図面 (/)

技術 補体成分C4dに対して特異的な抗体、およびその使用

出願人 ユーロ-ディアグノスティカアーベー
発明者 ブロム,アンナオクロイ,マルシンセバスティアン
出願日 2015年9月8日 (5年3ヶ月経過) 出願番号 2017-513702
公開日 2017年9月28日 (3年2ヶ月経過) 公開番号 2017-528472
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード カットオフ装置 繰り返し期間 凍結融解サイクル数 符号順 フィッシュゼラチン 切断カス 副経路 コントロール対象
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年9月28日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (19)

課題・解決手段

本発明は、医薬診断および医療機器と、それらの使用の分野に関する。本発明は、補体系の成分に特異的に向けられ、補体活性化の古典的経路の改良された測定を可能にする抗体を提供する。特に、本発明は、補体活性化の古典的経路の活性化を検出するための手段および方法を提供する。特に、本発明は、試料中の補体成分C4dの存在を検出するための手段および方法を提供する。

概要

背景

補体系は、病原体生物体から排除するために、抗体、および食細胞能力補助、または「補完」する。補体系は、適応可能ではなく、個体の生存期間にわたって変化しない自然免疫系(1)と称される免疫系の一部である。しかしながら、補体系は、適応免疫系によって、迅速に形成され、作動することができる。

補体系は、血中に見出される多くのタンパク質であって、一般的に肝臓によって合成され、通常、不活性な前駆体(前駆タンパク質)として循環するタンパク質からなる。いくつかのトリガーの1つによって刺激されたとき、前記系におけるプロテアーゼは、特定のタンパク質を切断し、アナフィラトキシンを放出し、さらなる切断カスケードの増幅惹起する。この活性カスケードの最終結果は、反応の大量増幅、および細胞死滅させる膜攻撃複合体の活性化である。30以上のタンパク質、およびタンパク質フラグメントが、血中において高濃度で見出される可溶タンパク質、および細胞膜受容体を含む補体系を構成する。それらは、血清グロブリン画分の約5%を占め、オプソニンとして機能可能である。

補体系を構成するタンパク質は、主に肝細胞によって合成される。また、組織マクロファージ、血中単球、ならびに尿生殖器管、および消化管上皮細胞によって相当量が製造される。補体系は、古典的経路副経路、およびレクチン経路の、3つの生化学的経路によって惹起可能である(2)。

活性化の3つの経路は全て、タンパク質性C3コンバターゼ類似体と、膜攻撃形態をもたらす一般的な終末経路とを生じる。古典的補体経路は、典型的に、活性化のために抗原抗体複合体免疫複合体)を必要とするが、副経路、およびマンノース結合レクチン経路は、抗体の存在なしに、それぞれ自然なC3加水分解、または炭水化物によって活性化することができる。全ての3つの経路において、C3コンバターゼは、補体C3を切断、および活性化し、C3aおよびC3bを生じ、さらなる切断、および活性化事象のカスケードをもたらす。

古典的経路は、C1複合体の活性化によって惹起される。C1複合体は、1分子のC1q、2分子のC1rおよび2分子のC1sからなるか、またはC1qr2s2からなる。C1複合体は、C1qが、抗原複合化した、IgMまたはIgGに結合したときに活性化される。単一のIgMは、前記経路を惹起することができるが、IgGは、複数必要である。このことは、C1qが病原体の表面に直接に結合したときに生じる。そのような結合は、C1q分子における立体構造変化をもたらし、2つのC1r分子の活性化をもたらす。C1rは、セリンプロテアーゼである。活性化されたC1rは、C1sを切断する(別のセリンプロテアーゼ)。C1r2s2成分は、C4と、C2とに分かれ、C4a、C4b、C2a、およびC2bを生じる。C4b、およびC2aは、結合し、C3をC3aおよびC3bに切断することを促進する古典的経路C3コンバターゼ(C4b2a複合体)を形成する。C3bは、後にC4b2a(C3コンバターゼ)に加わり、C5コンバターゼ(C4b2a3b複合体)を形成する。

古典的経路の活性化の間に形成されたC4bは、続いてセリンプロテアーゼ因子Iによって迅速に分解され、当該セリンプロテアーゼ因子Iは、C4b結合タンパク質などの共因子の存在下において、古典的補体経路の活性化によってのみ現れる、C4b分解の最終生成物であるC4dを生じる。C4dは、したがって、in vivo、およびin vitroにおける古典的補体活性化のための優れたマーカである。近年、全身液中のC4dは、肺がん診断および予後マーカとして記載された(3)。C4dは、全身エリテマトーデスSLE)(4)、および抗体媒介移植片拒絶(5)のマーカとして広く使用されている。C4dの大部分は、古典的補体経路を最初に活性化した細胞の表面に結合したままであるが、ある部分は、放出され、血中において検出可能である。C4d形成のスキームは、図1に示される。

いくつかの疾患の原因となる、C4dの役割、および古典的経路活性化を調査、および理解するために、C4dに対して特異的な試薬、特に抗体が求められている。本願は、その要求について取り組むものである。

概要

本発明は、医薬診断および医療機器と、それらの使用の分野に関する。本発明は、補体系の成分に特異的に向けられ、補体活性化の古典的経路の改良された測定を可能にする抗体を提供する。特に、本発明は、補体活性化の古典的経路の活性化を検出するための手段および方法を提供する。特に、本発明は、試料中の補体成分C4dの存在を検出するための手段および方法を提供する。

目的

本発明は、補体系の成分に特異的に向けられた抗体であって、古典的補体経路の活性化の改良測定を可能にする抗体を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

補体成分C4dと特異的に反応し、補体成分C4bまたはC4と反応しない抗体であって、アミノ酸配列VTSSTGR−COOHからなるエピトープを含むペプチドに反応し、アミノ酸配列NVTLSSTGRNGFK−COOHを含むペプチドに反応しないことを特徴とする抗体。

請求項2

モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項1に記載の抗体。

請求項3

ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項1に記載の抗体。

請求項4

マウス抗体ラット抗体、またはウサギ抗体であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。

請求項5

動物が、実質的にアミノ酸配列SSTGR−COOHからなるペプチドによって免疫されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体を産生する方法。

請求項6

請求項5に従った方法によって取得可能であることを特徴とする抗体。

請求項7

試料中の補体成分C4dの検出のためのinvitro方法であって、当該試料を、請求項1〜4または6のいずれか1項に従った抗体に接触させ、当該抗体とC4dとの間の結合が検出されることを特徴とする方法。

請求項8

前記試料は、血液試料血清試料血漿試料滑液試料、または液状試料であることを特徴とする請求項7に記載の方法。

請求項9

前記試料は、熱不活性化されることを特徴とする請求項7または8に記載の方法。

請求項10

ELISARIAEIA、および免疫組織化学からなる群から選択されることを特徴とする請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。

請求項11

SLE、抗体媒介移植片拒絶関節リウマチ、強皮病、乾癬性関節炎強直性脊椎炎血管炎腎炎抗リン脂質症候群シェーグレン症候群筋炎肺がん、および血液腫瘍からなる群から選択される疾患の、診断または予後のためのinvitro方法であって、請求項1〜4または6のいずれか1項に従った抗体を、個体に由来する試料に接触させ、当該試料が、所定の参照値に比較して、高いレベルの補体成分C4dを含む場合、前記個体が、前記疾患を罹患するか、または発達させる高いリスクを有すると結論付けることを特徴とする方法。

