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課題・解決手段

本発明は、細胞リプログラミング誘導組成物に関する。本発明の組成物に含まれるインダゾール誘導体化合物は、改善された生物学的プロファイル(biological profile)を表すと同時に効率的な細胞リプログラミング(re-programming)を行うことができる。また、本発明のインダゾール誘導体化合物は、従来の低分子細胞リプログラミング誘導化合物(例えば、リバーシンまたはBIO)と異なり、細胞毒性(cytotoxcicity)を表さないから、臨床適用時に細胞治療剤市場での高成長を期待することができる。一方、従来のインダゾール誘導体(indazole derivatives)化合物は、細胞リプログラミング用途として全く知られたことがなく、本発明の化合物の場合、従来のインダゾール誘導体化合物と比較して細胞毒性(cytotoxicity)がないか、または顕著に低いながらも細胞リプログラミング能力は、極めて優れている。

概要

背景

高齢化社会到来するにつれて、退行性疾患により既に多くの人々が苦痛を受けており、その数が増加している傾向にある。パーキンソン病筋萎縮性側索硬化症を含んだ多数の退行性難治性疾患の最も理想的な治療法は、患者細胞から由来した分化多能性幹細胞またはこれから分化した機能細胞患部移植することである。最近、退行性難治性疾患の根本的な治療のために、細胞リプログラミング(reprogramming)または逆分化技術に基づいて、細胞治療剤及び新薬開発を主導するための世界各国の技術開発競争が熾烈を極めている。

逆分化技術は、患者に身体的損傷及び不便さがほとんどない比較的容易な方法で自家-体細胞を確保し、これから人間胎芽幹細胞のような特性の誘導多能幹細胞を製造するのを可能にすることによって、患者-体細胞から特別注文型自家全分化能幹細胞株を確立する戦略を画期的に進化させた。例えば、未分化幹細胞を誘導するために特定遺伝子組合わせられたウイルスを利用でき、前記ウイルスを細胞内に伝達して遺伝子が細胞の誘電体に挿入された形態で該当蛋白質発現させる方法が複数の研究者によって提示された。一方、このような方法によって製造されたリプログラミングされた細胞は、胎芽幹細胞とほぼ同等な細胞特性分化能を有していると確認されたが、ウイルスベクトルを媒介として遺伝子を伝達したため、細胞の誘電体上にウイルス由来遺伝物質を多量含むようになるという問題点がある。また、インビボ実験では、誘導多能幹細胞から癌を形成する副作用が現れたし、これは、誘導多能幹細胞を実際臨床に適用することがまだ非常に危険でありうることを意味する。

このように逆分化幹細胞は、リプログラミング過程癌遺伝子(oncogene)を利用するという問題点を有しているから、最近では、従来のリプログラミング方式から脱皮して、体細胞を患者に必要な細胞系統に直接分化させる直接リプログラミング(direct reprogramming)に対する研究が盛んに進められている。

一方、従来の化合物のうち、細胞リプログラミング用途として使用可能な化合物(例えば、リバーシン、Auroraキナーゼ阻害剤)は、細胞に毒性があるから、細胞リプログラミング組成物として使用するには適していない。

本発明者らは、上述の問題点を解消するために、細胞に毒性がないながら分化された細胞から直ちに他の形質の細胞にリプログラミング(Direct reprogramming)を可能にする化合物を合成し、これを利用する場合、安全でかつ効率的な細胞リプログラミングが可能であることを確認した。

本明細書の全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入されて、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がさらに明確に説明される。

概要

本発明は、細胞リプログラミング誘導組成物に関する。本発明の組成物に含まれるインダゾール誘導体化合物は、改善された生物学的プロファイル(biological profile)を表すと同時に効率的な細胞リプログラミング(re-programming)を行うことができる。また、本発明のインダゾール誘導体化合物は、従来の低分子細胞リプログラミング誘導化合物(例えば、リバーシンまたはBIO)と異なり、細胞毒性(cytotoxcicity)を表さないから、臨床適用時に細胞治療剤市場での高成長を期待することができる。一方、従来のインダゾール誘導体(indazole derivatives)化合物は、細胞リプログラミング用途として全く知られたことがなく、本発明の化合物の場合、従来のインダゾール誘導体化合物と比較して細胞毒性(cytotoxicity)がないか、または顕著に低いながらも細胞リプログラミング能力は、極めて優れている。

目的

パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症を含んだ多数の退行性難治性疾患の最も理想的な治療法は、患者の細胞から由来した分化多能性幹細胞またはこれから分化した機能細胞を患部に移植することである

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

下記の式Aで表される化合物を含む細胞リプログラミング(re-programming)誘導用組成物:前記式A中、R1は、水素ニトロ、ニトロキシまたはY-カルボニルであり;前記Yは、水素、ヒドロキシハロ、C1-30アルコキシヘテロ原子として窒素酸素または黄を含むC2-30ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-20ヘテロシクロアルケニル、C6-30アリール、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R2は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R3は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;Xは、アミンアミドスルホンアミド、カルボニル、オキシムまたはイミドアミドである。

請求項2

前記組成物は、分化された細胞からリプログラミングされた細胞を誘導することを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項3

前記組成物は、分化された細胞からリプログラミングされた造骨細胞(osteoblast)または脂肪細胞(adipocyte)を誘導することを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項4

前記細胞は、哺乳動物由来であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項5

前記Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-15アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルケニル、C6-15アリール、C1-15アルキルまたはC2-15アルケニルであることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項6

前記Yにおけるヘテロシクロアルキルは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C1-5アルコキシ、C2-8アルコキシアルキル、C2-8アルコキシカルボニル、ヘテロ原子として窒素を含むC2-8ヘテロシクロアルケニルアルキル、またはこれらの組み合わせにより置換されることができることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項7

前記ヘテロシクロアルケニルアルキルは、(1H-イミダゾール-1-ly)アルキルであることを特徴とする請求項6に記載の組成物。

請求項8

前記R2は、水素、ハロ、C1-15アリール、C1-15アルコキシまたはC1-15アルキルまたはC2-15アルケニルであることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項9

前記R2におけるアリールは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキル、C2-5アルケニルまたはこれらの組み合わせにより置換されることができることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項10

前記式A中、前記Xは、イミドアミド()で、前記R2は、前記イミドアミドのCまたはN'に結合されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項11

前記ヘテロ原子は、窒素であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項12

前記化合物は、次の式1ないし式45から構成された群から選択される式で表されることを特徴とする請求項1に記載の組成物:

請求項13

前記化合物は、次の式1、式25、式30、式31、式33、式34、式35及び式45から構成された群から選択される式で表されることを特徴とする請求項12に記載の組成物:

請求項14

インダゾール誘導体(indazolederivatives)として次の式Aで表される化合物:前記式A中、R1は、水素、ニトロ、ニトロキシまたはY-カルボニルであり;前記Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-30ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-20ヘテロシクロアルケニル、C6-30アリール、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R2は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R3は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;Xは、アミン、アミド、スルホンアミド、カルボニル、オキシムまたはイミドアミドであり;ただし、前記R1がニトロで前記Xがアミドである場合、R2は、フェニルではなく;前記R1及びR3が水素で、前記XがN-ヒドロキシ-イミドアミドで前記R2がフェニルである場合、R2は、イミドアミドの炭素原子に結合しない。

請求項15

前記Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-15アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルケニル、C6-15アリール、C1-15アルキルまたはC2-15アルケニルであることを特徴とする請求項14に記載の化合物。

請求項16

前記Yにおけるヘテロシクロアルキルは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C1-5アルコキシ、C2-8アルコキシアルキル、C2-8アルコキシカルボニル、ヘテロ原子として窒素を含むC2-8ヘテロシクロアルケニルアルキル、、またはこれらの組み合わせにより置換されることができることを特徴とする請求項14に記載の化合物。

請求項17

前記ヘテロシクロアルケニルアルキルは、(1H-イミダゾール-1-ly)アルキルであることを特徴とする請求項16に記載の化合物。

請求項18

前記R2は、水素、ハロ、C1-15アリール、C1-15アルコキシまたはC1-15アルキルまたはC2-15アルケニルであることを特徴とする請求項14に記載の化合物。

請求項19

前記R2におけるアリールは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキル、C2-5アルケニルまたはこれらの組み合わせにより置換されることができることを特徴とする請求項14に記載の化合物。

請求項20

前記ヘテロ原子は、窒素であることを特徴とする請求項14に記載の化合物。

請求項21

前記化合物は、次の式1、式2及び式4ないし式45から構成された群から選択される式で表されることを特徴とする請求項14に記載の化合物:

請求項22

前記化合物は、次の式1、式25、式30、式31、式33、式34、式35及び式45から構成された群から選択される式で表されることを特徴とする請求項21に記載の化合物:

請求項23

(a)請求項1ないし請求項13に記載の細胞リプログラミング(re-programming)組成物を分化された細胞に接触させるステップと、(b)前記ステップ(a)の細胞を培養するステップとを含む分化された細胞からリプログラミングされた細胞を製造する方法。

