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技術 WNTシグナリングアゴニスト分子

出願人 ザボードオブトラスティーズオブザレランドスタンフォードジュニアユニバーシティーユニヴァーシティオブワシントン
発明者 ガルシア,ケナンクリストファーベイカー,デイビッドジャンダ,クラウディアイヴォンヌダン,ルークムーディー,ジェイムズダニエル
出願日 2015年9月11日 (5年8ヶ月経過) 出願番号 2017-510495
公開日 2017年10月12日 (3年7ヶ月経過) 公開番号 2017-530099
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 支持歯 候補コード 前庭器官 表皮状態 三半規管 代替コード 再生体 マトリックスキャリア
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年10月12日)のものです。
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図面 (16)

課題・解決手段

Wntシグナリングアゴニスト組成物およびその使用のための方法が提供される。本発明のWntシグナリングアゴニストは、LRP5またはLRP6結合部分に融合またはコンジュゲートされたフリルド結合部分を含む。本発明は、例えば、Lrp5/6とフリズルド(Fzd)受容体二量体化させる水溶性カノニカルWntシグナリングアゴニストであって、カノニカルwntシグナリングを直接的に活性化する、Wntシグナリングアゴニストを提供する。

概要

背景

Wnt(ウイングレス(Wingless)およびInt−1)は、その細胞増殖分化および遊走に及ぼす影響のため、脊椎動物および無脊椎動物発生の中心的メディエータである。Wntは、「カノニカル」β−カテニン経路ならびに「非カノニカル」平面内細胞極性(PCP)経路およびCa2+経路を含む少なくとも3種の異なるシグナリング経路活性化する、レスポンダー細胞における細胞表面受容体の活性化により作用する。
Wntシグナルは、発生、生理機能および疾患における多種多様細胞応答誘導することができる。Wnt経路の撹乱は、出生欠損からがんに及ぶ種々のヒトの疾患をもたらす可能性がある。Wntシグナリング不適切な活性化は、FAP、肝臓がん皮膚がん肺がんウィルムス腫瘍前立腺がんおよび乳がんを含むがんに見出されてきた。四肢形成(無四肢症(tetra−amelia))、骨化(bone ossification)、眼の血管新生および歯の発生における欠損を含む、種々の発生的な遺伝子欠損もまた、Wnt経路誤調節の結果として生じることが示されてきた。

Wnt/β−カテニンシグナル伝達は、細胞質タンパク質β−カテニンを核へと進入させて、転写モジュレートする。この経路が活性化されない場合、β−カテニンは、連続的な合成と、足場タンパク質アキシンおよびAPCならびにキナーゼSK3およびカゼインキナーゼ1(CK1)で構成されたβ−カテニン分解複合体による破壊サイクルに付される。Wntシグナリングは、この複合体からAPCを除去し、アダプターDshを介して他の構成成分を形質膜に再局在化させ、これにより、核に進入して転写を媒介するβ−カテニンを安定化する。

7回(seven−pass)膜貫通受容体フリルド(Frizzled)(Fz)は、ほとんど全てのWntシグナリングにとって必要不可欠であり、N末端FzシステインリッチドメインCRD)は、Wnt結合ドメインとして機能する。Fzに加えて、Wnt/β−カテニン経路は、共受容体として機能する低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5および6(Lrp5/6)を必要とする。LRP5およびLRP6は、機能的に重複した(redundant)1回膜貫通受容体である。LRP6の生化学的研究は、異なるWntが、LRP5/6タンパク質の異なる細胞外ドメインに結合し得ることを示す。LRP6細胞外ドメインは、β−プロペラ(propeller)および上皮増殖因子様(βP−E)ドメインの4個の反復配列を含有する。細胞外LRP6領域の結晶構造は、βP−E反復が、それぞれ2個のβP−Eペアを含有する2個の別々のコンパクトで硬い構造であることを示す。Wnt9bは、LRP6の細胞外ドメインにおける最初の2個のβP−E反復に結合する一方、Wnt3aは、最後の2個のβP−Eドメインに結合する。FzおよびLRP5/6へのWntリガンドの結合は、ホスファチジルイノシトール(4,5)−ビスホスフェート(PIP2)の産生をもたらす。PIP2の増加は、LRP5/6のオリゴマー形成およびクラスター形成を誘導する。PIP2の増加は、LRP5/6へのアキシンのリクルートを誘導する。このリクルートは、一部には、アキシン、CK1γおよびGSK3に結合する、ウィルムス腫瘍において変異される腫瘍抑制因子である、Amer1/WTX(X染色体上のAPC膜リクルート1またはウィルムス腫瘍遺伝子)の作用によるものである場合がある。Amer1/WTXは、PIP2依存性様式で形質膜にリクルートされる。

LRP6およびアキシンの間の相互作用は、Wnt経路の活性化にとって必要不可欠であり、Wntリガンド結合による形質膜へのアキシンおよび関連する分解複合体のリクルートは、LRP5/6の細胞内ドメインのリン酸化をもたらす一連事象惹起する。Wnt−Fz依存性様式でのLRP6へのアキシンのこのような初期リクルートは、Wnt経路活性化の「開始ステップ」と称される。LRP5/6受容体は、シグナル伝達に必要とされる5個のPPPSPxSモチーフをその細胞内ドメインに含有する。これら5個のモチーフはそれぞれ単独で、Wnt/β−カテニン経路を活性化することができる:異種受容体移入された場合、PPPSPxSモチーフは、経路活性化に十分となる。これらのモチーフの変異解析は、これらが、協同的様式で作用して、下流シグナリングを媒介することを示す。LRP5/6へのWntの結合は、PPPSPリン酸化を誘導することが示された。リン酸化されたLRP6は、アキシンに対し高親和性を有し、細胞表面への細胞質のアキシン結合GSK3複合体のさらなるリクルートを促進する。アキシン結合β−カテニン分解複合体が、LRP6によってリクルートされると、LRP6のリン酸化された細胞質ドメインは、GSK3活性を直接的に阻害し、β−カテニンのリン酸化およびその後のユビキチン媒介性プロテアソーム分解を遮断することができる。

非Wntアゴニストは、ノリン(Norrin)およびR−スポンジン(Spondin)を含む。ノリンは、LRP5と複合体形成するFz4特異的リガンドである。4種のR−スポンジン遺伝子は、Wnt経路を増強する保存された分泌タンパク質ファミリーを表す。LGR4/5/6(ロイシンリッチ反復含有GPCR4、5および6)は、R−スポンジンの受容体である。R−スポンジンの役割は、Wnt受容体のFzおよびLRP6を安定化して、Wntシグナリングを促進するようである。

近年、1型膜貫通タンパク質であるTikiが、X.laevisにおける軸形成を撹乱したmRNAスクリーニングする発現クローニングにおいて同定された(Zhangら、2012年)。Tikiは、成熟Wntタンパク質のN末端8アミノ酸を切断する新規メタロプロテアーゼであることが示された。in vitroにおいて、WntのこのようなN末端断片のTiki媒介性切断は、酸化およびジスルフィド結合形成により、可溶性の大型オリゴマーWnt複合体の形成をもたらす。このような大型で不活性なタンパク質分解されたWnt複合体の形成が、in vivoでのWnt経路におけるTikiの作用機構であるか否かは、依然として不明である。

概要

Wntシグナリングアゴニスト組成物およびその使用のための方法が提供される。本発明のWntシグナリングアゴニストは、LRP5またはLRP6結合部分に融合またはコンジュゲートされたフリズルド結合部分を含む。本発明は、例えば、Lrp5/6とフリズルド(Fzd)受容体を二量体化させる水溶性カノニカルWntシグナリングアゴニストであって、カノニカルwntシグナリングを直接的に活性化する、Wntシグナリングアゴニストを提供する。

目的

「水溶性」とは、界面活性剤非存在下で水性バッファーに可溶性であり、通常、生物学的有効用量のポリペプチドを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

Lrp5/6とフリルド(Fzd)受容体二量体化させる水溶性カノニカルWntシグナリングアゴニスト

請求項2

カノニカルwntシグナリングを直接的に活性化する、請求項1に記載のWntシグナリングアゴニスト。

請求項3

分子ポリペプチドを含む、請求項2に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項4

前記ポリペプチドが、1種または複数種のFzdタンパク質に対し高親和性を有する結合ドメインと、Lrp5およびLrp6タンパク質の一方または両方に対し高親和性を有する結合ドメインとを含む、請求項3に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項5

前記結合ドメイン同士が、直接的に接続されている、請求項4に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項6

前記結合ドメイン同士が、リンカーを介して接続されている、請求項4に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項7

代替物が、中立物質または陰性対照によって誘導されるβ−カテニンシグナリングと比較して、β−カテニンシグナリングを少なくとも50%増強する、請求項1から6のいずれかに記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項8

前記代替物が、中立物質または陰性対照によって誘導されるβ−カテニンシグナリングと比較して、β−カテニンシグナリングを少なくとも10倍増強する、請求項7に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項9

前記代替物が、中立物質または陰性対照によって誘導されるβ−カテニンシグナリングと比較して、β−カテニンシグナリングを少なくとも1000倍増強する、請求項7に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項10

前記代替物が、ヒト細胞におけるβ−カテニンシグナリングを増強する、請求項7から9のいずれかに記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項11

前記Fzd結合ドメインが、少なくとも約1×10−7MのKDで、1種または複数種のFzdタンパク質に結合する、請求項4に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項12

前記Fzd結合ドメインが、ポリペプチドである、請求項11に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項13

前記Fzd結合ドメインが、denovo設計されたFzd結合ドメインである、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項14

前記Fzd結合ドメインが、抗体由来結合タンパク質である、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項15

前記Fzd結合ドメインが、ナノボディ由来の結合ドメインである、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項16

前記Fzd結合ドメインが、ノッチンを操作した足場である、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項17

前記Fzd結合ドメインが、ノリンタンパク質またはそれに由来する結合性断片である、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項18

前記Fzd結合ドメインが、所望の特異性のために親和性選択された、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項19

前記Fzd結合ドメインが、2種またはそれを超える異なるフリズルドタンパク質に結合する、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項20

前記Fzd結合ドメインが、目的のフリズルドタンパク質に対し選択的である、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項21

前記Fzd結合ドメインが、抗Fzd抗体の6個のCDR領域を含むscFvである、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項22

前記Fzd結合ドメインが、汎特異的フリズルド抗体OMP−18R5の6個のCDR領域を含むscFvである、請求項12に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項23

前記Lrp5/6結合ドメインが、少なくとも約1×10−7MのKDで、Lrp5およびLrp6タンパク質の一方または両方に結合する、請求項4に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項24

前記Lrp5/6結合ドメインが、ポリペプチドである、請求項23に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項25

前記Lrp5/6結合ドメインが、denovo設計されたFzd結合ドメインである、請求項23に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項26

前記Lrp5/6結合ドメインが、抗体由来の結合タンパク質である、請求項23に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項27

前記Lrp5/6結合ドメインが、ナノボディ由来の結合ドメインである、請求項23に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項28

前記Lrp5/6結合ドメインが、ノッチンを操作した足場である、請求項23に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項29

前記Lrp5/6結合ドメインが、DKKタンパク質の結合部分を含む、請求項23に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項30

前記Lrp5/6結合ドメインが、ヒトDKK1のC末端ドメインを含む、請求項29に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項31

前記結合ドメイン同士が、2〜100アミノ酸を含むペプチドリンカーによって接続されている、請求項1から30のいずれか一項に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項32

前記リンカーが、約100オングストローム未満の結合ドメイン間の距離を強制する、請求項31に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項33

前記結合ドメイン同士が、非ペプチドリンカーによって接続されている、請求項1から30のいずれか一項に記載のwntシグナリングアゴニスト。

請求項34

請求項1から33のいずれか一項に記載のwntシグナリングアゴニストと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物

請求項35

wntシグナリングを活性化または増強する方法であって、有効用量の請求項1から33のいずれか一項に記載のwntシグナリングアゴニストと、フリズルド受容体を発現する細胞とを接触させるステップを含む方法。

請求項36

疾患または障害処置または防止することを必要とする被験体における疾患または障害を処置または防止する方法であって、有効量の請求項1から33のいずれか一項に記載のwntシグナリングアゴニストを該被験体に与えるステップを含む方法。

請求項37

前記被験体が、wntシグナリング低下に関連する疾患または障害を有する、請求項36に記載の方法。

請求項38

前記被験体が、放射線照射化学療法傷害粘膜炎炎症性腸疾患短腸症候群遺伝性腸障害セリアック病代謝性疾患、遺伝性症候群ウイルス感染症(例えば、hepB/C)、中毒状態、アルコール性肝臓脂肪肝肝硬変感染症悪性貧血潰瘍糖尿病糖尿病性足部潰瘍(例えば、難治性糖尿病性足部潰瘍)、島細胞破壊骨質量損失骨粗鬆症)、機能的皮膚の損失、毛髪の損失、機能的肺組織の損失、腎臓組織の損失(例えば、急性細管壊死)、内耳における感覚性細胞の損失、関節障害、骨粗鬆症および関連する骨疾患禿頭症ならびに移植片対宿主病から選択される疾患または障害を有する、請求項36または請求項37に記載の方法。

請求項39

創傷治癒および/または組織生成を増強することを必要とする被験体における創傷治癒および/または組織生成を増強する方法であって、有効量の請求項1から33のいずれか一項に記載のwntシグナリングアゴニストを該被験体に与えるステップを含む方法。

技術分野

0001

政府支援
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約GM097015のもとの政府支援で行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。

背景技術

0002

Wnt(ウイングレス(Wingless)およびInt−1)は、その細胞増殖分化および遊走に及ぼす影響のため、脊椎動物および無脊椎動物発生の中心的メディエータである。Wntは、「カノニカル」β−カテニン経路ならびに「非カノニカル」平面内細胞極性(PCP)経路およびCa2+経路を含む少なくとも3種の異なるシグナリング経路活性化する、レスポンダー細胞における細胞表面受容体の活性化により作用する。
Wntシグナルは、発生、生理機能および疾患における多種多様細胞応答誘導することができる。Wnt経路の撹乱は、出生欠損からがんに及ぶ種々のヒトの疾患をもたらす可能性がある。Wntシグナリング不適切な活性化は、FAP、肝臓がん皮膚がん肺がんウィルムス腫瘍前立腺がんおよび乳がんを含むがんに見出されてきた。四肢形成(無四肢症(tetra−amelia))、骨化(bone ossification)、眼の血管新生および歯の発生における欠損を含む、種々の発生的な遺伝子欠損もまた、Wnt経路誤調節の結果として生じることが示されてきた。

