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技術 植物脂質から工業製品を製造する工程

出願人 コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガナイゼーション
発明者 トーマス・ヴァンハーケジェームズ・ロバートソン・ペトリーアンナ・エル・ターチースリンダー・パル・シンカイル・レイノルズキン・リウベンジャミン・アルド・レイタ
出願日 2015年7月7日 (5年4ヶ月経過) 出願番号 2017-500957
公開日 2017年10月5日 (3年1ヶ月経過) 公開番号 2017-529060
状態 未査定
技術分野 飼料(2)(一般) 脂肪類、香料 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 植物の育種及び培養による繁殖 微生物、その培養処理
主要キーワード 内側エンベロープ 超音波振動処理 切断モジュール 段階期間 マイクロスクリーン エネルギー濃度 補正面積 短鎖分子
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (18)

課題・解決手段

本発明は、植物脂質、特に植物の生育部分から工業製品を製造する方法に関する。特に、本発明は、バイオディーゼル及び合成ディーゼルなどの油製品、ならびにこれらを製造する工程に加え、トリアシルグリセロール等の1つ以上の非極性脂質ベルの増加した植物、及び非極性脂質の総含有量の増加した植物を提供する。特定の一実施形態では、本発明は、植物またはその任意の部分において、1つ以上の非極性脂質のレベル及び/または非極性脂質の総含有量及び/または一価不飽和脂肪酸含有量を増加させる、2つ以上の脂質処理酵素油体タンパク質、低脂質分解酵素及び/または脂質生合成を調節する転写因子改変の組み合わせに関する。一実施形態では、本発明は脂質の抽出工程に関する。別の実施形態では、採取された植物生育部分において、脂質を1つ以上の炭化水素生成物へと転換し、再生可能バイオディーゼル燃料としての用途に適した脂肪酸アルキルエステルを製造する。

概要

背景

世界のエネルギー、特に輸送に関するエネルギーの大部分は、有限石油から得られる燃料により供給されている。例えば、生物から生成される油等の、再生可能代替原料が必要とされている。

トリアシルグリセロール生合成
トリアシルグリセロール類(TAG)は、種子中の脂質の主形態を構成し、エステル化されグリセロール主鎖となる3つのアシル鎖から構成される。脂肪酸は、アシル−アシル担体タンパク質(ACP)中間体として、最初の不飽和化触媒を受け得る色素体中で合成される。この反応は、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ不飽和化酵素)により触媒され、オレイン酸(C18:1Δ9)を生成する。次いで、アシル鎖は、アシル−コエンザイムCoAチオエステルとして細胞質ゾル及び小胞体ER)へと移送される。主要なTAG生合成経路(ケネディ経路またはグリセロールリン酸(G3P)経路としても知られる)に入る前に、アシル鎖は、通常、ER膜のリン脂質へと組み込まれ、更なる不飽和化を受けることができる。多価不飽和脂肪酸の産生における2つの重要な酵素は、膜結合FAD2及びFAD3デサチュラーゼであり、それらは、それぞれ、リノール酸(C18:2Δ9、12)及びαリノレン酸(C18:3Δ9、12、15)を産生する。

ケネディ経路を介したTAG生合成は、引き続く一連アシル化(各々、アシル供与体として、アシル−CoAエステルを用いる)から構成される。最初のアシル化ステップは通常、G3P主鎖のsn1−位で発生し、グリセロール3リン酸アシルトランスフェラーゼ(sn1−GPAT)により触媒される。産物である、sn1−リゾホスファチジン酸(sn1−LPA)は、第2のアシル鎖をsn2−位で連結させ、ホスファチジン酸を形成するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)の基質として機能する。PAは更に、ホスファチジン酸ホスファターゼPAP)によりジアシルグリセロール(DAG)へと脱リン酸化され、それによって、最終アシル化ステップの基質がもたらされる。最後に、第3のアシル鎖が、ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ(DGAT)により触媒される反応においてDAGのsn3−位でエステル化され、油体蓄積されるTAGを形成する。第2の酵素反応である、ホスファチジルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ(PDAT)によっても、DAGからTAGへの転換がもたらされる。この反応は、DGATとは関連がなく、アシル供与体として、リン脂質を使用する。

脂質の商用製造量最大化するために、トランスジェニック生物またはそれらの一部(例えば、植物、種子、葉、藻類及び菌類)において、脂質、特に、例えばDAG及びTAG等の非極性脂質のレベルを増加させる手段が更に求められている。植物での中性脂質収率を上げる試みは、主に、脂肪酸生合成またはTAGアセンブリに関連する個々の重要な酵素ステップに焦点が置かれてきた。しかしこれらの戦略は、種子の油体または葉の油体において、ほどほどの増加をもたらしたのみであった。油性酵母Yarrowia lipolyticaに関する近年の代謝工学研究により、グリセロール3リン酸産生の増加と、β酸化を介したTAG分解の阻害を組み合わせたアプローチにより、脂質の総含有量の累積的増加がもたらされたことが示された(Dulermo et al.,2011)。

種子油のトリアシルグリセロール(TAG)等の植物油は、例えば料理用途(ショートニングテクスチャフレーバー)、工業用途石鹸蝋燭香料化粧品、適切な乾燥剤絶縁体潤滑剤)等の多くの用途があり、そして栄養的な価値がある。また、植物油を使用したバイオ燃料の製造に注目が集まっている。

脂質の生物からの商用製造を最大化するために、トランスジェニック生物またはその一部(例えば、植物、種子、葉、藻及び菌類等)において、脂質、特に非極性脂質(例えば、DAG及びTAG等)のレベルを増加させるための更なる手段が必要とされている。

概要

本発明は、植物脂質、特に植物の生育部分から工業製品を製造する方法に関する。特に、本発明は、バイオディーゼル及び合成ディーゼルなどの油製品、ならびにこれらを製造する工程に加え、トリアシルグリセロール等の1つ以上の非極性脂質レベルの増加した植物、及び非極性脂質の総含有量の増加した植物を提供する。特定の一実施形態では、本発明は、植物またはその任意の部分において、1つ以上の非極性脂質のレベル及び/または非極性脂質の総含有量及び/または一価不飽和脂肪酸含有量を増加させる、2つ以上の脂質処理酵素、油体タンパク質、低脂質分解酵素及び/または脂質生合成を調節する転写因子改変の組み合わせに関する。一実施形態では、本発明は脂質の抽出工程に関する。別の実施形態では、採取された植物生育部分において、脂質を1つ以上の炭化水素生成物へと転換し、再生可能バイオディーゼル燃料としての用途に適した脂肪酸のアルキルエステルを製造する。

目的

本発明は、バイオディーゼル及び合成ディーゼルなどの油製品、ならびにこれらを製造する工程に加え、トリアシルグリセロールなどの1つ以上の非極性脂質レベルが増加した植物、及び非極性脂質の総含有量が増加した植物を提供する

効果

実績

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請求項1

油製品の製造工程であって、該工程が、(i)反応器内で、(a)乾重量が少なくとも2gであり、非極性脂質の総含有量を乾重量基準で少なくとも5重量%有する生育植物部分と、(b)水、アルコールまたは両方を含む溶媒と、(c)場合により触媒と、を含む組成物を処理するステップであって、該処理は、酸化還元または不活性環境にて組成物を温度約50℃〜約450℃、圧力5〜350barで1〜120分間加熱することを含むステップと、(ii)生育植物部分の乾重量に対して、少なくとも35重量%の収率で反応器から油製品を回収すること、それによって油製品を製造するステップと、を含む、前記工程。

請求項2

以下の1つ以上またはそのすべてを特徴とする、請求項1に記載の工程:(i)前記生育植物部分が、少なくとも1kgの乾重量を有する、(ii)前記生育植物部分が、乾重量基準で少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、約25%、約30%、約35%、または30%〜75%の非極性脂質の総含有量を有する、(iii)前記組成物が、5%〜90%の固体濃度を有する、(iv)前記触媒が、NaOHまたはKOHまたは両方を、好ましくは0.1M〜2Mの濃度で含む、(v)前記処理時間が、1〜60分、好ましくは10〜60分、より好ましくは15〜30分間である、(vi)前記溶媒が水である場合、前記工程により、前記生育植物部分の乾重量に対して、最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%または40重量%から、最大55%または60重量%までの収率の前記油製品が製造される、(vii)前記溶媒がアルコールを含む場合、前記工程により、前記生育植物部分の乾重量に対して、最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%または40重量%から、最大65%または70重量%までの収率の前記油製品が製造される、(viii)前記溶媒が約80%の水を含む場合、前記油製品は約30%のC13〜C22炭化水素化合物を含む、(ix)前記溶媒が約50%のメタノールを含む場合、前記油製品は約50%の脂肪酸メチルエステルFAME)を含む、(x)前記回収した油製品が、約15重量%未満の含水量を有する、(xi)油製品の前記収率が、非極性脂質の含有量が乾重量基準で2%未満である、相当する生育植物部分を用いた相当する工程と比較して、少なくとも2重量%多い、(xii)工程(i)(a)において、前記生育植物部分が、乾燥、切断、破砕粉砕、回転、加圧圧縮または摩砕のうち1つ以上によって物理的に処理された。

請求項3

以下の1つ以上を更に含む、請求項1または請求項2に記載の工程:(i)前記回収した油製品の水素化脱酸素、(ii)前記回収した油製品の水素処理により、前記油製品のケトンまたは糖のレベルを低減すること、(iii)前記回収した油製品からの合成ガスの製造、及び(iv)前記回収した油製品を分画し、1種以上の燃料油ディーゼル油灯油またはガソリンを製造すること。

請求項4

前記生育植物部分が、植物の葉、または両方を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の工程。

請求項5

組み換え真核細胞であって、a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、b)1つ以上の非極性脂質の生合成関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、ならびにc)遺伝子改変欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性下方調節する第1の遺伝子改変、d)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及びe)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第2の転写因子ポリペプチドをコードする、第4の外因性ポリヌクレオチドのうち、1つまたは2つまたは3つすべてを含み、ここでの各外因性ポリヌクレオチドが、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーター作動可能に連結される、前記組み換え真核細胞。

請求項6

以下の1つ以上またはそのすべてを更に含む、請求項5に記載の細胞a)油体被覆(OBC)ポリペプチドをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、b)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、ならびにc)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

請求項7

前記細胞が、植物の生育部分由来の、またはその内部の植物細胞であり、該生育部分では、該植物の種子と比較して、プロモーターの1つ以上またはそのすべてを高レベルで発現する、請求項5または請求項6に記載の細胞。

