図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2017年9月14日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (16)

課題・解決手段

診断アッセイ、及びサンプル中のRGMa断片を検出し、定量化するための前記診断アッセイの使用方法を提供する。前記方法は、神経変性疾患における薬物治療及び薬物治療の有効性モニターするためにRGMa断片を検出するために使用され得る。

概要

背景

多発性硬化症(MS)は中枢神経系の慢性炎症性疾患である。ガドリニウムを適用する現在利用されているMRI技術は疾患過程で生ずる各種病巣可視化し、生物学的マーカーとして役立つ。しかしながら、脳脊髄液CSF)及びタンパク質の研究は疾患の進行、慢性炎症、及び髄腔内遅放性ステロイド適用のような治療に対する応答相互作用に対する更なる洞察を与え得る。

軸索再生のプロセスは多発性硬化症の臨床成果を改善する。ミエリン及びグリア構造中の幾つかの再生インヒビター、すなわちミエリン結合糖タンパク質、NogoA、OMgp(希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質)の存在が公知である。1つの更なるインヒビターは反発性誘導分子A(RGMa)であり、これはニューロン再生及び機能回復をも妨げる。RGMaは、神経突起伸張の強力なインヒビターであり、CNS外傷または炎症後のニューロン再生及び機能回復を阻害する重要な因子として現れるグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型糖タンパク質である。RGMaは膜結合型可溶性形態で存在し、これらは神経突起伸長を阻害する。RGMaは外傷性脳損傷または虚血性卒中を患っているヒトのCNSミエリン、新鮮病巣及び成熟瘢痕組織局在化している。

脳及び脊髄中に存在しているRGMa及びその断片は神経変性を促進し、神経再生を阻害し得る。RGMaは神経線維の再生及びニューロン変性に影響を与える。ELISAベースアッセイが再生活性の阻害を同定すべくRGMa種を検出するために使用されてきた。しかしながら、これらのアッセイはサイズの異なるRGMa断片を区別することができず、通常各種RGMa断片を検出するために必要な高感度のレベルを示さない。加えて、ELISAベースアッセイは体液中のタンパク質量が少ないためにRGMaを検出することができない。より高い感度を有し、RGMa断片を検出し、区別することができ、RGMa断片をMSまたは他の神経変性疾患を患っている患者における高い機能回復及び再生と相関させることができる診断アッセイが必要とされている。

概要

診断アッセイ、及びサンプル中のRGMa断片を検出し、定量化するための前記診断アッセイの使用方法を提供する。前記方法は、神経変性疾患における薬物治療及び薬物治療の有効性モニターするためにRGMa断片を検出するために使用され得る。

目的

本発明では、RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法も提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化する方法であって、(a)被験者から少なくとも1個のRGMa断片を含むサンプルを得るステップと、(b)前記サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、前記キャプチャー結合タンパク質は前記少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、(c)前記サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、前記検出結合タンパク質は前記キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成する、(d)前記サンプル中の前記少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化するステップとを含む方法。

請求項2

前記少なくとも1個のRGMa断片は約1kDa〜約65kDaのサイズを有するRGMa断片である、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記RGMa断片は、10kDa、18kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDまたは65kDaのサイズを有する、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

前記RGMa断片は、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び40kDaのRGMa断片からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。

請求項5

ステップ(b)の前に、ゲル電気泳動を用いて、前記少なくとも1個のRGMa断片を分離する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。

請求項6

ステップ(b)の前に、前記少なくとも1個のRGMa断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を作成させるステップと;ステップ(b)において前記ウェスタンブロッティング膜を前記キャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、前記キャプチャー結合タンパク質は前記ウェスタンブロッティング膜上に固定化した前記少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する;ステップ(c)において前記ウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、前記検出結合タンパク質は前記キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成する、をさらに含む、請求項5に記載の方法。

請求項7

少なくとも2個のRGMa断片を検出する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。

請求項8

前記少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有する、請求項7に記載の方法。

請求項9

少なくとも3個のRGMa断片を検出する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。

請求項10

前記少なくとも3個のRGMa断片は、18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有する、請求項9に記載の方法。

請求項11

前記少なくとも1個のRGMa断片は、可溶性RGMa断片である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。

請求項12

ステップ(b)においてゲル上で前記サンプル中の前記タンパク質と同時にRGMaタンパク質標準を分離するステップと;(g)前記少なくとも1個のRGMa断片を前記分離したRGMaタンパク質標準と比較して前記断片を定量化するステップとをさらに含む、請求項5〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項13

前記RGMaタンパク質は、組換えRGMa断片の勾配である、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記勾配は、RGMaタンパク質標準10、25、50、100及び200pg/mLを含む、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記RGMa断片のサイズをSDS−PAGEにより測定する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。

請求項16

前記SDSPAGEは4〜15%である、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記膜は、ニトロセルロース膜である、請求項6〜16のいずれか1項に記載の方法。

請求項18

前記キャプチャー結合タンパク質は、RGMa選択的抗体である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。

請求項19

前記抗体は、ビオチン化RGMa選択的抗体である、請求項18に記載の方法。

請求項20

前記検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、前記検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項19に記載の方法。

請求項21

ペルオキシダーゼ染色キットを用いて、前記少なくとも1個のRGMa断片を検出する、請求項20に記載の方法。

請求項22

神経変性疾患に対する治療の必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療の有効性判定方法であって、(a)前記被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと;(b)前記被験者からのサンプル中の前記少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、前記少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと、ここで、前記少なくとも1個の断片のレベルが前記対照レベルと比較して高い場合、前記治療は神経変性疾患の治療に無効であると判定され、前記少なくとも1個の断片のレベルが前記対照レベルと比較して同一であるかまたは低い場合、前記治療は神経変性疾患の治療に有効であると判定される;を含む、方法。

請求項23

神経変性疾患に対する治療の必要な前記被験者に対して、神経変性疾患の治療に有効であると判定された治療を施行し続けることをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルは、神経変性疾患にかかっているが、神経変性疾患に対する治療を受けたことがない被験者中の前記少なくとも1個のRGMa断片のレベルである、請求項22または23に記載の方法。

請求項25

神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性予測方法であって、(a)前記被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと;(b)前記被験者からのサンプル中の前記少なくとも1個のRGMa断片のレベルを前記少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(c)サンプル中の前記少なくとも1個のRGMa断片のレベルが前記対照レベルと比較して低い場合、前記被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップと;を含む、方法。

請求項26

前記治療に応答すると予測された被験者に対して、該治療を施行することをさらに含む、請求項25に記載の方法。

請求項27

神経変性疾患を患っている被験者の治療方法であって、(a)前記被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと;(b)前記被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(c)前記断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、前記被験者に対して治療レジメン投与するステップと;を含む、方法。

請求項28

前記治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含む、請求項22〜27のいずれか1項に記載の方法。

請求項29

前記治療は、トリアムシノロンアセトニド(TCA)、テクフィデラ/BG−12(フマル酸ジメチル)、ジレニアフィンゴリモド)、ラキニモド、β−インターフェロンコパキソンダクリズマブアレムツズマブリツキシマブ、またはその組合せの少なくとも1つを含む、請求項22〜28のいずれか1項に記載の方法。

請求項30

前記治療は、トリアムシノロンアセトニド(TCA)を含む、請求項26〜29のいずれか1項に記載の方法。

請求項31

神経変性疾患を患っている被験者に対する治療レジメンの最適化方法であって、(a)被験者から得られた第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、前記第1サンプルは、前記被験者が治療レジメンを始める前またはその間の時点で前記被験者から採取される;(b)ステップ(a)より後の時点で前記被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、前記少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した前記少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの低下は該治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し;(c)前記被験者からの第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1に記載の方法を用いて測定するステップと;(d)前記被験者からのサンプル中の前記少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、前記少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(e)サンプル中の前記少なくとも1個のRGMa断片のレベルが前記対照レベルと比較して低い場合、前記被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップと;を含む、方法。

請求項32

前記治療レジメンは、神経回復治療レジメンである、請求項31に記載の方法。

請求項33

前記神経回復治療レジメンの成功率を向上させる、請求項32に記載の方法。

請求項34

前記治療レジメンは、神経保護治療レジメンである、請求項31に記載の方法。

請求項35

前記神経保護治療レジメンの成功率を向上させる、請求項34に記載の方法。

請求項36

神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療モニタリング方法であって、(a)被験者から得られた第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、第1サンプルは、前記被験者が薬物治療を始める前またはその間の時点で前記被験者から採取される;(b)ステップ(a)より後の時点で前記被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、前記少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した前記少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの低下は、該薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、前記少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した前記少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの上昇は、該薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し;(c)前記薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していない場合、前記被験者に対して別の薬物治療を施行するステップと;を含む、方法。

請求項37

神経変性疾患に対する治療効果についての化合物スクリーニング方法であって、(a)細胞を含むサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと;(b)前記サンプルを化合物と接触させるステップと;(c)ステップ(b)より後の時点で前記被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、前記少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した前記少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの低下は、該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、前記少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した前記少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの上昇は、該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し;(d)治療効果を有すると同定された化合物を選択するステップと;を含む、方法。

請求項38

少なくとも2個のRGMa断片を検出する、請求項22〜37のいずれか1項に記載の方法。

請求項39

前記少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有する、請求項38に記載の方法。

請求項40

少なくとも3個のRGMa断片を検出する、請求項22〜37のいずれか1項に記載の方法。

請求項41

前記少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有する、請求項40に記載の方法。

請求項42

請求項43

神経変性疾患または障害は、多発性硬化症である、請求項22〜42のいずれか1項に記載の方法。

請求項44

前記RGMa断片は、ヒトRGMa断片である、請求項1〜43のいずれか1項に記載の方法。

請求項45

前記サンプルは、脳脊髄液、血液、血清または血漿を含む、請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、サンプル中のRGMa断片を検出し、測定するためのアッセイ、及び神経変性疾患を患っている被験者治療の判定、最適化、予測及びモニタリングにおける前記アッセイの使用に関する。

背景技術

0002

多発性硬化症(MS)は中枢神経系の慢性炎症性疾患である。ガドリニウムを適用する現在利用されているMRI技術は疾患過程で生ずる各種病巣可視化し、生物学的マーカーとして役立つ。しかしながら、脳脊髄液CSF)及びタンパク質の研究は疾患の進行、慢性炎症、及び髄腔内遅放性ステロイド適用のような治療に対する応答相互作用に対する更なる洞察を与え得る。

0003

軸索再生のプロセスは多発性硬化症の臨床成果を改善する。ミエリン及びグリア構造中の幾つかの再生インヒビター、すなわちミエリン結合糖タンパク質、NogoA、OMgp(希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質)の存在が公知である。1つの更なるインヒビターは反発性誘導分子A(RGMa)であり、これはニューロン再生及び機能回復をも妨げる。RGMaは、神経突起伸張の強力なインヒビターであり、CNS外傷または炎症後のニューロン再生及び機能回復を阻害する重要な因子として現れるグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型糖タンパク質である。RGMaは膜結合型可溶性形態で存在し、これらは神経突起伸長を阻害する。RGMaは外傷性脳損傷または虚血性卒中を患っているヒトのCNSミエリン、新鮮病巣及び成熟瘢痕組織局在化している。

0004

脳及び脊髄中に存在しているRGMa及びその断片は神経変性を促進し、神経再生を阻害し得る。RGMaは神経線維の再生及びニューロン変性に影響を与える。ELISAベースアッセイが再生活性の阻害を同定すべくRGMa種を検出するために使用されてきた。しかしながら、これらのアッセイはサイズの異なるRGMa断片を区別することができず、通常各種RGMa断片を検出するために必要な高感度のレベルを示さない。加えて、ELISAベースアッセイは体液中のタンパク質量が少ないためにRGMaを検出することができない。より高い感度を有し、RGMa断片を検出し、区別することができ、RGMa断片をMSまたは他の神経変性疾患を患っている患者における高い機能回復及び再生と相関させることができる診断アッセイが必要とされている。

0005

本発明は、サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化する方法に関する。この方法は、(a)被験者から少なくとも1個のRGMa断片を含むサンプルを得るステップと、(b)サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、(c)サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成する、(d)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化するステップとを含む。少なくとも1個のRGMa断片は、約1kDa〜約65kDaのサイズを有するRGMa断片であり得る。RGMa断片は、10kDa、18kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDaまたは65kDaのサイズを有し得る。RGMa断片は、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び40kDaのRGMa断片からなる群から選択され得る。ステップ(b)の前に、ゲル電気泳動を用いて、少なくとも1個のRGMa断片を分離してもよい。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は、18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも1個のRGMa断片は、可溶性RGMa断片であり得る。RGMa断片のサイズはSDS−PAGEにより測定され得る。SDS PAGEは4〜15%であり得る。キャプチャー結合タンパク質は、RGMa選択的抗体であり得る。抗体は、ビオチン化RGMa選択的抗体であり得る。検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼであり得る。少なくとも1個のRGMa断片は、ペルオキシダーゼ染色キットを用いて検出され得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0006