0003

Wnt/β−カテニンシグナル伝達は、細胞質タンパク質β−カテニンを核へと進入させて、転写モジュレートする。この経路が活性化されない場合、β−カテニンは、連続的な合成と、足場タンパク質アキシンおよびAPCならびにキナーゼSK3およびカゼインキナーゼ1(CK1)で構成されたβ−カテニン分解複合体による破壊サイクルに付される。Wntシグナリングは、この複合体からAPCを除去し、アダプターDshを介して他の構成成分を形質膜に再局在化させ、これにより、核に進入して転写を媒介するβ−カテニンを安定化する。

0004

7回(seven−pass)膜貫通受容体フリルド(Frizzled)(Fz)は、ほとんど全てのWntシグナリングにとって必要不可欠であり、N末端FzシステインリッチドメインCRD)は、Wnt結合ドメインとして機能する。Fzに加えて、Wnt/β−カテニン経路は、共受容体として機能する低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5および6(Lrp5/6)を必要とする。LRP5およびLRP6は、機能的に重複した(redundant)1回膜貫通受容体である。LRP6の生化学的研究は、異なるWntが、LRP5/6タンパク質の異なる細胞外ドメインに結合し得ることを示す。LRP6細胞外ドメインは、β−プロペラ(propeller)および上皮増殖因子様(βP−E)ドメインの4個の反復配列を含有する。細胞外LRP6領域の結晶構造は、βP−E反復が、それぞれ2個のβP−Eペアを含有する2個の別々のコンパクトで硬い構造であることを示す。Wnt9bは、LRP6の細胞外ドメインにおける最初の2個のβP−E反復に結合する一方、Wnt3aは、最後の2個のβP−Eドメインに結合する。FzおよびLRP5/6へのWntリガンドの結合は、ホスファチジルイノシトール(4,5)−ビスホスフェート(PIP2)の産生をもたらす。PIP2の増加は、LRP5/6のオリゴマー形成およびクラスター形成を誘導する。PIP2の増加は、LRP5/6へのアキシンのリクルートを誘導する。このリクルートは、一部には、アキシン、CK1γおよびGSK3に結合する、ウィルムス腫瘍において変異される腫瘍抑制因子である、Amer1/WTX(X染色体上のAPC膜リクルート1またはウィルムス腫瘍遺伝子)の作用によるものである場合がある。Amer1/WTXは、PIP2依存性様式で形質膜にリクルートされる。

0005

LRP6およびアキシンの間の相互作用は、Wnt経路の活性化にとって必要不可欠であり、Wntリガンド結合による形質膜へのアキシンおよび関連する分解複合体のリクルートは、LRP5/6の細胞内ドメインのリン酸化をもたらす一連事象惹起する。Wnt−Fz依存性様式でのLRP6へのアキシンのこのような初期リクルートは、Wnt経路活性化の「開始ステップ」と称される。LRP5/6受容体は、シグナル伝達に必要とされる5個のPPPSPxSモチーフをその細胞内ドメインに含有する。これら5個のモチーフはそれぞれ単独で、Wnt/β−カテニン経路を活性化することができる:異種受容体移入された場合、PPPSPxSモチーフは、経路活性化に十分となる。これらのモチーフの変異解析は、これらが、協同的様式で作用して、下流シグナリングを媒介することを示す。LRP5/6へのWntの結合は、PPPSPリン酸化を誘導することが示された。リン酸化されたLRP6は、アキシンに対し高親和性を有し、細胞表面への細胞質のアキシン結合GSK3複合体のさらなるリクルートを促進する。アキシン結合β−カテニン分解複合体が、LRP6によってリクルートされると、LRP6のリン酸化された細胞質ドメインは、GSK3活性を直接的に阻害し、β−カテニンのリン酸化およびその後のユビキチン媒介性プロテアソーム分解を遮断することができる。

0006

非Wntアゴニストは、ノリン(Norrin)およびR−スポンジン(Spondin)を含む。ノリンは、LRP5と複合体形成するFz4特異的リガンドである。4種のR−スポンジン遺伝子は、Wnt経路を増強する保存された分泌タンパク質ファミリーを表す。LGR4/5/6(ロイシンリッチ反復含有GPCR4、5および6)は、R−スポンジンの受容体である。R−スポンジンの役割は、Wnt受容体のFzおよびLRP6を安定化して、Wntシグナリングを促進するようである。

0007

近年、1型膜貫通タンパク質であるTikiが、X.laevisにおける軸形成を撹乱したmRNAスクリーニングする発現クローニングにおいて同定された(Zhangら、2012年)。Tikiは、成熟Wntタンパク質のN末端8アミノ酸を切断する新規メタロプロテアーゼであることが示された。in vitroにおいて、WntのこのようなN末端断片のTiki媒介性切断は、酸化およびジスルフィド結合形成により、可溶性の大型オリゴマーWnt複合体の形成をもたらす。このような大型で不活性なタンパク質分解されたWnt複合体の形成が、in vivoでのWnt経路におけるTikiの作用機構であるか否かは、依然として不明である。

発明が解決しようとする課題

0008

したがって、水溶性薬学的に活性を有するwnt組成物の開発には大きな関心が持たれる。

課題を解決するための手段

0009

Wntシグナリングアゴニスト分子およびその使用のための方法が提供される。本発明の分子は、水溶性であり;(i)フリズルド(Fzd)タンパク質および(ii)Lrp5/6の両方と高親和性で結合し;カノニカルwnt経路シグナリングを直接的に活性化する。wntシグナリングアゴニスト分子は、Fzdのアゴニストとして作用し、wnt経路シグナリングを活性化する方法における用途を見出す。一部の実施形態では、wntシグナリングアゴニスト分子は、ヒトFzdタンパク質およびLrp5/6タンパク質に結合する。本発明の分子は、有機小分子およびポリペプチドを限定することなく含む。

0010

本発明の一部の実施形態では、wntシグナリングアゴニスト分子は、Fzdに対するおよびLrp5/6に対する離間したまたは近接した結合ドメインまたはエレメントを含むことができるポリペプチドである。ポリペプチドwntシグナリングアゴニストは、単鎖二量体またはより高次多量体であってよい。Fzd結合ドメイン/エレメントおよびLrp5/6結合ドメイン/エレメントは、直接的に接続されても、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチド性リンカー等によって離間されていてもよい。

0011

ポリペプチドの実施形態では、Fzd結合ドメインは、高親和性で、例えば、少なくとも約1×10−7M、少なくとも約1×10−8M、少なくとも約1×10−9Mまたは少なくとも約1×10−10MのKDでFzdに結合するいずれかのドメインから選択することができる。適したFzd結合ドメインは、de novo設計されたFzd結合タンパク質抗体由来の結合タンパク質、例えば、scFv、Fab等および1種または複数種のFzdタンパク質に特異的に結合する抗体の他の部分;ナノボディ由来の結合ドメイン;ノッチンに基づく操作された足場;ノリンおよびこれに由来する操作された結合性断片天然起源のFzd結合ドメインなどを限定することなく含む。Fzd結合ドメインは、所望のFzdタンパク質または複数のFzdタンパク質への結合を増強するよう、例えば、組織選択性をもたらすように親和性選択することができる。

0012

一部の実施形態では、Fzd結合ドメインは、1、2、3、4、5種またはそれを超える異なるフリズルドタンパク質、例えば、ヒトフリズルドタンパク質Fz1、Fz2、Fz3、Fz4、Fz5、Fz6、Fz7、Fz8、Fz9、Fz10のうち1種または複数種に結合する。一部の実施形態では、抗体に基づくシグナリングアゴニストは、Fz1、Fz2、Fz5、Fz7およびFz8に結合する。他の実施形態では、フリズルド結合部分は、1種または複数種の目的のフリズルドタンパク質に選択的である、例えば、他のフリズルドタンパク質と比べて少なくとも10倍、25倍、50倍、100倍、200倍またはそれを超える、1種または複数種の所望のフリズルドタンパク質に対する特異性を有する。

0013

ポリペプチドの実施形態では、Lrp5/6結合ドメインまたはエレメントは、高親和性で、例えば、少なくとも約1×10−7M、少なくとも約1×10−8M、少なくとも約1×10−9M、少なくとも約1×10−10MのKDでLrp5/6に結合するいずれかのドメインから選択することができる。適したLrp5/6結合ドメインは、de novo設計されたLrp5/6結合タンパク質、抗体由来の結合タンパク質、例えば、scFv、Fab等および1種または複数種のFzdタンパク質に特異的に結合する抗体の他の部分;ナノボディ由来の結合ドメイン;ノッチンに基づく操作された足場;ノリン、DKK1、DKK2、DKK3、DKK4、スクレロスチンを限定することなく含む天然起源のLrp5/6結合タンパク質またはポリペプチド;などを限定することなく含む。ある特定の実施形態では、Lrp5/6結合ドメインは、DKK1のc末端部分である。Lrp5/6結合ドメインは、結合を増強するように親和性選択することができる。

0014

wntシグナリングアゴニストポリペプチドは、wnt活性化を増強するための作用物質(agent)と融合、連結あるいは共投与することができる。wnt活性を増強するポリペプチドは、R−スポンジン1、R−スポンジン2、抗スクレロスチン(sclerosin)抗体等を限定することなく含む。

0015

wntシグナリングアゴニストポリペプチドは、骨成長皮膚再生幹細胞活性化などに活性を有する増殖因子を含む目的の増殖因子と融合、連結あるいは共投与することができる。

0016

Fzd結合ドメインおよびLrp5/6結合ドメインは、1個の球状ドメイン内で近接していても、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチド性リンカー等によって離間されていてもよい。リンカーの長さ、したがって、結合ドメイン間のスペーシングは、シグナル強度のモジュレートに使用することができ、wntシグナリングアゴニストの所望の使用に応じて選択することができる。結合ドメイン間の強制された距離は、変動し得るが、ある特定の実施形態では、約100オングストローム未満、約90オングストローム未満、約80オングストローム未満、約70オングストローム未満、約60オングストローム未満または約50オングストローム未満であってよい。

0017

一部の実施形態では、リンカーは、硬いリンカーであり、他の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。リンカーは、ペプチドリンカーである場合、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個またはそれを超えるアミノ酸の長さであってよく、結合ドメイン間の距離の強制に十分な長さおよびアミノ酸組成である。一部の実施形態では、リンカーは、1個または複数個グリシンおよび/またはセリン残基を含むまたはそれからなる。

0018

wntシグナリングアゴニストは、例えば、Fcドメインを介して、連鎖(concatenation)、コイルドコイル、ポリペプチドジッパービオチンアビジンまたはストレプトアビジン多量体化などにより、多量体化することができる。wntシグナリングアゴニストは、in vivoにおける安定性を増強することが当技術分野で公知のPEG、Fc等の部分に接続することもできる。

0019

目的の組成物は、薬学的に許容される賦形剤に有効用量のwntシグナリングアゴニストを限定することなく含む。組成物は、追加的な作用物質、例えば、アジュバントなどを含むことができる。Wntシグナリングアゴニストは、合成により;当技術分野で公知の様々な適した組換え方法などにより産生することができる。加えて、水溶型のwntシグナリングアゴニストの利益は、その治療有用性を限定し得る製剤添加物、例えば、脂質、界面活性剤等の必要性を欠くことである。

0020

本発明の一部の態様では、細胞におけるWntシグナリングを活性化、増加または増強するための方法が提供される。斯かる方法において、フリズルド受容体を発現する細胞は、シグナリングの増加に、例えば、wntシグナリングアゴニストの非存在下でのシグナリングと比べて25%、50%、75%、90%、95%またはそれを超えるシグナリングの増加に有効な、ある濃度のwntシグナリングアゴニストと接触される。斯かるシグナリング活性化は、標的化された細胞の増殖を誘導することができ、このような細胞は、幹細胞を限定することなく含む、または標的化された細胞におけるWntシグナリング経路を他の仕方で活性化することができる。一部の方法において、受容体発現細胞は、in vitroで接触される。他の実施形態では、受容体発現細胞は、in vivoで接触される。目的の細胞は、当技術分野で公知の多種多様なFzd受容体発現細胞、例えば、皮膚細胞腸細胞骨芽細胞、幹細胞等を含む。

0021

本発明の一部の態様では、それを必要とする被験体における疾患または障害処置または防止するための方法であって、有効量のwntシグナリングアゴニストを被験体に与えるステップを含む方法が提供される。特定の実施形態では、被験体は、wntシグナリングの低下に関連する疾患または障害を有する。

0022

本発明の一部の態様では、それを必要とする被験体における創傷治癒および/または組織生成を増強するための方法であって、有効量のwntシグナリングアゴニストを被験体に与えるステップを含む方法が提供される。本発明の組成物および方法の利益は、標的化の特異性およびシグナリングアゴニストの水溶性であり、このようなwntシグナリングアゴニストは、ネイティブwntタンパク質と同じ細胞を標的とすることができる、または所望の組織におけるwntシグナリングを選択的に活性化することができる。

0023

本発明は、添付の図面と併せて読むと、次の詳細な記載から最も良く理解される。慣行に従い、図面の様々な特色が一定の縮尺(to−scale)ではないことが強調される。その反対に、様々な特色の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小されている。図面には、次の図が含まれる。

図面の簡単な説明

0024

図1は、親和性成熟に寄与する、設計されたFzd27バリアントにおける界面、コアおよび構造残基を示す。

0025

図2は、Fz27−B12が、高親和性でFz8に結合することを示す。蛍光コンジュゲートされたFz8−CRDを使用した酵母表面ディスプレイによる結合の確認を可能にする構築物において、Fz27を発現させた。ノックアウト変異(A173R/A174D)は、結合を排除または有意に抑止し、タンパク質が、設計された結合モードにより結合したことを示す。設計の作製に使用された野生型足場(2QUP)は、結合せず、これは、結合活性が、合理的操作によるものであることを示す。

