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技術 骨分化促進能及び歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチド及びその用途

出願人 ケアジェンカンパニー,リミテッド
発明者 ヨンジ・チョンウンミ・キムウンジ・リアルム・ハンヒョナ・チョン
出願日 2014年8月5日 (5年6ヶ月経過) 出願番号 2017-504365
公開日 2017年9月14日 (2年5ヶ月経過) 公開番号 2017-526653
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 力動的 常温貯蔵 固定バッファ 登録特許 分間常温 成長効果 歯周症 被覆組織
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年9月14日)のものです。
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図面 (16)

課題・解決手段

本発明の配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるペプチドは、造骨細胞の増殖と分化促進、及び歯周靭帯線維母細胞の増殖と活性促進効能を示す。本発明のペプチドは、smad1/5/8リン酸化のようなBMPシグナリングを増加させ、造骨細胞の成長及びCOL1A1、BSP、ALPのような分化マーカー発現を増加させることにより、究極的に造骨活性を示す。本発明のペプチドは、PI3K及びAktリン酸化を通じて、歯周靭帯線維母細胞の成長を促進し、COL1A1及びDSPPのような活性マーカーの発現を増加させることにより、究極的に歯周組織再生活性を示す。本発明は、上述のペプチドを含む骨疾患の予防または治療用組成物及び歯周疾患の予防または治療用組成物を提供する。

概要

背景

骨は、我が体において、石灰化された代表的な組織であって、再形成過程を通じて体を支え役割をしている。骨に生じる疾患の原因は、大きく3つに分類されるが、その1、成長発育過程で大きさの異常が生じる場合、その2、骨のリモデリング過程で造骨細胞による骨形成破骨細胞による吸収のバランス崩れる場合、その3、骨の石灰化あるいは鉱物化(mineralization)に異常が生じる場合がある。

TGF−β(Transforming growth factor−beta)スーパーファミリーは、TGF−β、Nodal、アクチビン(Activin)、BMPs(bone morphogenetic proteins)のような40個以上の種類から構成されている。TGF−βシグナリングは、特定なタイプIとタイプIIセリントレオニンキナーゼ受容体複合体を形成し、異型複合体(heteromeric complex)の形態で原形質膜を横切って最初に信号を伝達する。TGF−β/BMPsは、身体で多様な機能と哺乳類発達過程の骨形成に関与すると知られている。TGF−β/BMPシグナリングが邪魔されると、腫瘍転移短指症関節炎のような多発性骨関連疾患に影響を受けるようになる。

人体の骨は、毎日少しずつ分解されて、分解された量だけ新しい骨で満たされて恒常性を維持する、非常に力動的器官である。骨を分解する破骨細胞と、骨を再生する造骨細胞のうち、一方の細胞活性が増加するか減少すると、恒常性破壊による様々な疾病が起こるようになる。骨を吸収する破骨細胞の活性が増加すると、骨を分解が促進され、骨がもろくなって骨折しやすくなる骨粗しょう症のような疾患が起こり、造骨細胞の活性が増加すると、骨密度の増加により骨の奇形や骨石灰症が起こるようになる。そのため、破骨細胞と造骨細胞のバランスが重要である。

今まで知られた薬品としては、バイオシミラー医薬品専門企業のコリボーンバンクが最近骨形成タンパク質‘Rafugen’に対して食品医薬品安全から臨床試験承認をもらって、臨床試験に入った。その他にも、大熊製薬株式会社が、骨形成促進タンパク質‘BMP2’と人工骨グラフトした新概念バイオ融合医療機器としてノボシス(NOVOSIS)を発売したが、このノボシスは、インプラントを始めとした骨移植関連治療に多様に活用される予定であって、自家移植より骨がさらによく接合されて、手術時間と出血は減少され、速い回復が期待できると報告した。その他にも、同和薬品株式会社の‘DW1350’という薬品が、破骨細胞の抑制だけではなく、造骨細胞の促進機能に優れている薬品として発売されたが、今まで臨床試験を続けており、国内に発売されていない状況である。