本発明は、サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化する方法に関する。この方法は、(a)被験者から少なくとも1個のRGMa断片を含むサンプルを得るステップと、(b)サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、(c)サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成する、(d)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化するステップとを含む。少なくとも1個のRGMa断片は約1kDa〜約65kDaのサイズを有するRGMa断片であり得る。RGMa断片は10kDa、18kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDaまたは65kDaのサイズを有し得る。RGMa断片は18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び40kDaのRGMa断片からなる群から選択され得る。ステップ(b)の前に、ゲル電気泳動を用いて、少なくとも1個のRGMa断片を分離してもよい。方法は更に、ステップ(b)の前に、少なくとも1個のRGMa断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を生成し;ステップ(b)においてウェスタンブロッティング膜をキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、ウェスタンブロッティング膜上に固定化した少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成するステップ(c)においてウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成することを含む。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも1個のRGMa断片は可溶性RGMa断片であり得る。RGMa断片のサイズはSDS−PAGEにより測定され得る。SDS PAGEは4〜15%であり得る。膜は、ニトロセルロース膜であり得る。キャプチャー結合タンパク質は、RGMa選択的抗体であり得る。抗体は、ビオチン化RGMa選択的抗体であり得る。検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼであり得る。ペルオキシダーゼ染色キットを用いて、少なくとも1個のRGMa断片が検出され得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0007

本発明は、サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化する方法に関する。この方法は、(a)被験者から少なくとも1個のRGMa断片を含むサンプルを得るステップと、(b)サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、(c)サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成する、(d)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化するステップとを含む。少なくとも1個のRGMa断片は約1kDa〜約65kDaのサイズを有するRGMa断片であり得る。RGMa断片は10kDa、18kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDaまたは65kDaのサイズを有し得る。RGMa断片は18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び40kDaのRGMa断片からなる群から選択され得る。ステップ(b)の前に、ゲル電気泳動を用いて、少なくとも1個のRGMa断片を分離してもよい。方法は、ステップ(b)の前に、少なくとも1個のRGMa断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を作成させるステップと、ステップ(b)においてウェスタンブロッティング膜をキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、ウェスタンブロッティング膜上に固定化した少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、ステップ(c)においてウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成するステップとをさらに含む。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも1個のRGMa断片は可溶性RGMa断片であり得る。方法は、ステップ(b)においてゲル上でサンプル中のタンパク質と同時にRGMaタンパク質標準を分離するステップと、(g)少なくとも1個のRGMa断片を分離したRGMaタンパク質標準と比較して、断片を定量化するステップとをさらに含む。RGMaタンパク質標準は組換えRGMa断片の勾配であり得る。勾配は、RGMaタンパク質標準10、25、50、100及び200pg/mLを含み得る。RGMa断片のサイズはSDS−PAGEにより測定され得る。SDS PAGEは4〜15%であり得る。膜は、ニトロセルロース膜であり得る。キャプチャー結合タンパク質は、RGMa選択的抗体であり得る。抗体は、ビオチン化RGMa選択的抗体であり得る。検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼであり得る。ペルオキシダーゼ染色キットを用いて、少なくとも1個のRGMa断片が検出され得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0008

本発明は、神経変性疾患に対する治療が必要な被験者における神経変性疾患に対する治療の有効性判定方法に関する。この方法は、(a)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、(b)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと、ここで、少なくとも1個の断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、治療は、神経変性疾患の治療において無効であると判定され、少なくとも1個の断片のレベルが対照レベルと比較して同一であるかまたは低い場合、治療は、神経変性疾患の治療において有効であると判定されることを含み得る。少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルは、神経変性疾患にかかっているが、神経変性疾患に対する治療を受けたことがない被験者中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルであり得る。治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療は、トリアムシノロンアセトニド(TCA)、テクフィデラ/BG−12(フマル酸ジメチル)、ジレニアフィンゴリモド)、ラキニモド、β−インターフェロンコパキソンダクリズマブアレムツズマブリツキシマブ、またはその組合せの少なくとも1つを含み得る。治療は、トリアムシノロンアセトニド(TCA)を含み得る。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病アルツハイマー病テイ−サックス病ニーマン−ピック病ゴーシェ病ハーラー症候群ハンチントン病筋萎縮性側策硬化症特発性炎症性脱髄疾患ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症視神経炎脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障糖尿病性網膜症加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0009

本発明は、神経変性疾患に対する治療が必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療の有効性の判定方法に関する。この方法は、(a)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、(b)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップとを含み、ここで、少なくとも1個の断片のレベルを対照レベルと比較して高い場合、治療は神経変性疾患の治療において無効であると判定され、少なくとも1個の断片のレベルが対照レベルと比較して同一であるかまたは低い場合、治療は神経変性疾患の治療において有効であると判定される。方法は神経変性疾患の治療が必要な被験者に対して、神経変性疾患の治療に有効であると判定された治療を施行し続けることをさらに含む。少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルは、神経変性疾患にかかっているが、神経変性疾患に対する治療を受けたことがない被験者中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルであり得る。治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド(TCA)、テクフィデラ/BG−12(フマル酸ジメチル)、ジレニア(フィンゴリモド)、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも1つを含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド(TCA)を含み得る。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る、少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0010

本発明は、神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性予測方法に関する。この方法は、(a)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、(b)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(c)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルが対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む。治療は神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド(TCA)、テクフィデラ/BG−12(フマル酸ジメチル)、ジレニア(フィンゴリモド)、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも1つを含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド(TCA)を含み得る。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0011

本発明は、神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性の予測方法に関する。この方法は、(a)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと(b)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(c)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む。方法は治療に対して応答すると予測された被験者に対して治療を施行することをさらに含む。治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド(TCA)、テクフィデラ/BG−12(フマル酸ジメチル)、ジレニア(フィンゴリモド)、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも1つを含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド(TCA)を含み得る。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0012

本発明は、神経変性疾患を患っている被験者の治療方法に関する。この方法は、(a)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、(b)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(c)断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、被験者に対して治療レジメン投与するステップとを含む。治療は神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド(TCA)、テクフィデラ/BG−12(フマル酸ジメチル)、ジレニア(フィンゴリモド)、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも1つを含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド(TCA)を含み得る。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0013

本発明は、神経変性疾患を患っている被験者に対する治療レジメンの最適化方法に関する。この方法は、(a)被験者から得られた第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、第1サンプルは、被験者が治療レジメンを始める前またはその間の時点で被験者から採取される;(b)ステップ(a)より後の時点で被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して低いことは当該治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し;(c)被験者からの第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを請求項1に記載の方法を用いて測定するステップと、(d)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(e)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルが対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む。治療レジメンは、神経回復治療レジメンであり得る。神経回復治療レジメンの成功率を向上させ得る。治療レジメンは、神経保護治療レジメンであり得る。神経保護治療レジメンの成功率を向上させ得る。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0014

本発明は、神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療モニタリング方法に関する。この方法は、(a)被験者から得られた第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、第一サンプルは、被験者が薬物治療を始める前またはその間の時点で被験者から採取される、(b)ステップ(a)の後の時点で被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して低いことは薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して高いことは薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し;(c)薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していない場合、別の治療を被験者に対して施行するステップとを含む。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

0015

本発明は、神経変性疾患に対する治療効果についての化合物スクリーニング方法に関する。この方法は、(a)細胞を含むサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、(b)サンプルを化合物と接触させるステップと;(c)ステップ(b)より後の時点で被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して低いことは該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して高いことは該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し;(d)治療効果を有するとして同定された化合物を選択するステップとを含む。少なくとも2個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。少なくとも3個のRGMa断片を検出し得る。少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。RGMa断片は、ヒトRGMa断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。

図面の簡単な説明

0016

18、30及び40kDaの断片(a,b,c,実線の矢印)を生成するプロタンパク質変換酵素SKI−1及びフーリンによるRGMaの切断を示す。
進行性MS患者のCSF中に存在するRGMa断片を示す。
TCA治療中に即時応答した17人の患者の臨床データを改善されたEDSSで示す。データはすべて平均値±SEM(平均値の標準誤差)として示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前ベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前;V=第5回TCA投与前;VI=第6回TCA投与前。
TCA治療中に即時応答した17人の患者の臨床データを改善された歩行距離で示す。データはすべて平均値±SEM(平均値の標準誤差)として示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前;V=第5回TCA投与前;VI=第6回TCA投与前。
TCA治療中に即時応答した17人の患者の臨床データを改善された歩行速度で示す。データはすべて平均値±SEM(平均値の標準誤差)として示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前;V=第5回TCA投与前;VI=第6回TCA投与前。
TCA適用の反復に対して即時応答しない8人の患者の臨床データを改善のないEDSSで示す。データはすべて平均値±SEM(平均値の標準誤差)として示す。I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前;V=第5回TCA投与前。
TCA適用の反復に対して即時応答しない8人の患者の臨床データを改善のない歩行距離で示す。データはすべて平均値±SEM(平均値の標準誤差)として示す。I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前;V=第5回TCA投与前。
TCA適用の反復に対して即時応答しない8人の患者の臨床データを改善のない歩行速度(図4C)で示す。データはすべて平均値±SEM(平均値の標準誤差)として示す。I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前;V=第5回TCA投与前。
TCA治療に対する即時応答者の脳脊髄液中のRGMa濃度(40kDa)の変化を示す。データはすべて平均値±SEMとして示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前。
TCA治療に対する即時応答者の脳脊髄液中のRGMa濃度(30kDa)の変化を示す。データはすべて平均値±SEMとして示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前。
TCA治療に対する即時応答者の脳脊髄液中のタンパク質濃度の変化を示す。データはすべて平均値±SEMとして示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前。
TCA適用に対して即時応答した17人の患者から採取したRGMa CSFレベルのデンシトメトリー分析についての3つの代表的ウェスタンブロットヒストグラムで示す。
TCA治療に対して即時応答しないMS患者の脳脊髄液中のRGMa濃度(40kDa)を示す。データはすべて平均値±SEMとして示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前。
TCA治療に対して即時応答しないMS患者の脳脊髄液中のRGMa濃度(30kDa)を示す。データはすべて平均値±SEMとして示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前。
TCA治療に対して即時応答しないMS患者の脳脊髄液中のタンパク質濃度を示す。データはすべて平均値±SEMとして示す;*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001;*=事後解析からのp値の有意差レベル;I=第1回TCA投与前のベースライン;II=第2回TCA投与前;III=第3回TCA投与前;IV=第4回TCA投与前。
TCA適用に対して即時応答しない8人の患者から採取したRGMa CSFレベルのデンシトメトリー分析についての3つの代表的ウェスタンブロットをヒストグラムで示す。

0017

本発明は、RGMa断片のレベルを分析し、被験者の神経変性疾患に対する治療レジメンが必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療レジメンを判定し、最適化し、予測し、モニターするためのアッセイに関する。RGMa断片ベース診断アッセイは具体的サイズの特定RGMa断片を検出するために使用され得る。内因性及び組換えRGMa断片の免疫検出は、神経変性疾患を患っているかまたはその症状を呈している被験者における治療を判定し、最適化し、予測し、モニターするために使用され得る。RGMa断片ベース診断アッセイは、CSF、血液、血清及び血漿のようなヒト体液中に存在している可溶性再生抑制RGMa断片の濃度を少量用いて定量的に測定する。この診断アッセイは高感度(ヒト材料中の低ピコグラム(pg)量のRGMaを検出)を与え、RGMaタンパク質標準と組み合わせて多発性硬化症のような神経変性疾患を患っている患者の体液中のRGMa濃度を同定するための定量ツールである。加えて、このアッセイはRGMaの別の断片を区別し、疾患の進行中にこれらの断片のパターンシフトをモニターすることができる。従って、神経回復薬物トライアルにおける患者層化のための手段、再生促進薬に対して積極的に応答し得る患者を追跡するための手段、前記トライアルにおける非応答者を同定するための手段、神経回復治療作戦を最適化するための手段、及び神経回復薬アプローチの成功率を向上させるための手段を与えるので、この方法は全RGMタンパク質のみを調べる現在のテクノロジーに比して優れている。

