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図面 (8)

課題・解決手段

本明細書に開示した本発明は、(i)バチルスコアグランスMTCC 5856に対する天然植物性繊維増殖促進活性、(ii)病原性グラム陰性菌を抑制するための天然植物性繊維とバチルス コアグランス MTCC 5856の組合せ、および(iii)バチルス コアグランス MTCC 5856による植物性天然繊維を用いた短鎖脂肪酸(SCFA)の産生を記載する。

概要

背景

菌株プロバイオティクスプロバイオティック細菌)およびプレバイオティクスを組み合わせることで免疫補助効果の増強が達成されることは、当業界において周知である。具体的には、プロバイオティクスと天然植物性繊維を組み合わせ、シンバイオティクスを処方することは、有望な治療的手法として報告されている(Stig Bengmark and Robert Martindale. “Prebiotics and Synbiotics in Clinical Medicine”. Nutr Clin Pract vol 20 244-261, April 2005)。このような手法の成功は、腸における酵素加水分解および酸加水分解のいずれに対しても抵抗性のある天然植物性繊維によって、生菌数が効果的に増加する特定のプロバイオティック微生物慎重に選択することにかかっている。微生物による基質の利用しやすさ、繊維(飼料)の物理的および化学的性質、ならびにまた、消化過程動態という観点から、微生物による繊維の消化および利用には限界があるという教示をふまえると、こうした研究は、シンバイオティック食事療法に曝した宿主動物の性能に対応するために、決定的に重要である(Gabriella A. Varga and Eric S. Kolver, “Microbial and Animal Limitations to Fiber Digestion and Utilization”, J. Nutr. May 1, 1997 vol. 127 no. 5 819S-823S)。

概要

本明細書に開示した本発明は、(i)バチルスコアグランスMTCC 5856に対する天然植物性繊維の増殖促進活性、(ii)病原性グラム陰性菌を抑制するための天然植物性繊維とバチルス コアグランス MTCC 5856の組合せ、および(iii)バチルス コアグランス MTCC 5856による植物性天然繊維を用いた短鎖脂肪酸(SCFA)の産生を記載する。

目的

本発明の主目的は、バチルスコアグランスMTCC 5856の生菌数を増加させる、選択した天然繊維の性能(酵素加水分解および酸加水分解に対する抵抗性)を評価することである

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請求項1

バチルスコアグランスMTCC5856の生菌コロニー数を増加させる方法であって、トリゴネラフォエヌムグラエクム(フェヌグリーク種子繊維リキウムバルバルム種子繊維、リヌムウシタティッシマム(アマ)種子繊維、ココスヌシフェラ(ココナッツ)繊維、ジンギベルオフシナーレ(ショウガ根茎繊維、エンブリカオフィシナリスアムラ果実繊維プランタゴオバタオオバコ)繊維、およびウァッキニムオキシコッコス(クランベリー)種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維の存在下で、バチルスコアグランスMTCC5856を増殖させるステップを含む、方法。

請求項2

病原性グラム陰性菌を抑制する方法であって、前記グラム陰性菌を、トリゴネラフォエヌム−グラエクム(フェヌグリーク)種子繊維、リキウムバルバルム種子繊維、リヌムウシタティッシマム(アマ)種子繊維、ココスヌシフェラ(ココナッツ)繊維、ジンギベルオフィシナーレ(ショウガ)根茎繊維、エンブリカオフィシナリス(アムラ)果実繊維、プランタゴオバタ(オオバコ)繊維、およびウァッキニウムオキシコッコス(クランベリー)種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養したバチルスコアグランスMTCC5856と接触させるステップを含む、方法。