請求項24

下記の式Aで表される化合物を含む組成物を細胞に接触させて細胞リプログラミング(re-programming)を誘導する方法:前記式A中、R1は、水素、ニトロ、ニトロキシまたはY-カルボニルであり;前記Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-30ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-20ヘテロシクロアルケニル、C6-30アリール、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R2は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R3は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;Xは、アミン、アミド、スルホンアミド、カルボニル、オキシムまたはイミドアミドである。

請求項25

前記組成物は、分化された細胞からリプログラミングされた細胞を誘導することを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項26

前記組成物は、分化された細胞からリプログラミングされた造骨細胞(osteoblast)または脂肪細胞(adipocyte)を誘導することを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項27

前記細胞は、哺乳動物由来であることを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項28

前記Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-15アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルケニル、C6-15アリール、C1-15アルキルまたはC2-15アルケニルであることを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項29

前記Yにおけるヘテロシクロアルキルは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C1-5アルコキシ、C2-8アルコキシアルキル、C2-8アルコキシカルボニル、ヘテロ原子として窒素を含むC2-8ヘテロシクロアルケニルアルキル、、またはこれらの組み合わせにより置換されることができることを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項30

前記ヘテロシクロアルケニルアルキルは、(1H-イミダゾール-1-ly)アルキルであることを特徴とする請求項29に記載の方法。

請求項31

前記R2は、水素、ハロ、C1-15アリール、C1-15アルコキシまたはC1-15アルキルまたはC2-15アルケニルであることを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項32

前記R2におけるアリールは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキル、C2-5アルケニルまたはこれらの組み合わせにより置換されることができることを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項33

前記式A中、前記Xは、イミドアミド()で、前記R2は、前記イミドアミドのCまたはN'に結合されることを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項34

前記ヘテロ原子は、窒素であることを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項35

前記化合物は、次の式1ないし式45から構成された群から選択される式で表されることを特徴とする請求項24に記載の方法:

請求項36

前記化合物は、次の式1、式25、式30、式31、式33、式34、式35及び式45から構成された群から選択される式で表されることを特徴とする請求項35に記載の方法:

技術分野

0001

本特許出願は、2014年7月1日に大韓民国特許提出された大韓民国特許出願第10—2014-0081889号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。本発明は、細胞リプログラミング誘導用組成物に関する。

背景技術

0002

高齢化社会到来するにつれて、退行性疾患により既に多くの人々が苦痛を受けており、その数が増加している傾向にある。パーキンソン病筋萎縮性側索硬化症を含んだ多数の退行性難治性疾患の最も理想的な治療法は、患者の細胞から由来した分化多能性幹細胞またはこれから分化した機能細胞患部移植することである。最近、退行性難治性疾患の根本的な治療のために、細胞リプログラミング(reprogramming)または逆分化技術に基づいて、細胞治療剤及び新薬開発を主導するための世界各国の技術開発競争が熾烈を極めている。

0003

逆分化技術は、患者に身体的損傷及び不便さがほとんどない比較的容易な方法で自家-体細胞を確保し、これから人間胎芽幹細胞のような特性の誘導多能幹細胞を製造するのを可能にすることによって、患者-体細胞から特別注文型自家全分化能幹細胞株を確立する戦略を画期的に進化させた。例えば、未分化幹細胞を誘導するために特定遺伝子組合わせられたウイルスを利用でき、前記ウイルスを細胞内に伝達して遺伝子が細胞の誘電体に挿入された形態で該当蛋白質発現させる方法が複数の研究者によって提示された。一方、このような方法によって製造されたリプログラミングされた細胞は、胎芽幹細胞とほぼ同等な細胞特性分化能を有していると確認されたが、ウイルスベクトルを媒介として遺伝子を伝達したため、細胞の誘電体上にウイルス由来遺伝物質を多量含むようになるという問題点がある。また、インビボ実験では、誘導多能幹細胞から癌を形成する副作用が現れたし、これは、誘導多能幹細胞を実際臨床に適用することがまだ非常に危険でありうることを意味する。

0004

このように逆分化幹細胞は、リプログラミング過程癌遺伝子(oncogene)を利用するという問題点を有しているから、最近では、従来のリプログラミング方式から脱皮して、体細胞を患者に必要な細胞系統に直接分化させる直接リプログラミング(direct reprogramming)に対する研究が盛んに進められている。

0005

一方、従来の化合物のうち、細胞リプログラミング用途として使用可能な化合物(例えば、リバーシン、Auroraキナーゼ阻害剤)は、細胞に毒性があるから、細胞リプログラミング組成物として使用するには適していない。

0006

本発明者らは、上述の問題点を解消するために、細胞に毒性がないながら分化された細胞から直ちに他の形質の細胞にリプログラミング(Direct reprogramming)を可能にする化合物を合成し、これを利用する場合、安全でかつ効率的な細胞リプログラミングが可能であることを確認した。

0007

本明細書の全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入されて、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がさらに明確に説明される。

発明が解決しようとする課題

0008

本発明者らは、従来のインダゾール誘導体化合物より改善した生物学的プロファイル(biological profile)を表しながら細胞リプログラミング(re-programming)を行うことができる化合物を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、細胞リプログラミング誘導能力を有する新規なインダゾール誘導体化合物を分子設計し合成し、これらの化合物が従来のインダゾール誘導体(例えば、キナーゼ阻害剤)とは異なり、細胞毒性(cytotoxcicity)を表さないながらも優れた細胞リプログラミング能力を表すことを確認することによって、本発明を完成するに至った。

0009

したがって、本発明の目的は、細胞リプログラミング(re-programming)誘導用組成物を提供することにある。

0010

本発明の他の目的は、新規なインダゾール誘導体(indazole derivatives)を提供することにある。

0011

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。

課題を解決するための手段

0012

本発明の一態様によると、本発明は、下記の式Aで表される化合物を含む細胞リプログラミング(re-programming)誘導用組成物を提供する。



前記式A中、R1は、水素ニトロ、ニトロキシまたはY-カルボニルであり;前記Yは、水素、ヒドロキシハロ、C1-30アルコキシヘテロ原子として窒素酸素または黄を含むC2-30ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-20ヘテロシクロアルケニル、C6-30アリール、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R2は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R3は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;Xは、アミンアミドスルホンアミド、カルボニル、オキシムまたはイミドアミドである。

0013

本発明の他の様態によれば、本発明は、本発明の細胞リプログラミング(re-programming)組成物を分化された細胞に接触させるステップと、(b)前記ステップ(a)の細胞を培養するステップとを含む分化された細胞からリプログラミングされた細胞を製造する方法を提供する。

0014

本発明者らは、従来のインダゾール誘導体化合物より改善された生物学的プロファイル(biological profile)を表しながら細胞リプログラミング(re-programming)を行うことができる化合物を開発しようと鋭意研究努力した結果、細胞リプログラミング誘導能力を有する新規なインダゾール誘導体化合物を分子設計し合成し、これらの化合物が従来のインダゾール誘導体(例えば、キナーゼ阻害剤)とは異なり、細胞毒性(cytotoxcicity)を表さないながらも優れた細胞リプログラミング能力を表したことを確認した。

0015

式Aで表される本発明の化合物は、分化された細胞を新しい形質の細胞にリプログラミングする化合物であって、インダゾール(indazole)を母核として化学的に合成される。従来のインダゾール誘導体(indazole derivatives)化合物は、細胞リプログラミング用途として全く知られたことがなく、本発明の化合物の場合、従来のインダゾール誘導体化合物と比較して、細胞毒性(cytotoxicity)がないか、または顕著に低いながらも細胞リプログラミング能力は、極めて優れている。従来の直接リプログラミング(direct reprogramming)方法は、ウイルスを利用して遺伝子を導入する方法で患者に直接適用し難く、誘導過程の効率性が低く、免疫的に問題になるという短所があった。本発明の低分子物質を利用した直接リプログラミングの場合、ウイルスを介した遺伝子導入の代わりに、低分子物質の処理だけでリプログラミングを誘導するから、安定性経済性及び効率性面において極めて優れている。

0016

本発明の組成物は、分化された細胞からリプログラミングされた細胞を誘導するのに極めて有効である。本発明によれば、本発明の組成物は、哺乳動物由来の分化された細胞からリプログラミングされた骨形成(osteogenic lineage)細胞または脂肪形成(adipogenic lineage)細胞など、多様な系統細胞株を誘導できる。本発明の一実施例によれば、本発明の組成物は、筋芽細胞(myoblast)から造骨細胞(osteoblast)または脂肪細胞(adipocyte)への分化を誘導する。

0017

分化された細胞とは、特に限定されず、例えば、体細胞または体細胞幹細胞を含む。体細胞とは、成体を構成する細胞として分化能及び自家生産能が制限された細胞を意味し、前記体細胞は、人間の皮膚、毛髪、脂肪または骨(bone)を構成する体細胞でありうる。

0018

前記分化された細胞は、人間、マウス及びうさぎなどの多様な哺乳動物から由来した細胞であっても良く、好ましくは、人間から由来した細胞でありうる。

0019

本明細書において用語「リプログラミング(Reprogramming)」は、分化能のない細胞または一定部分に分化能のある細胞など、互いに異なる様態として存在する分化された細胞から、最終的に新しい類型の細胞または新しい類型の分化潜在力を有する状態に復元または転換されうるプロセスを意味する。本発明によれば、分化された細胞は、本発明の組成物と接触するにつれて、0%ないし100%の異なる形質を表す細胞にリプログラミングされることができる。

