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課題・解決手段

本発明は、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞を含む患者の癌の治療に用いる細胞集団に関し、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞が、CD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+樹状細胞について枯渇していることを特徴とする。

概要

背景

序論
樹状細胞(DC)は、免疫応答の中心的な役割を担う。プロフェッショナル抗原提示細胞として、DCは、組織微小環境サンプリングし、病原体由来生成物および腫瘍細胞を含む死滅宿主細胞の両方を食菌する(Banchereau J、Steinman RM、Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998; 392:245−252 )。 DCは、ナイーブ腫瘍抗原特異的CD4+およびCD8+T細胞引き付け活性化する特異的な能力を有する。 DCベース免疫療法は、DCのこの特性を利用する:腫瘍抗原を有するDCを、T細胞を刺激し、腫瘍根絶を開始するために癌患者に注射する(FigdorCG, de Vries IJM, Lesterhuis WJ, Melief CJM. Dendritic cell immunotherapy: mappingthe way. Nature Medicine 2004; 10:475−480; Tacken PJ, de Vries IJM, Torensma R, Figdor CG. Dendritic−cell immunotherapy: from ex vivo loading to in vivo targeting. Nat.Rev.Immunol. 2007; 7:790−802)。

概要

本発明は、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞を含む患者の癌の治療に用いる細胞集団に関し、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞が、CD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+樹状細胞について枯渇していることを特徴とする。

目的

効果

実績

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請求項1

CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞が、CD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+樹状細胞について枯渇し、CD14+細胞の少なくとも75%が、患者のCD14+CD16−血液由来単球と比較して枯渇(減少)している、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞を含むかまたはそれからなる患者の癌の治療に用いる細胞集団

請求項2

前記細胞集団が、CD304(BDCA−4)である細胞をさらに含むかまたはそれからなる、請求項1に記載の細胞集団。

請求項3

前記細胞の少なくとも50%に腫瘍抗原または腫瘍ペプチド負荷されている、請求項1または2に記載の細胞集団。

請求項4

前記細胞が、特に癌治療を必要とする患者の血液由来の血液から精製される、請求項1〜3のいずれか一つに記載の細胞集団。

請求項5

前記癌が、固形癌または慢性骨髄性白血病などの血液癌である、請求項1〜4のいずれか一つに記載の細胞集団。

請求項6

前記固形癌がメラノーマまたは前立腺癌である、請求項5に記載の細胞集団。

請求項7

−患者の血液から以下を使用して請求項1〜3の樹状細胞を精製すること−CD1cに結合することができる抗体(BDCA−1)、−Bリンパ球(CD19またはCD20)に結合することができる抗体、および−CD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞に結合することができる抗体;および−得られた樹状細胞を腫瘍抗原または腫瘍ペプチドとインキュベートするステップを含む、患者の癌を治療するための細胞集団を作製するための方法。

請求項8

−CD304(BDCA−4)に結合する抗体を用いて樹状細胞を精製するステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。

請求項9

−精製された樹状細胞の成熟誘導することをさらに含む、請求項7または8に記載の方法。

請求項10

CD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞が、以下のマーカー:CD11bまたはCCR5のいずれかの存在によって特徴付けられる、請求項7〜9のいずれか一つに記載の方法。

請求項11

患者の癌を治療するための細胞集団を生成するための、特に請求項7〜10の方法における、以下を含むキットの使用−CD1cに結合する抗体(BDCA−1)、−単球上に発現されたマーカーに結合することができる抗体、−Bリンパ球、特にCD19またはCD20上で発現されるマーカーに結合することができる抗体、および、任意に、−形質細胞様樹状細胞に結合することができる抗体。

請求項12

前記単球マーカーが、CD14、CD11b、およびCCR5からなる群より選択される、請求項12に記載の使用。

請求項13

前記B細胞マーカーが、CD19およびCD20からなる群から選択される、請求項11または12に記載の使用。

請求項14

腫瘍抗原または腫瘍ペプチドをさらに含む、請求項11〜13のいずれか一つに記載の使用。

請求項15

癌に罹患している患者に請求項1〜6の細胞集団を投与することを含む、癌を治療する方法。

技術分野

0001

本発明は、特に患者の癌を治療する際に使用するための腫瘍抗原または腫瘍ペプチド負荷された骨髄性樹状細胞CD1c(BDCA−1)+を含む細胞集団に関する。

背景技術

0002

序論
樹状細胞(DC)は、免疫応答の中心的な役割を担う。プロフェッショナル抗原提示細胞として、DCは、組織微小環境サンプリングし、病原体由来生成物および腫瘍細胞を含む死滅宿主細胞の両方を食菌する(Banchereau J、Steinman RM、Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998; 392:245−252 )。 DCは、ナイーブ腫瘍抗原特異的CD4+およびCD8+T細胞引き付け活性化する特異的な能力を有する。 DCベース免疫療法は、DCのこの特性を利用する:腫瘍抗原を有するDCを、T細胞を刺激し、腫瘍根絶を開始するために癌患者に注射する(FigdorCG, de Vries IJM, Lesterhuis WJ, Melief CJM. Dendritic cell immunotherapy: mappingthe way. Nature Medicine 2004; 10:475−480; Tacken PJ, de Vries IJM, Torensma R, Figdor CG. Dendritic−cell immunotherapy: from ex vivo loading to in vivo targeting. Nat.Rev.Immunol. 2007; 7:790−802)。

先行技術

0003

Banchereau J、Steinman RM、Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998; 392:245−252
FigdorCG, de Vries IJM, Lesterhuis WJ, Melief CJM. Dendritic cell immunotherapy: mappingthe way. Nature Medicine 2004; 10:475−480; Tacken PJ, de Vries IJM, Torensma R, Figdor CG. Dendritic−cell immunotherapy: from ex vivo loading to in vivo targeting. Nat.Rev.Immunol. 2007; 7:790−802

発明が解決しようとする課題

0004

免疫療法のためのDCは、一般に、単球前駆体からin vitroで調製される。広範囲の培養期間(8〜9日)およびそれらをDCに分化させるために必要な化合物は、それらの免疫学的能力に悪影響を及ぼすことがある。

0005

したがって、当技術分野では、代替のDCベースの免疫療法アプローチが必要とされている。

課題を解決するための手段

0006

発明の簡単な説明
一実施形態例において、本発明は、特に、患者の癌を治療するための、25%以下のこれらのCD1c+/CD19−樹状細胞を含むか、または、それから成る細胞集団であり、25%以下のこれらのCD1c+/CD19−樹状細胞が、CD1c+/CD19−/CD14+細胞である、細胞集団に関する。

0007

前記細胞集団は、CD304(BDCA−4)である細胞をさらに含むかまたはそれからなることができる。

0008

一実施形態例においては、細胞の少なくとも50%に腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷される。

0009

細胞は、血液から、特に癌治療を必要とする患者の血液から精製することができる。癌は、慢性骨髄性白血病メラノーマまたは前立腺癌のような固形癌であり得る。

0010

他の態様では、本発明は、患者の癌を治療するための細胞集団を作製するためのキット、および患者の癌を治療するための細胞集団を産生するその使用に関する。そのようなキットは、以下の成分を含むか、またはそれらからなる:
−CD1cに結合することができる抗体(BDCA−1)、
−単球に、好ましくは抑制性DCに結合することができる抗体、
B細胞、特にCD19またはCD20に結合することができる抗体、および場合により
−CD304(BDCA−4)に結合することができる抗体。

