが0である;kが1である;lが1である;kおよびlの両方が0である;またはkおよびlの両方が1である、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項10

XXXがX’X’X’に相補的であり、YYYがY’Y’Y’に相補的であり、かつZZZがZ’Z’Z’に相補的である、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項11

YYYモチーフが、前記センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項12

Y’Y’Y’モチーフが、前記アンチセンス鎖の5’末端の11位、12位、および13位に存在する、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項13

Y’が2’−O−メチルである、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項14

式(III)が、式(IIIa)で表される:センス:5’np−Na−YYY−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIa)、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項15

式(III)が、式(IIIb)で表される:センス:5’np−Na−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na’nq’5’(IIIb)、各NbおよびNb’が独立に、1〜5の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項16

式(III)が、式(IIIc)で表される:センス:5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIc)、各NbおよびNb’が独立に、1〜5の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項17

式(III)が、式(IIId)で表される:センス:5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na’−nq’5’(IIId)、各NbおよびNb’が独立に、1〜5の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、かつ各NaおよびNa’が独立に、2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項18

前記二本鎖領域が、15〜30ヌクレオチド対の長さである、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項19

前記二本鎖領域が、17〜23ヌクレオチド対の長さである、請求項18に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項20

前記二本鎖領域が、17〜25ヌクレオチド対の長さである、請求項18に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項21

前記二本鎖領域が、23〜27ヌクレオチド対の長さである、請求項18に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項22

前記二本鎖領域が、19〜21ヌクレオチド対の長さである、請求項18に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項23

前記二本鎖領域が、21〜23ヌクレオチド対の長さである、請求項18に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項24

各鎖が、15〜30ヌクレオチドを有する、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項25

各鎖が、19〜30ヌクレオチドを有する、請求項1または7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項26

前記ヌクレオチドの前記修飾が、LNA、HNA、CeNA、2’−メトキシエチル、2’−O−アルキル、2’−O−アリル、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−デオキシ、2’−ヒドロキシル、およびこられの組み合わせからなる群から選択される、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項27

前記ヌクレオチドの前記修飾が、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾である、請求項26に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項28

前記リガンドが、二価または三価分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNac誘導体である、請求項1または7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項29

前記リガンドが、である、請求項1または7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項30

前記リガンドが、前記センス鎖の3’末端に付着されている、請求項1または7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項31

次の略図で示されているようにリガンドにコンジュゲートされており、式中、XがOまたはSである、請求項30に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項32

少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項1または7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項33

ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の3’末端に存在する、請求項32に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項34

前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項33に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項35

前記鎖が、前記センス鎖である、請求項33に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項36

ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の5’末端に存在する、請求項32に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項37

前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項36に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項38

前記鎖が、前記センス鎖である、請求項36に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項39

ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の5’末端および3’末端の両方に存在する、請求項32に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項40

前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項39に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項41

6〜8のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項32に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項42

前記アンチセンス鎖が、5’末端の2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および3’末端の2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、前記センス鎖が、5’末端または3’末端のいずれかの少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項41に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項43

二重鎖の前記アンチセンス鎖の5’末端の1位における塩基対がAU塩基対である、請求項1または7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項44

前記Yヌクレオチドが、2’−フルオロ修飾を含む、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項45

前記Y’ヌクレオチドが、2’−O−メチル修飾を含む、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項46

p’>0である、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項47

p’=2である、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項48

q’=0であり、p=0であり、q=0であり、かつp’オーバーハングヌクレオチドが、標的mRNAに相補的である、請求項47に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項49

q’=0であり、p=0であり、q=0であり、かつp’オーバーハングヌクレオチドが、標的mRNAに非相補的である、請求項47に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項50

前記センス鎖が、合計21のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が、合計23のヌクレオチドを有する、請求項41に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項51

少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合されている、請求項46〜50のいずれか1項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項52

全てのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合されている、請求項51に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項53

表1または表2のいずれか一方に列記されているRNAi剤の群から選択される、請求項1または7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項54

AD−62994およびAD−62933からなる群から選択される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項55

AD−62994およびAD−62933である、請求項7に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項56

細胞でのHAO1の発現を阻害することができる二本鎖RNAi剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号1、配列番号2、配列番号5、または配列番号6のヌクレオチド配列のいずれか1つと3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号3、配列番号4、配列番号7、または配列番号8のヌクレオチド配列のいずれか1つと3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15の連続したヌクレオチドを含み、前記センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、2’−O−メチル修飾および2’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、前記センス鎖が、5’末端における2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、前記アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、2’−O−メチル修飾および2’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、前記アンチセンス鎖が、5’末端の2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および3’末端の2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつ前記センス鎖が、前記3’末端で二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNAc誘導体にコンジュゲートされている、二本鎖RNAi剤。

請求項57

前記センス鎖の全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む、請求項56に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項58

細胞でのHAO1(ヒドロキシ酸オキシダーゼ1)の発現を阻害することができる二本鎖RNAi剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、HAO1をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III)で表され:センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)式中:i、j、k、およびlが、それぞれ独立に0または1であり;p、p’、q、およびq’が、それぞれ独立に0〜6であり;各NaおよびNa’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜25のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各NbおよびNb’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜10のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;各np、np’、nq、およびnq’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、およびZ’Z’Z’がそれぞれ独立に、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり;Nbの修飾が、Yの修飾とは異なり、Nb’の修飾が、Y’の修飾とは異なり;かつ前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖RNAi剤。

請求項59

細胞でのHAO1(ヒドロキシ酸オキシダーゼ1)の発現を阻害することができる二本鎖RNAi剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、HAO1をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III)で表され:センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)式中:i、j、k、およびlが、それぞれ独立に0または1であり;各np、nq、およびnq’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し;p、q、およびq’が、それぞれ独立に0〜6であり;np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合され;各NaおよびNa’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜25のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各NbおよびNb’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜10のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、およびZ’Z’Z’がそれぞれ独立に、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり;Nbの修飾が、Yの修飾とは異なり、Nb’の修飾が、Y’の修飾とは異なり;かつ前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖RNAi剤。

請求項60

細胞でのHAO1(ヒドロキシ酸オキシダーゼ1)の発現を阻害することができる二本鎖RNAi剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、HAO1をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III)で表され:センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)式中:i、j、k、およびlが、それぞれ独立に0または1であり;各np、nq、およびnq’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し;p、q、およびq’が、それぞれ独立に0〜6であり;np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合され;各NaおよびNa’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜25のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各NbおよびNb’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜10のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、およびZ’Z’Z’がそれぞれ独立に、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり;Nbの修飾が、Yの修飾とは異なり、Nb’の修飾が、Y’の修飾とは異なり;かつ前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNac誘導体である、二本鎖RNAi剤。

請求項61

細胞でのHAO1(ヒドロキシ酸オキシダーゼ1)の発現を阻害することができる二本鎖RNAi剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、HAO1をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III)で表され:センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)式中:i、j、k、およびlが、それぞれ独立に0または1であり;各np、nq、およびnq’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し;p、q、およびq’が、それぞれ独立に0〜6であり;np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合され;各NaおよびNa’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜25のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各NbおよびNb’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜10のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、およびZ’Z’Z’がそれぞれ独立に、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり;Nbの修飾が、Yの修飾とは異なり、Nb’の修飾が、Y’の修飾とは異なり;前記センス鎖が、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み;かつ前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNac誘導体である、二本鎖RNAi剤。

請求項62

細胞でのHAO1(ヒドロキシ酸オキシダーゼ1)の発現を阻害することができる二本鎖RNAi剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、HAO1をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III)で表され:センス:5’np−Na−YYY−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(III)式中:各np、nq、およびnq’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し;p、q、およびq’が、それぞれ独立に0〜6であり;np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合され;各NaおよびNa’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである0〜25のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;YYYおよびY’Y’Y’がそれぞれ独立に、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり;前記センス鎖が、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み;かつ前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNac誘導体である、二本鎖RNAi剤。

請求項63

表1または表2に列記されているRNAi剤の群から選択されるRNAi剤。

請求項64

AD−62994およびAD−62933からなる群から選択される、請求項52に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項65

細胞でのHAO1の発現を阻害することができる改変アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物であって、前記作用剤が、表1または表2のいずれか一方に列記されている配列の群から選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、前記ポリヌクレオチドが、約14〜約30のヌクレオチド長である、組成物。

請求項66

請求項1、7、56、および58〜64のいずれか1項に記載の二本鎖RNAi剤を含むベクター

請求項67

請求項1、7、56、および58〜64のいずれか1項に記載の二本鎖RNAi剤を含む細胞。

請求項68

請求項1、7、56、および58〜64のいずれか1項に記載の二本鎖RNAi剤、または請求項65に記載の改変アンチセンスポリヌクレオチド剤、または請求項66に記載のベクターを含む医薬組成物

請求項69

RNAi剤が、非緩衝液中で投与される、請求項68に記載の医薬組成物。

請求項70

前記非緩衝液が、生理食塩水または水である、請求項69に記載の医薬組成物。

請求項71

前記siRNAが、緩衝液と共に投与される、請求項68に記載の医薬組成物。

請求項72

前記緩衝液が、酢酸塩クエン酸塩プロラミン炭酸塩、またはリン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項71に記載の医薬組成物。

請求項73

前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である、請求項72に記載の医薬組成物。

請求項74

細胞でのHAO1の発現を阻害する方法であって:(a)請求項1、7、56、および58〜64のいずれか1項に記載の二本鎖RNAi剤、または請求項65に記載の改変アンチセンスポリヌクレオチド剤、または請求項66に記載のベクター、または請求項68〜73のいずれか1項に記載の医薬組成物を前記細胞に接触させるステップ;および(b)ステップ(a)で得られた細胞を、HAO1遺伝子のmRNA転写物の分解を得えるのに十分な時間維持し、これにより前記細胞でのHAO1遺伝子の発現を阻害するステップを含む、方法。

請求項75

前記細胞が、対象の体内にある、請求項74に記載の方法。

請求項76

前記対象がヒトである、請求項75に記載の方法。

請求項77

前記HAO1の発現が、少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、または約100%阻害される、請求項74〜76のいずれか1項に記載の方法。

請求項78

HAO1関連障害を有する対象を処置する方法であって、治療有効量の、請求項1、7、56、および58〜64のいずれか1項に記載の二本鎖RNAi剤、または請求項65に記載の改変アンチセンスポリヌクレオチド剤、または請求項66に記載のベクター、または請求項68〜73のいずれか1項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、これにより前記対象を処置するステップを含む、方法。

請求項79

HAO1関連障害を有する対象を処置する方法であって、治療有効量の二本鎖RNAi剤を前記対象に皮下投与するステップを含み、前記二本鎖RNAi剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号1、配列番号2、配列番号5、または配列番号6のヌクレオチド配列のいずれか1つと3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号3、配列番号4、配列番号7、または配列番号8のヌクレオチド配列のいずれか1つと3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、2’−O−メチル修飾および2’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、前記アンチセンス鎖が、5’末端の2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および3’末端の2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、前記センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、2’−O−メチル修飾および2’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、前記センス鎖が、5’末端における2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつ前記センス鎖が、前記3’末端で二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNAc誘導体にコンジュゲートされ、これにより前記対象が処置される、方法。

請求項80

前記センス鎖の全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む、請求項79に記載の方法。

請求項81

前記対象がヒトである、請求項78または79に記載の方法。

請求項82

前記ヒトがPH1を有する、請求項81に記載の方法。

請求項83

前記二本鎖RNAi剤が、約0.01mg/kg〜約10mg/kgまたは約1mg/kg〜約10mg/kgの用量で投与される、請求項78または79に記載の方法。

請求項84

前記二本鎖RNAi剤が、約0.1mg/kg、約1.0mg/kg、または約3.0mg/kgの用量で投与される、請求項83に記載の方法。

請求項85

前記二本鎖RNAi剤が、約1mg/kg〜約10mg/kgの用量で投与される、請求項83に記載の方法。

請求項86

前記二本鎖RNAi剤が皮下投与される、請求項83に記載の方法。

請求項87

前記二本鎖RNAi剤が静脈内投与される、請求項83に記載の方法。

請求項88

前記RNAi剤が、2回以上で投与される、請求項83に記載の方法。

請求項89

前記RNAi剤が、約12時間に1回、約24時間に1回、約48時間に1回、約72時間に1回、および約96時間に1回からなる群から選択される間隔で投与される、請求項88に記載の方法。

請求項90

前記RNAi剤が、2週間まで、3週間まで、4週間まで、5週間まで、またはそれ以上まで週に1回投与される、請求項88に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、2014年10月10日出願の米国仮特許出願第62/062,751号明細書、2015年4月15日出願の同第62/147,976号明細書、および2015年9月4日出願の同第62/214,602号明細書の利益を請求するものである。

0002

配列表
本出願は、ASCII形式電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるものとする。2015年10月8日に作成された前記ASCIIコピーは、30864PCT_CRF_sequencelisting.txtという名称が付され、そのサイズは、735,705バイトである。