0020

本明細書において、式Aのインダゾール誘導体を定義するために用いられる用語「ニトロ」は、ハロゲン族元素を表し、例えば、フルオロクロロ、ブロモ及びヨードを含む。

0021

用語「ニトロキシ」は、-O-N=O官能基を意味する。

0022

用語「カルボニル」は、-(C=O)-官能基を意味する。

0023

用語「ヒドロキシ」は、-OH官能基を意味する。

0024

用語「ハロ」は、ハロゲン族元素を表し、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを含む。

0025

用語「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の非置換または置換された飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチルエチルプロピルイソブチルペンチル、へキシルヘプチルオクチル、ノニルデシルウンデシルトリデシルペンタデシル及びヘプタデシルなどを含む。C1-30アルキルは、炭素数1ないし30のアルキルユニットを有するアルキル基を意味し、C1-30アルキルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。本発明によれば、式A中、Y位置でのC1-30アルキルはC1-15アルキルで、式A中、R2位置のC1-30アルキルは、好ましくは、C1-15アルキルである。

0026

用語「アルケニル」は、指定された炭素数を有する直鎖または分岐鎖の非置換または置換された不飽和炭化水素基を表し、例えば、エテニルビニル、プロフェニルアリル、イソプロペニルブテニルイソブテニル、t-ブテニル、n-ペンテニル及びn-ヘキセニルを含む。C2-30アルケニルが炭素数2ないし30のアルケニルユニットを有するアルケニル基を意味し、C2-30アルケニルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。本発明によれば、式A中、Y位置でのC2-30アルケニルは、C2-15アルケニルであり、式A中、R2位置のC2-30アルケニルは、C2-15アルケニルである。

0027

用語「アルコキシ」は、1個の酸素原子と結合されたアルキル基またはアリールを意味する。例えば、メトキシエトキシプロトキシ、アリールオキシなどを含む。C1-30アルコキシは、炭素数1ないし30のアルコキシユニットを有するアルキル基を意味し、C1-30アルコキシが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。

0028

用語「アルコキシアルキル」は、アルコキシに置換されたアルキル基を意味する。C2-5アルコキシアルキルは、炭素数2ないし5のアルコキシアルキルユニットを有するアルコキシアルキル基を意味し、C2-5アルコキシアルキルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。

0029

用語「アルコキシカルボニル」は、アルコキシに置換されたカルボニルを意味する。C2-5アルコキシカルボニルは、炭素数2ないし5のアルコキシカルボニルユニットを有するアルコキシカルボニルを意味し、C2-5アルコキシカルボニルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。

0030

用語「ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むヘテロシクロアルキル」は、炭素と水素、最小一つのヘテロ原子(窒素、酸素または黄)を含む非-芳香族性サイクリック炭化水素基を意味する。前記ヘテロ原子は、好ましくは、窒素または酸素で、最も好ましくは、窒素である。本発明によれば、ヘテロ原子の数は、1-4個、1-3個、または1-2個である。C2-30ヘテロシクロアルキルは、リング構造を形成する炭素の数が2-30であるヘテロシクロアルキルを意味する。

0031

一方、前記ヘテロシクロアルキルは、全体的にまたは部分的に置換または非置換された炭素輪であって、前記ヘテロシクロアルキルは、ヒドロキシ、ハロ、C1-C5置換または非置換された直鎖または分枝鎖アルキル、C1-C5直鎖または分枝鎖アルコキシ、C1-C5直鎖または分枝鎖アルケニル、C2-8アルコキシアルキル、C2-8アルコキシカルボニル、ヘテロ原子として窒素を含むC2-8ヘテロシクロアルケニルアルキル



またはこれらの組み合わせにより置換されることができる。

0032

用語「ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むヘテロシクロアルケニル」は、炭素と水素、及び最小一つのヘテロ原子(窒素、酸素または黄)及び最小一つの二重結合を含む非-芳香族性サイクリック炭化水素基を意味する。前記ヘテロ原子は、好ましくは、酸素または窒素で、最も好ましくは、窒素である。本発明によれば、ヘテロ原子の数は、1-4個、1-3個、または1-2個である。C2-30ヘテロシクロアルケニルは、リング構造を形成する炭素の数が2-30であるヘテロシクロケニルを意味する。

0033

用語「ヘテロシクロアルケニルアルキル」は、ヘテロシクロアルケニル基に置換されたアルキル基を意味する。C2-8ヘテロシクロアルケニルアルキルは、炭素数2ないし5のヘテロシクロアルケニルアルキルユニットを有するヘテロシクロアルケニルアルキルを意味し、C2-5ヘテロシクロアルケニルアルキルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。

0034

用語「アリール」は、全体的にまたは部分的に不飽和された置換または非置換されたモノサイクリックまたはポリサクリック炭素輪を意味する。C6-30アリールは、炭素数6ないし30の炭素輪原子を有するアリール基を意味し、C6-30アリールが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。好ましくは、アリールは、モノアリールまたはビアリールである。モノアリールは、炭素数5-6を有することが好ましく、ビアリールは、炭素数9-10を有することが好ましい。本発明によれば、前記アリールは、置換または非置換されたフェニルである。モノアリール、例えば、フェニルが置換された場合には、多様な位置で多様な置換体により置換がなされることができ、例えば、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、C1-C5置換または非置換された直鎖または分枝鎖アルキル、C1-C5直鎖または分枝鎖アルコキシ、C1-C5直鎖または分枝鎖アルケニルまたはこれらの組み合わせにより置換されることができる。

0035

特に、好ましいアリール部位は、フェニル、ベンジルナフチルピロイルピロリジニルピリジニルピリミジニルプリニルキノリニルイソキノリニルフリルチオフェニル、イミダゾリルオキサゾリルチアゾリルピラゾリル及びチエニルを含むが、これに限定されるものではない。

0036

用語「アミン(amine)」は、非結合対(lone pair)を有する塩基性窒素原子を含む官能基を意味する。C1-10アミンは、-NH2または炭素数1ないし10のアミンユニットを有するアミン基を意味し、C1-10アミンが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。本発明によれば、式A中、X位置のC1-10アミンは、C1-5アミンまたは-NH2である。

0037

用語「アミド」は、窒素原子に結合されたアシル基から構成された官能基を意味する。C1-10アミドは、炭素数1ないし10のアミドユニットを有するアミド基を意味し、C1-10アミドが置換された場合、置換体の炭素数は含まれないことである。本発明によれば、前記アミドは、R-CO-NH-R'、スルホンアミドまたはホスホリルアミドである。

0038

用語「オキシム(oxime)」は、RR'C=N-OHのイミン(imines)を含む官能基を意味する。

0039

用語「イミドアミド」は、N-CR=N'H2を含む官能基を意味する。

0040

本発明によれば、前記式A中、Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-15アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルケニル、C6-15アリール、C1-15アルキルまたはC2-15アルケニルである。

0041

本発明によれば、前記Y中、ヘテロシクロアルキルは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C1-5アルコキシ、C2-8アルコキシアルキル、C2-8アルコキシカルボニル、ヘテロ原子として窒素を含むC2-8ヘテロシクロアルケニルアルキル、



またはこれらの組み合わせにより置換されることができる。

0042

本発明の一具現例によると、前記Yのヘテロシクロアルケニルアルキルは、(1H-イミダゾール-1-ly)アルキルである。

0043

本発明によれば、前記R2は、水素、ハロ、C1-15アリール、C1-15アルコキシまたはC1-15アルキルまたはC2-15アルケニルであり;前記R2におけるアリールは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキル、C2-5アルケニルまたはこれらの組み合わせにより置換されることができる。

0044

一方、前記式A中、前記Xがイミドアミド(

)である場合、前記R2は、前記イミドアミドのCまたはN'に結合されることができる。

0045

本発明の化合物は、一つまたはそれ以上のキラルセンター及び/または幾何異性センターを有することができ、これに本発明は、前記式Aで表されるすべての立体異性質体、すなわち、光学異性質体、部分立体異性質体及び幾何異性質体を含む。

0046

本発明によれば、本発明の細胞リプログラミング(re-programming)誘導用組成物は、次の式1ないし式45から構成された群から選択される式で表される化合物である:

0047

本発明によれば、本発明の細胞リプログラミング(re-programming)誘導用組成物は、次の式1、式25、式30、式31、式33、式34、式35及び式45から構成された群から選択される式で表される化合物である:

0048

本発明のさらに他の容態によれば、本発明は、インダゾール誘導体(indazole derivatives)として次の式Aで表される化合物を提供する:



前記式A中、R1は、水素、ニトロ、ニトロキシまたはY-カルボニルであり;前記Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-30ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-20ヘテロシクロアルケニル、C6-30アリール、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R2は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R3は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;Xは、アミン、アミド、スルホンアミド、カルボニル、オキシムまたはイミドアミドであり;ただし、前記R1がニトロで前記Xがアミドである場合、R2は、フェニルではなく;前記R1及びR3が水素で、前記XがN-ヒドロキシ-イミドアミドで前記R2がフェニルである場合、R2は、イミドアミドの炭素原子に結合しない(またはR2は、イミドアミドのN'原子に結合する)。