請求項3

バチルスコアグランスMTCC5856を、トリゴネラフォエヌム−グラエクム(フェヌグリーク)種子繊維、リキウムバルバルム種子繊維、リヌムウシタティッシマム(アマ)種子繊維、ココスヌシフェラ(ココナッツ)繊維、ジンギベルオフィシナーレ(ショウガ)根茎繊維、エンブリカオフィシナリス(アムラ)果実繊維、プランタゴオバタ(オオバコ)繊維、およびウァッキニウムオキシコッコス(クランベリー)種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養することによって、短鎖脂肪酸を産生する方法。

請求項4

食事性肥満およびインスリン抵抗性からの防護効果をもたらすために、トリゴネラフォエヌム−グラエクム(フェヌグリーク)種子繊維、リキウムバルバルム種子繊維、リヌムウシタティッシマム(アマ)種子繊維、ココスヌシフェラ(ココナッツ)繊維、ジンギベルオフィシナーレ(ショウガ)根茎繊維、エンブリカオフィシナリス(アムラ)果実繊維、プランタゴオバタ(オオバコ)繊維、およびウァッキニウムオキシコッコス(クランベリー)種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共にバチルスコアグランスMTCC5856を含む組成物投与することによって、哺乳動物の腸における食事性肥満およびインスリン抵抗性から防護する方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ2014年8月29日および2014年10月14日に出願された米国仮特許出願第62043599号および第62063453号の優先権を取得するPCT出願である。
本発明は、概して、バチルスコアグランス(Bacillus coagulans)(乳酸菌)に関する。より具体的には、本発明は、(i)バチルス コアグランスMTCC 5856(Bacillus coagulans MTCC 5856)に対する天然植物性繊維増殖促進活性、(ii)バチルス コアグランス MTCC 5856による植物性天然繊維を用いた短鎖脂肪酸(SCFA)の産生、および(iii)病原性グラム陰性菌を抑制するための天然植物性繊維とバチルス コアグランス MTCC 5856の組合せに関する。

背景技術

0002

菌株プロバイオティクスプロバイオティック細菌)およびプレバイオティクスを組み合わせることで免疫補助効果の増強が達成されることは、当業界において周知である。具体的には、プロバイオティクスと天然植物性繊維を組み合わせ、シンバイオティクスを処方することは、有望な治療的手法として報告されている(Stig Bengmark and Robert Martindale. “Prebiotics and Synbiotics in Clinical Medicine”. Nutr Clin Pract vol 20 244-261, April 2005)。このような手法の成功は、腸における酵素加水分解および酸加水分解のいずれに対しても抵抗性のある天然植物性繊維によって、生菌数が効果的に増加する特定のプロバイオティック微生物慎重に選択することにかかっている。微生物による基質の利用しやすさ、繊維(飼料)の物理的および化学的性質、ならびにまた、消化過程動態という観点から、微生物による繊維の消化および利用には限界があるという教示をふまえると、こうした研究は、シンバイオティック食事療法に曝した宿主動物の性能に対応するために、決定的に重要である(Gabriella A. Varga and Eric S. Kolver, “Microbial and Animal Limitations to Fiber Digestion and Utilization”, J. Nutr. May 1, 1997 vol. 127 no. 5 819S-823S)。

発明が解決しようとする課題

0003

本発明の主目的は、バチルスコアグランスMTCC 5856の生菌数を増加させる、選択した天然繊維の性能(酵素加水分解および酸加水分解に対する抵抗性)を評価することである。
また、本発明の別の目的は、病原性グラム陰性菌を抑制する、シンバイオティック組成物(天然繊維およびバチルス コアグランス MTCC 5856)の能力を評価することである。
さらに、本発明の別の目的は、望ましい短鎖脂肪酸を産生する、シンバイオティック組成物(天然繊維およびバチルス コアグランス MTCC 5856)の能力であって、甚大な治療的応用のある特性を評価することである。
本発明は、前述の目的を満たし、さらに関連する利点を提供する。