0026

図3は、設計されたタンパク質のフリズルド特異性を示す。酵母表面力価測定(titration)から得られるおよそのKdは、Fzd8−CRDへの結合の合理的実用的な設計のおかげで、Fzd4−CRDと比較して、Fzd8−CRDに高度に特異的であるとFz27バリアントを決定した。Fzd4−CRDを上回るFzd8−CRDに対する現存する優先度は、フリズルドサブタイプ間を識別することができる結合剤を設計する能力を実証する。

0027

図4は、B12−DKK1cがXWnt8活性を再現し(recapitulate)、Fzd5およびFzd8を過剰発現するマウスL−細胞におけるWntシグナリング依存性ルシフェラーゼレポーターの発現を活性化することを示す。7個のTCF/LE結合部位上流コンカテマーを有するホタルルシフェラーゼレポーターであるSuperTopFlashレポーターを安定的にトランスフェクトし、Fzd5、Fzd8またはプラスミドを一過的にトランスフェクトしたマウスL−細胞を、XWnt8またはB12−DKK1cで16〜20時間処理した。その後、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼのWntシグナリング依存性発現を、デュアル−ルシフェラーゼレポーター系により検出した。

0028

図5は、scFvドメインおよびLrp5/6結合ドメインを描写する、例示的な代替wntアゴニストのアミノ酸配列(配列番号10)を示す。scFv(Onco)−DKK1cは、リンカー1によって接続された軽鎖可変領域および軽鎖の可変領域として表示された(labeled ass)OMP−18R5抗体のscFv断片(Oncomed)、ならびに柔軟なポリペプチドリンカー2によって共有結合により連結されたヒトDKK−1のC末端ドメインを含む。

0029

図6は、Biacoreチップに固定されたFzd1CRD、Fzd5CRD、Fzd7CRDおよびFzd8CRDへの可溶性scFv(Onco)−DKK1cの結合を測定する表面プラズモン共鳴実験を示す。

0030

図7は、R−スポンジン2(Rspo2)が、馴化培地において送達されるWnt3aの活性を増強するのと匹敵する様式で、Wnt代替アゴニストscFv(Onco)−DKK1c(DKK1c)の活性を増強して、A375 pBAR細胞およびSY5Y pBAR細胞におけるWntシグナリング依存性ルシフェラーゼレポーターの発現を活性化することを示す。ホタル(firely)ルシフェラーゼレポーターの上流に12個のTCF/LEF結合部位のコンカテマーを含有するWnt依存性pBARレポーターで細胞を安定的にトランスフェクトしたことを除いて、図4と同様にアッセイを行った。

0031

図8A〜図8Cは、図8A)非小細胞肺がん細胞株A549 pBAR、図8B)メラノーマ細胞株A375 pBARおよび図8C神経芽細胞腫細胞株SY5Y pBARにおける代替リガンドによるWnt依存性pBARレポーターのフリズルドサブタイプ特異的活性化を示す。pBARレポーターの発現を誘導するための、scFv−DKK1cおよびB12−DKK1c代替リガンド、XWnt8、B12、DKK1および無関係のタンパク質の活性を、様々な異なる濃度(図の下に示す)で測定した。増強されたレポーター発現は、代替Wntアゴニストのフリズルド特異性およびqRT−RCRによって決定される対応する細胞のフリズルド発現プロファイル相関する。scFv−DKK1c、B12−DKK1cおよびXWnt8のフリズルド反応性は、表に示し、対応する細胞のフリズルド発現プロファイルは、qRT−PCRによって決定して、マークされたボックスで示し、対応するリガンドによるWntレポーター活性化は、図の下の表におけるマークされたボックスで示す。
図8A〜図8Cは、図8A)非小細胞肺がん細胞株A549 pBAR、図8B)メラノーマ細胞株A375 pBARおよび図8C)神経芽細胞腫細胞株SY5Y pBARにおける代替リガンドによるWnt依存性pBARレポーターのフリズルドサブタイプ特異的活性化を示す。pBARレポーターの発現を誘導するための、scFv−DKK1cおよびB12−DKK1c代替リガンド、XWnt8、B12、DKK1および無関係のタンパク質の活性を、様々な異なる濃度(図の下に示す)で測定した。増強されたレポーター発現は、代替Wntアゴニストのフリズルド特異性およびqRT−RCRによって決定される対応する細胞のフリズルド発現プロファイルと相関する。scFv−DKK1c、B12−DKK1cおよびXWnt8のフリズルド反応性は、表に示し、対応する細胞のフリズルド発現プロファイルは、qRT−PCRによって決定して、マークされたボックスで示し、対応するリガンドによるWntレポーター活性化は、図の下の表におけるマークされたボックスで示す。

0032

図9A〜図9Cは、L−細胞における代替リガンドによるWntシグナリング依存性SuperTopFlashレポーターのフリズルドサブタイプ特異的活性化を示す。図9A)scFv(Onco)−DKK1cは、フリズルド7を優勢に発現するL−細胞におけるWntシグナリング依存性ルシフェラーゼレポーターの発現を活性化するが、これらの細胞は、Fzd5/8特異的B12−DKK1c代替リガンドならびにXWnt8または単離されたB12およびDKK−1に対し応答性ではない。図9B/図9C)L−細胞におけるB12−DKK1cおよびXWnt8の活性は、一過的トランスフェクションによるフリズルド5およびフリズルド8の過剰発現によってレスキューすることができる。

0033

図10は、A549細胞におけるWntシグナリング依存性pBARレポーターの発現を誘導するためのB12−DKK1cの活性が、Fzd8CRD−Fc(B12への結合による)、DKK−1(Lrp5/6への結合による)およびB12(Fzd5およびFzd8への結合による)によって阻害することができるが、B12に結合しないため、Fzd1CRD−Fcによっては阻害することができないことを示す。A549細胞におけるWntシグナリング依存性pBARレポーターの発現を誘導するためのscFv(Oncomed)−DKK1cの活性は、Fzd1CRD−Fc、Fzd8CRD−Fc(scFv−DKK1cへの結合による)およびDKK−1(Lrp5/6への結合による)によってアンタゴナイズすることができるが、B12は、フリズルドへのscFv(Onco)の結合を阻害しないため、B12によってはアンタゴナイズすることができない。図4の通りにアッセイを行った。

0034

図11は、増加する濃度のscFv(Onco)−DKK1cまたはWnt3a含有馴化培地(CM)によるSY5Y pBAR細胞の2時間処理が、基本の(plain)培地(neg ctr)、陰性対照タンパク質B12(Neg ctrl(nM))または対照馴化培地(偽CM)による処理と比較して、細胞質ベータ−カテニンの蓄積をもたらすことを示す。表示の処理で細胞を2時間処理し、その後、等張性溶解バッファーに細胞を溶解し、ウエスタンブロッティングによって可溶性画分から細胞質ベータ−カテニンを検出した。ラミンA/Cをローディング対照として使用した。

0035

図12は、scFv(Onco)−DKK1cが、Wnt様の様式で、様々な細胞株における直接的Wnt標的遺伝子アキシン2およびTroyの転写を誘導することを示す。SY5Y pBAR細胞およびA375 pBAR細胞を、50nM scFv(Onco)−DKK1c、50nM B12または30%Wnt3a−L馴化培地で24時間処理した。mRNAを抽出し、cDNA逆転写し、qRT−PCRを使用して、Wnt標的遺伝子アキシン2およびTroy転写物のレベルを検出した。

0036

図13A〜図13Bは、代替Wntリガンドの柔軟なリンカーの長さを変更し、それによって、フリズルド/Lrp5/6二量体化幾何学的配置を変更すると、Wnt標的遺伝子転写(図13A)およびWntシグナリング依存性ルシフェラーゼレポーターの発現(図13B)によって観察されるシグナリングの大きさが変化することを示す。A)2μM IWP−2の存在下でA549 pBAR細胞を、50nMのXWnt8、50nMの0aa、5aa、10aaおよび15aaリンカーを有するB12−DKK1cまたは30%Wnt3a−L馴化培地で24時間処理した。mRNAを抽出し、cDNAに逆転写し、qRT−PCRを使用して、Wnt標的遺伝子アキシン2転写物のレベルを検出した。図13B)増加する濃度のXWnt8および可変的なリンカーの長さを有するB12−DKK1cバリアントによるA549 pBAR細胞におけるレポーター活性化の大きさを、図4に記載されている通りに2uM IWP−2の存在下で評価した。

0037

図14は、scFv(Onco)−DKK1cが、Wnt様の様式で、SY5Y細胞およびA375細胞における細胞質ベータ−カテニンの蓄積を増強することを示す。SY5Y細胞およびA375細胞を、表示濃度のscFv(Onco)−DKK1c、馴化培地または陰性対照で2時間処理した。2時間後に、等張性溶解バッファーに細胞を溶解し、ウエスタンブロッティングによって可溶性画分から細胞質ベータ−カテニンを検出した。アルファチューブリンをローディング対照として使用した。

0038

図15は、R−スポンジン2がscFv(Onco)−DKK1cの活性を強く増強して、Wnt3aに匹敵するレベルまで、HEK293細胞におけるWntシグナリング依存性SuperTopFlashレポーターの発現を誘導することを示す。SuperTopFlash Wntレポーターを安定的にトランスフェクトしたHEK293細胞を、20nM Rspo2ありおよびなしで16〜20時間、scFv(Onco)−DKK1c(4nM、8nM、16nM、31nM、62nM)、Wnt3a(23%、29%、33%、38%、41%、44%)で16〜20時間処理した。増強されたルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系により検出した。

0039

本方法および組成物について記載する前に、記載されている特定の方法または組成物は当然ながら変動し得るため、本発明が、記載されている特定の方法または組成物に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書に使用されている用語法が、単に特定の実施形態について記載することを目的としており、限定を目的としないことも理解されたい。

0040

値の範囲が提示されている場合、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、この範囲の上限および下限の間の、それぞれ介在する値も、下限の単位の10分の1まで、特に開示されていることが理解される。記述されている範囲内のいずれか記述されている値または介在する値と、この記述されている範囲内のいずれか他の記述されている値または介在する値との間のそれぞれのより狭い範囲が、本発明の内に包含される。このようなより狭い範囲の上限および下限は独立に、この範囲に含まれても除外されてもよく、上限と下限のいずれか一方またはその両方が、より狭い範囲に含まれるまたはどちらも含まれないような各範囲も、本発明の内に包含され、記述されている範囲のいずれか特に除外される限界の対象となる。記述されている範囲が、限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれか一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。

0041

他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様または均等のいかなる方法および材料を使用することもできるが、いくつかの有望な好まれる方法および材料についてここに記載する。本明細書に言及されているあらゆる刊行物は、刊行物が引用されているものに関連して方法および/または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に援用する。矛盾が生じる程度まで、本開示が、援用されている刊行物のいかなる開示にも優先することが理解される。

0042

本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されている場合、単数形(「a」、「an」および「the」)は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。よって、例えば、「細胞(a cell)」の言及は、複数の斯かる細胞を含み、「ペプチド(the peptide)」の言及は、当業者に公知の通り、1個または複数個のペプチドおよびその均等物、例えば、ポリペプチドの言及を含む、等々。

0043

本明細書に記述されている刊行物は、単に、本願の出願日に先立つその開示のために提示されている。本明細書におけるいかなる記述も、本発明が、先行発明によって、斯かる刊行物に先行する権利を与えられていないことの承認として解釈するべきではない。さらに、提示されている刊行物の日付は、場合により独立に確認される必要がある実際の刊行日と異なっていてよい。

0044

「を含む」とは、列挙されているエレメントが、組成物/方法/キットにおいて必要とされるが、特許請求の範囲内の他のエレメントが含まれて、組成物/方法/キット等を構成してもよいことを意味する。例えば、wnt代替物を含む組成物は、wnt代替物(複数可)に加えて他のエレメント、例えば、当技術分野で容易に理解される通り、いずれかの否定的条件(negative provisos)によって包含されるエレメントを除く、wnt代替物に結合、例えば、共有結合されたポリペプチド、小分子または核酸等、機能的部分;wnt代替組成物の安定性を促進する作用物質、wnt代替組成物の溶解性を促進する作用物質、アジュバント等を含むことができる組成物である。

0045

「から本質的になる」とは、対象発明の基本および新規特徴(複数可)に実質的に影響を与えない指定されている材料またはステップへの、記載されている組成物または方法の範囲の限定を意味する。例えば、開示されている配列「から本質的になる」wnt代替物は、これが由来する配列に基づく配列の境界における、開示されている配列プラスまたはマイナス約5アミノ酸残基の、例えば、列挙されている境界アミノ酸残基よりも約5残基、4残基、3残基、2残基もしくは約1残基少ない、または列挙されている境界アミノ酸残基よりも約1残基、2残基、3残基、4残基もしくは5残基多いアミノ酸配列を有する。

0046

「からなる」とは、組成物、方法またはキットから、特許請求の範囲において指定されていないいかなるエレメント、ステップまたは成分も除外することを意味する。例えば、開示されている配列「からなる」wnt代替物は、開示されているアミノ酸配列のみからなる。

0047

「機能的部分」または「FM」とは、組成物に機能的活性を付与するポリペプチド、小分子または核酸組成物を意味する。機能的部分の例として、治療部分、結合部分およびイメージング部分が限定することなく挙げられる。

0048

「治療部分」または「TM」とは、組成物に治療活性を付与するポリペプチド、小分子または核酸組成物を意味する。治療部分の例として、細胞にとって内因的に有害な細胞毒、例えば、小分子化合物タンパク質毒素および放射線増感部分、すなわち、放射性核種等;細胞の活性を変更する作用物質、例えば、小分子、ペプチド模倣物サイトカインケモカイン;ならびにADCCまたはCDC依存性死亡のために細胞を標的とする部分、例えば、免疫グロブリンのFc構成成分が挙げられる。

0049

「イメージング部分」または「IM」とは、細胞、例えば、対象出願の組成物によって標的化された細胞の位置決定および任意選択可視化に使用することができる非細胞傷害性作用物質を意味する。

0050

用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを一般に意味するように本明細書において使用されている。効果は、疾患もしくはその症状の完全もしくは部分的な防止に関して予防的となることができる、および/または疾患および/または疾患に起因し得る有害作用の部分的もしくは完全治癒に関して治療的となることができる。「処置」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物における疾患のいずれかの処置を網羅し、(a)疾患の素因がある可能性があるが、未だ疾患を有するとは診断されていない被験体における疾患発生の防止;(b)疾患の阻害、すなわち、その発症の抑止;または(c)疾患の軽減、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または傷害の発症の前、最中または後に投与することができる。患者の望ましくない臨床症状を安定化または低下する、進行中の疾患の処置には、特に関心が持たれる。斯かる処置は、罹患組織において機能が完全に喪失するより前に行われるのが望ましい。対象治療法は、疾患の症候性ステージの間に投与することができ、一部の事例では、疾患の症候性ステージの後に投与することができる。