0049

本発明によれば、前記Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-15アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-15ヘテロシクロアルケニル、C6-15アリール、C1-15アルキルまたはC2-15アルケニルである。

0050

本発明によれば、式Aの前記Yにおけるヘテロシクロアルキルは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C1-5アルコキシ、C2-8アルコキシアルキル、C2-8アルコキシカルボニル、ヘテロ原子として窒素を含むC2-8ヘテロシクロアルケニルアルキル、



またはこれらの組み合わせにより置換されることができる。本発明の一具現例によれば、前記ヘテロシクロアルケニルアルキルは、(1H-イミダゾール-1-ly)アルキルである。

0051

本発明によれば、前記式A中、前記R2は、水素、ハロ、C1-15アリール、C1-15アルコキシまたはC1-15アルキルまたはC2-15アルケニルであり、前記R2におけるアリールは、ヒドロキシ、ハロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキル、C2-5アルケニルまたはこれらの組み合わせにより置換されることができる。

0052

本発明の一具現例によれば、前記式A中、前記ヘテロ原子は、窒素である。

0053

本発明のインダゾール誘導体化合物は、次の式1、式2及び式4ないし式45から構成された群から選択される式で表される。

0054

本発明によれば、本発明のインダゾール誘導体化合物は、次の式1、式25、式30、式31、式33、式34、式35及び式45から構成された群から選択される式で表される。

0055

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、下記の式Aで表される化合物を含む組成物を細胞に接触させて細胞リプログラミング(re-programming)を誘導する方法を提供する:



前記式A中、R1は、水素、ニトロ、ニトロキシまたはY-カルボニルであり;前記Yは、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アルコキシ、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-30ヘテロシクロアルキル、ヘテロ原子として窒素、酸素または黄を含むC2-20ヘテロシクロアルケニル、C6-30アリール、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R2は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;R3は、水素、ヒドロキシ、ハロ、C1-30アリール、C1-30アルコキシ、C1-30アルキルまたはC2-30アルケニルであり;Xは、アミン、アミド、スルホンアミド、カルボニル、オキシムまたはイミドアミドである。

0056

本発明の細胞リプログラミング(re-programming)誘導方法は、上述の本発明の細胞リプログラミング誘導用組成物を利用することであって、この両者に共通した内容は、繰り返し記載による明細書の過度複雑性を避けるために、その記載を省略する。

発明の効果

0057

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のとおりである。
(a)本発明は、細胞リプログラミング誘導組成物に関する。
(b)本発明のインダゾール誘導体化合物は、改善された生物学的プロファイルを表すと共に、効率的な細胞リプログラミング(re-programming)を行うことができる。
(c)本発明のインダゾール誘導体化合物は、従来の低分子細胞リプログラミング誘導化合物(例えば、リバーシンまたはBIO)とは異なり、細胞毒性(cytotoxcicity)を表さないから、臨床適用時に細胞治療剤または細胞リプログラミング誘導剤市場での高成長を期待することができる。
(d)一方、従来のインダゾール誘導体(indazole derivatives)化合物は、細胞リプログラミング用途として全く知られたことがなく、非特異的細胞毒性によって高濃度処理が不可能である。
(e)本発明の化合物の場合、従来のインダゾール誘導体化合物と比較して細胞毒性(cytotoxicity)がないか、または顕著に低く、かつ細胞リプログラミング能力が非常に優れており、新規な作用機序を有する。

図面の簡単な説明

0058

図1は、C2C12マウス筋芽細胞(myoblast)を本発明の化合物と接触させた後に造骨細胞にリプログラミングされた結果を示す。本発明の化合物であるLDD-1821、LDD-1664、LDD-1945、LDD-2199またはLDD-2200と接触させた後、アリザリンレッド染色して観察した(ATDC5:軟骨前駆細胞株)。
図2は、C2C12マウス筋芽細胞(myoblast)を本発明の化合物と接触させた後に造骨細胞にリプログラミングされた結果を示す。本発明の化合物であるLDD-1821、LDD-1664、LDD-1945、LDD-2199またはLDD-2200と接触させた後、アリザリンレッド染色して観察した(ATDC5:軟骨前駆細胞株)。
図3は、C2C12マウス筋芽細胞(myoblast)を本発明の化合物と接触させて、アリザリンレッドアッセイした結果を示す。グラフは、各化合物を処理した場合の吸光度を示す。
図4は、C2C12マウス筋芽細胞でのMTアッセイ結果を示す。

実施例

0059

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、この技術分野における通常の知識を有した者にとって自明であるはずである。

0060

[合成例]
[合成模式図1

0061

以下、合成例において記載する反応過程及び置換基は、前記合成模式図上の反応過程及び置換基を意味する。

0062

[一般的合成過程
[ステップ(a)の一般的過程]
出発物質(1.0g,6.02mmol)をn-ブタノール(20mL)に溶解させた。以後、ヒドラジンハイドレート(420μL,7.22mmol)を溶液に添加した。前記混合物を110℃で2時間の間に撹拌し冷却させた後、メチレンクロリド(MC)を反応物に添加して生成された沈殿物をろ過することにより、目的化合物を得た。

0063

[合成例1:5-ニトロ-1H-インダゾール-3-イルアミン(化合物1)]
2-フルオロ-5-ニトロベンゾニトリル(1.0g,6.02mmol)をn-ブタノール(20mL)に溶解させた。以後、ヒドラジンハイドレート(420μL,7.22mmol)を溶液に添加した。前記混合物を110℃で2時間の間に撹拌し冷却させた後、MCを反応物に添加した後に生成された沈殿物をろ過して、目的化合物を得た(収率84%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.89(d,1H)、8.05(dd,1H)、7.34(d,2H)、5.98(s,2H).MASS=178.15

0064

[合成例2:3-アミノ-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物2)]
3-シアン-4-フルオロ安息香酸(1.0g,6.02mmol)をn-ブタノール(20mL)に溶解させた。以後、ヒドラジンハイドレート(420μL,7.22mmol)を溶液に添加した。前記混合物を110℃で2時間の間に撹拌し冷却させた後、生成された沈殿物をろ過した後MeOHで洗浄して、目的化合物を得た(収率55%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、8.45(s,1H)、7.80(d,2H)、7.22(d,1H)、5.59(s,2H).MASS=177.16

0065

[ステップ(b-2)の一般的過程]
合成模式図1化学構造式2の化合物(50mg,0.28mmol)をピリジン(0.3mL)に溶解させた。以後、R2-ベンゾイルクロリド(16.5μL,0.28mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。合わせられた有機層ブライン(brine)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた後に真空濃縮した後、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物(化合物3ないし化合物6)を得た。

0066

[合成例3(LDD-1664):N-(5-ニトロ-1(2)H-インダゾール-3-イル)-ベンズアミド(化合物3)]
5-ニトロ-1H-インダゾール-3-イルアミン(50mg,0.28mmol)をピリジン(0.3mL)に溶解させた。次に、ベンゾイルクロリド(16.5μL,0.28mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。カラムクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率42%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.95(d,1H)、8.22(dd,1H)、8.12(m,2H)、8.12(m,2H)、7.69(m,4H).MASS=282.26

0067

[合成例4(LDD-1663):3-ブロモ-N-(5-ニトロ-1H-インダゾール-3-イル)ベンズアミド(化合物4)]
5-ニトロ-1H-インダゾール-3-イルアミン(0.14mmol)をピリジン(0.4mL)に溶解させた。次に、3-ブロモベンゾイルクロリド(19μL,0.14mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。前記抽出物ジクロロメタン(DCM)とヘキサンを添加して沈殿物を作った後にろ過して、目的化合物を得た(収率37%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H)、8.93(d,1H)、8.26(s,1H)、8.19(dd,1H).MASS=361.16

0068

[合成例5(LDD-2348):4-メトキシ-N-(5-ニトロ-1H-インダゾール-3-yl)ベンズアミド(化合物5)]
5-ニトロ-1H-インダゾール-3-イルアミン(25mg,0.14mmol)をピリジン(0.3mL)に溶解させた。次に、4-メトキシベンゾイルクロリド(24mg,0.14mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。カラムクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率40%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.93(d,1H)、8.20(dd,1H)、8.12(d,2H)、7.67(d,1H)、7.11(d,2H)、3.86(s,3H).MASS=312.28

0069

[合成例6(LDD-1665):3-ベンズアミド-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物6)]
3-アミノ-1H-インダゾール-5-カルボン酸(25mg,0.14mmol)をピリジン(0.5mL)に溶解させた。次に、ベンゾイルクロリド(16.5μL,0.14mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。DCMを利用して沈殿物を作った後にろ過して、目的化合物を得た(収率31%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.98(s,1H)、8.11(d,2H)、7.94(dd,1H)、7.66(t,1H)、7.58(t,3H).MASS=281.27

0070

[ステップ(c-3)の一般的過程]
合成模式図1、化学構造式3の化合物(25mg,0.14mmol)をジメチルホルムアミドDMF、1mL)に溶解させた。以後、(ジメチルアミノピリジンDMAP、0.03mmol)、ピペリジン(0.17mmol)及びエチレンジクロリド(EDC、0.28mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0071

