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課題・解決手段

試料中の微生物非存在または存在を検出する方法であって:試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、を含む方法。対応するキットもまた、提供される。

概要

背景

細胞生存能力に関連する或る分子の存在およびレベルを測定することは、多くの状況において重要である。例えば、ATPのレベルを測定することは、増殖解析および毒性学の目的について、哺乳類細胞において有用である。培養アプローチ少数の細菌を検出するために使用され得るが、かかる技術は、特に少数の細菌を検出しようとする時、およびより遅く増殖する微生物を検出する時にも完了するために数日を必要とする。

生存能力指標としてのアデニル酸キナーゼの検出も、提唱されている(Squirrell DJ,Murphy MJ,Leslie RL,Green JCD:A comparison ofATPand adenylate kinase as bacterial cell markers: correlation with agar plate counts。WO96/002665は、試料中のアデニル酸キナーゼの量が、アデノシン二リン酸ADP)とそれを混合し、このADPからの試料により生産されたアデノシン三リン酸エステル(ATP)の量を決定し、そして、そのように生産されたATPの量を、アデニル酸キナーゼの存在/または量と関連させ、かつ微生物および/またはそれらの細胞内物質と関連させることにより推定されることを特徴とする、試料中に存在する微生物の存在および/もしくは量、ならびに/またはそれらの細胞内物質を決定するための方法であって、ここでADPからATPへの変換がADPからATPへの最大変換を可能にするのに十分なモル濃度マグネシウムイオンの存在下で実施される方法を記載する。

WO2009/007719では、リガーゼとりわけNAD依存性リガーゼは、試料中の(生存可能な)微生物の存在の有用な指標として開示されている。リガーゼは、核酸分子ライゲーション触媒する酵素である。ライゲーション反応は、関連するリガーゼに依存して、補因子としてATPまたはNAD+のいずれかを必要とする。この開示では、NAD依存性リガーゼ活性の使用は、試料中の(生存可能な)微生物の存在の指標として利用される。

WO2011/130584は、試料が微生物のポリメラーゼのための基質として作用する核酸基質と接触され、インタクト微生物由来ポリメラーゼ活性に適切な条件下でインキュベートされ、かつ生じる任意の核酸産物が定量ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を使用して決定される、DNAまたはRNAポリメラーゼの検出に基づく、生存可能な微生物の検出のための方法を記述する。かかるアッセイは、「ETGAアッセイ」と呼ばれており、ここでETGAは酵素的テンプレート生成および増幅(Enzymatic Template Generation and Amplification)を意味する。粗試料中の生存可能な微生物についてのETGAアッセイの問題は、宿主(例えばヒト)細胞および死んだ微生物から生じる、微生物以外の汚染ポリメラーゼ活性の存在である。ETGAアッセイは、微生物ポリメラーゼ活性を宿主の微生物ポリメラーゼ活性または死んだ微生物の微生物ポリメラーゼ活性と区別できない。

出願人の同時係属中の出願WO2010/119270は、インタクトな微生物以外の酵素活性(この場合、DNAリガーゼ)を除去するための方法を記述し、これはまた、汚染核酸ポリメラーゼ活性の除去のためにも使用され得る。

概要

試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、を含む方法。対応するキットもまた、提供される。

目的

陰性の結果を決定するためのより早い方法(血液培養の5日間と比較して)は、不要な抗生物質療法のコストを削減することにおいて重要な価値があるだろうし、C.ディフィシル(C.difficile)感染、抗生物質毒性のリスクを減少させ、抗菌剤耐性における増加率を低下させる観点で、健康上の利益を提供する

効果

実績

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請求項1

試料中の微生物非存在または存在を検出する方法であって:(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、を含む、方法。

請求項2

核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに3’および/もしくは5’末端の保護から選択される、請求項1に記載の方法。

請求項3

合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項2に記載の方法。

請求項4

基質核酸分子への核酸改変活性の作用が、伸長した核酸分子を生産する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

核酸改変活性がポリメラーゼ活性を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

核酸分子が少なくとも2nMであるが50nM未満の濃度で試料に加えられる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

工程(a)および/または(b)が少なくとも100μMの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

工程(a)が内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでIPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、ペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

工程(a)が内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでIPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

IPC核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに3’および/もしくは5’末端の保護から選択される、請求項9に記載の方法。

請求項11

合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項10に記載の方法。

請求項12

工程(c)においてプライマー結合に対して競合があるように、IPC核酸分子が核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程(c)において加えられ、任意に核酸プローブが標識化されている、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程(c)において加えられ、任意にさらなる核酸プローブが標識化されている、請求項13に記載の方法。

請求項15

核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、請求項14に記載の方法。

請求項16

核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、請求項14または請求項15に記載の方法。

請求項17

核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ工程(c)が相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を加えることを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、請求項17に記載の方法。

請求項19

3’末端での改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、請求項18に記載の方法。

請求項20

伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)であり、任意にddNTPがジデオキシシチジンである、請求項19に記載の方法。

請求項21

試料中のヌクレアーゼ活性を不活性化する工程を含まない、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。

請求項22

工程(c)が核酸増幅工程を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。

請求項23

増幅工程前に、40℃超、50℃超、60℃超、70℃超、80℃超、90℃超または95℃超の温度で実施される工程を含まない、請求項22に記載の方法。

請求項24

40℃超、50℃超、60℃超、70℃超、80℃超、90℃超または95℃超の温度で実施される工程を含まない、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。

請求項25

摂氏10から50度の間で、摂氏15から45度の間で、摂氏20から40度の間で、摂氏25から40度の間で、摂氏30から40度の間で、摂氏25から35度の間で、または摂氏15から30度の間の温度で実施され、任意に室温で実施される、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。

請求項26

請求項1から25のいずれか一項に記載の方法であって、試料が非微生物起源の核酸改変活性を含有し、かつ該方法が:(a)高pH条件下で試料を、非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために、5分間以内で処理すること、(b)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、(c)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および(d)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、を含む、方法。

請求項27

高pH条件が、試料をNaOHまたはNa2CO3と接触させることを含む、請求項26に記載の方法。

請求項28

NaOHまたはNa2CO3の濃度が約5mM以上である、請求項27に記載の方法。

請求項29

高pH条件下での処理が、pHを低下させるための試薬を加えることにより停止される、請求項26から28のいずれか一項に記載の方法。

請求項30

pHが緩衝液または酸を加えることにより低下される、請求項29に記載の方法。

請求項31

緩衝液がTris−HCl緩衝液(例えばpH7.2または8)を含む、請求項30に記載の方法

請求項32

高pH条件下で試料を処理するさらなる工程が、摂氏15から30度の間の温度で実施され、任意に高pH条件下で試料を処理するさらなる工程が室温で実施される、請求項26から31のいずれか一項に記載の方法。

請求項33

請求項1から25のいずれか一項に記載の方法であって、試料が、非微生物起源の核酸改変活性を含有し、かつ該方法が:(a)(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、(ii)任意に、試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること、(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること、(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離、(vi)いずれかの分離された微生物の溶解、(vii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、(viii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および(ix)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること;または(b)(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、(ii)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離、(iii)ペレットからの上清の除去、(iv)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために8分間以内でインキュベートすること、(v)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること、(vi)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離、(vi)ペレットからの上清の除去、(vii)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること、(viii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、(ix)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および(x)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、を含む、方法。

請求項34

工程(a)(vi)および(a)(vii)またはb(vii)およびb(viii)が共に実施され、任意に核酸分子が溶解試薬と共に試料に加えられる、請求項33に記載の方法。

請求項35

高pH試薬がNaOHまたはNa2CO3を含む、請求項33または34に記載の方法。

請求項36

高pH試薬の濃度が約5mM以上である、請求項33から35のいずれか一項に記載の方法。

請求項37

pH低下試薬が緩衝液または酸を含み、任意に緩衝液がTris−HCl緩衝液(pH7.2または8)を含む、請求項33から36のいずれか一項に記載の方法。

請求項38

工程(a)(iii)または(b)(iv)が摂氏15から30度の間の温度で実施され、任意に温度は室温である、請求項33から37のいずれか一項に記載の方法。

請求項39

請求項1から25のいずれか一項に記載の方法であって、試料が非微生物起源のヌクレアーゼ活性を潜在的に含有し、かつ該方法が:(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化、(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること、(iv)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること;または(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離、(b)ペレットからの上清の除去、(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること、(d)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、を含む、方法。

請求項40

工程(iii)および(iv)または(c)および(d)それぞれが共に実施され、任意に核酸分子が、溶解試薬と共に試料に加えられる、請求項39に記載の方法。

請求項41

(a)微生物に対する薬剤に対する微生物の耐性についてスクリーニングする;(b)1つ以上の微生物を死滅、または増殖を防ぐことができてもよい、候補薬剤をスクリーニングする;(c)感染、または対象中の微生物の存在に関連する疾患を診断する;または(d)試料または血液試料を含有する血小板における微生物汚染の存在を検出するための、請求項1から40のいずれか一項に記載の方法の使用。

請求項42

(a)少なくとも1つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する少なくとも1つの核酸分子、および(b)核酸分子とIPCの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも1つの内部陽性対照(IPC)核酸分子を含む、請求項1から41のいずれかに記載の方法を実行するためのキット