背景技術

0003

発明の背景
原発性シュウ酸尿症1型(PH1)は、グリオキシル酸代謝の常染色体劣性障害である。肝臓グリオキシル酸の解毒が、AGXT遺伝子の変異によって妨げられ、このAGXT遺伝子は、肝臓ペルオキシソームアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(AGT酵素をコードする。AGT1は、ヒドロキシプロリンの代謝分解における最終酵素である。中間代謝産物グリオキシル酸をグリシンに変換するAGT機能の喪失により、グリオキシル酸が蓄積し、グリオキシル酸は、ヒドロキシ酸オキシダーゼHAO1)としても知られる酵素グリコール酸オキシダーゼ(GO)によってシュウ酸塩酸化されるグリコール酸に還元される。

0004

グリオキシル酸塩、シュウ酸塩の重要な前駆体の調節が、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、およびサイトゾルを含む多数の細胞内の部位で生じる。PH1患者における過剰なシュウ酸塩は、腎臓によって十分に排出することができないため、シュウ酸カルシウム結晶が形成され、腎臓および尿路に蓄積する。シュウ酸による尿細管毒性、腎石灰沈着、および石による腎臓の閉塞の組み合わせによって腎障害が引き起こされる。30%を超える患者が、末期腎不全ESRD)に進行する。

0005

HAO1遺伝子は、グリコール酸オキシダーゼ(「GO」)としても知られる酵素ヒドロキシ酸オキシダーゼ1をコードする。HAO1タンパク質は、主に肝臓で発現され、かつグリコール酸に対して最も活性が高い2−ヒドロキシ酸オキシダーゼである。

0006

AGT1遺伝子が欠失されたPH1のマウスモデルでは、HAO1遺伝子が欠失された場合に尿中シュウ酸塩のレベルが低下する。

0007

PH1、AGXT、およびHAO1は、非特許文献1〜4に記載されている。

先行技術

0008

Angel L.Pey,Armando Albert, and Eduardo Salido,“Protein Homeostasis Defects of Alanine−Glyoxylate Aminotransferase:New Therapeutic Strategies in Primary Hyperoxaluria Type I,”BioMed Research International,vol. 2013,Article ID 687658,15 pages,2013.doi:10.1155/2013/687658
Cochat and Rumsby(2013)NEJM 369:7
Salido et al(2006)PNAS 103:18249
Baker et al(2004)American Journal of Physiology − Heart andCirculatory Physiology Published 1 October 2004Vol.287no.4,H1771−H1779DOI:10.1152/ajpheart.00234.2004

課題を解決するための手段

0009

発明の概要
本発明は、HAO1を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖iRNA剤を含む組成物を提供する。本発明はまた、HAO1の発現を阻害するためおよびHAO1関連疾患、例えば、PH1を処置するために本発明の組成物を使用する方法も提供する。

図面の簡単な説明

0010

図1は、ヒト(Homo sapiens)HAO1mRNAヌクレオチド配列(配列番号1)を示している。
図2は、ハツカネズミ(Mus musculus)HAO1 mRNAのヌクレオチド配列(配列番号2)を示している。
図3Aは、初代カニクイザル肝細胞でのGO(HAO)GalNac−siRNAコンジュゲートのin vitroスクリーニングの結果を示すグラフである。
図3Bは、初代カニクイザル肝細胞でのGO(HAO)GalNac−siRNAコンジュゲートの用量反応曲線を示すグラフである。
図4Aは、単回投与後のC57B6マウスでのGO(HAO)GalNac−siRNAコンジュゲートのin vivo評価の結果を示すグラフである。
図4Bは、単回投与後のC57B6マウスでのGO(HAO)GalNac−siRNAコンジュゲートのin vivo評価の結果を示すグラフである。
図5Aは、GO(HAO)GalNac−siRNAコンジュゲートで処置した後のAGXTノックアウト(KO)マウスでの尿中シュウ酸塩のレベルを示すグラフである。
図5Bは、GO(HAO)GalNac−siRNAコンジュゲートで処置した後のAGXTKOマウスでの尿中グリコール酸塩のレベルを示すグラフである。
図6Aは、AGXT siRNAの単回投与の72時間後のPH1のラットモデルでのAGXT mRNAのレベルを示すグラフである。
図6Bは、GO(HAO)GalNac−siRNAコンジュゲートでの処置の72時間後のPH1のラットモデルでの尿中シュウ酸塩のレベルを示すグラフである。
図6Cは、図示されているように、AF−011−63102およびAD−62994の両方の14日目および21日目の継続した毎週投与および24時間の尿の収集での49日間後のPH1のラットモデルでの尿中シュウ酸塩のレベルを示すグラフである。
図6Dは、ラットにおけるHAO1ノックダウンの期間を示すグラフである。PBSで処置されたラットに見られるレベル対して表された、4回の投与の最後から1週間後または4週間後(図6Cの28日目および49日目に対応する)のmRNAのレベルが示されている。
図7は、ヒト(Homo sapiens)HAO1 mRNAのヌクレオチド配列の逆相補配列(配列番号3)を示している。
ハツカネズミ(Mus musculus)HAO1 mRNAのヌクレオチド配列の逆相補配列(配列番号4)を示している。
図9は、カニクイザル(Macaca fascicularis)HAO1 mRNAのヌクレオチド配列(配列番号5)を示している。
図10は、ドブネズミ(Rattus norvegicus)HAO1 mRNAのヌクレオチド配列(配列番号6)を示している。
図11は、カニクイザル(Macaca fascicularis)HAO1 mRNAのヌクレオチド配列の逆相補配列(配列番号7)を示している。
図12は、ドブネズミ(Rattus norvegicus)HAO1 mRNAのヌクレオチド配列の逆相補配列(配列番号8)を示している。
図13は、GO GalNAcコンジュゲートのin vivoスクリーニングを示している。
図14は、マウスでのGO GalNAcコンジュゲートのin vivo評価を示すグラフである。
図15は、マウスでのGO GalNAcコンジュゲートの用量反応評価を示すグラフである。
図16は、マウスでのGO GalNAcコンジュゲートの用量反応評価を示すグラフである。
図17は、マウスでの用量反応評価を示すグラフである。
図18は、マウスでのmRNAノックダウンと血清中グリコール酸塩のレベルとの関係を示す2つのグラフである。
図19は、ラットでのmRNAノックダウンと血清中グリコール酸塩のレベルとの関係を示す2つのグラフである。
図20は、初代カニクイザル肝細胞でのALN−65585によるHAO1 mRNAの用量依存性阻害を示すグラフである。
図21は、マウスにおけるALN−GO1での単回投与処置後のHAO1 mRNAおよび血清中グリコール酸塩のレベルを示す2つのグラフである。
図22は、マウスにおけるALN−GO1での単回投与処置後のHAO1 mRNAサイレンシングの期間を示すグラフである。
図23は、ラットにおけるALN−GO1での単回投与処置後のHAO1 mRNAおよび血清中グリコール酸塩のレベルを示すグラフである。
図24は、ALN−GO1の単回投与後の原発性シュウ酸尿症I型のマウスモデルでの尿中シュウ酸塩およびグリコール酸塩のレベルを示す2つのグラフである。
図25Aは、ALN−GO1の単回投与後の原発性シュウ酸尿症I型のラットモデルでのHAO1 mRNAのレベルを示すグラフである。
図25Bは、ALN−GO1の単回投与後の原発性シュウ酸尿症I型のラットモデルでの尿中シュウ酸塩のレベルを示すグラフである。
図26は、ALN−GO1の反復投与後の原発性シュウ酸尿症I型のラットモデルでのHAO1 mRNAおよび尿中シュウ酸塩のレベルを示す2つのグラフである。
図27は、非ヒト霊長類での反復投与後のHAO1 mRNAおよび尿中グリコール酸塩のレベルを示す2つのグラフである。

0011

発明の詳細な説明
本発明は、HAO1を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤を含む組成物を提供する。本発明はまた、HAO1の発現を阻害するため、およびHAO1関連障害を処置するために本発明の組成物を使用する方法も提供する。

0012

I.定義
本発明をより容易に理解できるようにするために、まず特定の用語を定義する。加えて、パラメーター数値または数値範囲が述べられる場合は必ず、述べられる値に対する中間の値および範囲も本発明の一部であるものとすることに留意されたい。

0013

詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、1つまたは2つ以上の(即ち、少なくとも1つの)文法的な目的語である物品を指すために本明細書で使用される。例として、「1つの要素」は、1つの要素または2つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。

0014

「含む」という語は、「限定されるものではないが、〜を含む」というを意味し、この句と互換的に本明細書で使用される。

0015

「または」という語は、本明細書では、明確に否定する記載がない限り、「および/または」という語を意味し、かつ「および/または」と互換的に使用される。

0016

本明細書で使用される「HAO1」は、酵素ヒドロキシ酸オキシダーゼ1をコードする遺伝子を指す。他の遺伝子名としては、GO、GOX、GOX1、およびHAOX1が挙げられる。このタンパク質は、グリコール酸オキシダーゼおよび(S)−2−ヒドロキシ酸オキシダーゼとしても知られている。ヒトHAO1mRNAのGenBankアクセッション番号は、NM_017545.2であり;カニクイザル(Macaca fascicularis)HAO1 mRNAは、XM_005568381.1であり;ハツカネズミ(Mus musculus)HAO1 mRNAは、NM_010403.2であり;ドブネズミ(Rattus norvegicus)HAO1 mRNAは、XM_006235096.1である。

0017

本明細書で使用される「HAO1」という語は、自然に存在するHAO1遺伝子のDNA配列変異体、例えば、HAO1遺伝子における一塩基多型(SNP)も指す。例示的なSNPは、www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNPで利用可能なNCBI dbSNP Short Genetic Variationsデータベースで確認することができる。

0018

本明細書で使用される「標的配列」は、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAを含む、HAO1遺伝子の転写の際に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。

0019

本明細書で使用される「配列を含む鎖」という語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて参照されるこの配列によって示されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

0020

「G」、「C」、「A」、および「U」はそれぞれ、一般に、塩基としてグアニンシトシンアデニン、およびウラシルを含むヌクレオチドの略号である。「T」および「dT」は、本明細書では互換的に使用され、核酸塩基チミジン、例えば、デオキシリボチミン、2’−デオキシチミジン、またはチミジンであるデオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、または「デオキシリボヌクレオチド」という語は、詳細が後述される修飾ヌクレオチド、または代理置換部分(surrogate replacement moiety)も指すことがあることを理解されたい。当業者であれば、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対の特性を実質的に変更することなく、他の部分によって置換できることを十分に認識している。例えば、限定されるものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。従って、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって本発明のヌクレオチド配列において置換することができる。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。

0021

本明細書で互換的に使用される「iRNA」、「RNAi剤」、「iRNA剤」、「RNA干渉剤」という語は、本明細書で定義されるRNAを含む作用剤を指し、かつRNA誘導型サイレンシング複合体RISC経路によってRNA転写物の標的の切断を媒介する。iRNAは、RNA干渉(RNAi)としてのプロセスによってmRNAの配列特異的分解を誘導する。iRNAは、細胞、例えば、対象の細胞、例えば、哺乳動物対象の細胞におけるHAO1の発現を調節、例えば、阻害する。

0022

一実施形態では、本発明のRNAi剤は、標的RNA配列、例えば、HAO1標的mRNA配列相互作用して標的RNAの切断を誘導する一本鎖RNAを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内に導入される長い二本鎖RNAは、Dicerとして知られているIII型エンドヌクレアーゼによってsiRNAに分解されると考えられている(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer、リボヌクレアーゼII様酵素は、dsRNAを処理して、2塩基3’オーバーハングを特徴とする19〜23塩基対の短い干渉RNAにする(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。次いで、siRNAは、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)に取り込まれ、そこで、1つ以上のヘリカーゼが、siRNA二重鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が、標的の認識をガイドできるようになる(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。適切な標的mRNAに結合すると、RISC内の1つ以上のエンドヌクレアーゼが、標的を切断してサイレンシングを誘導する(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。従って、一態様では、本発明は、細胞内で生成されて、RISC複合体の形成を促進して標的遺伝子、例えば、HAO1遺伝子のサイレンシングを行う一本鎖RNA(siRNA)に関する。従って、「siRNA」という語は、本明細書では、上記のRNAiを指すためにも使用される。

0023

別の実施形態では、RNAi剤は、標的mRNAを阻害するために細胞または器官に導入される一本鎖siRNAであっても良い。一本鎖RNAi剤は、後に標的mRNAを切断するRISCエンドヌクレアーゼArgonaute 2に結合する。一本鎖siRNAは、一般に、15〜30のヌクレオチドであり、化学修飾されている。一本鎖siRNAのデザインおよび試験は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,101,348号明細書およびLima et al.,(2012) Cell 150:883−894に記載されている。本明細書に記載されるいずれのアンチセンスヌクレオチド配列も、本明細書に記載される一本鎖siRNAとして使用する、またはLima et al.,(2012) Cell 150;:883−894に記載されている方法によって化学修飾することができる。