[合成例7(LDD-1820):N-(5-(ピペリジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-イル)ベンズアミド(化合物7)]
3-ベンズアミド-1H-インダゾール-5-カルボン酸(25mg,0.14mmol)をDMF(1mL)に溶解させた。DMAP(0.03mmol)、ピペリジン(0.17mmol)及びEDC(0.28mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率33%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.02(s,1H)、9.26(s,1H)、8.15(s,1H)、8.04(d,2H)、7.59(m,3H)、7.37(d,1H)、7.21(d,1H)、3.59(m,4H)、1.75(m,6H).MASS=348.41

0072

[ステップ(d-4)の一般的過程]
合成模式図1、化学構造式3の化合物(25mg,0.14mmol)をDMF(1mL)に溶解させた。DMAP(0.03mmol)、t-ブチル4-アミノピペリジン-1-カルボキシレート(0.17mmol)及びEDC(0.28mmol)を反応混合物に添加した後、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0073

[合成例8(LDD-1690):tert-ブチル4-(3-ベンズアミド1H-インダゾール-5-カルボニル)ピペラジン-1-カルボキシレート(化合物8)]
3-ベンズアミド-1H-インダゾール-5-カルボン酸(25mg,0.14mmol)をDMF(1mL)に溶解させた。DMAP(0.03mmol)、t-ブチル4-アミノピペリジン-1-カルボキシレート(0.17mmol)及びEDC(0.28mmol)を反応混合物に添加した後、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率33%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.82(s,1H)、8.23(s,2H)、8.07(d,2H)、7.85(d,1H)、7.60(m,4H)、3.96(m,3H)、2.79(m,2H)、1.74(m,2H)、1.41(m,11H).MASS=449.51

0074

[ステップ(e-5)の一般的過程]
合成模式図1、化学構造式5の化合物(30mg,0.065mmol)をDCM(0.7mL)に溶解させた。0℃でTFA(0.2ml)を入れた後に0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にアンモニアで飽和(saturation)されたクロロホルムメタノールを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0075

[合成例9(LDD-1691):N-(5-(ピペラジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-イル)ベンズアミド(化合物9)]
tert-ブチル4-(3-ベンズアミド1H-インダゾール-5-カルボニル)ピペラジン-1-カルボキシレート(30mg,0.065mmol)をDCM(0.7mL)に溶解させた。次に、0℃でトリフルオロ酢酸(TFA、0.2ml)を入れた後、0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にアンモニアで飽和されたクロロホルムとMeOHを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率20%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.86(s,1H)、8.40(d,1H)、8.24(s,1H)、8.07(d,2H)、7.85(d,1H)、7.63(m,4H).MASS=349.39

0076

[合成模式図2

0077

以下、合成例において記載する反応過程及び置換基は、前記合成模式図上の反応過程及び置換基を意味する。

0078

[一般的合成過程]
[ステップ(a)の一般的過程]
合成模式図2、化学構造式2の化合物(50mg,0.28mmol)をピリジン(0.9mL)に溶解させた。次に、R2-ベンゼンスルホニルクロリド(36μL,0.28mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。DCMを利用して沈殿物を作った後にろ過して、目的化合物を得た。

0079

[合成例10(LDD-1667):N-(5-ニトロ-1H-インダゾール-3-イル)ベンゼンスルホンアミド(化合物10)]
5-ニトロ-1H-インダゾール-3-イルアミン(50mg,0.28mmol)をピリジン(0.9mL)に溶解させた。次に、ベンゼンスルホニルクロリド(36μL,0.28mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、アセテート及び1N HClで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した.MCを利用して沈殿物を作った後にろ過して、目的化合物を得た(収率43%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.14(s,1H)、8.70(d,1H)、8.12(dd,1H)、7.78(d,2H)、7.55(m,4H).MASS=318.31

0080

[合成例11(LDD-1666):3-ブロモ-N-(5-ニトロ-1H-インダゾール-3-yl)ベンゼンスルホンアミド(化合物11)]
5-ニトロ-1H-インダゾール-3-イルアミン(0.28mmol)をピリジン(0.9mL)に溶解させた。次に、3-ブロモベンゼンスルホニルクロリド(40μL,0.28mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。前記抽出物にDCMとヘキサンを添加して沈殿物を作った後にろ過して、目的化合物を得た(収率50%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.99(s,1H)、8.72(d,1H)、8.19(m,1H)、7.99(t,1H)、7.87(d,1H)、7.81(d,1H)、7.63(d,1H)、7.54(t,1H).MASS=397.20

0081

[合成例12(LDD-1668):3-(フェニルスルホンアミド)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物12)]
3-アミノ-1H-インダゾール-5-カルボン酸(25mg,0.14mmol)をピリジン(0.7mL)に溶解させた。ベンゼンスルホニルクロリド(20μL,0.14mmol)を反応混合物に添加し1時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。メタノールを利用して沈殿物を作った後にろ過して、目的化合物を得た(収率20%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.88(s,1H)、8.42(s,1H)、7.89(dd,3H)、7.63(m,4H).MASS=317.32

0082

[ステップ(b-2)の一般的過程]
合成模式図2、化学構造式7の化合物(25mg,0.08mmol)をDMF(0.8mL)に溶解させた。DMAP(0.02mmol)、t-ブチル4-アミノピペリジン-1-カルボキシレート(0.09mmol)及びEDC(0.16mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0083

[合成例13(LDD-1692):tert-ブチル4-(3-(フェニルスルホンアミド)-1H-インダゾール-5-カルボニル)ピペラジン-1-カルボキシレート(化合物13)]
3-(フェニルスルホンアミド)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(25mg,0.08mmol)をDMF(0.8mL)に溶解させた。DMAP(0.015mmol)、t-ブチル4-アミノピペリジン-1-カルボキシレート(0.09mmol)及びEDC(0.16mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率50%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.77(s,1H)、8.31(d,2H)、7.83(m,3H)、7.62(m,1H)、7.57(t,2H)、7.44(d,1H).MASS=485.56

0084

[ステップ(c-3)の一般的過程]
合成模式図2、化学構造式8の化合物(20mg,0.038mmol)をDCM(0.4mL)に溶解させた。0℃でTFA(0.15ml)を入れた後に0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にアンモニアで飽和されたクロロホルムとMeOHを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0085

[合成例14(LDD-1693):N-(5-(ピペラジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-yl)ベンゼンスルホンアミド(化合物14)]
tert-ブチル4-(3-(フェニルスルホンアミド)-1H-インダゾール-5-カルボニル)ピペラジン-1-カルボキシレート(20mg,0.038mmol)をDCM(0.4mL)に溶解させた。次に、0℃でTFA(0.15ml)を入れた後に0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にアンモニアで飽和されたクロロホルムとメタノールを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率20%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.92(s,1H)、8.28(d,1H)、8.22(s,1H)、7.80(m,2H)、7.68(d,1H)、7.38(d,3H)、7.20(d,1H)、3.95(m,1H)、3.16(d,3H)、2.78(t,2H)、1.85(m,2H)、1.57(m,2H).MASS=385.44

0086

[合成模式図3

0087

以下、実施例において記載する反応過程及び置換基は、前記合成模式図上の反応過程及び置換基を意味する。

0088

[一般的合成過程]
[ステップ(a)の一般的過程]
出発物質(1.0g,6.2mmol)に水(40ml)を入れた後、水に溶かしてある亜硝酸ナトリウム(sodium nitrite,4.3g,62mmol)を添加した。次に、反応混合物に3N HClを一滴ずつゆっくり20分間滴加した。常温で8時間撹拌した後、生成された沈殿物をろ過した。完全に乾燥させた後に、目的化合物を得た。

0089

[合成例15:5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルバルデヒド(化合物15)]
5-ニトロ-1H-インドール(1.0g,6.2mmol)に水(40ml)を入れた後、水に溶かしてある亜硝酸ナトリウム(4.3g,62mmol)を添加した。次に、反応混合物に3N HCl(21ml)を一滴ずつゆっくり20分間滴加した。常温で8時間撹拌した後に生成された沈殿物をろ過した。真空状態で完全に乾燥させた後に、目的化合物を得た(収率40%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.98(s,1H)、9.75(s,1H)、8.87(s,1H)、8.56(m,2H).MASS=191.15

0090

[合成例16:3-ホルミル-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物16)]
1H-インドール-5-カルボン酸(1.0g,6.02mmol)に水(40ml)を入れた後、水に溶かしてある亜硝酸ナトリウム(4.3g,62mmol)を添加した。反応混合物に3N HCl(21ml)を1滴ずつゆっくり20分間滴加した。常温で8時間撹拌した後に生成された沈殿物をろ過した。真空状態で完全に乾燥させた後に、目的化合物を得た(収率84%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H)、8.74(s,1H)、8.02(d,1H)、7.75(d,2H).MASS=190.16

0091

[ステップ(b-2)の一般的過程]
合成模式図3、化学構造式11の化合物(500mg,2.63mmol)をDMF(13mL)に溶解させた。次に、ヒドロキシルアミンヒドロクロリド(550mg,7.89mmol)とトリエチルアミン(110μL,7.89mmol)を反応混合物に添加し80℃で12時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。別の精製過程無しで次の反応を行うための目的化合物を得た。