0018

セクションで使用されているセクションの見出し及びこの中の全開示内容系統立ての目的のみであり、限定的と意図されない。

0019

1.定義
別段の定めがない限り、本明細書中で使用されているすべての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含めた本明細書が支配する。好ましい方法及び材料が以下に記載されているが、本明細書中に記載されているものと類似または均等の方法及び材料が本発明の実施または試験の際に使用され得る。本明細書中に挙げられているすべての刊行物特許出願明細書、特許文献及び他の文献は全文を参照により組み入れる。本明細書中に開示されている材料、方法及び例は例示に過ぎず、限定的と意図されない。

0020

本明細書中で使用されている単数形“a”、“an”及び“the”は文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数形を含む。本明細書中の数値の範囲を列挙する場合もその間にある各数値は同一の精度で明示的に意図される。例えば、範囲6〜9の場合には6及び9に加えて数値7及び8が考えられ、範囲6.0〜7.0の場合には数値6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及び7.0が明示的に意図される。

0021

「または」の使用は、特に言及のない限り「及び/または」を意味する。更に、用語「含む(including)」及び「有する(having)」、並びにこれらの用語の他の形、例えば“includes”、“included”、“has”及び“have”は限定的でない。

0022

明細書及び特許請求の範囲中で使用されている場合、次の用語は以下の意味を有する:
本明細書中で使用されている用語「対照被験者」は健康な被験者、すなわち多発性硬化症(MS)のような神経変性疾患の臨床兆候または症状を有していない被験者を意味する。対照被験者は、MSの兆候または症状が他の方法で不検出であると臨床的に評価されており、その評価にはルーチン身体検査及び/または臨床検査が含まれ得る。本明細書中で使用されている「対照群」は対照被験者または健康被験者の群、すなわちMSのような神経変性疾患の臨床兆候または症状を持たない被験者の群を指す。

0023

本明細書中で使用されている「サンプル」、「生体サンプル」、「試験サンプル」、「標本」、「被験者からのサンプル」及び「患者サンプル」は互換可能に使用され得、血液、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞または組織、内皮細胞白血球または単球のサンプルであり得る。サンプルは患者から入手したまま直接使用しても、または本明細書中で検討されているかまたは当業界で公知である幾つかの方法でサンプルの特徴を修飾するために、例えば濾過蒸留、抽出、濃縮遠心干渉成分不活化試薬の添加等により前処理してもよい。

0024

本明細書中で使用されている用語「被験者」、「患者」または「方法における被験者」は互換可能に脊椎動物を意味し、脊椎動物には哺乳動物(例えば、ウシブタラクダラマウマヤギ、家兔、ヒツジハムスターモルモットネコイヌラット及びマウス)、非ヒト霊長類(例えば、カニクイザルまたはアカゲザルのようなサルチンパンジー)、及びヒトが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、被験者はヒトまたは非ヒトであり得る。幾つかの実施形態では、被験者はMSのような神経変性疾患を発症するリスクがあるかまたはそのリスクがあると疑われている、または既に発症しているヒト被験者であり得る。

0025

本明細書中で使用されている用語「治療する(treat)」、「治療した(treated)」、または「治療する(treating)」は、対象者が望ましくない生理的状態、障害または疾患を鈍化させる(緩和する)、または有利なまたは望ましい臨床結果を得る治療を指す。本発明の目的のために、有利なまたは望ましい臨床結果には、症状の緩和;状態、障害または疾患の程度の減少;状態、障害または疾患の状態の安定化(すなわち、悪化せず);状態、障害または疾患の発症の遅れまたは進行の遅延;状態、障害または疾患状態の緩和;及び検出できるかまたは検出できない(部分的または全体的)寛解、或いは状態、障害または疾患の強化または改善が含まれるが、これらに限定されない。治療には、治療を受けていない場合の予想される生存と比較して延長した生存も含まれる。

0026

本明細書中に別段の定めがない限り、本開示に関連して使用されている科学及び技術用語は当業者が通常理解している意味を有する。例えば、本明細書中に記載されている細胞及び組織培養分子生物学免疫学微生物学遺伝学、タンパク質及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションに関連して使用されている専門用語及び技術は当業界で公知であり、通常使用されているものである。用語の意味及び範囲は明確でなければならない。しかしながら、潜在的な曖昧さがある場合には、本明細書中に記載されている定義が辞書または外部の定義に優先する。更に、文脈上別段の指定がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。

0027

2.RGMa断片ベース診断アッセイ
本発明は、サンプル中のRGMa断片を定量化し、検出するための診断アッセイに関する。RGMaはRGMa断片であり得る。診断アッセイは少なくとも1個のRGMa断片を定量化し、検出し得る。RGMaは、47アミノ酸(aa)シグナル配列、121aaN末端プロセグメント、256成熟領域及び26aaC末端プロセグメントを含む450aaプレプロタンパク質として合成される。N末端プロセグメントはRGDトリペプチド及び分子のたった2個の可能性あるN連結グリコシル化部位を含む。成熟セグメントはフォンビルブランド因子ドメインに対して構造相同性を有する省略短縮ドメインを示す。タンパク質分解プロセッシングアスパラギン酸プロリン結合で起こり、予測32kDa成熟領域が生ずる。GPIアンカーRGMaタンパク質は、フーリン及びプロタンパク質変換酵素SKI−1により多数の膜結合型可溶性断片にプロセッシングされ、このブロセッシングはその適切なインビボ機能のために必要である。

0028

RGMaに対する受容体ネオゲニンであると報告されている。RGM−Aは骨形成タンパク質補助受容体であり、BMP−2、BMP−4、BMP−5及びBMP−6に結合し得ることも判明している。RGMaの幾つかの異なる断片は、そのニューロン受容体ネオゲニンに結合することにより神経突起伸長抑制機能を発揮する。ネオゲニンは免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーであり、4個のN末端免疫グロブリン様ドメインIg)、6個のフィブロネクチンIII型FNIII)ドメイン、貫膜ドメイン及びC末端内部ドメインからなる。2個の異なるRGMa断片のN末端(30kDa)及びC末端断片(40kDa)は、配列相同性欠くにもかかわらずネオゲニンの同一FNIIIドメイン(ドメイン3−4)に結合する。RGMa断片はインビトロで神経突起伸長を抑制することが判明している。脊髄損傷モデルにおいてRGMa活性をポリクローナルRGMa抗体中和すると長距離軸索再生が生じ、機能回復が改善された。脳卒中モデルでは、RGMaをダウンレギュレーションすると、神経保護が生じ、軸索誘導及び細胞分化における基本的役割のために公知であるネオゲニンを介して作用する機能回復が強化された。ヒトCSF中の2個の再生抑制性RGMa断片(30及び40kDa)の存在から、これらのタンパク質が進行性MS患者における再生失敗及び神経変性に寄与することが示唆される。MS患者では、RGMaは脳及び脊髄中で未熟及び成熟樹状細胞により発現する。RGMaはCD68陽性マクロファージ及びCD4陽性Tリンパ球上で発現するので、免疫系において、例えばミクログリア細胞上またはT細胞応答の調節においても役割を有し得る。脳では、活性化ミクログリア細胞はその表面上でRGMaを発現し、ミクログリアRGMa発現が低下するとインビトロ及びインビボの両方で軸索成長が高まる。加えて、RGMa遺伝子はMS患者及び実験自己免疫脳脊髄炎で誘導したあるラットの緊張疾患関連遺伝子として同定された。

0029

診断アッセイは、被験者から少なくとも1個のRGMa断片を含むサンプルを入手し;サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させ、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも1個のRGMa断片と結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、サンプルを検出結合タンパク質と接触させ、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成する、サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化することを含む。少なくとも1個のRGMa断片は約1kDa〜約65kDaのサイズを有し得る。少なくとも1個のRGMa断片は約10kDa、約18kDa、約20kDa、約30kDa、約40kDa、約50kDaまたは約65kDaのサイズを有し得る。少なくとも1個のRMGa断片は18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び40kDaのRGMa断片からなる群から選択され得る。少なくとも1個のRGMa断片はサンプルの他の成分、例えば異なるサイズを有する他のRGMa断片から分離され得る。幾つかの実施形態では、アッセイはゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー質量分光法のような分離技術を用いてサイズに応じて断片を分離することを含む。

0030

a.RGMa断片
RGMaを診断アッセイにより検出する。RGMaはRGMa断片であり得る。アッセイは少なくとも1個のRGMa断片を検出し得る。

0031

RGMaは、N末端アミノ酸168でN末端ドメイン内で2個のプロテアーゼのプロタンパク質変換酵素SKI−1及びフーリンにより切断されて、機能的に活性なタンパク質及び18、30及び40kDaの活性断片が生ずる(図1)。30kDa断片はジスルフィド結合(S−S)を介して膜結合型C末端40kDa断片にリンクしている。C末端(矢印,シェディング)GPIアンカードメイン内で切断すると、RGMaの可溶性形態を形成する3個の断片が遊離する。切断がC末端でシェダーゼ及びGPIアンカーを切断する酵素により起こると、これらの断片の可溶性形態が生ずる。膜アンカー形態のように、これら3個の可溶性断片(18kDa=末端切断型N末端ドメイン,30kDa=N末端ドメイン,40kDa=C末端ドメイン)はすべて神経突起伸長及び再生インヒビターとして活性である。

0032

RGMa断片ベース診断アッセイは、約1kDa〜約65kDaのサイズを有する少なくとも1個のRGMa断片を検出し得る。RGMa断片は約1kDa、約2kDa、約3kDa、約4kDa、約5kDa、約6kDa、約7kDa、約8kDa、約9kDa、約10kDa、約11kDa、約12kDa、約13kDa、約14kDa、約15kDa、約16kDa、約17kDa、約18kDa、約19kDa、約20kDa、約21kDa、約22kDa、約23kDa、約24kDa、約25kDa、約26kDa、約27kDa、約28kDa、約29kDa、約30kDa、約31kDa、約32kDa、約33kDa、約34kDa、約35kDa、約36kDa、約37kDa、約38kDa、約39kDa、約40kDa、約41kDa、約42kDa、約43kDa、約44kDa、約45kDa、約4kDa、約47kDa、約48kDa、約49kDa、約50kDa、約51kDa、約52kDa、約53kDa、約54kDa、約55kDa、約56kDa、約57kDa、約58kDa、約59kDa、約60kDa、約61kDa、約62kDa、約63kDa、約64kDa、約65kDa、またはその組合せであり得る。

0033

RGMa断片ベース診断アッセイは、少なくとも1個のRGMa断片、少なくとも2個のRGMa断片、少なくとも3個のRGMa断片、少なくとも4個のRGMa断片、少なくとも5個のRGMa断片、少なくとも6個のRGMa断片、または少なくとも7個のRGMa断片を検出し得る。RGMa断片ベース診断アッセイは、10kDaのRGMa断片、18kDaのRGMa断片、20kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片、40kDaのRGMa断片、50kDaのRGMa断片、65kDaのRGMa断片、またはその組合せを検出し得る。例えば、RGMa断片ベース診断アッセイは、10kDaのRGMa断片;18kDaのRGMa断片;20kDaのRGMa断片;30kDaのRGMa断片;40kDaのRGMa断片;50kDaのRGMa断片;65kDaのRGMa断片;10kDaのRMGa断片及び18kDaのRGMa断片;10kDaのRMGa断片及び20kDaのRGMa断片;10kDaのRMGa断片及び30kDaのRGMa断片;10kDaのRMGa断片及び40kDaのRGMa断片;10kDaのRMGa断片及び50kDaのRGMa断片;10kDaのRMGa断片及び60kDaのRGMa断片;18kDaのRMGa断片及び20kDaのRGMa断片;18kDaのRMGa断片及び30kDaのRGMa断片;18kDaのRMGa断片及び40kDaのRGMa断片;18kDaのRMGa断片及び50kDaのRGMa断片;18kDaのRMGa断片及び60kDaのRGMa断片;20kDaのRMGa断片及び30kDaのRGMa断片;20kDaのRMGa断片及び40kDaのRGMa断片;20kDaのRMGa断片及び50kDaのRGMa断片;20kDaのRMGa断片及び60kDaのRGMa断片;30kDaのRMGa断片及び40kDaのRGMa断片;30kDaのRMGa断片及び50kDaのRGMa断片;30kDaのRMGa断片及び60kDaのRGMa断片;40kDaのRMGa断片及び50kDaのRGMa断片;40kDaのRMGa断片及び60kDaのRGMa断片;50kDaのRMGa断片及び60kDaのRGMa断片;10kDaのRGMa断片及び少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の18kDaのRGMa断片、20kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片、40kDaのRGMa断片、50kDaのRGMa断片または65kDaのRGMa断片;18kDaのRGMa断片及び少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の10kDaのRGMa断片、20kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片、40kDaのRGMa断片、50kDaのRGMa断片または65kDaのRGMa断片;20kDaのRGMa断片及び少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の10kDaのRGMa断片、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片、40kDaのRGMa断片、50kDaのRGMa断片または65kDaのRGMa断片;30kDaのRGMa断片及び少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の10kDaのRGMa断片、18kDaのRGMa断片、20kDaのRGMa断片、40kDaのRGMa断片、50kDaのRGMa断片または65kDaのRGMa断片;40kDaのRGMa断片及び少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の10kDaのRGMa断片、18kDaのRGMa断片、20kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片、50kDaのRGMa断片または65kDaのRGMa断片;50kDaのRGMa断片及び少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の10kDaのRGMa断片、18kDaのRGMa断片、20kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片、40kDaのRGMa断片または65kDaのRGMa断片;65kDaのRGMa断片及び少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の10kDaのRGMa断片、18kDaのRGMa断片、20kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片、40kDaのRGMa断片または50kDaのRGMa断片を検出し得る。RGMa断片ベース診断アッセイは、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び40kDaのRGMa断片が以下に検討する抗RGMa抗体のようなキャプチャー結合タンパク質に対する結合エピトーブ部位を保持している限り、これら3個の断片を検出し得る。