0011

別の態様では、本発明は、癌を治療するための方法であって、
−上述したような細胞集団を癌に罹患している患者に投与すること、を含む方法に関する。

図面の簡単な説明

0012

BDCA1+CD14+細胞の割合は、癌患者において増加する。
卵巣癌腫のBDCA1+CD14+の割合が高い。
:異なる細胞サブセット表現型
BDCA1+CD14+集団は、トランスクリプトーム解析によって示されるように、独特サブセットである。
マウスにおける骨髄発生関与することが記載されている転写因子発現
マウスにおける骨髄発生に関与することが記載された成長因子受容体の発現。
BDCA1+CD14+集団は、多重分析によって示されるようにユニークなサブセットである。
BDCA1+CD14+細胞は、抗原取り込みにおいて非常に効率的である。
BDCA1+CD14+細胞は、TLRリガンドによる刺激の際に共刺激分子CD80をアップレギュレートする。
BDCA1+CD14+細胞は、固有炎症性サイトカインプロファイルを有する。
MLR
ナイーブT細胞の刺激能力。
BDCA1+CD14+DCは、TLR刺激に応答してPD−L1をアップレギュレートする。
PD−L1ブロッキングは、BDCA1+CD14+のT細胞刺激能力を増強する。
骨髄性DC免疫療法におけるBDCA1+CD14+細胞のより高い割合は、患者におけるより低い応答と相関する。
:BDCA1+CD14+DCは、KLH特異的CD4+T細胞の増殖を抑制する。
BDCA1+CD14+DCサプレッサーの能力は、オキサリプラチンによって阻害される。
BDCA1+CD14+DCはポリクローナルT細胞の増殖を抑制しない。
可能なソート手順。
濃縮したCD1c+CD19−細胞(CD14枯渇なし)。
本発明の組成物は、図10のR2(BDCA1+CD14+)で示される亜集団が集団の総細胞数の25%を超えないような(R1とR2が共に)「BDCA−1富化」細胞集団である。すなわち、本発明によれば、癌に罹患した患者に投与するための細胞集団を得るために、BDCA1+CD14+の画分を全細胞の25%未満に減少させる必要がある。

0013

発明の詳細な説明
ヒト末梢血において、自然循環するDCの二つの主な集団が区別され得る;CD1cの発現およびCD19(CD1c+(BDCA−1)CD19−)の発現の欠如を特徴とする骨髄性DC(mDC)、並びにCD304(CD304+(BDCA−4))の発現を特徴とする形質細胞様DC(pDCs)である。これらのサブタイプは、機能、局在、および表現型が異なる。mDCは主にリンパ節周辺ゾーンに移動するか、またはそこに存在し、細菌抗原および真菌抗原を認識し応答すると考えられている。一方、pDCは、主にリンパ節のT細胞領域に存在し、ウイルス抗原認識に特化しているようである(Liu YJ. Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate and adaptive immunity. Cell 2001;106:259−262)。mDCおよびpDCの両方は、遭遇する病原体に応じて、適切なT細胞応答を開始する能力を有する。

0014

本発明は、抗腫瘍DCワクチンおよびその製造ならびにその使用方法に関する。本発明者らは、DCマーカーCD1c(BDCA−1)および単球性マーカーCD14の同時発現のために異なる新規の血液骨髄細胞集団を同定した。このBDCA−1+CD14+集団は、抗原特異的免疫抑制を発揮する。BDCA−1+CD14+細胞はT細胞の弱い誘導因子である。したがって、癌患者におけるこの新規集団の標的化および/またはBDCA1+CD14+無細胞DCワクチンの調製は、抗腫瘍DCベースのワクチンの臨床効果を改善する。

0015

明細書中で使用される場合、用語「CD14+」は、先天性免疫系の成分であるCD14遺伝子を発現する細胞を示す。CD14タンパク質は、分子量55kDのタンパク質であり、グリコシルホスファチジルイノシトールテイルによって細胞膜に固定されている。一般に、CD14+という用語は、標識抗CD14抗体またはその断片、すなわちCD14高(high)細胞およびCD14低(low)細胞と接触した場合に染色され得るすべての細胞を含む。

0016

CD14高とは、標識された抗CD14抗体と接触すると明るく染色される細胞を指す。この発現レベルは、血液単球の主なサブセットを示し、全ての血液細胞最高レベルでCD14を発現するヒト末梢血からの古典的なCD14高CD16単球によって発現されるようなレベルに相当する(Ziegler−Heitbrock et al.,BLOD, 21OCTBER2010 VOLUME 116, NUMBER 16)。CD14低は、標識された抗CD14抗体と接触した場合あまり明るくない染色細胞を示す。 CD14低細胞は、ヒト末梢血からの非古典的CD14+CD16高単球によって発現されるようなレベルに対応し、CD14高細胞およびCD14細胞の間の発現レベルを示す(Ziegler−Heitbrock et al.,BLOOD, 21 OCTOBER 2010 VOLUME 116, NUMBER 16)。

0017

一実施形態において、本発明は、細胞集団は、CD1c(BDCA−1)+/CD19−細胞を含むか、それから成り、患者の癌を治療における使用のための細胞集団に関する。用語「〜成る」は、全細胞の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、好ましくは、集団の全CD1c+細胞の95%、98%または99%、または99.9%がCD19であればよい。

0018

本発明によれば、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞(mDC)はCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞に関して枯渇(減少)(depleted)したものである。好ましくは、CD14+細胞の少なくとも75%が枯渇している。

0019

すなわち、一態様において、本発明は、これら25%からそれより少ない(≦25%の)CD1c+/CD19−樹状細胞がCD1c+/CD19−/CD14+細胞である、CD1c+/CD19−樹状細胞を含むか、又は、それから成る細胞集団であり;CD1c+/CD19−樹状細胞は25%またはそれより少ない(≦25%の)CD1c+/CD19−/CD14+細胞を含むように、CD1c+/CD19−/CD14+細胞についてCD1c+/CD19−樹状細胞が枯渇している。

0020

好ましい実施形態において、CD1c+/CD19−樹状細胞の細胞集団は、20%未満の、好ましくは15%未満の、10%未満の、5%未満の、または最も好ましくは1%未満のCD1c+/CD19−/CD14+細胞を含む。

0021

またCD1c+/CD19−/CD14+細胞はFceR1+であるので、このマーカーをCD1c+/CD19−/CD14+細胞からそれらの細胞を区別するために使用されることができる。

0022

他の実施形態において、本発明は、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞がCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞、好ましくはCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14高のために枯渇しており、細胞集団がCD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞を含むか、またはそれから成る、患者の癌を治療における使用のための細胞集団に関する。他の実施形態において、CD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞、好ましくはCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14高のためのCD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞の枯渇は、25%かそれ未満のCD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞がCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞である細胞集団を導くことになる。

0023

他の実施形態例においては、CD1c(BDCA−1)は、CD19 +休眠Bリンパ球サブ集団上でも発現するmDCとは別個のものである。そのため、CD1c(BDCA−1)のmDCの単離のために、例えば、mDCの濃縮の前にマーカーCD19および/またはCD20を使用することにより、B細胞を枯渇(減少)させる。CD1c(BDCA−1)+/CD19−mDCのサブセットの単離のために、mDCの濃縮の前にマーカーCD14を使用することにより、CD14+細胞を枯渇(減少)させる。B細胞およびCD14+細胞の枯渇の後、(例えば、CD1cに結合することができる抗体を使用して)mDCは標識されることができ、好ましくは、(CD1c抗体が直接的に磁気ビーズに結合される場合、またはビオチン結合CD1c抗体および抗ビオチン抗体を使用して磁気ビーズに間接的に結合される場合において)好ましくは時期的に標識されることができ、そしてCD1c(BDCA−1)の特異的な発現により濃縮される。

0024

CD14−であるCD1c+/CD19−細胞は、CD11bおよびCCR5low/でもある。対照的に、抗原特異的免疫抑制を示すCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞は、分子マーカーCD14、CD11、またはCCR5を発現し、「抑制性樹状細胞(DC)」と示される。

0025

本発明の一実施形態において、細胞集団はCD1c+/CD19樹状細胞を含むか、またはそれから成り、ここでCD1c+/CD19樹状細胞の25%またはそれ未満(≦25%)は、CD304(BDCA−4)+(形質細胞DC)である細胞と共にあるCD1c+/CD19−/CD14+細胞である。