本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

概要

本発明の配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるペプチドは、造骨細胞の増殖と分化促進、及び歯周靭帯線維母細胞の増殖と活性促進効能を示す。本発明のペプチドは、smad1/5/8リン酸化のようなBMPシグナリングを増加させ、造骨細胞の成長及びCOL1A1、BSP、ALPのような分化マーカー発現を増加させることにより、究極的に造骨活性を示す。本発明のペプチドは、PI3K及びAktリン酸化を通じて、歯周靭帯線維母細胞の成長を促進し、COL1A1及びDSPPのような活性マーカーの発現を増加させることにより、究極的に歯周組織再生活性を示す。本発明は、上述のペプチドを含む骨疾患の予防または治療用組成物及び歯周疾患の予防または治療用組成物を提供する。a

目的

本発明の目的は、骨分化促進活性及び歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチドを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
牽制数
- 件

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請求項1

列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列から構成された群から選択される1種のアミノ酸配列からなる、骨分化促進活性を有するペプチド

請求項2

前記ペプチドは、造骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、請求項1に記載のペプチド。

請求項3

前記ペプチドは、Smad1、Smad5及びSmad8のリン酸化を増加させることを特徴とする、請求項1に記載のペプチド。

請求項4

前記ペプチドは、ALP(Alkalinephosphatase)、COL1A1(CollagentypeIalpha1)及びBSP(Bonesialoprotein)の発現を増加させることを特徴とする、請求項1に記載のペプチド。

請求項5

配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列から構成された群から選択される1種のアミノ酸配列からなる、歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチド。

請求項6

前記ペプチドは、歯周靭帯線維母細胞の増殖を促進することを特徴とする、請求項5に記載のペプチド。

請求項7

前記ペプチドは、PI3K及びAktのリン酸化を増加させることを特徴とする、請求項5に記載のペプチド。

請求項8

前記ペプチドは、COL1A1(CollagentypeIalpha1)及びDSPP(Dentinsialophosphoprotein)の発現を増加させることを特徴とする、請求項5に記載のペプチド。

請求項9

請求項1から4のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、骨疾患の予防または治療用組成物

請求項10

請求項5から8のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、歯周疾患の予防または治療用組成物。

請求項11

有効成分として請求項1から4のいずれかに記載のペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、骨疾患の予防または治療方法

請求項12

有効成分として請求項5から8のいずれかに記載のペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、歯周疾患の予防または治療方法。

技術分野

0001

本特許出願は、2014年7月28日に大韓民国特許提出された大韓民国特許出願第10−2014−0095893号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。

0002

本発明は、骨分化促進能及び歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチド及びその用途に関する。

背景技術

0003

骨は、我が体において、石灰化された代表的な組織であって、再形成過程を通じて体を支え役割をしている。骨に生じる疾患の原因は、大きく3つに分類されるが、その1、成長発育過程で大きさの異常が生じる場合、その2、骨のリモデリング過程で造骨細胞による骨形成破骨細胞による吸収のバランス崩れる場合、その3、骨の石灰化あるいは鉱物化(mineralization)に異常が生じる場合がある。

0004

TGF−β(Transforming growth factor−beta)スーパーファミリーは、TGF−β、Nodal、アクチビン(Activin)、BMPs(bone morphogenetic proteins)のような40個以上の種類から構成されている。TGF−βシグナリングは、特定なタイプIとタイプIIセリントレオニンキナーゼ受容体複合体を形成し、異型複合体(heteromeric complex)の形態で原形質膜を横切って最初に信号を伝達する。TGF−β/BMPsは、身体で多様な機能と哺乳類発達過程の骨形成に関与すると知られている。TGF−β/BMPシグナリングが邪魔されると、腫瘍転移短指症関節炎のような多発性骨関連疾患に影響を受けるようになる。

0005

人体の骨は、毎日少しずつ分解されて、分解された量だけ新しい骨で満たされて恒常性を維持する、非常に力動的器官である。骨を分解する破骨細胞と、骨を再生する造骨細胞のうち、一方の細胞の活性が増加するか減少すると、恒常性破壊による様々な疾病が起こるようになる。骨を吸収する破骨細胞の活性が増加すると、骨を分解が促進され、骨がもろくなって骨折しやすくなる骨粗しょう症のような疾患が起こり、造骨細胞の活性が増加すると、骨密度の増加により骨の奇形や骨石灰症が起こるようになる。そのため、破骨細胞と造骨細胞のバランスが重要である。