課題を解決するための手段

0004

(i)バチルスコアグランスMTCC 5856に対する天然植物性繊維の増殖促進活性、(ii)病原性グラム陰性菌を抑制する天然植物性繊維とバチルス コアグランス MTCC 5856の組合せ、および(iii)バチルス コアグランス MTCC 5856による植物性天然繊維を用いた短鎖脂肪酸(SCFA)の産生を開示する。
本発明の他の特徴および利点は、例として本発明の原理例証する添付の画像と併せて、以下のより詳細な説明によって明らかになる。

図面の簡単な説明

0005

様々な天然植物繊維(%、w/v)単独の存在下における、バチルスコアグランスMTCC 5856の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
様々な天然植物繊維(%、w/v)単独の存在下における、バチルス コアグランス MTCC 5856の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
様々な天然植物繊維(%、w/v)単独の存在下における、バチルス コアグランス MTCC 5856の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
MR培地ブドウ糖欠除)中、様々な天然植物繊維(%、w/v)の存在下における(0.5、1.0、2.0%、w/v)、バチルス コアグランス MTCC 5856の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
MRS培地(ブドウ糖欠除)中、様々な天然植物繊維(%、w/v)の存在下における(0.5、1.0、2.0%、w/v)、バチルス コアグランス MTCC 5856の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
MRS培地(ブドウ糖欠除)中、様々な天然植物繊維(%、w/v)の存在下における(0.5、1.0、2.0%、w/v)、バチルス コアグランス MTCC 5856の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
培地として植物性天然繊維中で共培養した場合の、B.コアグランス MTCC 5856による大腸菌(E.coli)ATCC25922の増殖抑制についてグラフ表示した図である。生菌数の平均値をlog10cfu/mlで示す。
短鎖脂肪酸のクロマトグラフ読取り値を示す図である。

0006

最も好ましい実施形態において、本発明は、バチルスコアグランスMTCC 5856の生菌コロニー数を増加させる方法であって、トリゴネラフォエヌムグラエクム(フェヌグリークコロハ))種子繊維(Trigonella foenum−graecum(fenugreek) seed fibers)、リキウムバルバルム種子繊維(Lycium barbarum seed fibers)、リヌムウシタティッシマム(アマ)種子繊維(Linum usitatissimum(Flax) seed fibers)、ココスヌシフェラ(ココナッツ)繊維(Cocos nucifera(Coconut) fibers)、ジンギベルオフシナーレ(ショウガ根茎繊維(Zingiber officinale(Ginger) rhizome fibers)、エンブリカオフィシナリスアムラ果実繊維(Emblica officinalis(Amla) fruit fibers)、プランタゴオバタオオバコ)繊維(Plantago ovata(Psyllium) fibers)、およびウァッキニウムオキシコッコス(クランベリー)種子繊維(Vaccinium oxycoccos(Cranberry) seed fibers)からなる群から選択された天然植物繊維の存在下で、バチルス コアグランス MTCC 5856を増殖させるステップを含む、方法に関する。

0007

別の最も好ましい実施形態において、本発明は、病原性グラム陰性菌を抑制する方法であって、前記グラム陰性菌を、トリゴネラフォエヌム−グラエクム(フェヌグリーク)種子繊維、リキウムバルバルム種子繊維、リヌムウシタティッシマム(アマ)種子繊維、ココスヌシフェラ(ココナッツ)繊維、ジンギベルオフィシナーレ(ショウガ)根茎繊維、エンブリカオフィシナリス(アムラ)果実繊維、プランタゴオバタ(オオバコ)繊維、およびウァッキニウムオキシコッコス(クランベリー)種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養したバチルスコアグランスMTCC 5856と接触させるステップを含む、方法に関する。