0026

CD1c(BDCA−1)+mDCは、以下であることを特徴とする:CD11b−、CCR5low/−、CD19−、CD11c−high、CD123−low、CD4+、CD45RO+、CD2+、CD16−、CD141(BDCA−3)low、CD303(BDCA−2)−、CD304(BDCA−4)−。これらは系統マーカー(CD3、CD16、CD19、CD20)の発現を欠損させ、CD13およびCD33およびFcレセプター、例えば、CD32、またはCD64、またはFcεRIなどの骨髄マーカーを発現する。

0027

本発明の一実施形態において、mDCは、癌の治療を必要とする患者の血液から精製される。これは重大な副作用を引き起こすことなく患者に投与することができる自系のmDCの細胞集団の生成を可能とする。当該一実施形態において当技術分野で知られているアフェレーシス療法を行うことである。本発明の一実施形態では、mDCは活性化され、患者への投与前に腫瘍抗原が負荷される。

0028

pDCをとmDCがお互いの機能を補完し、最適な免疫応答のために相乗的に作用する。生体外において(ex vivo)で異化単球由来DCでのワクチン接種と比較して、mDCとpDCの同時投与によって、より強力かつ長期にわたる抗腫瘍免疫応答をしばしば生じさせる。CD1c+/CD19樹状細胞を含むか、またはそれから成る細胞集団と共にmDCとpDCの同時投与による癌患者のワクチン接種であり、ここで当該CD1c+/CD19樹状細胞の25%またはそれ未満(≦25%)がCD1c+/CD19−/CD14+細胞であることは、本発明の好ましい実施形態を構成する。

0029

したがって、本発明の細胞組成物は、一実施形態において、癌の治療を必要とする患者の血液から精製された、(CD304(BDCA−4)+である)pDCをさらに含む。したがって、pDCは投与される患者の自系のものである。

0030

他の実施形態において、本発明の細胞組成物は、癌の治療を必要とする患者の血液から精製された(自系)、(特に培養前に単離された細胞中の)CD303(BDCA−2)+細胞をさらに含む。

0031

CD304(BDCA−4/ニューロピリン1)+pDCはCD11c、CD123high、CD4+、CD45RA+、CD303(BDCA−2)+、CD141(BDCA−3)dim、CD1c(BDCA−1)-およびCD2-として特徴付けられる。これらは、これらは系統マーカー(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56)の発現を欠損させ、CD13およびCD33のような骨髄マーカーだけでなくFcεRIも発現しないが、これらはTLR7およびTLR9陽性である。

0032

本発明の細胞集団は、薬学的組成物として調製することができる。この目的のため、本発明の細胞組成物は、例えば、生理的食塩水により懸濁させる。

0033

本発明の一実施形態において、細胞集団の樹状細胞には腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷される。他の実施形態において、細胞集団の樹状細胞にはHLA腫瘍抗原またはペプチドが負荷される。

0034

本発明は特定の種類の腫瘍に限定されない。代わりに、本発明の細胞集団は、いずれかの種類の癌を治療するために使用することができる。本発明の一実施形態において、細胞集団は、患者におけるメラノーマ、卵巣癌または前立腺癌の治療に使用される。

0035

治療する腫瘍としては、例えば、Staging System of The American Joint Committee on Cancerによる全てステージ、特に、ステージIIIとIVのメラノーマである。また、治療する腫瘍としては、例えば、Staging System of The American Joint Committee on Cancerによる全てステージ、特に、ステージIIIとIVの前立腺癌である。

0036

一つの態様において、本発明は、CD1c(BDCA−1)+/CD19−細胞からなる樹状細胞の細胞集団に関し、ここで、当該CD1c+/CD19細胞の細胞集団が25%未満のCD1c+/CD19−/CD14+細胞を含む。好ましい実施形態例において、細胞集団は、全CD1c+/CD19樹状細胞集団の20%未満、好ましくは15%未満、10%未満、5%未満、または、最も好ましくは、1%未満のCD1c+/CD19−/CD14+細胞を含む。

0037

方法としては、樹状細胞を精製し、腫瘍抗原またはペプチドと共にそれらをインキュベートする工程を含む、患者における癌を治療するための細胞集団の製造方法である。

0038

この方法は、以下のステップを含むことができる:
−癌の処置または治療を必要とする患者(自己)の血液から樹状細胞(CD1c(BDCA−1)+/CD19/CD14細胞)を精製する。これにより、自系のmDCの細胞集団が得らる。この精製は、すなわち、以下の抗体を使用して行われる、すなわち
−CD1c+細胞を濃縮するためのCD1c(BDCA−1)に結合することができる少なくとも第一の抗体、
−Bリンパ球に結合できる少なくとも第2の抗体、および
−抑制性DCに結合することができる少なくとも第三の抗体。

0039

磁気細胞分離(MACS)を行う場合、最初のB細胞及びCD14+細胞を枯渇(depleted)させ;その後、mDCはCD1c抗体と濃縮される。フロー分離のために、ステップの順序は無関係である。

0040

Bリンパ球に結合することができる少なくとも第2の抗体は、一実施形態例においては、CD19またはCD20に結合することができる抗体からなる群から選択される。

0041

抑制性DCに結合することができる少なくとも第三の抗体は、一実施形態では、CD14、CD11b、またはCCR5に結合することができる抗体からなる群から選択される。マーカーCD14、CD11b、およびCCR5は、抑制性DC上に共発現される。従って、3つのマーカーのいずれかを用いて抑制性DCの枯渇(depletion)を行うことができる。一実施形態では、CD14、CD11b、およびCCR5からなる群からの3つのマーカーの2つまたはすべてを用いて枯渇が行われる。

0042

この方法において、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞は、好ましくはCD14+細胞の少なくとも75%が枯渇するように、CD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD1+細胞について枯渇される。特定の実施形態では、CD14+細胞の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%が枯渇する。あるいは、この方法において、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞は、CD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞について、これらの25%以下(≦25%)CD1c+/CD19−樹状細胞はCD1c+/CD19−/CD14+細胞である。

0043

例えば、mDCは、アフェレーシス生成物から直接単離することができる。このために、CD1c(BDCA−1)+に結合することができる一次抗体を使用することができ;この抗体は、二次抗体によって結合され得るビオチンまたは他の分子とコンジュゲート(結合)することができる。例えば、ビーズ、特に磁気ビーズ(MicroBead)などの固体支持体を、ビオチンに結合することができる二次抗体に結合させるか、または一次CD1cにカップリングさせる分子に結合することができる二次抗体に結合させる。二次抗ビオチン抗体と結合された磁気ビーズの使用は、ビオチン化抗CD1c(BDCA−1)抗体に結合したmDCの磁気分離を可能にする。一実施形態では、CD1c(BDCA−1)−抗体は、ビーズ、特に磁気ビーズ(MicroBead)のような固体支持体に直接的に結合することができる。別の実施形態では、完全閉鎖免疫磁気CliniMACS単離システム(Miltenyi Biotec GmbH)を用いてmDCを単離する。

0044

ここで使用される抗体は、インタクト免疫グロブリン分子、ならびに例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fv、CDR領域パラトープまたはそれらの部分などのフラグメント、またはそれらの断片、ペプチドおよび誘導体、または、抗原もしくはエピトープに結合することができる抗体の全ての部分およびペプチドを意味し、ポリクローナル抗体モノクローナル抗体キメラ抗体、完全ヒト化抗体組換え抗体、およびトランスジェニック動物によって産生されるモノクローナル抗体、またはそれらの断片、ペプチドおよび誘導体を含む。抗体は、それが分子と特異的に反応して分子が抗体に結合することができる場合、分子に「結合することができる」と示される。多数の抗体がヒトにおける使用のために承認されている。例えば、Walden、9 Nat. Med. 269(2004)またはhttp://www.immunologylink.com/FDA−app−Abs.htmlを参照のこと。