0006

今まで知られた薬品としては、バイオシミラー医薬品専門企業のコリボーンバンクが最近骨形成タンパク質‘Rafugen’に対して食品医薬品安全庁から臨床試験承認をもらって、臨床試験に入った。その他にも、大熊製薬株式会社が、骨形成促進タンパク質‘BMP2’と人工骨グラフトした新概念バイオ融合医療機器としてノボシス(NOVOSIS)を発売したが、このノボシスは、インプラントを始めとした骨移植関連治療に多様に活用される予定であって、自家移植より骨がさらによく接合されて、手術時間と出血は減少され、速い回復が期待できると報告した。その他にも、同和薬品株式会社の‘DW1350’という薬品が、破骨細胞の抑制だけではなく、造骨細胞の促進機能に優れている薬品として発売されたが、今まで臨床試験を続けており、国内に発売されていない状況である。

0007

本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

発明が解決しようとする課題

0008

本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるペプチドが、造骨細胞の成長及び分化を促進し、歯周靭帯線維母細胞の活性を促進するなど、優れた生理活性を有することを見出し、本発明を完成した。

0009

したがって、本発明の目的は、骨分化促進活性及び歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチドを提供することにある。

0010

本発明の他の目的は、骨疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。

0011

本発明のまた他の目的は、歯周疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。

課題を解決するための手段

0012

本発明の一様態によると、本発明は、配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列から構成された群から選択される1種のアミノ酸配列からなる、造骨分化促進活性を有するペプチドを提供する。

0013

本発明の他の一様態によると、本発明は、配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列から構成された群から選択される1種のアミノ酸配列からなる、歯周靭帯線維母細胞活性促進活性を有するペプチドを提供する。

0014

本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるペプチドが、造骨細胞の成長及び分化を促進し、歯周靭帯線維母細胞の活性を促進するなど、優れた生理活性を有することを見出した。

発明の効果

0015

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである:
(i)本発明の配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるペプチドは、造骨細胞の増殖と分化促進、及び歯周靭帯線維母細胞の増殖と活性促進効能を示す。
(ii)本発明のペプチドは、smad1/5/8リン酸化のようなBMPシグナリングを増加させ、造骨細胞の成長及びCOL1A1、BSP、ALPのような分化マーカー発現を増加させることにより、究極的に造骨活性を示す。
(iii)本発明のペプチドは、PI3K及びAktリン酸化を通じて、歯周靭帯線維母細胞の成長を促進し、COL1A1及びDSPPのような活性マーカーの発現を増加させることにより、究極的に歯周組織再生活性を示す。
(iv)本発明は、上述のペプチドを含む骨疾患の予防または治療用組成物及び歯周疾患の予防または治療用組成物を提供する。

図面の簡単な説明

0016

図1aは、本発明の合成例により製造された配列番号1のペプチドを処理した骨母細胞細胞成長促進効果を示したグラフである。
図1bは、本発明の合成例により製造された配列番号2のペプチドを処理した骨母細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。
図2aは、本発明の合成例により製造された配列番号1のペプチドを処理した場合に発現されるALP(Alkaline phosphatase)の程度を、細胞染色を通じて確認した結果である。
図2bは、本発明の合成例により製造された配列番号2のペプチドを処理した場合に発現されるALP(Alkaline phosphatase)の程度を、細胞染色を通じて確認した結果である。
図3aは、本発明の合成例により製造された配列番号1のペプチドを処理した場合の骨分化マーカーのmRNA発現程度を確認した結果である。
図3bは、本発明の合成例により製造された配列番号2のペプチドを処理した場合の骨分化マーカーのmRNA発現程度を確認した結果である。
図4aは、本発明の合成例により製造された配列番号1のペプチドを処理した場合の、骨分化関連シグナルであるSmad1/5/8のリン酸化程度を確認した結果である。
図4bは、本発明の合成例により製造された配列番号2のペプチドを処理した場合の、骨分化関連シグナルであるSmad1/5/8のリン酸化程度を確認した結果である。
本発明の合成例により製造された配列番号1のペプチドを処理した場合の、コラーゲンスポンジ内に浸透した骨細胞様相をH&E染色で確認した結果である。
図6aは、本発明の合成例により製造された配列番号1のペプチドを処理した場合の、歯周靭帯線維母細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。
図6bは、本発明の合成例により製造された配列番号2のペプチドを処理した場合の、歯周靭帯線維母細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。
図7aは、本発明の合成例により製造された配列番号1のペプチドを処理した場合の、歯周靭帯線維母細胞の細胞成長促進関連タンパク質であるPI3K及びAktのリン酸化程度が増加することを確認した結果である。
図7bは、本発明の合成例により製造された配列番号2のペプチドを処理した場合の、歯周靭帯線維母細胞の細胞成長促進関連タンパク質であるPI3K及びAktのリン酸化程度が増加することを確認した結果である。
図8aは、本発明の合成例により製造された配列番号1のペプチドを処理した場合の歯周靭帯線維母細胞の活性化程度を、関連遺伝子であるCOL1A1及びDSPPのmRNA発現増加により確認した結果である。
図8bは、本発明の合成例により製造された配列番号2のペプチドを処理した場合の歯周靭帯線維母細胞の活性化程度を、関連遺伝子であるCOL1A1及びDSPPのmRNA発現増加により確認した結果である。