0024

なお別の実施形態では、本発明は、HAO1を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子を提供する。「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子」は、標的mRNA(即ち、HAO1)内の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、mRNAに塩基対合して翻訳機構物理的に妨害することによって化学量論的に翻訳を阻害することができる。Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1:347−355を参照されたい。あるいは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的にハイブリダイズして、RNaseH切断事象によって標的を切断することによって標的mRNAを阻害する。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約10〜約30ヌクレオチド長であり得、かつ標的配列に相補的な配列を有する。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載のいずれか1つのアンチセンスヌクレオチド配列、例えば、表1または表2のいずれか1つに示される配列の少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20以上の連続したヌクレオチドである配列を含むことができる、または本明細書に記載の任意の標的部位に結合することができる。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、修飾RNA、DNA、またはこれらの組み合わせを含み得る。

0025

別の実施形態では、本発明の組成物、使用、および方法に使用される「iRNA」は、二本鎖RNAであり、本明細書では、「二本鎖RNAi剤」、「二本鎖RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA剤」、または「dsRNA」と呼ばれる。「dsRNA」という語は、標的RNA、即ち、HAO1遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」の向きを有するとされる、2つの逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を指す。本発明の一部の実施形態では、二本鎖RNA(dsRNA)が、本明細書ではRNA干渉またはRNAiと呼ばれる転写後遺伝子サイレンシング機構によって標的RNA、例えば、mRNAの分解を引き起こす。

0026

一般に、dsRNA分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に説明されるように、それぞれの鎖または両方の鎖が、1つ以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび/または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用される「RNAi剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得;RNAi剤は、多数のヌクレオチドの実質的な修飾を含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されるまたは当分野で公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。siRNA型分子で使用されるこのような修飾はいずれも、本明細書および特許請求の範囲において「RNAi剤」に包含される。

0027

二重鎖構造を形成する2本の鎖は、1つの大きいRNA分子の異なる部分でも良いし、または別個のRNA分子でも良い。2本の鎖が、1つの大きい分子の一部であり、従って、二重鎖構造を形成する一方の鎖の3’末端と他方の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって接続されている場合、接続するRNA鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。2本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の3’末端と他方の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合で接続されている場合、この接続構造は「リンカー」と呼ばれる。RNA鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、dsRNAの最も短い鎖のヌクレオチドの数から二重鎖に存在する全てのオーバーハングを減じた値である。二重鎖構造に加えて、RNAi剤は、1つの以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。本明細書で使用される「siRNA」という語も、上記のようなRNAi剤を指す。

0028

一実施形態では、本発明のRNAi剤は、標的RNA配列、例えば、HAO1標的mRNA配列と相互作用して標的RNAの切断を誘導する24〜30ヌクレオチドのdsRNAである。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内に導入される長い二本鎖RNAは、Dicerとして知られているIII型エンドヌクレアーゼによってsiRNAに分解される(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer、リボヌクレアーゼIII様酵素は、dsRNAを処理して、2つの塩基3’オーバーハングを特徴とする19〜23塩基対の短い干渉RNAにする(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。次いで、siRNAは、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)に取り込まれ、そこで、1つ以上のヘリカーゼが、siRNA二重鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が、標的の認識をガイドできるようになる(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。適切な標的mRNAに結合すると、RISC内の1つ以上のエンドヌクレアーゼが、標的を切断してサイレンシングを誘導する(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。

0029

本明細書で使用される「ヌクレオチドオーバーハング」は、RNAi剤の一方の鎖の3’末端が他方の鎖の5’末端を越えて延びている場合またはその逆の場合に、塩基対を形成していないヌクレオチド、またはRNAi剤の二重鎖構造から突き出たヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」とは、二本鎖RNAi剤の端部に塩基対を形成していないヌクレオチドが存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」RNAi剤とは、その全長に亘って二本鎖である、即ち、分子のいずれの端部にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないdsRNAのことである。本発明のRNAi剤は、一端にヌクレオチドオーバーハング(即ち、一端がオーバーハングで、他端が平滑末端)を有する、または両端にヌクレオチドオーバーハングを有するRNAi剤を含む。

0030

「アンチセンス鎖」という語は、標的配列(例えば、ヒトHAO1mRNA)に実質的に相補的な領域を含む二本鎖RNAi剤の鎖を指す。本明細書で使用される「HAO1をコードするmRNAの一部に相補的な領域」という語は、HAO1mRNA配列の一部に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に完全には相補的でない場合、ミスマッチは、末端領域で最も許容され、存在する場合は、一般に末端領域、または、例えば、5’および/または3’末端の6、5、4、3、もしくは2ヌクレオチド以内の領域である。

0031

本明細書で使用される「センス鎖」という語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含むdsRNAの鎖を指す。

0032

本明細書で使用される「切断領域」という語は、切断部位のすぐ近傍に位置する領域を指す。切断部位は、切断が起こる標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端部およびこの切断部位のすぐ近傍の3つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端部およびこの切断部位のすぐ近傍の2つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド10および11によって結合された部位に特異的に存在し、切断領域は、ヌクレオチド11、12、および13を含む。

0033

特段の記載がない限り、本明細書で使用される「相補的な」という語は、第2のヌクレオチド配列に対する第1のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下で、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指し、当業者には理解される。このような条件は、例えば、ストリンジェント条件とすることができ、このストリンジェント条件は:400mMのNaCl、40mMのPIPESpH6.4、1mMのEDTA、50oCまたは70oCで12〜16時間、これに続く洗浄を含み得る。他の条件、例えば、生物体内で遭遇し得る生理的に適切な条件を適用することができる。例えば、相補的な配列は、例えば、RNAiになるために核酸関連機能を果たすのに十分である。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従った2つの配列の相補性の試験に最も適切な一連の条件を決定することができる。

0034

第1および第2のヌクレオチド配列の全長に亘って、第1のヌクレオチド配列のヌクレオチドと第2のヌクレオチド配列のヌクレオチドとの塩基対合が存在する場合、配列は、互いに対して「完全に相補的」であり得る。しかしながら、本明細書では、第1の配列が、第2の配列に対して「実質的に相補的」であると述べられる場合、2つの配列が、完全に相補的であり得る、または2つの配列が、最終的な適用に対して最も適した条件下でハイブリダイズする能力を維持したまま、ハイブリダイゼーション時に4つ、3つ、または2つを超えない、1つ以上のミスマッチの塩基対を形成し得る。しかしながら、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に1つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に係るミスマッチとは見なされるべきではない。例えば、21ヌクレオチド長さの1つのオリゴヌクレオチドと、23ヌクレオチド長さの別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的である21ヌクレオチドの配列を含むdsRNAはなお、本明細書に記載される目的のために「完全に相補的」であると言うことができる。

0035

本明細書で使用される「相補的な」配列は、相補的な配列のハイブリダイズする能力についての上記の要件が満たされるのであれば、非ワトソンクリック塩基対および/または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含んでも良いし、またはワトソン・クリック塩基対および/または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対から完全に形成されても良い。このような、非ワトソン・クリック塩基対としては、限定されるものではないが、G:Uゆらぎ塩基対形成またはフーグスタイ塩基対形成(Hoogstein base pairing)が挙げられる。

0036

本明細書の「相補的な」、「完全に相補的な」、および「実質的に相補的な」という語は、これらの使用の文脈から分かるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の塩基のマッチ、またはdsRNAのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基のマッチに対して使用することができる。

0037

本明細書で使用される、メッセンジャーRNA(mRNA)の「少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、または3’UTRを含む目的のmRNA(例えば、HAO1をコードするmRNA)の連続した部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列が、HAO1をコードするmRNAの連続した部分に実質的に相補的である場合、HAO1 mRNAの少なくとも一部に相補的である。

0038

本明細書で使用される「阻害する」という語は、「減少させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、および他の同様の語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。

0039

本明細書で使用される「HAO1の発現を阻害する」という句は、あらゆるHAO1遺伝子(例えば、マウスHAO1遺伝子、ラットHAO1遺伝子、サルHAO1遺伝子、またはヒトHAO1遺伝子など)およびHAO1遺伝子の変異体(例えば、自然に存在する変異体)または突然変異体の発現の阻害を含む。従って、HAO1遺伝子は、野生型HAO1遺伝子、突然変異HAO1遺伝子、または遺伝子操作された細胞、細胞群、もしくは生物の文脈における遺伝子組換えHAO1遺伝子であっても良い。

0040

「HAO1遺伝子の発現を阻害する」は、HAO1遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、HAO1遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制、例えば、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の阻害を含む。

0041

HAO1遺伝子の発現を、HAO1遺伝子の発現に関連した任意の変数のレベル、例えば、組織でのHAO1mRNAのレベルまたはHAO1タンパク質のレベル、および/または尿中シュウ酸塩のレベルなどに基づいて評価することができる。阻害は、対照レベルと比較した1つ以上のこれらの変数の絶対レベルまたは相対レベルの低下によって評価することができる。対照レベルは、当分野で利用されているあらゆるタイプの対照レベル、例えば、投薬ベースラインレベル、または未処置もしくは対照(例えば、緩衝液のみの対照もしくは不活性剤の対照)で処置された類似の対象、細胞、もしくはサンプルから決定されるレベルであり得る。

0042

本明細書で使用される「細胞に二本鎖RNAi剤を接触させる」という句は、任意の可能な手段によって細胞に接触させることを含む。細胞に二本鎖RNAi剤を接触させるは、in vitroで細胞にRNAi剤を接触させること、またはin vivoで細胞にRNAi剤を接触させることを含む。このような接触は、直接的または間接的に行うことができる。従って、例えば、RNAi剤を、方法を行う個人によって細胞に物理的に接触させることができる、あるいは、RNAi剤を、後に細胞への接触を可能にするまたは接触させる状況に置くことができる。

0043

in vitroでの細胞の接触は、例えば、細胞をRNAi剤と共にインキュベートすることによって行うことができる。in vivoでの細胞の接触は、例えば、細胞が位置する組織もしくはその近傍にRNAi剤を注入することによって、または接触させられる細胞が位置する組織にRNAi剤が後に到達するように別の領域、血流もしくは皮下腔にRNAi剤を注入することによって行うことができる。例えば、RNAi剤は、RNAi剤を目的の部位、例えば、肝臓に誘導するリガンド、例えば、GalNAc3リガンドを含んでも良いし、かつ/またはリガンドに結合しても良い。接触させるin vitro法とin vivo法の組み合わせも可能である。本発明の方法に関連して、細胞をin vitroでRNAi剤に接触させて、後に対象に移植することができる。

0044

本明細書で使用される「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物を含む。対象は、トランスジェニック生物を含み得る。最も好ましくは、対象は、ヒト、例えば、HAO1関連障害に罹患しているまたはこの障害を発症しやすいヒトである。

0045

本明細書で使用される「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトまたはサルを含むものとする。最も好ましくは、対象または患者はヒトである。

0046

本明細書で使用される「HAO1関連障害」は、HAO1の発現を阻害することによって、処置もしくは防止することができるあらゆる障害、または緩和することができる症状を含むものとする。例としては、限定されるものではないが、原発性シュウ酸尿症1型(PH1)が挙げられる。

0047

本明細書で使用される「治療有効量」は、HAO1関連疾患を治療するために患者に投与されたときに、この疾患を治療する(例えば、既存の疾患または疾患の1つ以上の症状を軽減する、改善する、または維持する)のに十分なRNAi剤の量を含むものとする。「治療有効量」は、RNAi剤、RNAi剤が投与される方法、疾患およびその重症度病歴年齢、体重、家族歴遺伝子構造、HAO1発現によって媒介される病的過程の段階、以前の治療または併用療法の種類(存在する場合)、および治療される患者の他の個人的な特徴によって異なり得る。

0048

本明細書で使用される「予防有効量」は、HAO1関連疾患に罹患していない、またはその症状を示していないがこの疾患に罹患する可能性がある患者に投与されたときに、この疾患またはその1つ以上の症状を防止または改善するのに十分なRNAi剤の量を含むものとする。この疾患を改善することは、疾患の進行を遅延させること、または後に発症する疾患の重症度を軽減することを含む。「予防有効量」は、RNAi剤、RNAi剤が投与される方法、疾患のリスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、以前の治療または併用療法の種類(存在する場合)、および治療される患者の他の個人的な特徴によって異なり得る。

0049

「治療有効量」または「予防有効量」はまた、あらゆる治療に適用可能な妥当な効果/リスク比である程度の望ましい局所効果または全身効果が得られるRNAi剤の量も含む。本発明の方法に利用されるRNAi剤は、このような治療に適用可能な妥当な効果/リスク比をもたらす十分な量を投与することができる。