0008

さらに別の最も好ましい実施形態において、本発明は、バチルスコアグランスMTCC 5856を、トリゴネラフォエヌム−グラエクム(フェヌグリーク)種子繊維、リキウムバルバルム種子繊維、リヌムウシタティッシマム(アマ)種子繊維、ココスヌシフェラ(ココナッツ)繊維、ジンギベルオフィシナーレ(ショウガ)根茎繊維、エンブリカオフィシナリス(アムラ)果実繊維、プランタゴオバタ(オオバコ)繊維、およびウァッキニウムオキシコッコス(クランベリー)種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養することによって、短鎖脂肪酸を産生する方法にも関する。代替の実施形態において、本発明は、食事性肥満およびインスリン抵抗性からの防護効果をもたらすために、トリゴネラ フォエヌム−グラエクム(フェヌグリーク)種子繊維、リキウム バルバルム種子繊維、リヌム ウシタティッシマム(アマ)種子繊維、ココス ヌシフェラ(ココナッツ)繊維、ジンギベル オフィシナーレ(ショウガ)根茎繊維、エンブリカ オフィシナリス(アムラ)果実繊維、プランタゴ オバタ(オオバコ)繊維、およびウァッキニウム オキシコッコス(クランベリー)種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共にバチルス コアグランス MTCC 5856を含む組成物投与することによって、哺乳動物の腸における食事性肥満およびインスリン抵抗性から防護する方法にも関する。
明細書中以下に挙げられる具体的な例は、本発明の前述の最も好ましい実施形態を例証する。

0009

(例1)
繊維を調製する方法
トリゴネラフォエヌム−グラエクム(フェヌグリーク)種子繊維
トリゴネラ フォエヌム−グラエクム(フェヌグリークとしても知られている)種子を現地市場から収集し、粉砕して粗粉末(10メッシュを通過)とした。さらに、100gのトリゴネラ フォエヌム−グラエクム種子粗粉末に4容のn−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。n−ヘキサン画分を、Whatmanフィルターno1で濾過し、再び同じ抽出を3回行った。抽出後、残留物を80℃で5時間乾燥させ、これを粉砕して40メッシュを通過する粉末を得た。代替方法では、フェヌグリーク種子脂肪または油を、液体CO2を溶媒として用いる超臨界流体抽出法によって除去した。食物繊維ガラクトマンナン)の含有量を増やすため、フローチャートに示される通り、セルラーゼを用いて酵素加水分解を行った。ガラクトマンナン含有量は、Megazymeキット(K−GALM03/11)を製造業者指示通りに用いて決定した(Megazyme International Ireland、Bray Business Park、Bray、ウィックロー州、アイルランド)。

0010

リキウムバルバルム種子繊維
ゴジ、ゴジベリー、またはクコは、リキウム バルバルムの果実である。リキウム バルバルムの果実を乾燥させ、種子を取り出し、粉砕して粗粉末とした。さらに、100gのリキウム バルバルム粗粉末に4容のn−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。n−ヘキサン画分を、Whatmanフィルターno1で濾過し、再び同じ抽出を3回行った。抽出後、残留物を80℃で5時間乾燥させ、これを粉砕して60メッシュを通過する粉末を得た。食物繊維の総量は、酵素重量法(AOAC985.29)によって決定した。

0011

リヌムウシタティッシマム(アマ種子)繊維
リヌム ウシタティッシマム(亜麻アマニ、またはアマとしても知られている)種子を収集し、粉砕して粗粉末(10メッシュを通過)とした。さらに、100gのリヌム ウシタティッシマム粗粉末に4容のn−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。n−ヘキサン画分を、Whatmanフィルターno1で濾過し、再び同じ抽出を3回行った。抽出後、残留物を80℃で5時間乾燥させ、これを粉砕して40メッシュを通過する粉末を得た。食物繊維の総量は、酵素重量法(AOAC985.29)によって決定した。