請求項43

核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに3’および/もしくは5’末端の保護から選択される、請求項42に記載のキット。

請求項44

合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項43に記載のキット。

請求項45

核酸改変活性がポリメラーゼ活性を含む、請求項42から44のいずれか一項に記載のキット。

請求項46

核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブをさらに含み、任意に核酸プローブが標識化されている、請求項42から45のいずれか一項に記載のキット。

請求項47

IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブをさらに含み、任意にさらなる核酸プローブが標識化されている、請求項46に記載のキット。

請求項48

核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、請求項47に記載のキット。

請求項49

核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、請求項47または請求項48に記載のキット。

請求項50

核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、請求項42から49のいずれか一項に記載のキット。

請求項51

3’末端での改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、請求項50に記載のキット。

請求項52

伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)であり、任意にddNTPがジデオキシシチジンである、請求項51に記載のキット。

請求項53

IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、請求項42から52のいずれか一項に記載のキット。

請求項54

IPC核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに3’および/もしくは5’末端の保護から選択される、請求項53に記載のキット。

請求項55

合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項54に記載のキット。

請求項56

高pH試薬をさらに含み、任意に高pH試薬がNaOHまたはNa2CO3を含む、請求項42から55のいずれか一項に記載のキット。

請求項57

高pH試薬の濃度が約5mM以上である、請求項56に記載のキット。

請求項58

pH低下剤をさらに含む、請求項42から57のいずれか一項に記載のキット。

請求項59

pH低下試薬が緩衝液または酸を含み、任意に緩衝液がTris−HCl緩衝液(pH7.2または8)を含む、請求項58に記載のキット。

技術分野

0001

本発明は、一般に、試料中の微生物非存在または存在を検出する分野に関する。当該方法は典型的には、試料中に存在する微生物酵素活性(もしあれば)を測定することに依存しており、ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を使用して実施されることができるような方法に関連してもよい。従って、本発明の方法は、未精製血液、血液培養および他の体液などの試料中の微生物病原体の非存在および存在の決定を可能にする。この発明はまた、かかる方法における使用のための試薬、および当該方法を実施することについて有用な、かかる試薬を含む試験キットに関する。

背景技術

0002

細胞生存能力に関連する或る分子の存在およびレベルを測定することは、多くの状況において重要である。例えば、ATPのレベルを測定することは、増殖解析および毒性学の目的について、哺乳類細胞において有用である。培養アプローチ少数の細菌を検出するために使用され得るが、かかる技術は、特に少数の細菌を検出しようとする時、およびより遅く増殖する微生物を検出する時にも完了するために数日を必要とする。

0003

生存能力指標としてのアデニル酸キナーゼの検出も、提唱されている(Squirrell DJ,Murphy MJ,Leslie RL,Green JCD:A comparison ofATPand adenylate kinase as bacterial cell markers: correlation with agar plate counts。WO96/002665は、試料中のアデニル酸キナーゼの量が、アデノシン二リン酸ADP)とそれを混合し、このADPからの試料により生産されたアデノシン三リン酸エステル(ATP)の量を決定し、そして、そのように生産されたATPの量を、アデニル酸キナーゼの存在/または量と関連させ、かつ微生物および/またはそれらの細胞内物質と関連させることにより推定されることを特徴とする、試料中に存在する微生物の存在および/もしくは量、ならびに/またはそれらの細胞内物質を決定するための方法であって、ここでADPからATPへの変換がADPからATPへの最大変換を可能にするのに十分なモル濃度マグネシウムイオンの存在下で実施される方法を記載する。

0004

WO2009/007719では、リガーゼとりわけNAD依存性リガーゼは、試料中の(生存可能な)微生物の存在の有用な指標として開示されている。リガーゼは、核酸分子ライゲーション触媒する酵素である。ライゲーション反応は、関連するリガーゼに依存して、補因子としてATPまたはNAD+のいずれかを必要とする。この開示では、NAD依存性リガーゼ活性の使用は、試料中の(生存可能な)微生物の存在の指標として利用される。

0005

WO2011/130584は、試料が微生物のポリメラーゼのための基質として作用する核酸基質と接触され、インタクト微生物由来ポリメラーゼ活性に適切な条件下でインキュベートされ、かつ生じる任意の核酸産物が定量ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を使用して決定される、DNAまたはRNAポリメラーゼの検出に基づく、生存可能な微生物の検出のための方法を記述する。かかるアッセイは、「ETGAアッセイ」と呼ばれており、ここでETGAは酵素的テンプレート生成および増幅(Enzymatic Template Generation and Amplification)を意味する。粗試料中の生存可能な微生物についてのETGAアッセイの問題は、宿主(例えばヒト)細胞および死んだ微生物から生じる、微生物以外の汚染ポリメラーゼ活性の存在である。ETGAアッセイは、微生物ポリメラーゼ活性を宿主の微生物ポリメラーゼ活性または死んだ微生物の微生物ポリメラーゼ活性と区別できない。

0006

出願人の同時係属中の出願WO2010/119270は、インタクトな微生物以外の酵素活性(この場合、DNAリガーゼ)を除去するための方法を記述し、これはまた、汚染核酸ポリメラーゼ活性の除去のためにも使用され得る。

0007

発明の説明
しかしながら、汚染活性を除去するための、WO2010/119270において使用される条件は20分間の高pH(約pH11)でのインキュベーションを含む。有用である一方で、これらの条件は、H.インフルエンザ(H.influenzae)の特定の臨床株などの特定の菌株に有害であると、発明者らにより見出された。

0008

高pHでの処理は、全ての場合において血液培養などの試料中の余分な微生物ヌクレアーゼ活性の全てを除去するわけではないこと、およびこのヌクレアーゼ活性が試験で使用される核酸基質を分解することにより、アッセイに有害な影響を及ぼし得ることがさらに見出された。核酸増幅アッセイは、増幅反応の正しい機能をモニターするための内部対照プローブを含んでもよい(例えば、WO2011/130584のアッセイと同様のDNAポリメラーゼアッセイに適用されるWO2013/103744を参照されたい)。しかしながら、この内部対照は核酸増幅試薬合物の一部として加えられ、先のヌクレアーゼ活性を検出しないだろう。WO2011/130584において記述される方法のさらなる問題は、C.アルビカンス(C.albicans)およびC.グラブラータ(C.glabrata)などの酵母を検出することにおける感度の相対的な欠如である。

0009

迅速な試験では、当技術分野は、それらの非存在を決定することよりもむしろ微生物の存在の検出に焦点を当ててきた。「それらの非存在を決定すること」という用語は、出願人は試料が必ずしも無菌であることを意味するわけではなく、実用上の目的について陰性であるように十分低い生物負荷を有していてもよい。例えば、血液培養は、未処理のまま放置した場合、急速に致死的となり得る状態である敗血症に関連し得る血流感染を有すると疑われる患者からしばしば取得される。陰性の結果を報告する前に少なくとも5日間、かかる検体をインキュベートすることは臨床微生物研究所にとって日常的であり、この間、患者はしばしば広域抗生物質が続けられる。典型的には最大90%のそのような患者が陰性であり、かなり多くの患者が、彼らの状態に必要ではない抗生物質療法で5日間放置される。陰性の結果を決定するためのより早い方法(血液培養の5日間と比較して)は、不要な抗生物質療法のコストを削減することにおいて重要な価値があるだろうし、C.ディフィシル(C.difficile)感染、抗生物質毒性のリスクを減少させ、抗菌剤耐性における増加率を低下させる観点で、健康上の利益を提供するだろう。

0010

発明者らは、試料中の微生物の非存在または存在の決定を最適化する観点で既存のETGAアッセイの一連の改良を考案し、試験した。本発明の基礎は、試料中の微生物の非存在または存在を検出するこのような方法であって:
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること
を含む、方法である。この基本的なアッセイ形式の様々な開発が本明細書に提示される。