0045

この方法はさらに、上記の精製工程を行った後に得られた樹状細胞を腫瘍抗原またはペプチドと共にインキュベートする工程をさらに含む。

0046

例えば、CD19に結合することができる抗体、例えば、磁気ビーズ結合−抗CD19抗体を用いてB細胞を最初に枯渇させる。CD14+細胞は、CD14マイクロビーズ(すなわち、CD14に結合することができる抗体、ここで抗体はマイクロビーズ、特に磁気的に分類可能なマイクロビーズに結合する)を用いて枯渇させる。その後、CD1c(BDCA−1)+mDCが積極的に選択される。この目的のために、CD1c/BDCA−1に結合することができる抗体が使用される(抗CD1c/BDCA−1抗体)。これは、例えば、ビオチン被覆抗CD1c一次抗体および磁気ビーズ結合−二次抗ビオチン抗体を用いて行うことができる。

0047

mDCの単離後、mDCを培養することができ、例えば、一晩、好ましくは約0.1×106細胞/ml〜2×106細胞/mlの濃度で、mDCの成熟を可能にする条件下でインキュベートする。このようなmDCは、以下の基準で、成熟培養工程前のmDCと比較したMHCクラスI、MHCクラスII、CD83およびCD86の発現が増加していることで特徴付けることができる。

0048

本発明の一実施形態においては、この方法は、CD1c+/CD19−mDCの単離に加えて、例えばCD304(BDCA−1)を用いた癌治療を必要とする患者の血液から形質細胞様樹状細胞を精製する追加の工程を含む。

0049

該方法は、少なくとも1つの実施形態において、精製された樹状細胞を成熟のために誘導する工程をさらに含む。この誘導は、当該分野で公知の任意の刺激、例えば、トール様受容体(TLR)アゴニストまたはDCの成熟を可能にする他の刺激を使用することによって行うことができる。一実施形態では、RNA−プロタミン複合体が刺激として使用される。

0050

1つの実施例によれば、この方法は、以下のステップを使用して行う:
第1に、癌治療を必要とする患者由来のアフェレーシス細胞を、所望の細胞を単離するために磁気的に標識する。特に、標識は、抗CD1c−ビオチン(すなわち、抗体がビオチンで標識されているCD1cに結合する抗体)、CD14マイクロビーズ(すなわち、CD14に結合することができる抗体、すなわち、磁気ビーズ、特に磁気的に選別可能なマイクロビーズ)、およびCD19マイクロビーズ(すなわち、CD19に結合することができる抗体で、抗体はマイクロビーズ、特に磁気的に分類可能なマイクロビーズに結合する)を含む。マーカーCD19は、上に説明したように、B細胞を枯渇させるために使用される。

0051

第2に、CD14+およびCD19+細胞は、出発細胞組成物から枯渇させる。この目的のために、CD14マイクロビーズおよびCD19マイクロビーズを患者由来の細胞とインキュベートし、磁気標識されたB細胞およびCD14+細胞(それぞれCD14−マイクロビーズおよびCD19−マイクロビーズが結合している)を除去する。マイクロビーズが磁性である場合、それに結合した細胞の除去は、磁気分離システム(例えば、Miltenyi Biotech GmbHによって提供される)を用いて行われる。

0052

第3に、抗ビオチンマイクロビーズ(すなわち、ビオチンに結合することができる抗体、ここで抗体はマイクロビーズ、特に磁気的に分類可能なマイクロビーズに結合する)を残りの磁気陰性細胞に添加する。任意に、CD1c+/CD19−mDCおよびCD304+pDCを同時に単離するために、抗ビオチンマイクロビーズおよびCD304(BDCA−4)マイクロビーズ(すなわち、CD304(BDCA−4)に結合することができる抗体マイクロビーズ、特に磁気的に選別可能なマイクロビーズ)が残りの細胞に添加される。

0053

第4のステップでは、CD1c(BDCA−1)+細胞および場合によりCD1c(BDCA−1)+およびCD304(BDCA−4)+が濃縮され、すなわち血液細胞の集団から単離される。

0054

本発明の一実施形態では、CD1c(BDCA−1)+/CD19−樹状細胞はCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14+細胞を枯渇させ、CD1c+/CD19−細胞の細胞集団は最大で25%のCD1c+/CD19−/CD14+細胞を含むようにする。別の実施形態では、CD14+細胞の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%を枯渇させ、CD1+/CD19+細胞の細胞集団が最大で25%のCD1c+/CD19−/CD14+細胞を含有する。

0055

本発明の一実施形態においては、pDCおよびmDCには、異なる抗原またはペプチドまたはその断片が負荷される。

0056

別の態様では、本発明は、患者の癌を治療するための細胞集団を産生するための、特に上記および本明細書に記載の方法におけるキットの使用に関する。そのようなキットは、以下の成分を含むか、またはそれらからなる:
−CD1cに結合する抗体(BDCA−1)、
−単球に、好ましくは抑制性DCに結合することができる抗体、
−B細胞に結合することができる抗体、および場合により
−CD304(BDCA−4)に結合することができる抗体。

0057

抑制性DCに結合することができる抗体は、CD14、CD11bおよびCCR5からなる群から選択することができる。B細胞に結合することができる抗体は、CD19またはCD20に結合することができる抗体からなる群から選択することができる。

0058

前記使用の一実施形態では、HLA結合腫瘍抗原をさらに含む。腫瘍抗原(例えば、腫瘍ペプチド)は、治療される癌に従って選択されるべきである。

0059

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞集団を、そのような治療を必要とするヒト癌患者に投与する工程を含む癌の治療方法に関する。本方法の一実施形態によれば、(例えば、25%以下のCD1c+/CD19−/CD14+細胞および好ましくはCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14−細胞を有するCD1c(BDCA−1)+/CD19−/CD14−細胞またはCD1c+CD19+細胞、または、CD304(BDCA−4)+細胞に加えて25%以下のCD1c+/CD19−/CD14+細胞を有するCD1c+CD19+細胞などの)血液樹状細胞集団が癌に罹患している患者に投与される。

0060

投与されるべきDCの投与率は、通常、注射当たり103〜109、好ましくは105〜107であるが、治療される患者に適合させる必要がある。腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷されたDCは、好ましくは超音波誘導の下で、リンパ節領域に結節内に投与することができる。

0061

通常、2〜4回の結節内注射を1〜4週間に1回行い、任意にDTHチャレンジ(DTH=遅延型過敏症)を行う。DTH応答は、患者を腫瘍細胞または特定の腫瘍抗原に免疫する能力の尺度であり、ここで対照として役立つ。疾患の進行がない場合、患者は、さらなるワクチン接種および場合によってはDTHチャレンジからなる維持サイクル適格性があり、それぞれ、例えば3〜7ヶ月の間隔で、好ましくは6ヶ月の間隔で行われる。

0062

通常、mDCおよびpDCの集団の1×105〜1×107個の細胞が投与される。

0063

mDCおよびpDCは、患者の血液から単離された場合、通常、未成熟(CD83、CD86、MHCクラスIおよびMHCクラスIIの低発現レベルを示す)である。したがって、本発明の一実施形態において、mDCは、刺激によって、例えば、RNA−プロタミン(CD83、CD86、MHCクラスIおよびMHCクラスII発現のアップレギュレーション)を用いて、培養され、成熟される。

0064

一実施形態では、mDCは、磁気ビーズ結合抗体(Miltenyi Biotec GmbH、Germany)を含む完全閉鎖免疫磁気CliniMACS分離システムを使用して、アフェレーシス産物から直接単離される。