0017

本発明のペプチドは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含む。具体的に、本発明のペプチドは、必須的に配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列から構成されている。

0018

本発明の一具現例によると、本発明のペプチドは、造骨細胞の増殖を促進して、Smad1、Smad5及びSmad8のリン酸化を誘導し、BMPシグナルを活性化させて、骨形成マーカーと知られたALP(Alkaline phosphatase)、COL1A1(Collagen type I alpha 1)及びBSP(Bone sialoprotein)の発現を増加させることにより、結果的に骨分化を促進させる。

0019

本発明の他の具現例によると、本発明のペプチドは、PI3K及びAktリン酸化を通じて、歯周靭帯線維母細胞の成長を促進し、PI3K及びAktのリン酸化を増加させて、COL1A1(Collagen type I alpha 1)及びDSPP(Dentin sialophosphoprotein)のような活性マーカーの発現を増加させ、歯周靭帯線維母細胞の活性を促進させることにより、究極的に歯周組織再生活性を示す。

0020

本明細書で使用される用語‘ペプチド’は、ペプチド結合により、アミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術(solid−phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149−54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984))または液相合成技術(US登録特許第5,516,891号)によって製造できる。

0021

本発明の一具現例によると、前記ペプチドのN−またはC−末端は、アセチル基フルオレニルメトキシカルボニル基ホルミル基パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(PEG)からなる群から選択される保護基が結合される。

0022

上述のアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。

0023

上述の保護基は、生体内のタンパク質切断酵素攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。

0024

本明細書で言及される用語‘安定性’は、‘インビボ’安定性だけではなく、貯蔵安定性(例えば、常温貯蔵安定性)も意味する。

0025

本発明の他の様態によると、本発明は、上述の配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列から構成された群から選択される1種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、骨疾患の予防または治療用組成物を提供する。

0026

本発明の組成物は、上述の本発明の配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。

0027

下記の実施例で立証されたように、本発明の配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるペプチドは、造骨細胞の増殖及び分化を促進するため、骨疾患の予防または治療に非常に有効である。

0028

本発明の骨疾患予防または治療用組成物は、造骨機能が円滑ではなくて骨密度が低下するか、あるいは関節の炎症などにより破骨作用が過度なる場合に発生するあらゆる疾患に使用でき、例えば、骨粗しょう症、少年期骨粗しょう症、骨形成不全症骨軟化症骨壊死症、くる病骨髄炎歯槽骨消失、骨のパジェット病(Paget’s disease)、高カルシウム血症原発性副甲状腺機能亢進症転移性(metastatic)骨疾患、骨髄腫リウマチ関節炎における骨消失、癌による骨消失、線維性異形性症、無形性骨疾患、代謝性骨疾患及び年による骨質量の消失などに使用できる。

0029

本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、(a)上述の本発明のペプチドの薬剤学的有効量;及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物で製造できる。

0030

本明細書で用語‘薬剤学的有効量’は、上述のペプチドの効能または活性を達成するに十分な量を意味する。

0032

本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤甘味剤香味剤乳化剤懸濁剤保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。