図面の簡単な説明

0011

NTPおよび基質濃度を増加させることによる微生物の改善されたETGA検出。それぞれのチャートは、関連する様々な微生物についてのETGA検出実験において、ETGA標的基質FAチャネル)の検出について得られたCt値を示す。全ての場合において、陰性血液培養対照は>39.9Ctユニットであり、陰性試薬陰性対照は>40Ctユニットであり、かつ陽性試薬対照は<20Ctユニットであった。
陰性対照試料と比較して、微生物溶解混合物(LM)またはPCRマスターミックス(MM)中にのみ加えられたIPC DNAで調製された血液培養試料におけるIPC分子の検出。LMに加えられたIPC DNAの量は、MMに加えた時と同一のCt値を提供する。データは、MMに加えた時でなく、LMに加えた時に陰性対照(血液無し)と比較して、陰性血液培養試料中のIPC分子の検出が完全に失われている(40サイクルPCR反応において)ことを示す。
MMの代わりにLMにIPCを加えることによるバックグラウンドの増加。チャートにプロットされたデータは、FAMチャネル(ETGA基質を検出する)におけるCt値 対 IPCが、LM(ダイアモンド)およびMM(四角)に加えられたプロトコールを使用して、血液培養試料について得られた総生存数(TVC)を示す。LMに加えられたIPCの量は、それぞれのPCR反応のMMより50x高いものと同等だった。MM中のIPCの標準濃度を使用する場合と比較して、測定されたバックグラウンドは、LM中のIPCの50x正常濃度を使用する場合よりも高かった。バックグラウンドレベルは、いかなる加えられた細菌も含有しない血液培養試料中のMM(青色の破線)またはLM(緑色の点線)中の、IPCを用いるETGA試験手順により測定された。
ETGA試験バックグラウンド減少および改善された試験感度。グラフは、血液培養におけるC.アルビカンスの希釈系列で実施されたETGA試験からのqPCR反応でFAMチャネルにおいて検出された蛍光を示す。qPCR反応は、改変されたETGA基質を検出できるFAM−標識化されたプローブを含有していたので、増幅は、微生物の存在を示す。図4aは、標準基質およびIPCオリゴを使用して実施された一連のETGA試験の結果を示す。図4bは、PTO基質およびIPCを使用して、全く同一の試料から得られた結果を示す。バックグラウンドは図4bにおいて、はるかに低いこと、および試験でより低い数の酵母細胞を検出することが可能であることに注意されたい。
PTOオリゴの使用による酵母検出の改善。グラフは、PTOオリゴを使用するETGA試験と比較して、標準オリゴを使用するETGA試験における酵母(C.アルビカンス)の検出感度を示す。
ETGAによるあまり頑でない微生物の検出。チャートは、H.インフルエンザの繊細な株の検出がETGA試験手順により影響されることを示す。S.アウレウスおよびH.インフルエンザの純粋培養物(105cfu)を、異なる工程で一般的な試験プロトコール(10mL)に加えた。データは、微生物をNaOH再懸濁工程前に加えると、検出が有意に減少したことを示す。
NaOHへの暴露の制御は、H.インフルエンザの検出を改善する。グラフは、標準手順と比較して、ETGA試験手順において、105cfu H.インフルエンザを含有する培養試料がNaOHに曝される時間の量を制御する効果を示す。10mLについての一般的なプロトコールが、血液なしのBacT/ALERTブロスにおけるH.インフルエンザの懸濁液で実施された;NaOHにおける再懸濁および0、0.5、2.5および5分間のインキュベーション後に、1mLの200mMのTris−HCl[pH7.2]を遠心分離前に加えた。
pH低下工程による1mlのETGAプロトコールの改善。A)無スパイク、B)H.インフルエンザ(105cfu)、C)H.インフルエンザ(104cfu)、D)S.アウレウス(105cfu)、E)S.アウレウス(104cfu)を含有する血液培養試料は、最初の1mlの手順(1mLのNaOHにおける再懸濁に基づく)およびpH−低下工程(0.75mLのNaOH、5分のインキュベーション、0.5mLの試薬Cにおける再懸濁)を含有する手順により試験された。より低いCt値は、微生物がより強く検出されることを示す。
図9A−C。 E.コリが添加された血液ブロス試料および陽性対照(Pol(+))のコグニター(cognitor)マイナス結果。データは、(A)実験2、(B)実験3および(C)実験4について、0、2および20時間で95℃工程の有無について解析されるコグニターマイナス試料のために示される。実験1についてのデータは、試料が0時間の時点でQPCRにより解析されたのみであるから、示されない。
E.コリが添加された血液ブロス試料(n=4)についての、対数変換された全cfu値に対してプロットされたCt値。傾向線は、95℃(+)または95℃(−)データセット内でそれぞれの時点(0時間、2時間および20時間)についてプロットされた。陽性対照データは、ここに示されない。
図11A−B。(A)未改変のオリゴヌクレオチド溶解混合物または(B)ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド溶解混合物のいずれかを使用して処理された95℃(+)および95℃(−)試料についての、0、2および20時間での、E.コリが添加された血液ブロス試料および陽性対照(Pol+ve)についてのCt値。示されるデータは、単一の実験(n=1)からのものである。
図12A−E。(A)E.コリ、(B)S.アウレウスおよび(C)C.アルビカンスが添加された血液ブロス試料、(D)陽性対照(PC)および(E)無スパイク対照(NSC)のコグニターマイナス結果。3つの反復実験(n=3)からのCt値は、試料貯蔵持続時間に対してプロットされた。傾向線は、それぞれの試料セットについてプロットされた:PTO95℃(+);PTO95℃(−);UMO95℃(+);およびUMO95℃(−)。ほとんどのPTO LM試料が、不十分な増幅に起因して‘Ctなし’を引き起こしたので、UMO LMデータのみがNSC試料について示される。

0012

第一の態様によれば、本発明は、試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。

0013

本発明の文脈において、核酸分子はヌクレアーゼ活性からそれを保護するために予め改変されている、つまり、それが工程(a)において試料と接触される前に、核酸分子はヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。

0014

発明者らは、ヌクレアーゼ活性からの基質核酸分子の保護が、本発明のアッセイの状況において有益であると決定した。本明細書に示されるように、より具体的には、保護された核酸分子の、本発明の方法への組み込みは検出感度を改善する。任意の適切な手段が、ヌクレアーゼ活性から核酸分子を保護するために利用されてもよい。非限定例は、核酸分子へのメチル化の組み込み、3’および/もしくは5’末端の保護などの末端改変ならびに合成ヌクレオチドの組み込みを含む。具体的な実施形態では、合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。特定の実施形態では、合成ヌクレオチドは、核酸分子中の少なくとも1から最大で全ての、ヌクレオチドを置換する。

0015

発明者らは、ETGAアッセイ前と比較して、反応における核酸分子の濃度を増加させることは、改善された結果につながり得ることをさらに決定した。従って、さらなる態様では、本発明は、試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子が少なくとも2nMであるが50nM未満の濃度で試料に加えられることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。

0016

以前には、かかるアッセイにおいて、核酸基質は1nMの濃度で利用された。発明者らはこの濃度を50nM未満まで、例えば2nM、5nM、7.5nMまたは10nMに増加させることは、改善された検出感度をもたらすことを決定した。50nMで、またはそれを超えると、改善された感度は、アッセイから生じる偽陽性の増加に起因して喪失される。本明細書に記載の濃度は、典型的には、試料中に存在する場合には、微生物を溶解するために使用される溶解混合物における濃度である。従って、試料を基質核酸分子と接触させる工程(a)は典型的には、試料中に存在する場合には、微生物を溶解する溶解混合物中の基質の追加を伴う。溶解試薬/混合物のさらなる詳細は本明細書中に提供される。

0017

発明者らは、反応における遊離のヌクレオチドの濃度を増加させることはアッセイ感度を改善するのにさらに役に立つことを、さらに別に決定した。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、50μM超、例えば55から300μM、または60から250μMまたは75から200μM、とりわけ少なくとも100μMの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を試料に加えることを含む。いくつかの実施形態では、dNTPは、工程(a)および/または工程(b)のいずれかにおいて加えられてもよい。本明細書に記載の濃度は典型的には、試料中に存在する場合には、微生物を溶解するために使用される溶解混合物における濃度である。従って、試料を基質核酸分子と接触させる工程(a)は典型的には、試料中に存在する場合には、微生物を溶解する溶解混合物中の基質の添加を伴い、溶解混合物はdNTPを含有する。溶解試薬/混合物のさらなる詳細は本明細書中に提供される。

0018

上記のように、発明者らは汚染活性を除去するためにWO2010/119270において採用された高pH条件が有用である一方で、これらの条件は、H.インフルエンザの或る臨床株などの特定の菌株に対して有害であり得ることを発見した。従って、さらなる態様では、本発明は、試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)高pH条件下で試料を、非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために、8分間以内で処理すること、
(b)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(c)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(d)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法を提供する。

0019

高pH条件の持続時間は20分未満であり、10、9、8、7、6または5分未満であってもよく、約5、6、7、8、9または10分であってもよい。さらに別の実施形態では、処理は約2から15分間、例えば約5分間実施される。「約」という用語は、プラスまたはマイナス30秒が意味される。

0020

任意の適切な試薬が、高pH条件を提供するために試料に加えられてもよい。特定の実施形態では、高pH条件は、試料をアルカリと接触させることを含む。特定の実施形態では、NaOHまたはNa2CO3が使用される。具体的な実施形態では、NaOHまたはNa2CO3の濃度は約5mM以上である。

0021

高pH条件は典型的には、哺乳類細胞などの非微生物起源由来のATP−依存性リガーゼおよびポリメラーゼを含む核酸改変酵素の活性を阻害するが、微生物リガーゼまたはポリメラーゼの活性を阻害しない。これは、これらの条件および/または、非微生物酵素のみが高pH条件に曝されることを確実にする方法において利用される差次的な溶解条件に対する、微生物酵素のより大きい抵抗性に起因し得る。高pHは一般的には、少なくとも約10、例えば約10、11、12、13または14のpHである。低pHは一般的には、約4、例えば約4、3、2または1未満か、または等しいpHである。「約」という用語は、示された値の両側のpHユニットの0.5が意味される。試料のpHを変えることは、当業者により容易に理解されるだろう任意の適切な手段を使用して達成されてもよい。哺乳類リガーゼは同一のpH条件下で失活され得るが、ポリメラーゼおよびリガーゼなどの微生物酵素は、極端なpHに対して抵抗性であり得る。これは哺乳類細胞と微生物細胞の両方を含有する試料中の微生物のリガーゼの選択的な検出を可能にする。具体的な実施形態では、哺乳類細胞由来のATP−依存性リガーゼなどの非微生物核酸改変活性の活性を阻害するが、微生物のリガーゼなどの微生物起源の核酸改変活性の活性を阻害しない条件は、試料を水酸化ナトリウム(NaOH)または炭酸ナトリウム(Na2CO3)で処理することを含む。本明細書に示されるように、かかる薬剤は、試料のpHを高pHに増加させ、従って微生物の(真菌のおよび細菌性の)リガーゼを活性にしたままにする一方で哺乳類リガーゼ活性不活性化するために、容易に使用され得る。適切な薬剤の、適切な濃度および容積は、当業者により適用され得る。しかしながら、特定の実施形態では、NaOHは少なくとも約5mMのNaOHである。いくつかの実施形態では、アルカリ濃度は10mM未満、例えば5、6、7、8、9または10mMである。