請求項12

個体における疾患活動性監視するためのinvitro方法であって、前記疾患は、SLE、血管炎、および抗体媒介移植片拒絶からなる群から選択され、請求項1〜4または6のいずれか1項に係る抗体を、前記個体に由来する試料に接触させ、当該試料中に存在するC4dのレベルが経時的に監視されることを特徴とする方法。

請求項13

個体における疾患の処置の効率を決定するためのinvitro方法であって、前記疾患が、肺がん、SLE、血管炎、および抗体媒介移植片拒絶からなる群から選択され、請求項1〜4または6のいずれか1項に従った抗体を、処置の前後に個体から取得された試料に接触させ、処置後に取得された試料が、処置前に取得された試料中のC4dレベルに比べて、減少または低下したC4dレベルを有する場合、前記個体が、前記処置に反応すると結論付けることを特徴とする方法。

請求項14

固体支持体固定化された請求項1〜4または6のいずれか1項に従った抗体と、免疫複合体の検出のための試薬とを含むことを特徴とする補体成分C4dの検出のためのキット

請求項15

全身エリテマトーデスの個体における疾患活動性の再燃予測または診断するためのinvitro方法であって、請求項1〜4または6のいずれか1項に従った抗体が、前記個体に由来する試料と接触させられることを特徴とする方法。

技術分野

0001

本発明は、医療診断法、および他の医療器具、ならびにそれらの使用の分野に属する。より詳細には、本発明は、補体系の成分に特異的に向けられた抗体であって、古典的補体経路活性化の改良測定を可能にする抗体を提供する。さらに詳細には、本発明は、古典的補体経路の活性化を検出するための、手段および方法を提供する。さらに、本発明は、生物学的試料における補体成分C4dの存在を測定するための、手段および方法を提供する。

背景技術

0002

補体系は、病原体生物体から排除するために、抗体、および食細胞能力補助、または「補完」する。補体系は、適応可能ではなく、個体の生存期間にわたって変化しない自然免疫系(1)と称される免疫系の一部である。しかしながら、補体系は、適応免疫系によって、迅速に形成され、作動することができる。

0003

補体系は、血中に見出される多くのタンパク質であって、一般的に肝臓によって合成され、通常、不活性な前駆体(前駆タンパク質)として循環するタンパク質からなる。いくつかのトリガーの1つによって刺激されたとき、前記系におけるプロテアーゼは、特定のタンパク質を切断し、アナフィラトキシンを放出し、さらなる切断カスケードの増幅惹起する。この活性カスケードの最終結果は、反応の大量増幅、および細胞死滅させる膜攻撃複合体の活性化である。30以上のタンパク質、およびタンパク質フラグメントが、血中において高濃度で見出される可溶タンパク質、および細胞膜受容体を含む補体系を構成する。それらは、血清グロブリン画分の約5%を占め、オプソニンとして機能可能である。

0004

補体系を構成するタンパク質は、主に肝細胞によって合成される。また、組織マクロファージ、血中単球、ならびに尿生殖器管、および消化管上皮細胞によって相当量が製造される。補体系は、古典的経路副経路、およびレクチン経路の、3つの生化学的経路によって惹起可能である(2)。

0005

活性化の3つの経路は全て、タンパク質性C3コンバターゼ類似体と、膜攻撃形態をもたらす一般的な終末経路とを生じる。古典的補体経路は、典型的に、活性化のために抗原抗体複合体免疫複合体)を必要とするが、副経路、およびマンノース結合レクチン経路は、抗体の存在なしに、それぞれ自然なC3加水分解、または炭水化物によって活性化することができる。全ての3つの経路において、C3コンバターゼは、補体C3を切断、および活性化し、C3aおよびC3bを生じ、さらなる切断、および活性化事象のカスケードをもたらす。

0006

古典的経路は、C1複合体の活性化によって惹起される。C1複合体は、1分子のC1q、2分子のC1rおよび2分子のC1sからなるか、またはC1qr2s2からなる。C1複合体は、C1qが、抗原複合化した、IgMまたはIgGに結合したときに活性化される。単一のIgMは、前記経路を惹起することができるが、IgGは、複数必要である。このことは、C1qが病原体の表面に直接に結合したときに生じる。そのような結合は、C1q分子における立体構造変化をもたらし、2つのC1r分子の活性化をもたらす。C1rは、セリンプロテアーゼである。活性化されたC1rは、C1sを切断する(別のセリンプロテアーゼ)。C1r2s2成分は、C4と、C2とに分かれ、C4a、C4b、C2a、およびC2bを生じる。C4b、およびC2aは、結合し、C3をC3aおよびC3bに切断することを促進する古典的経路C3コンバターゼ(C4b2a複合体)を形成する。C3bは、後にC4b2a(C3コンバターゼ)に加わり、C5コンバターゼ(C4b2a3b複合体)を形成する。

0007

古典的経路の活性化の間に形成されたC4bは、続いてセリンプロテアーゼ因子Iによって迅速に分解され、当該セリンプロテアーゼ因子Iは、C4b結合タンパク質などの共因子の存在下において、古典的補体経路の活性化によってのみ現れる、C4b分解の最終生成物であるC4dを生じる。C4dは、したがって、in vivo、およびin vitroにおける古典的補体活性化のための優れたマーカである。近年、全身液中のC4dは、肺がん診断および予後マーカとして記載された(3)。C4dは、全身エリテマトーデスSLE)(4)、および抗体媒介移植片拒絶(5)のマーカとして広く使用されている。C4dの大部分は、古典的補体経路を最初に活性化した細胞の表面に結合したままであるが、ある部分は、放出され、血中において検出可能である。C4d形成のスキームは、図1に示される。

0008

いくつかの疾患の原因となる、C4dの役割、および古典的経路活性化を調査、および理解するために、C4dに対して特異的な試薬、特に抗体が求められている。本願は、その要求について取り組むものである。

0009

本発明は、補体成分C4dに特異的に反応するが、補体成分C4bまたはC4には反応しない抗体であって、アミノ酸配列VTSSTGR−COOHからなるエピトープを含むペプチドに反応し、アミノ酸配列NVTLSSTGRNGFK−COOHを含むペプチドに反応しないエピトープに関する。

0010

本発明は、そのような抗体を作製する方法であって、実質的にアミノ酸配列SSTGR−COOHからなるペプチドが、抗原として使用される方法を提供する。

0011

また、本発明は、試料中の補体成分C4dの検出方法であって、当該試料を本明細書に記載されたように抗体に接触させ、抗体とC4dとの間の結合が検出される検出方法を提供する。

0012

また、本発明は、肺がん、SLE、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択される疾患の、診断または予後のための方法であって、本明細書に記載されたような抗体を、個体に由来する試料に接触させ、当該試料が、コントロール対象の試料と比較して、補体成分C4dの高いレベルを含む場合、前記個体が、前記疾患を、罹患または発症する高いリスクを有すると結論付ける方法を提供する。

0013

また、本発明は、疾患活動性監視するための方法であって、疾患が、疾患活性の再燃によって特徴付けられる方法を提供する。そのような疾患は、SLE、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択されてもよく、本明細書に記載されたような抗体を、個体に由来する試料に接触させ、当該試料中に存在するC4dレベルが経時的に監視される。