0051

用語「個体」、「被験体」、「宿主」および「患者」は、本明細書において互換的に使用されており、診断、処置または治療法が望まれるいずれかの哺乳動物被験体、特に、ヒトを指す。

0052

分子および細胞生化学における一般的方法は、その開示が参照により本明細書に援用される、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版(Sambrookら、CSH Laboratory Press 2001年);Short Protocols in Molecular Biology、第4版(Ausubelら編、John Wiley & Sons 1999年);Protein Methods(Bollagら、John Wiley & Sons 1996年);Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagnerら編、Academic Press 1999年);Viral Vectors(KapliftおよびLoewy編、Academic Press 1995年);Immunology Methods Manual(I. Lefkovits編、Academic Press 1997年);およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(DoyleおよびGriffiths、John Wiley & Sons 1998年)等の標準的な教科書に見出すことができる。本開示において参照されている遺伝子操作のための試薬クローニングベクターおよびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma−AldrichおよびClonTech等の商業的ベンダーから入手することができる。
組成物

0053

本明細書において代替分子とも称されるWntシグナリングアゴニストおよびその使用のための方法が提供される。本発明の上記および他の目的、利点および特色は、より十分に後述する組成物および方法の詳細を読むことにより、当業者に明らかとなる。

0054

Wnt代替分子は、その物理的および生物学的特性により定義される。鍵となる特色は、水溶性であることと、1種または複数種のFzdタンパク質およびLrp5/6への結合を介する、特に、細胞表面、例えば、ヒト細胞の表面におけるこれらのタンパク質への結合によるカノニカルwntシグナリングの直接的活性化である。wnt代替物によるwntシグナリングの直接的活性化は、ネイティブwntタンパク質が存在する場合にのみ活性を増強する、wntシグナリングの増強とは対照的である。

0055

wnt代替物は、水溶性であることと、1種または複数種のFzdタンパク質およびLrp5/6への結合を介するカノニカルwntシグナリングの直接的活性化の特性を有するいずれかの分子、例えば、タンパク質または医薬品であってよい。約15Kd未満であり得る小分子を目的とし、これは、本明細書に記載されている化合物スクリーニングにより開発することができる。ポリペプチドも目的とする。加えて、ある特定のwnt代替物は、ポリペプチド領域またはドメインおよび非ポリペプチド領域またはドメインの両方を含むことができる。

0056

wnt代替物は、ポリペプチドであってよく、Fzdに対する結合ドメインは、Lrp5/6に対する結合ドメインに接続される。ポリペプチドwnt代替物は、単鎖、二量体またはより高次の多量体であってよい。Fzd結合ドメインおよびLrp5/6結合ドメインは、直接的に接続されていても、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチド性リンカー等によって離間されていてもよい。

0057

本発明のWnt代替物は、通常、同族フリズルド受容体への結合およびwntシグナリングの活性化において生物学的に活性である、すなわち、この代替物は、wntアゴニストである。用語「wntアゴニスト活性」は、フリズルドタンパク質に結合するwntタンパク質の効果または活性を模倣するアゴニストの能力を指す。wntの活性を模倣する本発明のアゴニストの能力は、多数のアッセイによって確認することができる。本発明のアゴニストは、典型的に、受容体の天然リガンドによって惹起されるものと同様のまたは同じ反応または活性を惹起する。特に、本発明のアゴニストは、カノニカルWnt/β−カテニンシグナリング経路を増強する。本明細書において使用される場合、用語「増強する」は、本発明のアゴニストの非存在下でのレベルと比較した、Wnt/β−カテニンシグナリングのレベルの測定可能な増加を指す。

0058

カノニカルWnt/β−カテニンシグナリングのレベルを測定するための様々な方法が、当技術分野で公知である。これらとして、Wnt/β−カテニン標的遺伝子発現;TCFレポーター遺伝子発現ベータ−カテニン安定化;LRPリン酸化;細胞質から形質膜へのアキシンの移行およびLRPへの結合を測定するアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。カノニカルWnt/β−カテニンシグナリング経路は、最終的に、転写因子TCF7、TCF7L1、TCF7L2およびLEFを介する遺伝子発現の変化をもたらす。Wnt活性化に対する転写応答は、多数の細胞および組織において特徴付けられている。そのため、当技術分野で周知の方法による網羅的転写プロファイリングを使用して、Wnt/β−カテニンシグナリング活性化を評価することができる。

0059

wnt応答性遺伝子発現の変化は、一般に、TCFおよびLEF転写因子によって媒介される。TCFレポーターアッセイは、TCF/LEF制御される遺伝子の転写の変化を評価して、Wnt/β−カテニンシグナリングのレベルを決定する。TCFレポーターアッセイは最初に、Korinek, V.ら、1997年によって記載された。TOP/FOPとしても公知のこの方法は、内在性β−カテニン/TCF4のトランス活性化活性を決定するための、ルシフェラーゼ発現を駆動する最小c−Fosプロモーターの上流の、3コピーの最適TCFモチーフCCTTTGATCまたは3コピーの変異体モチーフCCTTTGGCCの使用を伴う(それぞれpTOPFLASHおよびpFOPFLASH)。これら2種のレポーター活性(TOP/FOP)のより高い比は、より高いβ−カテニン/TCF4活性を示す。

0060

Wntシグナルに応答する様々な他のレポーター導入遺伝子は、動物においてインタクトで存在し、したがって、内在性Wntシグナリングを有効に反映する。これらのレポーターは、LacZまたはGFPの発現を駆動する多量体化したTCF結合部位に基づき、この発現は、当技術分野で公知の方法によって容易に検出可能である。これらのレポーター遺伝子は、TOP−GAL、BAT−GAL、ins−TOPEGFP、ins−TOPGAL、LEF−EGFP、アキシン2−LacZ、アキシン2−d2EGFP、Lgr5tm1(cre/ERT2)、TOPdGFPを含む。

0061

膜への脱リン酸化されたβ−カテニンのリクルート、β−カテニンの安定化およびリン酸化状態、ならびに核へのβ−カテニンの移行(Klapholz−Brown Zら、PLoS One.2巻(9号)e945頁、2007年)は、場合によりTCF転写因子およびTNIKとの複合体形成によって媒介され、Wntシグナリング経路における鍵となるステップである。安定化は、細胞内β−カテニンの分解が低下され、その後に核へのβ−カテニンの移行が続くように、「分解」複合体を阻害するディシェベルド(Disheveled)ファミリータンパク質によって媒介される。したがって、細胞におけるβ−カテニンのレベルおよび位置の測定は、Wnt/β−カテニンシグナリングのレベルの優れた反映である。斯かるアッセイの非限定例は、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)のC末端に融合されたヒトβ−カテニンを安定的に発現する組換えU2OS細胞をもたらす「BioImage β−Catenin Redistribution Assay」(Thermo Scientific)である。イメージングおよび解析は、EGFP−β−カテニンのレベルおよび分布の可視化を可能にする蛍光顕微鏡またはHCSプラットフォームにより行われる。

0062

分解複合体が阻害される別の仕方は、Wnt共受容体LRPの細胞質テイルへのアキシンのリクルートによるアキシンの除去によって為される。アキシンは、LRPテイルのリン酸化型に優先的に結合することが示された。例えば、GFP−アキシン融合タンパク質によるアキシン移行の可視化は、したがって、Wnt/β−カテニンシグナリングのレベルを評価するための別の方法である。

0063

ある特定の実施形態では、本発明の代替物は、上記のアッセイにおいて測定される通り、例えば、TOPFlashアッセイにおいて測定される通り、中立物質(neutral substance)または陰性対照によって誘導されるβ−カテニンシグナリングと比較して、β−カテニンシグナリングを少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、150%、200%、250%、300%、400%または500%増強することができる。陰性対照は、これらのアッセイに含まれてよい。特定の実施形態では、本発明の代替物は、上記のアッセイにおいて測定される場合、例えば、TOPFlashアッセイまたは本明細書に言及されている他のアッセイのいずれかにおいて測定される場合、アゴニストの非存在下での活性と比較して、β−カテニンシグナリングを2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍またはそれを超えて増強することができる。

0064

「Wnt遺伝子産物」または「Wntポリペプチド」は、本明細書に使用される場合、ネイティブ配列Wntポリペプチド、Wntポリペプチドバリアント、Wntポリペプチド断片およびキメラWntポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、Wntポリペプチドは、ネイティブヒト全長成熟Wntタンパク質である。

0065

例えば、本願における目的のヒトネイティブ配列Wntタンパク質は、次のものを含む:Wnt−1(GenBank受託番号NM_005430);Wnt−2(GenBank受託番号NM_003391);Wnt−2B(Wnt−13)(GenBank受託番号NM_004185(アイソフォーム1)、NM_024494.2(アイソフォーム2))、Wnt−3(RefSeq.:NM_030753)、Wnt3a(GenBank受託番号NM_033131)、Wnt−4(GenBank受託番号NM_030761)、Wnt−5A(GenBank受託番号NM_003392)、Wnt−5B(GenBank受託番号NM_032642)、Wnt−6(GenBank受託番号NM_006522)、Wnt−7A(GenBank受託番号NM_004625)、Wnt−7B(GenBank受託番号NM_058238)、Wnt−8A(GenBank受託番号NM_058244)、Wnt−8B(GenBank受託番号NM_003393)、Wnt−9A(Wnt−14)(GenBank受託番号NM_003395)、Wnt−9B(Wnt−15)(GenBank受託番号NM_003396)、Wnt−10A(GenBank受託番号NM_025216)、Wnt−10B(GenBank受託番号NM_003394)、Wnt−11(GenBank受託番号NM_004626)、Wnt−16(GenBank受託番号NM_016087))。各メンバーは、ファミリーにより変動する程度の配列同一性を有するが、全て、そのスペーシングが高度に保存された23〜24個の保存されたシステイン残基を含有する、小型の(すなわち、39〜46kD)アシル化パルミトイル化分泌糖タンパク質をコードする(McMahon, A Pら、TrendsGenet.1992年;8巻:236〜242頁;Miller, J R.、Genome Biol.2002年;3巻(1号):3001.1〜3001.15頁)。他の目的のネイティブ配列Wntポリペプチドは、イヌネコウシウマヒツジブタヤギウサギラット、マウス、カエルゼブラフィッシュショウジョウバエ蠕虫等、家庭動物および農場動物および動物園実験動物またはペット動物を含むいずれかの哺乳動物に由来する上記のオルソログを含む。

0066

「Wntタンパク質シグナリング」または「Wntシグナリング」は、生物学的に活性なWntが、細胞の活性をモジュレートするよう細胞においてその効果を発揮する機構を指すように本明細書において使用されている。Wntタンパク質は、タンパク質のフリズルド(Fz)ファミリーに由来するタンパク質、タンパク質のRORファミリーに由来するタンパク質、タンパク質のLRPファミリーに由来するタンパク質LRP5、LRP6、タンパク質FRL1/cryptoおよびタンパク質Derailed/Rykを含むWnt受容体に結合することにより細胞活性をモジュレートする。Wnt結合によって活性化されると、Wnt受容体(複数可)は、1種または複数種の細胞内シグナリングカスケードを活性化する。これらは、カノニカルWntシグナリング経路;Wnt/平面内細胞極性(Wnt/PCP)経路;Wnt−カルシウム(Wnt/Ca2+)経路(Giles, RHら(2003年)Biochim Biophys Acta 1653巻、1〜24頁;Peifer, M.ら(1994年)Development 120巻:369〜380頁;Papkoff, J.ら(1996年)Mol. Cell Biol.16巻:2128〜2134頁;Veeman, M. T.ら(2003年)Dev.Cell 5巻:367〜377頁);および当技術分野で周知の通り他のWntシグナリング経路を含む。

0067

例えば、カノニカルWntシグナリング経路の活性化は、細胞内タンパク質β−カテニンのリン酸化の阻害をもたらし、サイトゾルにおけるβ−カテニンの蓄積と、その後の核への移行をもたらし、核において、β−カテニンは、転写因子、例えば、TCF/LEFと相互作用して、標的遺伝子を活性化する。Wnt/PCP経路の活性化は、RhoA、c−JunN末端キナーゼ(JNK)およびネモ(nemo)様キナーゼ(NLK)シグナリングカスケードを活性化して、組織極性および細胞運動等の生物学的過程を制御する。例えば、Wnt−4、Wnt−5AまたはWnt−11の結合によるWnt/Ca2+の活性化は、カルシウムイオンの細胞内放出を誘発し、カルシウムイオンは、タンパク質キナーゼC(PKC)、カルシウム−カルモジュリン依存性キナーゼII(CamKII)またはカルシニューリン(CaCN)等のカルシウム感受性酵素を活性化する。上記のシグナリング経路の活性をアッセイすることにより、Wnt組成物の生物学的活性を容易に決定することができる。「生物学的に活性なwnt代替物」は、in vitroまたはin vivoで細胞に与えられると、すなわち、動物、例えば、哺乳動物に投与されると、Fzd受容体に特異的に結合し、Wntシグナリングを活性化することができるwnt代替組成物である。

0068

ある特定の実施形態では、本発明のwnt代替物は、代替物の非存在下でのwntシグナリングのレベルと比べて、カノニカルwnt経路のシグナリングを少なくとも約50%、約75%、約100%、約150%、約200%、約300%、約400%、約5倍、約10倍増加させ、シグナリングを50倍、100倍、500倍またはそれを超えて増加させることができる。

0069

用語「特異的な結合」は、共有結合による相互作用もしくは非共有結合による相互作用または共有結合による相互作用および非共有結合による相互作用の組合せによって媒介され得る、酵素/基質、受容体/リガンド、抗体/抗原およびレクチン炭水化物等の対になった種の間に生じる結合を指す。2種の種の相互作用が、非共有結合した複合体を産生する場合、生じる結合は、典型的には、静電気的相互作用、水素結合相互作用または親油性相互作用の結果である。したがって、「特異的な結合」は、対になった種の間に生じ、そこでは、該2種の間に、抗体/抗原またはリガンド/受容体相互作用の特徴を有する結合した複合体を産生する相互作用が存在する。in vivo投与後に機能的アッセイにおいて活性のレベル、例えば、骨再生加速、幹細胞増殖の増強等、β−カテニンの核局在化、wnt応答性遺伝子の転写増加等を決定することにより、組成物におけるwnt代替物の生物学的活性を決定することができる。