0022

さらなる実施形態では、pHは、微生物核酸改変活性(ポリメラーゼおよび/またはリガーゼ活性など)ではなく、哺乳類核酸改変活性(ポリメラーゼおよび/またはATP−依存性リガーゼ活性など)を失活させるために約12である。具体的な実施形態では、pH条件は、少なくとも約11、または少なくとも11.2に増加されてもよい。この処理は試料中の微生物の溶解をもたらしてもよく、従って、試料中への核酸改変活性(例えばポリメラーゼおよび/またはリガーゼ)の放出につながり得る。これは別の細胞溶解工程を必要とせずに、微生物に由来する、試料中の核酸改変活性(例えばポリメラーゼおよび/またはリガーゼ)の検出を可能にする。これらの条件で、哺乳類リガーゼ(血液ATP−依存性リガーゼなど)は、失活される。しかしながら、より詳細に本明細書の下記に記載されるように、典型的には、当該方法は試料中の微生物を溶解するための別の工程を含む。

0023

いくつかの実施形態では、高pH条件下での処理はpHを低下させるための試薬を加えることにより停止される。適切な試薬は、緩衝液および/または酸を含む。具体的な実施形態では、緩衝液はTris−HCl緩衝液(例えばpH7.2または8)を含む。pHを低下させるための他の適切な薬剤は、塩酸(HCl)および硫酸(H2SO4)などの酸を含む。これらの(および他の)酸は、当業者により容易に理解されるであろう緩衝液に組み込まれてもよい。これらの工程は、上記で概説された方法の工程(a)に組み込まれてもよい。

0024

具体的な実施形態では、工程(a)は約(プラスまたはマイナス0.5度を意味する)摂氏15から30度の間の温度で実施される。特定の実施形態では、工程(a)は、室温で実施される。本明細書に記載される方法の全体は、これらの温度で実施されてもよい。

0025

これらの方法のより具体的な説明では、本発明はさらに、試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)任意に、試料中のインタクト(intact)な微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離
(vi)任意の分離された微生物の溶解
(vi)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(vii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(viii)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法を提供する。

0026

いくつかの実施形態では、溶解細胞物質は、インタクトな微生物から分離されていることを必要としないため、工程(ii)は任意の工程である。これは、いずれの場合においても、工程(iii)は溶解細胞物質において見られる核酸改変活性を阻害するために使用されるためである。

0027

「溶解細胞物質」という用語は、非微生物の溶解産物が意味される。これは、細胞膜および溶解細胞の細胞内内容物を含む。

0028

より具体的には、当該方法は、以下の工程を含んでもよい:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(iii)ペレットからの上清の除去
(iv)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために8分間以内でインキュベートすること
(v)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(vi)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
(vi)ペレットからの上清の除去
(vii)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(viii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(ix)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(x)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること。

0029

具体的な実施形態では、工程(iii)もしくは(iv)それぞれ、または全方法が摂氏15から30度の間の温度で実施される。あるいは、工程(iii)もしくは(iv)それぞれ、または全方法が、室温で実施されてもよい。

0030

試料中に存在する場合には非微生物、とりわけ哺乳類細胞を溶解するが、試料中の微生物を溶解しない試薬は、任意の適切な試薬であってもよい。いくつかの実施形態では、試薬は、界面活性剤または非イオン性洗剤などの洗剤を含んでもよい。適切な例は、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(Tween20)、例えば5%w/vを含む。試薬は、サポニンを例えば5%w/vで含んでもよい。試薬は、塩化ナトリウムなどの金属ハロゲン化物塩を、例えば8.5g/lで含んでもよい。試薬は、全ての3つの成分の混合物を含んでもよい。試料は、試料中に存在する場合には非微生物、とりわけ哺乳類細胞の溶解を確実にするが、試料中に存在する場合には微生物の非(またはわずかな)溶解を確実にするのに適切な条件下で、試薬と混合されてもよい。試料は、約5から30分間、例えば5、10、15、20、25または30分の期間、試薬に曝されてもよい。この工程は、任意の適切な温度、例えば摂氏15から30度の間でまたは室温で実施されてもよい。

0031

使用される場合、試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離は、任意の適切な方法により実施されてもよい。それは例えば(ポリクローナル抗体ベースアプローチなどのアフィニティー精製の一種に依存してもよい。いくつかの実施形態では、それは濾過に依存してもよい。分離は、試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離に依存してもよい。試料の遠心分離は、任意の適切な速度および任意の適切な持続時間で実施されてもよい。例えば、試料は、3000から10000gの間の速度、例えば約7000gまたは7300gで遠心分離されてもよい。試料は、試料中に存在する場合には非微生物、とりわけ哺乳類細胞の連続的な溶解を確実にするが試料中の微生物の非溶解またはわずかな溶解を確実にする適切な時間で遠心分離されてもよい。これは遠心分離の速度と併せて決定されてもよい。期間は、約1から30分間、例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25または30分であってもよい。この工程は、任意の適切な温度、例えば摂氏15から30度の間でまたは室温で実施されてもよい。分離後、溶解細胞物質が(上清の形態で)廃棄され、非溶解細胞が保持されてもよい(例えばペレットとして)。

0032

より一般的な方法に関する上記で提供された説明は、ここでは準用する。いくつかの実施形態によれば、高pH試薬はNaOHまたはNa2CO3を含む。いくつかの実施形態では、高pH試薬の濃度は約5mM以上である。特定の実施形態では、pH低下試薬はTris−HCl緩衝液などの緩衝液または酸を含む。具体的な実施形態では、緩衝液はpH7.2または8緩衝液であってもよい。

0033

pH改変試薬への暴露後に、試料中のいずれかの微生物は、pH改変条件から分離される。これは、試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離、続いてペレットからの上清の除去により達成されてもよい。適切な遠心分離条件は上記に記載される。

0034

次に、当該方法は、核酸改変活性の検出を可能にする任意の分離された微生物の溶解を必要とする。これは溶解混合物の添加により達成されてもよい。溶解混合物は一般に本発明の方法において有用である。溶解混合物は、細胞内の核酸改変活性に悪影響を及ぼすことなく微生物の効率的な溶解を確実にするための成分の、特定の混合物を含んでもよい。成分は、BSAなどのキャリア血清タンパク質、界面活性剤/洗剤、金属ハロゲン化物塩、緩衝液、キレート剤等から選択されてもよい。その基本的な形態では、本発明の溶解混合物は、以下の成分を含んでもよい:
1.界面活性剤/洗剤
2.アルブミン(例えばBSA)などの血清タンパク質
3.緩衝液
4.dNTPなどのヌクレオチド
5.核酸分子(本発明のアッセイにおいて基質として作用する)。

0035

適切な溶解混合物は、下記表1に記載され、かつ本発明の別の態様を形成する:
表1.溶解混合物成分



それぞれの成分の例示的な濃度が記載されているが、当業者により容易に理解されるように改変されてもよい。

0036

溶解はまた、細胞の破壊を必要としてもよい。例えば、細胞は、物理的および/または酵素的手段と組み合わせて、溶解混合物を使用して破壊されてもよい。いくつかの実施形態では、物理的な破壊にはディスラプターを利用する。ディスラプターは、細胞を溶解するためにガラスビーズなどのビーズが組み込まれてもよい。適切な装置は商業的に入手可能であり、かつサイエンティフィックインダストリーズ社製のディスラプターGenieを含む。いくつかの実施形態では、酵素的破壊は、リゾスタフィンリゾチームおよび/またはリチカーゼから選択される薬剤の使用を必要としてもよい。

0037

表1に示されるように、試料を試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる工程は、溶解混合物に核酸分子を加えることを含んでもよい。

0038

試料はその後、核酸改変活性に適切な条件下でインキュベートされる。これは核酸改変活性についての最適温度でのインキュベーションを伴ってもよい。例えば、試料は、摂氏約15から40度、例えば摂氏約37度の温度でインキュベートされてもよい。これは、任意の適切な時間、例えば5から60分間、例えば約5、10、15、20、25または30分間であってもよい。これに続いて、核酸改変活性は、改変された核酸分子検出工程前に失活されてもよい。これは、例えば適切な時間、摂氏95度などの摂氏60度を超える温度まで温度を上昇させることにより達成されてもよい。これは、1、2、3、4、5、10、15分またはそれ以上などの比較的に短い時間であってもよい。