請求項8

以下の特徴の1つ以上またはすべてが該当する、請求項5〜7のいずれか1項に記載の細胞;i)前記細胞が、第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸の合成が増加しているか、または第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸の異化が減少しているか、またはその両方であり、それによって第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸のレベルが増加している、ii)前記細胞が、第1の外因性ポリヌクレオチドを有し、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、TAG、DAGまたはMAG、好ましくはTAGの合成を触媒する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼの発現及び/または活性が増加している、iii)前記細胞が、第1の外因性ポリヌクレオチドを有し、細胞内の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、色素体中のアシル−ACP及びG3Pからのリゾホスファチジン酸LPA)の産生が減少している、iv)前記細胞が、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸含有量及び/またはガラクト脂質の含有量のうち、C18:3脂肪酸に対するC16:3の比率が変化している、好ましくは比率が減少している、v)前記細胞が、植物の生育部分にあり、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含む、vi)前記細胞が、植物の生育部分にあり、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)のTAG含有量を含む、vii)前記転写因子ポリペプチドが、Wrinkled1(WRI1)、LeafyCotyledon1(LEC1)、LEC1様、LeafyCotyledon2(LEC2)、BABYBOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4及びDof11からなる群から選択される、viii)オレイン酸が、前記細胞中、総脂肪酸含有量の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)または少なくとも60%(mol%)、好ましくは約65%(mol%)または20%〜約65%を占める、ix)前記細胞内の非極性脂質に含まれる脂肪酸が、水酸基エポキシ基シクロプロパン基、炭素炭素二重結合、炭素−炭素三重結合共役二重結合分枝鎖(例えばメチル化若しくはヒドロキシル化された分枝鎖、またはそれらの2つ以上の組み合わせ)、または上述の基、結合若しくは分枝鎖のうち任意の2つ、3つ、4つ、5つまたは6つを含む、x)前記細胞の非極性脂質が、エイコサジエン酸(EDA)、アラキドン酸(ARA)、ステアリドン酸(SDA)、エイコサトリエン酸(ETE)、エイコサテトラエン酸(ETA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサペンタエン酸DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)またはそれらの2つ以上の組み合わせから選択される1種以上の多価不飽和脂肪酸を含む、xi)前記細胞が、植物またはその一部、好ましくは生育植物部分にあり、または前記細胞が、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類または不等毛藻類等の藻細胞であり、または前記細胞が、真菌等の発酵に適した微生物であるか、またはそれらに由来する、xii)1つ以上またはすべての前記プロモーターが、組織特異的プロモーター(例えば葉及び/または茎に特異的なプロモーター)、老化特異的プロモーター等の発生的調節プロモーター(例えば、SAG12プロモーター)、誘導性プロモーター、または概日リズム調節プロモーターから選択される、xiii)前記細胞が、中鎖脂肪酸、好ましくはC12:0、C14:0または両方を総脂肪酸含有量のうち少なくとも5%のレベルで含む、総脂肪酸含有量を含み、更に場合により、中鎖長(C8〜C14)、好ましくはC12:0またはC14:0を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるLPAATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、xiv)前記細胞に含まれる総脂肪酸含有量のうち、オレイン酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、少なくとも2%増加している、及び/またはαリノレン酸(ALA)レベルが、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、少なくとも2%低下している、xv)前記細胞内の非極性脂質に含まれる、ステロール、好ましくは遊離(非エステル型)ステロール、ステロイルエステル、ステロイルグリコシドの総量のレベルが外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞の非極性脂質と比較して変化している、xvi)前記細胞の非極性脂質が、ワックス及び/またはワックスエステルを含む、xvii)前記細胞が、少なくとも約1000のこのような細胞、好ましくは生育植物部分または種子の集団またはコレクションの1つのメンバーである、xviii)前記細胞がサイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、該外因性ポリヌクレオチドが細胞内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結されている、xix)前記細胞の1つ以上の非極性脂質のレベル及び/または非極性脂質の総含有量が、ArabidposisthalianaWRI1(配列番号21)及びArabidposisthalianaDGAT1(配列番号1)をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む相当する細胞中よりも、重量基準で少なくとも2%多い、及びxx)外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞の多価不飽和脂肪酸(PUFA)の総含有量と比較して、PUFAの総含有量が減少している。

請求項9

関連する場合に、以下の特徴の1つ以上またはすべてが該当する、請求項5〜8のいずれか1項に記載の細胞;i)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与する前記ポリペプチドが、細胞内のTAG、DAGまたはモノアシルグリセロール(MAG)の生合成に関与する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼであり、例えば、DGAT、PDAT、LPAAT、GPATまたはMGAT、好ましくはDGATまたはPDATである、ii)細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与する前記ポリペプチドが、SDPリパーゼ、Cgi58ポリペプチド、アシル−CoAオキシダーゼ(例えばACX1またはACX2)、またはPXA1ペルオキシソームATP結合カセットトランスポーター等の細胞内での脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドであり、好ましくはSDP1リパーゼである、iii)前記油体被覆(OBC)ポリペプチドが、ポリオレオシン若しくはカレオシン等のオレオシン、または脂肪滴会合タンパク質(LDAP)である、iv)細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させる前記ポリペプチドが、FATAポリペプチドまたはFATBポリペプチド等のC16またはC18脂肪酸チオエステラーゼ、ABCA9ポリペプチド等の脂肪酸トランスポーター、または長鎖アシル−CoAシンテターゼ(LACS)である、v)細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与する前記ポリペプチドが、脂肪酸トランスポーターまたはそのサブユニット、好ましくはTGDポリペプチドである、及びvi)色素体のジアシルグリセロール(DAG)産生に関与する前記ポリペプチドが、色素体GPAT、色素体LPAATまたは色素体PAPである。

請求項10

請求項5〜9のいずれか1項に記載の細胞であって、i)16:3植物由来であるか、若しくは16:3植物内、若しくはその生育部分若しくは種子内のものであり;a)外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及びc)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変のうち、1つ以上またはすべてを含み、ここでの外因性ポリヌクレオチドが、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される、前記細胞、またはii)18:3植物由来であるか、若しくは18:3植物内、若しくはその生育部分若しくは種子内のものである、前記細胞。

請求項11

前記細胞が、植物開花前の植物の葉または茎に由来する、またはそれら内部のものであり、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、8%〜15%または9%〜12%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含む、請求項10に記載の細胞。

請求項12

前記遺伝子改変が、遺伝子を部分的に、または完全に不活性化する内因性遺伝子の変異、例えばポイントミューテーション、挿入または欠失等であるか、または前記遺伝子改変が、内因性遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする外因性ポリヌクレオチドであり、該外因性ポリヌクレオチドが、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される、請求項5〜11のいずれか1項に記載の細胞。

請求項13

請求項5〜12のいずれか1項以上に記載の1種以上の細胞を含む、非ヒト生物またはその一部。

請求項14

トランスジェニック植物またはその一部であって、a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、ならびにc)遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変、d)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及びe)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第2の転写因子ポリペプチドをコードする、第4の外因性ポリヌクレオチドのうち、1つまたは2つまたは3つすべてを含み、ここでの各外因性ポリヌクレオチドが、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される、前記トランスジェニック植物またはその一部。

請求項15

以下の1つ以上またはそのすべてを更に含む、請求項14に記載の植物またはその一部a)油体被覆(OBC)ポリペプチドをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、b)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及びc)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

請求項16

前記部分が生育部分であり、プロモーターのうちの1つ以上またはすべてが植物の種子と比較して、該生育部分において高レベルで発現する、請求項14または請求項15に記載の植物またはその一部。

請求項17

請求項9〜12のいずれか1項に記載の1つ以上の特徴を含む、請求項14〜16のいずれか1項に記載の植物またはその一部。

請求項18

各々が請求項14〜17のいずれか1項に記載の植物であり、耕地生長する少なくとも約1000の植物集団、または各々が請求項14〜17のいずれか1項に記載の生育植物部分であり、該生育植物部分が耕地で生長する植物から採取された、少なくとも約1000の生育植物部分のコレクション。

請求項19

請求項14〜17のいずれか1項に記載の植物の種子または植物から得た種子。

請求項20

請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞を得るための工程であって、該工程が、i)請求項5〜12のいずれか1項に記載の少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を真核細胞に導入し、請求項5〜12のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットを含む真核細胞を産生すること、ii)細胞またはその子孫細胞の外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を発現させること、iii)細胞または子孫細胞の脂質含有量分析すること、及びiv)請求項5〜12のいずれか1項に記載の細胞を選択することを含む、前記工程。

請求項21

請求項14〜17のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットをゲノム統合した植物の製造方法であって、該方法が、i)一方の植物が請求項14〜17のいずれか1項に記載の少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を含み、他方の植物が請求項14〜17のいずれか1項に記載の少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を含み、かつ両者間で2つの親植物が請求項14〜17のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットを含む、2つの親植物を交配するステップ、ii)請求項14〜17のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットが存在するまたは存在しない交配種から1つ以上の子孫植物選別するステップ、iii)請求項14〜17のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットを含む子孫植物を選択し、それにより植物を産生するステップを含む、前記方法。

請求項22

工業製品の製造工程であって、該工程が、i)請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、または請求項19に記載の種子を得るステップ、及びii)a)加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物またはその一部、または種子の脂質にinsituで適用することにより、ステップi)の細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品に転換するステップ、またはb)ステップi)の細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子を物理的に処理し、同時にまたは後に加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、処理された細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の脂質に適用することにより、処理された細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品へと転換するステップのいずれか、及びiii)工業製品を回収すること、それによって、工業製品を製造するステップを含む、前記工程。

請求項23

前記植物部分が生育植物部分である、請求項22に記載の工程。

請求項24

請求項22または請求項23に記載の工程であって、(a)細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の非極性脂質含有量の少なくとも一部を非極性脂質として抽出するステップ、及び(b)抽出された非極性脂質を回収するステップを更に含み、ここでのステップ(a)及び(b)が、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品へと転換するステップの前に実施される、前記工程。

請求項25

抽出された脂質の製造工程であって、該工程が、i)請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、または請求項19に記載の種子を得るステップ、ii)細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部または種子から脂質を抽出するステップ、及びiii)抽出された脂質を回収すること、それによって、抽出された脂質を製造するステップを含む、前記工程。

請求項26

前記抽出された脂質を容器内に収集するにより回収すること、ならびに/または抽出された脂質、開花及び/若しくは抽出された脂質由来のワックスエステルの脱ガム脱臭、脱色、乾燥、分画のうち、1つ以上を行うこと、または抽出された脂質の脂肪酸成分を分析することを含む、請求項24または請求項25に記載の工程。

請求項27

前記工程が、抽出された脂質を工業製品に転換することを更に含む、請求項24〜26のいずれか1項に記載の工程。

請求項28

前記工業製品が、炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル及び/または脂肪酸エチルエステルアルカン(例えば、メタンエタンまたは長鎖アルカン)、長鎖アルカン類の混合物アルケンバイオ燃料一酸化炭素及び/または水素ガスバイオアルコール(例えば、エタノールプロパノールまたはブタノール)、バイオ炭、または一酸化炭素、水素及びバイオ炭の混合物等である、請求項22〜24または27のいずれか1項に記載の工程。

請求項29

前記植物部分が、植物地上部若しくは縁色植物部分、好ましくは生育植物部分、例えば植物の葉若しくは茎であるか、または前記植物部分が、塊茎若しくは食用根、例えばジャガイモ(Solanumtuberosum)塊茎若しくはサトウダイコンである、請求項22〜28のいずれか1項に記載の工程。

請求項30

種子の製造工程であって、該工程が、i)請求項14〜17のいずれか1項に記載の植物を生長させること、及びii)その植物から種子を採取することを含む、前記工程。

請求項31

請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子から得られる、または請求項25〜29のいずれか1項に記載の工程により得られる、回収または抽出された脂質。

請求項32

炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル及び/または脂肪酸エチルエステル、アルカン(例えば、メタン、エタンまたは長鎖アルカン)、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素及び/または水素ガス、バイオアルコール(例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール)、バイオ炭、または一酸化炭素、水素及びバイオ炭の混合物等である、請求項22〜24、27または28のいずれか1項に記載の工程により製造された工業製品。

請求項33

請求項5〜9のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子、または請求項31に記載の回収若しくは抽出された脂質の工業製品の製造への使用。

請求項34

燃料の製造工程であって、該工程が、i)請求項31に記載の脂質を、場合により触媒の存在下で、アルコールと反応させ、アルキルエステルを得ること、及びii)場合により、該アルキルエステルと石油系燃料を混合することを含む、前記工程。

請求項35

合成ディーゼル燃料の製造工程であって、該工程が、i)請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、または請求項19に記載の種子内の脂質を、熱分解または熱水処理を含む工程によりバイオ油に転換すること、またはガス化により合成ガスに転換すること、及びii)分画、好ましくは約150℃〜約200℃または約200℃〜約300℃で凝縮する炭化水素化合物の選別を含む工程により、バイオ油を合成ディーゼル燃料に転換すること、または金属触媒または微生物触媒を使用して合成ガスをバイオ燃料に転換することを含む、前記工程。

請求項36

請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、または請求項19に記載の種子内の脂質を、熱分解によりバイオ油に、発酵によりバイオアルコールに、またはガス化若しくは嫌気性消化によりバイオガスに転換することを含む、バイオ燃料の製造工程。