0033

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入皮下注入筋肉注入腹腔注入、局所投与経皮投与などにより投与できる。

0034

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法投与方式患者年齢、体重、性、病的状態飲食、投与時間、投与経路排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方できる。一方、本発明の薬剤学的組成物のある投与量は、1日当たり0.0001〜200μgである。

0035

本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造するか、または多用量容器内に入れて製造できる。ここで剤形は、オイルまたは水性媒質中溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤粉末剤顆粒剤錠剤カプセル剤またはゲル(例えば、ハイドロゲル)の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

0036

本発明の他の様態によると、本発明は、上述の配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列から構成された群から選択される1種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、歯周疾患の予防または治療用組成物を提供する。

0037

本発明の組成物は、上述の本発明のペプチドを有効成分として含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。

0038

歯周疾患治療の究極的な目標は、歯槽骨、歯周靭帯、セメント質など、破壊された組織の再生にある。ヒト歯周靭帯線維母細胞は、歯周靭帯線維母細胞と骨母細胞、セメント芽細胞に分化、増殖が可能であって、歯周組織再生の中枢的役割を担当するため、歯周組織再生のための歯周組織工学の応用時、活用すべき代表的な細胞である。歯周組織の再生のためには、多様な分化能力のある歯周靭帯細胞の増殖を促進させ、組織再生を誘導することが重要である。

0039

下記の実施例で立証されたように、本発明のペプチドは、歯周靭帯線維母細胞の増殖と活性を促進し、歯周組織の維持と再生に関与する細胞外基質構成成分の強化効果を示す。したがって、本発明の組成物は、多様な歯周疾患の予防または治療に非常に有効である。

0040

歯周疾患は、数多い口腔感染疾患の一つであって、30以上の人間から発生する歯牙消失の主要原因である。

0041

本明細書の用語‘歯周疾患(peridontal disease)’は、実質的に歯周組織(periodontium)に影響を及ぼす数多い疾患を含む。歯周組織は、歯牙の被覆組織及び支持組織から構成されており、歯槽骨(alveolar bone)、歯周靭帯(periodontal ligament)、セメント質(cementum)及び歯齦(gingiva)を含む。他のたくさんの疾患が歯牙−支持組織(tooth−supporting structures)に影響を及ぼす反面、プラーク−誘導された炎症性疾患が歯周疾患の大部分を占めて、伝統的に歯齦炎(gingivitis)または歯周炎(periodontitis)に分類される。

0042

本発明において歯周疾患は、歯周炎(periodontitis)、歯齦炎(gingivitis)、歯冠周囲炎(pericoronitis)、歯周膿瘍(Parodontal abscess)、歯周症(Periodontosis)、その他の歯周疾患(otherperiodontal diseases)またはこれらの組み合わせから選択される。

0043

本明細書の用語‘歯齦炎(gingivitis)’は、歯齦組織の炎症であって、歯周疾患発病の第一のサインである。

0044

本明細書の用語‘歯周炎(periodontitis)’は、歯齦ユニット(gingival unit)だけではなく、歯槽骨、歯周靭帯及びセメント質で発生する炎症を意味する。一般に、歯周炎は、歯齦の慢性付着(attachment)の消失(loss)及び骨の放射性消失により特徴付けられる。

0045

本発明は、歯周疾患の効果的な予防及び治療のために、口腔用組成物形態として提供できて、前記口腔用組成物の剤形は、特に限定されず、通常の剤形であればよい。具体的には、歯磨き、口腔洗浄剤または口腔清潔剤などの剤形である。本発明で提供する口腔用組成物は、その剤形によって、製剤化に必要な各種の基剤添加物を含有することができて、これらの成分の種類と量は、当業者によって容易に選定できる。例えば、口腔用組成物の剤形が歯磨き類である場合、研磨剤、湿潤剤、気泡剤結合剤、甘味剤、pH調節剤防腐剤薬効成分、香料増白剤色素溶剤などを添加して製造できる。