0039

微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することは、本明細書中で説明される任意の適切な方法により実施されてもよい。好ましい方法は、核酸増幅に基づき、かつ試料中の核酸改変活性(従って微生物)の定量化を可能にしてもよい。

0040

発明者らはまた、ETGA法の状況における内部陽性対照(IPC)分子の使用を研究した。とりわけ、本発明は、IPCが同一の条件に曝されるように、基質核酸分子とIPCを含めることに依存してもよい。それらは、試料中の残留ヌクレアーゼ活性は、試料(特に本明細書に定義される溶解混合物)に加えられた基質に影響してもよいことを見出した。従って、ヌクレアーゼ活性由来のIPCを保護することにおいて利点がある。従って、本発明はまた、(液体)試料(潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
(iv)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。

0041

いくつかの実施形態では、溶解細胞物質がインタクトな微生物から分離されていることを必要としないため、工程(ii)における分離は任意の工程である。いくつかの実施形態では、溶解細胞物質において見られる核酸改変活性を不活性化する、代替的またはさらなる工程が実施される。本明細書で説明されるように、任意の適切な不活性化技術が利用されてもよい。例えば、不活性化は、溶解細胞物質における核酸改変活性および/またはヌクレアーゼ活性についてであってもよい。不活性化は、任意の適切な手段、例えば本明細書中で説明される高pH処理を使用して達成されてもよい。微生物をインタクトなままにしておくという事実は、不活性化処理からそれらを保護してもよい。

0042

同様に、本発明はまた、(液体)試料(潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(b)ペレットからの上清の除去
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(d)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する

0043

保護されたIPCは、保護された基質分子の使用の状況において特に有利である。従って、いくつかの実施形態では、(基質)核酸分子も、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。これは両方の核酸分子が保護され、同一の条件に供されることを確実にする。任意の適切な手段が、ヌクレアーゼ活性から核酸分子を保護するために利用されてもよい。非限定例は、核酸分子へのメチル化の組み込み、3’および/もしくは5’末端の保護などの末端改変ならびに合成ヌクレオチドの組み込みを含む。具体的な実施形態では、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。特定の実施形態では、合成ヌクレオチドは、少なくとも1から最大で全ての、核酸分子中のヌクレオチドを置換する。具体的な実施形態では、IPCおよび基質核酸分子は同一の方法で改変されている。これは、可能な限りヌクレアーゼ活性からの保護を提供する観点である。

0044

本発明の文脈において、もし、IPCがヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されているならば、IPCはヌクレアーゼ活性からそれを保護するために予め改変されている、つまり、IPCが試料と接触される前にヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。

0045

本発明はまた、試料中の潜在的な、汚染ヌクレアーゼ活性をモニターするためにIPCを使用することも企図している。従って、本発明はまた、(液体)試料(潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
(iv)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。

0046

いくつかの実施形態では、溶解細胞物質がインタクトな微生物から分離されていることを必要としないため、工程(ii)における分離は任意の工程である。いくつかの実施形態では、溶解細胞物質において見られる核酸改変活性を不活性化する、代替的またはさらなる工程が実施される。本明細書で説明されるように、任意の適切な不活性化技術が利用されてもよい。例えば、不活性化は、溶解細胞物質における核酸改変活性および/またはヌクレアーゼ活性についてであってもよい。不活性化は、任意の適切な手段、例えば本明細書中で説明される高pH処理を使用して達成されてもよい。微生物をインタクトなままにしておくという事実は、不活性化処理からそれらを保護してもよい。

0047

同様に、(液体)試料(潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(b)ペレットからの上清の除去
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(d)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法がさらに提供される。

0048

典型的には、工程(iii)および(iv)または(c)および(d)は共に実施される。

0049

具体的な実施形態では、本発明の方法において使用される(基質)核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定する工程は、相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を加えることを含む。

0050

特定の実施形態では、部分的に二本鎖の(基質)核酸分子の第一の鎖は、合成ヌクレオチド(例えばホスホロチオエートヌクレオチド)を含み(または、からなり)、第二の(相補的な)鎖は、ウラシル残基および、任意に合成ヌクレオチド(例えばホスホロチオエートヌクレオチド)を含む(または、からなる)。好ましくは、二本鎖の領域は、第一のおよび第二の(相補的な)鎖の3’末端領域を包含する。好ましくは、二本鎖の領域は少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20または少なくとも25ヌクレオチドであり;任意に、二本鎖の領域は50ヌクレオチド以下である。第一の鎖は、本明細書中に記載されるインキュベーション工程の間に、非保護(または標準)のヌクレオチドを含む伸長された第一の鎖を形成するために、試料中の微生物のポリメラーゼ活性により、非保護(または標準)のdNTPを使用して伸長されてもよい。この工程は、鋳型(第一の鎖と第二の鎖の間の相補性領域上流)として第二の鎖を使用することに依存する。インキュベーション工程後に、第二の(相補的な)鎖は、試料にウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を加えることにより、合成ヌクレオチドおよび非保護ヌクレオチドを含む一本鎖分子として伸長された第一の鎖をそのままにして、分解されてもよい。第二の鎖の分解後、(基質)核酸分子の伸長された第一の鎖は、増幅工程中に検出されてもよい。発明者らは、上述される部分的に二本鎖の(基質)核酸分子の使用は、試料中の微生物の検出を改善することを見出した。

0051

特定の実施形態では、プライマー結合に対して競合があるように、IPC核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む(方法の工程(vi)または(f)における)。

0052

さらなる実施形態では、核酸分子内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが加えられる(工程(vi)または(f)において)。典型的には、当該プローブは核酸分子のセンス鎖に結合する。他の実施形態では、IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが、工程(vi)または(f)のそれぞれにおいて加えられる。具体的な実施形態では、核酸プローブは、IPC核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない。核酸プローブおよび/またはさらなる核酸プローブは標識化されていてもよい。好ましくは、それらは異なって標識化されている。

0053

具体的な実施形態では、核酸分子の相補鎖は、伸長を防ぐために3’末端での改変を含む。この改変は伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含んでもよい。具体的な実施形態では、伸長不可能なヌクレオチドは、ジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である。

0054

IPCがヌクレアーゼ活性に感受性である方法において、(基質)核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていてもよい。適切な改変が本明細書中に記載され、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択されてもよい。合成ヌクレオチドの例は、ホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。

0055

基本的なアッセイ形式の様々な開発は、特に特異的かつ高感度な方法を作るために、有利に組み合わせられることができる。従って、本発明は、試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)任意に、試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離
(vi)任意の分離された微生物の溶解
(vii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(viii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(ix)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法をさらに提供する。

0056

いくつかの実施形態では、溶解細胞物質は、インタクトな微生物から分離されていることを必要としないため、工程(ii)は任意の工程である。これは、いずれの場合においても、工程(iii)は溶解細胞物質において見られる核酸改変活性を阻害するために使用されるためである。

0057

同様に、本発明はさらに、試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(b)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(c)ペレットからの上清の除去
(d)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(e)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(f)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
(g)ペレットからの上清の除去
(h)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(i)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(j)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(k)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法を提供する。

0058

従って、これらの方法は、本明細書に記載される他の方法の組み合わせを表す。従って、全ての関連する実施形態はこの全体的な方法に準用する。例えば、核酸が改変されている他の実施形態に関して、改変は、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択されてもよい。合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。

0059

特定の実施形態では、核酸分子は2nM、5nM、7.5nMまたは10nMなどの、少なくとも2nMであり、かつ50nM未満(例えば2nMから25nM、5nMから15nM、または7.5から12.5nM)の濃度で試料に加えられる。核酸分子は、方法の工程(vi)または(h)において使用される溶解混合物中に含まれてもよい(つまり、特定の濃度は溶解混合物中の濃度)。従って、いくつかの実施形態では、単一の工程として、工程(vi)および(vii)または(h)および(i)それぞれは、効率的に組み合わせられてもよい。溶解混合物は、表1により特定されているか、または本開示の他の箇所で詳述されていてもよい。

0060

当該方法は同様に、50μM超、好ましくは少なくとも100μM、例えば55から300μM、または60から250μM、または75から200μMの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む。また、dNTPは、方法の工程(vi)または(h)において使用される溶解混合物中に含まれてもよい(つまり、特定の濃度は溶解混合物中の濃度)。従って、いくつかの実施形態では、単一の工程として、工程(vi)および(vii)または(h)および(i)それぞれは、効率的に組み合わせられてもよい。

0061

上記で本明細書より詳細に記載されるように、高pH試薬は、NaOHまたはNa2CO3であってもよいし、または含んでもよい。具体的な実施形態では、高pH試薬の濃度が約5mM以上である。pH低下試薬はTris−HCl緩衝液(例えばpH7.2または8)などの緩衝液または酸を含んでもよい。具体的な実施形態では、工程(iii)または(d)は摂氏15から30度の間の温度で実施されるか、または室温で実施される。いくつかの実施形態では、当該方法の、それぞれおよび/または全ての工程は、摂氏15から30度の間の温度でまたは室温で実施されてもよい。PCRなどの核酸増幅工程が利用される場合、それらの工程は、本明細書中に詳述され、当業者により理解される適切な温度で実施される必要があるだろう。