0070

「水溶性」とは、界面活性剤の非存在下で水性バッファーに可溶性であり、通常、生物学的有効用量のポリペプチドを提供する濃度の可溶性の組成物を意味する。水溶性である組成物は実質的に均質な組成物を生成し、該均質な組成物は、これが出発材料から精製される該出発材料の少なくとも約5%、通常は、出発材料の少なくとも約10%、20%または30%、より通常は、出発材料の約40%、50%または60%である比活性、および、約50%、約90%またはそれ超となり得る比活性を有する。本発明のWnt代替組成物は、典型的に、少なくとも25μMおよびより高い、例えば、少なくとも25μM、40μMまたは50μM、通常少なくとも60μM、70μM、80μMまたは90μM、場合により、100μM、120μMまたは150μMもの高さの濃度の、実質的に均質な水溶液を生成する。言い換えると、本発明のwnt代替組成物は、典型的に、約0.1mg/ml、約0.5mg/mlもしくは(of)約1mg/mlまたはそれを超える濃度の、実質的に均質な水溶液を生成する。

0071

Fzd結合ドメイン。Fzd結合ドメインは、小分子またはポリペプチドであってよく、高親和性で、例えば、少なくとも約1×10−7M、少なくとも約1×10−8M、少なくとも約1×10−9M、少なくとも約1×10−10MのKDでFzdに結合するいずれかのドメインから選択することができる。適したFzd結合ドメインは、de novo設計されたFzd結合タンパク質、抗体由来の結合タンパク質、例えば、scFv、Fab等および1種または複数種のFzdタンパク質に特異的に結合する他の抗体部分;ナノボディ由来の結合ドメイン;ノッチンに基づく操作された足場;ノリンおよびそれに由来する結合性断片;などを限定することなく含む。

0072

Fzd結合ドメインは、所望のFzdタンパク質または複数のFzdタンパク質への結合を増強するように、例えば、組織選択性をもたらすように、親和性選択することができる。この目的のための親和性選択の方法は、標的化されたアミノ酸変化を導入し、候補コード配列のライブラリーを作製し、候補コード配列により細胞集団を、例えば、酵母細胞形質転換し、所望の特異性に関して選択(例えば、常磁性マイクロビーズを使用して)することによる、1または複数ラウンドの選択を任意選択で利用することができる。典型的には、複数ラウンドの選択が行われ、その結果得られるベクター配列決定し、タンパク質工学のための基盤として使用する。例えば、ノリン結合ドメイン、抗体またはナノボディ由来のドメイン、操作されたタンパク質等を限定することなく含むFzd結合ドメインは、1種または複数種の目的のFzdタンパク質に選択的に結合するよう選択することができる。例えば、ノリンは、Fzd4以外のまたはそれに加えたFzd受容体に結合するように親和性選択することができる。

0073

一部の実施形態では、Fzd結合ドメインは、1、2、3、4、5種またはそれを超える異なるフリズルドタンパク質、例えば、ヒトフリズルドタンパク質Fz1、Fz2、Fz3、Fz4、Fz5、Fz6、Fz7、Fz8、Fz9、Fz10のうち1種または複数種に結合する。一部の実施形態では、抗体に基づく代替物は、Fz1、Fz2、Fz5、Fz7およびFz8に結合する。他の実施形態では、フリズルド結合部分は、1種または複数種の目的のフリズルドタンパク質に選択的である、例えば、1種または複数種の所望のフリズルドタンパク質に対し、他のフリズルドタンパク質と比べて少なくとも10倍、25倍、50倍、100倍、200倍またはそれを超える特異性を有する。

0074

ある特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、汎(pan)特異的フリズルド抗体OMP−18R5(バンチクツマブ(vantictumab))の6個のCDR領域を含む。ある特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、汎特異的フリズルド抗体OMP−18R5(バンチクツマブ)の6個のCDR領域を含むscFvである。例えば、特に本明細書に参照として援用される米国特許第8507442号を参照されたい。例えば、OMP−18R5のCDR配列は、GFTFSHTLS(配列番号1)を含む重鎖CDR1、VISGDGSYTYYADSVKG(配列番号2)を含む重鎖CDR2およびNFIKYVFAN(配列番号3)を含む重鎖CDR3、ならびに(ii)SGDKLGKKYAS(配列番号4)またはSGDNIGSFYVH(配列番号7)を含む軽鎖CDR1、EKDNRPSG(配列番号5)またはDKSNRPSG(配列番号8)を含む軽鎖CDR2およびSSFAGNSLE(配列番号6)またはQSYANTLSL(配列番号9)を含む軽鎖CDR3を含む。特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、配列番号1〜9のCDR配列を含む、ScFv、ミニボディ(minibody)、ナノボディおよび様々な抗体模倣物を限定することなく含む抗体またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、これらのCDR配列は、配列番号1〜9と比較して1個または複数個のアミノ酸修飾を含む。

0075

他の実施形態では、Fzd結合ドメインは、当技術分野で公知であり、かつ市販されている、またはde novoで作製することができる、多数のフリズルド特異的抗体のいずれかに由来する可変領域配列またはそのCDRを含む。フリズルドポリペプチドのいずれかを免疫原としてまたはスクリーニングアッセイにおいて使用して、抗体を開発することができる。「Fz」、「Fzタンパク質」および「Fz受容体」は、フリズルド受容体ファミリーのタンパク質を指すように本明細書で使用されている。これらのタンパク質は、CRDドメインを含む、7回膜貫通タンパク質(Ingham, P. W.(1996年)TrendsGenet.12巻:382〜384頁;Yang−Snyder, J.ら(1996年)Curr. Biol.6巻:1302〜1306頁;Bhanot, P.ら(1996年)Nature 382巻:225〜230頁)である。Fzファミリーには10種の公知メンバーが存在し(Fz1からFz10)、そのいずれも、Wntの受容体として機能することができる。ヒトフリズルド参照配列のGenbank受託番号を次に示す:FZD1(NM_003505);FZD2(NM_001466);FZD3(NM_145866);FZD4(NM_012193);FZD5(NM_003468);FZD6(NM_003506);FZD7(NM_003507);FZD8(NM_031866);FZD9(NM_003508);FZD10(NM_007197)。

0076

フリズルド結合ドメインの非限定例として、Biolegendから入手できる抗体、例えば、ヒトフリズルド4(CD344)に特異的なクローンCH3A4A7;ヒトFz9(CD349)に特異的なクローンW3C4E11;Abcamから入手できる抗体、例えば、Fz7に特異的なab64636;ヒトFz4に特異的なab83042;ヒトFz7に特異的なab77379;ヒトFz8に特異的なab75235;ヒトFz9に特異的なab102956;などが挙げられる。適した抗体の他の例は、とりわけ、それぞれ特に本明細書に参照として援用される、米国特許出願公開第20140105917号;米国特許出願公開第20130230521号;米国特許出願公開第20080267955号;米国特許出願公開第20080038272号;米国特許出願公開第20030044409号;等に記載されている。

0077

代替物のフリズルド結合部分は、wntタンパク質のフリズルド結合領域に対する構造的相同性に関して選択された、操作されたタンパク質であってよい。斯かるタンパク質は、相同性について構造データベースをスクリーニングすることにより同定することができる。このようにして同定された初期タンパク質は、例えば、微生物Bh1478タンパク質である。次に、ネイティブタンパク質を、親和性を増加させるアミノ酸置換をもたらすように操作し、所望のフリズルドタンパク質への結合における親和性および選択性増加について親和性成熟によってさらに選択することができる。フリズルド結合部分の非限定例として、図1に例示されているFz27およびFz27−B12タンパク質が挙げられる。

0078

Lrp5/6結合ドメイン。Lrp5/6は、例えば、少なくとも約1×10−7M、少なくとも約1×10−8M、少なくとも約1×10−9M、少なくとも約1×10−10MのKDによりLrp5またはLrp6に高親和性で結合するいずれかのドメインから選択することができる。

0079

「LRP」、「LRPタンパク質」および「LRP受容体」は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質ファミリーのタンパク質を指すように本明細書において使用されている。これらの受容体は、受容体媒介性エンドサイトーシス過程においてリガンドに結合し内部移行させる1回膜貫通タンパク質である。LRPタンパク質LRP5(GenBank受託番号NM002335.2)およびLRP6(GenBank受託番号NM002336.2)は、Wnt受容体複合体に含まれる。

0080

適したLrp5/6結合ドメインは、de novo設計されたLrp5/6結合タンパク質、抗体由来の結合タンパク質、例えば、scFv、Fab等および1種または複数種のFzdタンパク質に特異的に結合する他の抗体部分;ナノボディ由来の結合ドメイン;ノッチンに基づく操作された足場;DKK1、DKK2、DKK3、DKK4、スクレロスチンを限定することなく含む天然起源のLrp5/6;Wise;上記のいずれかを含む融合タンパク質;上記のいずれかの誘導体;上記のいずれかのバリアント;ならびに上記のいずれかの生物学的活性断片、などを限定することなく含む。Lrp5/6結合ドメインは、結合を増強するように親和性選択することができる。

0081

Dickkopf(Dkk)遺伝子ファミリーのメンバー(Krupnikら(1999年)Gene 238巻(2号):301〜13頁を参照)は、Dkk−1、Dkk−2、Dkk−3およびDkk−4ならびにDkk−3関連タンパク質Soggy(Sgy)を含む。hDkk1〜4は、ファミリーメンバー間で10個のシステイン残基のポジションが高度に保存された、2個の別個のシステインリッチドメインを含有する。ヒトDkk遺伝子およびタンパク質の例示的な配列は公開されており、例えば、Genbank受託番号NM_014419(soggy−1);NM_014420(DKK4);AF177394(DKK−1);AF177395(DKK−2);NM_015881(DKK3);およびNM_014421(DKK2)である。本発明の一部の実施形態では、Lrp6結合部分は、ヒトDKK1のC末端ドメインを限定することなく含むDKK1ペプチドである。図5に示す通り、C末端ドメインは、配列



(Genbank受託番号NP_036374を参照)またはその生物学的活性断片を含むことができる。

0082

LRP5/6へのDKKタンパク質の結合は、例えば、それぞれ特に本明細書に参照として援用される、BrottおよびSokol、Mol. Cell.Biol.22巻(17号)6100〜6110頁(2002年);ならびにLiら、J. Biol. Chem.277巻(8号)5977〜5981頁(2002年)に記述されている。ヒトDKK2(Genbank参照NP_055236)の対応する領域は、配列



またはその生物学的活性断片を含むことができる。

0083

Lrp5またはLrp6に特異的に結合する抗体は、当技術分野で公知であり、市販されている、またはde novoで作製することができる。Lrp5、Lrp6またはそれらの断片を免疫原としてまたはスクリーニングアッセイにおいて使用して、抗体を開発することができる。公知抗体の例として、Gongら(2010年)PLoS One.5巻(9号):e12682頁;Ettenbergら(2010年)Proc Natl Acad Sci U S A.107巻(35号):15473〜8頁に記載されている抗体;ならびに市販されている抗体、例えば、ヒト起源の合成LRP5/6に対し作製され、マウスおよびヒト起源のLRP6およびLRP5の全長およびタンパク質分解性断片の両方に結合する、Santa Cruz biotechnologyの抗体クローン1A12;モノクローナル抗体2B11;LRP5(D80F2)に特異的なCell Signaling Technologyの抗体、カタログ番号5731;等が限定することなく挙げられる。

0084

バリアント。結合ドメインは、上記のポリペプチドの誘導体、バリアントおよび生物学的活性断片を含むこともできる。「バリアント」ポリペプチドは、提示されている配列と100%未満の配列同一性を有する、下に定義される生物学的活性ポリペプチドを意味する。斯かるバリアントは、提示されている配列と比較して、1個または複数個のアミノ酸修飾、例えば、挿入、欠失または置換を含むポリペプチドであって、ここで、例えば、1個または複数個のアミノ酸残基が、ネイティブ配列のN末端もしくはC末端またはネイティブ配列の中に付加される;約1〜40個のアミノ酸残基が欠失され、任意選択で1個または複数個のアミノ酸残基によって置換される、ポリペプチド;および、上記のポリペプチドの誘導体であって、アミノ酸残基が、得られる産物が非天然起源のアミノ酸を有するように、共有結合により修飾されている誘導体、を含む。通常、生物学的に活性なバリアントは、ネイティブ配列ポリペプチドと少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約95%、より好ましくは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

0085

配列の「機能的誘導体」は、初期の配列と共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。共通の生物学的活性を有する限り、「機能的誘導体」として、配列の断片および配列の誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントおよびその共有結合修飾の両方を包含する。

0086

対象組成物および方法における使用のためのWnt代替物は、タンパク質分解による分解に対するその抵抗性を改善するために、または溶解特性を最適化するために、またはこれを治療剤としてより適したものとするために、通常の分子生物学技法および合成化学を使用して修飾することができる。斯かるポリペプチドのアナログは、天然起源のL−アミノ酸以外の残基、例えば、D−アミノ酸または非天然起源の合成アミノ酸を含有するアナログを含む。D−アミノ酸を、アミノ酸残基の一部または全てに代えて置換することができる。

0087

wnt代替物は、当技術分野で公知の従来方法を使用して、in vitro合成により調製することができる。様々な市販の合成装置、例えば、Applied Biosystems,Inc.、Beckman等による自動合成機を利用することができる。合成機を使用することにより、天然起源のアミノ酸は、非天然アミノ酸により置換することができる。特定の配列および調製様式は、便利さ、経済性、要求される純度などによって決定される。必要に応じて、合成の際にまたは発現の際に様々な基をペプチドに導入することができ、これは、他の分子または表面への連結を可能にする。よって、システインは、チオエーテルを作製するために、ヒスチジンは、金属イオン錯体に連結するために、カルボキシル基は、アミドまたはエステルを生成するために、アミノ基は、アミドを生成するために使用することができるなどである。