0012

ココスヌシフェラ繊維
成熟したココナッツを現地市場から入手し、乾燥させた。さらに、胚乳(ココナッツ果肉)を切って、粗く均一サイズの材料とした。さらに、100gのココス ヌシフェラ粗材料に4容のn−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。n−ヘキサン画分を、Whatmanフィルターno1で濾過し、再び同じ抽出を3回行った。抽出後、残留物を80℃で5時間乾燥させ、これを粉砕して60メッシュを通過する粉末を得た。食物繊維の総量は、酵素重量法(AOAC985.29)によって決定した。

0013

ジンギベルオフィシナーレ(ショウガ)根茎繊維
ジンギベル オフィシナーレ根茎、ショウガ根、または単にショウガを乾燥させ、粉砕して粗粉末(10メッシュを通過)とした。さらに、100gのジンギベル オフィシナーレ根茎粗粉末に4容のn−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。n−ヘキサン画分を、Whatmanフィルターno1で濾過し、再び同じ抽出を3回行った。代替方法では、フェヌグリーク種子の脂肪または油を、液体CO2を溶媒として用いる超臨界流体抽出法によって除去した。抽出後、残留物を80℃で5時間乾燥させ、これを粉砕して40メッシュを通過する粉末を得た。食物繊維の総量は、酵素重量法(AOAC985.29)によって決定した。

0014

エンブリカオフィシナリス(アムラ)果実繊維
エンブリカ オフィシナリス(フィランツス エンブリカ(Phyllanthus emblica))は、エンブリック、エンブリックミロバラン、ミロバラン、インディアングーズベリー、マラッカツリー、またはサンスクリット名amalika由来のアムラとしても知られている。エンブリカ オフィシナリスの果実を現地市場から入手し、乾燥させ、粉砕し、60メッシュに通した。この粉末を図2に示す通り、繊維抽出のために用いた。食物繊維の総量は、酵素重量法(AOAC985.29)によって決定した。

0015

(例2)
酸加水分解
表1に記載された植物性天然繊維2gを100mlのHCl(0.10M)に溶解し、37℃、100rpmで180分間インキュベートした。0、30、60、90、120、および180分の時点で試料採取した。試験では、天然繊維との比較基準としてフラクトオリゴ糖(FOS、Tata Chemicals、インド)も用い、また対照としてデンプンジャガイモ可溶性デンプン、HiMedia、ムンバイ、インド)も用いた。還元性炭水化物の増加は、ジニトロサリチル酸試薬によって測定した(Nilsson and Bjorck 1988. Journal of Nutrition 118, 1482-1486)。

0016

0017

表2は、植物性天然繊維に対する酸加水分解(0.1M HCl、37℃、100rpm)の影響を示す。還元糖の総量は、ジニトロサリチル酸(DNSA)によって決定した。

0018

0019

(例3)
酵素加水分解
100mgのブタ膵臓由来パンクレアチン4×USP(Sigma−Aldrich Corporationセントルイスミズーリ州、アメリカ)を100mlのリン酸緩衝液(50mM、pH7.0)に溶解した。さらに、植物性天然繊維(2g)を前述のパンクレアチン溶液に溶解し、37℃、100rpmで180分間インキュベートした。0、30、60、90、120、および180分の時点で試料を採取した。試験では、植物性天然繊維との比較基準としてFOSも用い、また対照としてデンプンも用いた。還元性炭水化物の増加は、ジニトロサリチル酸試薬によって測定した(Oku et al. 1984. Journal of Nutrition 114, 1574-1581)。植物性天然繊維に対する酵素加水分解(20mMPBS中0.1%パンクレアチンpH7.0、37℃、100rpm)の影響を表3に示す。還元糖の総量は、ジニトロサリチル酸(DNSA)によって決定した。