請求項37

前記部分が生育植物部分である、請求項35または請求項36に記載の工程。

請求項38

請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子、若しくは請求項31に記載の回収または抽出された脂質、またはそれらの抽出物若しくは一部を少なくとも1つの他の食品原料成分と混合することを含む、飼料の製造工程。

請求項39

請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子、若しくは請求項31に記載の回収若しくは抽出された脂質、またはそれらの抽出物若しくは一部を含む、飼料、化粧品または化学薬品

請求項40

請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子、または請求項31に記載の回収若しくは抽出された脂質を動物に与える工程を含む、動物に給餌する工程。

技術分野

0001

本発明は、植物脂質、特に植物の生育部分から工業製品を製造する方法に関する。特に、本発明は、バイオディーゼル及び合成ディーゼルなどの油製品、ならびにこれらを製造する工程に加え、トリアシルグリセロールなどの1つ以上の非極性脂質ベルが増加した植物、及び非極性脂質の総含有量が増加した植物を提供する。特定の一実施形態では、本発明は、植物またはその任意の部分において、1つ以上の非極性脂質のレベル及び/または非極性脂質の総含有量及び/または一価不飽和脂肪酸含有量を増加させる、2つ以上の脂質処理酵素油体タンパク質、低脂質分解酵素及び/または脂質生合成を調節する転写因子改変の組み合わせに関する。一実施形態では、本発明は脂質の抽出工程に関する。別の実施形態では、採取された植物生育部分において、脂質を1つ以上の炭化水素生成物へと転換し、再生可能バイオディーゼル燃料としての用途に適した脂肪酸アルキルエステルを製造する。

背景技術

0002

世界のエネルギー、特に輸送に関するエネルギーの大部分は、有限石油から得られる燃料により供給されている。例えば、生物から生成される油等の、再生可能な代替原料が必要とされている。

0003

トリアシルグリセロール生合成
トリアシルグリセロール類(TAG)は、種子中の脂質の主形態を構成し、エステル化されグリセロール主鎖となる3つのアシル鎖から構成される。脂肪酸は、アシル−アシル担体タンパク質(ACP)中間体として、最初の不飽和化触媒を受け得る色素体中で合成される。この反応は、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ不飽和化酵素)により触媒され、オレイン酸(C18:1Δ9)を生成する。次いで、アシル鎖は、アシル−コエンザイムCoAチオエステルとして細胞質ゾル及び小胞体ER)へと移送される。主要なTAG生合成経路(ケネディ経路またはグリセロールリン酸(G3P)経路としても知られる)に入る前に、アシル鎖は、通常、ER膜のリン脂質へと組み込まれ、更なる不飽和化を受けることができる。多価不飽和脂肪酸の産生における2つの重要な酵素は、膜結合FAD2及びFAD3デサチュラーゼであり、それらは、それぞれ、リノール酸(C18:2Δ9、12)及びαリノレン酸(C18:3Δ9、12、15)を産生する。

0004

ケネディ経路を介したTAG生合成は、引き続く一連アシル化(各々、アシル供与体として、アシル−CoAエステルを用いる)から構成される。最初のアシル化ステップは通常、G3P主鎖のsn1−位で発生し、グリセロール3リン酸アシルトランスフェラーゼ(sn1−GPAT)により触媒される。産物である、sn1−リゾホスファチジン酸(sn1−LPA)は、第2のアシル鎖をsn2−位で連結させ、ホスファチジン酸を形成するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)の基質として機能する。PAは更に、ホスファチジン酸ホスファターゼPAP)によりジアシルグリセロール(DAG)へと脱リン酸化され、それによって、最終アシル化ステップの基質がもたらされる。最後に、第3のアシル鎖が、ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ(DGAT)により触媒される反応においてDAGのsn3−位でエステル化され、油体蓄積されるTAGを形成する。第2の酵素反応である、ホスファチジルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ(PDAT)によっても、DAGからTAGへの転換がもたらされる。この反応は、DGATとは関連がなく、アシル供与体として、リン脂質を使用する。

0005

脂質の商用製造量最大化するために、トランスジェニック生物またはそれらの一部(例えば、植物、種子、葉、藻類及び菌類)において、脂質、特に、例えばDAG及びTAG等の非極性脂質のレベルを増加させる手段が更に求められている。植物での中性脂質収率を上げる試みは、主に、脂肪酸生合成またはTAGアセンブリに関連する個々の重要な酵素ステップに焦点が置かれてきた。しかしこれらの戦略は、種子の油体または葉の油体において、ほどほどの増加をもたらしたのみであった。油性酵母Yarrowia lipolyticaに関する近年の代謝工学研究により、グリセロール3リン酸産生の増加と、β酸化を介したTAG分解の阻害を組み合わせたアプローチにより、脂質の総含有量の累積的増加がもたらされたことが示された(Dulermo et al.,2011)。

0006

種子油のトリアシルグリセロール(TAG)等の植物油は、例えば料理用途(ショートニングテクスチャフレーバー)、工業用途石鹸蝋燭香料化粧品、適切な乾燥剤絶縁体潤滑剤)等の多くの用途があり、そして栄養的な価値がある。また、植物油を使用したバイオ燃料の製造に注目が集まっている。

0007

脂質の生物からの商用製造を最大化するために、トランスジェニック生物またはその一部(例えば、植物、種子、葉、藻及び菌類等)において、脂質、特に非極性脂質(例えば、DAG及びTAG等)のレベルを増加させるための更なる手段が必要とされている。

先行技術

0008

Dulermo and Nicaud(2011)Metab. Eng. 13:482−491.

課題を解決するための手段

0009

本発明者らは、生育植物部分から油製品を製造する工程を特定した。

0010

第1の態様では、本発明は油製品の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む:
(i)反応器内で、
(a)乾重量が少なくとも2gであり、非極性脂質の総含有量を乾重量基準で少なくとも5重量%有する生育植物部分と、
(b)水、アルコールまたは両方を含む溶媒と、
(c)場合により触媒と、を含む組成物を処理するステップであって、
該処理が、酸化還元または不活性環境にて組成物を温度約50℃〜約450℃、圧力5〜350barで1〜120分間加熱することを含むステップ、
(ii)生育植物部分の乾重量に対して、少なくとも35重量%の収率で反応器から油製品を回収すること、
それによって油製品を製造するステップ。

0011

一実施形態では、生育植物部分は、少なくとも1kgの乾重量を有する。

0012

一実施形態では、生育植物部分は、乾重量基準で少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、約25%、約30%、約35%、10%〜75%、20%〜75%、または好ましくは30%〜75%の非極性脂質の総含有量を有する。

0013

一実施形態では、組成物は、5%〜90%、好ましくは15%〜50%(乾重量/重量)の固体濃度を有する。

0014

任意の好適な触媒を用いることができる。一実施形態では、触媒はアルカリ、酸または貴金属触媒である。例えば、一実施形態では、触媒はNaOHまたはKOHまたは両方を好ましくは0.1M〜2Mの濃度で含む。

0015

一実施形態では、処理時間は1〜60分、好ましくは10〜60分、より好ましくは15〜30分間である。圧力が50bar未満である一実施形態では、反応時間は最長24時間あるいは最長7日でも良い。好ましい実施形態では、温度は275℃〜360℃であり、圧力は100〜200barであり、反応は10〜60分生じる。

0016

一実施形態では、溶媒が水である場合、この工程により、生育植物部分の乾重量に対して、最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%または40重量%から、最大55%または好ましくは60重量%までの収率の油製品が製造される。本実施形態では、油製品は、脂肪酸アシルエステルより少なくとも2倍、好ましくは少なくとも3倍の炭化水素化合物を含む。油製品は、35%、より好ましくは40%のC13〜C22炭化水素化合物を含むことが好ましい。

0017

別の実施形態では、溶媒がアルコール、好ましくはメタノールを含む場合、この工程により、生育植物部分の乾重量に対して、最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%または40重量%から、最大65%または好ましくは70重量%までの収率の油製品が生じる。本実施形態では、油製品は、炭化水素化合物よりも少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍の脂肪アシルエステルを含む。油製品は、40%、より好ましくは50%の脂肪酸メチルエステルを含むことが好ましい。

0018

更に別の実施形態では、溶媒が約80%の水を含む場合、油製品は約30%のC13〜C22炭化水素化合物、好ましくは約35%、より好ましくは約40%のC13〜C22炭化水素化合物を含む。

0019

別の実施形態では、溶媒が約50%のメタノールを含む場合、油製品は約50%の脂肪酸メチルエステル(FAME)を含む。

0020

更に別の実施形態では、回収された油製品は、約15重量%未満、好ましくは5重量%未満の含水量を有する。

0021

また別の実施形態では、油製品の収率は、非極性脂質の含有量が乾重量基準で2%未満である、相当する生育植物部分を用いた相当する工程と比較して、少なくとも2重量%、好ましくは少なくとも4重量%多い。

0022

一実施形態では、ステップ(i)(a)において、生育植物部分は、乾燥、切断、破砕粉砕、回転、加圧圧縮または摩砕のうち1つ以上によって物理的に処理された。代替的一実施形態では、組成物の調製前に含水量10%未満まで生育植物部分を乾燥させないようにした。例えば、生育植物部分は少なくとも20%または少なくとも30%の含水量を有するか、または生育植物部分が採取されたときに有した含水量の少なくとも50%を保持する。

0023

一実施形態では、この工程は以下の1つ以上を更に含む:
(i)回収された油製品の水素化脱酸素
(ii)回収した油製品の水素処理により、油製品のケトンまたは糖のレベルを低減すること、
(iii)回収した油製品からの合成ガスの製造、及び
(iv)回収した油製品を分画し、1種以上の燃料油ディーゼル油灯油またはガソリンを製造すること。例えば、分画ステップは、分別蒸留によってなされる。

0024

一実施形態では、生育植物部分は、植物の葉、または両方を含む。

0025

一実施形態では、生育植物部分は、本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変の組み合わせを含む。

0026

本発明者らは、脂肪酸生合成、脂質アセンブリ及び脂質パッケージング経路の操作によって、ならびに脂質異化作用の抑制によって、生物、特に植物の生育部分及び種子の脂質含有量が有意に増加することも実証した。遺伝子の各種の組合せ及び遺伝子発現の抑制を用いて、含油率の大幅な増加を達成した。これは、バイオ燃料及び油由来の他の工業製品の製造に極めて重要である。

0027

第2の態様では、本発明は以下を含む組み換え真核細胞を提供する:
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、ならびに次の1つまたは2つまたは3つすべて:
c)遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性下方調節する第1の遺伝子改変、
d)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及び
e)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第2の転写因子ポリペプチドをコードする、第4の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーター作動可能に連結される。

0028

一実施形態では、細胞は、a)、b)及びc)、ならびに場合により、d)またはe)を含む。

0029

一実施形態では、細胞は、a)、b)及びd)、ならびに場合により、c)またはe)を含む。

0030

一実施形態では、細胞は、a)、b)及びe)、ならびに場合により、c)またはd)を含む。

0031

一実施形態では、細胞は以下の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
a)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくは脂肪滴会合タンパク質(LDAP)をコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
b)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、ならびに
c)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0032

一実施形態では、組み換え真核細胞は、以下を含む:
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、
c)遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、場合により細胞は次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
d)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0033

一実施形態では、細胞は植物の生育部分からの、またはその内部の植物細胞であり、この生育部分では、植物の種子と比較して、プロモーターの1つ以上またはそのすべてを高レベルで発現する。

0034

好ましい実施形態では、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドと共に、c)、d)またはe)がある場合、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含むが、c)、d)、e)のそれぞれを欠く、相当する細胞と比較して、細胞、好ましくは葉または茎等の生育植物部分内の細胞での非極性脂質の総含有量を増加させる。増加は相乗作用的である方がより好ましい。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0035

一実施形態では、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、細胞内でのTAGの異化に関与するポリペプチドはSDPリパーゼである。

0036

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATである。

0037

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATである。

0038

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、細胞内でのトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドはSDP1リパーゼである。

0039

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、及び細胞内でのトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドはSDP1リパーゼである。