0034

b.断片検出
被験者からのサンプル中のRGMa断片は、該断片を分離し、その断片のサイズを測定するための各種手段により検出され、定量化され得る。断片は、RGMa断片に特異的に結合するキャプチャー結合タンパク質、例えば抗RGMa抗体のようなRGMa断片結合タンパク質を用いて検出され得る。キャプチャー結合タンパク質は、検出可能標識を有し得、または検出可能標識を有する検出結合タンパク質により認識される。検出可能標識によりRGMa断片を同定できる。

0035

幾つかの実施形態では、RGMa断片はSDS−PAGE/ウェスタンブロッティング分析を用いて同定、サイズ分け及び定量化され得る。幾つかの実施形態では、RGMa断片はカラムクロマトグラフィー技術を用いて同定、サイズ分け及び定量化され得る。幾つかの実施形態では、RGMa断片は質量分析法を用いて同定、サイズ分け及び定量化され得る。

0036

キャプチャー結合タンパク質は、抗RGMa抗体、例えばビオチン化RGMa選択的抗体(BAF2459 R&D Systems)、または米国特許出願公開Nos.2004/0102376、2010/0028340、2011/0135664、2013/0330347及び2014/0023659に記載されているRGMa抗体であり得る。RGMa断片に結合する抗体は、ABCペルオキシダーゼ染色キット(Pierce;32020)または高感度ECL溶液(Thermo Scientific,SuperSignal West Femto Chemiluminescence Substrate,34094)とインキュベートした後可視化され、VersaDocイメージャー(BioRad)を用いてスキャンされ得る。体液中の組換えRGMa(R&D Systems,2459−RM−050)及び1個のRGMa断片のバンド強度を定量化するためにQuantity One Version 4.6.9(BioRad)が使用され得る。

0037

(1)SDS−PAGE/ウェスタンブロッティング
RGMa断片ベース診断アッセイは、少なくとも1個のRGMa断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を作成させるステップと、ウェスタンブロッティング膜をキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、ウェスタンブロッティング膜上に固定化した少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、ウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成するステップとをさらに含み得る。

0038

RGMaタンパク質標準マーカーを使用し、サンプルと同時にSDS−PAGEを用いて分離し得る。少なくとも1個のRGMa断片結合強度をRGMaタンパク質標準マーカーと比較して、RGMa断片のサイズを測定し、及び/または少なくとも1個のRGMa断片の量を定量化する。RGMaタンパク質標準は組換えRGMa断片の勾配であり得る。幾つかの実施形態では、組換えRGMa断片の勾配は、10、25、50、100及び200pg/mLを含む。SDS−PAGEは5%〜25%アクリルアミドを有し得る。幾つかの実施形態では、SDS−PAGEは4〜15% アクリルアミド勾配ゲルであり得る。膜は、ニトロセルロースまたはPVDF膜であり得る。

0039

3.RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法診断、予測、または治療/予防治療の効果の評価
本発明では、RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法も提供する。方法は、その必要がある被験者からサンプルを入手することを含む。方法は、被験者から得たサンプル中の少なくとも1個の上記RGMa断片の存在及び/またはレベルを検出するためにRGMa断片ベース診断アッセイを利用する。被験者は神経変性疾患を患っているかそのリスクを有し得る。

0040

方法は、神経変性疾患に対する治療または治療レジメンの有効性を判定するためにRGMa断片ベース診断アッセイを利用する。他の実施形態では、方法は、神経変性疾患を患っている被験者の治療または治療レジメンに対する応答性を予測するためにRGMa断片ベース診断アッセイを利用する。幾つかの実施形態では、方法は、治療または治療レジメンを被験者に投与すべきかを判定するためにRGMa断片ベース診断アッセイを利用する。もっと他の実施形態では、方法は、神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンを最適化するためにRGMa断片ベース診断アッセイを利用する。幾つかの実施形態では、方法は、神経変性疾患を患っている被験者の治療または治療レジメンをモニターするためにRGMa断片ベース診断アッセイを使用し得る。他の実施形態では、方法は、神経変性疾患に対して治療上有効である化合物をスクリーニングするためにRGMa断片ベース診断アッセイを利用する。

0041

a.神経変性疾患
RGMaは、慢性疾患の神経変性及び進行と再生の間の相互作用のモジュレーターとして役割を発揮し得る。神経変性疾患はRGMaの存在が疾患に関係している、すなわちRGMa活性が有害である疾患であり得る。例えば、RGMaは虚血損傷ヒト脳組織中、外傷性脳損傷を患っているヒトの病巣中、AD患者プラーク領域中、パーキンソン病患者黒質中、及びMS患者中に見られた。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷のようなCNSに対する外傷性損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳卒中のような卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性及び白質ジストロフィーであり得る。

0042

(1)多発性硬化症
多発性硬化症(MS)は、脳内及び脳と身体間の情報の流れを分断する中枢神経系の身体障害性疾患である。MSは、身体の免疫系の異常応答が脳、脊髄、網膜及び視神経から構成される中枢神経系(CNS)に向けられている免疫媒介プロセスを伴う。この疾患は、その進行、及び炎症病巣のその顕著な大脳及び脊髄局在に関して各種サブタイプにより特徴づけられる。前記サブタイプには、再発寛解型MS(RRMS)、二次性進行型MS(SPMS)、一次性進行型MS(PPMS)及び進行再発型MS(PRMS)が含まれる。

0043

RRMSは、しばしば再発、再燃または憎悪と呼ばれる悪化する神経機能の明確に規定された発作の後、その間に症状が部分的または完全に改善され、疾患の明らかな進行がない部分的または完全回復期間(寛解)により特徴づけられる。SPMSはMSの二次相として特徴づけられ、当初RRMS疾患経過を有していた個人で生ずる。SPMSにかかっている個人は、疾患が次第にRRMSで見られる炎症プロセスから神経損傷または損失により特徴づけられるより着実に進行する相に徐々に変化するので、炎症に起因する再発を経験し続けることも、しないこともある。PPMSは明確な再発または寛解期間なく神経機能の着実な悪化により特徴づけられる。PPMSにかかっている個人はたまの停滞期または一時的な回復があるが、進行は続いている長期間にわたって変わり得る進行速度を有している。PRMSは、PRMSにかかっている個人がRRMSにかかっている人が経験するようなたまの回復に加えて、非常に初期から神経機能の着実な悪化を経験する点でPPMSに類似している。

0044

用語「最初の臨床症状」(CIS)は、少なくとも24時間続き、中枢神経系の1つ以上の部位における炎症及び脱髄に起因している神経症状の第1エピソードを表すために使用される。CISは、人が1つの病巣に起因する1つの神経兆候または症状を経験する単発性、または人が2つ以上の場所の病巣に起因する2つ以上の兆候または症状を経験する多発性であり得る。CISを経験した人はMSを発症することも、しないこともある。長期間には、多くの患者は最後には神経変性を有する進行性くすぶり型慢性炎症性プロセスに至る。

0045

MSを患っているかまたは患っていると疑われる被験者は総合障害度評価スコア(EDSS)及び/または最大歩行距離及び/または歩行速度の評価を用いて評価または診断され得る。幾つかの実施形態では、低いEDSSスコア、増加した歩行距離及び/または低下した歩行速度を有する被験者は治療または治療レジメンが該被験者に対して有効であることを示し得る。

0046

例えば、被験者のEDSSスコアが治療前の被験者のEDSSスコアと比較して少なくとも約0.1、少なくとも約0.2、少なくとも約0.3、少なくとも約0.4、少なくとも約0.5、少なくとも約0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.8、少なくとも約0.9、少なくとも約1.0、少なくとも約2.0、少なくとも約3.0、少なくとも約4.0、少なくとも約5.0、または少なくとも約6.0低いことは、治療または治療レジメンが神経変性疾患に有効であることを示す。

0047

例えば、被験者の歩行距離が約70m〜約150m、約70m〜約145m、約70m〜約140m、約70m〜約135m、約70m〜約130m、約70m〜約125m、約70m〜約120m、約70m〜約115m、約70m〜約110m、約70m〜約105m、約70m〜約100m、約70m〜約95m、約70m〜約90m、約70m〜約85m、約70m〜約80m、約70m〜約75m、約75m〜約150m、約75m〜約145m、約75m〜約140m、約75m〜約135m、約75m〜約130m、約75m〜約125m、約75m〜約120m、約75m〜約115m、約75m〜約110m、約75m〜約105m、約75m〜約100m、約75m〜約95m、約75m〜約90m、約75m〜約85m、約75m〜約80m、約80m〜約150m、約80m〜約145m、約80m〜約140m、約80m〜約135m、約80m〜約130m、約80m〜約125m、約80m〜約120m、約80m〜約115m、約80m〜約110m、約80m〜約105m、約80m〜約100m、約80m〜約95m、約80m〜約90m、約80m〜約85m、約85m〜約150m、約85m〜約145m、約85m〜約140m、約85m〜約135m、約85m〜約130m、約85m〜約125m、約85m〜約120m、約85m〜約115m、約85m〜約110m、約85m〜約105m、約85m〜約100m、約85m〜約95m、約85m〜約90m、約90m〜約150m、約90m〜約145m、約90m〜約140m、約90m〜約135m、約90m〜約130m、約90m〜約125m、約90m〜約120m、約90m〜約115m、約90m〜約110m、約90m〜約105m、約90m〜約100m、約90m〜約95m、約95m〜約150m、約95m〜約145m、約95m〜約140m、約95m〜約135m、約95m〜約130m、約95m〜約125m、約95m〜約120m、約95m〜約115m、約95m〜約110m、約95m〜約105m、約95m〜約100m、約100m〜約150m、約100m〜約145m、約100m〜約140m、約100m〜約135m、約100m〜約130m、約100m〜約125m、約100m〜約120m、約100m〜約115m、約100m〜約110m、約100m〜約105m、約105m〜約150m、約105m〜約145m、約105m〜約140m、約105m〜約135m、約105m〜約130m、約105m〜約125m、約105m〜約120m、約105m〜約115m、約105m〜約110m、約110m〜約150m、約110m〜約145m、約110m〜約140m、約110m〜約135m、約110m〜約130m、約110m〜約125m、約110m〜約120m、約110m〜約115m、約115m〜約150m、約115m〜約145m、約115m〜約140m、約115m〜約135m、約115m〜約130m、約115m〜約125m、約115m〜約120m、約120m〜約150m、約120m〜約145m、約120m〜約140m、約120m〜約135m、約120m〜約130m、約120m〜約125m、約250m〜約750m、約250m〜約700m、約250m〜約650m、約250m〜約600m、約250m〜約550m、約250m〜約500m、約250m〜約450m、約250m〜約400m、約250m〜約350m、約250m〜約300m、約300m〜約750m、約300m〜約700m、約300m〜約650m、約300m〜約600m、約300m〜約550m、約300m〜約500m、約300m〜約450m、約300m〜約400m、約300m〜約350m、約350m〜約750m、約350m〜約700m、約350m〜約650m、約350m〜約600m、約350m〜約550m、約350m〜約500m、約350m〜約450m、約350m〜約400m、約400m〜約750m、約400m〜約700m、約400m〜約650m、約400m〜約600m、約400m〜約550m、約400m〜約500m、約400m〜約450m、約450m〜約750m、約450m〜約700m、約450m〜約650m、約450m〜約600m、約450m〜約550m、約450m〜約500m、約500m〜約750m、約500m〜約700m、約500m〜約650m、約500m〜約600m、約500m〜約550m、約550m〜約750m、約550m〜約700m、約550m〜約650m、約550m〜約600m、約600m〜約750m、約600m〜約700m、約600m〜約650m、約650m〜約750m、または約650m〜約700m増加したことは、治療または治療レジメンが被験者における神経変性疾患に有効であることを示す。被験者の歩行距離が少なくとも約1m、少なくとも約2m、少なくとも約3m、少なくとも約4m、少なくとも約5m、少なくとも約10m、少なくとも約15m、少なくとも約20m、少なくとも約25m、少なくとも約30m、少なくとも約35m、少なくとも約40m、少なくとも約45m、少なくとも約50m、少なくとも約55m、少なくとも約60m、少なくとも約65m、少なくとも約70m、少なくとも約75m、少なくとも約80m、少なくとも約85m、少なくとも約90m、少なくとも約95m、少なくとも約100m、少なくとも約105m、少なくとも約110m、少なくとも約115m、少なくとも約120m、少なくとも約125m、少なくとも約130m、少なくとも約135m、少なくとも約140m、少なくとも約145m、少なくとも約150m、少なくとも約155m、少なくとも約160m、少なくとも約165m、少なくとも約170m、少なくとも約175m、少なくとも約180m、少なくとも約185m、少なくとも約190m、少なくとも約195m、または少なくとも約200m増加したことは、治療または治療レジメンが被験者における神経変性疾患に有効であることを示す。