0014

また、本発明は、疾患の処置の効率を決定するための方法を提供する。特に、疾患は、肺がん、SLE、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択される。そのような方法において、本明細書に記載されたような抗体を、処置の前後に個体から取得された試料に接触させ、処置後に取得された試料が、処置前に取得された試料におけるC4dレベルと比べて減少または低下したC4dレベルを有する場合、個体が処置に対して反応すると結論付けられる。

実施例

0015

C4dに反応する抗体は、当該分野において公知であり、市販されている。しかしながら、C4dの存在についての診断試薬として有用であるためには、抗体が、補体活性化の結果として生じた遊離のC4dに特異的であることが不可避であり、このことは、当該抗体が、C4dのみを認識するが、C4bまたはC4を認識しないことを意味する。C4dは、C4bおよびC4の断片であるので、このことは、簡単な問題ではない。

0016

活性化された補体タンパク質が、それらの親分子に存在しない特定の構造的エピトープを示すことが結論付けられた(6〜8)。そのようなエピトープは、多くの場合、ネオエピトープと表わされる。A251抗体などの、C4dにおけるネオエピトープに対する抗体は、Quidel社(12544 High Bluff Drive, Suite 200、サンディエゴ、カルフォニア、米国)から市販されており、Quidel Specialty Products社によって販売されている市販のMicroVue(商標)C4dEIAキット基礎である。Quidel C4d MicroVueELISAは、血清または血漿におけるC4d断片の測定のための試験として、国際補体学会によって推奨されるアッセイである(9)。このアッセイは、捕捉抗体として抗C4dモノクローナル抗体A251に基づくものであり、検出抗体としてヤギポリクローナル抗体C4dを採用している。我々は、C4dに特異的に反応するA251抗体を試験し、当該抗体がC4およびC4bを認識することを見出した(実施例7、図2)。

0017

C4dに対する抗体の他の代表的な例は、ヒト血漿から精製されたC4dに対して産生されたAb167093抗体(クローンLP69)である。この抗体は、Abcam社から市販されている(330 Cambridge Science Park、ケンブリッジ、CB4 0FL、英国)。我々は、C4dに特異的に向けられた抗体を試験し、当該抗体がC4およびC4bに交差反応することを明らかにした(実施例7、図3)。したがって、ヒト血漿から精製されたC4dは、C4d特異的抗体を生成するために適したソースではないと考えられる。

0018

C4d特異的抗体を産生する他の手法は、抗原としてC4dの内部配列に由来する合成ペプチドの使用に依拠する。このグループの代表的な例は、ウサギモノクローナル抗体Ab136921、クローンA24-Tであり、Abcam社から市販されている。我々は、C4dに特異的に向けられたAb136921抗体を試験した。この抗体も、C4およびC4bに交差反応するようである(実施例7、図4)。

0019

C4dに特異的に反応する他の抗体は、参考文献No.20(Aliら)に記載されたウサギポリクローナル抗体12〜5000である。この抗体は、American Research products社から得られ、C4dに特異的に向けて試験された。この抗体も、C4およびC4bに交差反応するようである(実施例7、図16)。

0020

したがって、C4dに由来する内部ペプチドも、C4d特異的抗体を得るために好適な抗原として使用することができないと考えられる。

0021

疑わしいC4d特異的抗体のさらなる種類は、C4dのC末端半分に由来するペプチドに対して産生された抗体である。我々は、そのような抗体の3つの代表例を試験した。Abcam社から市販のウサギモノクローナル抗体183311、クローンSP91も、C4d対して特異的でないことが見出された。なぜなら、この抗体は、C4とC4bとに反応するからである(図5)。

0022

我々は、C4dに由来するC末端ペプチドで免疫されたウサギに由来するポリクローナル抗体を試験した。この抗体(Abcam社から市販のAb58781)は、C4dに特異的ではない。なぜなら、この抗体は、C4とC4bとに反応するからである(図17)。

0023

また、我々は、C4dに由来するC末端ペプチドで免疫されたウサギに由来する別のポリクローナル抗体を試験した。この抗体(CPAMD2、カタログ番号AP15376PU-S、Acris社から市販)は、C4dに特異的ではない。なぜなら、この抗体は、C4とC4bとに反応するからである(図18)。これらの結果は、C4dに由来するC末端ペプチドによる免疫化が、C4bおよび/またはC4に交差反応しない、C4dに特異的な抗体を得るための効果的な戦略ではないことも示している。

0024

C4dに対して真に特異的な抗体を得るために、我々は、グリシンシステインスペーサに付着された、C4dのN末端、およびC末端配列に由来する5アミノ酸に対応するペプチドでウサギを免疫した(ペプチドあたりウサギ2匹)。このことは、実施例4に詳述される。免疫化に使用された2つのペプチドの配列は、
N末端 C4d部分:NH2−TLEIPG−GGC(配列番号1)
C末端 C4d部分:CGG−SSTGR−COOH(配列番号2)であった。

0025

太い字体で示されたアミノ酸は、C4dアミノ酸配列の一部であり、グリシン残基、およびシステイン残基は、スペーサとして使用される。ウサギ♯1および♯2は、配列番号1に係るペプチドで免疫された。ウサギ♯3および♯4は、配列番号2に係るペプチドで免疫された。免疫化および採血は、Agrisera AB社(スウェーデン)によって行われ、集められた抗血清は、上記で使用されたような同一のアッセイにおいて、C4、C4b、およびC4dに対する反応性についてELISAで試験された。

0026

配列SSTGR−COOHを含むC末端ペプチドによって免疫された、ウサギ♯3および♯4の両方は、C4dに特異的な抗体を産生した。それらは、C4dに等しく良好に反応し、C4またはC4bに反応しなかった(ウサギ♯3に由来する抗体のみが図6に示されている)。C末端ペプチドCGGSSTGR−COOH(配列番号2)で免疫された、ウサギ♯3および♯4に由来する2つの血清は、同一の特異性を有するようであった。本明細書に記載された実験は、ウサギ♯3に由来する抗体で全て行われた。ウサギ♯4に由来する抗体が使用されたとき、それらは、同一の結果をもたらした。ウサギ♯3に由来する抗体は、さらに、本明細書において、BLOK C4d抗体として表わされた。配列NH2−TLEIPGを含むN末端ペプチドで免疫された2匹のウサギ(♯1および♯2)に由来する抗体は、C4、C4b、またはC4dに反応せず、廃棄された。

0027

BLOK C4dによって認識されるエピトープは、Cys−NVTLSSTGR−COOHペプチド(配列番号3)に対するBLOK C4dの反応性と、Cys−NVTLSSTGRNGFK−COOHペプチド(配列番号4)に対する反応性の欠如とによって示されるように、C4dの最終C末端に置かれた。

0028

配列番号3は、遊離のカルボキシル基を有するC4dの最終C末端を表し、一方、配列番号4は、C4dおよびC4cのC末端の間の結合を表す(図1を参照)。したがって、BLOK C4d抗体は、C4dに特異的なエピトープであって、その前駆体C4bまたはC4に存在しない、C4dの最終C末端に存在するエピトープを認識すると結論付けられる。