0050

本明細書で使用される「サンプル」という語は、対象から単離される同様の液体、細胞、または組織の採取物、および対象の体内に存在する液体、細胞、または組織を含む。生体液の例として、血液、血清、および漿膜液、血漿脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、および唾液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、器官、または局所領域からのサンプルを挙げることができる。例えば、サンプルは、特定の器官、器官の一部、またはこれらの器官内の液体もしくは細胞に由来し得る。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓(例えば、全肝臓、肝臓の特定の部分、もしくは肝臓の特定の種類の細胞、例えば、肝細胞)に由来し得る。一部の実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取された血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象に由来する肝組織(もしくはその小成分)を指す。

0051

II.本発明のdsRNAiRNA剤
細胞、例えば、対象、例えば、哺乳動物、例えば、HAO1関連障害を有するヒトの細胞でのHAO1遺伝子の発現を阻害する二本鎖RNAi剤、およびこのような二本鎖RNAi剤の使用が、本明細書に記載されている。

0052

従って、本発明は、in vivoでの標的遺伝子(即ち、HAO1遺伝子)の発現を阻害することができる化学修飾を有する二本鎖RNAi剤を提供する。

0053

以下により詳細に示されているように、本発明の特定の態様では、本発明のiRNAのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。本発明の他の実施形態では、本発明のiRNAのヌクレオチドの全てが修飾されている。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」本発明のiRNAは、大部分が修飾されているが全てが修飾されているのではなく、5つ以下、4つ以下、3つ以下、2つ以下、または1つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。

0054

RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。RNAi剤の各鎖は、12〜30ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、14〜30ヌクレオチド長、17〜30ヌクレオチド長、19〜30ヌクレオチド長、25〜30ヌクレオチド長、27〜30ヌクレオチド長、17〜23ヌクレオチド長、17〜21ヌクレオチド長、17〜19ヌクレオチド長、19〜25ヌクレオチド長、19〜23ヌクレオチド長、19〜21ヌクレオチド長、21〜25ヌクレオチド長、または21〜23ヌクレオチド長であり得る。

0055

各鎖は、12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、26ヌクレオチド長、27ヌクレオチド長、28ヌクレオチド長、29ヌクレオチド長、または30ヌクレオチド長であり得る。RNAi剤の各鎖は、同じ長さであっても良いし、または異なる長さであっても良い。

0056

センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には二重鎖の二本鎖RNA(dsRNA)を形成し、本明細書ではRNAi剤とも呼ばれる。RNAi剤の二重鎖領域は、12〜30ヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、二重鎖領域は、14〜30ヌクレオチド対の長さ、17〜30ヌクレオチド対の長さ、27〜30ヌクレオチド対の長さ、17〜23ヌクレオチド対の長さ、17〜21ヌクレオチド対の長さ、17〜19ヌクレオチド対の長さ、19〜25ヌクレオチド対の長さ、19〜23ヌクレオチド対の長さ、19〜21ヌクレオチド対の長さ、21〜25ヌクレオチド対の長さ、または21〜23ヌクレオチド対の長さであり得る。別の例では、二重鎖領域は、15ヌクレオチド対の長さ、16ヌクレオチド対の長さ、17ヌクレオチド対の長さ、18ヌクレオチド対の長さ、19ヌクレオチド対の長さ、20ヌクレオチド対の長さ、21ヌクレオチド対の長さ、22ヌクレオチド対の長さ、23ヌクレオチド対の長さ、24ヌクレオチド対の長さ、25ヌクレオチド対の長さ、26ヌクレオチド対の長さ、および27ヌクレオチド対の長さから選択される。

0057

一実施形態では、RNAi剤は、一方または両方の鎖の3’末端、5’末端、または両末端に1つ以上のオーバーハング領域および/またはキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、1〜6ヌクレオチド長、例えば、2〜6ヌクレオチド長、1〜5ヌクレオチド長、2〜5ヌクレオチド長、1〜4ヌクレオチド長、2〜4ヌクレオチド長、1〜3ヌクレオチド長、2〜3ヌクレオチド長、または1〜2ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長いこと、または同じ長さの2本の鎖がずれていることで生じ得る。オーバーハングは、標的mRNAとミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的である遺伝子配列に相補的であり得る、または別の配列であり得る。第1の鎖および第2の鎖は、例えば、追加の塩基によって連結してヘアピンを形成しても良いし、または他の非塩基リンカーによって連結しても良い。

0058

一実施形態では、RNAi剤のオーバーハング領域におけるヌクレオチドはそれぞれ独立して、限定されるものではないが、2’−糖修飾、例えば、2−F、2’−O−メチル、チミジン(T)、2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン(Teo)、2’−O−メトキシエチルアデノシンAeo)、2’−O−メトキシエチル−5−メチルシチジン(m5Ceo)、およびこれらの任意の組み合わせを含め、修飾されたヌクレオチドであっても良いし、または非修飾ヌクレオチドであっても良い。例えば、TTは、いずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列とすることができる。オーバーハングは、標的mRNAとのミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、もしくは別の配列であっても良い。

0059

RNAi剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖における5’または3’オーバーハングは、リン酸化されても良い。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、間にホスホロチオエートを有する2つのヌクレオチドを含み、この2つのヌクレオチドは、同じヌクレオチドでも良いし、異なるヌクレオチドでも良い。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の3’末端に存在する。一実施形態では、この3’オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この3’オーバーハングは、センス鎖に存在する。

0060

RNAi剤は、その全体的な安定性に影響を与えることなく、RNAiの干渉活性を強めることができる1つのオーバーハングのみを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の3’末端、あるいはアンチセンス鎖の3’末端に位置し得る。RNAiは、アンチセンス鎖の5’末端(またはセンス鎖の3’末端)(あるいはその逆)に位置する平滑末端も有し得る。一般に、RNAiのアンチセンス鎖は、3’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、5’末端が平滑である。理論に拘束されることを望むものではないが、アンチセンス鎖の5’末端の非対称平滑末端およびアンチセンス鎖の3’末端オーバーハングは、RISCプロセスに付加されるガイド鎖好む

0061

合成および修飾
本発明で取り上げられる任意の核酸、例えば、RNAiは、当分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USAに記載されているような方法によって合成および/または修飾することができる。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、5’末端修飾(リン酸化、結合、逆連結)または3’末端修飾(結合、DNAヌクレオチド、逆連結など);塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、もしくは幅広レパートリーパートナーと塩基対合する塩基での置換、塩基の除去(脱塩基ヌクレオチド)、または共役塩基ホスホジエステル結合の修飾もしくは置換を含む糖修飾(例えば、2’位置もしくは4’位置)または糖の置換;および/または主鎖の修飾が挙げられる。本明細書に記載の実施形態に有用なiRNA化合物の特定の例としては、限定されるものではないが、修飾主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むRNAが挙げられる。修飾主鎖を有するRNAとしては、特に、主鎖にリン原子を有していないRNAが挙げられる。本明細書においては、当分野で時々言及されるように、そのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有していない修飾RNAは、オリゴヌクレオシドと見なすこともできる。一部の実施形態では、修飾iRNAは、そのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有する。

0062

修飾RNA主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホジチオエート、ホスホトリエステルアミノアルキルホスホトリエステル、3’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および直鎖状の3’−5’結合を有するボラノホスフェート、これらの2’−5’結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が3’−5’から5’−3’または2’−5’から5’−2’に結合されている逆の極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸型も含まれる。

0063

上記のリン含有結合の形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第3,687,808号明細書;同第4,469,863号明細書;同第4,476,301号明細書;同第5,023,243号明細書;同第5,177,195号明細書;同第5,188,897号明細書;同第5,264,423号明細書;同第5,276,019号明細書;同第5,278,302号明細書;同第5,286,717号明細書;同第5,321,131号明細書;同第5,399,676号明細書;同第5,405,939号明細書;同第5,453,496号明細書;同第5,455,233号明細書;同第5,466,677号明細書;同第5,476,925号明細書;同第5,519,126号明細書;同第5,536,821号明細書;同第5,541,316号明細書;同第5,550,111号明細書;同第5,563,253号明細書;同第5,571,799号明細書;同第5,587,361号明細書;同第5,625,050号明細書;同第6,028,188号明細書;同第6,124,445号明細書;同第6,160,109号明細書;同第6,169,170号明細書;同第6,172,209号明細書;同第6,239,265号明細書;同第6,277,603号明細書;同第6,326,199号明細書;同第6,346,614号明細書;同第6,444,423号明細書;同第6,531,590号明細書;同第6,534,639号明細書;同第6,608,035号明細書;同第6,683,167号明細書;同第6,858,715号明細書;同第6,867,294号明細書;同第6,878,805号明細書;同第7,015,315号明細書;同第7,041,816号明細書;同第7,273,933号明細書;同第7,321,029号明細書;米国再特許第39464号明細書が挙げられる。

0064

リン原子を含んでいない修飾RNA主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらの修飾RNA主鎖としては、モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される)を有する主鎖;シロキサン主鎖スルフィドスルホキシド、およびスルホン主鎖;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖;アルケン含有主鎖;スルファメート主鎖;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖;スルホネートおよびスルホンアミド主鎖;アミド主鎖;ならびに混合されたN、O、S、およびCH2構成成分を有する他の主鎖が挙げられる。

0065

上記のオリゴヌクレオシドの形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第5,034,506号明細書;同第5,166,315号明細書;同第5,185,444号明細書;同第5,214,134号明細書;同第5,216,141号明細書;同第5,235,033号明細書;同第5,64,562号明細書;同第5,264,564号明細書;同第5,405,938号明細書;同第5,434,257号明細書;同第5,466,677号明細書;同第5,470,967号明細書;同第5,489,677号明細書;同第5,541,307号明細書;同第5,561,225号明細書;同第5,596,086号明細書;同第5,602,240号明細書;同第5,608,046号明細書;同第5,610,289号明細書;同第5,618,704号明細書;同第5,623,070号明細書;同第5,663,312号明細書;同第5,633,360号明細書;同第5,677,437号明細書;および同第5,677,439号明細書が挙げられる。

0066

他の実施形態では、iRNAに使用されるように企図され、このように使用される場合、適切なRNA模倣物が、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、即ち、主鎖の両方が新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。1つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているRNA模倣物は、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物では、RNAの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は、維持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合されている。PNA化合物の形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第5,539,082号明細書;同第5,714,331号明細書;および同第5,719,262号明細書が挙げられる。本発明のiRNAに使用するのに適したさらなるPNA化合物は、例えば、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497−1500に記載されている。

0067

本発明で取り上げられる一部の実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するRNA、ならびにヘテロ原子主鎖、特に、上記参照した米国特許第5,489,677号明細書の−CH2−NH−CH2−、−CH2−N(CH3)−O−CH2−[メチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖として知られている]、−CH2−O−N(CH3)−CH2−、−CH2−N(CH3)−N(CH3)−CH2−およびN(CH3)−CH2−CH2−[天然ホスホジエステル主鎖は、−O−P−O−CH2−として表される]、および上記参照した米国特許第5,602,240号明細書のアミド主鎖を有するオリゴヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げられるRNAは、上記参照した米国特許第5,034,506号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。

0068

修飾RNAは、1つ以上の置換糖部分も含み得る。本発明で取り上げられるiRNA、例えば、dsRNAは、2’位置に以下の1つを含み得る:OH;F;O−、S−、もしくはN−アルキル;O−、S−、もしくはN−アルケニル;O−、S−、もしくはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換C1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的かつ適切な修飾は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2を含み、式中、nおよびmは、1〜約10である。他の実施形態では、dsRNAは、2’位置に以下の1つを含む:C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルアラルキル、O−アルカリル、またはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキルヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基インターカレーター、iRNAの薬理学的特性を改善するための基、またはiRNAの薬理学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基を含む。一部の実施形態では、修飾は、2’−メトキシエトキシ(2’−O−CH2CH2OCH3、2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOEとしても知られている)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78:486−504)、即ち、アルコキシアルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下の本明細書の実施例で説明される、2’−DMAOEとしても知られる、2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、O(CH2)2ON(CH3)2基、および2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(当分野では2’−O−ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’−DMAEOEとしても知られている)、即ち、2’−O−CH2−O−CH2−N(CH2)2である。

0069

他の修飾は、2’−メトキシ(2’−OCH3)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCH2CH2CH2NH2)、および2’−フルオロ(2’−F)を含む。同様の修飾を、iRNAのRNAにおける他の位置、特に、3’末端ヌクレオチドの糖の3’位置または2’−5’結合dsRNA、および5’末端ヌクレオチドの5’位置にも設けることができる。iRNAは、例えば、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣物、例えば、シクロブチル部分を有することもできる。このような修飾糖構造の形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第4,981,957号明細書;同第5,118,800号明細書;同第5,319,080号明細書;同第5,359,044号明細書;同第5,393,878号明細書;同第5,446,137号明細書;同第5,466,786号明細書;同第5,514,785号明細書;同第5,519,134号明細書;同第5,567,811号明細書;同第5,576,427号明細書;同第5,591,722号明細書;同第5,597,909号明細書;同第5,610,300号明細書;同第5,627,053号明細書;同第5,639,873号明細書;同第5,646,265号明細書;同第5,658,873号明細書;同第5,670,633号明細書;および同第5,700,920号明細書が挙げられ、これらの一部は、所有者が本出願人である。これらの各特許の全開示内容は、参照により本明細書に組み入れられる。