0048

例えば、被験者の歩行速度(s/8m)が少なくとも約30s/8m〜少なくとも約10s/8m、少なくとも約25s/8m〜少なくとも約10s/8m、少なくとも約20s/8m〜少なくとも約10s/8m、少なくとも約15s/8m〜少なくとも約10s/8m、少なくとも約30s/8m〜少なくとも約15s/8m、少なくとも約25s/8m〜少なくとも約15s/8m、少なくとも約20s/8m〜少なくとも約15s/8m、少なくとも約30s/8m〜少なくとも約20s/8m、少なくとも約25s/8m〜少なくとも約20s/8m、または少なくとも約30s/8m〜少なくとも約25s/8m増加したことは、治療または治療レジメンが被験者における神経変性疾患に有効であることを示す。被験者が約30.0s/8m未満、約25.0s/8m未満、約20.0s/8m未満、約15.0s/8m未満、約14.5s/8m未満、約14.0s/8m未満、約13.5s/8m未満、約13.0s/8m未満、約12.9s/8m未満、約12.8s/8m未満、約12.7s/8m未満、約12.6s/8m未満、約12.5s/8m未満、約12.4s/8m未満、約12.3s/8m未満、約12.2s/8m未満、約12.1s/8m未満、約12.0s/8m未満、約11.9s/8m未満、約11.8s/8m未満、約11.7s/8m未満、約11.6s/8m未満、約11.5s/8m未満、約11.4s/8m未満、約11.3s/8m未満、約11.2s/8m未満、約11.1s/8m未満、約11.0s/8m未満、約10.5s/8m未満、約10.0s/8m未満、約9.5s/8m未満、約9.0s/8m未満、約8.5s/8m未満、または約8.0s/8m未満の歩行速度を有していることは、治療または治療レジメンが被験者の神経変性疾患に有効であることを示す。

0049

例えば、被験者が8m歩行するのに要する時間が少なくとも約0.5秒、少なくとも約1秒、少なくとも約2秒、少なくとも約3秒、少なくとも約4秒、少なくとも約5秒、少なくとも約6秒、少なくとも約7秒、少なくとも約8秒、少なくとも約9秒、少なくとも約10秒、少なくとも約11秒、少なくとも約12秒、少なくとも約13秒、少なくとも約14秒、少なくとも約15秒、少なくとも約16秒、少なくとも約17秒、少なくとも約18秒、少なくとも約19秒、少なくとも約20秒、少なくとも約21秒、少なくとも約22秒、少なくとも約23秒、少なくとも約24秒、または少なくとも約25秒だけ短いことは、治療または治療レジメンが被験者における神経変性疾患に有効であることを示す。

0050

b.対照基準レベル
対照サンプルを含めることが望ましいことがある。対照サンプルは上記した被験者からのサンプルと同時に分析され得る。被験者サンプルから得た結果は対照サンプルから得た結果と比較し得る。標準曲線を用意し得、これと生体サンプルについてのアッセイ結果を比較し得る。標準曲線は、アッセイ単位、すなわち化学発光標識を使用する場合、化学発光シグナル強度関数としてマーカーレベルを与える。複数のドナーから採取したサンプルを用いて、標準曲線は正常健康組織または治療を受けたことのないMS組織中のRGMa断片の対照レベルに対して用意され得る。

0051

よって、上記にてらして、試験サンプル中のRGMa断片の存在、量または濃度の測定方法を提供する。方法は、(1)RGMa断片について試験サンプルをウェスタンブロット分析により、例えばRGMa断片上のエピトープに結合する少なくとも1つのキャプチャー抗体、及びキャプチャー抗体またはキャプチャー抗体に対するエピトープとは異なるRGMa断片上のエピトープに結合し、場合により検出可能標識を含む少なくとも1つの検出抗体を使用することによりアッセイすることを含む。方法は更に、(2)試験サンプル中のRGMa断片の存在、量または濃度の直接または間接指標として検出可能標識より生じたシグナルキャリブレーター中のRGMa断片の存在、量または濃度の直接または間接指標として生じたシグナルと比較することを含む。キャリブレーターは場合により、キャリブレーターの各々が一連の他のキャリブレーターとRGMa断片の濃度だけ異なる一連のキャリブレーターの一部であり、そうであることが好ましい。

0052

(1)基準レベル
本明細書中に記載されている方法は、(1)神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンの有効性を同定し、判定する;(2)神経変性疾患を患っている被験者の治療または治療レジメンに対する応答性を予測する;(3)神経変性疾患を患っている被験者に対して治療または治療レジメンを与える;(4)神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンを最適化する;(5)神経変性疾患を患っている被験者に対する再生促進薬物治療または治療レジメンをモニターする;及び(6)化合物を神経変性疾患に対する治療効果についてスクリーニングするために被験者のRGMa断片の基準レベルを使用する。

0053

通常、所定または基準レベルがベンチマークとして使用され得、このベンチマークに対して試験サンプルをRGMa断片(例えば、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片)についてアッセイしたときに得られる結果を評価する。通常、比較する際、所定レベルアナライトの存在、量または濃度を具体的指標を有するMSの特定段階またはエンドポイント連係または関連させ得るように特定のアッセイを適切な条件で十分な回数実施することにより得られる。典型的には、所定レベルは基準被験者(または、被験者の集団)のアッセイで得られる。基準被験者は神経疾患にかかっていない正常または健康被験者のような対照被験者、またはMS被験者のような神経疾患にかかっている被験者であり得る。MS被験者は、MSに対する治療を受けているかまたは受けていないMSの特定段階または前段階(すなわち、RRMS、SPMS、PPMS、PRMSまたはCIS)を有する被験者である。基準群基準集団は対照群またはMS群であり得る。MS群には、MSの特定段階または前段階(すなわち、RRMS、SPMS、PPMS、PRMSまたはCIS)を有するMS被験者、及び/またはMSにかかっているが、MSに対する治療を受けていない被験者が含まれ得る。基準レベルは治療または治療レジメンを被験者に投与する前の被験者のRGMa断片レベルであり得る。

0054

特に、治療応答性について使用される所定レベルに関して、上記したRGMa断片の量または濃度は「変化なし」、「有利」(または、「有利に変化した」)、または「不利」(または、「不利に変化した」)であり得る。「高い」または「上昇した」は、試験サンプル中の量または濃度が典型的または正常レベルまたは範囲(例えば、所定レベル)、例えば対照群またはMS群で見られる典型的または正常レベルよりも高いかまたは大きいこと、または別の基準レベルまたは範囲(例えば、前のまたはベースラインサンプル)よりも高いかまたは大きいことを指す。「高い」または「上昇した」は、試験サンプル中の量または濃度が治療を開始する前の被験者で見られるレベルまたは範囲よりも高いかまたは大きいことをも指し得る。用語「低い」または「減少した」は、試験サンプル中の量または濃度が典型的または正常レベルまたは範囲(例えば、所定レベル)、例えば対照群またはMS群で見られる典型的または正常レベル以下またはそれ未満であること、または別の基準レベルまたは範囲(例えば、前のまたはベースラインサンプル)以下またはそれ未満であることを指す。用語「低い」または「減少した」は、試験サンプル中の量または濃度が治療を開始する前の被験者で見られるレベルまたは範囲以下またはそれ未満であることをも指す。用語「変化した」は、サンプル中の量または濃度が典型的または正常レベルまたは範囲(例えば、所定レベル)、例えば対照群またはMS群で見られる典型的または正常レベルに比べて、または別の基準レベルまたは範囲(例えば、前のまたはベースラインサンプル)に比べて変化していることを指す。

0055

上記したRGMa断片についての典型的または正常レベルまたは範囲、または別の基準レベルまたは範囲(例えば、前のまたはベースラインサンプル)は標準プラクティスに従って規定される。所謂変化したレベルまたは変化は、典型的または正常レベルまたは範囲、または基準レベルまたは範囲と比較して、実験誤差またはサンプル分散により説明することができない正味変化があるときに生じると見なされ得る。幾つかの実施形態では、具体的サンプルで測定されたレベルを所謂正常被験者、すなわち対照被験者からの類似サンプルで測定したレベルまたはレベルの範囲と比較する。これに関連して、「正常な」(時に「対照」または「健康な」)被験者はMS不検出の個人であり、「正常な」患者または集団は例えば検出できないMSを示すものである。「見かけ正常な被験者」はRGMa断片(例えば、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片)をまだ評価していないか評価しているものである。アナライトのレベルは、アナライトが通常不検出である(例えば、正常レベルは0、または正常集団の約25〜約75パ—センタイルの範囲内である)が、試験サンプル中で検出されるときに、及びアナライトが試験サンプル中に正常レベルよりも多く存在しているときに「高い」と言われる。幾つかの実施形態では、具体的サンプルで測定されたレベルをMS被験者からの類似サンプル、または治療を開始する前の被験者から採取した前のまたはベースラインサンプル中で測定したレベルまたはレベルの範囲と比較する。

0056

幾つかの実施形態では、基準レベルがMSに対する治療を受けたかまたは受けていないMS被験者におけるRGMa断片レベルである場合、RGMa断片(例えば、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片)の基準レベルより高いレベルは被験者が治療または治療レジメンに応答しないと同定し、治療がMSの治療のために有効でないと同定する。RGMa断片(例えば、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片)の基準レベルと同等またはそれ以下のレベルは被験者が治療または治療レジメンに対して応答すると同定し、または治療がMSの治療のために有効であると同定する。

0057

幾つかの実施形態では、対照、ベースライン、または前のレベルまたは範囲と比較したサンプル中の相対的RGMa断片レベルの変化は、被験者が治療または治療レジメンに応答すると同定し、または治療がMSの治療のために有効であると同定する。幾つかの実施形態では、被験者から採取したサンプル中の相対的RGMa断片レベルが対照、前のまたはベースラインサンプル中のRGMa断片レベルと比較して約100%未満、約95%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、または約5%未満であることは、被験者が治療または治療レジメンに応答するかまたは応答すると予測されると同定し、または治療がMSの治療のために有効であると同定する。

0058

c.サンプル
RGMa断片ベース診断アッセイの方法は被験者から1つ以上のサンプルを得ることを含み得る。1つ以上のサンプルは脳脊髄液(CSF)サンプルであり得る。他の実施形態では、1つ以上のサンプルは任意のソース、例えば組織、血液、血漿、唾液つば粘液、尿、尿道スワブ頸管スワブ、尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼液(ocular lens fluid)、または脳脊髄液から採取し得る。1つ以上のサンプルは、(i)被験者から得たまま直接、または(ii)1つ以上のサンプルの特性を修飾するために前処理した後使用し得る。よって、1つ以上のサンプルは、例えば血液からの血漿または血清の調製、細胞の破壊固体材料からの液体材料の調製、粘性流体希釈液体の濾過、試薬の添加、核酸の精製、タンパク質の精製等により前処理され得る。