0040

一実施形態では、存在する場合に、2つの転写因子は、WRI1及びLEC2またはWRI1及びLEC1である。

0041

上記実施形態では、細胞は、土壌生長している植物、または土壌で生長した後に、その植物部分を採取した植物の生育部分にあり、かつ、該細胞が重量基準(乾重量%)で少なくとも8%、例えば8%〜75%、または8%〜30%等のTAGを含むことが好ましい。より好ましくは、TAGの含有量は、少なくとも10%、例えば10%〜75%、または10%〜30%である。これらのTAGレベルが、植物の開花前若しくは開花時、または植物成長結実段階前に生育部分に存在していることが好ましい。これらの実施形態では、植物の葉内のTAG含有量と、茎内のTAG含有量との比率が1:1〜10:1であり、及び/またはこの比率が、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含み、第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、増加していることが好ましい。

0042

上記実施形態では、細胞は、好ましくはDGATをコードする外因性ポリヌクレオチド及び内因性SDP1リパーゼの産生を下方調節する遺伝子改変を含む。より好ましくは、細胞はPDATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び/またはNicotiana benthamiana(ニコチアナ・ベンサミアナ)細胞以外の細胞であり、及び/またはWRI1は、Arabidopsis thaliana(アラビドプシス・サリアナ)WRI1(配列番号21または22)以外のWRI1である。最も好ましくは、細胞の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または開花開始後または老化中に、上方調節されるプロモーター等から発現する。

0043

第3の態様では、本発明は以下を含む組み換え真核細胞を提供する:
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくは脂肪滴会合ポリペプチド(LDAP)をコードする第3の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、かつ、該組み換え真核細胞では、ヌクレオチド配列が配列番号176に示された配列の補体である第3の外因性ポリヌクレオチドを含む、相当する細胞と比較して、1つ以上の非極性脂質のレベル及び/またはOBCポリペプチド量が増加している。

0044

一実施形態では、上記態様の細胞は、次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0045

一実施形態では、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0046

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATである。

0047

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0048

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂肪の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0049

一実施形態では、細胞は、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、2種類の転写因子ポリペプチド、例えばWRI1とLEC2、またはWRI1とLEC1等をコードする2つの外因性ポリヌクレオチドを含む。

0050

好ましい実施形態では、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドと共に、OBCポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第3の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、植物細胞、好ましくは葉または茎等の生育植物部分内の細胞での非極性脂質の総含有量を増加させる。増加は相乗作用的である方がより好ましい。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0051

第4の態様では、本発明は、色素体、及び細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、ならびに次の1つ以上またはそのすべてを含む組み換え真核細胞を提供する;
a)第2の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0052

一実施形態では、植物細胞は、好ましくはa)及び場合により、b)またはc)を含む。

0053

一実施形態では、上記態様の細胞は、次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
d)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
e)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変、及び
f)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド。

0054

好ましい実施形態では、細胞、好ましくは植物細胞は、第1、第2及び第3の外因性ポリヌクレオチド、ならびに場合により、第3の遺伝子改変または第4の外因性ポリヌクレオチドを含む。

0055

好ましい実施形態では、第1及び、存在する場合、第3の外因性ポリヌクレオチドと共に、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチド、好ましくはFATAポリペプチド等の脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする第2の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第1及び、存在する場合、第3の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第2の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物細胞と比較して、植物細胞、好ましくは葉または茎等の生育植物部分内の細胞での非極性脂質の総含有量を増加させる。より好ましくは、第2の外因性ポリヌクレオチドにより提供される増加は、相乗作用的である。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0056

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドは、WRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチド、好ましくはArabidopsis thaliana WRI1(配列番号21または22)以外の転写因子であり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはFATAまたはFATBポリペプチド、より好ましくはFATAポリペプチド、または中鎖脂肪酸チオエステラーゼ以外の脂肪酸チオエステラーゼである。中鎖チオエステラーゼ以外のチオエステラーゼの存在は、チオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、ほぼ同等である細胞の総脂肪酸含有量におけるC12:0及び/またはC14:0脂肪酸の比率によって示される。好ましくは、細胞はDGATをコードする外因性ポリヌクレオチド及び内因性SDP1リパーゼの産生を下方調節する遺伝子改変を更に含む。一実施形態では、SDP1リパーゼ産生の低下は、転写因子及び脂肪酸チオエステラーゼと相乗作用し、細胞の非極性脂質の総含有量を増加させる。より好ましくは、細胞はPDATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び/またはNicotiana benthamiana細胞以外の細胞である。最も好ましくは、細胞の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または老化中に上方調節されるプロモーター等から発現する。

0057

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはTGDポリペプチドである。

0058

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、ジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドは色素体GPATである。

0059

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはFATAまたはFATBポリペプチドであり、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはTGDポリペプチドである。

0060

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはFATAまたはFATBポリペプチドであり、ジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドは色素体GPATである。

0061

一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、細胞の色素体への脂肪酸の移入を増加させるポリペプチドは、TGDポリペプチドであり、ジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドは色素体GPATである。

0062

一実施形態では、細胞は、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、2種類の転写因子ポリペプチド、例えばWRI1とLEC2、またはWRI1とLEC1等をコードする2つの外因性ポリヌクレオチドを含む。

0063

第2、第3及び第4の態様の実施形態では、細胞が、脂肪酸チオエステラーゼ、例えばFATAまたはFATBポリペプチド等をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む場合、チオエステラーゼは好ましくは、FATAポリペプチド、または中鎖脂肪酸チオエステラーゼ以外の脂肪酸チオエステラーゼである。

0064

第5の態様では、本発明は以下を含む組み換え真核細胞を提供する:
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチド、好ましくはWRI転写因子をコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)中鎖長(C8〜C14)を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるLPAATである、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)第3の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からのC8〜C14脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0065

一実施形態では、第3の外因性ポリヌクレオチドは、チオエステラーゼ、好ましくは中鎖長(C8〜C14)を有する脂肪酸に対して優先的活性を有するFATBチオエステラーゼをコードする。

0066

好ましい実施形態では、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドと共に、細胞の色素体からのC8〜C14脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第3の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、細胞(好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分内の細胞)でのMCFAの総含有量を増加させる。より好ましくは、第3の外因性ポリヌクレオチドにより提供される増加は、相乗作用的である。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0067

一実施形態では、中鎖長(C8〜C14)を有する脂肪酸に対して優先的活性を有するFATBチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドは、その配列が配列番号193〜199のいずれかに示されたアミノ酸、またはそのいずれか1つのアミノ酸の生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号193〜199のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドを含む。より好ましくは、中鎖長(C8〜C14)を有する脂肪酸に対して優先的活性を有するFATBチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドは、その配列が配列番号193〜199に示されたアミノ酸、またはそのいずれか1つのアミノ酸の生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号193〜199のいずれか1つまたは両方と少なくとも30%同一であるポリペプチドを含む。

0068

第5の態様の一実施形態では、転写因子はArabidopsis thaliana WRI1(配列番号21または22)ではない。

0069

第5の態様の一実施形態では、LPAATをコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号200に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも30%同一であるポリペプチドを含む。

0070

第5の態様の一実施形態では、細胞は次の1つ以上またはそのすべてを更に含む;
d)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与する更に別のポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
e)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
f)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
g)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
h)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0071

第5の態様の一実施形態では、細胞は植物の生育部分からの、またはその内部の植物細胞であり、この生育部分では、植物の種子と比較して、プロモーターの1つ以上またはそのすべてを高レベルで発現する。

0072

第5の態様の実施形態では、中鎖長を有する脂肪酸は、少なくともミリスチン酸である。好ましい実施形態では、細胞は、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、8%〜25%、8%〜20%、10%〜25%、11%〜25%、約15%〜25%、約20%〜25%(w/w乾重量)のミリスチン酸成分を含む。

0073

第3、第4及び第5の態様の実施形態では、細胞は、土壌で生長している植物、または土壌で生長した後、その植物部分を採取した植物の生育部分にあり、かつ、該細胞が重量基準(乾重量%)で少なくとも8%、例えば8%〜75%、または8%〜30%等のTAGを含むことが好ましい。より好ましくは、TAGの含有量は、少なくとも10%、例えば10%〜75%、または10%〜30%である。これらのTAGレベルが、植物の開花前若しくは開花時、または植物成長の結実段階前に生育部分に存在していることが好ましい。これらの実施形態では、植物の葉内のTAG含有量と、茎内のTAG含有量との比率が1:1〜10:1であり、及び/またはこの比率が、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含み、第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、増加していることが好ましい。

0074

第2、第3、第4及び第5の態様の実施形態では、細胞は、好ましくはDGATをコードする外因性ポリヌクレオチド及び内因性SDP1リパーゼの産生を下方調節する遺伝子改変を含む。好ましい実施形態では、細胞はPDATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び/またはNicotiana benthamiana細胞以外の細胞であり、及び/またはBrassica napus(セイヨウアブラナ)細胞以外の細胞である。最も好ましくは、細胞の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または老化中に上方調節されるプロモーター等から発現する。

0075

一実施形態では、本発明(第2、第3、第4及び第5の態様を含む)の細胞は、以下の1つ以上またはそのすべての特徴を有する(該当する場合);

0076

i)細胞は、第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸の合成が増加しているか、または第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸の異化が減少しているか、またはその両方であり、それによって第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸のレベルが増加している、

0077

ii)細胞は、第1の外因性ポリヌクレオチドを有し、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、TAG、DAGまたはMAG、好ましくはTAGの合成を触媒する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ(fatty acyl acyltransferase)の発現及び/または活性が増加している、

0078

iii)細胞は、第1の外因性ポリヌクレオチドを有し、細胞内の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、色素体中のアシル−ACP及びG3Pからのリゾホスファチジン酸(LPA)の産生が減少している、

0079

iv)細胞は、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸含有量及び/またはガラクト脂質の含有量のうち、C18:3脂肪酸に対するC16:3の比率が変化している、好ましくは比率が減少している、

0080

v)細胞は植物の生育部分にあり、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含む、

0081

vi)細胞は植物の生育部分にあり、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)のTAG含有量を含む、

0082

vii)転写因子ポリペプチド(複数を含む)が、Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1様、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4、およびDof11からなる群、またはMYB73、bZIP53、AGL15、MYB115、MYB118、TANMEIWUS、GFR2a1、GFR2a2及びPHR1からなる群から選択される、

0083

viii)オレイン酸は、細胞中、総脂肪酸含有量の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)または少なくとも60%(mol%)、好ましくは約65%(mol%)または20%〜約65%を占める、

0084

ix)細胞内の非極性脂質に含まれる脂肪酸は、水酸基エポキシ基シクロプロパン基、炭素炭素二重結合、炭素−炭素三重結合共役二重結合分枝鎖(例えばメチル化若しくはヒドロキシル化された分枝鎖、またはそれらの2つ以上の組み合わせ)、または上述の基、結合若しくは分枝鎖のうち任意の2つ、3つ、4つ、5つまたは6つを含む、

0085

x)細胞の非極性脂質は、エイコサジエン酸(EDA)、アラキドン酸(ARA)、ステアリドン酸(SDA)、エイコサトリエン酸(ETE)、エイコサテトラエン酸(ETA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサペンタエン酸DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)またはそれらの2つ以上の組み合わせから選択される1種以上の多価不飽和脂肪酸を含む、

0086

xi)細胞は、植物またはその一部、好ましくは生育植物部分にあり、または細胞は、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類または不等毛藻類等の藻細胞であり、または細胞は、真菌等の発酵に適した微生物であるか、またはそれらに由来する、

0087

xii)1つ以上またはすべてのプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーター、好ましくは組織特異的プロモーター(例えば葉及び/または茎に特異的なプロモーター)、老化特異的プロモーター等の発生的調節プロモーター(例えば、SAG12プロモーター)、誘導性プロモーター、または概日リズム調節プロモーターから選択され、好ましくは転写因子ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターが構成的プロモーター以外である、