0070

iRNAは、核酸塩基(当分野では単純に「塩基」と呼ばれることが多い)修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン(A)およびグアニン(G)、およびピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)を含む。修飾核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えば、デオキシ−チミン(dT)、5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシンキサンチンヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾウシル、6−アゾシトシン、および6−アゾチミン、5−ウラシル(ウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル、および他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニン、ならびに3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンを含む。さらなる核酸塩基は、米国特許第3,687,808号に開示されている核酸塩基、Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley−VCH,2008に開示されている核酸塩基;The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858−859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley&Sons,1990に開示されている核酸塩基、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613に開示されている核酸塩基、およびSanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289−302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRCPress,1993に開示されている核酸塩基を含む。これらの特定の核酸塩基は、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらは、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、ならびに2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル、および5−プロピニルシトシンを含むN−2、N−6、および0−6置換プリンを含む。5−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃高めることが示され(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276−278)、特に2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられると、さらに例示的な塩基置換である。

0071

上記の特定の修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基の形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、上記の米国特許第3,687,808号明細書;同第4,845,205号明細書;同第5,130,30号明細書;同第5,134,066号明細書;同第5,175,273号明細書;同第5,367,066号明細書;同第5,432,272号明細書;同第5,457,187号明細書;同第5,459,255号明細書;同第5,484,908号明細書;同第5,502,177号明細書;同第5,525,711号明細書;同第5,552,540号明細書;同第5,587,469号明細書;同第5,594,121号明細書;同第5,596,091号明細書;同第5,614,617号明細書;同第5,681,941号明細書;同第5,750,692号明細書;同第6,015,886号明細書;同第6,147,200号明細書;同第6,166,197号明細書;同第6,222,025号明細書;同第6,235,887号明細書;同第6,380,368号明細書;同第6,528,640号明細書;同第6,639,062号明細書;同第6,617,438号明細書;同第7,045,610号明細書;同第7,427,672号明細書;および同第7,495,088号明細書が挙げられる。

0072

iRNAのRNAは、1つ以上のロックド核酸(LNA)を含むように修飾することもできる。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、このリボース部分は、2’と4’炭素を結合するさらなる架橋を含む。この構造は、リボースを3’内部構造立体構造に効果的に「ロック」する。ロックド核酸のsiRNAへの付加は、血清中でのsiRNAの安定性を高め、かつ標的外の影響を低減することが示されている(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic AcidsResearch 33(1):439−447;Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833−843;Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185−3193)。

0073

ロックド核酸ヌクレオチドの形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる:参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第6,268,490号明細書;同第6,670,461号明細書;同第6,794,499号明細書;同第6,998,484号明細書;同第7,053,207号明細書;同第7,084,125号明細書;および同第7,399,845号明細書。

0074

潜在的に安定させるRNA分子の末端の修飾は、N−(アセチルアミノカプロイル)−4−ヒドロキシプロリノール(Hyp−C6−NHAc)、N−(カプロイル−4−ヒドロキシプロリノール(Hyp−C6)、N−アセチル−4−ヒドロキシプロリノール(Hyp−NHAc)、チミジン−2’−0−デオキシチミジン(エーテル)、N−(アミノカプロイル)−4−ヒドロキシプロリノール(Hyp−C6−アミノ)、2−ドコサノイル−ウリジン−3’’−ホスフェート、および逆塩基dT(idT)などを含み得る。この修飾の開示は、PCT国際公開特許第2011/005861号パンフレットで確認することができる。

0075

本発明のモチーフを含む修飾iRNA
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖RNAi剤は、例えば、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、2011年11月18日に出願の米国仮特許出願第61/561,710号明細書、または2012年11月16日に出願され、国際公開第2013075035 A1号パンフレットとして公開された国際出願PCT/US2012/065691号明細書に開示されているような化学修飾を有する作用剤を含む。

0076

本明細書および米国仮特許出願第61/561,710号明細書に示されているように、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾の1つ以上のモチーフをRNAi剤のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖、特に切断部位またはその近傍に導入することによって優れた結果を得ることができる。一部の実施形態では、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、別の方法で完全に修飾することができる。これらのモチーフの導入により、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の修飾パターンが存在する場合は、これを中断することができる。RNAi剤は、任意選択により、例えばセンス鎖にあるGalNAc誘導体リガンドにコンジュゲートされ得る。得られるRNAi剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。

0077

より詳細には、驚くべきことに、二本鎖RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、RNAi剤の少なくとも一方の鎖の切断部位またはその近傍における3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾の1つ以上のモチーフを有するように修飾された場合、RNAi剤の遺伝子サイレンシング活性が最高に高められることが見出された。

0078

一実施形態では、RNAi剤は、19のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖(double ended bluntmer)であり、センス鎖は、5’末端の7位、8位、9位の3つの連続したヌクレオチドにおける3つの2’−F修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、5’末端の11位、12位、13位の3つの連続したヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含む。

0079

別の実施形態では、RNAi剤は、20のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、5’末端の8位、9位、10位の3つの連続したヌクレオチドにおける3つの2’−F修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、5’末端の11位、12位、13位の3つの連続したヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含む。

0080

また別の実施形態では、RNAi剤は、21のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、5’末端の9位、10位、11位の3つの連続したヌクレオチドにおける3つの2’−F修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、5’末端の11位、12位、13位の3つの連続したヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含む。

0081

一実施形態では、RNAi剤は、21ヌクレオチドのセンス鎖および23ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、このセンス鎖は、5’末端の9位、10位、11位における3つの連続したヌクレオチドの3つの2’−F修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含み;このアンチセンス鎖は、5’末端の11位、12位、13位における3つの連続したヌクレオチドの3つの2’−O−メチル修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含み、RNAi剤の一端は平滑であるが、他端は、2ヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、2ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の3’末端にある。2ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の3’末端にある場合は、末端の3つのヌクレオチド間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し得、3つのヌクレオチドのうちの2つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接した対合ヌクレオチドである。一実施形態では、RNAi剤は、センス鎖の5’末端およびアンチセンス鎖の5’末端の両方における末端の3つのヌクレオチド間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有する。一実施形態では、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、モチーフの一部であるヌクレオチドを含め、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基は、例えば交互モチーフにおいて、2’−O−メチルまたは3’−フルオロで独立に修飾されている。任意選択により、RNAi剤は、リガンド(好ましくはGalNAc3)をさらに含む。

0082

一実施形態では、RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、RNAi剤は、少なくとも25、最大で29のヌクレオチド長さを有する第1の鎖、および5’末端から11位、12位、13位にある3つの連続したヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾からなる少なくとも1つのモチーフを有する、最大で30のヌクレオチド長さを有する第2の鎖を含み;第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端は、平滑末端を形成し、第2の鎖は、3’末端で第1の鎖よりも1〜4ヌクレオチド長く、二重鎖領域は、少なくとも25のヌクレオチド長さであり、第2の鎖は、RNAi剤が哺乳動物の細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を低減するように、第2の鎖の長さの少なくとも19のヌクレオチドに沿って標的mRNAに十分に相補的であり、RNAi剤のダイサー切断(dicer cleavage)が、優先的に第2の鎖の3’末端を含むsiRNAをもたらし、これにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減する。任意選択で、RNAi剤は、リガンドをさらに含む。

0083

一実施形態では、RNAi剤のセンス鎖は、3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含み、モチーフの1つは、センス鎖の切断部位に存在する。

0084

一実施形態では、RNAi剤のアンチセンス鎖も、3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含んでも良く、モチーフの1つは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。

0085

17〜23のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有するRNAi剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には、5’末端から10位、11位、および12位の付近である。従って、3つの同一の修飾からなるモチーフは、アンチセンス鎖の9位、10位、11位;10位、11位、12位;11位、12位、13位;12位、13位、14位;13位、14位、15位に存在しても良く、この位置は、アンチセンス鎖の5’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる、またはアンチセンス鎖の5’末端の二重鎖領域内の最初の対を形成したヌクレオチドから数え始められる。アンチセンス鎖の切断部位はまた、5’末端のRNAi剤の二重鎖領域の長さに従って変更され得る。

0086

RNAi剤のセンス鎖は、その鎖の切断部位の3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなる少なくとも1つのモチーフを含むことができ;アンチセンス鎖は、その鎖の切断部位またはその近傍の3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなる少なくとも1つのモチーフを有し得る。センス鎖とアンチセンス鎖がdsRNA二重鎖を形成する場合は、センス鎖とアンチセンス鎖は、センス鎖の3つのヌクレオチドからなる1つのモチーフおよびアンチセンス鎖の3つのヌクレオチドからなる1つのモチーフが、少なくとも1つのヌクレオチドのオーバーラップ、即ち、センス鎖のモチーフの3つのヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、アンチセンス鎖のモチーフの3つのヌクレオチドのうちの少なくとも1つと塩基対を形成するように整列させることができる。あるいは、少なくとも2つのヌクレオチドがオーバーラップする、または3つ全てのヌクレオチドがオーバーラップしても良い。

0087

一実施形態では、RNAi剤のセンス鎖は、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる2つ以上のモチーフを含むことができる。第1のモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在することがあり、他方のモチーフは、ウィング修飾(wing modification)であっても良い。本明細書の「ウィング修飾」という語は、鎖の切断部位またはその近傍のモチーフから離れた同じ鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウィング修飾は、第1のモチーフの近傍であるか、または少なくとも1つ以上のヌクレオチドによって離隔している。モチーフが、その性質化学的よりも互いに接近している場合は、モチーフは互いに異なり、モチーフが、その化学的性質よりも1つ以上のヌクレオチドによって離隔している場合は、モチーフは、同じであるか、または異なることもある。2つ以上のウィング修飾が存在しても良い。例えば、2つのウィング修飾が存在する場合、各ウィング修飾は、切断部位もしくはその近傍の第1のモチーフに対する一端に、またはリードモチーフ(lead motif)のいずれかの側に存在し得る。

0088

センス鎖と同様に、RNAi剤のアンチセンス鎖は、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる2つ以上のモチーフを含み得、少なくとも1つのモチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウィング修飾と同様の配列で1つ以上のウィング修飾も含み得る。

0089

一実施形態では、RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウィング修飾は、典型的には、鎖の3’末端、5’末端、または両方の末端の最初の1つまたは2つの末端ヌクレオチドを含まない。

0090

別の実施形態では、RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウィング修飾は、典型的には、鎖の3’末端、5’末端、または両方の末端の二重鎖領域内の最初の1つまたは2つの塩基対形成ヌクレオチドを含まない。

0091

RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも1つのウィング修飾を含む場合、このウィング修飾は、二重鎖領域の同じ末端に存在しても良く、1つ、2つ、または3つのヌクレオチドのオーバーラップを有する。

0092

RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも2つのウィング修飾を含む場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、1つの鎖の2つの修飾がそれぞれ、二重鎖領域の一端に位置して1つ、2つ、または3つのヌクレオチドのオーバーラップを有する;1つの鎖の2つの修飾がそれぞれ、二重鎖領域の他端に位置して1つ、2つ、または3つのヌクレオチドのオーバーラップを有する;1つの鎖の2つの修飾が、リードモチーフの各側に位置して、二重鎖領域に1つ、2つ、または3つのヌクレオチドのオーバーラップを有する、ように整列させることができる。

0093

一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖における各ヌクレオチドを修飾しても良い。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾しても良く、この修飾は、非結合リン酸酸素および/または1つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の1つ以上の変更;リボース糖の成分、例えば、リボース糖の2’ヒドロキシルの変更;リン酸部分の「脱リン酸」リンカー(“dephospho”linker)での大量の置換;天然の塩基の修飾または置換;およびリボース−リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。

0094

核酸がサブユニット重合体であるため、多くの修飾、例えば、塩基、リン酸部分、またはリン酸部分の非結合Oの修飾は、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸内の全ての目的の位置に存在するが、多くの場合はそうではない。一例として、修飾は、3’または5’末端位置のみに存在しても良く、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドの位置または鎖の最後の2つ、3つ、4つ、5つ、または10のヌクレオチドのみに存在しても良い。修飾は、二本鎖領域一本鎖領域、または両方に存在し得る。修飾は、RNAの二本鎖領域のみに存在しても良いし、またはRNAの一本鎖領域のみに存在しても良い。例えば、非結合酸素位置でのホスホロチオエート修飾は、一方もしくは両方の末端のみに存在しても良いし、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドのある位置、または鎖の最後の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは10のヌクレオチドのみに存在しても良いし、あるいは二本鎖領域および一本鎖領域、特に末端に存在しても良い。5’末端または両末端は、リン酸化されても良い。