0088

wnt代替物は、追加的なポリペプチド配列に融合または結合することができる。その例として、wnt代替物を免疫グロブリン配列、特にFc配列と組み合わせるイムノアドヘシン、および「タグポリペプチド」に融合されたネイティブ阻害因子ポリペプチドまたはその部分を含むエピトープタグ付けされたポリペプチドが挙げられる。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製することができるエピトープをもたらすのに十分な残基であるが、ネイティブ阻害因子ポリペプチドの生物学的活性に干渉しないように十分に短い残基を有する。適したタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6アミノ酸残基、通常、約6〜60の間のアミノ酸残基を有する。wnt代替物は、wnt活性を増強する作用物質、例えば、R−スポンジン1、R−スポンジン2、抗スクレロスチン抗体等と融合するまたは製剤において組み合わせるまたは共投与することもできる。

0089

リンカー。Fzd結合ドメインおよびLrp5/6結合ドメインは、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチド性リンカー等によって離間されていてよい。ドメインを接続するアミノ酸リンカーは、多ドメインタンパク質の構造および機能において重要な役割を果たすことができる。その触媒活性が、適切なリンカー組成を必要とするタンパク質の多数の例が存在する。一般に、ドメインを連結するリンカーの長さの変更は、タンパク質安定性、フォールディング率およびドメイン−ドメイン配向性に影響を与えることが示されてきた(GeorgeおよびHering(2003年)Prot. Eng.15巻:871〜879頁を参照)。wnt代替物におけるリンカー、したがって、結合ドメイン間のスペーシングの長さは、wnt代替物のシグナル強度のモジュレートに使用することができ、wnt代替物の所望の使用に応じて選択することができる。wnt代替物の結合ドメイン間の強制された距離は、変動し得るが、ある特定の実施形態では、約100オングストローム未満、約90オングストローム未満、約80オングストローム未満、約70オングストローム未満、約60オングストローム未満、約50オングストローム未満であってよい。

0090

一部の実施形態では、リンカーは、硬いリンカーであり、他の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。一部の実施形態では、リンカー部分は、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、2〜100アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99個、ただし100個以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、5〜75、5〜50、5〜25、5〜20、5〜15、5〜10または5〜9アミノ酸の間の長さである。例示的なリンカーは、Gly−Gly、Gly−Ala−Gly、Gly−Pro−Ala、Gly−Gly−Gly−Gly−Ser等、少なくとも2アミノ酸残基を有する直鎖状ペプチドを含む。適した直鎖状ペプチドは、ポリグリシンポリセリンポリプロリンポリアラニン、ならびにアラニルおよび/またはセリニル(serinyl)および/またはプロリニル(prolinyl)および/またはグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、



からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列



(配列中、nは、1、2、3、4、5等である)を含む;しかし、多くの斯かるリンカーが当技術分野で公知であり、使用されており、この目的に役立つことができる。

0091

Wnt代替物は、単鎖形態で提供することができ、このことは、結合ドメイン同士が、リンカーペプチドを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。他の実施形態では、これらの結合ドメインは、個々のペプチドであり、非ペプチド性リンカーを介して接続することができる。

0092

結合ドメインの連結における用途を見出す化学基は、当技術分野で公知の通り、カルバメート;アミド(アミン・プラス・カルボン酸);エステル(アルコール・プラス・カルボン酸)、チオエーテル(ハロアルカン・プラス・スルフヒドリルマレイミド・プラス・スルフヒドリル)、シッフ塩基(アミン・プラス・アルデヒド)、尿素(アミン・プラス・イソシアネート)、チオ尿素(アミン・プラス・イソチオシアネート)、スルホンアミド(アミン・プラス・スルホニルクロリド)、ジスルフィドヒドラゾン(hyrodrazone)、脂質などを含む。

0093

結合ドメイン間の連結は、スペーサー、例えば、アルキルスペーサーを含むことができ、これは、直鎖状であっても分岐状であってもよいが、通常は直鎖状であり、1個または複数個の不飽和結合を含むことができ;通常は、1〜約300個の炭素原子;より通常は、約1〜25個の炭素原子を有し;約3〜12個の炭素原子であってよい。この種のスペーサーは、アミン、エーテルホスホジエステルなどを含む、ヘテロ原子または官能基を含むこともできる。目的の特異的な構造は、(CH2CH2O)n(式中、nは、1〜約12である);(CH2CH2NH)n(式中、nは、1〜約12である);[(CH2)n(C=O)NH(CH2)m]z(式中、nおよびmは、1〜約6であり、zは、1〜約10である);[(CH2)nOPO3(CH2)m]z(式中、nおよびmは、1〜約6であり、zは、1〜約10である)を含む。斯かるリンカーは、直鎖状であっても分岐状であってもよいポリエチレングリコールを含むことができる。

0094

結合ドメインは、親水性頭部へと安定的な連結を形成することができる基を一末端に、標的部分へと安定的な連結を形成することができる基を反対の末端に有する、ホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーを介して接続することができる。例示的な実体は、アジドベンゾイルヒドラジド、N−[4−(p−アジドサリチルアミノ)ブチル]−3’−[2’−ピリジルジチオプロピオンアミド(propionamide))、ビススルホスクシンイミジルスベレートアジイミド酸ジメチルジスクシンイミジルタルトレート、N−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル4−アジドベンゾエート、N−スクシンイミジル[4−アジドフェニル]−1,3’−ジチオプロピオネート、N−スクシンイミジル[4−ヨードアセチルアミノベンゾエートグルタルアルデヒド、NHS−PEG−MAL;スクシンイミジル4−[N−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カルボキシレート;3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP);N,N’−(1,3−フェニレンビスマレイミド;N,N’−エチレン−ビス−(ヨードアセトアミド);または4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SMCC);m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)およびスクシンイミド4−(p−マレイミドフェニル)ブチレートSMPB)、MBSの伸長鎖アナログを含む。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。

0095

この目的に有用な他の試薬は、p,p’−ジフルオロ−m,m’−ジニトロジフェニルスルホン(アミノおよびフェノール基不可逆的架橋を形成する);アジプイミド酸ジメチル(アミノ基に特異的);フェノール−1,4−ジスルホニルクロリド(アミノ基と主に反応する);ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネートまたはアゾフェニル−p−ジイソシアネート(アミノ基と主に反応する);ビス(dis)ジアゾベンジジンチロシンおよびヒスチジンと主に反応する);O−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルウロニウム(tetramethuluronium)ヘキサフルオロホスフェートHATU)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(carbodiimde)、ブロモ−tris(ピロリジノホスホニウムブロミド(PyBroP);N,N−ジメチルアミノピリジンDMAP);4−ピロリジノピリジン;N−ヒドロキシベンゾトリアゾール;などを含む。ホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン(「BMH」)を含む。

0096

抗体:本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、特定の標的抗原への特異的結合の付与に十分なカノニカル免疫グロブリン配列エレメントを含むポリペプチドを指す。当技術分野で公知の通り、天然に産生されるインタクト抗体は、「Y字形」構造と一般的に称される構造になるよう互いに会合した、2本の同一重鎖ポリペプチド(それぞれ約50kD)および2本の同一軽鎖ポリペプチド(それぞれ約25kD)で構成された、およそ150kD四量体作用物質である。各重鎖は、少なくとも4個のドメイン(それぞれ約110アミノ酸長)である、アミノ末端可変(VH)ドメイン(Y構造の先端に位置)と、続く3個の定常ドメイン:CH1、CH2およびカルボキシ末端CH3(Yの幹部分の基部に位置)で構成される。「スイッチ」として公知の短い領域は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を連結する。「ヒンジ」は、抗体の残り部分へとCH2ドメインおよびCH3ドメインを連結する。このヒンジ領域における2個のジスルフィド結合は、インタクト抗体において2本の重鎖ポリペプチドを互いに連結する。各軽鎖は、別の「スイッチ」によって互いに離間された2個のドメインである、アミノ末端可変(VL)ドメインと、続くカルボキシ末端定常(CL)ドメインで構成される。インタクト抗体四量体は、単一のジスルフィド結合によって重鎖および軽鎖が互いに連結された、2個の重鎖−軽鎖二量体で構成される;2個の他のジスルフィド結合は、二量体が互いに連結され、四量体が形成されるように、重鎖ヒンジ領域を互いに連結する。天然に産生される抗体は、また、典型的にはCH2ドメインがグリコシル化されている。天然抗体における各ドメインは、圧縮逆平行ベータバレル(compressed antiparallel beta barrel)において互いに対して束ねられた2個のベータシート(例えば、3、4または5本鎖シート)から形成された「免疫グロブリンフォールド」によって特徴付けられた構造を有する。各可変ドメインは、「相補性(complement)決定領域」として公知の3個の超可変ループ(CDR1、CDR2およびCDR3)および4個の幾分インバリアントな「フレームワーク」領域(FR1、FR2、FR3およびFR4)を含有する。天然抗体がフォールドすると、FR領域は、ドメインに構造フレームワークをもたらすベータシートを形成し、重鎖および軽鎖の両方に由来するCDRループ領域は、Y構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を生じるように、三次元空間で集まる。

0097

天然起源の抗体のFc領域は、補体系のエレメントに、また、例えば、細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞を含むエフェクター細胞における受容体に結合する。当技術分野で公知の通り、Fc受容体に対するFc領域の親和性および/または他の結合特質は、グリコシル化または他の修飾によりモジュレートすることができる。一部の実施形態では、本発明に従って産生および/または利用される抗体は、グリコシル化等、修飾または操作されたFcドメインを含む、グリコシル化されたFcドメインを含む。

0098

天然抗体に見出される十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む、いずれかのポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、斯かるポリペプチドが、天然に産生される(例えば、抗原に反応する生物によって生成される)にしろ、組換え工学化学合成または他の人工の系もしくは方法論によって産生されるにしろ、「抗体」を指すことができるおよび/または抗体として使用することができる。一部の実施形態では、抗体配列エレメントは、当技術分野で公知の通り、ヒト化霊長類化(primatized)、キメラ等である。

0099

さらに、用語「抗体」は、本明細書において使用される場合、適切な実施形態では(それ以外のことが記述されているまたは文脈から明らかでなければ)、代用的な提示において抗体の構造および機能的特色を利用するための当技術分野で公知のまたは開発された構築物またはフォーマットのいずれかを指すことができる。例えば、ある実施形態では、本発明に従って利用される抗体は、インタクトIgGIgEおよびIgM二重特異性抗体または多特異性抗体(例えば、Zybodies(登録商標)等)、単鎖Fv、Fab、小モジュラー免疫医薬(Small Modular ImmunoPharmaceuticals)(「SMIPs(商標)」)、単鎖またはタンデムダイアボディ(diabody)(TandAb(登録商標))、VHH、Anticalins(登録商標)、Nanobodies(登録商標)、ミニボディ、BiTE(登録商標)、アンキリン反復タンパク質またはDARPINs(登録商標)、Avimers(登録商標)、DART、TCR様抗体、Adnectins(登録商標)、Affilins(登録商標)、Trans−bodies(登録商標)、Affibodies(登録商標)、TrimerX(登録商標)、MicroProteins、Fynomers(登録商標)、Centyrins(登録商標)およびKALBITOR(登録商標)から選択されるが、これらに限定されないフォーマットで存在する。一部の実施形態では、抗体は、天然に産生された場合に保有する筈の、共有結合修飾(例えば、グリカンの結合)を欠如することができる。一部の実施形態では、抗体は、共有結合修飾(例えば、グリカン、ペイロード[例えば、検出可能部分、治療部分、触媒部分等]または他のペンダント基[例えば、ポリエチレングリコール等]の結合)を含有することができる。

0100

多くの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、相補性決定領域(CDR)として当業者によって認識される1種または複数の構造エレメントを含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含む;一部の実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、参照抗体に見出されるものと実質的に同一である少なくとも1個のCDR(例えば、少なくとも1個の重鎖CDRおよび/または少なくとも1個の軽鎖CDR)を含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、含まれるCDRは、配列が同一である、または参照CDRと比較して1〜5アミノ酸の間の置換を含有するという点において、参照CDRと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるCDRは、参照CDRと少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%配列同一性を示すという点において、参照CDRと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるCDRは、参照CDRと少なくとも96%、96%、97%、98%、99%または100%配列同一性を示すという点において、参照CDRと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるCDRは、含まれるCDR内の少なくとも1個のアミノ酸が、参照CDRと比較して欠失、付加または置換されているが、含まれるCDRが、他の点では参照CDRアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照CDRと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるCDRは、含まれるCDR内の1〜5アミノ酸が、参照CDRと比較して欠失、付加または置換されているが、含まれるCDRが、他の点では参照CDRのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照CDRと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるCDRは、含まれるCDR内の少なくとも1個のアミノ酸が、参照CDRと比較して置換されているが、含まれるCDRが、他の点では参照CDRのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照CDRと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるCDRは、含まれるCDR内の1〜5アミノ酸が、参照CDRと比較して欠失、付加または置換されているが、含まれるCDRが、他の点では参照CDRのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照CDRと実質的に同一である。一部の実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、免疫グロブリン可変ドメインとして当業者によって認識される構造エレメントを含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分は相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。

0101

代替物のフリズルド結合部分は、wntタンパク質のフリズルド結合領域に対する構造的相同性に関して選択される操作されたタンパク質であってよい。斯かるタンパク質は、相同性に関して構造データベースをスクリーニングすることにより同定することができる。このように同定される初期のタンパク質は、例えば、微生物Bh1478タンパク質である。次に、ネイティブタンパク質は、親和性を増加させるアミノ酸置換をもたらすように操作され、所望のフリズルドタンパク質への結合における親和性および選択性の増加に関して、親和性成熟によってさらに選択することができる。フリズルド結合部分の非限定例として、図1に例示するFz27タンパク質およびFz27−B12タンパク質が挙げられる。

0102

例えば、限定することなく、本発明は、図1のポリペプチドまたはその親和性成熟されたバリアントを含む。

0103

親和性成熟されたwntペプチド代替物は、選択されるポジションが変異された、フリズルドに対する少なくとも約1×10−7M;少なくとも約1×10−8M;少なくとも約5×10−9Mまたはそれを超えるKDの増強されたアビディティーを有するペプチドを限定することなく含む。親和性成熟されたwntペプチド代替物の例として、B12バリアントならびに図3に描写するC3およびC49バリアントが限定することなく挙げられる。