0062

具体的な実施形態では、ヌクレアーゼ感受性IPCが利用されてもよい。従って、工程(vii)または(i)それぞれは、内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含んでもよく、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用される。

0063

あるいは、ヌクレアーゼ耐性IPCが利用されてもよい。従って、工程(vii)または(i)それぞれは、内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含んでもよく、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。適切な改変は本明細書中に、より詳細に記載され、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択されてもよい。合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドであってもよいし、または含んでもよい。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。もし両分子が改変されているならば、ヌクレアーゼ耐性が同等であるように、それらが、同一のまたは同様の方法で改変されていることが好ましい。これにより、IPCが、基質分子に対するヌクレアーゼ活性の影響を決定するのに最も有用な比較機能を果たすことが可能になる。

0064

既に言及されたように、いくつかの実施形態では、工程(vi)および(vii)または(h)および(i)は共に実施される。ここで、核酸分子は、溶解混合物を形成するために溶解試薬と共に試料に加えられる。

0065

必要に応じて準用される本明細書中にさらに詳細に記載されるように、改変された核酸分子の検出は、配列決定または核酸増幅を含む様々な方法により検出されてもよい。具体的な実施形態では、工程(ix)または(k)それぞれは核酸増幅工程を含む。

0066

任意の適切な核酸分子が利用されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子はウラシル残基を組み込む。具体的な実施形態では、核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含む。かかる実施形態では、当該方法(および、とりわけそれぞれの方法の工程(ix)または(k))は、相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を加えることを含んでもよい。さらなる実施形態では、核酸分子の相補鎖は、伸長を防ぐために3’末端での改変を含む。「伸長」という用語は、さらなるヌクレオチドの追加が意味される。任意の適切な改変が利用されてもよい。具体的な実施形態では、改変は、伸長不可能なヌクレオチドの組み込みであるか、または含む。任意の適切な伸長不可能なヌクレオチドが利用されてもよい。例えば、伸長不可能なヌクレオチドは、ジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)であってもよいし、または含んでもよい。

0067

特定の実施形態では、改変された核酸分子の検出の工程(工程(ix)または(k)における)の間に、プライマー結合に対して競合があるように、IPC核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む。

0068

明細書中で説明されるように、利用可能な様々な増幅技術があり、それらの多くはプローブ(加水分解性のまたはヘアピンプローブなど)に依存する。いくつかの実施形態では、方法は、とりわけ工程(ix)または(k)における、プローブの使用を含む。具体的な実施形態では、方法の工程(ix)または(k)において、核酸プローブが加えられる。このプローブは、核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する。「結合する」という用語は、当業者により容易に理解されるように、当該方法に適用される条件下でのハイブリダイゼーションが意味される。いくつかの実施形態では、IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが利用され、例えば工程(ix)または(k)において加えられる。具体的な実施形態では、核酸プローブはIPC核酸分子に結合せず、さらなる核酸プローブは、(基質)核酸分子に結合しない。プローブおよび核酸分子(IPCまたは基質)は、当技術分野において知られる、技術およびツール(オンラインデザインツールなど)を使用して、不要なクロス−ハイブリダイゼーションを回避するよう設計され得る。

0069

核酸プローブおよび/またはさらなる核酸プローブは標識化されていてもよい。具体的な実施形態では、核酸プローブおよびさらなる核酸プローブは異なって標識化されている。例えば、それらは、最大発光の異なる波長を有する蛍光色素分子で標識化されていてもよい。標識の適切なペアは当業者により容易に選択されることができ、例えばFAMおよびTexas Redは、異なる標識として使用されてもよい。

0070

本発明の全ての態様では、核酸改変活性は、微生物生存能力を示すために有用である任意の活性であってもよい。核酸改変活性は、微生物により提供される酵素活性である。例は、ポリメラーゼおよび/またはリガーゼ活性を含む。好ましくは、核酸改変活性はポリメラーゼ活性である。ポリメラーゼ活性は、DNAおよび/またはRNAポリメラーゼ活性を含んでもよい。好ましくは、ポリメラーゼ活性はDNAおよび/またはRNAポリメラーゼ活性である。リガーゼ活性は、ATP依存性またはNAD依存性であってもよい。ホスファターゼキナーゼおよび/またはヌクレアーゼ活性などの、生存能力に関連する他の核酸改変活性が代わりに測定されてもよい。

0071

好ましくは、基質核酸分子への核酸改変活性の作用が、伸長した核酸分子を生産する。

0072

適切な基質分子は本明細書に詳細に記載される。核酸改変活性を検出するために有用な適切な基質分子が開示される場合、WO2011/130584、WO2010/119270およびWO2009/007719(明細書中に組み込まれる関連する開示)もまた、参照することができる。ホスファターゼ活性の場合、開示が出典明示により明細書中に組み込まれるWO2006/123154において、適切な核酸分子が開示される。

0073

本発明の、方法における使用およびキット中の包含物のための基質核酸分子は、NAD依存性リガーゼが、検出可能な連結された(新規の)核酸分子を生産するための分子に作用できるように、配列および構造でなければならない。

0074

本発明における使用のための適切な基質核酸分子は、下記実験の項でより詳細に説明される。従って、基質は、以下の分子を含んでもよい:
AS
Uaggcgucggugacaaacggccagcguuguugucucu−DDC(3’末端はジデオキシ−Cである)(配列番号6)
S1
Gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagactgaccgaccgataagctagaacagagagacaacaac(配列番号7)

0075

これは、アンチセンス鎖にウラシル残基を組み込む基質核酸分子の例である。核酸分子は、部分的に二本鎖であり、相補鎖においてウラシル残基を含む。これにより、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)は伸長後に相補鎖におけるウラシル残基を分解することが可能となり、従って、伸長の非存在において(つまり、試料中の核酸改変活性の非存在において)、基質分子が非特異的に増幅されることから防ぐ。さらなる実施形態では、核酸分子の相補鎖は、伸長を防ぐために3’末端での改変を含む。「伸長」という用語は、さらなるヌクレオチドの追加が意味される。任意の適切な改変が利用されてもよい。具体的な実施形態では、改変は、伸長不可能なヌクレオチドの組み込みであるか、または含む。任意の適切な伸長不可能なヌクレオチドが利用されてもよい。例えば、伸長不可能なヌクレオチドは、配列番号6に示されるジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)であってもよいし、または含んでもよい。

0076

これらの配列のバリアントが本発明において利用されてもよいことが留意される。例えば、さらなる隣接配列配列が加えられてもよい。代替のddNTPが利用されてもよい。バリアント配列は、配列番号6および7に記載される基質核酸分子のヌクレオチド配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のヌクレオチド配列同一性を有していてもよい。核酸分子は、適切な合成ヌクレオチド類似体を組み込んでもよく、または例えば、RNAもしくはPNAまたはそれらの混合物をベースとするものであってもよい。例えば、ヌクレアーゼ活性から保護するため適切な改変は、本明細書中に記載される。特定の実施形態では、それらは、検出を促進するために、蛍光標識、またはFRETペアなどを使用して標識化されてもよい。適切な検出方法は本明細書中に記載される。

0077

従って、(基質)核酸分子は、(新規の検出可能な)核酸分子を生成するための核酸改変活性により作用されることができる、任意の天然の核酸ならびに天然もしくは合成の類似体を含んでもよい。具体的な実施形態では、基質は伸長され、および/または連結されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸基質分子の組み合わせは、ポリメラーゼおよびリガーゼ活性の検出を可能にするために利用されてもよい。

0078

好ましくは、核酸基質は、試料中の核酸改変活性(微生物により提供される)よりも過剰に、とりわけ大モル過剰に存在する。これは、従来の方法に対する重要な技術的な区別である。新規の、伸長された核酸分子または連結された核酸分子が検出されるので、試料中のこの分子の存在のみが、効率的に働く検出方法のために必須である。従って、もし、他の核酸分子が、検出される微生物由来または例えば試験された試料中で見出され得る哺乳類もしくは他の起源由来などの試料に存在するならば、本発明の方法に有害ではない。

0079

いくつかの実施形態では、基質および/またはプライマーは、ゲノムDNAの非特異的な検出を回避するために、互いに塩基対を形成できる相補的な非天然分子を組み込んでもよい。一例として、pyDADおよびpuADAは、プライマーおよび基質分子に適切に組み込まれてもよい(Sismour et al.,Nucleic AcidsResearch、2004,Vol.32,No.2:728−735)。

0080

本明細書中にまた説明されるように、本発明の方法は、IPC分子を組み込んでもよい。任意の適切なIPCは、当該方法の要件に従って利用されてもよい。一例として、以下のIPCが、本発明において使用されてもよい:
gcc gat atc gga caa cgg ccg aac tgg gaa ggc gag atc agc agg cca cac gtt aaa gac aga gag aca aca acg ctg gcc gtt tgt cac cga cgc cta(配列番号3)