0065

材料と方法
細胞の単離:
異なるサブセットを単離するために、最初のPBMCを、フィコール勾配(Lucron Bioproducts)を用いて健康なドナーまたはステージIIIまたはステージIVメラノーマ患者から分離した。BDCA1+DC単離キット(Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch Gladbach、Germany)を用いてPBMCからBDCA1を発現する全集団(BDCA +DCおよびBDCA1+CD14+集団を含む)を単離し、続いて抗CD14マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)により単球分離を行った。2つのBDCA1発現サブセットは、抗CD14−PerCP(BD Biosciences、San Jose、CA)を用いることにより、CD14発現に基づいて遅れ識別された。

0066

BDCA1+DCは、BDCA1+CD14+細胞、単球および骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を各々、単離するために、我々は、PBMCからT、BおよびNK細胞の枯渇によって前処理されたFACSを使用した。任意の非特異的な抗体の結合を回避するために、最初のPBMCsをFcRブロッカーミルニーバイオテク社)により処理し、次いで、PBMCsを抗CD3−FITC、抗CD20−FITC、抗CD56−FITC(これら全てBD Biosciences社から)および抗で処理しCD19−FITC(Dako Cytomation、Glostrup、Denmark)を用いて処理し、続いて抗FITCマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)および磁気活性化細胞分離で処理した。次いで、枯渇したPBMCsを、以下の抗体で標識することにより、フロー活性化細胞選別(FACS)のために調製した:系統カクテル−FITC、抗CD14−PerCP、抗HLA−DR−PE−Cy7(全てBD Biosciences製)および抗BDCA1−PE(Miltenyi Biotec)。4つのサブセットをFACS Aria(BD Biosciences)を用いて単離した。図8に、FACSゲーティング手順を示す。

0067

MACS CD4+T細胞単離キット(Miltenyi Biotech)を用いて最初に全CD4+T細胞集団を単離することにより、ナイーブ(naive、純粋な)CD4+T細胞集団をPBMCから単離した。続いて、抗CD45RO−PE(Dako Cytomation)および抗PEビーズ(Miltenyi Biotech)を適用することによって、ナイーブCD45RA+CD45RO−CD4+T細胞をメモリーT細胞から分離した。フローサイトメトリーの測定によれば、98%より高い純度レベルが達成された。

0068

表現型:BDCA1+DC、BDCA1+CD14+細胞およびMDSCの表現型をフローサイトメトリーによって比較した。総BDCA1+集団および単球集団を、上記のようにMACSによって単離した。BDCA1+CD14+細胞は、抗CD14−PerCP(BD Biosciences)で標識することにより、BDCA1+DCと区別された。以下の抗体を、表現型を決定するために使用した:抗のCD1a−FITC、抗CD33−APC、抗CD206−PE(これら全てBD Biosciences社)、抗CD16−APC(Miltenyi Biotec)、および抗CD209−PE(Beckman Coulter)。

0069

取り込みアッセイ:BDCA1+DC、BDCA1+CD14+細胞および単球の抗原取り込み能力は、Alexa−488標識ウシ血清アルブミンBSA)をどの程度まで吸収できるかを測定することによって測定した。BDCA1の100x103+細胞(上記のようにMACSによって単離された)または単球は、37°Cで5、15、30、または60分間でBSA−のAlexa−488を1mg/mlの存在下または非存在下でX−VIVO15培地(Lonza社)で培養した。BSAの自発的結合に起因するバックグラウンド測定値を測定するために、同様の培養を4℃で行った。培養期間の後、BDCA1+細胞を抗CD14−PerCPで染色して、BDCA1+CD14+細胞をBDCA1+DCと識別した。様々な細胞サブセットによるBSA−Alexa488の取り込みをフローサイトメトリー(FACSCalibur、BD Biosciences)によって測定した。

0070

細胞サブセット活性化:単離後、5%ヒト血清を含むX−VIVO 15培地を用いて、丸底96ウェルプレートサイトカイン検出のための50x103細胞およびT細胞との共培養のための10x103細胞)で細胞サブセットを培養した、(HS, bloodbank,Rivierenland)。これらの細胞は刺激しないまま放置したか、またはGMCSFLPSまたはポリIC(両方ともSigma−Aldrich、St.Louis、MO、USA製)で刺激し、37℃で一晩インキュベートした。活性化後の共刺激分子の発現は、抗CD80−APCおよび抗CD86−APC(いずれもBD Biosciences製)を用いて測定した。これらのサブセットによるサイトカイン産生は、標準サンドイッチEILSAを用いてIL−6、IL−12、TNF−αおよびIL−10を測定することによって測定した。

0071

混合リンパ球反応(MLR):T細胞増殖およびサイトカイン産生を誘導するサブセットの能力をMLRで試験を行った。健康なドナーからの100x103の新たに単離された同種異系非接着性末梢血リンパ球(PBL)に10x103の非刺激細胞または刺激細胞(上記)を加えた。これらのT細胞によるIFN−γおよびIL−10産生を、標準サンドイッチELISAによって48時間の上清中で測定した。増殖は、[3H]−チミジン取り込みによって測定した。取り込まれた[3H]−チミジンは、液体シンチレーション分光法により16時間後に測定した。

0072

ナイーブCD4+T細胞増殖を誘導するサブセットの能力を、10×103の刺激されていない細胞または刺激された細胞(上記のように)を50×103の同種のナイーブCD4+T細胞と共培養することによって測定した。記載されている場合、抗PD−L1(R&Dシステム)またはアイソタイプ対照抗体を添加した。T細胞の増殖は、3〜4日間の共培養後の[3H]−チミジン取り込みによって測定した。

0073

KLH特異的サプレッサーアッセイ:BDCA1+DC、BDCA1+CD14+細胞、単球およびMDSCは、上記のようにメラノーマ患者からのFACSによって単離した。各サブセットの20×103個の細胞を、3連で、X−VIVO5%HS中、37℃で一晩培養した。一方、37℃で一晩かけて余分な単球にKLHをパルスした。さらに、自己由来のCD4+集団をMACSCD4+T細胞単離キット(Miltenyi Biotech)によって単離し、4℃でX−VIVO5%HS中に保持した。翌日、KLH特異的T細胞を含む単離されたCD4+T細胞を、4つのサブセットのうちの1つの存在下または非存在下でKLHパルス単球によって刺激した。T細胞の増殖は、24時間から48時間の共培養後の[3H]−チミジン取り込みによって測定した。

0074

結果
CD1c(BDCA1)およびCD14の同時発現を特徴とする特異的骨髄性サブセットは、腫瘍と関連している
進行性腫瘍が循環中のBDCA1+DC数に影響を及ぼすかどうかを決定するために、この集団のパーセンテージをステージIII/IVメラノーマ患者および健常ドナーの末梢血で評価した。メラノーマ患者におけるBDCA1+DCのより低い傾向が観察されたが、それは有意ではなかった(図1A)。興味深いことに、単球マーカーCD14を共発現するBDCA1+CD11c+HLA−DRhi集団(ゲーティング手順の場合、図8も参照)は、健康なドナー(図1A)と比較してメラノーマ患者において有意に上昇した。このBDCA1+CD14+集団の観察された増加は、CD14+HLA−DRLow(ゲーティング手順の場合、図8も参照)として特徴付けられる循環骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の割合の有意な増加と同時に生じた。BDCA1+CD14+集団の存在は、卵巣癌患者由来の炎症性腫瘍腹水においてもこの集団が検出されたので、循環に限定されない。事実、腹水材料は、BDCA1+DCと比較してBDCA1+CD14+集団の有意に高い含量を示した(図1B)。