0020

0021

(例4)
バチルスコアグランスMTCC 5856に対する植物性天然繊維の増殖促進活性
バチルス コアグランス MTCC 5856の分離した単一コロニーをMRSブロス(pH7.0±20、Himedia、ムンバイ、インド)に接種し、37℃、120rpmで一晩インキュベートした。植物性天然繊維単独(0.5、1.0、2.0%、w/v)、およびMRS培地(ブドウ糖欠除)中の前記繊維(0.5、1.0、2.0%、w/v)を調製した。MRSブロスおよびMRS(ブドウ糖欠除)も個別に調製した。同様に、試験では、植物性天然繊維と比較するための基準対照としてフラクトオリゴ糖(FOS)も用いた。すべての培地の最終pHを7.0に調整した。一晩増殖したバチルス コアグランス MTCC 5856培養菌の5%をすべてのフラスコに接種し、37℃、100rpmで24時間インキュベートした。インキュベーション0時間および発酵後(24時間)の時点におけるpH値も記録した。試料を滅菌生理食塩水系列希釈し、グルコース酵母エキス寒天培地(HiMedia、ムンバイ、インド)にプレーティングすることで、0時間および発酵後(24時間)の時点における生菌数を一覧表にまとめた。平板培地を37℃で48〜72時間インキュベートした。各分析は、2つの異なる状況で、3連で実施された。生菌数の平均値をlog10cfu/mlで示す(図1a、1b、および1c)。

0022

(例5)
大腸菌の増殖抑制
プロバイオティック細菌であるバチルスコアグランスMTCC 5856を用いた植物性天然繊維による、病原性グラム陰性菌である大腸菌の抑制効果を評価するため、インビトロ実験を設計した。簡潔に述べると、2.0gの植物性天然繊維を100mlの脱イオン水に加えた。オオバコ殻繊維およびアマ種子繊維はゲル化特性が高いため、0.5gを100mLの脱イオン水に加えた。pHを7.0±0.2に調整し、121℃で20分間オートクレーブ処理した。滅菌後、酸素還元酵素であるOxyrase(Oxyrase(登録商標)for Broth、Oxyrase,Inc、マンスフィールド、オハイオ州、アメリカ)を各フラスコに加えた。バチルス コアグランス MTCC 5856は、グルコース酵母エキス寒天培地(Himedia、ムンバイ、インド)で増殖し、大腸菌ATCC25922は、トリプチケースソイ寒天培地(Himedia、ムンバイ、インド)で増殖した。両培養菌の単離した単一コロニーを用い、細菌懸濁液濁度をMcFarland標準溶液0.5(1.5×108コロニー形成単位(CFU)/mlと同等)に調整した。1mlの大腸菌ATCC 25922を、植物性天然繊維を含有するフラスコに加えた。同様に、他の群では、1mlの大腸菌ATCC 25922および1mlのB.コアグランス MTCC 5856を、植物性天然繊維を含有するフラスコに加えた。フラスコを37℃、100rpmで24時間インキュベートした。試料を滅菌生理食塩水で系列希釈し、エオシンメチレンブルー寒天培地(EMB寒天培地、HiMedia、ムンバイ、インド)にプレーティングすることで、0時間および発酵後(24時間)の時点における大腸菌ATCC 25922の生菌数を一覧表にまとめた。平板培地を37℃で48時間インキュベートした。各分析は、2つの異なる状況で、3連で実施された。生菌数の平均値をlog10cfu/mlで示す(図3)。