0046

本発明の歯周疾患の予防または治療用組成物は、薬剤学的組成物に製造できる。

0047

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

0048

合成例1:ペプチド合成
クロロトリチルクロライドレジン(Chloro trityl chloride resin; CTLresin, Nova biochem Cat No. 01−64−0021) 700mgを反応容器に入れて、メチレンクロライド(MC) 10mlを加えて3分間攪拌した。溶液を除去してジメチルホルムアミドDMF) 10mlを入れて3分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に10mlのジクロロメタン(DCM)溶液を入れて、Fmoc−Ser(tBu)−OH(Bachem, Swiss) 200mmole及びジイソプロピルエチルアミン(DIEA) 400mmoleを入れた後、攪拌してよく溶かし、1時間攪拌しながら反応した。反応後、洗浄して、メタノールとDIEA(2:1)をDCMに溶かして10分間反応して、過量のDCM/DMF(1:1)で洗浄した。溶液を除去して、DMFを10ml入れて、3分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液(20%のピぺリジン(Piperidine)/DMF) 10mlを反応容器に入れて、10分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び10分間反応を維持した後、溶液を除去し、それぞれ3分間ずつDMFで2回、MCで1回、DMFで1回洗浄し、Ser(tBu)−CTL Resinを製造した。

0049

新しい反応器に10mlのDMF溶液を入れて、Fmoc−Lys(Boc)−OH(Bachem, Swiss) 200mmole、HoBt 200mmole及びBop 200mmoleを入れた後、攪拌して、よく溶かした。反応器に400mmole DIEA(N,N−Diisopropylethylamine)を分画で2回にかけて入れた後、全ての固体溶けるまで少なくとも5分間攪拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンの入った反応容器に入れて、1時間常温で攪拌しながら反応した。反応液を除去して、DMF溶液で3回5分間ずつ攪拌した後、除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト(Nihydrin test)を利用して反応程度を点検した。上記と同様に脱保護溶液で2回脱保護反応し、Lys(Boc)−Ser(tBu)−CTLResinを製造した。DMFとMCで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。

0050

選定されたアミノ酸配列に基づき、Fmoc−Gln(Trt), Fmoc−Ser(tBu), Fmoc−Asp(OtBu), Fmoc−Arg(Pbf), Fmoc−Leu, Fmoc−Asn(Trt), Fmoc−Leu, Fmoc−Ser(tBu), Fmoc−Arg(Pbf)順に連鎖反応を行った。Fmoc−保護基を脱保護溶液で10分間ずつ2回反応した後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とDIEA、HoBt(Hydroxybenzotriazole)を入れて一時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをDMF、MC及びメタノールでそれぞれ3回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、五酸化リン(Phosphorus pentoxide, P2O5)下で真空減圧し、完全に乾燥した後、脱漏溶液[TFA(Trifluroacetic acid) 95%、蒸留水2.5%、チオアニソール(Thioanisole) 2.5%] 30mlを入れた後、常温で時々振りながら2時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量の溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、50mlの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに2回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のArg−Ser−Leu−Asn−Leu−Arg−Asp−Ser−Gln−Lys−Serペプチド1(配列番号1)を0.85g合成した(収率: 89.9%)。分子量測定器を利用して測定時、分子量1303(理論値: 1303.440)が得られた。上記のような方法で、Phe−Asp−Met−Gly−Ala−Tyr−Lys−Ser−Ser−Lysペプチド2(配列番号2)も合成した(収率: 92.1%)。分子量測定器を利用して測定時、分子量1133(理論値: 1133.275)の値が得られた。

0051

0052

実施例1:合成ペプチドを活用した骨細胞成長効果の確認
合成例1で合成された配列ペプチドに対するBMP2類似効能を分析するために、筋芽細胞株(myoblast cell line)のC2C12細胞を利用したMTアッセイを進行し、増殖促進効能があるかどうかを確認した。

0053

C2C12細胞を、500ml容量の組織培養フラスコを利用して、10%牛胎児血清(FBS; fetal bovine serum, Sigma)を含むDMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco)で培養した。培養された細胞株を1%トリプシン溶液培養容器の底から剥がし、遠心分離して、細胞沈殿物だけを集めた。これを、FBSが含有されていないDMEM培養液に再び懸濁した後、96−ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり1×103細胞になるように入れて、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。24時間後、血清を完全に除いた同一な培養液で培地入れ替えた後、標準を定めるための空試料と合成ペプチドを蒸留水に滅菌状態で溶かした後、10μg/mlの濃度で72時間上記と同一条件で培養した。培養完了したウェルにMTT試料を入れて、4時間後形成されたホルマザンをDMSOに溶かして、560nm吸光度を測定し、細胞増殖を測定した。