0095

例えば、安定性を高めること、オーバーハングに特定の塩基を含めること、あるいは一本鎖オーバーハング、例えば、5’もしくは3’オーバーハング、または両方のオーバーハングに修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能であろう。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合もある。一部の実施形態では、3’または5’オーバーハングの全てまたは一部の塩基を、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾しても良い。修飾は、例えば、当分野で公知の修飾を用いたリボース糖の2’位での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖ではなくデオキシリボヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロ(2’−F)、または2’−O−メチル修飾の使用、およびリン酸基の修飾、例えば、ホスホチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。

0096

一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、LNA、HNA、CeNA、2’−メトキシエチル、2’−O−メチル、2’−O−アリル、2’−C−アリル、2’−デオキシ、2’−ヒドロキシル、または2’−フルオロで修飾される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、2つ以上の修飾を含み得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、2’−O−メチルまたは2’−フルオロで修飾される。

0097

少なくとも2つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。これらの2つの修飾は、2’−O−メチルもしくは2’−フルオロ、または他のものであっても良い。

0098

一実施形態では、Naおよび/またはNbは、交互パターンの修飾を含む。本明細書で使用される「交互モチーフ」という語は、各修飾が1つの鎖の交互ヌクレオチドに存在する1つ以上の修飾を有するモチーフを指す。交互ヌクレオチドは、1つおきのヌクレオチドに1つ、3つおきのヌクレオチドに1つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、A、B、およびCがそれぞれ、ヌクレオチドに対する1種類の修飾を表す場合、交互モチーフは、「ABABABABABAB...」、「AABBAABBAABB...」、「AABAABAABAAB...」、「AAABAAABAAAB...」、「AAABBBAAABBB...」、または「ABCABCABCABC...」などであり得る。

0099

交互モチーフに含まれる修飾の種類は、同じであっても良いし、または異なっていても良い。例えば、A、B、C、Dがそれぞれ、ヌクレオチドの1種類の修飾を表す場合、交互パターン、即ち、1つおきのヌクレオチドの修飾は、同じでも良いが、センス鎖またはアンチセンス鎖はそれぞれ、交互モチーフ、例えば、「ABABAB...」、「ACACAC...」、「BDBDBD...」、または「CDCDCD...」などの内部の修飾のいくつかの可能性から選択することができる。

0100

一実施形態では、本発明のRNAi剤は、アンチセンス鎖における交互モチーフの修飾パターンに対してシフトしている、センス鎖における交互モチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応するようなシフトであっても良いし、この逆のシフトでも良い。例えば、センス鎖は、dsRNA二重鎖におけるアンチセンス鎖と塩基対を形成した場合、センス鎖における交互モチーフが、センス鎖の5’から3’へ「ABABAB」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフが、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の5’から3’へ「BABABA」で始まり得る。別の例として、センス鎖における交互モチーフは、センス鎖の5’から3’へ「AABBAABB」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフは、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の5’から3’へ「BBAABBAA」で始まり得るため、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な、または部分的なシフトが存在する。

0101

一実施形態では、RNAi剤は、最初に、センス鎖における2’−O−メチル修飾と2’−F修飾との交互モチーフのパターンを有し、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における2’−O−メチル修飾と2’−F修飾との交互モチーフのパターンに対してシフトを有する、即ち、センス鎖における2’−O−メチル修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖における2’−F修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、逆の場合も同様である。センス鎖の1位は、2’−F修飾で始まることができ、アンチセンス鎖の1位は、2’−O−メチル修飾で始まることができる。

0102

3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなる1つ以上のモチーフのセンス鎖および/またはアンチセンス鎖への導入は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンを中断する。3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなる1つ以上のモチーフのセンス鎖および/またはアンチセンス鎖への導入による、センス鎖および/またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を驚くほど高める。

0103

一実施形態では、3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなるモチーフが、いずれの鎖に導入される場合も、モチーフの次のヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「...NaYYYNb...」であり、「Y」は、3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなるモチーフの修飾を表し、「Na」および「Nb」は、Yの修飾とは異なる、モチーフ「YYY」の次のヌクレオチドの修飾を表し、NaおよびNbは、同じ修飾でも異なる修飾でも良い。あるいは、Naおよび/またはNbは、ウィング修飾が存在する場合は、存在しても存在しなくても良い。

0104

RNAi剤は、少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および/もしくはアンチセンス鎖、または両鎖のいずれかの位置のどのヌクレオチドにも存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖およびアンチセンス鎖のどのヌクレオチドにも存在し得る;各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および/もしくはアンチセンス鎖における交互パターンに存在し得る;あるいはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンにおける両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでも異なっても良く、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンに対してシフトを有しても良い。

0105

一実施形態では、RNAi剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、2つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合を有する2つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾は、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の塩基対形成ヌクレオチドに結合させるために形成することもできる。例えば、少なくとも2つ、3つ、4つ、または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって結合することができ、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをその次の塩基対形成ヌクレオチドに結合する追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合が存在しても良い。例えば、末端の3つのヌクレオチド間に少なくとも2つのホスホチオエートのヌクレオチド間結合が存在しても良く、この末端の3つのヌクレオチドのうちの2つは、オーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の塩基対形成ヌクレオチドである。これらの末端の3つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端、センス鎖の3’末端、アンチセンス鎖の5’末端、および/またはアンチセンス鎖の5’末端であり得る。

0106

一実施形態では、2ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の3’末端にあり、末端の3つのヌクレオチド間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、3つのヌクレオチドのうちの2つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接した対合ヌクレオチドである。任意選択により、RNAi剤は、センス鎖の5’末端およびアンチセンス鎖の5’末端の両方における末端の3つのヌクレオチド間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有し得る。

0107

一実施形態では、RNAi剤は、標的とのミスマッチ、二重鎖内のミスマッチ、またはこれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域、または二重鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離または融解(例えば、特定の対合の結合または解離の自由エネルギーに対してであり、最も単純なアプローチは、個々の塩基対ベースで塩基対を評価することであるが、類縁または同様の分析を用いることもできる)を促進する傾向に基づいてランク付けしてもよい。解離の促進に関しては、A:Uは、G:Cよりも好ましく;G:UはG:Cよりも好ましく;I:CはG:Cよりも好ましい(I=イノシンである)。ミスマッチ、例えば、非正準な対合または正準以外の対合(本明細書の他の部分に記載)は、正準な対合(A:T、A:U、G:C)よりも好ましく;ユニバーサル塩基を含む塩基対は、正準な対合よりも好ましい。

0108

一実施形態では、RNAi剤は、A:U、G:U、I:Cの群から選択されるアンチセンス鎖の5’末端からの二重鎖領域内の最初の1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの塩基対の少なくとも1つ、および二重鎖の5’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対合、例えば、非正準な対合もしくは正準以外の対合、またはユニバーサル塩基を含む対合を含む。

0109

一実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端からの二重鎖領域内の1位にあるヌクレオチドは、A、dA、dU、U、およびdTからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の5’末端からの二重鎖領域内の最初の1つ、2つ、または3つの塩基対の少なくとも1つは、AU塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の5’末端からの二重鎖領域内の最初の塩基対は、AU塩基対である。

0110

一実施形態では、センス鎖配列は、式(I)で表すことができる:
5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’ (I)
式中、
iおよびjはそれぞれ独立して、0または1であり;
pおよびqはそれぞれ独立して、0〜6であり;
各Naは独立して、0〜25の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み;
各Nbは独立して、0〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
各npおよびnqは独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
NbおよびYは、同じ修飾を有しておらず;かつ
XXX、YYY、およびZZZはそれぞれ独立して、3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表している。好ましくは、YYYは、2’−F修飾ヌクレオチドである。

0111

一実施形態では、Naおよび/またはNbは、交互パターンの修飾を含む。

0112

一実施形態では、YYYモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、RNAi剤が、17〜23のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有する場合、YYYモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し得(例えば、6位、7位、8位;7位、8位、9位;8位、9位、10位;9位、10位、11位;10位、11位,12位;または11位、12位、13位に存在し得)、この位置は、5’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる;または任意選択で、5’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる。

0113

一実施形態では、iが1でjが0である、iが0でjが1である、またはiとjの両方が1である。従って、センス鎖は、以下の式で表すことができる:
5’np−Na−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’ (Ib)
5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Na−nq3’ (Ic);または
5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’ (Id)。

0114

センス鎖が、式(Ib)で表される場合、Nbは、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2、または0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Naは独立して、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。

0115

センス鎖が、式(Ic)で表される場合、Nbは、0〜10、0〜7、0〜10、0〜5、0〜4、0〜2、または0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Naは独立して、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。

0116

センス鎖が、式(Id)で表される場合、各Nbは独立して、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2、または0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。好ましくは、Nbは、0、1、2、3、4、5、または6である。各Naは独立して、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。

0117

X、Y、およびZはそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。

0118

他の実施形態では、iは0であり、jは0であり、かつセンス鎖は、式で表すことができる:
5’np−Na−YYY−Na−nq3’ (Ia)。

0119

センス鎖が、式(Ia)で表される場合、各Naは独立に、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

0120

一実施形態では、RNAi剤のアンチセンス鎖配列は、式(II)によって表すことができる:
5’nq’−Na’−(Z’Z’Z’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(X’X’X’)l−N’a−np’3’ (II)
式中、
kおよびlはそれぞれ独立して、0または1であり;
p’およびq’はそれぞれ独立して、0〜6であり;
各Na’は独立して、0〜25の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み;
各Nb’は独立して、0〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
各np’およびnq’は独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
Nb’およびY’は、同じ修飾を有しておらず;かつ
X’X’X’、Y’Y’Y’、およびZ’Z’Z’はそれぞれ独立して、3つの連続したヌクレオチドにおける3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表している。

0121

一実施形態では、Na’および/またはNb’は、交互パターンの修飾を含む。

0122

Y’Y’Y’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、RNAi剤は、17〜23のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有し、Y’Y’Y’モチーフは、アンチセンス鎖の9位、10位、11位;10位、11位、12位;11位、12位、13位;12位、13位、14位;または13位、14位、15位に存在し得、この位置は、5’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる;または任意選択で、5’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる。好ましくは、Y’Y’Y’モチーフは、11位、12位、13位に存在する。

0123

一実施形態では、Y’Y’Y’モチーフは、2’−OMe修飾ヌクレオチドである。

0124

一実施形態では、kが1でlが0である、kが0でlがlである、またはkとlの両方が1である。

0125

従って、アンチセンス鎖は、以下の式で表すことができる:
5’nq’−Na’−Z’Z’Z’−Nb’−Y’Y’Y’−Na’−np’3’ (IIb);
5’nq’−Na’−Y’Y’Y’−Nb’−X’X’X’−np’3’ (IIc);または
5’nq’−Na’−Z’Z’Z’−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−X’X’X’−Na’−np’3’ (IId)。

0126

アンチセンス鎖が、式(IIb)で表される場合、Nb’は、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2、または0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は独立に、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0127

アンチセンス鎖が、式(IIc)で表される場合、Nb’は、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2、または0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は独立に、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0128

アンチセンス鎖が、式(IId)で表される場合、各Nb’は独立に、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2、または0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は独立に、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Nbは、0、1、2、3、4、5、または6である。

0129

他の実施形態では、kは0であり、1は0であり、かつアンチセンス鎖は、式で表すことができる:
5’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’3’ (Ia)。

0130

アンチセンス鎖が、式(IIa)で表される場合、各Na’は独立に、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0131

X’、Y’、およびZ’はそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。

0132

センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、LNA、HNA、CeNA、2’−メトキシエチル、2’−O−メチル、2’−O−アリル、2’−C−アリル、2’−ヒドロキシル、または2’−フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、2’−O−メチルまたは2’−フルオロで修飾される。特に、X、Y、Z、X’、Y’、およびZ’はそれぞれ、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾を表すことができる。

0133

一実施形態では、RNAi剤のセンス鎖は、二重鎖領域が21のヌクレオチドである場合にセンス鎖の9位、10位、および11位に存在するYYYモチーフを含むことができ、この位置は、5’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められ、または任意選択で、5’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められ;かつYは、2’−F修飾を表している。センス鎖は、二重鎖領域の反対の末端におけるウィング修飾としてXXXモチーフまたはZZZモチーフを追加的に含むことができ;かつXXXおよびZZZはそれぞれ独立して、2’−OMe修飾または2’−F修飾を表している。

0134

一実施形態では、アンチセンス鎖は、このセンス鎖の11位、12位、および13位に存在するY’Y’Y’モチーフを含むことができ、この位置は、5’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる、または任意選択で、5’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められ;かつY’は、2’−O−メチル修飾を表している。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の反対の末端におけるウィング修飾としてX’X’X’モチーフまたはZ’Z’Z’モチーフを追加的に含むことができ;かつX’X’X’およびZ’Z’Z’はそれぞれ独立して、2’−OMe修飾または2’−F修飾を表している。