0029

上述された市販の抗C4d抗体は、配列番号3および配列番号4に係るペプチドについてそれらの反応性を試験された。市販の抗体はいずれも、配列番号3または配列番号4に係るペプチドに反応しなかった。このことは、図7に図示される。

0030

本発明は、したがって、アミノ酸配列NVTLSSTGR−COOHからなるエピトープを含むペプチドに特異的に反応するが、アミノ酸配列NVTLSSTGRNGFK−COOHを含むペプチドに反応しない抗体についての一態様に関する。そのような抗体は、C4dに特異的に反応し、C4またはC4bに反応しない。

0031

表現「アミノ酸配列NVTLSSTGR−COOHからなるエピトープを含むペプチドに特異的に反応するが、アミノ酸配列NVTLSSTGRNGFK−COOHを含むペプチドに反応しない」は、抗体が、アミノ酸SSTGRと遊離のC末端アルギニン残基(R−COOHとして示された)とを含むC4dのC末端におけるエピトープに特異的に反応することを示すために、本明細書において使用される。さらに、アミノ酸配列NVTLSSTGR−COOHからなるエピトープを含むペプチドに特異的に反応するが、4つのC末端アミノ酸(NGFK)の余分のストレッチによってのみ異なる同一のペプチド、すなわち、アミノ酸配列NVTLSSTGRNGFK−COOHを含む同一のペプチドに反応しない。

0032

さらに異なる用語において、本発明に係る抗体は、ペプチドNVTLSSTGR−COOHに含まれるエピトープに反応するが、NVTLSSGRNGFK−COOHに反応しない抗体として記載されてもよい。

0033

別の態様において、本発明は、補体成分C4dに特異的に反応し、補体成分C4bに反応しない抗体であって、アミノ酸配列NVTLSSTGR−COOHからなるエピトープを含むペプチドに反応し、アミノ酸配列NVTLSSTGRNGFK−COOHを含むペプチドに反応しない抗体に関する。

0034

そのような抗体は、当該技術分野において知られた従来の免疫化法を用いて作製されてもよい。好ましい実施形態において、そのような抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、それらの標的抗原に結合する高いアビティおよび高いアフィニティについて知られている。別の好ましい実施形態において、本発明に係る抗体は、マウスモノクローナル抗体ラットモノクローナル抗体、またはウサギモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体であってもよい。そのようなモノクローナル抗体は、無制限の供給で製造することができるのに、抗体の品質を保つという利点を有する。

0035

本発明に係る抗体は、当該技術分野において知られた従来法によって得ることができ、実質的にアミノ酸配列SSTGR−COOHからなるペプチドが免疫原として使用される。言い換えれば、本発明は、上述されたような抗体を産生する方法であって、実質的にアミノ酸配列SSTGR−COOHからなるペプチドが免疫原として使用される方法に関する。本発明の他の態様は、したがって、そのような方法によって得ることができる抗体に関する。

0036

産生された抗体は、したがって、従来技術の抗体に対して顕著な利点を有し、本明細書に記載されたような予期せぬ特性を示す。

0037

A251抗体が捕捉抗体として使用されているQuidelMicroVue(商標) C4dEIAキット(カタログ番号 A008)は、血清または血漿におけるC4d断片の測定用の試験として国際補体学会によって推奨されている(6)。我々は、このアッセイが、多くの欠点および欠陥を抱えることを見出した。第1に、何度も凍結融解された試料で行われたとき、一貫性のない結果をもたらす。我々は、本明細書において、12回凍結融解された2つの試料(♯1および♯8)を用いて得られた結果を示す。これらの試料は、凍結融解サイクルの数が増加するとともに増加するC4dレベルを示した(図8)。これらと同じ試料が、BLOK C4d抗体が捕捉抗体として使用されたサンドイッチアッセイにおいて分析されたとき、結果は、一貫しており、凍結融解サイクル数の増加とともに変化することはなかった(図9)。

0038

市販のQuidelMicroVue(商標)C4dEIAキットの別の欠陥は、熱不活性化された血清を使用することができないことである。正常ヒト血清(NHS)が熱不活性化の前後で試験されたとき、Quidelアッセイは、非常に多くの偽陽性反応を生じたが、一方、BLOK C4d抗体を用いるサンドイッチアッセイでは、生じなかった(図10)。

0039

また、図10に示されるデータは、BLOK C4d抗体を採用するアッセイが、非常に高い、従って良好な信号対雑音比を有するが、一方、QuidelMicroVue(商標)アッセイは、信号対雑音比10をもたらし(高標準物質/低標準物質)、捕捉抗体としてBLOK C4dを採用するサンドイッチELISAアッセイは、同一の高標準物質および低標準物質が使用されたとき、信号対雑音比300をもたらした。

0040

本発明に係る抗体は、したがって、C4dの検出のための改良アッセイの製造を可能にする。また、本発明は、したがって、試料中の補体成分C4dのin vitro検出方法であって、当該試料を、上述のように抗体に接触させ、抗体とC4dとの間の結合が検出される検出方法に関する。

0041

有利な実施形態において、本発明は、上述のような方法であって、試料が、血液試料血清試料血漿試料滑液試料、または液体試料である方法に関する。本発明に従った方法は、臨床研究に由来する保存試料を用いる場合にはよくあることであるが、試料を、複数回にわたって熱不活性化または融解するとき、特に良好な結果をもたらすことができる。

0042

本発明に従った抗体は、多くの免疫学的アッセイフォーマットにおいて使用可能である。ELISA、RIA、EIA、および免疫組織化学におけるその使用が特に好ましい。

0043

さらに、我々は、リツキシマブを用いる処置を行われた白血病患者における古典的補体経路の活性化の評価を試みた。リツキシマブは、CD20を保有するがん細胞に結合したとき、C1複合体に結合し、古典的経路を直接に活性化する。

0044

我々は、リツキシマブの注入の前後に得られた試料中のC4dのレベルを測定した。また、我々は、古典的経路の活性化のさらなる下流マーカである終末補体複合体(TCC)のレベルを測定した。

0045

TCCは、以下のように生じる。C3コンバターゼは、C3bを生じるC3を活性化し、C3bは、続いて、その特異性を変化するC3コンバターゼに結合し、C5コンバターゼとなる。この酵素複合体は、C5をC5bに活性化し、C6、C7、C8、およびC9と相互作用して、細胞膜入り細胞死をもたらすTCCを形成する。C5b−9複合体のいくらかは、溶液中に残り、ELISAによって測定可能である(10)。

0046

リツキシマブなどの分子が古典的経路を活性化するとき、当業者は、生成された、C4d(経路の初期)およびTCC(経路の最後)の間の相関を予期することができるであろう。

0047

血漿試料は、ストックホルムのカロリスカ大学病院からの、抗CD20mAb(リツキシマブ(商標))で処置された、非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病(CLL)患者から得られた。試料は、リツキシマブ未処置の患者からのみ集められた。我々は、リツキシマブ注入の直前および直後に集められた11人の患者に由来する試料を得、BLOK C4d抗体を採用する本発明に従ったC4dELISAにおいて、およびQuidel社のC4dMicroVue(商標)アッセイにおいてそれらを試験した。リツキシマブ処置の前後における、試料中のC4dレベルの増加は、両方のアッセイについて測定され、終末補体複合体(TCC)のレベルと比較された。