0104

発現構築物:本方法において、wnt代替物は、ポリペプチドである場合、組換え方法によって産生することができる。アミノ酸配列バリアントは、DNAコード配列に適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。斯かるバリアントは、アミノ酸配列内のまたはその一端もしくは両端における残基の挿入、置換および/または指定の欠失を表す。最終構築物が、本明細書に定義される所望の生物学的活性を保持する限り、挿入、置換および/または指定の欠失のいずれかの組合せが為されて、最終構築物に到達する。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数もしくはポジションの変化、膜係留特徴の変更、および/またはポリペプチドのリーダー配列の挿入、欠失もしくは他の仕方で影響を与えることによる細胞位置の変更等、ポリペプチドの翻訳後過程を変更することもできる。

0105

wnt代替物をコードする核酸は、発現のために複製可能なベクターに挿入することができる。多くの斯かるベクターを利用することができる。ベクター構成成分として、次のうち1種または複数種が一般に挙げられるがこれらに限定されない:複製起点、1種または複数種のマーカー遺伝子エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列

0106

発現ベクターは、宿主生物によって認識され、wnt代替コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。プロモーターは、これが作動可能に連結された特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子開始コドンに対し上流(5’)に位置する(一般に、約100〜1000bp以内)非翻訳配列である。斯かるプロモーターは、典型的に、2種のクラス、誘導性および構成的に分けられる。誘導性プロモーターは、培養条件のある変化、例えば、栄養素の存在もしくは非存在または温度変化に応答したその制御下において、DNAからの増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。

0107

原核生物宿主による使用に適したプロモーターは、□−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼトリプトファン(trp)プロモーター系ならびにtacプロモーター等のハイブリッドプロモーターを含む。しかし、他の公知の細菌プロモーターも適している。斯かるヌクレオチド配列公表されているため、当業者であれば、これらをDNAコード配列に作動可能にライゲーションすることができる。細菌系における使用のためのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結されたシャインダルガーノ(S.D.)配列も含有する。

0108

プロモーター配列は、真核生物で公知である。酵母宿主による使用のための適した促進配列(promoting sequences)の例として、エノラーゼグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼヘキソキナーゼピルビン酸デカルボキシラーゼホスホフルクトキナーゼグルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼピルビン酸キナーゼトリオースリン酸イソメラーゼホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ等、3−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーターが挙げられる。成長条件によって制御される転写の追加的な利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロム(isocytochrome)C、酸ホスファターゼ窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、EP73,657にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターにより有利に使用される。

0109

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス鶏痘ウイルスアデノウイルス(アデノウイルス2等)、ウシパピローマウイルストリ肉腫ウイルスサイトメガロウイルスレトロウイルスB型肝炎ウイルス、最も好ましくはサルウイルス40(SV40)等、ウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターPGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)または免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御することができるが、ただし斯かるプロモーターは、宿主細胞系と適合性であることが求められる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点も含有するSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターは、HindIII E制限断片として簡便に得られる。

0110

高等真核生物による転写は、多くの場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加される。エンハンサーは、その転写を増加させるようにプロモーターにおいて作用する、通常約10〜300bpのDNAのシス作動性エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向性およびポジション非依存的であり、イントロン内で、また、コード配列それ自体の内で、転写単位に対して5’および3’で見出されている。哺乳動物遺伝子(グロビンエラスターゼアルブミン、□−フェトプロテインおよびインスリン)由来の多くのエンハンサー配列が現在公知である。しかし典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。その例として、複製起点の後側(late side)におけるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側におけるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列に対しポジション5’または3’において発現ベクターへとスプライスされてよいが、好ましくは、プロモーターから部位5’に位置する。

0111

真核生物宿主細胞(酵母、真菌昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞)において使用される発現ベクターは、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列を含有することもできる。斯かる配列は、真核生物DNAまたはウイルスDNAまたはcDNAの5’および場合により3’非翻訳領域から一般的に入手することができる。

0112

上に収載されている構成成分のうち1種または複数種を含有する適したベクターの構築は、標準技法を用いる。単離されたプラスミドまたはDNA断片は、要求されるプラスミドの作製に望まれる形態で切断し、調整し(tailored)、再度ライゲーションすることができる。構築されたプラスミドにおける正確な配列を確認するための解析のため、ライゲーション混合物が、宿主細胞の形質転換に使用され、成功した形質転換体が、適切な場合アンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗性によって選択される。形質転換体からプラスミドが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって解析される、および/または配列決定される。

0113

本明細書において使用される場合、ベクターにおけるDNAのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母または高等真核細胞である。この目的に適した原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Escherichia、例えば、E.coli、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、例えば、Salmonella typhimurium、Serratia、例えば、Serratia marcescansおよびShigella等のEnterobacteriaceae、ならびにB.subtilisおよびB.licheniformis等のBacilli、P.aeruginosa等のPseudomonasならびにStreptomyces等、真正細菌を含む。これらの例は、限定ではなく説明のためのものである。

0114

原核生物に加えて、糸状真菌または酵母等、真核生物微生物が、適した発現宿主である。Saccharomyces cerevisiaeまたは一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかし、Schizosaccharomyces pombe;K.lactis、K.fragilis等のような、Kluyveromyces宿主;Pichia pastoris;Candida;Neurospora crassa;Schwanniomyces occidentalis等、Schwanniomyces;ならびにPenicillium宿主、Tolypocladium宿主ならびにA.nidulanおよびA.niger等のAspergillus宿主等、糸状真菌等、多数の他の属、種および株が一般的に利用でき、本明細書において有用である。

0115

ワタトウモロコシジャガイモダイズペチュニアトマトおよびタバコ植物細胞培養物を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌Agrobacterium tumefaciensのある特定の株とのインキュベーションによりトランスフェクトされる。植物細胞培養物の斯かるインキュベーションの際に、DNAコード配列は、トランスフェクトされ、適切な条件下でDNAを発現するように、植物細胞宿主に移入される。加えて、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列等、植物細胞と適合性の調節配列およびシグナル配列を利用することができる。

0116

有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、マウスL細胞(L−M[TK−]、ATCC#CRL−2648)、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7、ATCC CRL 1651);ヒト胎児由来腎臓株(懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた293または293細胞;ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO);マウスセルトリ細胞(TM4);サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76、ATCC CRL−1 587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット(buffalo rat)肝臓細胞BRL3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳房腫瘍(MMT060562、ATCC CCL51);TRI細胞;MRC5細胞;FS4細胞;およびヒトヘパトーマ株(Hep G2)である。

0117

宿主細胞は、wnt代替物産生のために上記の発現ベクターをトランスフェクトされ、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択するまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地において培養される。哺乳動物宿主細胞は、種々の培地において培養することができる。Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、Sigma)、RPMI1640(Sigma)およびダルベッコ変法イーグル培地((DMEM)、Sigma)等、市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。これらの培地のいずれかに、ホルモンおよび/または他の増殖因子(インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子等)、塩(塩化ナトリウム塩化カルシウム塩化マグネシウムおよびリン酸塩等)、バッファー(HEPES等)、ヌクレオシドアデノシンおよびチミジン等)、抗生物質微量元素およびグルコースまたは等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。他のいずれかの必要なサプリメントが、当業者にとって公知の適切な濃度で含まれていてもよい。温度、pH等のような、培養条件は、発現に関して選択された宿主細胞により以前に使用された条件であり、当業者であれば明らかである。

0118

分子組成物。本発明のWnt代替物は、有機分子、好ましくは、50ダルトン超かつ約20,000ダルトン未満の分子量を有する小分子有機化合物も含む。有用な代替物は、例えば、目的のFzdタンパク質およびLrp5/6の一方または両方に対する高親和性結合に関して分子がアッセイされるスクリーニングアッセイによって同定される。分子は、別の結合部分に接続、またはポリペプチド作用物質のための上記の結合ドメインに接続される結合部分を提供することができる。

0119

候補代替物は、FzdまたはLrp5/6等のタンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み、典型的に、少なくともアミン基カルボニル基ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み、好ましくは、これらの官能化学基のうち少なくとも2種を含む。候補代替物は、多くの場合、上記の官能基のうち1種または複数種により置換された、環状(cyclical)炭素もしくは複素環式構造および/または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。候補作用物質は、ペプチド、糖類、脂肪酸ステロイドプリンピリミジン、これらの誘導体、構造アナログまたは組合せを含む生体分子の中にも見出される。

0120

候補代替物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および定方向合成(directed synthesis)のための多数の手段を利用することができる。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物植物抽出物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを利用することができるまたは容易に産生することができる。その上、天然または合成により産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーの生成に使用することができる。公知の薬理学的作用物質を、アシル化、アルキル化エステル化アミド化(amidification)等のような、定方向化学修飾またはランダム化学修飾に付して、構造アナログを産生することができる。被験作用物質は、例えば、天然物ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー等、ライブラリーから得ることができる。多数の異なる種類のコンビナトリアルライブラリーおよび斯かるライブラリーを調製するための方法は、例えば、そのそれぞれが参照として本明細書の援用される、PCT公開のWO93/06121、WO95/12608、WO95/35503、WO94/08051およびWO95/30642を含む文献に記載されている。

0121

スクリーニングアッセイが、結合アッセイである場合、分子のうち1種または複数種は、標識に接続することができ、標識は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的にもたらすことができる。様々な標識は、放射性同位元素蛍光物質(fluorescer)、化学発光物質(chemiluminescer)、酵素、特異的結合分子粒子、例えば、磁気粒子などを含む。特異的結合分子は、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシン等のペアを含む。特異的結合メンバーのため、相補的メンバーは通常、公知手順に従って検出を提供する分子で標識される。

0122

種々の他の試薬が、スクリーニングアッセイに含まれてよい。これらとして、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にするためおよび/または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低下させるために使用される、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤等のような試薬が挙げられる。プロテアーゼ阻害剤ヌクレアーゼ阻害剤抗菌剤等のような、アッセイの効率を改善する試薬を使用することができる。必要な結合をもたらす構成成分の混合物がいずれかの順序で添加される。いずれか適した温度で、典型的には4〜40℃の間で、インキュベーションが行われる。インキュベーション期間は、最適な活性を得るように選択されるが、迅速ハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化することもできる。典型的には、0.1〜1時間の間で十分である。

0123

FzdまたはLrp5/6ポリペプチドに結合することができる化合物をスクリーニングすることにより、予備的スクリーニングを行うことができる。結合アッセイは通常、1種または複数種の被験化合物とFzdまたはLrp5/6ポリペプチドを接触させ、十分な時間、タンパク質および被験化合物に結合複合体を形成させることを伴う。形成されたいずれかの結合複合体は、多数の確立された分析技法のいずれかを使用して検出することができる。タンパク質結合アッセイとして、共沈殿非変性SDS−ポリアクリルアミドゲルにおける共移動を、また、ウエスタンブロットにおける共移動を測定する方法が挙げられるがこれらに限定されない(例えば、Bennet, J. P.およびYamamura, H. I.(1985年)「Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods」、Neurotransmitter Receptor Binding(Yamamura, H. I.ら、編)中の61〜89頁を参照)。

0124

ある特定のスクリーニング方法は、wntシグナリング活性をモジュレートする化合物のスクリーニングに関与する。斯かる方法は、細胞に基づくアッセイの実行に関与することができ、このようなアッセイにおいて、被験化合物を、Fzdを発現する1種または複数種の細胞と接触させ、続いてwnt応答性遺伝子の発現の増加を検出すること、およびb−カテニンの核局在化を検出すること等が行われる。

0125

発現または活性のレベルは、ベースライン値と比較することができる。上に示す通り、ベースライン値は、対照試料の値または対照集団発現レベルの代表である統計的な値とすることができる。発現レベルは、陰性対照として、wnt受容体を発現しない細胞に対して決定することもできる。斯かる細胞は一般に、その他の点では実質的に遺伝的に被験細胞と同じである。レポーター構築物を欠く細胞を用いるか、またはレポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させないことによる平行した反応を実施することを含む、様々な対照を実施して、観察される活性が信頼すべきものであることを確実にすることができる。以下に記載する通り、化合物をさらに検証することもできる。

0126

前述のスクリーニング方法のいずれかにより初期に同定された化合物をさらに検査して、見かけ上の活性を検証することができる。斯かる方法の基本フォーマットは、ヒトのためのモデルとして役立つ、動物へのまたは細胞培養モデルにおける、初期スクリーニングにおいて同定されたリード化合物の投与に関与する。検証研究において利用される動物モデルは一般に、哺乳動物である。適した動物の具体例として、霊長類、マウスおよびラットが挙げられるがこれらに限定されない。

0127

本明細書に記載されているスクリーニング方法によって同定された活性被験作用物質は、アナログ化合物の合成のためのリード化合物として役立つことができる。典型的には、アナログ化合物は、リード化合物の電子配置および分子高次構造と同様の電子配置および分子高次構造を有するように合成される。アナログ化合物の同定は、自己無撞着場(self−consistent field)(SCF)解析、配置間相互作用CI)解析およびノーマルモード動力学解析(normal mode dynamics analysis)等の技法の使用により行うことができる。これらの技法を実行するためのコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Reinら(1989年)Computer−Assisted Modeling of Receptor−Ligand Interactions(Alan Liss、New York)を参照されたい。
医薬組成物

0128

治療適用のため、wnt代替物は、ボーラスとしてまたはある期間にわたる持続注入によりヒトに静脈内投与することができる剤形を含む生理学的に許容される剤形で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。代用投与経路は、局所的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内(intracerobrospinal)、皮下、関節内、滑膜内(intrasynovial)、髄腔内、経口、局所的または吸入経路を含む。wnt代替物はまた、局所治療効果ならびに全身治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周囲病巣内または病変周囲経路によってまたはリンパに適宜投与される。

0129

医薬組成物は、幹細胞、前駆体細胞などを含む細胞と本発明の分子との組合せを含むこともできる。一部の実施形態では、組成物は、再生体細胞性幹細胞、例えば、上皮幹細胞神経幹細胞肝臓幹細胞造血幹細胞、骨芽細胞、筋肉幹細胞間葉系幹細胞膵臓幹細胞等と組み合わせた、本発明の分子を含む。斯かる組合せにおいて、細胞は、使用に先立ち本発明の分子で前処理することができる、例えば、wnt代替物で細胞をex vivo処理することができる;細胞は、別々のまたは組み合わせた製剤において、本発明の分子と同時に投与することができる;細胞は、本発明の分子による処理に先立ち個体に与えることができるなどである。