0088

xiii)細胞は、中鎖脂肪酸、好ましくはC12:0、C14:0または両方を総脂肪酸含有量のうち少なくとも5%のレベルで含む、総脂肪酸含有量を含み、更に場合により、中鎖長(C8〜C14)、好ましくはC12:0またはC14:0を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるLPAATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、

0089

xiv)細胞に含まれる総脂肪酸含有量のうち、オレイン酸レベル及び/またはパルミチン酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、少なくとも2%増加している、及び/またはαリノレン酸(ALA)レベル及び/またはリノール酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、少なくとも2%低下している、

0090

xv)細胞内の非極性脂質に含まれる、ステロール、好ましくは遊離(非エステル型)ステロール、ステロイルエステル(steroyl ester)、ステロイルグリコシド(steroyl glycoside)の総量のレベルが外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞の非極性脂質と比較して変化している、

0091

xvi)細胞の非極性脂質は、ワックス及び/またはワックスエステルを含む、

0092

xvii)細胞は、少なくとも約1000のこのような細胞、好ましくは生育植物部分または種子の集団またはコレクションの1つのメンバーである、

0093

xviii)細胞がサイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、該外因性ポリヌクレオチドが細胞内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結されている、

0094

xix)細胞の1つ以上の非極性脂質のレベル及び/または非極性脂質の総含有量が、Arabidposis thaliana WRI1(配列番号21)及びArabidposis thaliana DGAT1(配列番号1)をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む相当する細胞中よりも、重量基準で少なくとも2%多い、

0095

xx)外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞の多価不飽和脂肪酸(PUFA)の総含有量と比較して、PUFAの総含有量が減少している。

0096

以降の実施形態は、本発明(第2、第3、第4および第5の態様を含む)の細胞、ならびに細胞の産生方法及び細胞の使用方法にも当てはまる。これらの実施形態では、細胞が植物の生育部分にある場合、植物は土壌で生長しているか、または土壌で生長したものであることが好ましい。

0097

一実施形態では、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドは、細胞内のTAG、DAGまたはモノアシルグリセロール(MAG)、好ましくは細胞内のTAGの生合成に関与する、例えばDGAT、PDAT、LPAAT、GPATまたはMGAT等の脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ、好ましくはDGATまたはPDATである。

0098

一実施形態では、細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドは、SDP1リパーゼ、Cgi58ポリペプチド、アシル−CoAオキシダーゼ(例えばACX1またはACX2)、またはPXA1ペルオキシソームATP結合カセットトランスポーター等の細胞内での脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドであり、好ましくはSDP1リパーゼである。

0099

一実施形態では、油体被覆(OBC)ポリペプチドは、ポリオレオシン若しくはカレオシン等のオレオシン、または好ましくは脂肪滴会合タンパク質(LDAP)である。

0100

一実施形態では、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、FATAポリペプチドまたはFATBポリペプチド等のC16またはC18脂肪酸チオエステラーゼ、ABCA9ポリペプチド等の脂肪酸トランスポーター、または長鎖アシル−CoAシンテターゼ(LACS)である。

0101

一実施形態では、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドは、脂肪酸トランスポーターまたはそのサブユニット、好ましくはTGDポリペプチド、例えばTGD1ポリペプチド、TGD2ポリペプチド、TGD3ポリペプチドまたはTGD4ポリペプチド等である。

0102

一実施形態では、色素体のジアシルグリセロール(DAG)産生に関与するポリペプチドは、色素体GPAT、色素体LPAATまたは色素体PAPである。

0103

一実施形態では、細胞は、16:3植物由来であるか、または16:3植物内、またはその生育部分若しくは種子内のものであり、以下の1つ以上または以下のすべてを含む;
a)外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変。ここでの外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0104

代替的実施形態では、細胞は、18:3植物由来であるか、または18:3植物内、またはその生育部分若しくは種子内のものである。

0105

一実施形態では、細胞は植物開花前の植物の葉、茎または根由来であるか、またはそれら内にあり、該細胞は、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、8%〜15%または9%〜12%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含む。一実施形態では、細胞の非極性脂質の総含有量は、第2、第3、第4及び第5の態様で本明細書に記載した、WRI1及びDGATをコードしているが、他の外因性ポリヌクレオチド及び遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された相当する細胞での非極性脂質の総含有量よりも、少なくとも3%、より好ましくは少なくとも5%より多い。植物の茎若しくは根の細胞内に、その程度の増加が見られることがより好ましい。

0106

一実施形態では、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子改変、好ましくは、OBC若しくは脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、または細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変、より好ましくは、FATAチオエステラーゼ若しくはLDAPをコードする、または細胞のSDP1 TAGリパーゼ等の内因性TAGリパーゼの発現を減少させる外因性ポリヌクレオチドを加えた結果、特に植物開花前の、更により詳細には植物の茎及び/または根の導入遺伝子WRI1及びDGATの対に追加されたとき、細胞の非極性脂質の総含有量が相乗作用的に増加する。例えば、実施例8、11および15を参照されたい。好ましい実施形態では、植物の茎または根の細胞のTAG含有量の増加は、WRI1及びDGAT1をコードしているが、FATAチオエステラーゼ、LDAP、及び細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された、相当する細胞と比較して、少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍である。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0107

遺伝子改変は、自然発生的な細胞に対して何らかの変化をもたらし、望ましい効果を与えることができる。細胞の遺伝子改変方法は当技術分野において周知である。一実施形態では、1つ以上またはすべての遺伝子改変は各々、遺伝子を部分的に、または完全に不活性化する内因性遺伝子の変異であり、好ましくはポイントミューテーション、挿入または欠失(または、その1つ以上の組み合わせ)等の誘導型変異である。ポイントミューテーションは、遺伝子またはコードされたポリペプチドの活性を抑制する未成熟終止コドンスプライス部位変異フレームシフト変異またはアミノ酸置換変異であり得る。欠失は、遺伝子の転写されたエキソンまたはプロモーター内の1つ以上のヌクレオチドにあっても、複数のエキソンに跨がってもまたは渡ってもよく、遺伝子全体に欠失が及んでいてもよい。好ましくは、欠失は、ZF、TALENまたはCRISPR技術を使用して誘導される。一実施形態では、1つ以上またはすべての遺伝子改変は、内因性遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする外因性ポリヌクレオチドであり、ここでの外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。内因性遺伝子の発現を抑制する外因性ポリヌクレオチドの例は、アンチセンスポリヌクレオチドセンスポリヌクレオチド、マイクロRNA、内因性酵素を結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、二重鎖RNA分子、及びそれから誘導される操作されたRNA分子からなる群から選択される。一実施形態では、細胞は、内因性遺伝子の誘導された変異である遺伝子改変、及び別の内因性遺伝子の発現を抑制するRNA分子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

0108

一実施形態では、WRI1をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の1つ以上を含む:
i)配列番号21〜75または205〜210のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号21〜75または205〜210のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下でi)及び/またはii)にハイブリダイズするヌクレオチド。WRI1ポリペプチドは、好ましくは、Arabidopsis thaliana WRI1(配列番号21または22)以外のWRI1ポリペプチドである。より好ましくは、WRI1ポリペプチドは、配列番号208に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも30%同一であるポリペプチドを含む。

0109

第2、第3、第4または第5の態様の一実施形態では、組み換え細胞は、ジャガイモ(Solanum tuberosum)塊茎の細胞、サトウダイコン(Beta vulgaris)の根または葉の細胞、サトウキビ(Saccharum sp.)若しくはサトウモロコシ(Sorghum bicolor)の茎または葉の細胞、単子葉植物内胚乳細胞であり、該細胞は、相当する野生型内胚乳細胞、例えば、コムギ(Triticum aestivum)穀物、イネ(Oryza sp.)穀物またはトウモロコシ(Zea mays)穀粒等の細胞、高い総脂肪酸含有量を有するBrassica sp.種子、例えば、カノーラ種子等の細胞、または高い総脂肪酸含有量を有するマメ科種子、例えば、ダイズ(Glycine max)種子等の細胞と比較して、総脂肪酸含有量が増加している。

0110

第6の態様では、本発明は、本発明の1種以上の細胞を含む、またはそれからなる非ヒト生物またはその一部を提供する。

0111

一実施形態では、非ヒト生物の一部は、植物の種子、果物または生育部分、例えば葉または茎等の植物地上部または緑色部分である。

0112

別の実施形態では、非ヒト生物は、例えば植物若しくは藻類等の光合成生物、または例えば真菌類等の発酵に適した微生物である。

0113

第7の態様では、本発明は、以下を含むトランスジェニック植物またはその一部、好ましくは生育植物部分を提供する:
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、ならびに次の1つまたは2つまたは3つすべて:
c)遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変、
d)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、植物細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及び
e)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第2の転写因子ポリペプチドをコードする、第4の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0114

一実施形態では、植物は、a)、b)及びc)、ならびに場合により、d)またはe)を含む。

0115

一実施形態では、植物またはその一部は、a)、b)及びd)、ならびに場合により、c)またはe)を含む。

0116

一実施形態では、植物またはその一部は、a)、b)及びe)、ならびに場合により、c)またはd)を含む。

0117

好ましい実施形態では、a)及びb)と共に、c)、d)またはe)がある場合、a)およびb)を含むが、c)、d)及びe)の各々を欠く、相当する細胞と比較して、植物またはその一部(好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分)での非極性脂質の総含有量を増加させる。増加は相乗作用的である方が好ましい。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0118

一実施形態では、植物またはその一部は、以下の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
a)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
b)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
c)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0119

一実施形態では、トランスジェニック植物またはその一部は、以下を含む:
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、好ましくは構成的プロモーター以外のプロモーターから発現されるポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、場合により植物は次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
d)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0120

一実施形態では、部分は生育部分であり、プロモーターのうちの1つ以上またはすべては植物の種子と比較して、生育部分において高レベルで発現する。

0121

一実施形態では、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、植物内でのTAGの異化に関与するポリペプチドはSDP1リパーゼである。

0122

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATである。

0123

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATである。

0124

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、植物内でのトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドはSDP1リパーゼである。

0125

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、及び植物内でのトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドはSDP1リパーゼである。

0126

一実施形態では、存在する場合に、2つの転写因子は、WRI1及びLEC2またはWRI1及びLEC1である。

0127

上記実施形態では、植物は土壌で生長しているか、または土壌で生長した後に、その一部が採取されたものであることが好ましい。植物の生育部分は、重量基準(乾重量%)で少なくとも8%、例えば8%〜75%、または8%〜30%等のTAGを含むことが好ましい。より好ましくは、TAGの含有量は、少なくとも10%、例えば10%〜75%、または10%〜30%である。これらのTAGレベルが、植物の開花前若しくは開花時、または植物成長の結実段階前に生育部分に存在していることが好ましい。これらの実施形態では、植物の葉内のTAG含有量と、茎内のTAG含有量との比率が1:1〜10:1であり、及び/またはこの比率が、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含み、第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、増加していることが好ましい。

0128

上記実施形態では、植物またはその一部の非極性脂質の総含有量は、WRI1及びDGATをコードしているが、本明細書に記載の他の外因性ポリヌクレオチド及び遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された相当する植物またはその一部での非極性脂質の総含有量よりも、好ましくは少なくとも3%、より好ましくは少なくとも5%多い。植物の茎若しくは根の組織内に、その程度の増加が見られることがより好ましい。

0129

上記の実施形態では、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子改変、好ましくは、OBC若しくは脂肪酸チオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、または細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変、より好ましくは、LDAP若しくはFATAチオエステラーゼをコードする、または細胞のSDP1 TAGリパーゼ等の内因性TAGリパーゼの発現を減少させる外因性ポリヌクレオチドを加えた結果、特に植物開花前の、更により詳細には植物の茎及び/または根の組織の導入遺伝子WRI1及びDGATの対に追加されたとき、植物またはその一部の非極性脂質の総含有量が相乗作用的に増加する。例えば、実施例8、11及び15を参照されたい。好ましい実施形態では、植物の葉、茎若しくは根の組織またはその3つすべてのTAG含有量の増加は、WRI1及びDGAT1をコードしているが、OBCまたは脂肪酸チオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、及び細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された相当する部分と比較して、少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍である。