0048

図11および図12は、それぞれ2つのC4dELISAにおいて測定されたようにC4dの増加が示され、TCC ELISAを用いて得られた結果に対してプロットされた。 我々は、本発明に従ったC4d ELISAにおいて得られたデータが、TCCアッセイとよく相関し(スペアマンr=0.88,p=0.0007,図11)、一方、Quidelアッセイを用いて得られたC4dデータは、TCCデータと相関しなかった(スペアマン r=−0.29,p=0.38,図12)。

0049

我々は、本発明に従った抗体および方法は、従来技術の抗体および方法よりも生物学的な試料においてC4dを検出するために適していると結論付ける。

0050

補体成分C4dは、最近、SLE、抗体媒介移植片拒絶、関節リウマチ、血管炎、腎炎抗リン脂質症候群強皮症シェーグレン症候群筋炎、肺がん、および血液腫瘍などの多くの疾患の診断および予後マーカとして記載された。

0051

全身エリテマトーデスは、複雑な病因を有し、多臓器関与する慢性自己免疫疾患である。補体の清掃機能は、感染しやすいので、SLEの病状が補体系における欠陥に関係するとの証拠が存在する。(Pickering et al., 2000)。他方、本体が、SLEの経過の間に処分されない自己抗原は、補体活性化の潜在能力を保持しており、それによって疾患を悪化させる(Leffler et al., 2012)。

0052

SLEは、再燃と名付けられた悪化した臨床症状の繰り返し期間と、寛解と称される疾患度が低下した期間とによって特徴付けられる。SLEについての根治的治療は存在しないので、治療的介入の目的は、再燃症状を和らげることによって臓器損傷を最小化することである。補体C3タンパク質および補体C4タンパク質の総レベルの測定を含む、バイオマーカの大規模アレイは、SLEを診断し、監視するために使用されるが、それらは、再燃の予測において信頼性がない。

0053

我々は、したがって、本発明に従った抗体および方法がSLEの再燃を予測可能であるか否かを検討し、SLE患者が前記疾患の再燃を経験したか否かを、実際に予測し、正確に決定することが可能であることを見出した。これらの実験は、実施例12に記載されている。

0054

本発明は、したがって、請求項1〜4、または6のいずれか1項に従った抗体が、個体に由来する試料に接触させられる、全身エリテマトーデスの個体の臨床状態を監視するためのin vitro方法に関する。そのような監視は、疾患活動性における再燃を、予測または診断することを含んでもよい。

0055

本発明者らは、本発明に従った抗体が、C4dについて、より正確で、特異的なアッセイを可能にし、本発明に従った抗体は、SLE、抗体媒介移植片拒絶、関節リウマチ、強皮病、乾癬性関節炎強直性脊椎炎、血管炎、腎炎、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群、筋炎、肺がん、および血液腫瘍からなる群から選択された疾患の、診断または予後のための方法において有利に使用されてもよく、本発明に従った抗体を、個体に由来する試料に接触させ、当該試料が、所定の参照値と比較して、補体成分C4dの高いレベルを含む場合、個体が、前記疾患に罹患するか、または発症する高いリスクを有すると結論付けることを確立した。当業者は、たとえば、コントロール対象の試料に由来する参照値を得るための様々な方法を十分に把握している。

0056

また、本発明は、疾患活動性を監視するための方法であって、疾患が疾患活動性の再燃によって特徴付けられる方法を提供する。そのような疾患は、SLE、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択されてもよく、本明細書に記載されたような抗体を、個体に由来する試料に接触させ、試料中に存在するC4dのレベルが、経時的に監視される。

0057

また、本発明は、疾患の処置の効率を決定するための方法を提供する。特に、疾患は、肺がん、血液腫瘍、SLE、血管炎、および抗体媒介性移植片拒絶からなる群から選択される。処置の効率の決定は、様々な方法で行われてもよい。たとえば、血液腫瘍のための処置は、腫瘍細胞が、補体によって死滅するように、作動機構として補体を使用する。したがって、薬剤に対する臨床応答は、補体活性化と、結果的により高いC4dとに付随する。上述されたような、多くの他の疾患において、高レベルのC4dは、病気自発的な補体活性化の印であり、処置は、標的における補体活性化の除去を後にもたらす、病原性因子の除去を目的とする。そのような方法においては、本明細書に記載されたような抗体を、処置の前後に個体から取得された試料に接触させ、処置後に取得された試料が、処置前に取得された試料におけるC4dレベルに比べて、C4dの減少または低下したレベルを有する場合、個体が処置に反応すると結論付けられる。

図面の簡単な説明

0058

C4cおよびC4dへの補体成分C4bの処理。
固定化された補体成分C4、C4b、およびC4dに対するマウスモノクローナル抗体A251(Quidel社)の反応性。
固定化された補体成分C4、C4b、およびC4dに対するマウスモノクローナル抗体LP69(Abcam社)の反応性。
固定化された補体成分C4、C4b、およびC4dに対するウサギモノクローナル抗体A24-T(Abcam社)の反応性。
固定化された補体成分C4、C4b、およびC4dに対するウサギモノクローナル抗体SP91(Abcam社)の反応性。
固定化された補体成分C4、C4b、およびC4dに対する、C4dのC末端エピトープSSTGR−COOHを含むペプチドを用いて免疫されたウサギ♯3に由来する血漿の反応性。ウサギ♯4に由来する血清は、同一の結果をもたらし、血清♯3および♯4は、抗体BLOK C4dを形成するために組み合わせられた。
C4dに含まれるペプチドNVTSSTGR−COOHに対するBLOK C4d抗体の特異的反応と、C4bにおいてのみ生じるペプチドNVTSSTGRNGFKに対する反応性の欠如とを示すグラフである。
凍結融解サイクル数の増加とともにQuidelMicroVue(商標)C4dELISAの反応性を示すグラフである。
凍結/融解サイクル数の増加とともに、BLOK C4d抗体を採用するサンドイッチELISAの反応性を示すグラフである。
QuidelMicroVue(商標)アッセイと、BLOK C4d抗体を採用するサンドイッチELISAとの結果の比較を示すグラフである。低標準物質、および高標準物質(それぞれ0および242ng/ml)と、正常ヒト血清(NHS)と、熱不活性化された正常ヒト血清とが試験された。
リツキシマブ(商標)で処置された11人の白血病患者における、BLOK C4d ELISAの結果と、TCC ELISAの結果との相関を示すグラフである。
リツキシマブ(商標)で処置された11人の白血病患者における、QuidelMicroVue(商標)C4d ELISAの結果と、TCC ELISAの結果との相関を示すグラフである。
I因子阻害抗体の量の増加(0、0.5、1、および2マイクロリットル)にともなう、IgG活性化された正常ヒト血清に対するBLOK C4d抗体の反応性を示すグラフである。
SLEの患者に由来する血清におけるC4dレベルが、疾患の寛解および再燃時において取得された。同一の血清におけるC3およびC4のレベルが、比較のために示される。
同一の患者から得られる再燃−寛解の組み合わせによる、SLEの患者に由来する血清におけるC4dレベルの比較。
固定化された補体成分C4、C4b、およびC4dに対するAmerican research products社のウサギポリクローナル抗体12〜5000の反応性。
固定化された補体成分C4、C4b、およびC4dに対するAbcam社のウサギポリクローナル抗体58781の反応性。
固定化された補体成分C4、C4b、およびC4dに対するAcris社のウサギポリクローナル抗体15376カタログ番号AP15376PU-Sの反応性。
選択された患者の血清に対するBLOKC4d抗体の反応性。