0054

図1は、配列番号1及び配列番号2のペプチド処理後の造骨細胞の成長に対する結果である。図1a及び1bに示したように、本発明のペプチドは、造骨細胞の成長を大きく増進させた。

0055

本発明のペプチドは、BMPIb型受容体に結合して発掘されたものであって、本ペプチドは、骨形成に重要なタンパク質であるBMPと同一な機能をすることが確認された。本発明のBMP受容体Ib型結合ペプチドは、天然のBMPと類似した機能を行う。

0056

実施例2:合成ペプチドの骨分化促進効果確認
合成例1で合成された配列ペプチドに対するBMP2類似効能を分析するために、前駆−骨芽細胞株(pre−osteoblast cell line)のMC3T3−E1細胞を利用して、ALP(Alkaline Phosphatase)染色を通じて、造骨細胞分化促進効能を示すかどうか確認した。MC3T3−E1細胞を24−ウェルプレートに3×104細胞になるように入れて、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。24時間後、10% FBS, 50ug/mlアスコルビン酸+100mM b−グリセロホスフェートが含有されたアルファMEM培地に、合成したペプチドを10ug/ml, 50ug/ml濃度で処理して、培地を3日に1回ずつ入れ替えながら13日間培養した。培養完了されたプレートウェルPBSで2回洗浄後、アセトン、37%ホルムアルデヒドクエン酸溶液を含む固定バッファーで30秒間細胞固定した。白血球アルカリホスファターゼ染色キット(SIGMA)を利用して、下記の染色を進行した。

0057

FBB−アルカリ溶液亜硝酸ナトリウム溶液を1:1で混ぜて、2分間処理した後、蒸留水とナフトールAS−BIアルカリ溶液とからなるバッファーを処理して、37℃培養器で1時間発色した。

0058

実験結果、前駆−骨芽細胞MC3T3−E1に配列番号1及び2のペプチドを濃度別に処理した時、分化促進によるALP発現増加を確認した(図2a、b)。

0059

実施例3:合成ペプチドによる骨分化関連遺伝子の発現増加の確認
合成例1で合成された配列ペプチドによる骨分化関連遺伝子BSP(bone sialoprotin)及びCOL1A1(collagen type I alpha 1)のmRNA発現程度を確認するために、MC3T3−E1細胞を6−ウェルプレートに2×105細胞になるように入れて、24時間37℃, 5% CO2条件下で培養した。24時間後、FBS 10%含まれた培地に、それぞれのペプチドを10ug/ml、50ug/ml濃度で処理し、陽性対照群として使用されたBMP2は、100ng/ml濃度で処理した。2日後、PBSで洗浄し、Easy blue(Intron)を利用してRNAを分離した。1ugのRNAとRTpremixture(Intron)を利用してcDNAを合成し、PCRpremixture(Bioneer)を利用してPCRを進行した後、アガロースゲルにかけて各遺伝子のmRNA発現程度を確認した。

0060

実験結果、前駆−骨芽細胞MC3T3−E1に配列番号1及び2のペプチドを濃度別に処理した時、骨分化遺伝子のmRNA発現が増加されることを確認した(図3a、b)。

0061

実施例4:合成ペプチドによる骨分化のシグナル促進効果の確認
骨分化促進に係るシグナルのpSmad1/5/8を、本ペプチドが活性化させるかどうか確認するために、MC3T3−E1細胞を6−ウェルプレートに2×105細胞になるように入れて、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。24時間後、血清の含まれていない培地に入れ替え、24時間培養した後、ペプチドを10μg/ml濃度で処理して、陽性対照群として使用されたBMP2は、50ng/ml濃度で処理して15分間、30分間後にPBSで洗浄し、溶解バッファーを入れて溶解させた後、タンパク質を得てウェスタンブロッティングを進行した。