0130

上記実施形態では、植物またはその一部は、好ましくはDGATをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド及び内因性SDP1リパーゼの産生を下方調節する第1の遺伝子改変を含む。より好ましくは、植物またはその一部はPDATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び/またはNicotiana benthamiana及び/またはBrassica napus以外の植物またはその一部であり、及び/またはWRI1は、Arabidopsis thaliana WRI1以外のWRI1である(配列番号21または22)。一実施形態では、植物はサトウキビ以外である。最も好ましくは、植物の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または開花開始後または老化中に、上方調節されるプロモーター等から発現する。好ましくは、少なくとも第1の外因性ポリヌクレオチド(転写因子をコードする)は、このようなプロモーターから発現する。

0131

第8の態様では、本発明は、以下を含むトランスジェニック植物またはその一部、好ましくは生育植物部分を提供する:
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、かつ、該植物では、ヌクレオチド配列が配列番号176に示された配列の補体である第3の外因性ポリヌクレオチドを含む、相当する植物と比較して、1つ以上の非極性脂質のレベル及び/またはOBCポリペプチド量が増加している。

0132

好ましい実施形態では、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドと共に、OBCポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第3の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物部分と比較して、植物またはその一部(好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分)での非極性脂質の総含有量を増加させる。増加は相乗作用的である方が好ましい。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0133

第8の態様の一実施形態では、植物またはその一部は次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0134

一実施形態では、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0135

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATである。

0136

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0137

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂肪の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0138

一実施形態では、細胞は、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、2種類の転写因子ポリペプチド、例えばWRI1とLEC2、またはWRI1とLEC1等をコードする2つの外因性ポリヌクレオチドを含む。

0139

第9の態様では、本発明は、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び次の1つ以上またはそのすべてを含む、トランスジェニック植物またはその一部、好ましくは生育植物部分を提供する;
a)第2の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0140

一実施形態では、植物細胞またはその一部、好ましくは、生育植物部分は、a)及び場合により、b)またはc)を含む。

0141

第9の態様の一実施形態では、植物またはその一部は次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
d)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
e)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変、及び
f)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド。

0142

好ましい実施形態では、植物またはその一部、好ましくは生育植物部分は、第1、第2及び第3の外因性ポリヌクレオチド、ならびに場合により、第3の遺伝子改変または第4の外因性ポリヌクレオチドを含む。

0143

好ましい実施形態では、第1及び、存在する場合、第3の外因性ポリヌクレオチドと共に、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチド、好ましくはFATAポリペプチド等の脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする第2の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第1及び、存在する場合、第3の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第2の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物部分と比較して、植物部分(好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分)での非極性脂質の総含有量を増加させる。より好ましくは、第2の外因性ポリヌクレオチドにより提供される増加は、相乗作用的である。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0144

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはTGDポリペプチドである。

0145

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、ジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドは色素体GPATである。

0146

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはFATAまたはFATBポリペプチドであり、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはTGDポリペプチドである。

0147

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはFATAまたはFATBポリペプチドであり、ジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドは色素体GPATである。

0148

一実施形態では、植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、植物の色素体への脂肪酸の移入を増加させるポリペプチドは、TGDポリペプチドであり、ジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドは色素体GPATである。

0149

一実施形態では、植物は、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、2種類の転写因子ポリペプチド、例えばWRI1とLEC2、またはWRI1とLEC1等をコードする2つの外因性ポリヌクレオチドを含む。

0150

第7、第8及び第9の態様の実施形態では、植物が、脂肪酸チオエステラーゼ、例えばFATAまたはFATBポリペプチド等をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む場合、チオエステラーゼは好ましくは、FATAポリペプチド、または中鎖脂肪酸チオエステラーゼ以外の脂肪酸チオエステラーゼである。

0151

第10の態様では、本発明は、以下を含むトランスジェニック植物またはその一部、好ましくは生育植物部分を提供する:
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチド、好ましくはWRI転写因子をコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)中鎖長(C8〜C14)を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるLPAATである、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)第3の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からのC8〜C14脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0152

好ましい実施形態では、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドと共に、植物の色素体からのC8〜C14脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第3の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較して、植物部分(好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分)でのMCFAの総含有量を増加させる。より好ましくは、第3の外因性ポリヌクレオチドにより提供される増加は、相乗作用的である。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0153

第10の態様の一実施形態では、トランスジェニック植物またはその一部は、次の1つ以上またはそのすべてを更に含む;
d)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与する更に別のポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
e)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
f)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
g)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
h)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0154

第10の態様の一実施形態では、転写因子はArabidopsis thaliana WRI1(配列番号21または22)ではなく、及び/または植物はN.benthamianaではない。

0155

第10の態様の一実施形態では、LPAATをコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号200に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも30%同一であるLPAATポリペプチドを含む。

0156

第10の態様の一実施形態では、好ましくは、少なくとも第1の外因性ポリヌクレオチドを発現するプロモーターを含めた、プロモーターのうちの1つ以上またはすべてが、植物の種子と比較して、生育部分において高レベルで発現する。

0157

第10の態様の実施形態では、中鎖長を有する脂肪酸は、少なくともミリスチン酸(C14:0)である。好ましい実施形態では、植物、好ましくは生育植物部分が、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、8%〜25%、8%〜20%、10%〜25%、11%〜25%、約15%〜25%、約20%〜25%(w/w乾重量)のミリスチン酸成分を含む。

0158

第6、第7、第8、第9及び第10の態様の実施形態では、植物は土壌で生長している、または土壌で生長した後、その植物部分、好ましくは生育植物部分を採取されたものであり、かつ、該植物部分が重量基準(乾重量%)で少なくとも8%、例えば8%〜75%、または8%〜30%等のTAGを含むことが好ましい。より好ましくは、TAGの含有量は、少なくとも10%、例えば10%〜75%、または10%〜30%である。これらのTAGレベルが、植物の開花前若しくは開花時、または植物成長の結実段階前に生育部分に存在していることが好ましい。これらの実施形態では、植物の葉内のTAG含有量と、茎内のTAG含有量との比率が1:1〜10:1であり、及び/またはこの比率が、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドを含み、第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、増加していることが好ましい。

0159

第6、第7、第8、第9及び第10の態様の実施形態では、植物またはその一部は、好ましくはDGATをコードする外因性ポリヌクレオチド及び内因性SDP1リパーゼの産生を下方調節する遺伝子改変を含む。好ましい実施形態では、植物またはその一部はPDATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び/またはNicotiana benthamiana植物以外の植物である。最も好ましくは、植物またはその一部の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または老化中に上方調節されるプロモーター等から発現する。

0160

第11の態様では、本発明は、生育部分を含む植物またはその生育部分を提供し、該生育部分は、少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、約18%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含み、該非極性脂質は少なくとも90%のトリアシルグリセロール(TAG)を含む。

0161

好ましい実施形態では、生育植物部分は、第7、第8、第9および第10の態様に記載した特性を特徴とする。植物は好ましくは18:3植物である。

0162

上記態様の一実施形態では、植物細胞または植物部分は、もう繁殖できないように、または生きた植物を発生させないように処理されており、すなわち死滅している。例えば、植物細胞または植物部分は、乾燥及び/または粉砕されている。

0163

第12の態様では、本発明は、生育部分を含む植物またはその生育部分を提供し、該生育部分は、少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、約18%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)のTAG含有量を有し、該非極性脂質は少なくとも90%のトリアシルグリセロール(TAG)を含む。植物は好ましくは18:3植物である。

0164

第13の態様では、本発明は、生育部分を含む植物またはその生育部分を提供し、該生育部分は、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含み、該非極性脂質は少なくとも90%のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、該植物は16:3植物またはその生育植物部分である。

0165

第14の態様では、本発明は、生育部分を含む植物またはその生育部分を提供し、該生育部分は、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)のTAG含有量を有し、該非極性脂質は少なくとも90%のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、該植物は16:3植物またはその生育植物部分である。

0166

一実施形態では、本発明(第2、第3、第4及び第5の態様を含む)の細胞は、以下の種または属の細胞であり、または本発明(第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13および第14の態様を含む)の植物またはその一部は、Acrocomia aculeata(モモヤシ)、Arabidopsis thaliana(シロイヌナズナ)、Aracinis hypogaea(ピーナッツ)、Astrocaryum murumuru(ムルムル)、Astrocaryum vulgare(ツクマ)、Attalea geraensis(Indaia−rateiro)、Attalea humilis(アメリカアブラヤシ)、Attalea oleifera(andaia)、Attalea phalerata(uricuri)、Attalea speciosa(ババス)、Avena sativa(オーツ)、Beta vulgaris(サトウダイコン)、Brassica sp.(例えば、Brassica carinata、Brassica juncea、Brassica napobrassica、Brassica napus(カノーラ))、Camelina sativa(アマナズナ)、Cannabis sativa(タイマ)、Carthamus tinctorius(ベニバナ)、Caryocar brasiliense(ペキー)、Cocos nucifera(ココナッツ)、Crambe abyssinica(アビニアケール)、Cucumis melo(メロン)、Elaeis guineensis(アフリカヤシ)、Glycine max(ダイズ)、Gossypium hirsutum(ワタ)、Helianthus sp.(例えばHelianthus annuus(ヒマワリ))、Hordeum vulgare(オオムギ)、Jatropha curcas(フィジックナッツ)、Joannesia princeps(arara nut−tree)、Lemna sp.(ウキクサ)(例えばLemna aequinoctialis、Lemna disperma、Lemna ecuadoriensis、Lemna gibba(イボウキクサ)、Lemna japonica、Lemna minor、Lemna minuta、Lemna obscura、Lemna paucicostata、Lemna perpusilla、Lemna tenera、Lemna trisulca、Lemna turionifera、Lemna valdiviana、Lemna yungensis)、Licania rigida(オイチシカ)、Linum usitatissimum(アマ)、Lupinus angustifolius(ルピナス)、Mauritia flexuosa(ミリチーヤシ)、Maximiliana maripa(イナジャヤシ)、Miscanthus sp.(例えば、Miscanthus x giganteus及びMiscanthus sinensis)、Nicotiana sp.(タバコ)(例えば、Nicotiana tabacumまたはNicotiana benthamiana)、Oenocarpus bacaba(bacaba−do−azeite)、Oenocarpus bataua(pataua)、Oenocarpus distichus(bacaba−de−leque)、Oryza sp.(イネ)(例えば、Oryza sativa及びOryza glaberrima)、Panicum virgatum(スイッチグラス)、Paraqueiba paraensis(mari)、Persea amencana(アボカド)、Pongamia pinnata(Indian beech)、Populus trichocarpa、Ricinus communis(トウゴマ)、Saccharum sp.(サトウキビ)、Sesamum indicum(ゴマ)、Solanum tuberosum(ジャガイモ)、Sorghum sp.(例えば、Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、Theobroma grandiforum(クプアス)、Trifolium sp.、Trithrinax brasiliensis(Brazilian needle palm)、Triticum sp.(コムギ)(例えば、Triticum aestivum)及びZea mays(トウモロコシ)である。