0130

用語「幹細胞」は、本明細書において使用される場合、自己再生の特性を有し、複数の細胞型へと分化する発生能を有する細胞を指す。幹細胞は、増殖し、その発生能を維持しつつ、より多くの斯かる幹細胞を生じることができる。幹細胞は、非対称的に分裂することができ、一方の娘細胞が、親幹細胞の発生能を保持しながら、他方の娘細胞は、親細胞とは別個の他のある特異的な機能、表現型および/または発生能を発現することができる。娘細胞それ自体は、増殖し、親の発生能を有する1個または複数個の細胞の保持も行いつつ、1種または複数の成熟細胞型へとその後に分化する後代を産生するように誘導され得る。分化した細胞は、それ自体は複能性細胞に由来する複能性細胞に由来し得る等である。これらの複能性細胞のそれぞれを幹細胞と考慮することができるが、斯かる幹細胞のそれぞれが生じることができる細胞型の範囲、すなわち、その発生能は、相当に変動し得る。あるいは、集団における幹細胞のいくつかは、確率的分化として公知の、2個の幹細胞へと対称的に分裂し、これにより、集団における一部の幹細胞を全体として維持することができるが、集団における他の細胞は、分化した後代のみを生じる。したがって、用語「幹細胞」は、特定の状況下で、より特殊化または分化した表現型へと分化する発生能を有し、ある状況下で、実質的に分化することなく増殖する能力を保持するいずれかの細胞サブセットを指す。

0131

用語「体細胞性幹細胞」は、胎児組織、若年組織および成体組織を含む非胚性組織に由来するいずれかの多能性または複能性幹細胞を指すように本明細書で使用されている。天然の体細胞性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓骨格筋および心筋を含む多種多様な成体組織から単離されている。用語「前駆体細胞」は、これが分化によって生じることができる細胞と比べて、発生の経路または進行に沿ってより初期のステージにある細胞を指すように本明細書で使用されている。多くの場合、前駆体細胞は、有意なまたは非常に高い増殖能を有する。前駆体細胞は、発生経路ならびに細胞が発生および分化する環境に応じて、複数の別個の分化した細胞型、または単一の分化した細胞型を生じることができる。

0132

医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与のための医薬組成物の製剤化に一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される無毒性希釈液キャリアを含むことができる。希釈液は、この組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。斯かる希釈液の例は、蒸留水緩衝水、生理食塩水PBSリンゲル溶液デキストロース溶液およびハンクス溶液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他のキャリア、アジュバントまたは無毒性、非治療的、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含むことができる。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤ならびに界面活性剤等、生理的条件に近づけるための追加的な物質を含むこともできる。

0133

組成物は、例えば抗酸化剤等、種々の安定化剤のいずれかを含むこともできる。医薬組成物が、ポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのin vivo安定性を増強する、またはその薬理学的特性を他の仕方で増強する(例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低下させる、溶解性または取込みを増強する)様々な周知化合物と複合体形成することができる。斯かる修飾剤または複合体形成剤(complexing agent)の例として、サルフェートグルコネート、シトレートおよびホスフェートが挙げられる。組成物のポリペプチドは、そのin vivo特質を増強する分子と複合体形成することもできる。斯かる分子は、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン(例えば、ナトリウムカリウム、カルシウム、マグネシウムマンガン)および脂質を含む。

0134

様々な種類の投与に適した製剤に関するさらに別のガイダンスは、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mace Publishing Company、Philadelphia, Pa.、第17版(1985年)に見出すことができる。薬物送達のための方法に関する短い総説については、Langer、Science 249巻:1527〜1533頁(1990年)を参照されたい。

0135

医薬組成物は、予防的および/または治療的処置のために投与することができる。活性成分の毒性および治療有効性は、例えば、LD50(集団の50%に対して致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療上有効な用量)の決定を含む、細胞培養および/または実験動物における標準の薬学的手順に従って決定することができる。毒性作用および治療効果の間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好まれる。

0136

細胞培養および/または動物研究から得られるデータは、ヒトのためのある範囲の投薬量の製剤化において使用することができる。活性成分の投薬量は、典型的には、低い毒性を有するED50を含む循環濃度の範囲内を網羅する。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。

0137

経口投与のため、活性成分は、カプセル錠剤および粉末等、固体剤形で、またはエリキシル剤シロップおよび懸濁液等、液体剤形で投与することができる。活性構成成分(複数可)は、グルコース、ラクトース、スクロースマンニトールデンプンセルロースまたはセルロース誘導体ステアリン酸マグネシウムステアリン酸サッカリンナトリウム(sodium saccharin)、タルカム炭酸マグネシウム等、不活性成分および粉末化キャリアと共に、ゼラチンカプセル内に被包することができる。望ましい色、味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の望ましい特色をもたらすために添加することができる追加的な不活性成分の例は、赤色酸化鉄(red iron oxide)、シリカゲルラウリル硫酸ナトリウム二酸化チタンおよび食用ホワイトインク(white ink)である。同様の希釈剤を使用して、圧縮錠剤を作製することができる。錠剤およびカプセルは両者共に、数時間の期間にわたる薬物の持続性放出をもたらす徐放生成物として製造することができる。圧縮錠剤は、不快な味をマスクし、大気から錠剤を保護するために糖衣もしくはフィルムコーティングすることができる、または胃腸管における選択的崩壊のために腸溶コーティングすることができる。経口投与のための液体剤形は、患者許容性を増加させるための着色剤および香味料を含有することができる。

0138

活性成分は、単独で、または他の適した構成成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアゾール製剤へと作製することができる(すなわち、「霧状にする(nebulized)」ことができる)。エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタンプロパン窒素等、加圧された許容される噴霧剤の中に置くことができる。

0139

例えば、関節内(関節の中に)、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路による等の非経口的投与に適した製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性、等張性無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤可溶化剤増粘剤、安定剤および保存料を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液を含む。

0140

医薬組成物の製剤化に使用される構成成分は、好ましくは、高純度のものであり、潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない(例えば、少なくとも米国食品(National Food)(NF)等級、一般には、少なくとも分析グレード、より典型的には、少なくとも医薬品グレード)。さらに、in vivo使用に意図される組成物は、通常無菌である。使用前に所定の化合物が合成される必要がある程度まで、得られる産物は、典型的には、合成または精製過程において存在し得るいずれか潜在的に毒性の作用物質、特に、いずれかのエンドトキシンを実質的に含まない。非経口的(parental)投与のための組成物も、無菌で実質的に等張性であり、GMP条件下で作製される。

0141

特定の患者に与えるべき治療組成物の有効量は、種々の因子に依存し、そのうちいくつかは、患者間で異なる。製剤は、例えば、単位用量で提供することができる。有能臨床医であれば、患者に投与するべき治療剤の有効量を決定することができる。代替物の投薬量は、処置、投与の経路、治療薬性質、治療薬に対する疾患の感受性等に依存する。LD50動物データおよび利用できる他の情報を利用して、臨床医は、投与の経路に応じて、個体の最大安全用量を決定することができる。身体から急速に排除される組成物は、治療濃度を維持するために、より高用量で、または反復した用量で投与することができる。通常の技能を利用して、有能な臨床医であれば、常習的な臨床治験の経過において、特定の治療またはイメージング組成物の投薬量を最適化することができる。典型的には、投薬量は、被験体の体重1キログラム当たり0.001〜100ミリグラム薬剤となる。

0142

組成物は、一連の2回以上の投与において被験体に投与することができる。治療組成物のため、規則的な定期投与(例えば、2〜3日毎)が、毒性を低下するために要求される場合がある、または望ましい場合がある。反復した用量レジメンにおいて利用される治療組成物のため、免疫応答を引き起こさない部分が好ましい。

0143

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載されている状態の処置に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルを含む。適した容器は、例えば、ボトルバイアルシリンジおよび試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等、種々の材料で形成されていてよい。容器は、状態の処置に有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる(例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な(pierceable)ストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルとすることができる)。組成物中の活性薬剤は、wnt代替物である。容器に貼ったまたは添えたラベルは、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液等、薬学的に許容されるバッファーを保持することができる、さらに別の容器(複数可)を製造品に提供することができる。製造品は、他のバッファー、希釈液、フィルター、針、シリンジおよび使用説明が記された添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。

0144

本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」は、治療投薬レジメンに従って疾患、障害および/または状態を患うまたはこれになりやすい集団に投与されたときに、この疾患、障害および/または状態の処置に十分な量を意味する。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患、障害および/または状態の発生率および/または重症度を低下させる、その1種もしくは複数の特徴を安定化させる、および/またはその1種もしくは複数種の症状の発症を遅延させる量である。当業者であれば、用語「治療有効量」が、実際には、特定の個体における処置成功の達成を要求しないことを認められよう。むしろ、治療有効量は、斯かる処置を必要とする患者に投与されたときに、有意な数の被験体において特定の所望の薬理学的応答をもたらす量とすることができる。

0145

例えば、一部の実施形態では、用語「治療有効量」は、発明に関する治療法の文脈において、それを必要とする個体に投与されたときに、前記個体において生じている疾患過程を遮断、安定化、減弱または反転する量を指す。
使用方法

0146

wnt代替物は、予防および治療目的の両方に有用である。よって、本明細書において使用される場合、用語「処置する」は、疾患の防止および既存の状態の処置の両方を指すように使用される。ある特定の事例において、防止は、疾患または状態の発症リスクがあると同定された患者における疾患または状態の発症の阻害または遅延を示す。患者の臨床症状を安定化または改善するための、進行中の疾患の処置は、本発明によって提供される特に重要な利益である。斯かる処置は、罹患組織において機能が喪失するより前に行われるのが望ましい;結果的に、本発明によって提供される予防的治療利益も重要である。治療効果の証拠は、疾患の重症度におけるいずれかの縮小であり得る。治療効果は、臨床成績の観点から測定することができる、または免疫学的もしくは生化学的検査によって決定することができる。処置のための患者は、哺乳動物、例えば、ヒトを含む霊長類であってよく、実験動物、例えば、ウサギ、ラット、マウス等、特に、治療法の評価のためには、ウマ、イヌ、ネコ、農場動物等であってよい。

0147

治療製剤、例えば、医薬組成物の投薬量は、状態の性質、投与の頻度、投与の様式、宿主からの薬剤のクリアランスなどに応じて広範に変動する。特定の実施形態では、初期用量が大きく、続いてより少量の維持用量とすることができる。ある特定の実施形態では、用量は、毎週または隔週ほどの低頻度で投与することができる、またはより頻繁には、より少ない用量へと分割され、毎日、週2回(semi−weekly)もしくは有効な投薬量レベルの維持に必要とされるなどの頻度で投与され得る。

0148

本発明の一部の実施形態では、wnt代替物を含む組成物または製剤の投与は、局所投与(local administration)によって行われる。局所投与は、本明細書において使用される場合、局所的な投与(topical administration)を指すことができるが、身体の処置部位への注射または他の導入も指す。斯かる投与の例として、筋肉内注射皮下注射腹腔内注射などが挙げられる。他の実施形態では、wnt代替物を含む組成物または製剤は、全身性、例えば、経口または静脈内投与される。一実施形態では、wnt代替物を含む組成物または製剤(composition of formulation)は、ある期間、例えば、10分間、20分間、3分間、1時間、2時間、3時間、4時間またはそれを超える期間にわたる注入、例えば、持続注入によって投与される。

0149

本発明の一部の実施形態では、組成物または製剤は、活性の急速で有意な増加を得るために、短期ベースで、例えば、単一の投与、または例えば1、2、3日間もしくはそれ超、最大1もしくは2週間にわたって行われる一連の投与によって投与される。投与される用量のサイズは、医師によって決定される必要があり、疾患の性質および重大さ、患者の年齢および健康状態、ならびに薬物それ自体に対する患者の耐容能等、多数の因子に依存する。

0150

本発明のある特定の方法において、wnt代替物を含む組成物の有効量は、例えば、所望の効果の達成のために、例えば、Wntシグナリング、増殖等の増強のために有効な量の該組成物と細胞とを接触させることにより、細胞に与えられる。特定の実施形態では、接触は、in vitro、ex vivoまたはin vivoで行われる。特定の実施形態では、細胞は、Wntシグナリングの増加を必要とする(in need or)被験体に由来するまたは被験体内に存在する。

0151

本発明の一部の方法において、有効量の対象組成物は、細胞におけるWntシグナリングを増強するために与えられる。生化学的な見地によると、Wnt代替物の有効量または有効用量は、細胞におけるWntシグナリングを、wnt代替物の非存在下でのシグナリングと比べて少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%増加させる量である。細胞の活性のモジュレーションの量は、wnt生物学の技術分野の当業者に公知の多数の仕方で決定することができる。

0152

臨床的な意味においては、wnt代替組成物の有効用量は、適した期間、例えば、少なくとも約1週間、おそらく約2週間またはそれ超、最大約4週間、8週間またはそれより長い期間被験体に投与されたときに、wntシグナリングの欠如に関連する症状の変更を証明する用量である。一部の実施形態では、有効用量は、疾患状態の進行を遅くするまたは停止することができるのみならず、状態の反転を誘導することもできる。当業者であれば、初期用量を斯かる期間投与し、続いて場合によっては低下した投薬量となる維持用量を投与することができることが理解される。

0153

投与するべきwnt代替組成物の有効量または有効用量の計算は、当業者の技能範囲内であり、当業者にとって常習的なものである。言うまでもなく、投与するべき最終量は、投与の経路および処置するべき障害または状態の性質に依存する。

0154

対象方法における使用に適した細胞は、1種または複数種のFzd受容体を含む細胞である。接触させるべき細胞は、in vitro、すなわち、培養されていてよい、またはin vivo、すなわち、被験体中に存在していてよい。細胞は、いかなる生物に由来する/存在することもできるが、好ましくは、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、蠕虫等のような、ヒト、家庭動物および農場動物ならびに動物園、実験動物またはペット動物を含む哺乳動物に由来する。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。細胞は、いかなる組織に由来することもできる。細胞は、凍結していても、新鮮であってもよい。細胞は、初代細胞であっても、細胞株であってもよい。多くの場合、細胞は、in vivoで使用される、またはレシピエントへの導入に先立ちex vivoで処理される初代細胞である。

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