0059

実施例1:C4dタンパク質の作製
200マイクログラム/mlのC4b溶液(Complement Technology社4801 Troup Hwy, Suite 701、タイラー、テキサス、75703 米国、カタログ番号A108、ロット#5C)を、20マイクログラム/mlの血漿精製I因子と混合し(11)、pH8.0 Tris緩衝生理食塩水で50マイクロリットルの最終体積の、400マイクログラム/mlの血漿精製C4BP(12)は、37℃で5時間にわたってインキュベートされた。

0060

実施例2:C4と、その断片C4bおよびC4dとを用いるELISA
マイクロタイタープレート(Maxisorp、Nunc社)を室温(RT)で一晩コートした。実施例1に記載されたように取得した、PBS中の5マイクログラム/mlのC4溶液(Complement technology社、カタログ番号A105、ロット#22a)、またはC4b(Complement Technology社、カタログ番号A108、ロット#5C)、もしくはC4d調製物の50マイクロリットルを各ウェルに添加した。マイクロタイタープレートは、続いて洗浄緩衝液(50mM Tris pH8、150mM NaCl、0.1% Tween 20)で洗浄され、RTで2時間にわたって、200マイクロリットルのブロッキング緩衝液(洗浄緩衝液中の1%BSA)を用いてブロッキングされた。50マイクロリットルのブロッキング緩衝液中に1:1000で希釈された、血清または精製された抗体を、1時間にわたって添加し、RTでインキュベートし、続いて洗浄し、同じブロッキング緩衝液中に希釈された50マイクロリットルのヤギ抗ウサギ−HRP抗体(Dako社)を用いてインキュベートした。最終的な洗浄後、50マイクロリットルの標準OPDタブレット溶液(Dako社、製造者指示書に従って作製した)をウェルに添加し、十分な色が得られると直ちに0.5M H2SO4を用いて発色反応を停止した。吸光度は、マイクロプレートリーダ(Varian社)において490nmで測定された。

0061

実施例3:ウサギの免疫
我々は、グリシン/システインスペーサで伸長されたC4dのN末端およびC末端配列からの5アミノ酸に対応するペプチドを用いてウサギ(ペプチドあたりウサギ2匹)を免疫した。免疫に使用された2つのペプチドの配列は、N末端C4d部分:NH2−TLEIPGGGC(配列番号1)、およびC末端C4d部分:CGGSSTGR−COOH(配列番号2)であった。

0062

ペプチドは、Innovagen AB社(スウェーデン)によって、標準のF−moc化学を用いて合成された。ペプチドは、続いてキーホールリンペットヘモシアニンに結合された。免疫は、Agrisera AB社の標準的なプロトコールに従って行われた。簡潔には、ウサギは、t=0において、フロイント完全アジュバントFCA)中の200マイクログラムのペプチドを用いて免疫され、続いて、t=27日目において、フロイント不完全アジュバント(FIA)中の200マイクログラムのペプチドの2回の追加免疫を注入され、t=54およびt=81日目において、FIA中の100マイクログラムのペプチドの2回の追加免疫を注入された。動物は、t=92日において、採血され、屠殺された。C末端ペプチドを用いて免疫された2匹のウサギに由来する血清は、特異性の点で同様であり、BLOK C4d抗体として明細書において言及される。

0063

実施例4BLOK C4d抗体の特異性
我々は、C4dの形成が、I因子(ヒトI因子(♯1)に対するマウスモノクローナル抗体Quidel Corp社 米国)に対する抗体によって阻害された試料に対するその反応性を決定することによってBLOK C4dの特異性を確かめた。補体因子I(fI)は、補体系のタンパク質であり、モルモット血清において1966年に最初に単離され(14)、細胞に結合した、または液相のC3bおよびC4bを切断することによって補体活性化を制御する(15)。I因子が阻害されたとき、C4bに由来するC4dの形成は、阻害される。

0064

2マイクロリットルの正常ヒト血清は、0、0.5、1、および2マイクロリットルのI因子抗体(1、2mg/ml)と混合され、5分間上でインキュベートされた。2マイクロリットルの熱凝集IgG(10mg/ml)は、1mM CaおよびMgを含む25マイクロリットルのPBSと混合され、37℃で45分間にわたってインキュベートされた。混合物は、続いて40mMEDTAGVB緩衝液を用いて300マイクロリットルまで希釈された。50マイクロリットルのこの調製物は、実施例6に従って作製されたマイクロELISAプレートのウェル毎に使用された。

0065

試料のC4dレベルは、抗体を阻害するI因子の量の増加とともに減少することが観察された(図13)。

0066

我々は、BLOK C4d抗体が、C4dに特異的であると結論付けた。なぜなら、BLOK C4d抗体は、C4dを除く、古典的補体経路の全ての成分を含む試料に対して全く反応性を示さなかったからである。

0067

熱不活性化されたヒト血清を用いて行われたコントロール実験は、全くシグナルを示さなかったが、I因子に対する抗体が、等量のコントロール抗体(タンパク質Sに対するMK54)によって置き換えられた試料において100%のシグナルが得られた。

0068

実施例5試薬の作製
熱不活性化された正常ヒト血清(NHS)は、成分を不活性化するために56℃で60分間にわたってNHSをインキュベートすることによって作製された。

0069

熱凝集IgGは、PBS中の10mg/mlのIgG溶液(Immuno社、オーストリア)を63℃で30分間にわたって加熱することによって作製された。15.000×Gで5分間の遠心分離後、ペレットは、廃棄された。

0070

標準物質は、2マイクロリットルのNHSと2マイクロリットルの熱凝集IgG(10mg/ml)とを混合することによって作製され、1mM CaおよびMgを含むPBS緩衝液を用いて25マイクロリットルまで希釈され、37℃で1時間にわたってインキュベートされた。混合物は、続いて40mMEDTA−GVB(2.075mMベロナール緩衝液pH7.3、10mM EGTA、7mM MgCl2、0.083%ゼラチン、116mMグルコース、60mM NaCl)を用いて200マイクロリットルまで希釈された。50マイクロリットルのそのような試料は、ELISAウェル毎に入れられ、C4dの1任意単位(AU)を含むと規定されたが、この標準物質の連続希釈液は、標準曲線を満たした。緩衝液のみ(40mM EDTA−GVB)を、0値とした。

0071

実施例6 C4d捕捉アッセイ
Maxisorp96ウェルプレート(Nunc社)は、0.02%アジ化ナトリウムを含む0.1M炭酸塩緩衝液pH9.6中に10倍希釈された50マイクロリットルのBLOK C4d抗体を用いて一晩コートされた。マイクロタイタープレートは、37℃で1時間にわたって200マイクロリットルのブロッキング緩衝液(洗浄緩衝液中の3%フィッシュゼラチン(Nordic社))を用いてブロッキングされた。洗浄後、50マイクロリットルの試料が入れられ、37℃で1時間にわたってインキュベートされた。洗浄後、50マイクロリットルの検出抗体(抗C4dマウスモノクローナル、Quidel社、#A213、ブロッキング緩衝液中に1:1500で希釈された)は、後続の別の洗浄サイクルを適用され、50マイクロリットルのヤギ抗マウスHRP(Dako社)は、ブロッキング緩衝液中に1:1000で希釈された。50マイクロリットルの標準OPDタブレット溶液(Dako社、製造者の指示書に従って作製された)は、ウェルに添加され、発色反応は、十分な色が得られると、0.5M H2SO4を用いて停止された。吸光度は、マイクロプレートリーダにおいて490nmで測定された。コントロール実験は、実施例11に記載されたようにアフィニティ精製された抗体を用いて行われ、3.5マイクログラム/mlIgGの最終濃度まで希釈された。アフィニティ精製された抗体は、BLOK C4d抗体と同一の結果をもたらした。