0062

実験結果、前駆−骨芽細胞MC3T3−E1に配列番号1及び2のペプチドを濃度別に処理した時、骨分化シグナル活性化を示すSmad1/5/8のリン酸化が促進されることを確認した(図4a、b)。

0063

実施例5:合成ペプチドによる骨細胞浸透及び増殖効果の確認
配列番号1のペプチド100μgに0.5mm×0.5mmのコラーゲンスポンジを浸して、Balb/cマウスの背中に移植して、2週間放置した。その後、コラーゲンスポンジを摘出し、パラフィンブロック制作して、H&E染色を通じてコラーゲンスポンジ内の骨細胞浸透及び増殖程度を測定した(図5)。

0064

これを通じて、イン・ビトロ上で見られた配列番号1のペプチドの骨細胞増殖及び分化のような骨形成促進効能を、イン・ビボ上でも再確認することができた。

0065

実施例6:合成ペプチドによる歯周靭帯線維母細胞の成長促進効果の確認
配列番号1及び2のペプチドの歯周組織に対する効果を確認するために、歯周靭帯線維母細胞(Human periodontal ligament fibroblast)に対する成長促進効果を分析した。歯周靭帯線維母細胞を48−ウェルプレートに1×103細胞になるように入れて、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。24時間後、血清の含まれていない培地に入れ替え、6時間培養した後、ペプチドを0.05〜10μg/ml濃度で処理して、陽性対照群として使用されたBMP2及びIGF−1は、0.2μg/ml濃度で処理して、72時間培養した。培養が完了した後、培養上澄み液を除去し、エタノールを利用して細胞を固定化した後、細胞固定が終わった後、PBS(phosphate buffer saline)で3回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色SRB溶液で処理して、1%アセト酸で十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して生存細胞の状態を観察して、20mMトリスで脱染色された溶液に対して紫外線560nmで吸光度を測定し、細胞の生存状態を測定した。

0066

実験結果、歯周靭帯線維母細胞に配列番号1及び2のペプチドを濃度別に処理した時、細胞の成長が処理濃度依存的に増加することを確認した(図6a、b)。

0067

実施例7:合成ペプチドによる歯周靭帯線維母細胞の成長促進メカニズムの確認
配列番号1及び2のペプチドの歯周靭帯線維母細胞(Human periodontal ligament fibroblast)に対する成長促進効果を確認するために、関連シグナリング分子のリン酸化程度をウェスタンブロッティングで確認した。歯周靭帯線維母細胞を6−ウェルプレートに5×105細胞になるように入れて、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した後、ペプチドを10μg/ml濃度で処理して、陽性対照群として使用されたbFGFは、0.2μg/ml濃度で処理した後、5〜15分間培養時間別に細胞を回収して、全体タンパク質を分離し、p−PI3K、p−Aktに対するウェスタンブロッティングを進行した。

0068

実験結果、歯周靭帯線維母細胞に配列番号1及び2のペプチドを処理した時、PI3K及びAktのリン酸化程度が増加することを確認した(図7a、b)。

0069

実施例8:合成ペプチドによる歯周靭帯線維母細胞の活性促進確認
配列番号1及び2のペプチドの歯周靭帯線維母細胞活性促進効果を確認するために、関連遺伝子のmRNA発現をRT−PCRで確認した。歯周靭帯線維母細胞を24−ウェルプレートに1.5×104細胞になるように入れて、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。24時間後、血清の含まれていない培地に入れ替え、24時間培養した後、ペプチドを1、10μg/ml濃度で処理して、陽性対照群として使用されたBMP−2及びIGF−1は、0.2μg/ml濃度で処理して、72時間培養した。培養完了後、PBSで洗浄して、Easy blue(Intron)を利用してRNAを分離した。1μgのRNAとRT premixture(Intron)を利用してcDNAを合成して、PCR premixture(Bioneer)を利用してPCRを進行した後、アガロースゲルにかけて各マーカーのmRNAベルを確認した。

0070

実験結果、歯周靭帯線維母細胞に配列番号1及び2のペプチドを濃度別に処理した時、細胞活性関連遺伝子であるCOL1A1(alpha−1 type I collagen)及びDSPP(Dentin sialophosphoprotein)のmRNA発現程度が増加することを確認した(図8a、b)。

実施例

0071

以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

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