0092

[合成例17:5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルボキサルデヒドオキシム(化合物17)]
5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルバルデヒド(500mg,2.63mmol)をDMF(13mL)に溶解させた。ヒドロキシルアミンヒドロクロリド(550mg,7.89mmol)とトリエチルアミン(110μL,7.89mmol)を反応混合物に添加し80℃で12時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。別の精製過程無しで次の反応を行うための目的化合物を得た(収率93%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.98(s,1H)、11.12(s,1H)、8.87(s,1H)、8.56(m,2H)、7.95(s,1H).MASS=206.16

0093

[合成例18:3-((ヒドロキシイミノ)メチル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物18)]
3-ホルミル-1H-インダゾール-5-カルボン酸(500mg,2.63mmol)をDMF(13mL)に溶解させた。ヒドロキシルアミンヒドロクロリド(550mg,7.89mmol)とトリエチルアミン(110μL,7.89mmol)を反応混合物に添加し80℃で12時間の間に撹拌した後、エチルアセテート及び1N HClで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。別の精製過程無しで次の反応を行うための目的化合物を得た(収率93%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.61(s,1H)、8.75(s,1H)、8.38(s,1H)、7.96(d,2H)、7.62(d,1H).MASS=205.17

0094

[ステップ(c-3)の一般的過程]
合成模式図3、化学構造式12の化合物(500mg,2.44mmol)をDMF(12mL)に溶解させた。次に、N-クロロスクシンイミド(320mg,2.44mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を40℃で1時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。別の精製過程無しで得た目的物を用いて次の反応を進行した。

0095

[合成例19:N-ヒドロキシ-5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルイミドイルクロリド(化合物19)]
5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルボキサルデヒドオキシム(500mg,2.44mmol)をDMF(12mL)に溶解させた。N-クロロスクシンイミド(320mg,2.44mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を40℃で1時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。別の精製過程無しで目的化合物を得た(収率80%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.98(s,1H)、11.12(s,1H)、8.87(s,1H)、8.56(m,2H).MASS=240.60

0096

[合成例20:3-(クロロ(ヒドロキシイミノ)メチル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物20)]
3-((ヒドロキシイミノ)メチル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(500mg,2.44mmol)をDMF(12mL)に溶解させた。N-クロロスクシンイミド(320mg,2.44mmol)を反応混合物に添加した後に混合物を40℃で1時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。別の精製過程無しで目的化合物を得た(収率86%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.98(s,1H)、8.78(s,1H)、7.99(d,1H)、7.68(d,1H).MASS=239.62

0097

[ステップ(d-4)の一般的過程]
合成模式図3、化学構造式13の化合物(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。次に、R2-アニリン(35μL,0.38mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0098

[合成例21(LDD-2369):N'-ヒドロキシ-5-ニトロ-N-フェニル-1H-インダゾール-3-カルボキシイミドアミド(化合物21)]
N-ヒドロキシ-5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルイミドイルクロリド(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。アニリン(35μL,0.38mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率33%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.97(s,1H)、8.90(d,1H)、8.47(s,1H)、8.23(dd,1H)、7.75(dd,1H).MASS=297.27

0099

[合成例22(LDD-2370):N-(4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシ-5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルボキシイミドアミド(化合物22)]
N-ヒドロキシ-5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルイミドイルクロリド(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。次に、4-フルオロアニリン(37μL,0.38mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率33%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.95(s,1H)、8.92(d,1H)、8.49(s,1H)、8.23(dd,1H)、7.75(dd,1H)、6.94(m,2H)、6.75(m,2H).MASS=315.26

0100

[合成例23(LDD-2371):N'-ヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)-5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルボキシミドアミド(化合物23) ]
N-ヒドロキシ-5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルイミドイルクロリド(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。次に、4-ヒドロキシアニリン(41mg,0.38mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率33%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.65(s,1H)、8.92(s,1H)、8.84(d,1H)、8.21(dd,1H)、8.09(s,1H)、7.72(d,1H)、6.60(m,2H)、6.50(m,2H).MASS=313.27

0101

[合成例24(LDD-2372):N'-ヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルボキシミドアミド(化合物24)]
N-ヒドロキシ-5-ニトロ-1H-インダゾール-3-カルイミドイルクロリド(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。次に、4-メトキシアニリン(41mg,47mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率33%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.74(s,1H)、8.87(d,H)、8.23(s,1H)、8.21(dd,1H)、7.72(d,1H)、6.68(m,4H).MASS=327.30

0102

[合成例25(LDD-1986):3-(N'-ヒドロキシ-N-フェニルカルバムイミドイル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物25)]
3-(クロロ(ヒドロキシイミノ)メチル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。次に、アニリン(35μL,0.38mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率75%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.82(s,1H)、8.66(s,1H)、8.38(s,1H)、7.95(dd,1H)、7.60(d,1H)、7.07(t,2H)、6.78(t,1H)、6.69(d,2H).MASS=296.29

0103

[合成例26(LDD-2197):3-N-(4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシカルバムイミドイル-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物26)]
3-(クロロ(ヒドロキシイミノ)メチル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。次に、4-フルオロアニリン(37μL,0.38mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率29%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.79(s,1H)、8.67(s,1H)、8.40(s,1H)、7.95(dd,1H)、7.60(dd,1H)、6.93(m,2H)、6.714(m,2H).MASS=314.28

0104

[合成例27(LDD-2349):3-(N'-ヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)カルバムイミドイル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物27)]
3-(クロロ(ヒドロキシイミノ)メチル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。次に、4-ヒドロキシアニリン(41mg,0.38mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率31%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.23(s,1H)、10.45(s,1H)、8.93(s,1H)、8.90(s,1H)、7.92(m,2H)、7.47(d,1H)、6.64(d,2H)、6.40(d,2H).MASS=312.28

0105

[合成例28(LDD-2198):3-(N'-ヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)カルバムイミドイル)-1H-iインダゾール-5-カルボン酸(化合物28)]
3-(クロロ(ヒドロキシイミノ)メチル)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(30mg,0.13mmol)をエタノール(1.5mL)に溶解させた。次に、4-メトキシアニリン(41mg,47mmol)を添加した後に混合物を80℃で2時間の間に撹拌した。得られた残余物は、エタノールを濃縮して除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率31%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.60(s,1H)、8.59(s,1H)、8.11(s,1H)、7.89(dd,1H)、7.54(dd,1H)、6.61(s,4H)、3.58(s,3H).MASS=326.31

0106

[ステップ(e-5)の一般的過程]
合成例25にて得られた化合物(10mg,0.02mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、0℃でテトラメチルシランTMS)-ジアゾメタン(100μL)をゆっくり滴加した後に0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0107

[合成例29(LDD-2196):メチル-3-(N'-ヒドロキシ-N-フェニルカルバムイミドイル)-1H-インダゾール-5-カルボキシレート(化合物29)]
合成例25にて得られた化合物(10mg,0.02mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、0℃でTMS-ジアゾメタン(100μL)をゆっくり滴加した後に0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率83%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.27(s,1H)、9.56(dd,1H)、9.20(s,1H)、8.65(dd,1H)、8.25(dd,1H)、7.54(m,2H)、7.19(t,1H)、7.06(dd,2H)、3.55(s,3H).MASS=310.31

0108

[ステップ(f-6)の一般的過程]
合成模式図3、化学構造式14の化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、ヒドロキシベンゾトリアゾル(HOBt,0.04mmol)、ピペリジン(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及びEDC(0.09mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び飽和されたNH4Cl水溶液で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0109

[合成例30(LDD-1821):N'-ヒドロキシ-N-フェニル-5-(ピペリジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-カルボキシミドアミド(化合物30)]
合成例25にて得られた化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.04mmol)、ピペリジン(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及びEDC(0.09mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び飽和されたNH4Cl水溶液で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率65%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.67(s,1H)、8.36(s,1H)、7.83(s,1H)、7.55(d,1H)、7.34(d,1H)、7.02(t,2H)、6.73(t,1H)、6.64(d,2H)、3.56(m,4H)、1.58(m,6H).MASS=363.42

0110

[合成例31(LDD-2199):N-(4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシ-5-(ピペリジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-カルボキシミドアミド(化合物31)]
合成例26にて得られた化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.04mmol)、ピペリジン(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及びEDC(0.09mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び飽和されたNH4Cl水溶液で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率72%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.67(s,1H)、8.41(s,1H)、7.88(s,1H)、7.58(dd,1H)、7.38(dd,1H)、6.915(m,2H)、6.71(m,2H)、3.33(m,4H)、1.62(m,6H).MASS=381.41

0111

[合成例32(LDD-2350):N'-ヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(ピペリジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-カルボキシミドアミド(化合物32)]
合成例27にて得られた化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.04mmol)、ピペリジン(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及びEDC(0.09mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び飽和されたNH4Cl水溶液で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率65%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.25(s,1H)、10.34(s,1H)、8.84(s,1H)、7.96(s,1H)、7.74(s,1H)、7.51(d,1H)、7.31(dd,1H)、6.53(m,2H)、6.44(m,2H)、3.39(m,4H)、1.60(m,6H).MASS=379.42