0059

サンプルは治療または治療レジメンを被験者に投与する前またはその後の各種時点で採取され得る。例えば、サンプルは治療または治療レジメンの被験者への投与の1日前、0日前、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後、9日後、または10日後に採取され得る。

0060

d.他のバイオマーカーとの組合せ
本明細書中に記載されている方法は、(1)神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンの有効性を同定し、判定する;(2)神経変性疾患を患っている被験者の治療または治療レジメンに対する応答性を予測する;(3)神経変性疾患を患っている被験者に対して治療または治療レジメンを与える;(4)神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンを最適化する;(5)神経変性疾患を患っている被験者に対する再生促進薬物治療または治療レジメンをモニターする;及び(6)化合物を神経変性疾患に対する治療効果についてスクリーニングするために、RGMa断片ベース診断アッセイを別のバイオマーカーと組み合わせて使用することを含み得る。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはMSのバイオマーカー、例えばNOGO A、Nogo受容体(NgR)に対するリガンド、NOGO受容体、希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質(OMgp)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ニューロフィラメント(Nf)、成長関連タンパク質3(GAP−43);オステオポンチンインターロイキン17、インターロイキン6、インターフェロンγ及びTNF−αであり得る。幾つかの実施形態では、RGMa断片のレベルの変化と共にMSのバイオマーカーのレベルの変化、すなわち上昇または低下は治療または治療レジメンが有効であるかを示す。

0061

e.治療レジメン
RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患に対する治療または治療レジメンにおいて使用され得る。治療または治療レジメンには、神経再生薬、神経保護薬、またはその組合せを含めた神経回復薬が含まれ得る。神経回復は、シナプス強度の変化、シナプス活性シフトサイレトシナプスの活性化、抑制性シナプスサイレンシングによる機能不全ニューロンネットワーク補正包含する。神経回復は神経再生プロセスを含む。神経再生は、損傷線維の再成長により、損傷線維路または健康な隣接非損傷路の側枝再成長後の新しいシナプスの形成、及び後の新しいミエリンシートのもっと後の形成による損傷されたニューロンネットワークの修復である。神経保護は、ニューロンの損失を停止または少なくとも遅らすことによる疾患の進行及び二次的損傷を予防または遅延するためのニューロン構造及び/または機能の相対的保存である。

0062

治療または治療レジメンには、コルチコステロイド、例えばトリアムシノロンアセトニド(TCA);テクフィデラ/BG−12(フマル酸ジメチル)、ジレニア(フィンゴリモド)、ラキニモド、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、プレドニゾロンメチルプレドニゾロンアザチオプリンシクロホスファミドシクロスポリンメトトレキサート4−アミノピリジンチザニジンインターフェロンβ1a(AVONEX;Biogen);インターフェロンβ1b(BETASERON;Chiron/Berlex);インターフェロンα−n3(Interferon Sciences/Fujimoto)、インターフェロンα(Alfa Wassermann/J&J)、インターフェロンβ1A−IF(Serono/Inhale Therapeutics)、ペグインターフェロンα2b(Enzon/Schering−Plough)、コポリマー1(Cop−1;コパキソン;Teva Pharmaceutical Industries,Inc.);高圧酸素静注用免疫グロブリン;クラドリビン;他のヒトサイトカイン、または増殖因子及びその受容体、例えばTNF、LTIL−1、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−23、IL−15、IL−16、IL−18、EMAP−11、GM−CSF、FGF及びPDGFに対する抗体またはアンタゴニスト細胞表面分子、例えばCD2、CD3、CD4、CDS、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、またはそのリガンドに対する抗体、ナタリズマブ物質、例えばメトトレキサート、シクロスポリン、FK506、ラパマイトンミコフェノール酸モフェチルテリフルノミドレフルノミドグラチラマー酢酸塩、ジレニア(フィンゴリモド)、ミトキサントロンペグインターフェロンβ−1a、フマル酸ジメチル、NSAID、例えばイブプロフェン、コルチコステロイド、例えばプレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤アデノシンアゴニスト抗血栓薬補体阻害剤アドレナリン作用薬炎症性サイトカイン、例えばTNFαまたはIL−1によるシグナリング干渉する物質(例えば、IRAK、NIK、IKK、p38またはMAPキナーゼ阻害剤)、IL−1β変換酵素阻害剤、TACE阻害剤、T細胞シグナリング阻害剤、例えばキナーゼ阻害剤メタロプロテアーゼ阻害剤スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリンアンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体(例えば、可溶性p55またはp75 TNF受容体、siL−lRI、siL−lRII、siL−6R)、抗炎症性サイトカイン(例えば、IL−4、IL−10、IL−13及びTGFβ)、またはその組合せが含まれ得る。治療または治療レジメンには、プロ再生性RGMa抗体が含まれ得る。プロ再生性RGMa抗体は、米国特許出願公開Nos.2004/0102376、2010/0028340、2011/0135664、2013/0330347及び2014/0023659に記載されている。

0063

治療には、更に治療薬造影剤細胞傷害性物質血管形成抑制剤;キナーゼ阻害剤;共刺激分子ブロッカー細胞接着分子ブロッカー;抗サイトカイン抗体またはその機能性断片;メトトレキサート;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;検出可能標識またはリポーターTNFアンタゴニスト抗リウマチ薬筋弛緩薬睡眠薬非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、鎮痛薬麻酔薬鎮静薬局所麻酔薬神経筋ブロッカー、抗微生物薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド、蛋白同化ステロイド、エリスロポエチン免疫治療薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬成長ホルモンホルモン補充薬、放射性医薬品抗うつ薬、抗精神薬刺激薬喘息治療薬、β−アゴニスト吸入用ステロイド、エピネフリンまたはアナログサイトカインサイトカインアンタゴニスト抗酸化剤のような神経保護薬、ラジカルスカベンジャーフェニトインのような抗痙攣薬貧血治療薬エリスロポエチン、またはその組合せが含まれ得る。

0064

(1)TCA
神経変性疾患の治療または治療レジメンは、トリアムシノロンアセトニド治療であり得る。トリアムシノロンアセトニド(TCA=VOLON A)と呼ばれるデポ剤コルチコステロイドの髄腔内適用がMS患者で使用され得る。多数のTCA研究は、治療患者において低下したEDSS(総合障害度評価スコア)、増加した歩行距離及び低下した歩行速度で有意な改善を示した。しかしながら、MS患者のこの改善された機能回復についての根本的な分子メカニズムは完全に不明であった。

0065

前の非盲検観察トライアルは、原発性及び続発性進行性MS患者において、特に脊髄症状を被っているときの徐放性ステロイドのトリアムシノロンアセトニド(TCA)の繰返し髄腔内適用効果を記載していた。臨床的に、TCA治療に対して3種の応答:(I)患者は4〜6回のTCAの一連の適用中に即時の改善を報告し得る;(II)数回TCA注射後に疾患症状が遅れて改善;または(III)効果なしがある。TCA治療に対するこれら3つの挙動応答パターン生化学的及び薬理学的理由は詳細に知られていない。上肢及び下肢機能の明らかな即時強化を有する患者ではフリーラジカルのCSF合成が少ないことが判明した。通常、フリーラジカルは組織破壊を媒介し、各種CSFタンパク質の産生を調節する能力を有している。徐放性ステロイドのトリアムシノロンアセトニドの反復髄腔適用は進行性多発性硬化症患者において有利であり得る。

0066

f.神経変性疾患に対する治療有効性の判定方法
RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患に対する治療の必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療または治療レジメンの有効性を判定するための方法において使用され得る。判定方法は、被験者から得たサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルの測定を含み得る。判定は、サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の存在及び/またはレベルを検出または測定するためにRGMa断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。

0067

判定方法は、少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較することを含み得る。少なくとも1個のRGMa断片のレベルが少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較して高い場合、治療または治療レジメンは、神経変性疾患の治療において無効であると判定され得る。治療または治療レジメンが神経変性疾患の治療において無効である判定されたときには、方法は無効の治療または治療レジメンとは異なる治療または治療レジメンを被験者に対して施行することをも含み得る。

0068

少なくとも1個のRGMa断片のレベルが少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較して低い場合、治療または治療レジメンは、神経変性疾患において有効であると判定され得る。治療または治療レジメンが神経変性疾患の治療において有効である判定されたときには、方法は有効な治療または治療レジメンを被験者に対して投与し続けることをも含み得る。

0069

g.神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性の予測方法
RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性を予測する方法において使用され得る。方法は、被験者から得たサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを測定することを含み得る。測定は、サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の存在及び/またはレベルを検出または測定するためにRGMa断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。

0070

予測方法は、少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較することをも含み得る。予測方法は更に、少なくとも1個のRGMa断片のレベルがRGMa断片の対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療または治療レジメンに対する応答性の予測を与えることをも含み得る。応答性の予測を与える場合、予測方法は被験者に対して治療または治療レジメンを投与することをも含み得る。

0071

h.神経変性疾患を患っている被験者の治療方法
RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患を患っている被験者の治療方法において使用され得る。方法は、被験者から得たサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを測定することを含み得る。測定は、サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の存在及び/またはレベルを検出または測定するためにRGMa断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。

0072

方法は、少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較することをも含み得る。方法は更に、少なくとも1個のRGMa断片のレベルがRGMa断片の対照レベルと比較して高い場合、治療または治療レジメンを被験者に対して投与することを含み得る。

0073

i.神経変性疾患を患っている被験者に対する治療レジメンの最適化方法
RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンの最適化方法において使用され得る。方法は、被験者から得られた第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを測定することを含み得る。第1サンプルは、被験者が治療または治療レジメンを始める前またはその間の時点で採取し得る。方法は、被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定することをも含み得る。第2サンプルは第1時点より後の時点で被験者から得られ得る。第2サンプルは、第1サンプルを採取してから少なくとも約1時間後、少なくとも約2時間後、少なくとも約3時間後、少なくとも約4時間後、少なくとも約5時間後、少なくとも約6時間後、少なくとも約7時間後、少なくとも約8時間後、少なくとも約9時間後、少なくとも約10時間後、少なくとも約12時間後、少なくとも約24時間後、少なくとも約2日後、少なくとも約3日後、少なくとも約4日後、少なくとも約5日後、少なくとも約4日後、少なくとも約5日後、少なくとも約2週間後、少なくとも約1ヶ月後、または少なくとも約1年後に採取し得る。第1及び第2レベルの測定は、それぞれのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の存在及び/またはレベルを検出または測定するためにRGMa断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。

0074

少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベル未満の場合、治療または治療レジメンは、神経変性疾患に対して有効であり得、治療レジメンを変更しない。少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと同等またはそれ以上の場合、治療または治療レジメンは、神経変性疾患に対して有効でないことがあり、治療レジメンを変更する。

0075

j.神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療のモニタリング方法
RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療のモニタリング方法において使用され得る。方法は、被験者から得た第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを測定することを含み得る。第1サンプルは、被験者が治療または治療レジメンを始める前またはその間の時点で採取し得る。方法は、被験者から得た第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定することをも含み得る。第2サンプルは、第1時点よりも後の時点で被験者から得られ得る。第2サンプルは、第1サンプルを採取してから少なくとも約1時間後、少なくとも約2時間後、少なくとも約3時間後、少なくとも約4時間後、少なくとも約5時間後、少なくとも約6時間後、少なくとも約7時間後、少なくとも約8時間後、少なくとも約9時間後、少なくとも約10時間後、少なくとも約12時間後、少なくとも約24時間後、少なくとも約2日後、少なくとも約3日後、少なくとも約4日後、少なくとも約5日後、少なくとも約4日後、少なくとも約5日後、少なくとも約2週間後、少なくとも約1ヶ月後、または少なくとも約1年後に採取し得る。第1及び第2レベルの測定は、それぞれのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の存在及び/またはレベルを検出または測定するためにRGMa断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。

0076

少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して低いことは治療または治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有することを示し得る。治療または治療レジメンが神経変性疾患に対して治療上有効であると判定される場合、モニタリング方法は治療上有効な治療または治療レジメンを被験者に対して投与し続けることを含み得る。

0077

少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して高いことは治療または治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有さないことを示し得る。治療または治療レジメンが神経変性疾患に対して治療上有効ではないと判定される場合、モニタリング方法は治療上無効な治療または治療レジメンとは異なる治療または治療レジメンを被験者に投与することを含み得る。