0075

CD14+DCサブセットの存在は、皮膚真皮区画に広範に示されているが、そのような集団は、決して血液中調査されない。このBDCA1+CD14+集団が実際に別の骨髄DCサブセットであるかどうかを決定するために、この集団の表現型をBDCA1+DCおよび単球と比較して分析した。CD11cおよびHLA−DR(示されていない)、典型的なBDCA1+DC(青い線、左の線)の高発現に加えて、BDCA1+CD14+(緑色の線、中間の線)集団も単球マーカーCD11bを、BDCA1+DCよりも高いレベルで、しかし単球(オレンジ色の線、右の線)よりも低いレベルで発現している(図1C)。さらに、BDCA1+CD14+集団は、単球のサブセットおよび骨髄性DCのCD16+サブセットに特徴的なCD16の発現を欠いていた。3つの集団は、骨髄マーカーCD33の高い発現を示し、CD1a、DC−SIGN、およびCD206(マンノース受容体)の発現がほとんど存在しなかった(図1C)。集合的に、これらのデータは、進行性腫瘍に関連し、BDCA1+DCおよび単球の両方に対する表現型類似性を克服する新規な細胞集団を明確に示している。

0076

BDCA1+CD14+細胞のトランスクリプトームおよび抗体マイクロアレイ分析は、BDCA1++DCと密接に関連する異なる集団を明らかにする
BDCA1+CD14+集団は、単球およびBDCA1+DCの両方と特異的マーカーの発現を共有するので、この集団の特異性を決定するためにさらなる解析が必要であり、単なるDCまたは単球亜集団ではない。この疑問対処するために、3人の健康なドナーの血液から単離したBDCA1+CD14+細胞、BDCA1+DC、単球およびMDSCのトリスコピートームをRNAシークエンシングによって比較した。5000個の最高発現遺伝子を用いた異なるサンプルの階層的クラスタリングは、BDCA1+CD14+細胞を特異的集団として明確に示す。この集団は多く範囲で共有していたが、BDCA1+CD14+集団は、他の集団(図2A)よりもBDCA1+DCに密接に関連していた。本発明者らは、BDCA1+CD14+細胞の起源および発生をより詳細に知るために、マウスにおける骨髄発生に関与することが記載されている転写因子(図2B)および成長因子受容体(図2C)の発現を評価した。マウスにおけるDCの発生重要なIRF4、BATF3およびFLT3のRNA発現は、BDCA1+DC(青色のバー、左から1番目)中において最も高かったが、単球(オレンジバー、左から3番目)およびMDSC(紫色のバー、左から4番目のバー)と比較した場合、BDCA1+CD14+(緑色棒グラフ、左から2番目)の細胞は、より高い発現を示した。DC発生のためのもう1つの重要な因子であるIRF8のRNA発現は、4つの集団にわたって均一であった。同様に、マウスおよびヒトにおけるDC系統に特異的な転写因子であるZBTB46およびZNF366(DC−SCRIPT)のRNA発現は、BDCA1+DCに続いてBDCA1+CD14+細胞が最も高かった。さらに、DC24で特異的に発現することが明らかにされた長い非コードRNALOC645638(Inc−DC)のほとんどがBDCA1+DCによって独占的に発現されていた。対照的に、BDCA1+CD14+細胞、単球およびMDSCは、MAFB、EGR1およびEGR2、マウスのマクロファージ分化に関与するすべての転写因子のRNA発現に関して、BDCA1+DCよりも同等に高いRNA発現を有していた。さらに、マウスのマクロファージ分化にも関与するCSF1RのRNA発現は、最も高いBDCA1+CD14+細胞であったが、他の集団は等しい発現レベルであった。結論として、BDCA1+CD14+細胞は、独特の遺伝子発現プロファイルを有する別個の集団を形成する。

0077

RNA発現分析に加えて、抗体分子マイクロアレイを用いて3つの細胞集団においてCD分子、HLA分子、ケモカインおよびサイトカイン(表1)の微分タンパク質発現を調べた(多重分析)。差次的に発現されたタンパク質の階層的クラスタリングは、BDCA1+DCに近いクラスター化したBDCA1+CD14+細胞でRNA発現データと同様のパターンを示した(図3)。従って、タンパク質分析は、BDCA1+CD14+集団の特異性をさらに支持する。

0078

BDCA1+CD14+細胞は、DC機能的特徴を有する
RNAおよびタンパク質分析は、BDCA1+CD14+細胞とBDCA1+DCとの間の密接な関係を喚起するが、2つのサブセット間の機能的類似性は、この密接な関連性のさらなる証拠として測定する必要がある。DCは、T細胞を活性化することによって適応免疫応答を上昇させることができる専門的な抗原提示細胞である。したがって、本発明者らは、BDCA1+CD14+細胞が周囲環境から抗原を取り込む能力を最初に評価した。その目的のために、BDCA1+CD14+細胞、BDCA1+DCまたは単球による蛍光標識ウシ血清アルブミン(BSA)の取り込みを、37℃で異なる時間インキュベートした後のフローサイトメトリーによって測定した。BSAの細胞への自発的結合に起因する蛍光を避けるために、4℃コントロール(対照)を各時点で行い、これらの4℃サンプルで測定した平均蛍光強度MFI)値を、37℃サンプルから差し引いた(ΔMFI)。図4Aに示すように、BDCA1+CD14+細胞は、蛍光標識BSAとの15分間のインキュベーション後、より高いΔMFI値によって反映された著しく高い抗原取り込み能力を示す。興味深いことに、この取り込みアッセイでは、BDCA1+CD14+細胞と単球との間の差は有意ではなかったが、このプロセスにおいて単球が最良であることが明らかとなった(図4A左パネル)。

0079

DCの主要な特徴は、危険信号を感知し、共刺激分子を発現させ、サイトカインを分泌することによってそのようなシグナルに応答する能力であり、プロセスは成熟とも呼ばれる。BDCA1+CD14+細胞がこの性質をどの程度有しているかを測定するために、癌免疫療法に一般的に使用されるGM−CSF、LPS(TLR4リガンド)およびpIC(TLR3リガンド)による刺激を伴って、BDCA1+CD14+細胞、BDCA1+DCおよび単球の示差的な共刺激分子発現およびサイトカイン産生を測定した。BDCA1+DCは、LPSおよびpICの両方に応答したが、共刺激分子CD86およびCD80を上方制御することによって、BDCA1+CD14+細胞はCD80発現を単独でアップレギュレートすることによってこの刺激に反応した。一方、単球は、LPSに応答してのみ、BDCA1+CD14+細胞およびBDCA1+DCよりも効率的にCD80発現を適度にアップレギュレートした(図4B)。さらに、3つの集団すべてが、サイトカインのプロファイルを分泌することによって応答した。BDCA1+DCは、2つの他のサブセットに欠けているIL−12を分泌することによって特徴付けられたが、BDCA1+CD14+細胞は、BDCA1+DCおよび単球と比較して、より高い量のTNF−αを有意に産生した(図4C)。BDCA1+CD14+細胞および単球の両方が、BDCA1+DCよりも多量のIL−6を産生した。BDCA1+CD14+細胞は、より高い量の阻害性サイトカインIL−10を産生した(図4C)。

0080

成熟において観察された相違により、活性化T細胞における機能的変化を推測する。したがって、BDCA1+CD14+細胞、BDCA1+DCおよび単球のT細胞刺激能力を2つの設定で評価した。第1の設定は混合白血球反応(MLR)であり、これらの集団のいずれかが3[H]標識チミジン取り込みによって決定された同種末梢血リンパ球(PBL)の増殖を誘発するために使用された。上記の成熟データから予想されるように、PBL増殖を誘導するBDCA1+CD14+(3本棒の中央の緑色の棒)細胞の能力は、単球(オレンジ棒、右)よりも高く、BDCA1+DCよりも低かった;(青色棒、左、図5A)。この観察は、BDCA1+CD14+細胞がTLRリガンドによって刺激されているか否かにかかわらず存続する。刺激されたPBLの上清中のサイトカインレベルを評価すると、BDCA1+CD14+細胞誘導性PBLは、単球誘導PBLよりも多く、BDCA1+DC誘導性PBLよりもIFN−γを産生したが、任意の細胞サブセット(図5A)。異なるサブセットのT細胞刺激能力を評価するためのより洗練された選択肢は、同種異系のナイーブCD4+T細胞の増殖をどの程度まで誘導できるかを決定することによるものである。MLR設定と同様に、BDCA+CD14+細胞は、単球よりも高いCD4+T細胞増殖を誘導し、BDCA1+DCよりも低かった(図5B)。