0112

[合成例33(LDD-2200):N'-ヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-5-(ピペリジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-カルボキシミドアミド(化合物33)]
合成例28にて得られた化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.04mmol)、ピペリジン(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及びEDC(0.09mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び飽和されたNH4Cl水溶液で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率41%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.48(s,1H)、8.16(s,1H)、7.82(s,1H)、7.56(dd,1H)、7.36(dd,1H)、3.55(s,3H)、3.46(m,4H)、1.62(m,6H).MASS=393.45

0113

[合成例34(LDD-1987):N'-ヒドロキシ-N-フェニル-5-(4-プロピルピペラジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-カルボキシミドアミド(化合物34)]
合成例25にて得られた化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.04mmol)、1-プロピルピペラジン(0.09mmol)及びEDC(0.09mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率41%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.69(s,1H)、8.37(s,1H)、7.87(s,1H)、7.59(d,1H)、7.39(dd,1H)、7.06(t,2H)、6.77(t,1H)、6.69(d,2H)、3.45(m,4H)、2.37(m,4H)、2.29(t,2H)、1.47(q,2H)、0.88(m,3H).MASS=406.49

0114

[合成例35(LDD-1988):N'-ヒドロキシ-5-(4-(2-メトキシエチル)ピペラジン-1-カルボニル)-N-フェニル-1H-インダゾール-3-カルボキシイミドアミド(化合物35)]
合成例25にて得られた化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.04mmol)、1-(2-メトキシエチル)ピペラジン(0.09mmol)及びEDC(0.09mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で3時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率36%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.70(s,1H)、8.39(s,1H)、7.87(s,1H)、7.59(d,1H)、7.39(dd,1H)、7.06(t,2H)、6.77(t,1H)、6.69(d,2H)、3.46(m,6H)、3.24(s,1H)、2.52(m,2H)、2.40(m,4H).MASS=422.49

0115

[合成例36(LDD-2351):5-(4-(2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチル)ピペラジン-1-カルボニル)-N'-ヒドロキシ-N-フェニル-1H-インダゾール-3-カルボキシイミドアミド(化合物36)]
合成例25にて得られた化合物(20mg,0.06mmol)をDMF(0.6mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.08mmol)、1-(2-(1H-イミダゾール-1-yl)エチル)ピペラジン(0.19mmol)及びEDC(0.19mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で1時間の間に撹拌した。得られた残余物をMC:MeOH=10:1混合溶媒及び飽和されたNaHCO3水溶液で抽出した。アンモニアで飽和されたクロロホルムとメタノールを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率16%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.74(s,1H)、8.37(s,1H)、7.870(s,1H)、7.65(s,1H)、7.58(dd,1H)、7.38(dd,1H)、7.20(m,1H)、7.05(t,2H)、6.87(m,1H)、6.77(t,1H)、6.68(d,2H)、4.10(t,2H)、3.46(m,4H)、2.68(t,2H)、2.42(m,4H).MASS=458.53

0116

[合成例37(LDD-2352):5-(4-(2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチル)ピペラジン-1-カルボニル)-N-(4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシ-1H-インダゾール-3-カルボキシイミドアミド(化合物37)]
合成例25にて得られた化合物(20mg,0.06mmol)をDMF(0.6mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.08mmol)、1-(2-(1H-イミダゾール-1-yl)エチル)ピペラジン(0.19mmol)及びEDC(0.19mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で1時間の間に撹拌した。得られた残余物をMC:MeOH=10:1混合溶媒及び飽和されたNaHCO3水溶液で抽出した。アンモニアで飽和されたクロロホルムとメタノールを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率29%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.74(s,1H)、8.42(s,1H)、7.90(s,1H)、7.65(s,1H)、7.58(d,1H)、7.39(dd,1H)、7.20(t,1H)、6.92(m,3H)、6.70(m,2H)、4.10(t,2H)、3.50(m,4H)、2.68(t,2H)、2.40(m,4H).MASS=476.52

0117

[合成例38(LDD-2354):5-(4-(2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチル)ピペラジン-1-カルボニル)-N'-ヒドロキシ-N-(4-ヒドロキシフェニル)-1H-インダゾール-3-カルボキシイミドアミド(化合物38)]
合成例25にて得られた化合物(20mg,0.06mmol)をDMF(0.6mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.08mmol)、1-(2-(1H-イミダゾール-1-yl)エチル)ピペラジン(0.19mmol)及びEDC(0.19mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で1時間の間に撹拌した。得られた残余物をMC:MeOH=10:1混合溶媒及び飽和されたNaHCO3水溶液で抽出した。アンモニアで飽和されたクロロホルムとメタノールを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率14%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.29(s,1H)、10.41(s,1H)、8.88(s,1H)、7.99(s,1H)、7.79(s,1H)、7.71(s,1H)、7.55(d,1H)、7.36(dd,1H)、7.22(m,1H)、6.90(m,1H)、6.55(m,2H)、6.49(m,2H)、4.10(t,2H)、3.50(m,4H)、2.67(t,2H)、2.42(m,4H).MASS=474.52

0118

[合成例39(LDD-2353):5-(4-(2-(1H-イミダゾール-1-イル)エチル)ピペラジン-1-カルボニル)-N'-ヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-1H-インダゾール-3-カルボキシイミドアミド(化合物39)]
合成例25にて得られた化合物(20mg,0.06mmol)をDMF(0.6mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.08mmol)、1-(2-(1H-イミダゾール-1-yl)エチル)ピペラジン(0.19mmol)及びEDC(0.19mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で1時間の間に撹拌した。得られた残余物をMC:MeOH=10:1混合溶媒及び飽和されたNaHCO3水溶液で抽出した。アンモニアで飽和されたクロロホルムとMeOHを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率=31%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.29(s,1H)、10.41(s,1H)、8.88(s,1H)、7.99(s,1H)、7.79(s,1H)、7.71(s,1H)、7.55(d,1H)、7.36(dd,1H)、7.22(m,1H)、6.90(m,1H)、6.55(m,2H)、6.49(m,2H)、4.10(t,2H)、3.50(m,4H)、2.67(t,2H)、2.42(m,4H).MASS=488.55

0119

[合成例40(LDD-2319):tert-ブチル(2-(2-(2-(4-(3-(N'-ヒドロキシ-N-フェニルカルバムイミドイル)-1H-インダゾール-5-カルボニル)ピペラジン-1-イル)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバメート(化合物40)]
合成例25にて得られた化合物(20mg,0.07mmol)をDMF(0.6mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.11mmol)、tert-ブチル(2-(2-(2-(ピペラジン-1-イル)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバメート(0.14mmol)及びEDC(0.14mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で2時間の間に撹拌した。得られた残余物をエチルアセテート及び水で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率90%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.68(s,1H)、8.36(s,1H)、7.82(s,1H)、7.53(d,1H)、7.33(dd,1H)、6.99(t,2H)、6.71(m,2H)、6.63(d,2H)、3.49(m、8H)、3.29(m,4H)、3.01(m,2H)、2.49(m,2H)、2.37(m,4H)、1.32(s、9H).MASS=595.7

0120

[合成例41(LDD-2320):5-(4-(2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチル)ピペラジン-1-カルボニル)-N'-ヒドロキシ-N-フェニル-1H-インダゾール-3-カルボキシイミドアミド(化合物41)]
合成例25にて得られた化合物(10mg,0.02mmol)をDCM(0.3mL)に溶解させた。次に、0℃でTFA(0.15ml)を入れた後に0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にアンモニアで飽和されたクロロホルムとメタノールを利用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率85%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.75(s,1H)、8.40(s,1H)、7.86(s,1H)、7.57(d,1H)、7.38(dd,1H)、7.03(t,2H)、6.75(t,1H)、6.68(d,2H)、3.54(m,12H)、2.86(m,2H)、2.49(m,2H)、2.42(m,4H).MASS=495.58

0121

[合成模式図4

0122

以下、合成例において記載する反応過程及び置換基は、前記合成模式図上の反応過程及び置換基を意味する。

0123

[一般的合成過程]
[ステップ(a)の一般的過程]
合成模式図4、化学構造式2の化合物(20mg,0.11mmol)を1,4-ジオキサン(1mL)に溶解させた。次に、R2-N-ヒドロキシベンズイミドイルクロリド(0.17mmol)とTEA(0.22mmol)を溶液に添加した。前記混合物を常温で18時間撹拌した後に、得られた残余物をエチルアセテート及び飽和されたNH4Cl水溶液で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0124

[合成例42(LDD-2194):3-(N'-ヒドロキシベンズイミドアミド)-1H-インダゾール-5-カルボン酸(化合物42)]
合成例2にて得られた化合物(20mg,0.11mmol)を1,4-ジオキサン(1mL)に溶解させた。次に、N-ヒドロキシベンズイミドイルクロリド(0.17mmol)とTEA(0.22mmol)を溶液に添加した。前記混合物を常温で18時間撹拌した後に、得られた残余物をエチルアセテート及び飽和されたNH4Cl水溶液で抽出した。以後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率23%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.31(s,1H)、8.62(m,1H)、7.63(dd,1H)、7.43(m,3H)、7.33(m,2H)、7.16(dd,1H)、6.81(s,2H).MASS=296.29