0078

k.神経変性疾患に対する治療効果についての化合物のスクリーニング方法
RGMa断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患に対して治療効果を有する化合物のスクリーニング方法において使用され得る。例えば、RGMa断片ベース診断アッセイは神経再生性臨床薬候補、神経可塑性を強化する臨床薬候補、または髄鞘再生を促進する臨床薬候補を評価するために使用され得る。方法は、細胞を含むサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを測定することを含み得る。方法は、サンプルを化合物と接触させることをも含み得る。方法は更に、サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定することを含み得る。第2レベルは、サンプルを化合物と接触させてから少なくとも約1時間後、少なくとも約2時間後、少なくとも約3時間後、少なくとも約4時間後、少なくとも約5時間後、少なくとも約6時間後、少なくとも約7時間後、少なくとも約8時間後、少なくとも約9時間後、少なくとも約10時間後、少なくとも約12時間後、少なくとも約24時間後、少なくとも約2日後、少なくとも約3日後、少なくとも約4日後、少なくとも約5日後、少なくとも約4日後、少なくとも約5日後、少なくとも約2週間後、少なくとも約1ヶ月後、または少なくとも約1年後に測定され得る。第1及び第2レベルの測定は、それぞれのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の存在及び/またはレベルを検出または測定するためにRGMa断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。

0079

少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して低いことは化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有することを示し得る。少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルが少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較して高いことは化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有さないことを示し得る。

0080

4.方法を実施するためのキット
本発明は、上記した方法を実施するために使用され得るキットを提供する。キットは、(1)被験者から単離した生体サンプル中のRGMa断片、例えば18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片の各々のレベルを定量化するためにRGMa断片のいずれか、例えば18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片の各々に特異的に結合し得る試薬、及び(2)RGMa断片、例えば18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片の各々の基準レベルを示す基準標準を含み得、少なくとも1個の試薬は適当なマーカーに特異的に結合し得る少なくとも1つの抗体を含む。キットは、少なくとも1個のRGMa断片に特異的に結合し得る試薬、生体サンプル中の各バイオマーカーの濃度を定量化するための試薬、及び生体サンプル中のRGMa断片(すなわち、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片)の基準レベルを示す基準標準を含み得る。キット、MSの少なくとも1個の追加バイオマーカー、例えばNOGO A、NOGO受容体、OMgp、MBP、Nf、GAP−43、オステオポンチン、インターロイキン17、インターロイキン6、インターフェロンγ及びTNF−αに特異的に結合し得る少なくとも1つの試薬(すなわち、抗体)、及び存在する場合、MSの少なくとも1つの追加バイオマーカーの基準レベルを示す基準標準をさらに、含み得る。

0081

キットは抗体及び該抗体を投与するための手段を含み得る。キットは、キットを使用し、分析、モニタリングまたは治療を実施するための指示書をさらに含み得る。

0082

キットは1つ以上の容器、例えばバイアルまたはボトルをも含み得、各容器は別々の試薬を含有している。キットは、分析、モニタリング、治療、または本明細書中に記載されている方法をどのように実施または解釈するかを記載している説明書をさらに含み得る。

0083

例えば、キットは、試験サンプルを18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片についてウェスタンブロット分析によりアッセイするための指示書を含み得る。指示書は紙の形態、またはコンピューター読み取り可能な形態、例えばディスク、CD、DVD等の形態であり得る。抗体は、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片キャプチャー抗体、及び/または18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片検出抗体(検出可能標識で標識されている抗体を意味する)であり得る。例えば、キットは少なくとも1個のRGMa断片に特異的に結合する少なくとも1つのキャプチャー抗体を含み得る。キットはキャプチャー抗体に対するコンジュゲート抗体(例えば、検出可能標識で標識されている抗体)(すなわち、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片に特異的に結合するキャプチャー抗体に対するコンジュゲート抗体)をも含み得る。代替的または追加的に、キットは、例えば精製されており、場合により凍結乾燥されているキャリブレーターまたは対照(例えば、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片)、及び/またはアッセイを実施するための少なくとも1つの容器(例えば、既に抗−18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片モノクローナル抗体被覆されていてもよいチューブマイクロタイタープレートまたはストリップ)、及び/またはバッファー、例えば濃厚溶液、検出可能標識(例えば、酵素標識)に対する基質溶液、またはストップ溶液として用意され得るアッセイバッファーまたは洗浄バッファーを含み得る。好ましくは、キットは、アッセイを実施するために必要なすべての成分、すなわち試薬、標準、バッファー、希釈剤等を含む。指示書は18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片を定量化する目的で標準曲線または基準標準を作成するための指示書をも含み得る。

0084

前に示唆したように、キット中に用意されている抗体、例えば18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片に対して特異的な組換え抗体は、検出可能標識、例えば蛍光体放射活性部分、酵素、ビオチン/アビジン標識、発色団、化学発光標識等を配合し得る。または、キットは抗体または抗体を検出するための試薬(例えば、検出抗体)を標識するための試薬、及び/またはアナライトまたはアナライトを検出するための試薬を標識するための試薬を含み得る。抗体、キャリブレーター及び/または対照を別々の容器中に用意するか、または適切なアッセイフォーマット、例えばマイクロタイタープレートに予め分配してもよい。

0085

場合により、キットは品質管理成分(例えば、感度パネル、キャリブレーター、及びポジティブ対照)を含む。品質管理試薬の作成は当業界で公知であり、各種免疫診断製品インサートシートに記載されている。感度パネル部材は場合によりアッセイ性能特性を確認するために使用され、更に場合によりウェスタンブロットキット試薬及びアッセイの標準化完全性の有用な指標である。

0086

キットは場合により、診断アッセイを実施し、または品質管理評価を容易にするために必要な他の試薬、例えばバッファー、塩、酵素、酵素補因子基質検出試薬等をも含み得る。他の成分、例えばバッファー及び試験サンプルの単離及び/または処理のための溶液(例えば、前処理試薬)をキットに配合することもできる。キットは更に1つ以上の他の対照を配合し得る。キットの1つ以上の成分が凍結乾燥されていてもよく、この場合キットは更に凍結成分を再構成するのに適している試薬を含み得る。

0087

場合により、キットの各種成分は必要に応じて適当な容器、例えばマイクロタイタープレート中に用意されている。キットは、サンプルを保持または保存するための容器(例えば、血液サンプルのための容器またはカートリッジ)をさらに含み得る。適切な場合には、キットは場合により、試薬または試験サンプルの作成を容易にする反応容器混合容器、及び他の成分をも含み得る。キットは試験サンプルの入手を助ける1つ以上の器具、例えば針、ピペット鉗子計量スプーン等をも含み得る。

0088

検出可能標識が少なくとも1つのアクリニジウム化合物である場合、キットは少なくとも1つのアクリジニウム−9−カルボキサミド、少なくとも1つのアクリジニウム−9−カルボキシレートアリールエステル、またはその組合せを含み得る。検出可能標識が少なくとも1つのアクリジニウム化合物である場合、キットは過酸化水素源、例えばバッファー、溶液及び/または少なくとも1つの塩基性溶液をも含み得る。

0089

所望により、キットは固相、たとえは磁気粒子ビーズ試験管、マイクロタイタープレート、セル、膜、足場分子フィルム濾紙石英結晶、ディスクまたはチップを含み得る。キットは、検出抗体として機能する抗体のような抗体であり得るかまたは抗体にコンジュゲートされる検出可能標識をも含み得る。検出可能標識は、例えば酵素、オリゴヌクレオチドナノ粒子化学発光物質蛍光団蛍光クエンチャー、化学発光クエンチャー、またはビオチンであり得る直接標識であり得る。キットは場合により標識を検出するために必要な追加試薬を含み得る。

0090

所望により、キットは更に、別のアナライトについて試験サンプルをアッセイするために1つ以上の成分を単独で、または指示書と組み合わせて含み得、前記アナライトはバイオマーカー、例えばNOGO A、NOGO受容体、OMgp、MBP、Nf、GAP−43、オステオポンチン;インターロイキン17、インターロイキン6、インターフェロンγ及びTNF−αのようなMSのバイオマーカーであり得る、アナライトの例には、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片、並びに本明細書中で検討されているかまたは当業界で公知の他のアナライト及びバイオマーカーが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片について試験サンプルをアッセイするための1つ以上の成分により、18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片の存在、量または濃度を測定することができる。サンプル、例えば血清サンプルは18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び/または40kDaのRGMa断片についてTOF−MS及び内部標準を用いてアッセイされ得る。

0091

本明細書中に開示されている本発明の方法の他の適当な修飾及び改変は容易に適用され且つ自明であり、本発明の範囲、または本明細書中に開示されている態様及び実施形態を逸脱することなく適当な均等物を用いてなされ得ることは当業者にとって容易に分かるであろう。本発明を詳細に説明してきたが、本発明は本発明の幾つかの態様及び実施形態を例示するためにのみ意図されている以下の実施例を参照することにより明白に理解され、発明の範囲を限定するものと見なすべきではない。本明細書中に挙げられているすべての雑誌論文、米国特許及び公開明細書開示内容はその全文を参照により本明細書に組み入れる。

0092

本発明は以下の非限定的実施例により説明される複数の態様を有する。

0093

[実施例1]
材料及び方法
被験者25人のMS患者(年齢:50±1.64[平均値±SEM,]を研究した。平均MS期間は14.02±1.71[年]であった。被験者には、14人の女性及び11人の男性を含めた。被験者には、13人の二次性進行性[8人の女性、5人の男性]及び12人の原発性進行性[6人の女性、6人の男性])を含めた。除外基準は、憎悪の急性発症または症状の最近明らかに高まった進行であった。

0094

計画TCA適用後、CSF及び脊髄中のTCAの拡散を助け、容易にするために少なくとも6時間ベッドに止まるように命じられた。腰椎穿刺非外傷性スプロット針を用いて実施した。既存の免疫系調節性薬物治療は安定した状態を保っていた。痙縮抑制治療は変えなかった。総合障害度評価スコア(EDSS)評点、最大歩行距離及び歩行速度評価をベースライン時、及び10mlの食塩液に溶解させた40mgのトリアムシノロンアセトニド(TCA)を投与後毎日、最長第4回TCA適用まで実施した。

0095

CSFサンプリング及びCSF分析髄腔内TCA適用前にCSFを採取した。約1mlのCSFのアリコート滅菌エッペンドルフチューブ中に集め、直ちに凍結し、−20℃で保存した。RGMa測定を第1回TCA適用前のベースライン時(モーメントI)、及びTCA注射後毎日(モーメントII、III、IV及びV)実施した。タンパク質濃度はNanoDropアナライザー(Thermo Scientific)を用いる測定により調べた。

0096

ウェスタンブロット分析CSFRGMaレベルをウェスタンブロッティング及び免疫検出(Schaffarら,J Neurochem,107:418−431(2008))により分析した。簡単に説明すると、10μlの各CSFサンプルを10μlのSDS充填染料(Life Technologies)と混合し、95℃で10分間インキュベートした。これらのサンプルの10μlをSDS−PA−Gels(Life Technologies)を用いて分離し、ニトロセルロース膜に移した。抗RGMa抗体(R&D Systems,BAF2459)及び二次試薬超高感度ABCペルオキシダーゼ染色キット(Pierce,32050)を用いて免疫染色した後、膜を発光試薬(Thermo Scientific,SuperSignal West Femto Chemiluminescence Substrate,34094)とインキュベートした。

0097

バンド強度分析バンド強度をQuantity One Version 4.6.9(BioRad)を用いて測定した。簡単に説明すると、バンド分析クイックガイド中の“Frame lanes…”を選択し、レーンの数を選んだ。最後に、レーンを“Add/Adjust Anchors”ツールを用いて調節し、当該バンドを“Detect Bands…”ツールを用いて手動で検出した。“All Lane Report”を用いて、トレース強度x mmを検出し、分析のために使用した。患者毎に、モーメントIを100%として計算し、モーメントII、III及びIVをモーメントIに対するパーセントで関連づけた。これらのパーセントの平均をグラフプロットし、統計解析をGraphPad Prism 5においてANOVAボンフェローニ多重比較検定を用いて行った。

0098

検査結果の統計評価の手順:25人の患者すべてのCSFを臨床スコアとは独立してRGMa発現についてウェスタンブロッティングにより分析した。等量のCSFを同一容量中のRGMaレベルを比較するためにウェスタンブロッティングによる分析のために充填した。この群の25人の患者すべてのCSF中の30kDa及び40kDaバンドをデンシトメーター測定により分析した。臨床データを観察インターバル中即時応答者及び非即時非応答者に分類した。