0167

第15の態様では、本発明は、少なくとも2cmの直径を有し、乾重量基準で少なくとも0.5%のTAG含有量及び/または少なくとも1%、好ましくは少なくとも1.5%または少なくとも2.0%の総脂肪酸含有量を有するジャガイモ植物またはその一部、好ましくは塊茎を提供する。ジャガイモ塊茎は、総脂肪酸含有量と総脂肪酸含有量のうちのTAG分画の両方において、遺伝子改変及び/または外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を欠く、相当するジャガイモ塊茎と比較して、モノ不飽和脂肪酸(MUFA)レベルの増加及び/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)レベルの減少、例えばオレイン酸レベルの増加及びALAレベルの減少を有する。好ましくは、遺伝子改変及び/または外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を欠く、相当するジャガイモ塊茎と比較して、塊茎の総脂肪酸含有量中のALAレベルが10%未満に減少する、及び/または総脂肪酸含有量中のオレイン酸レベルが少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%またはより好ましくは少なくとも15%に増加する。更にまた、一実施形態では、遺伝子改変及び/または外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を欠く、相当するジャガイモ塊茎と比較して、塊茎の総脂肪酸含有量中のパルミチン酸レベルが増加する、及び/または、塊茎の総脂肪酸含有量中のステアリン酸(18:0)レベルが減少する。一実施形態では、同一条件下で生育された野生型塊茎と比較して、塊茎のデンプン含有量は重量基準で約90%〜100%である。

0168

一実施形態では、本発明のジャガイモ植物またはその一部、好ましくは、塊茎は以下を含む:
a)塊茎内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、生長期のジャガイモ植物の塊茎内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0169

好ましい実施形態では、ジャガイモ塊茎は、次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変であって、該ポリペプチドがSDP1である遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0170

更なる実施形態では、塊茎の付加的な遺伝子改変は、本発明の細胞または植物に関連して定義された通りである。

0171

第16の態様では、本発明は、乾重量基準で少なくとも6%または少なくとも8%の総脂肪酸含有量を有し、及び/または乾重量基準で少なくとも2%または少なくとも3%の茎中のTAG含有量を有し、及び/または重量基準でTAG含有量が茎中で少なくとも50倍及び/または葉中で少なくとも100倍に増加している、モロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部、好ましくは茎または葉を提供する。各実施形態において、モロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部、好ましくは茎または葉は、本発明の細胞または植物またはそれらの一部に関連して定義された通りの特徴を有する。

0172

第17の態様では、本発明は、以下を含むモロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部、好ましくは茎または葉を提供する:
a)植物またはその一部での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、生長期の植物またはその一部でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0173

好ましくは、少なくとも第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、イネユビキチンプロモーター(Rubi3)以外のプロモーターである。より好ましくは、プロモーターは、ユビキチンプロモーターでもなく、他のいかなる構成的プロモーターでもない。好ましくは、第1および第2の外因性ポリヌクレオチドならびにそれぞれのプロモーターは、植物ゲノムに組み込まれる1つの遺伝子構築物に連結される。

0174

一実施形態では、同一条件下で生育された野生型塊サトウキビ茎と比較して、サトウキビの糖含有量は重量基準で約70%〜100%である。あるいは、糖含有量は50%〜70%である。

0175

一実施形態では、本発明のモロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部、好ましくは茎または葉は、以下を含む:
a)植物の茎(複数を含む)内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも第1の外因性ポリヌクレオチドは、植物生育期の葉よりも、茎(複数を含む)内で優先的に発現するプロモーターと作動可能に連結される。

0176

一実施形態では、本発明のモロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部は、次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0177

本発明のモロコシ若しくはサトウキビ植物またはそれらの一部は、好ましくは、総脂肪酸含有量と総脂肪酸含有量のうちのTAG分画の両方において、遺伝子改変及び/または外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、モノ不飽和脂肪酸(MUFA)レベルの増加及び/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)レベルの減少、例えばオレイン酸レベルの増加及びALAレベルの減少を有する。

0178

好ましくは、遺伝子改変及び/または外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、総脂肪酸含有量中のALAレベルが10%未満であり、及び/または総脂肪酸含有量中のオレイン酸レベルが少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%またはより好ましくは少なくとも15%である。

0179

更なる実施形態では、モロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部の付加的な遺伝子改変は、本発明の細胞または植物に関連して定義された通りである。

0180

第18の態様では、本発明は、相当する非トランスジェニック単子葉植物またはその一部と比較して、総脂肪酸含有量またはTAG含有量が重量基準で少なくとも5倍に増加する、トランスジェニック単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、穀物、茎、根または内胚乳を提供する。あるいは、内胚乳のTAG含有量が重量基準で少なくとも2.0%、好ましくは少なくとも3%、より好ましくは少なくとも4%または少なくとも5%であるトランスジェニック単子葉植物、または植物の一部、好ましくは葉、茎、根、穀物または内胚乳を提供する。一実施形態では、内胚乳は少なくとも2%のTAG含有量を有し、これは相当する非トランスジェニック内胚乳と比較して、少なくとも5倍に増加している。好ましくは、植物は完全稔性雌雄であり、その花粉は本質的に100%生存可能であり、その穀物は相当する野生型穀粒に対して70%〜100%の発芽率を有する。一実施形態では、トランスジェニック植物は、最初のトランスジェニック小麦植物に由来する少なくとも2世代目の子孫植物であり、好ましくは導入遺伝子に対してホモ接合性である。各実施形態において、単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、茎、穀物または内胚乳は、本発明の細胞または植物に関連して定義された通りの1つ以上の特徴を更に有する。

0181

第19の態様では、本発明は、以下を含む単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、穀物、茎または内胚乳を提供する:
a)植物またはその一部での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物生長期の植物またはその一部のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0182

好ましくは、少なくとも第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0183

一実施形態では、同一条件下で生育された植物から取得された野生型穀物と比較して、本発明の単子葉植物の穀物のデンプン含有量は重量基準で約70%〜100%である。上記2つの態様の好適な単子葉植物は、コムギ、イネ、モロコシ及びトウモロコシ(maize)である。

0184

一実施形態では、本発明の単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、穀物または内胚乳は、以下を含む:
a)植物の内胚乳内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも第1の外因性ポリヌクレオチドは、植物生育期の葉よりも、内胚乳内に高レベルで発現するプロモーターと作動可能に連結される。

0185

好ましい実施形態では、単子葉植物またはその一部は、次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。

0186

一実施形態では、単子葉植物は、a)、b)、d)及びe)の一方または両方、ならびに場合によりにc)、f)及びg)いずれかの特徴を含む。

0187

本発明の単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、穀物、茎または内胚乳は、総脂肪酸含有量と総脂肪酸含有量のうちのTAG分画の両方において、遺伝子改変及び/または外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、モノ不飽和脂肪酸(MUFA)レベルの増加及び/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)レベルの減少、例えばオレイン酸レベルの増加及びLA(18:2)レベルの減少等を有する。

0188

好ましくは、遺伝子改変及び/または外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、相当する野生型植物またはその一部に対して、穀物または内胚乳の総脂肪酸含有量中のリノール酸(LA、18:2)レベルが、少なくとも5%減少し、及び/または総脂肪酸含有量中のオレイン酸レベルが少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%またはより好ましくは少なくとも15%増加している。

0189

以降の各実施形態は、第15、第16、第17、第18及び第19態様それぞれの植物及びその一部にも当てはまる。

0190

一実施形態では、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0191

一実施形態では、植物またはその一部内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATである。

0192

一実施形態では、植物またはその一部内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0193

一実施形態では、植物またはその一部内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂肪の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、OBCポリペプチドはオレオシンである。あるいは、OBCポリペプチドはLDAPである。

0194

一実施形態では、植物またはその一部は、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、2種類の転写因子ポリペプチド、例えばWRI1とLEC2、またはWRI1とLEC1等をコードする2つの外因性ポリヌクレオチドを含む。

0195

本発明(第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18及び第19の態様を含む)の細胞、植物及びその一部の各実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、及び細胞内でのトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドはSDP1リパーゼである。

0196

本発明(第2、第3、第5、第6、第7、第8、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18及び第19の態様を含むが、第5及び第10の態様を除く)の細胞、植物及びその一部の各実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド、LEC2ポリペプチド、LEC1ポリペプチドまたはLEC1様ポリペプチドであり、1つ以上の非極性脂肪の生合成に関与するポリペプチドはDGATまたはPDATであり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはFATAまたはFATBポリペプチド、より好ましくはFATAポリペプチド、または中鎖脂肪酸チオエステラーゼ以外の脂肪酸チオエステラーゼである。

0197

本発明(第2、第3、第4,第5、第6、第7、第8、第9,第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18及び第19の態様を含む)の細胞、植物及びその一部の上記各実施形態では、植物またはその一部内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドは、少なくとも2種のポリペプチドの組み合わせ、好ましくはWRI1ポリペプチド及びLEC2ポリペプチドである。より好ましくは、前記少なくとも2種の転写因子ポリペプチドは、異なるプロモーターから発現する。最も好ましくは、前記少なくとも2種のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドは、細胞または植物ゲノムに組み込まれる単一の遺伝子構築物に連結される。

0198

上記各実施形態において、植物が双子葉植物であるとき、前記転写因子が単子葉植物転写因子であってもよい。反対に、植物が単子葉植物であるとき、前記転写因子が双子葉植物転写因子であってもよい。前記転写因子は、好ましくはA.thaliana WRI1(配列番号21または22)以外の転写因子である。

0199

上記各実施形態では、植物が、最初のトランスジェニックコムギ植物に由来する少なくとも2世代目の子孫植物であり、好ましくは導入遺伝子に対してホモ接合性であることが好ましい。

0200

更なる実施形態では、植物またはその一部の付加的な遺伝子改変は、本発明の細胞に関連して定義された通りである。

0201

一実施形態では、本発明(第6、第7、第8、第9,第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18及び第19の態様を含む)の植物またはその一部は、以下の特徴の1つ以上またはそのすべてを有する(該当する場合)、

0202

i)植物は、第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する部分と比較して、総脂肪酸の合成が増加しているか、または第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する部分と比較して、総脂肪酸の異化が減少しているか、またはその両方であり、それによって第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する部分と比較して、総脂肪酸のレベルが増加している部分、好ましくは生育部分を含む、

0203

ii)植物は、第1の外因性ポリヌクレオチドを有し、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する部分と比較して、TAG、DAGまたはMAG、好ましくはTAGの合成を触媒する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼの発現及び/または活性が増加している、部分、好ましくは生育部分を含む、

0204

iii)植物は、第1の外因性ポリヌクレオチドを有し、植物部分内の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く、相当する部分と比較して、色素体中のアシル−ACP及びG3Pからのリゾホスファチジン酸(LPA)の産生が減少している、部分、好ましくは生育部分を含む、

0205

iv)植物は、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する部分と比較して、総脂肪酸含有量及び/またはガラクト脂質の含有量のうち、C18:3脂肪酸に対するC16:3の比率が変化している、好ましくは比率が減少している部分、好ましくは生育部分を含む、

0206

v)植物の生育部分は、好ましくは開花前に、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含む、

0207

vi)植物の生育部分は、好ましくは開花前に、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)のTAG含有量を含む、

0208

vii)転写因子ポリペプチド(複数を含む)が、WRI1、LEC1、LEC1様、LEC2、BBM、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4、およびDof11、好ましくはWRI1、LEC1またはLEC2からなる群、あるいはMYB73、bZIP53、AGL15、MYB115、MYB118、TANMEI、WUS、GFR2a1、GFR2a2及びPHR1からなる群から選択される、

0209

viii)オレイン酸は、植物またはその一部中、総脂肪酸含有量の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)または少なくとも60%(mol%)、好ましくは約65%(mol%)または20%〜約65%を占める、

0210

ix)植物またはその一部、好ましくは生育部分内の非極性脂質では、水酸基、エポキシ基、シクロプロパン基、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、共役二重結合、分枝鎖(例えばメチル化若しくはヒドロキシル化された分枝鎖、またはそれらの2つ以上の組み合わせ)、または上述の基、結合若しくは分枝鎖のうち任意の2つ、3つ、4つ、5つまたは6つを含む、1種以上の脂肪酸レベルが増加している、

0211

x)植物またはその一部、好ましくは生育部分の非極性脂質は、エイコサジエン酸(EDA)、アラキドン酸(ARA)、ステアリドン酸(SDA)、エイコサトリエン酸(ETE)、エイコサテトラエン酸(ETA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)またはそれらの2つ以上の組み合わせから選択される1種以上の多価不飽和脂肪酸を含む、