0072

実施例7 市販の抗C4d抗体およびBLOK C4d抗体の反応性
本明細書において使用された市販の抗体は、Quidel社のA251、ロット番号910499、Abcam社のクローンLP69、製造番号ab167093、ロット番号GR126509-6、Abcam社のクローンA24-T、製造番号ab136921、ロット番号GR161597-2、Abcam社のクローンSP91、製造番号ab183311、ロット番号GR181800-1、American Research Products社のウサギポリクローナル抗C4d12-5000、ロット番号41200、Abcam社のウサギポリクローナル抗C4d 58781、ロット番号GR173176-3、およびAcris社のウサギポリクローナル抗C4d AbCPAMD2、カタログ番号AP15376PU-S、ロット番号130618MCであった。

0073

ELISAアッセイは、実施例2に詳述されたように準備され、実施された。全ての抗体は、1:50に希釈された抗体SP91と、製造者によって予め希釈された既製のAbcam社のウサギポリクローナル抗C4d 抗C4d 58781とを除いて、10マイクログラム/mlで試験された。

0074

ブロッキング緩衝液中に好適に希釈された抗体(50マイクロリットル)は、37℃で1時間にわたってインキュベートされ、洗浄後、50マイクロリットルの二次抗体(A24-T、SP91、およびBLOK C4dに対する1:1000に希釈されたDako社のヤギ抗ウサギHRP、またはLP69およびA251に対する1:1000に希釈されたDako社のヤギ抗マウスHRP)を用いて1時間にわたってインキュベートされた。最後の洗浄後、50マイクロリットルの標準OPDタブレット溶液(Dako社、製造者の指示書に従って作製された)は、ウェルに添加され、発色反応は、十分な色が得られると、0.5M H2SO4を用いて停止された。吸光度は、マイクロプレートリーダで490nmにおいて測定された。最終結果は、ネガティブコントロール読み取り値(一次Abが添加されないとき、490nmにおける測定値)を減算することによって計算された。結果は、図2図6、および図16図18に示される。

0075

実施例8ペプチドELISA
C末端C4d部分についてのELISAは、配列Cys−NVTLSSTGR−COOH(配列番号3)、またはCys−NVTLSSTGRNGFK(配列番号4)を有するペプチドを50マイクログラム/ml含む50マイクロリットルのPBSを用いて、Maxisorpプレート(Nunc社)を37℃で1時間にわたってコーティングすることによって作製された。

0076

マイクロタイタープレートは、続いて洗浄緩衝液(50mM Tris pH8、150mM NaCl、0.1% Tween 20)を用いて洗浄され、200マイクロリットルのブロッキング緩衝液(洗浄緩衝液中に1%BSA)を用いてRTで2時間にわたってブロックキングされた。ブロッキング緩衝液中に希釈された抗体(50マイクロリットル)は、37℃で1時間にわたってインキュベートされ、続いて洗浄され、50マイクロリットルの二次抗体(A24-T、SP91、およびBLOK C4dに対するDako社の1:1000希釈されたヤギ抗ウサギ−HRP、またはLP69およびA251に対する1:1000希釈されたDako社のヤギ抗マウスHRP)を用いて1時間インキュベートされた。最後の洗浄後、50マイクロリットルの標準OPDタブレット溶液(Dako社、製造者の指示書に従って作製された)は、ウェルに添加され、発色反応は、十分な色が得られれば、0.5M H2SO4を用いて停止された。吸光度は、マイクロプレートリーダにおいて490nmで測定された。最終結果は、ネガティブコントロール(一次Abが添加されないとき、490nmにおける測定値)についての読み取り値の減算によって計算された。

0077

実施例9白血病/リンパ腫患者群
非ホジキンリンパ腫、または慢性リンパ性白血病(CLL)の患者は、スウェーデン、ストックホルムのカロリンスカ大学病院にて診断され、Anders Osterborg教授によって扱われた。リツキシマブ処置(単一薬治療として、または化学療法計画ととともに)に認定された患者に由来するEDTA血漿試料は、標準的な薬用量(375mg/m2)の薬剤の第1注入の直後および直前に採取された。

0078

血漿試料のいくつかは、凍結融解サイクルを通じてC4dの読み取り値の安定性のために試験された。この目的のために、それらは、10マイクロリットルに分割され、続いて−80℃で凍結され、液体状態になるまでRTで融解された。凍結融解は、所望のサイクル数に従って繰り返された。

0079

実施例10 TCCアッセイ
TCCアッセイは、以前に記載されたように(13)、捕捉抗体として、抗C9−ネオエピトープ抗体、クローンae11、検出抗体として、ビオチン化抗C6モノクローナル抗体、クローン9C4を用いて実施された。0.02%のアジ化ナトリウムを含むPBS中に希釈されたウェルあたり100マイクロリットルの捕捉抗体を、Maxisorpプレート(Nunc社)にRTで一晩固定化した。二次抗体の検出は、ウェルあたり100マイクロリットルのストレプトアビジン−HRPコンジュゲート(R&D社、米国)を用いて実施され、その後、アッセイは、OPDタブレット(Dako社)を用いて開発され、490nmにおける吸光度が測定された。

0080

実施例11BLOK C4d抗体のアフィニティ精製
特異性および感受性の点で優れた結果が提供されたという事実があるものの、抗体は、本明細書に開示されたように、ペプチドを用いるアフィニティ精製によってさらに精製されてもよい。特に有利な方法は、以下の通りである。

0081

3mlのウサギ♯3に由来するBLOK C4d抗血清は、アフィニティクロマトグラフィーを用いてC4d特異的な抗体を精製するために使用された。Sulpholinkビーズ(10mlのビーズ、Thermo Scientific社)は、製造者のプロトコールに従って、12mgの配列番号3(GenScript社、米国)に従ったペプチドを用いてコンジュゲートされた。カラムは、PBS緩衝液を用いて平衡化され、抗血清試料が入れられた。PBSを用いる洗浄後、ペプチド結合画分は、0.1MグリシンpH2.5を用いて溶出され、直ちに1/10体積の1M Tris pH8.0を用いて中和された。溶出液の中和画分は、配列番号4に従ったペプチド(GenScript社、米国)にコンジュゲートされた別のSulpholinkカラムに入れられた。このカラムは、C4d−C4c境界エピトープ(もしあれば)に潜在的に結合可能であるので、C4dに特異的ではない抗体のネガティブ選別に使用される。未結合画分は、集められ、PBS緩衝液に対して透析され、10kDaのカットオフ装置(Vivaspin、米国)を用いて濃縮された。