0125

[合成例45(LDD-1945):N'-ヒドロキシ-N-(5-(ピペリジン-1-カルボニル)-1H-インダゾール-3-イル)ベンズイミドアミド(化合物45)]
合成例44にて得られた化合物(10mg,0.04mmol)を1,4-ジオキサン(0.4mL)に溶解させた。次に、N-ヒドロキシベンズイミドイルクロリド(0.04mmol)とTEA(0.08mmol)を溶液に添加した。前記混合物を常温で18時間撹拌した後に生成された沈殿物をろ過しMCで洗浄した後に、目的化合物を得た(収率31%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.28(s,1H)、7.91(s,1H)、7.43(m,3H)、7.32(d,2H)、7.18(m,2H)、6.48(s,2H)、3.57(m,4H)、1.54(m,6H).MASS=363.42

0126

[ステップ(b-2)の一般的過程]
合成模式図4、化学構造式17の化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、0℃でTMS-ジアゾメタン(100μL)をゆっくり滴加した後に、0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た。

0127

[合成例43(LDD-2195):メチル-3-(N'-ヒドロキシベンズイミドアミド)-1H-インダゾール-5-カルボキシレート(化合物43)]
合成例42にて得られた化合物(10mg,0.03mmol)をDMF(0.3mL)に溶解させた。次に、0℃でTMS-ジアゾメタン(100μL)をゆっくり滴加した後に0℃で30分間撹拌した。真空で濃縮した後にシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的化合物を得た(収率85%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.31(s,1H)、8.66(m,1H)、7.640(dd,1H)、7.43(m,3H)、7.33(m,2H)、7.19(dd,1H)、6.87(s,2H)、3.84(s,3H).MASS=310.31

0128

[ステップ(c-3)の一般的過程]
合成模式図4、化学構造式2の化合物(100mg,0.56mmol)をDMF(2mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.85mmol)、多様なアミン(0.68mmol)、TEA(1.7mmol)及びEDC(1.13mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で12時間の間に撹拌した。得られた残余物を飽和されたNaHCO3水溶液及びエチルアセテートで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。DCMとヘキサンを利用して沈殿を作った後にろ過して、目的化合物を得た。

0129

[合成例44:(3-アミノ-1H-インダゾール-5-イル)(ピペリジン-1-イル)メタノン(化合物44)]
合成模式図4、化学構造式2の化合物(100mg,0.56mmol)をDMF(2mL)に溶解させた。次に、HOBt(0.85mmol)、多様なアミン(0.68mmol)、TEA(1.7mmol)及びEDC(1.13mmol)を反応混合物に添加した後に、混合物を常温で12時間の間に撹拌した。得られた残余物を飽和されたNaHCO3水溶液及びエチルアセテートで抽出した。合わせられた有機層をブライン(brine)で洗浄し無水Na2SO4で乾燥させた後に真空で濃縮した。DCMとヘキサンを利用して沈殿を作った後にろ過して、目的化合物を得た(収率41%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.58(s,1H)、7.81(m,1H)、7.24(s,2H)、5.50(s,2H)、3.40(m,4H)、1.61(m,6H).MASS=244.30

0130

[実験例]
実験例1:アリザリンレッド染色(Alizarin red staining)を利用した細胞スクリーニング
直接細胞リプログラミング(Direct cell reprogramming)を誘導する低分子化合物のスクリーニング
細胞リプログラミングを誘導する化合物を探すための方法は、従来の骨形成誘導による筋肉細胞骨細胞転換研究PMID:23044010及び18974773とリバーシン(reversine)論文を基盤とする(Chen S 2004)。C2C12マウス骨格筋細胞は、24-ウェル形態の細胞培養皿にウェル当たりの1x104の密度分注した。分注後24時間後、関心化合物を1の濃度で三個のウェルに添加した。陽性対照群(Positive control)では、100nMリバーシンまたは2μM BIOが細胞に処理された。両化合物は、筋肉芽細胞の骨細胞転換を誘導させると知られた化合物である(Chen S 2004 and Kim WH recapitulate papers)。音声対照群(Negative control)としてDMSOを細胞に処理するか、何らの処理もしなかった。化合物は、総72時間の間に細胞に処理されたが、48時間後に化合物を補充するために追加処理した。化合物の細胞毒性は、細胞のなくなった部分と培養する時に浮遊する細胞カスにより分かることができるが、毒性を引き起こす化合物は、250nMの濃度で再度スクリーニングした。72時間後、骨形成分化誘導培地(10%FBS,50μg/mLアスコルビン酸-2-フォスフェート、0.1μMデキサメタゾン、10mMβ-グリセロフォスフェート、50units mL-1ペニシリン、50-1ストレプトマイシンが添加されたDMEMを14日間処理)に変えた。骨形成誘導培地は、従来の直接細胞リプログラミング(reversine papers,Chen S 2004 and Chen S 2007)で描写したことを基盤とした。筋肉細胞から骨細胞への直接細胞リプログラミングは、骨系統細胞にあるカルシウム堆積(Gregory CA 2004:PMID:15136169)の有無を感知するアリザリンレッド染色(alizarin red staining)を介して探知された。

0131

アリザリンレッド染色(Alizarin red staining)
細胞をPBSで一度洗った後、phosphate-buffered formalinを利用して20分間固定した。固定された細胞を蒸留水で洗った後、水に溶かした1%アリザリンレッド-S(Sigma-Aldrich)に5分間浸漬させた。残った染色液は、蒸留水を利用して洗い落とした。細胞を乾かした後に光学顕微鏡CKX41 Olympus)を利用して染色された細胞の写真撮影した。染色された細胞は、明るい赤色部分にみえ、それは、「ヒット(hit)」化合物として選択されて、より多くの分析を行った。

0132

上述のアッセイ方法を利用して合成されたインダゾール化合物の細胞リプログラミング能力を評価した。LDD-1664、LDD-1821、LDD-1945、LDD-2199、LDD-2200は、造骨細胞への分化において陽性対照群であるリバーシンだけ強力なリプログラミング能力を見せ、LDD-1986、LDD-1987、LDD-1988もリプログラミング能力を見せた。脂肪細胞への分化を確認することができるオイルレッドO染色では、LDD-1821、LDD-1986、LDD-1987、LDD-1988物質が強力なリプログラミング能力を見せた。特に、LDD-1821の場合、造骨細胞と脂肪細胞への分化において両方とも強力なリプログラミング能力を見せた(図1図2及び図3参照)。

0133

++(強い陽性、strong positive)、+(弱い陽性、weak positive)、-(陰性、negative)

0134

実験例2:キナーゼ(Kinase)アッセイ
インダゾール誘導体のGSK-3β及びAurora Aに対する抑制活性は、HTRF(homogeneous time-sesolved fluorescence)アッセイを介して確認した。HTRFアッセイは、ATP存在下にペプチド物質リン酸化を確認するアッセイ方法である。リン酸化された物質は、TR-FRET(Time Resolved-Fluorescence Resonance)信号により検出された。再組み合わせられたGSK-3β及びAuroraAキナーゼは、Millipore(Billerica,MA)で購買した。HTRFKinEASEキットCisbio)を使用してアッセイを行い、各々GSK-3β及びAurora Aにインダゾール物質を1μMSずつ処理した後に阻害されたリン酸化程度を確認した。アッセイは、キナーゼ反応バッファ(250mMHEES(pH7.0)、0.5mMオルトバナデート(orthovanadate)、0.05%BSA、0.1%NaN3)に溶けてある物質-酵素混合物とペプチド物質から構成される。検出バッファを追加した後、TR-FRET信号は、EnVision multi-label readerにより検出された。

0135

LDD-1664、LDD-1667、LDD-1820、LDD-1821を1μMSずつそれぞれGSK-3β及びAurora Aに処理した後、酵素活性が阻害された程度を下記の表に表した。表2に表した結果のように、4通りの誘導体とも1μM濃度でGSK-3β及びAurora A全部に対して50%未満の阻害活性を表した。また、優れた細胞リプログラミング能力を見せたLDD-1821の場合、2通りの酵素に対して1μM濃度において全く阻害活性を見せなかった。したがって、GSK-3βまたはAurora Aの阻害諸であるBIO及びリバーシンとは異なる機序を介して細胞リプログラミングを誘導することと見られる。

0136

0137

実験例3:MTTアッセイ
C2C12筋芽細胞(myoblast)を96ウェルプレートにウェル当たりの3x103個細胞の密度で分注した。細胞を一日間培養した後に物質を処理した。以後、二日間培養した後に3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)を含むserum-freeDMEMを細胞に3時間の間に処理した。培地を除去した後に振りながら、DMSOで10分間培養した。吸光度は、570nmでマイクロリーダー(VersaMax,MolecularDevices)により測定した(図4参照)。

0138

下記の表3に整理された化合物の細胞毒性をMTTアッセイを介して評価した結果、評価されたすべてのインダゾール誘導体が10μM以上のIC50を表した。このような点でインダゾール誘導体は、従来の高い細胞毒性を表したBIO及びリバーシンと比較すると、優れた長所を有する。

0139

0140

以上、本発明の特定の部分を詳細に述べたが、この技術分野における通常の知識を有した者にとって、このような具体的な記述は、ただ好ましい具現例に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求の範囲とその等価物により定義されねばならない。

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