0081

総合的に、従来のBDCA1+DCと比較して低い程度であるが、BDCA1+CD14+細胞は、高い抗原摂取能、TLR刺激に応答して成熟し、T細胞増殖を誘導する能力によって証明されるように、DC機能が付与される。

0082

BDCA1+CD14+集団は、そのT細胞刺激能力を低下させるPD−L1発現の上昇を特徴とする
DC由来共刺激シグナルIIは、T細胞活性化に不可欠である。共刺激分子に加えて、シグナルIIは、DCによって発現され、弱毒化T細胞応答をもたらす共阻害分子を介して媒介されてもよい。これらの共阻害分子の中には、PD−L1およびPD−L2がある。PD−L2は、刺激の有無にかかわらず(データは示さず)、サブセットのいずれかにおいても発現されないが、PD−L1は、すべてのサブセットによるTLRライゲーションの後に発現する。しかし、BDCA1+CD14+細胞は、BDCA1+DCと比較して有意により高いレベルのPD−L1を示す(図6A)。BDCA1+CD14+細胞のT細胞刺激能力に対するPD−L1発現の影響を評価するために、ナイーブCD4+T細胞の活性化の間に抗体によってPD−L1分子をブロックした。実際、PD−L1分子を中和することは、BDCA1+CD14+細胞誘導T細胞増殖を有意に増強した(図6B)。したがって、BDCA1+CD14+細胞による高いPD−L1発現は、この細胞集団の機能を妨害することに関与する。

0083

BDCA1+CD14+細胞集団は、黒色腫患者におけるBDCA1+DCベースのワクチンに対する応答が低いことと関連している
臨床試験では、BDCA1+Cワクチンを用いてメラノーマ患者を治療した。これらのワクチンに使用されたBDCA1+DCは、磁気活性化細胞選別(MACS)によって患者の末梢血から単離された。この単離方法は、Bリンパ球枯渇後のBDCA1発現細胞の陽性選択に依存する。したがって、単離されたBDCA1+集団は、BDCA1+DCおよびBDCA1+CD14+細胞の両方を含む。後者のパーセンテージ(割合)は、全ワクチン調製物の6%〜45%の間で変動した。これに基づき、BDCA1+DCワクチンを投与された患者は、BDCA1+CD14+細胞含有量が25%未満のワクチンを受けたグループと、BDCA1+CD14+細胞含有量が25%を超えるワクチンを受けたグループの2つのグループに分けられた。ワクチンに使用されたBDCA1+細胞に、メラノーマ特異的抗原gp−100およびチロシナーゼおよびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を免疫原性対照抗原として負荷した。2群間のKLHに対する免疫応答を比較すると、BDCA1+CD14+細胞の含有量が低いBDCA1+ワクチンを受けた患者は、BDCA1+CD14+細胞が25%を超えるワクチンを受けた患者と比較して、有意に高いKLH特異的T細胞応答を示した(図7A)。この弱毒化免疫応答は、BDCA1+CD14+細胞の弱いT細胞刺激能力に起因し得る(図5)。しかしながら、T細胞免疫応答を減衰させる別の経路は、MDSCに類似したこれらの応答を積極的に抑制することによるものである。この仮説を検証するために、BDCA1+CD14+細胞、MDSC、単球およびBDCA1+DCの抑制特性を比較した。これらのサブセットのいずれも健常ドナーから単離された場合、自己CD4+T細胞のαCD3/αCD28誘導性増殖を抑制することができなかったが、MDSCのみがこれらの細胞をメラノーマ患者から単離したときにT細胞の湿潤を示した(図7C)。驚くべきことに、CD4+T細胞をKLH負荷単球で刺激すると、BDCA1+CD14+細胞のみがKLH特異的CD4+T細胞の増殖を抑制することができた(図7B、上のパネル)。興味深いことに、この負荷された抑制は、白金ベース化学療法剤であるオキサリプラチンの存在下で止められた(図7B、下部パネル)。従って、BDCA1+CD14+は、抗原特異的様式でT細胞応答を抑制する能力のみ有し、これは、BDCA1+CD14+細胞の含有量が高いBDCA1+DCワクチンを受けているメラノーマ患者における弱毒化KLH応答を説明することできる。

0084

BDCA1+CD14+細胞集団は、特定のゲーティング手順によって特徴づけることができる
ヒト末梢血由来の樹状細胞は、MHCクラスII分子(例えば、HLA−DR)の高発現レベル、および、例えばCD3(T細胞の場合)、CD14(単球の場合)、CD19(B細胞の場合)およびCD56(NK細胞の場合)などのいわゆる系統マーカーの発現の欠損により特徴付けられる。HLA−DR+Lin−細胞内には、CD1c+CD14−血液DCのサブセットが含まれる(図8)。Lin+細胞はCD14+細胞を含み、CD1c発現のレベルに応じてさらに分けることができる。CD1c+は、上記のような抑制機能を有するCD1c+CD14+細胞に相当する。CD1c−CD14+細胞は、2つのさらなるサブセットを含み、これらはHLA−DRの発現レベルにしたがって区別することができる。最初に発現する高レベルのHLA−DRは単球に対応し、HLA−DRの低いサブセットはMDSCに対応する(図8)。この知見と一致して、富化されたCD1c+細胞は異なるレベルでCD14を発現する(図9)。CD14+単球(図9、R4)と同じレベルでCD1c+CD14high細胞(図9、R3)がCD14を発現し、これは図8に示すようなゲーティング手順と一致する。CD14−フルオロフォア結合体輝度に応じて、CD1c+CD14−DCとCD1c+CD14high細胞との間の中間レベルでCD14を発現するさらなるCD1c+サブセットを区別することができる。これらの細胞は、CD1c+CD14lowと称することができ、図9の領域R2に含まれる.CD1c+CD14low細胞およびCD1c+CD14high細胞は、共に、上記のようにおよび図8に示されるCD1c+CD14+サブセットを構成する.CD1c+CD14−は、R1に示されている。

0085

0086

考察
免疫回避は、自然免疫応答および癌に対する免疫療法のアキレス腱である。免疫から回避する際の腫瘍の豊富さは、それらが発症する防御機構過多によって反映される。腫瘍は、T細胞誘引の中心的なケモカイン回路破壊することが示唆されている。さらに、腫瘍が腫瘍反応性T細胞の表面に血管障壁を形成し、これらの細胞を積極的に抑制するために、腫瘍が血管内皮を操作することが示されている。一旦T細胞が内皮関門を通過すると、これらのT細胞は腫瘍細胞に遭遇する前に敵対する免疫抑制性腫瘍間質交渉しなければならない。実際、腫瘍は、Treg細胞、MDSCおよびM2マクロファージのような免疫抑制性白血球集団の拡大を促し、促進する。この研究では、発明者らは、免疫抑制性白血球ファミリーに新しいメンバー;BDCA1+CD14+細胞を導入した。発明者らは、主に末梢血におけるこの新規集団を特徴づけたが、卵巣癌患者の腹水においてこの集団を追跡することができた。MDSCと同様に、この集団は、黒色腫患者の末梢血において有意に上昇し、腫瘍が末梢組織における抑制要素蓄積を促進するという概念を支持する。MDSCとBDCA1+CD14+細胞との間の共通の特徴は、CD14の発現であり、これは共同起源を意味し得る。しかし、これらの2つの抑制的集団は抑制の様式が異なる。MDSCはバイスタンダーT細胞の増殖を普遍的に抑制するが、BDCA1+CD14+細胞はT細胞のみを抗原特異的に抑制する。この差異は、CD4+T細胞への抗原提示に重要なHLA−DRの発現レベルと関連している可能性がある。MDSCは、定義上HLA−DRlowであるが、BDCA1+CD14+細胞は、BDCA1+DCによる発現と同等の高レベルでHLA−DRを発現する。これに沿って、Nagarajらは、特別な癌マウスモデル(MC38)では、CD4+T細胞耐性が観察され、実質的なレベルのMHC−IIを発現する特殊型のMDSCに起因することを発見した。これに基づいて、BDCA1+CD14+細胞は、MDSCのMHC−IIhiサブセットとして分類することができた。しかしながら、これらの2つのサブセット間のRNA発現プロファイルの大きな違いは、MDSCとしてBDCA1+CD14+細胞を分類することと相反している。また、トランスクリプトーム解析により、マウスのマクロファージ分化の中心的な遺伝子の発現によって、BDCA1+CD14+細胞とマクロファージとの間に関係がある可能性があることが明らかにされた。それにもかかわらず、CSF1Rは、マウスおよびヒトの両方において炎症性DC(infDC)によって高度に発現されることも報告されている。さらに、マクロファージは定義上は組織常在細胞であり、一方では、BDCA1+CD14+細胞は循環および組織の両方で見出されるという事実は、2つの細胞サブセット間の別の不一致を強調し、それらを同じグループ内で分類することに相反する。しかし、BDCA1+CD14+細胞とマクロファージとの間の潜在的な類似性は、これら2つの間の関係のさらなる議論を促す。