0082

実施例12BLOK C4d抗体は、SLEの再燃を予測および診断する。
4つ以上のアメリカ関節リウマチ学会の分類基準(Tan et al., 1982)を満たす98人のSLE患者は、本試験に含まれる。患者に由来する血漿は、1984年〜2009年までスウェーデンのルンド大学のリウマチ科において集められた。2つの時点に由来する試料が選択された。1つの時点は、患者が最も高いSLE疾患活動性インデックス2000(SLEDAI-2K, Gladmann, D., et al., J. Rheumatol (2002) 29: 288-291)を有するときであり、これは、「再燃」と定義され、別の時点は、患者が経験を積んだ熟練医によって評価される最も低い疾患活動性を有するときであり、「寛解」と定義される。

0083

日常実験室分析によるデータセット(C3およびC4の測定値など)は、全ての試料について利用可能であった。77人の健常ドナーに由来する血漿試料は、コントロールとして含まれた。C4dレベルは、実施例6に記載されたようなBLOK抗体に基づくC4dELISAを用いて、患者とコントロールとにおいて測定された。Quidel C4d MicroVueキットの精製されたC4dの希釈液は、標準物質として使用された。

0084

全ての患者が分析に入れられたとき、総C3およびC4レベルにおける相違(p=0.063および0.2065、n.s.)とは対照的に、再燃および寛解のC4dレベルの間で高い有意差が検出可能であった(図14マンホイットニー検定tによって、p=0.0005、***)。

0085

ウィルコクソン符号順位検定(同一の患者から得られた再燃−寛解の対合が考慮された)が、同一のデータセットにおいて実施されたとき、再燃と寛解とのC4dレベルの間において高い有意差を検出可能であった(図15、p=<0.0001 ***)。これに対して、C3レベルは、寛解に比べて再燃の間にわずかに減少し、非常に低いレベルにおいて顕著になった(p=0.0275 *)。C4レベルは、全く有意差を示さなかった(p=0.1085、n.s.)。

0086

本発明者らは、分析が、全コホートについて、または個々の患者からの結果に組み合わせて実施されるとき、本発明に従ったC4d抗体および方法が、SLE再燃を寛解から顕著に(p<0.05)識別可能である改良アッセイをもたらすと結論付けた。

0087

実施例13BLOK C4d抗体は、関節リウマチ、強皮症、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎の患者を健常コントロールから識別する。
試料は、関節リウマチ、強皮症、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎に罹患した20人の個体から得られた。20人の健常な個人集団は、コントロールとして機能する。これらの血清は、本明細書に記載されたようにBLOK C4dELISAにおいて試験された。我々は、BLOK C4d抗体が、患者群を通常のコントロールから識別することができることを見出した(表1および図19)。

0088

参考文献
1. Janeway CAJ, Traves P, Walport M: Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. The Immune System in Health and Disease 2001, New York.
2. Walport MJ: Complement. First of two parts. The New England journal of medicine 2001, 344:1058-1066.
3. Ajona D, Pajares MJ, Corrales L, Perez-Gracia JL, Agorreta J, Lozano MD, Torre W, Massion PP, de-Torres JP, Jantus-Lewintre E, et al: Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. Journal of the National Cancer Ins titute 2013, 105:1385-1393.
4. Kalunian KC, Chatham WW, MassarottiEM, Reyes-Thomas J, Harris C, Furie RA, Chitkara P, Putterman C, Gross RL, Somers EC, et al: Measurement of cell-bound complement activation products enhances diagnostic performance in systemic lupus erythematosus. Arthritis and rheumatism 2012, 64:4040-4047.
5. Djamali A, Kaufman DB, Ellis TM, Zhong W, Matas A, Samaniego M: Diagnosis and management of antibody-mediated rejection: current status and novel approaches. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons 2014, 14:255-271.
6. Nuijens JH, Huijbregts CC, Eerenberg-Belmer AJ, Abbink JJ, Strack van Schijndel RJ, Felt-Bersma RJ, Thijs LG, Hack CE: Quantification of plasma factor XIIa-Cl(-)-inhibitor and kallikrein-Cl(-)-inhibitor complexes in sepsis. Blood 1988, 72:1841-1848.
7. Garred P, Mollnes TE, Lea T, Fischer E: Characterization of a monoclonal antibody MoAb bH6 reacting with a neoepitope of human C3 expressed on C3b, iC3b, and C3c. Scandinavian journal of immunology 1988, 27:319-327.
8. Mollnes TE, Lea T, Harboe M, Tschopp J: Monoclonal antibodies recognizing a neoantigen of poly(C9) detect the human terminal complement complex in tissue and plasma. Scandinavian journal of immunology 1985, 22:183-195.
9. Bergseth G, Ludviksen JK, Kirschfink M, Giclas PC, Nilsson B, Mollnes TE: An international serum standard for application in assays to detect human complement activation products. Molecular immunology 2013, 56:232-239.
10. Deppisch R, Schmitt V, Bommer J, HanschGM, Ritz E, Rauterberg EW: Fluid phase generation of terminal complement complex as a novel index of bioincompatibility. Kidney international 1990, 37:696-706.
11. Blom AM, Kask L, Dahlb臘k B: CCP1-4 of the C4b-binding protein a-chain are required for Factor I mediated cleavage of C3b. Mol Immunol 2003, 39:547-556.
12. Dahlb臘k B: Purification of human C4b-binding protein and formation of its complex with vitamin K-dependent protein S. Biochem J 1983, 209:847-856.
13. Mollnes TE, Redl H, Hogasen K, Bengtsson A, Garred P, Speilberg L, Lea T, Oppermann M, Gotze O, Schlag G: Complement activation in septic baboons detected by neoepitope-specific assays for C3b/iC3b/C3c, C5a and the terminal C5b-9 complement complex (TCC). Clinical and experimental immunology 1993, 91:295-300.
14. Nelson R, Jensen J, Gigli I, Tamura N (1966). "Methodsfor the separation, purification and measurement of nine components of hemolytic complement in guinea-pig serum". Immunochemistry 3 (2): 111-35
15. Lachmann P, M・ler-Eberhard H (1968). "The demonstration in human serum of "conglutinogen-activating factor" and its effect on the third component of complement". Journal of Immunology 100 (4): 691-8.
16. Leffler J., Martin M., Gullstrand B., Tyden H., Lood C., Truedsson L., Bengtsson A. A. and Blom A. M., 2012. Neutrophil extracellular traps that are not degraded in systemic lupus erythematosus activate complement exacerbating the disease. J Immunol 188, 3522-31.
17. Pickering M. C., Botto M., Taylor P. R., Lachmann P. J. and Walport M. J., 2000. Systemic lupus erythematosus, complement deficiency, and apoptosis. Advances in immunology 76, 227-324.
18. Tan E. M., Cohen A. S., Fries J. F., Masi A. T., McShane D. J., Rothfield N. F., Schaller J. G., Talal N. and Winchester R. J., 1982. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and rheumatism 25, 1271-7.
19. Gladmann D.D., Ibanez D. and Urowitz M.B., Systemic lupus erythematosus disease activity index 2000. J. Rheumatol., 2002 29(2): 288-291.
20. Ali, S.A. et al., Frequent expression of C4d in hepatic graft-versus-host disease: Potential clue for diagnosis and distinguishing acute and chronic form, Transplant Immunology, 23: 77-80 (2010).

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