0023

(例6)
バチルスコアグランスMTCC 5856による植物性天然繊維を用いたSCFAの産生
McBurneyおよびThompsonによって記載された方法(McBurneyMIand Thompson LU. (1987) Effect of human faecal inoculum on in vitro fermentation variables. Brit J Nutr 58: 233-243)に若干修正を加えた下記方法によって、バチルス コアグランス MTCC 5856を用いたインビトロ発酵を行った。簡潔に述べると、2.0gのグルコースまたは植物性天然繊維を100mLの脱イオン水に加えた。オオバコ殻繊維およびアマ種子繊維はゲル化特性が高いため、0.5gを100mlの脱イオン水に加えた。pHを7.0±0.2に調整し、121℃で20分間オートクレーブ処理した。滅菌後、嫌気的条件導出するため、酸素還元酵素であるOxyrase(Oxyrase(登録商標)for Broth、Oxyrase,Inc、マンスフィールド、オハイオ州、アメリカ)を各フラスコに加えた。一晩増殖したバチルス コアグランス MTCC 5856培養菌の5%をすべてのフラスコに接種し、37℃、穏やかな振とうrpmで24時間インキュベートした。ボトル密閉し、パラフィルムで封をし、酵素補充によって生じた嫌気的条件を維持した。インキュベーション0時間および発酵後(24時間)の時点におけるpH値も記録した。1mlの硫酸銅(10g/L)を各試料に加え、微生物がさらに増殖することを抑制した(Sigma、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ)。前述の発酵試料中の短鎖脂肪酸の分析は、下記パラメーターを採用して行った。

0024

試薬
1.ジエチルエーテル(ARグレード
2.H2SO4
3.RO水
4.塩化ナトリウム(ARグレード)
クロマトグラフィーの条件
オーブン

0025

1.ポストラン温度 220℃
2.ポスト時間 5.0分
3.保持時間 18.00分
注入

0026

0027

カラム
1.DB−FFAPテレフタル酸修飾ポリエチレングリコール
2.寸法:30.00m×250.00mm×0.25μm。
3.キャリアガス窒素
4.流量:1.0ml/分
検出器
1.種類 FID
2.温度 350℃
3.水素流量30.0ml/分
4.空気流量 300.0ml/分
5.メークアップ流量 5.0ml/分

0028

標準溶液の調製
各脂肪酸標準品酢酸プロピオン酸、および酪酸)を正確に100.0mg量り、100mlメスフラスコに入れ、50.0mLの水に溶かし、標線まで水を補給し、よく混合した(ストック溶液)。さらに、ストック溶液10.0mLを水で100.0mLに希釈し、よく混合して標準溶液とした。本明細書中以下に記載されている通り、5mlの標準溶液の抽出を行った。

0029

1.標準溶液/試料を5mL取る。
2.0.5分間ボルテックスしながら、標準溶液に5mlの水を加えた。
3.0.5分間ボルテックスしながら、3M H2SO4でpHを1〜1.5に調整した。
4.1時間前までに−20℃に保ったジエチルエーテルを試料/実用標準溶液に加えた。
5.1分間ボルテックスしながら、10mlのジエチルエーテルを加えた。
6.1分間ボルテックスしながら、4gの塩化ナトリウムを加えた。
7.遠心分離して、水層ジエチル層に分離した。
8.1.0mLのジエチルエーテル層GCバイアルに移し、注入した。

0030

手順:
抽出した標準溶液を1μLずつ3回クロマトグラフに注入し、酢酸、プロピオン酸、および酪酸による主要ピーク応答を記録した。3回の注入で得られた酢酸、プロピオン酸、および酪酸によるピーク面積相対標準偏差%は、2.0%を超えるべきではない。抽出した試料溶液を1.0μLずつクロマトグラフに注入した。酢酸、プロピオン酸、および酪酸の含有量を以下の通り算出した。

クロマトグラフ分析の結果を図4および図5に示す。

実施例

0031

本発明は、好ましい実施形態を参照して記載されているが、本発明がこれに限定されるものではないことは、当業者に明確に理解されている。むしろ、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲に関連してのみ解釈されたものである。

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    【課題・解決手段】本発明は、細胞凝集塊の大きさを機械学的/物理学的な手段に依らずに適切に制御するための手段を提供することを目的とし、具体的には、SRF阻害剤を含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集... 詳細

  • 長瀬産業株式会社の「 エルゴチオネインの製造方法」が 公開されました。( 2020/12/17)

    【課題・解決手段】安価かつ大量にエルゴチオネインを製造する方法および該方法に使用する細菌を提供する。エルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、エルゴチオネイン生産能... 詳細

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