0087

CD14発現は、特定の区画内のDCまたは特定の条件下でCD14を発現するので、単球に限定されない。実際、定常状態ヒト真皮は、真皮DC(DDC)のCD14+サブセットを有する。BDCA1+CD14+集団と同様に、CD14+DDCは、真皮マクロファージとの区別を可能にするBDCA1を発現する。これらの2つのサブセット間の表現型の類似性は、重複する機能的性質によってさらに支持される。BDCA1+CD14+細胞と同様に、CD14+DDCは低レベルの共刺激分子を発現することが実証され、ナイーブT細胞増殖の誘導因子としては不十分であった。さらに、CD14+DDCは、Treg細胞の発達を促進することによって免疫寛容の誘導に関与している。BDCA1+CD14+細胞とCD14+DDCとの間の共通形質は、2つの集団間のリンクを強く示唆している。CD14+DDCに加えて、DCによる上方制御されたCD14発現も、ビタミンDデキサメタゾンおよびIL−10のような免疫調節試薬での処置後に観察される。これらのCD14+DCの全ての共通の特徴は、共刺激分子の低発現、T細胞応答の誘発不良および免疫寛容の促進である。このことは、BDCA1+CD14+血液集団が実際に循環抑制DCサブセットであり、BDCA1+CD14+細胞とBDCA1+DCとの間の密接なRNA発現プロファイルによって裏付けられる概念であると強く仮定する。

0088

腫瘍関連免疫抑制機構は、それらの同族受容体を免疫細胞に連結させて機能不全にすることによって、腫瘍特異的免疫応答を緩和する免疫抑制分子によって部分的に機能する。チェックポイントとも呼ばれるこれらの阻害経路のうち、PD−1/PD−L1経路に言及する。PD−1は、活性化T細胞およびB細胞によって発現され、DC、マクロファージおよびT細胞上で可変発現を有する2つのリガンドPD−L1およびPD−L2を有するCD28ファミリーのメンバーである。T細胞受容体シグナル伝達中のそのリガンドの1つによるPD−1の誘発は、T細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解活性をブロックし、T細胞の生存を損なう可能性がある。これらの阻害効果は、PD−145の細胞内ドメイン内の免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ(ITIM)および免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ(ITSM)に起因する。PD−L1/PD−1経路の阻害効果は、抗腫瘍免疫応答を回避するために腫瘍によって乗っ取りされ得る。PD−L1発現は、グリア芽細胞腫およびメラノーマ、ならびに頭部および頸部卵巣結腸腎臓および乳癌を含む多くの腫瘍で確認されている。腫瘍細胞、腫瘍浸潤性リンパ球またはその両方による攻撃的な腫瘍挙動、予後不良および死亡リスクの上昇による高発現PD−L1レベルがもたらせる。さらに、本発明者らは、BDCA1+CD14+集団が、その貧弱なT細胞刺激能力を部分的に担うPD−L1の発現の上昇によって特徴付けられることをここに記載した。したがって、PD−L1/PD−1チェックポイントは、腫瘍免疫抑制機構を中和する非常に興味深い標的である。実際、PD−1またはPD−L1に対する抗体を遮断することによってこの経路を標的とすることは、許容可能であることが証明されただけでなく、治療された患者の28%まで耐久性のある抗腫瘍応答を示した。Merck(MK−3475)によって開発された別の抗PD−1 mAbは、治療された進行性メラノーマ患者の50%までの臨床応答率を達成することが最近報告されている。したがって、チェックポイント阻害剤は、特にDCワクチンのような他の形態の免疫療法と組み合わせた場合、癌免疫療法において有望な未来を有する。

0089

要約すると、本発明者らは、腫瘍が免疫抑制の組織状態を維持し、活性な抗腫瘍免疫応答を阻止する新規な細胞サブセットを見出した。このBDCA1+CD14+集団の阻害機能によって、それが癌免疫療法の標的となる。

実施例

0090


図は以下のとおりである:
図1:BDCA1+CD14+DCは腫瘍と関連している。
図1A:BDCA1+CD14+細胞の割合は、癌患者において増加する。
図1B:卵巣癌腫のBDCA1+CD14+の割合が高い。
図1C:異なる細胞サブセットの表現型。
図2A:BDCA1+CD14+集団は、トランスクリプトーム解析によって示されるように、独特なサブセットである。
図2B:マウスにおける骨髄発生に関与することが記載されている転写因子の発現。
図2C:マウスにおける骨髄発生に関与することが記載された成長因子受容体の発現。
図3:BDCA1+CD14+集団は、多重分析によって示されるようにユニークなサブセットである。
図4:BDCA1+CD14+細胞はDC特性を有する。
図4A:BDCA1+CD14+細胞は、抗原取り込みにおいて非常に効率的である。
図4B:BDCA1+CD14+細胞は、TLRリガンドによる刺激の際に共刺激分子CD80をアップレギュレートする。
図4C:BDCA1+CD14+細胞は、固有の炎症性サイトカインプロファイルを有する。
図5A:MLR
図5B:ナイーブT細胞の刺激能力。
図6:BDCA1+CD14+細胞の減少した活性は、PD−L1およびMERTK発現によって引き起こされる。
図6A:BDCA1+CD14+DCは、TLR刺激に応答してPD−L1をアップレギュレートする。
図6B:PD−L1ブロッキングは、BDCA1+CD14+のT細胞刺激能力を増強する。
図7:BDCA1+CD14+細胞は、黒色腫患者における癌免疫療法に対する反応が低いことと関連している。
図7A:骨髄性DC免疫療法におけるBDCA1+CD14+細胞のより高い割合は、患者におけるより低い応答と相関する。
図7B:BDCA1+CD14+DCは、KLH特異的CD4+T細胞の増殖を抑制する。w
図7B:BDCA1+CD14+DCサプレッサーの能力は、オキサリプラチンによって阻害される。
図7C:BDCA1+CD14+DCはポリクローナルT細胞の増殖を抑制しない。
図8:可能なソート手順。
図9:濃縮したCD1c+CD19−細胞(CD14枯渇なし)。
図10:本発明の組成物は、図10のR2(BDCA1+CD14+)で示される亜集団が集団の総細胞数の25%を超えないような(R1とR2が共に)「BDCA−1富化」細胞集団である。すなわち、本発明によれば、癌に罹患した患者に投与するための細胞集団を得るために、BDCA1+CD14+の画分を全細胞の25%未満に減少させる必要がある。

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