0135

上記の式(Ia)、(Ib)、(Ic)、および(Id)の何れか1つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式(IIa)、(IIb)、(IIc)、および(IId)の何れか1つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。

0136

従って、本発明の方法に使用されるRNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、各鎖は、14〜30のヌクレオチドを有し、RNAi二重鎖は、式(III)で表される:
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’
(III)
式中:
i、j、k、およびlは、それぞれ独立に0または1であり;
p、p’、q、およびq’は、それぞれ独立に0〜6であり;
各NaおよびNa’は独立に、0〜25の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なる修飾ヌクレオチドを含み;
各NbおよびNb’は独立に、0〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
各np’、np、nq’、およびnqは、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し;かつ
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、Z’Z’Z’はそれぞれ独立に、3つの連続したヌクレオチドの3つの同一の修飾からなる1つのモチーフを表す。

0137

一実施形態では、iは0であり、jは0である;またはiは1であり、jは0である;またはiは0であり、jは1である;またはiおよびjの両方が0である;またはiおよびjの両方が1である。別の実施形態では、kは0であり、lは0である;またはkは1であり、lは0である;kは0であり、lは1である;またはkおよびlの両方が0である;またはkおよびlの両方が1である。

0138

RNAi二重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組み合わせは、以下の式を含む:
5’np−Na−YYY−Na−nq3’
3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’nq’5’
(IIIa)
5’np−Na−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’
3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na’nq’5’
(IIIb)
5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Na−nq3’
3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’
(IIIc)
5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’
3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na−nq’5’
(IIId)

0139

RNAi剤が、式(IIIa)で表される場合、各Naは独立に、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0140

RNAi剤が、式(IIIb)で表される場合、各Nbは独立に、1〜10、1〜7、1〜5、または1〜4の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは独立に、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0141

RNAi剤が、式(IIIc)で表される場合、各Nb、Nb’は独立して、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2、または0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Naは独立して、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。

0142

RNAi剤が、式(IIId)で表される場合、各Nb、Nb’は独立して、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2、または0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Na、Na’は独立して、2〜20、2〜15、または2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。それぞれのNa、Na’、Nb、Nb’は独立して、交互パターンの修飾を含む。

0143

式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、および(IIId)におけるX、Y、およびZはそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。

0144

RNAi剤が、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、および(IIId)で表される場合、Yヌクレオチドの少なくとも1つが、Y’ヌクレオチドの1つと塩基対を形成し得る。あるいは、Yヌクレオチドの少なくとも2つが、対応するY’ヌクレオチドと塩基対を形成する;またはYヌクレオチドの3つ全てが、対応するY’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

0145

RNAi剤が、式(IIIb)または(IIId)で表される場合、Zヌクレオチドの少なくとも1つが、Z’ヌクレオチドの1つと塩基対を形成し得る。あるいは、Zヌクレオチドの少なくとも2つが、対応するZ’ヌクレオチドと塩基対を形成する;またはZヌクレオチドの3つ全てが、対応するZ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

0146

RNAi剤が、式(IIIc)または(IIId)で表される場合、Xヌクレオチドの少なくとも1つが、X’ヌクレオチドの1つと塩基対を形成し得る。あるいは、Xヌクレオチドの少なくとも2つが、対応するX’ヌクレオチドと塩基対を形成する;またはXヌクレオチドの3つ全てが、対応するX’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

0147

一実施形態では、Yヌクレオチドの修飾は、Y’ヌクレオチドの修飾とは異なり、Zヌクレオチドの修飾は、Z’ヌクレオチドの修飾とは異なり、かつ/またはXヌクレオチドの修飾は、X’ヌクレオチドの修飾とは異なる。

0148

一実施形態では、RNAi剤が、式(IIId)で表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾である。別の実施形態では、RNAi剤が、式(IIId)で表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに連結される。なお別の実施形態では、RNAi剤が、式(IIId)で表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖が、二価または三価分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNAc誘導体にコンジュゲートされる。別の実施形態では、RNAi剤が、式(IIId)で表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖が、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖が、二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNAc誘導体にコンジュゲートされる。

0149

一実施形態では、RNAi剤が、式(IIIa)で表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル修飾または2’−フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖が、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖が、二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNAc誘導体にコンジュゲートされる。

0150

一実施形態では、RNAi剤は、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、および(IIId)で表される少なくとも2つの二重鎖を含む多量体であり、この二重鎖はリンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、この多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖はそれぞれ、同じ遺伝子または2つの異なる遺伝子を標的としても良いし;あるいは二重鎖はそれぞれ、2つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。

0151

一部の実施形態では、RNAi剤は、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、および(IIId)で表される3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上の二重鎖を含む多量体であり、この二重鎖は、リンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、この多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖はそれぞれ、同じ遺伝子または2つの異なる遺伝子を標的としても良いし;あるいは二重鎖はそれぞれ、2つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。

0152

一実施形態では、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、および(IIId)で表される2つのRNAi剤は、5’末端で互いに結合され、3’末端の一方または両方が、任意選択で、リガンドによってコンジュゲートされる。RNAi剤はそれぞれ、同じ遺伝子または2つの異なる遺伝子を標的としても良いし;あるいはRNAi剤はそれぞれ、2つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。

0153

様々な刊行物が、多量体RNAi剤について記載しており、本発明の方法に使用することができる。このような刊行物としては、参照によりそれらの全開示内容がそれぞれ本明細書に組み入れられる、国際公開第2007/091269号パンフレット、米国特許第7858769号明細書、国際公開第2010/141511号パンフレット、同第2007/117686号パンフレット、同第2009/014887号パンフレット、および同第2011/031520号パンフレットが挙げられる。

0154

1つ以上の糖質部分のRNAi剤に対するコンジュゲーションを含むRNAi剤は、このRNAi剤の1つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、糖質部分は、RNAi剤の修飾サブユニットに付着する。例えば、dsRNA剤の1つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、糖質リガンドが付着する非糖質担体(好ましくは環状)で置換することができる。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書では、リボース置換修飾サブユニット(RRMS)と呼ばれる。環状担体は、炭素環系、即ち全ての環原子炭素原子である環系であっても良いし、または複素環系、即ち1つ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る環系であっても良い。環状担体は、単環系であっても良いし、または2つ以上の環、例えば、融合環を含んでも良い。環状担体は、完全に飽和した環系であっても良いし、または1つ以上の二重結合を含んでも良い。

0155

リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着することができる。担体は、(i)少なくとも1つの「骨格付着点(backbone attachment point)」、好ましくは2つの「骨格付着点」、および(ii)少なくとも1つの「テザー付着点(tethering attachment point)」を含む。本明細書で使用される「骨格付着点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えば、リン酸塩の骨格、もしくは、例えば、硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、かつ適した結合を指す。「テザー付着点」(TAP)は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子(骨格付着点を提供する原子とは異なる)を指す。この選択された部分は、例えば、糖質、例えば、単糖二糖三糖四糖オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザー(intervening tether)によって環状担体に接続される。従って、環状担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、または、一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成環への組み込みまたは連結(tethering)に適した結合を可能にする。

0156

RNAi剤は、担体によってリガンドにコンジュゲートすることができ、この担体は、環状基または非環状基であり;好ましくは、環状基は、ピロリジニルピラゾニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニルピペラジニル、[1,3]ジオキソランオキサゾリジニルイソキサゾリジニル、モルホリニルチアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニルピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され;好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。

0157

ある特定の実施形態では、本発明の方法に使用されるRNAi剤は、表1および表2のいずれか一方に列記されている作用剤の群から選択される作用剤である。一実施形態では、作用剤が、表1に列記されている作用剤である場合、作用剤は、末端dTを欠失し得る。

0158

本発明は、アンチセンス鎖に5’リン酸塩またはリン酸塩模倣物を含む、表1または表2のいずれか一方に列記された配列のいずれか1つを含む二本鎖RNAi剤をさらに含む(例えば、PCT国際公開特許第2011005860号パンフレットを参照されたい)。さらに、本発明は、センス鎖の5’末端の2’−OMe基の代わりに2’フルオロ基を含む、表1または表2のいずれか一方に列記されているいずれか1つの配列を含む二本鎖RNAi剤を含む。

0159

さらなるモチーフ
特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、11未満、10未満、9未満、8未満、7未満、6未満、または5未満の2’−デオキシフルオロを含む。

0160

特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、10未満、9未満、8未満、7未満、6未満、5未満、4未満のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

0161

特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、10未満の2’−デオキシフルオロおよび6未満のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

0162

特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、8未満の2’−デオキシフルオロおよび6未満のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

0163

特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、9未満の2’−デオキシフルオロおよび6未満のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

0164

リガンド
本発明の二本鎖RNAi剤は、任意選択により、1つ以上のリガンドにコンジュゲートされ得る。リガンドは、3’末端、5’末端、または両末端でセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖に付着され得る。例えば、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の3’末端にコンジュゲートされる。一実施形態では、リガンドは、GalNAcリガンドである。特定の一部の実施形態では、リガンドはGalNAc3である。このリガンドは、介在テザーを介して直接的または間接的に結合される、好ましくは共有結合される。

0165

一部の実施形態では、リガンドは、このリガンドが取り込まれる分子の分布、標的化、または寿命を変更する。一部の実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して、選択される標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞型区画受容体、例えば、細胞もしくは器官の区画、組織、器官、または体の領域に対する親和性を高める。選択される標的に対する親和性を高めるリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。

0166

一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、および/または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、pH依存性の膜活性および融合性を示すポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。一実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのpHでその活性型立体構造をとると推定される。「活性型」立体構造とは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、および/または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、GALAペプチド(Subbarao et al.,Biochemistry,1987,26:2964−2972)、EALAペプチド(Vogel et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118:1581−1586)、およびこれらの誘導体(Turk et al.,Biochem.Biophys.Acta,2002,1559:56−68)が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム溶解成分は、pHの変化に応じて電荷またはプロトン化の変化を起こす化学基(例えば、アミノ酸)を含み得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖であっても、分岐鎖であっても良い。

0167

リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を向上させることができ、結果として得られる天然オリゴリボヌクレオチドもしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載されるモノマーおよび/もしくは天然リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子ヌクレアーゼ耐性も向上させることができる。

0168

リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療用修飾因子;例えば、分布を監視するための診断化合物またはレポーター基;架橋剤;およびヌクレアーゼ耐性を付与する部分を含み得る。一般的な例として、脂質、ステロイドビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体が挙げられる。

0169

リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミンHSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質HDL)、もしくはグロブリン);糖質(例えば、デキストランプルランキチンキトサンイヌリンシクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸);または脂質を挙げることができる。リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド(例えば、アプタマー)であっても良い。ポリアミノ酸を含むポリアミノ酸としては、ポリリジンPLL)、ポリL−アスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸スチレン無水マレイン酸コポリマー、ポリ(L−ラクチド−コ−グリコリエド(glycolied))コポリマージビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコールPVA)、ポリウレタン、ポリ(2−エチルアクリル酸)、N−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン(PLL)、スペルミンスペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニンアミジンプロタミンカチオン性脂質カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファリックスペプチドが挙げられる。

0170

リガンドとして、標的化基、例えば、細胞標的化剤または組織標的化剤、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合するレクチン糖タンパク質、脂質、もしくはタンパク質、例えば、抗体も挙げることができる。標的化基は、チロトロピンメラトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質A、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン(gulucosamine)、多価マンノース、多価フコースグリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリンビスホスホネートポリグルタミン酸塩ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸葉酸塩ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣体、またはアプタマーであっても良い。

0171

リガンドの他の例として、色素挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレンマイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリンサフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジンジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼまたはキレート剤(例えば、EDTA)、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシルグリセロールゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオールメントール、1,3−プロパンジオールヘプタデシル基パルミチン酸ミリスチン酸、O3−(オレオイルリトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリンビタミンE葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾールビスイミダゾールヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のEu3+複合体)、ジニトロフェニル、HRP、またはAPが挙げられる。

0172

リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であっても良い。リガンドとして、ホルモンおよびホルモン受容体も挙げることができる。リガンドとして、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーも挙げることができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、p38MAPキナーゼ活性化因子、またはNF−κBの活性化因子であっても良い。

0173

リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格破壊することによって、例えば、細胞の微小管マイクロフィラメント、および/または中間径フィラメントを破壊することによって、iRNA剤の細胞内への取り込みを増大させることができる物質、例えば、薬物であっても良い。薬物は、例えば、タクソンビンクリスチンビンブラスチンサイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド(japlakinolide)、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン、またはミオセルビン(myoservin)であっても良い。