0081

本発明の全ての方法において、改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することは、核酸増幅工程を含んでもよいし、本質的に核酸増幅工程からなってもよいし、または核酸増幅工程からなってもよい。これは、本発明の方法を最大の感度にするのに役に立つ。かかる増幅技術は当技術分野でよく知られており、PCR、NASBA(Compton、1991)、3SR(Fahy et al.,1991)、ローリングサークル複製転写媒介増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA) Clinical Chemistry 45:777−784、1999、US6261846(出典明示により本明細書に組み込まれる)に記載されるDNAオリゴマー自己集合法、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Barringer et al.,1990)、標的ポリヌクレオチド配列選択的増幅(US 6410276)、選択的プライムPCR(arbitrarily primed PCR)(WO 90/06995)、コンセンサス配列プライムイPCR(US 4437975)、インベーダーテクノロジー(invader technology)、鎖置換技術およびニック置換増幅(WO 2004/067726)などの方法を含む。上記のリスト網羅的なものを意図するものではない。適切な核酸産物特異的に増幅されるならば、任意の核酸増幅技術が使用されてもよい。同様に、いくつかの実施形態では、シーケンシングに基づく方法論は、様々な次世代シーケンシングプラットフォームのいずれかを含むよう、利用されてもよい。

0082

増幅は、検出される改変された核酸分子の配列に特異的な増幅プライマーの使用により達成される。核酸分子について特異性を提供するために、配列の適切な領域に対応するプライマー結合部位が選択されてもよい。当業者であれば、核酸分子はまた、試料中の改変活性により生産された新規の核酸分子の検出のために必要とされるプライマー結合部位以外の配列、例えばRNAポリメラーゼ結合部位を含んでもよく、またはプロモーター配列が、NASBA、3SRおよびTMAなどの等温性増幅技術のために必要とされてもよいことを認識するだろう。

0083

例えばライゲーション/伸長が起こった場合のみ、増幅産物が生成されるように、1つ以上のプライマー結合部位は、基質核酸分子のライゲーション/伸長境界架橋しても良い。あるいは、プライマーは、連結され/伸長した核酸分子が形成された場合にのみ増幅産物が生成されるように(指数関数的に)、連結/伸長境界あるいは境界にわたる直接の増幅のどちらかに結合してもよい。プライマーおよび基質核酸分子(複数)は、非特異的な増幅(例えば試料中のゲノムDNA)を回避するよう設計されてもよい。

0084

本発明の方法における使用のための適切なプライマーは、下記の実験の項に記載される。それらは、配列番号4および/もしくは5を含み、本質的に配列番号4および/もしくは5からなり、または配列番号4および/もしくは5からなるプライマーを含む。これらのプライマーは、本発明の別の態様を形成する。これらの配列のバリアントは、本発明において利用されてもよいことが留意される。とりわけ、例えば、必要に応じて結合特異性を改善するために、さらなる配列特異的な隣接配列配列が加えられてもよい。バリアント配列は、実験の項に記載されるプライマーのヌクレオチド配列と、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のヌクレオチド配列同一性を有してもよい。プライマーは、適切な合成ヌクレオチド類似体を組み込んでもよく、または例えば、RNAもしくはPNAまたはそれらの混合物をベースとするものであってもよい。プライマーは、利用される検出様式に依存して蛍光標識および/またはFRETペアなどで標識化されていてもよい。必要に応じてまた標識化されてもよいプローブが利用されてもよい。

0085

特定の態様によれば、本発明の方法は、試料中の微生物の存在を示す基質核酸分子に対する核酸改変活性の作用の直接的結果として生産された改変された核酸分子を検出するために核酸増幅技術を使用して実施される。特定の実施形態では、使用される技術は、PCR、NASBA、3SR、TMA、SDAおよびDNAオリゴマー自己集合から選択される。

0086

増幅産物の検出は、例えば、ゲル電気泳動などの日常的な方法によるものであってもよいが、いくつかの実施形態では、リアルタイムまたはエンドポイント検出方法を使用して実施される。

0087

増幅反応の産物のリアルタイムまたはエンドポイント検出のための多くの技術が、当技術分野で知られている。これらは、SYBRグリーンI(Sambrook and Russell,Molecular Cloning−A Laboratory Manual,Third edition)などのインターカーレーティング蛍光色素の使用を含み、増幅されたDNAの収率が、産生された蛍光の量に基づいて推定されることが可能となる。多くのリアルタイム検出法は、連続的にモニターされ得る蛍光の読み取り値を生成する;分子ビーコンおよび蛍光共鳴エネルギー移動プローブを含む具体的な例が挙げられる。リアルタイムおよびエンドポイント技術「単一チューブ」において反応を維持するので有利である。これは、結果を得るために下流分析を必要とせず、より迅速に得られる結果をもたらすことを意味する。さらに「単一チューブ」環境で反応を維持することは、交差汚染のリスクを減少させ、かつ本発明の方法からの定量的な出力を可能にする。これは、健康および安全性への懸念がもっとも重要であり得る場合(例えば患者試料中の潜在的な微生物感染を検出する場合など)、本発明の文脈において特に重要であってもよい。

0088

PCR反応のリアルタイムおよびエンドポイント定量化は、TaqMan(登録商標)系(Applied Biosystems)、Holland et alを参照されたい;Detection of specific polymerase chain reaction product by utilising the 5’−3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,7276−7280(1991)、Gelmini et al.Quantitative polymerase chain reaction−based homogeneous assay with flurogenic probes to measure C−Erb−2 oncogene amplification. Clin. Chem. 43, 752−758 (1997) and Livak et al. Towardsfully automated genome wide polymorphism screening. Nat. Genet. 9, 341−342 (19995)(出典明示により本明細書に組み込まれる)を使用して達成されてもよい。この型のプローブは、一般的に加水分解性プローブと称されてもよい。リアルタイムまたはエンドポイント検出における使用のための適切な加水分解性/Taqmanプローブもまた、提供される。プローブは、例えば下記に詳述される標識を使用して、適切に標識化されていてもよい。

0089

分子ビーコン系では、Tyagi & Kramer.Molecular beacons − probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14, 303−308 (1996) and Tyagi et al. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16, 49−53 (1998)(出典明示により本明細書に組み込まれる。)を参照されたい、ビーコンは、その標的に結合すると蛍光が回復する内部消光蛍光色素分子を有するヘアピン型プローブである。これらのプローブは、ヘアピンプローブと称されてもよい。本発明において有用な適切なプローブは、配列番号1および2に記載される。

0090

本発明の方法に組み込まれてもよいさらなるリアルタイム蛍光ベースの系は、Scorpion系、Detection ofPCRproducts using self−probing amplicons and fluorescence by Whitcombe et al. Nature Biotechnology 17, 804 − 807 (01 Aug 1999)を参照されたい。当業者によく知られ、かつ商業的に入手可能な、さらなるリアルタイムまたはエンドポイント検出技術は、Lightcycler(登録商標)テクノロジー、Amplifluour(登録商標)プライマーテクノロジー、DzyNAプライマー(Todd et al.,Clinical Chemistry 46:5,625−630(2000))、またはPlexorTM qPCRおよびqRT−PCR系を含む。

0091

本発明のさらなる態様によれば、核酸増幅の産物は、リアルタイムまたはエンドポイント技術を使用して検出される。本発明の具体的な実施形態では、リアルタイム技術は、加水分解性プローブ(Taqman(登録商標)系)、FRETプローブ(Lightcycler(登録商標)系)、ヘアピンプライマー(Amplifluour(登録商標)系)、ヘアピンプローブ(分子ビーコン系)、プライマーに組み込まれるヘアピンプローブ(Scorpion(登録商標)プローブ系)、DNAzymeの相補的な配列および切断可能な蛍光DNAzyme基質(DzYNA)を組み込むプライマー、Plexor qPCRならびにオリゴヌクレオチドブロッキング系のいずれかひとつを使用することからなる。

0092

増幅産物は、試料中の微生物の核酸改変活性、従って試料中の微生物のレベルの近似を与えるように定量されてもよい。従って、「非存在または存在」という用語は、試料中の微生物のレベルの定量化を包含するよう意図される。

0093

特定の実施形態では、反応混合物は、増幅産物のリアルタイムまたはエンドポイント検出を可能にするために必要とされる試薬に任意に加える、改変された核酸分子の増幅のために必要とされる、試験中の試料、基質核酸分子、試薬、緩衝液および酵素の全てを含有するだろう。従って、核酸改変活性(目的の1つ以上の細菌細胞または微生物由来)についての検出方法全体は、定量的な出力を伴い、かついかなる中間の洗浄工程を必要とせずに、単一の反応において、起こってもよい。「単一チューブ」反応の使用は、結果を得るために下流分析を必要とせず、より迅速に得られる結果をもたらすため有利である。さらに「単一チューブ」環境で反応を維持することは、交差汚染のリスクを減少させ、かつ本発明の方法からの定量的な出力を可能にする。また、単一チューブ反応は、例えばハイスループットの状況において、自動化に、より適している。

0094

あるいは、本発明の方法は、段階的な方法で実施されてもよい。第一の工程によれば、本発明の方法における使用に適切な形態で試料を調製することが第一に必要とされてもよい。例えば、本明細書中で説明されるように、選択的な細胞溶解または細胞透過性を増加させることが、必要とされてもよい。本明細書中にまた記載されるように、ポリメラーゼまたはリガーゼなどの特異的な核酸改変活性の捕捉が、望ましくてもよい。ヌクレアーゼ活性などの、他の核酸改変活性(起源)が、阻害等されてもよい。