0212

xi)部分が、生育植物部分、例えば葉または茎、またはその一部である、

0213

xii)1つ以上またはすべてのプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーター、好ましくは組織特異的プロモーター(例えば葉及び/または茎に特異的なプロモーター)、老化特異的プロモーター等の発生的調節プロモーター(例えば、SAG12プロモーター)、誘導性プロモーター、または概日リズム調節プロモーターから選択され、好ましくは転写因子ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターが構成的プロモーター以外である、

0214

xiii)植物またはその一部、好ましくは生育部分は、中鎖脂肪酸、好ましくはC12:0、C14:0または両方を総脂肪酸含有量のうち少なくとも5%のレベルで含む、総脂肪酸含有量を含み、及び場合により、中鎖長(C8〜C14)、好ましくはC12:0またはC14:0を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるLPAATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、

0215

xiv)植物またはその一部、好ましくは生育部分は、オレイン酸レベル及び/またはパルミチン酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、少なくとも2%増加している、及び/またはαリノレン酸(ALA)レベル及び/またはリノール酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、少なくとも2%低下している、総脂肪酸含有量を含む、

0216

xv)植物またはその一部、好ましくは生育部分内の非極性脂質に含まれる、ステロール、好ましくは遊離(非エステル型)ステロール、ステロイルエステル、ステロイルグリコシドの総量のレベルが外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する植物またはその一部の非極性脂質と比較して変化している、

0217

xvi)植物またはその一部の非極性脂質は、ワックス及び/またはワックスエステルを含む、

0218

xvii)植物またはその一部、好ましくは、生育部分が少なくとも約1000のこのような植物またはその一部の集団またはコレクションの1つのメンバーである、

0219

xviii)植物がサイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、該外因性ポリヌクレオチドが植物内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結されている、

0220

xix)植物またはその一部、好ましくは生育植物部分の1つ以上の非極性脂質のレベル及び/または非極性脂質の総含有量が、それぞれArabidposis thaliana WRI1(配列番号21)及びArabidposis thaliana DGAT1(配列番号1)をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む相当する植物またはその一部中よりも、重量基準で少なくとも2%多い、

0221

xx)外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する植物の多価不飽和脂肪酸(PUFA)総含有量と比較して、PUFAの総含有量が減少している、

0222

xxi)植物部分は、例えば、コムギ(Triticum aestivum)穀物またはトウモロコシ(Zea mays)穀粒、Nicotiana spp.の葉、または例えばBrassica sp.種子若しくはダイズ(Glycine max)種子等の高い総脂肪酸含有量を有するマメ科種子のように、内胚乳に高い総脂肪酸含有量を有する、ジャガイモ(Solanum tuberosum)塊茎、サトウダイコン(Beta vulgaris)の根、サトウキビ(Saccharum sp.)またはサトウモロコシ(Sorghum bicolor)の茎、単子葉植物の種子である、

0223

xxii)植物部分が種子である場合、相当する野生型種子と実質的に同等の速度で種子が生長する、あるいは土壌に植え付けされて実る植物の場合、その種子が相当する野生型種子と実質的に同等の速度で生長する、

0224

xxiii)植物は、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金茶藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類または不等毛藻類等の藻植物である。

0225

上記実施形態では、好適な植物部分は、少なくとも1cm2の表面積を有する葉部分または少なくとも1cmの長さを有する茎部分である。

0226

上記態様の一実施形態では、植物または植物部分は、もう繁殖できないように、または生きた植物を発生させないように処理されており、すなわち死滅している。例えば、植物または植物部分は、乾燥及び/または粉砕されている。

0227

上記実施形態では、植物部分の非極性脂質の総含有量は、WRI1及びDGATをコードしているが、上記の各態様で本明細書に記載されている他の外因性ポリヌクレオチド及び遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された相当する植物部分での非極性脂質の総含有量よりも、少なくとも3%多く、より好ましくは少なくとも5%多いことが好ましい。植物の茎または根に、その程度の増加が見られることがより好ましい。

0228

一実施形態では、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子改変、好ましくは、OBC若しくは脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、または植物内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変、より好ましくは、FATAチオエステラーゼ若しくはLDAPをコードする、または植物のSDP1 TAGリパーゼ等の内因性TAGリパーゼの発現を減少させる外因性ポリヌクレオチドを加えた結果、特に植物開花前の、更により詳細には植物の茎及び/または根の導入遺伝子WRI1及びDGATの対に追加されたとき、植物部分の非極性脂質の総含有量が相乗作用的に増加する。例えば、実施例8、11および15を参照されたい。好ましい実施形態では、植物の茎または根のTAG含有量の増加は、WRI1及びDGAT1をコードしているが、FATAチオエステラーゼ、LDAP、及び植物のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された、相当する部分と比較して、少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍である。最も好ましくは、少なくとも、第1の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。

0229

第6、第7、第8、第9,第10、第11、第12、第13、第14、第16、第18及び第19の態様の各実施形態では、植物またはその一部は、改変されていない植物またはその一部と比較して、生長及び生殖能力が大幅に減少しないという点で、表現型的に正常であることが好ましい。好ましくは、バイオマス生長速度、発芽率、貯蔵器官サイズ、種子サイズ及び/または実った種子の生存可能数が、同一条件下で生長した相当する野生型植物のそれの少なくとも90%を下回らない。一実施形態では、植物は相当する野生型植物と同程度に稔性の雌雄であり、及びその花粉(発生する場合)は野生型植物の花粉と同程度に生存可能、好ましくは約100%生存可能である。一実施形態では、植物は、相当する野生型植物の種子の発芽率と比較して、少なくとも90%の発芽率を有する種子を実らせる。一実施形態では、本発明の植物は、同一条件下で生長した相当する野生型植物の高さと比較して、少なくとも90%である植物の高さを有する。これらの各特徴の組み合わせが想定される。代替的実施形態では、本発明の植物は、同一条件下で生長した相当する野生型植物の高さと比較して、少なくとも60%〜90%である植物の高さを有する。一実施形態では、本発明の植物またはその一部、好ましくは植物の葉は、壊死の増加を呈さない。すなわち、壊死(生じる場合)の程度が、同一条件下で生長した及び植物成長の同段階にある、相当する野生型植物またはその一部によって生じるものと同様である。この特徴は特に、FATBチオエステラーゼ等の脂肪酸チオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む植物またはその一部に当てはまる。

0230

以降の各実施形態は、本発明(第6、第7、第8、第9,第10、第11、第12、第13、第14、第16、第18及び第19の態様を含む)の植物またはその一部、ならびに植物またはその一部の産生方法またはその使用方法に当てはまる。一実施形態では、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドは、植物またはその一部のTAG、DAGまたはモノアシルグリセロール(MAG)、好ましくは植物またはその一部でのTAGの生合成に関与する、例えばDGAT、PDAT、LPAAT、GPATまたはMGAT等の脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ、好ましくはDGATまたはPDATである。

0231

別の実施形態では、植物またはその一部のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドは、SDP1リパーゼ、Cgi58ポリペプチド、アシル−CoAオキシダーゼ(例えばACX1またはACX2)、またはPXA1ペルオキシソームATP結合カセットトランスポーター等の植物内での脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドであり、好ましくはSDP1リパーゼである。

0232

一実施形態では、油体被覆(OBC)ポリペプチドは、ポリオレオシン若しくはカレオシン等のオレオシン、または好ましくは脂肪滴会合タンパク質(LDAP)である。

0233

一実施形態では、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、FATAポリペプチドまたはFATBポリペプチド等のC16またはC18脂肪酸チオエステラーゼ、ABCA9ポリペプチド等の脂肪酸トランスポーター、または長鎖アシル−CoAシンテターゼ(LACS)である。

0234

一実施形態では、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドは、脂肪酸トランスポーターまたはそのサブユニット、好ましくはTGDポリペプチド、例えばTGD1ポリペプチド、TGD2ポリペプチド、TGD3ポリペプチドまたはTGD4ポリペプチド等である。

0235

一実施形態では、色素体のジアシルグリセロール(DAG)産生に関与するポリペプチドは、色素体GPAT、色素体LPAATまたは色素体PAPである。

0236

一実施形態では、本発明の植物またはその一部は、16:3植物またはその一部であり、次の1つ以上またはそのすべてを含む:
a)外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較して、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変。ここでの外因性ポリヌクレオチドは、植物またはその一部内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0237

代替的実施形態では、本発明の植物またはその一部は、18:3植物またはその一部である。

0238

一実施形態では、植物の生育部分は、植物開花前に少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、8%〜15%または9%〜12%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含む。

0239

一実施形態では、1つ以上またはすべての遺伝子改変は、遺伝子を部分的に、または完全に不活性化する内因性遺伝子の変異、例えばポイントミューテーション、挿入または欠失(または、その1つ以上の組み合わせ)等であり、好ましくは誘導型変異である。ポイントミューテーションは、遺伝子またはコードされたポリペプチドの活性を抑制する未成熟終止コドン、スプライス部位変異、フレームシフト変異またはアミノ酸置換変異であり得る。欠失は、遺伝子の転写されたエキソンまたはプロモーター内の1つ以上のヌクレオチドにあっても、複数のエキソンに跨がってもまたは渡ってもよく、遺伝子全体に欠失が及んでいてもよい。好ましくは、欠失は、ZF、TALENまたはCRISPR技術を使用して誘導される。代替的実施形態において、1つ以上またはすべての遺伝子改変は、内因性遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする外因性ポリヌクレオチドであり、ここでの外因性ポリヌクレオチドは、植物またはその一部内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。

0240

一実施形態では、WRI1をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の1つ以上を含む:
i)配列番号21〜75または205〜210のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号21〜75または205〜210のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下でi)及び/またはii)にハイブリダイズするヌクレオチド。好ましくは、WRI1ポリペプチドは、Arabidopsis thaliana WRI1(配列番号21または22)以外のWRI1ポリペプチドである。より好ましくは、WRI1ポリペプチドは、配列番号208に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも30%同一であるポリペプチドを含む。

0241

一実施形態では、非極性脂質の総含有量または1つ以上の非極性脂質、及び/または植物若しくはその一部のオレイン酸若しくはPUFAのレベルは、植物またはその生育部分から得た脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを用いた分析によって決定可能である。

0242

更なる実施形態において、植物部分が葉である場合、葉の非極性脂質の総含有量は、核磁気共鳴法(NMR)を用いた分析によって決定可能である。

0243

一実施形態では、植物またはその一部は、少なくとも約1000のこのような植物または部分の集団またはコレクションのメンバーである。

0244

更なる態様では、本発明は、各々が本発明の植物であり、耕地で生長する、少なくとも約1000の植物の集団を提供する。

0245

別の態様では、本発明は、各々が本発明の生育植物部分であり、該生育植物部分が耕地で生長した植物から採取された、少なくとも約1000の生育植物部分のコレクションを提供する。

0246

本発明の細胞、非ヒト生物、植物またはその一部の一実施形態では、細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはWRI1ポリペプチド転写因子であり、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはDGAT(例えばDGAT1またはDGAT2)またはPDATであり、及び細胞内でのトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドはSDP1リパーゼである。好ましい実施形態では、油体被覆(OBC)ポリペプチドはオレオシンであり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ(例えば、FATAまたはFATBチオエステラーゼ)であり、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはTGDポリペプチド、好ましくはTGD1ポリペプチドであり、色素体内のジアシルグリセロール(DAG)産生に関与するポリペプチドは、色素体GPATである。より好ましい実施形態では、細胞は生育植物部分にあり、植物の開花前の生育植物部分のTAG含有量は少なくとも8%(%乾重量)である。

0247

一実施形態では、植物、生育植物部分、非ヒト生物またはその一部、種子またはジャガイモ塊茎は、WRI1をコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、DGATまたはPDAT、好ましくはDGAT1をコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、SDP1ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するRNAをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及びオレオシンをコードする第4の外因性ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、生育植物部分、非ヒト生物またはその一部、種子またはジャガイモ塊茎は、以下の1つ以上またはそのすべての特徴を有する:

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