0174

リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン−1β、またはγインターフェロンが挙げられる。

0175

一態様では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合する。HSA結合リガンドは、コンジュゲートが、標的組織、例えば、体の非腎臓標的組織に分布するのを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であっても良い。HSAに結合し得る他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、(a)コンジュゲートの分解に対する耐性を増大させ、(b)標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させることができ、かつ/または(c)血清タンパク質、例えば、HSAに対する結合を調節するために使用することができる。

0176

脂質ベースのリガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節、例えば、制御するために使用することができる。例えば、HSAにより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、従って、体内から除去される可能性が低い。HSAにそれほど強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが腎臓を標的にするように使用することができる。

0177

一実施形態では、脂質ベースのリガンドはHSAに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、このコンジュゲートが、好ましくは非腎臓組織に分散するように十分な親和性でHSAに結合する。一実施形態では、この親和性は、HSA−リガンド結合が反転され得るような親和性である。別の実施形態では、脂質ベースのリガンドは、HSAに弱く結合するか、または全く結合しないため、このコンジュゲートは、好ましくは腎臓に分散される。腎臓細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはこれに加えて使用することができる。

0178

別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性型または非悪性型、例えば、癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンA、E、およびKが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンB、例えば、葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、HAS、低密度リポタンパク質(LDL)、および高密度リポタンパク質(HDL)もが挙げられる。

0179

別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス型の細胞透過剤である。好ましくは、作用剤は両親媒性である。例示的な作用剤は、ペプチド、例えば、tatまたはアンテナペディア(antennopedia)である。作用剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、反転異性体、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびD−アミノ酸の使用を含む修飾を施すことができる。好ましくは、このヘリックス型の細胞透過剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス型の作用剤である。

0180

リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。ペプチド模倣体(本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる)は、天然ペプチドと同様の定められた3次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分は、約5〜50のアミノ酸長さ、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50のアミノ酸長さであっても良い。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチドカチオン性ペプチド両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド(例えば、主にTyr、Trp、もしくはPheから構成される)であっても良い。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドであっても良い。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列(MTS)を含み得る。例示的な疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAP(配列番号:9)を有するRFGFである。疎水性MTSを含有するRFGF類似体(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP(配列番号:10))も標的化部分であっても良い。ペプチド部分は、「送達」ペプチドであっても良く、この送達ペプチドは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を、細胞膜を通過して運搬することができる。例えば、HIVTatタンパク質由来の配列(GRKKRRQRRRPPQ)(配列番号:11)およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の配列(RQKIWFQNRRMKWKK)(配列番号:12)は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体、例えば、ファージディスプレイライブラリー、または1ビーズ1化合物(OBOC)コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドは、DNAのランダム配列によってコードされても良い(Lam et al.,Nature,354:82−84,1991)。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してiRNA剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)−ペプチドまたはRGD模倣体である。ペプチド部分は、約5つのアミノ酸長さ〜約40のアミノ酸長さの範囲とすることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を高めるための、構造変化を有し得る。下記の構造変化のいずれも利用することができる。RGDペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62:5139−43,2002)。RGDペプチドは、、腎臓、脾臓、または肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍に対するiRNA剤の標的化を促進することができる(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8:783−787,2001)。好ましくは、RGDペプチドは、腎臓に対するiRNA剤の標的化を促進する。RGDペプチドは、直鎖または環状であっても良く、特定の組織に対する標的化を促進するために修飾する、例えば、グリコシル化またはメチル化することができる。例えば、グリコシル化RGDペプチドは、αvβ3を発現する腫瘍細胞にiRNA剤を送達することができる(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42:326−336,2001)。増殖細胞に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、RGD含有ペプチドおよびRGD含有ペプチド模倣体は、癌細胞、特に、インテグリン提示する細胞を標的とすることができる。従って、RGDペプチド、RGDを含有する環状ペプチド、D−アミノ酸を含むRGDペプチド、および合成RGD模倣体を使用することができる。RGDに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することもできる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生(angiogeneis)を制御するために使用することができる。この種のリガンドの一部のコンジュゲートは、PECAM−1、VEGF、または他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子を標的とする。

0181

「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−ヘリックス直鎖ペプチド(例えば、LL−37もしくはセロピンP1)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、もしくはバクテネシン)、または1種もしくは2種の優勢なアミノ酸のみを含有するペプチド(例えば、PR−39もしくはインドリシジン)であっても良い。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナルNLS)も含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、HIV−1 gp41の融合ペプチドドメインおよびSV40ラージT抗原のNLSに由来する二部両親媒性ペプチド、例えば、MPGであっても良い(Simeoni et al.,Nucl.AcidsRes.31:2717−2724,2003)。

0182

一実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性αヘリックスペプチドであっても良い。例示的な両親媒性α−ヘリックスペプチドとしては、限定されるものではないが、セクロピン、リコトキシン(lycotoxin)、パラダキシン(paradaxin)、ブフォリン、CPF、ボンビニン−様ペプチドBLP)、カテリシジンセラトトキシン(ceratotoxin)、エボヤ(S.clava)ペプチド、メクラウナギ抗菌ペプチド(HFIAP)、マガイニンブレビニン−2、デルマセプチンメリチンプレウロシジン、H2Aペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス−1(esculentinis−1)、およびカエリンが挙げられる。好ましくは、多数の因子が、ヘリックス安定性の完全性を維持すると見なされる。例えば、最大数のヘリックス安定化残基(例えばleu、ala、またはlys)を利用し、最小数のヘリックス不安定化残基(例えばプロリン、または環状モノマー単位を利用する。キャッピング残基も考慮される(例えば、Glyは、例示的なN−キャッピング残基であり、かつ/またはC末端アミド化は、追加的な水素結合を実現してヘリックスを安定させるために使用することができる。i±3位、またはi±4位離間した、反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって安定させることができる。カチオン性残基、例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンは、アニオン性残基であるグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。

0183

ペプチドリガンドおよびペプチド模倣体リガンドとしては、天然ペプチドまたは修飾ペプチド、例えば、DペプチドもしくはLペプチド;αペプチド、βペプチド、もしくはγペプチド;N−メチルペプチド;アザペプチド;1つ以上の尿素結合チオ尿素結合、カルバミン酸結合、もしくはスルホニル尿素結合で置換された1つ以上のアミド結合、即ち、ペプチ結合を有するペプチド;または環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。

0184

標的化リガンドは、特定の受容体を標的とすることができるあらゆるリガンドであっても良い。例として、葉酸塩、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース−6P、糖クラスター、例えば、GalNAcクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマーが挙げられる。クラスターは、2つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリンGCPII、ソマトスタチン、LDLリガンド、およびHDLリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えば、アプタマーをベースにしても良い。アプタマーは、未修飾でも良いし、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有しても良い。

0185

エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、PEI、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカーボキシレート(polycaboxylate)、ポリカチオン(polyacation)、マスクオリゴまたはポリカチオンまたはアニオンアセタールポリアセタールケタール/ポリケチアル(polyketyal)、オルトエステルマスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するポリマー、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。

0186

PKモジュレーターとは、薬物動態学的モジュレーターのことである。PKモジュレーターとしては、脂肪親和物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、PEG、ビタミンなどが挙げられる。例示的なPKモジュレーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリドジアシルグリセリドリン脂質スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンE、ビオチンなどが挙げられる。多数のホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に多数のホスホロチオエート連結を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約5塩基、10塩基、15塩基、または20塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして(例えば、PK調節リガンドとして)本発明に適用可能である。

0187

加えて、血清成分(例えば、血清タンパク質)に結合するアプタマーも、PK調節リガンドとして本発明に適用可能である。

0188

本発明に適用可能な他のリガンドコンジュゲートは、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、2004年8月10日出願の米国特許出願第10/916,185号明細書;2004年9月21日出願の同第10/946,873号明細書;2007年8月3日出願の同第10/833,934号明細書;2005年4月27日出願の同第11/115,989号明細書、および2007年11月21日出願の同第11/944,227号明細書に記載されている。

0189

2つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有しても良いし、全てが異なる特性を有しても良く、または一部のリガンドが、同じ特性を有する一方、他のリガンドが異なる特性を有しても良い。例えば、リガンドは、標的化特性を有しても良いし、エンドソーム的活性を有して良いし、またはPK調節特性を有しても良い。一実施形態では、全てのリガンドが異なる特性を有する。

0190

リガンドは、様々な位置、例えば3’末端、5’末端、および/または内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合することができる。一部の実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば、本明細書に記載される担体を介してオリゴヌクレオチドに結合している。モノマーが成長している鎖に組み込まれる場合、リガンドまたはテザーリガンドは、このモノマーに存在しても良い。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長している鎖に組み込まれた後で、この「前駆体」モノマーへの結合によって組み込むことができる。例えば、末端がアミノであるテザー(即ち、リガンドが結合されていない)、例えば、TAP−(CH2)nNH2を有するモノマーを、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基との結合によって、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、その後、前駆体モノマーに結合させることができる。

0191

別の例では、クリック化学反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーを、例えば、末端がアジドまたはアルキンのテザー/リンカーに組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、相補的な化学基、例えば、アルキンまたはアジドを有するリガンドを、アルキンおよびアジドを共に結合することによって前駆体モノマーに結合することができる。

0192

一部の実施形態では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートすることができる。プリン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の2位、6位、7位、または8位が、コンジュゲート部分に結合している。また、ピリミジン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、どの位置で生じても良い。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の2位、5位、および6位を、コンジュゲート部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分に対するコンジュゲーションは、どの炭素原子で生じても良い。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例には、2’、3’、および5’炭素原子が挙げられる。1’位も、コンジュゲート部分、例えば、脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合も、コンジュゲート部分を保持することができる。リン含有結合(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート(phosphorodithiotate)、およびホスホロアデートなど)の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に直接結合する、またはリン原子に結合しているO、N、またはS原子に結合することができる。アミンまたはアミドを含有するヌクレオシド間結合(例えば、PNA)の場合、コンジュゲート部分は、アミンまたはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合することができる。

0193

GalNAcリガンドおよびリンカー
一部の実施形態では、HAO1遺伝子を標的とするsiRNAは、炭水化物、例えば、単糖(例えば、GalNAc)、二糖、三糖、四糖、多糖にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、siRNAは、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)リガンドにコンジュゲートされる。これは、皮下投与後の肝細胞への効率的な送達を促進する。炭水化物、例えば、N−アセチルガラクトサミンの、例えば、siRNAへの結合の方法は、当業者に周知である。例は、米国特許第8,106,022号明細書および国際公開第2014/025805号パンフレットで確認することができる。

0194

一部の実施形態では、HAO1遺伝子を標的とするsiRNAは、リンカーを介してリガンド、例えば、GalNAcにコンジュゲートされる。例えば、リガンドは、二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つ以上のGalNAc(N−アセチルグルコサミン)誘導体であり得る。

0195

一実施形態では、本発明のdsRNAは、次の式(V)〜(VII)の何れかに示されている構造を含む二価および三価の分岐リンカーにコンジュゲートする:



式中、
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B、およびq5Cは存在ごとに独立して、0〜20を表し、反復単位は、同じであっても良いし、異なっていても良く;
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5Cはそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、またはCH2Oを表し;
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5Cは存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンを表し、1つ以上のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’’)、C≡C、またはC(O)の1つ以上によって中断または終了させることができ;
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5Cはそれぞれ存在ごとに独立して、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、−C(O)−CH(Ra)−NH−、CO、CH=N−O、



、またはヘテロシクリルを表し;
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B、およびL5Cは、リガンドを表す;即ち、それぞれ存在ごとに独立して、単糖(例えば、GalNAc)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し;かつ
Raは、Hまたはアミノ酸側鎖である。

0196

三価コンジュゲートGalNAc誘導体、例えば、式(VII)のような誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためのRNAi剤と共に使用すると特に有用である:



式中、L5A、L5B、およびL5Cは、単糖、例えば、GalNAc誘導体を表している。
適切な二価および三価分岐リンカー基コンジュゲートGalNAc誘導体は、限定されるものではないが、以下の化合物:

0197

適切な二価および三価分岐リンカー基コンジュゲートGalNAc誘導体は、限定されるものではないが、以下の化合物:

0198

さらなるリガンド
一部の実施形態では、リガンドは、以下の1つから選択される:

0199

III.本発明のiRNAの送達
本発明のiRNA剤の細胞、例えば、対象の細胞、例えば、ヒト対象(例えば、iRNA剤の送達を必要とする対象、例えば、HAO1関連障害を有する対象)の細胞への送達は、様々な方法で達成することができる。例えば、in vitroまたはin vivoで本発明のiRNAを細胞に接触させることによって送達を行うことができる。in vivo送達は、iRNA、例えば、dsRNAを含む組成物を対象に投与することによって直接行うこともできる。あるいは、in vivo送達は、iRNAをコードし、かつiRNAの発現を誘導する1つ以上のベクターを投与することによって間接的に行うことができる。これらの代替案を以下にさらに説明する。

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