0099

統計 このパイロットトライアルの探索的解析のために反復測定デザインのANCOVAを使用した。共変量はMS期間、MSタイプ、性別及び年齢であった。事後解析はベースラインに対するテューキー多重比較検定を用いて行った。統計解析はGraphPad Prism 5ソフトウェアを用いて実施しした。

0100

[実施例2]
MS患者の脳脊髄液中のRGMa
RGMa断片がMSを患っている患者の脳脊髄液中に存在しているかを調べるために、ヒトCSFサンプルのゲル電気泳動、ウェスタンブロット、及びRGMa特異的抗体を用いる免疫検出を実施例2に記載されているように実施した。図1は、ヒトCSF中の上記したRGMa断片すべての存在を示す(Key and Lah,Cell Adhesion & Migration 6:2,85−90(2012)から改変)。RGMa特異的抗体を用いて免疫検出すると、約40、30及び18kDaのサイズを有する3つの断片が検出された。TCA=進行性MS患者の髄腔内治療のために使用したデポ剤コルチコステロイドのトリアムシノロンアセトニド。I〜II、III、IV、Vはそれぞれ第1回、第2回、第3回、第4回及び第5回TCA治療前。

0101

[実施例3]
多発性硬化症患者におけるトリアムシノロンアセトニドの効果
多くの一般的な薬物はMSの疾患進行を遅らすが、MS患者の機能回復を高めない。実験は、脳脊髄液中のRGMaレベルと共に、1日おきの4回のトリアムシノロン適用の効果を立証するために実施した。25人の進行性多発性硬化症患者において臨床評価をベースライン時及びトリアムシノロン投与後毎日実施した。TCAを患者に投与する前に、CSFの1〜2mlアリコートを採取した。各トリアムシノロン適用前にRGMa濃度をウェスタンブロット分析により測定し、定量化した。患者は、疾患活動性に応じて通常TCAの4〜6回適用を受けた。

0102

応答者の臨床データ17人の患者(10人の男性,7人の女性;年齢:52.18±2.04,MS期間:15.74±1.92)は治療後改善した。これらの患者のEDSSスコア(F=8.55;p<0.009[図3A])は低下し、最大歩行距離は増加し(F=3.64;p=0.01[図3B])、歩行速度は向上した(F=3.42;p<0.01[図3C])。3人の患者は車椅子束縛されており、彼らのデータは歩行能力の解析に含めなかった。

0103

即時応答しなかった患者の臨床データ8人の患者(1人の男性,7人の女性;年齢:45.38±2.04;MS期間:10.38±3.24)は観察期間中即時応答しなかった。EDSSスコア(F=1;ns[図4A])、最大歩行距離(F=1.52;ns[図4B])及び歩行速度(F=0.021;ns[図4C])に有意な変化はなかった。6人の患者はTCA適用から3週間以内に遅れた改善を報告した。

0104

通常、すべての参加者重篤副作用は現れなかった。全分析で共変数の影響は見られなかった。

0105

検査結果応答者このコホートではRGMaレベルが低下した。低下は、40kDa形態(F=9.12;p<0.0001[図5A])よりも30kDa(F=3.82;p<0.05[図5B])であまりはっきりしなかった。タンパク質CSF濃度の有意な変化はなかった(F=2.77;ns[図5C])。図6は3つの代表的ウェスタンブロットを示す。

0106

即時応答しない患者CSF中のRGMaの両形態(30kDa:F=2.98;ns[図7B];40kDa:F=0.84;ns[図7A])及びタンパク質含量(F=2.86;ns[図7C])に有意な変化は見られなかった。図8はこの群の3つの代表的ウェスタンブロットを示す。

0107

17人の患者では、多発性硬化症の臨床スコアが改善し、最大歩行距離及び歩行速度が改善した。これらの応答者ではRGMaレベルが低下した。残りの患者は迅速な臨床効果も、RGMa濃度の低下も示さなかった。RGMaの低下は進行性多発性硬化症患者におけるトリアムシノロンによる再生及び機能回復を反映し得る。タンパク質濃度は応答者と非応答者の間で異なっていなかった。両コホートにおいてそれぞれ両者間のCSF中の細胞数相対的変化はなかった。

0108

TCA適用を反復すると、調べたRGMa断片のすべての濃度の低下が引き起こされた。驚くことに、CSF中の可溶性RGMa断片のTCAに起因する減少は機能改善を示した患者で観察され、RGMa断片がMS患者の成果を評価するために使用され得ることを示している。このことは、TCAで治療したMS患者の別の群はRGMa断片CSF濃度の低下を示さず、機能も回復しなかったという第2の観察によりさらに補強される。

0109

上記した詳細説明及び添付の実施例は単なる例示であり、添付の特許請求の範囲によってのみ規定される発明の範囲及びその均等物に対する限定としてとられるべきではないと理解されたい。

0110

開示されている実施形態の各種改変及び修飾は当業者に自明であろう。このような改変及び修飾には、非限定的に本発明の化学構造置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤または使用方法が含まれるが、これらは発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく加え得る。

0111

網羅のために、本発明の各種態様を以下の番号を付した条項に記載する:
条項1.サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化する方法であって、前記方法は、(a)被験者から少なくとも1個のRGMa断片を含むサンプルを得るステップと、(b)サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、(c)サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成する、(d)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片を検出し、定量化するステップとを含む前記方法。

0112

条項2. 少なくとも1個のRGMa断片は約1kDa〜約65kDaのサイズを有するRGMa断片である、条項1に記載の方法。

0113

条項3. RGMa断片は、10kDa、18kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDまたは65kDaのサイズを有する、条項1または2に記載の方法。

0114

条項4. RGMa断片は18kDaのRGMa断片、30kDaのRGMa断片及び40kDaのRGMa断片からなる群から選択される、条項1〜3のいずれか1項に記載の方法。

0115

条項5. ステップ(b)の前に、電気泳動を用いて、少なくとも1個のRGMa断片をゲル分離する、条項1〜4のいずれか1項に記載の方法。

0116

条項6. ステップ(b)の前に、少なくとも1個のRGMa断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を作成させるステップと、ステップ(b)においてウェスタンブロッティング膜をキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、ウェスタンブロッティング膜上に固定化した少なくとも1個のRGMa断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−RGMa断片複合体を形成する、ステップ(c)においてウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質RGMa断片複合体を形成するステップをさらに含む、条項5に記載の方法。

0117

条項7. 少なくとも2個のRGMa断片を検出する、条項1〜6のいずれか1項に記載の方法。

0118

条項8. 少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有する、条項7に記載の方法。

0119

条項9. 少なくとも3個のRGMa断片を検出する、条項1〜6のいずれか1項に記載の方法。

0120

条項10. 少なくとも3個のRGMa断片は、18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有する、条項9に記載の方法。

0121

条項11. 少なくとも1個のRGMa断片は、可溶性RGMa断片である、条項1〜10のいずれか1項に記載の方法。

0122

条項12. ステップ(b)においてゲル上でサンプル中のタンパク質と同時にRGMaタンパク質標準を分離するステップと、(g)少なくとも1個のRGMa断片を分離したRGMaタンパク質標準と比較して断片を定量化するステップとをさらに含む、条項5〜11のいずれか1項に記載の方法。

0123

条項13. RGMaタンパク質標準は組換えRGMa断片の勾配である、条項12に記載の方法。

0124

条項14.勾配は、RGMaタンパク質標準10、25、50、100及び200pg/mLを含む、条項13に記載の方法。

0125

条項15. RGMa断片のサイズをSDS−PAGEにより測定する、条項1〜14のいずれか1項に記載の方法。

0126

条項16. SDS PAGEは4〜15%である、条項15に記載の方法。

0127

条項17. 膜は、ニトロセルロース膜である、条項6〜16のいずれか1項に記載の方法。

0128

条項18.キャプチャー結合タンパク質は、RGMa選択的抗体である、条項1〜17のいずれか1項に記載の方法。

0129

条項19. 抗体は、ビオチン化RGMa選択的抗体である、条項18に記載の方法。

0130

条項20. 検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼである、条項19に記載の方法。

0131

条項21.ペルオキシダーゼ染色キットを用いて、少なくとも1個のRGMa断片を検出する、条項20に記載の方法。

0132

条項22.神経変性疾患に対する治療の必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療の有効性の判定方法であって、前記方法は、(a)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを条項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、(b)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと、ここで、少なくとも1個の断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、治療は神経変性疾患の治療に無効であると判定され、少なくとも1個の断片のレベルが対照レベルと比較して同一であるかまたは低い場合、治療は神経変性疾患の治療に有効であると判定されることを含む前記方法。

0133

条項23.神経変性疾患に対する治療の必要な被験者に対して神経変性疾患の治療に有効であると判定された治療を施行し続けることをさらに含む、条項22に記載の方法。

0134

条項24. 少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルは神経変性疾患にかかっているが、神経変性疾患に対する治療を受けたことがない被験者中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルである、条項22または23に記載の方法。

0135

条項25.神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性の予測方法であって、前記方法は、(a)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、条項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップ、(b)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(c)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルが対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む、前記方法。

0136

条項26.治療に応答すると予測された被験者に対して該治療を施行することをさらに含む、条項25に記載の方法。

0137

条項27.神経変性疾患を患っている被験者の治療方法であって、前記方法は、(a)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、条項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、(b)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(c)断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、被験者に対して治療レジメンを投与するステップとを含む前記方法。

0138

条項28.治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含む、条項22〜27のいずれか1項に記載の方法。

0139

条項29.治療は、トリアムシノロンアセトニド(TCA)、テクフィデラ/BG−12(フマル酸ジメチル)、ジレニア(フィンゴリモド)、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも1つを含む、条項22〜28のいずれか1項に記載の方法。

0140

条項30.治療は、トリアムシノロンアセトニド(TCA)を含む、条項26〜29のいずれか1つに記載の方法。

0141

条項31.神経変性疾患を患っている被験者に対する治療レジメンの最適化方法であって、(a)被験者から得られた第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを、条項1〜20のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップ、ここで、第一サンプルは、被験者が治療レジメンを始める前またはその間の時点で被験者から採取される、(b)ステップ(a)より後の時点で被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの低下は該治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し;(c)被験者からの第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを条項1に記載の方法を用いて測定するステップと、(d)被験者からのサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルを、少なくとも1個のRGMa断片の対照レベルと比較するステップと;(e)サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片のレベルが対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む前記方法。

0142

条項32.治療レジメンは、神経回復治療レジメンである、条項31に記載の方法。

0143

条項33.神経回復治療レジメンの成功率を向上させる、条項32に記載の方法。

0144

条項34.治療レジメンは、神経保護治療レジメンである、条項31に記載の方法。

0145

条項35.神経保護治療レジメンの成功率を向上させる、条項34に記載の方法。

0146

条項36.神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療のモニタリング方法であって、(a)被験者から得られた第1サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを条項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、第1サンプルは、被験者が薬物治療を始める前またはその間の時点で被験者から採取される(b)ステップ(a)より後の時点で被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの低下は、該薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの上昇は、該薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し;(c)薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していない場合、被験者に対して別の薬物治療を施行するステップとを含む前記方法。

0147

条項37.神経変性疾患に対する治療効果についての化合物のスクリーニング方法であって、前記方法は、(a)細胞を含むサンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルを条項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて測定するステップと、(b)サンプルを化合物と接触させるステップと;(c)ステップ(b)より後の時点で被験者から得られた第2サンプル中の少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの低下は、該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、少なくとも1個のRGMa断片の第1レベルと比較した少なくとも1個のRGMa断片の第2レベルの上昇は、該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し;(d)治療効果を有すると同定された化合物を選択するステップとを含む前記方法。

0148

条項38. 少なくとも2個のRGMa断片を検出する、条項22〜37のいずれか1項に記載の方法。

0149

条項39. 少なくとも2個のRGMa断片は、30kDa及び40kDaのサイズを有する、条項38に記載の方法。

0150

条項40. 少なくとも3個のRGMa断片を検出する、条項22〜37のいずれか1項に記載の方法。

0151

条項41. 少なくとも3個のRGMa断片は18kDa、30kDa及び40kDaのサイズを有する、条項40に記載の方法。

0152

条項42.神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンB12欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーである、条項22〜41のいずれか1項に記載の方法。

0153

条項43.神経変性疾患または障害は、多発性硬化症である、条項22〜42のいずれか1項に記載の方法。

0154

条項44. RGMa断片はヒトRGMa断片である、条項1〜43のいずれか1項に記載の方法。

実施例

0155

条項45.サンプルは脳脊髄液、血液、血清または血漿からなる、条項1〜44のいずれか1項に記載の方法。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