0095

増幅工程前の本発明の方法の工程は、40℃超、50℃超、60℃超、70℃超、80℃超、90℃超または95℃超の温度で実施される工程を含まなくてもよい。

0096

あるいは、本発明の方法は、40℃超、50℃超、60℃超、70℃超、80℃超、90℃超または95℃超の温度で実施される工程を含まなくてもよい。

0097

増幅工程前の本発明の方法の工程は、摂氏10から50度の間で、摂氏15から45度の間で、摂氏20から40度の間で、摂氏25から40度の間で、摂氏30から40度の間で、摂氏25から35度の間で、または摂氏15から30度の間の温度で実施されてもよく、任意に、増幅工程前の方法の工程が室温で施されてもよい。

0098

あるいは、本発明の方法の工程は、全て、摂氏10から50度の間で、摂氏15から45度の間で、摂氏20から40度の間で、摂氏25から40度の間で、摂氏30から40度の間で、摂氏25から35度の間で、または摂氏15から30度の間の温度で実施されてもよく、任意に、方法の工程の全てが室温で施されてもよい。

0099

本発明の方法は、試料中のヌクレアーゼ活性を不活性化する工程を含んでもよい。あるいは、本発明の方法は、試料中のヌクレアーゼ活性を不活性化する工程を含まない。もし、実施されるならば、ヌクレアーゼ活性を不活性化する工程は、インキュベーション工程後および改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定する工程(例えば増幅による)前に行われる。

0100

本発明の文脈における「試料」という用語は、核酸改変活性を発現する、真菌(例えば酵母)または細菌などの微生物の存在について試験することが望ましい任意の試料を含むと定義される。従って、試料は、血液試料などの臨床試料を含んでもよいし、本質的に血液試料などの臨床試料からなってもよいし、または血液試料などの臨床試料からなってもよい。本発明の方法は、陰性の血液培養の迅速な決定に特に適用可能である。従って、試料は、血流感染に罹患していると疑われているまたは血流感染について検査されている、患者由来の血液培養試料を含んでもよい。試料は、任意の適切な容積、例えば1から10ml、好ましくは1mlの血液培養試料であってもよい。

0101

あるいは、試料は、例えばインビトロアッセイ系であってもよいし、または例えばインビトロアッセイ系を含んでもよい。試料は、以下のものを含んでもよいし、本質的に以下のものからなってもよいし、または以下のものからなってもよい:飲料もしくは食品試料またはそれらの調製物、または医薬品またはシャンプーコンディショナー保湿剤を含むパーソナルケア製品などの化粧品等であり、それらの全ては、日常的な問題として微生物汚染について試験される。試料は、組織もしくは細胞を含んでもよいし、本質的に組織もしくは細胞からなってもよいし、または組織もしくは細胞からなってもよく、そして、例えばまたは血液試料もしくは血小板試料を含んでもよいし、本質的に例えば痰または血液試料もしくは血小板試料からなってもよいし、または例えば痰または血液試料もしくは血小板試料からなってもよい。さらに、本発明の方法およびキットは、例えば食品が調製される場所などの表面の汚染をモニターするために使用されてもよい。汚染は、微生物の核酸改変活性の存在により示される。汚染は、いずれかの微生物起源、とりわけ細菌性のまたは真菌の(例えば酵母)汚染由来であってもよい。さらに本発明は、給水、排水、海洋環境などの環境条件をモニターすることにおいても有用である。本発明はまた、細菌または胞子含量を、病院産業施設または生物防御の用途において評価することができる細菌増殖発酵法および空気サンプリングでモニターすることにおいても有用である。

0102

本発明の方法は、微生物の非存在または存在について試料をスクリーニングすることに加えて、様々な有用性を有する。従って、さらなる態様では、本発明は、微生物に対する薬剤に対する、微生物の耐性についてスクリーニングするための、本明細書中に記載される方法の使用を提供する。当該方法は、目的の微生物を含有する試料を薬剤に曝し、その後、微生物が耐性であるかどうかを決定するために本発明の方法を実施する工程を伴ってもよい。もし、微生物が耐性であるならば、改変された核酸分子が検出されるだろう。典型的には、かかる方法は、目的の微生物の培養された臨床分離株などの十分に特性が明らかにされた試料を使用して実施される。

0103

同様に、本発明は、1つ以上の微生物を死滅させ、または増殖を防ぐことができてもよい、候補薬剤をスクリーニングするための本明細書中に記載される方法の使用を提供する。この方法は、微生物を含有する試料を薬剤に曝し、その後本発明の方法を実施することを伴なってもよい。もし、薬剤が有効な死滅薬であるならば、検出される改変された核酸は、ない(または減少している)だろう。典型的には、かかる方法は、目的の微生物の培養された臨床分離株などの十分に特性が明らかにされた試料を使用して実施される。当該方法は、薬剤が微生物の増殖を防ぐことができる(たとえ死滅することができないとしても)かどうかを決定するための時間経過実験として実施されてもよい。薬の非存在下で微生物の増殖を決定するために、薬剤の非存在下で平行反応が実施されてもよい。これは、増殖阻害活性に関して薬剤の有効性についての比較を提供する。

0104

さらに、本発明は、感染、対象中の微生物の存在に関連する疾患を診断するための、本明細書中に記載される方法の使用を提供する。この文脈では、「試料」という用語は、一般に臨床試料であるだろう。使用される試料は、試験される条件に依存するだろう。本発明を限定することを意図するのではないが、使用されてもよい典型的な試料は、患者、もっとも好ましくはヒト患者から得られる、全血血清血漿血小板および尿試料等を含む。

0105

好ましい実施形態では、試験は、対象から除去された試料で実施されるインビトロ試験であるだろう。さらなる実施形態では、上述の診断方法は、対象から試料を得る工程をさらに含んでもよい。対象から適切な試料を得る方法は、当技術分野でよく知られている。あるいは、当該方法は、別の手順で患者から既に単離された試料から開始して実施されてもよい。当該診断方法は、もっとも好ましくはヒト由来の試料で実施されるが、本発明の方法は多くの動物について診断上有用性を有し得る。

0106

本発明の診断方法は、潜在的に初期診断を確認する方法として、既に利用可能な任意の診断技術を補完するために使用されてもよい。あるいは、当該方法は、迅速かつ簡便な診断方法を提供するので、それ自体の予備的な診断方法として使用されてもよい。さらに、それらの本来の感度に起因して、本発明の診断方法は、最小限の試料しか必要とせず、従って、不要な侵襲手術を防ぐ。また、大きいが、非濃縮の試料もまた、本発明の方法によれば、効率的に試験され得る。

0107

従って、本発明の方法は、試料中の汚染生物の検出を超えて、複数の用途を有する。本発明の様々な態様に関して上述した説明は、本発明の他の態様について準用し、簡潔さの理由から繰り返されていない。例えば、適切な対照は、本発明のそれぞれ方法について組み込まれてもよい。

0108

具体的な実施形態では、微生物は病原菌などの病原性微生物である。細菌は、感染または、対象好ましくはヒト対象における疾患を引き起こす能力のある、任意の細菌であってもよい。一実施形態では、細菌は、スタフィロコッカス種、とりわけスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)および好ましくはメチシリン耐性株、エンテロコッカス種、ストレプトコッカス種マイコバクテリウム種、とりわけマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium・tuberculosis)、ビブリオ種、とりわけビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、サルモネラおよび/またはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等の任意の1つ以上を含む、または本質的にそれらからなる、またはそれらからなる。特定の実施形態では、細菌は、クロストリジウム種およびとりわけC.ディフィシルを含んでもよいし、本質的にクロストリジウム種およびとりわけC.ディフィシルからなってもよいし、またはクロストリジウム種、とりわけC.ディフィシルからなってもよい。C.ディフィシルは、抗生物質に関連する下痢および大腸炎、他の基礎疾患を有する高齢患者に主に影響する医療関連腸感染症の主原因である。C.アルビカンス、C.パラプシローシス(parapsilosis)およびC.グラブラータなどのカンジダ種が、検出されてもよい。C.ネオフォルマンス(neoformans)などのクリプトコッカス種が、検出されてもよい。カンジダ血症などの真菌血症が、本発明を使用して検出(存在または非存在)されてもよい。

0109

特定の実施形態では、本発明のこれらのさらなる態様では、当該方法で試験されている分子(耐性または感染症または細胞毒性治療する能力のいずれか)は、抗菌化合物である。化合物スクリーニング方法では、任意の分子が試験されてもよい。例は、抗菌薬、siRNA(dsRNA)分子およびアンチセンス分子を含む核酸分子、小分子、抗体ならびに例えばそれらが結合親和性等を保持するならばFab断片可変領域断片および単一ドメイン抗体を含む、それらの全ての誘導体を含む。当該方法は、短時間に多数の分子をスクリーニングするために、ハイスループットの状況において実施されてもよい。

0110

一実施形態では、抗菌薬は、2つの主要な型の抗菌薬、抗生物質(微生物により生産される天然物質)および化学療法薬化学的に合成された)から得られてもよく、または、半合成抗生物質(その後改変された自然に生産された抗生物質)または合成抗生物質(天然抗生物質の合成されたバージョン)などの2つのハイブリッドであってもよい。

0111

適切な候補抗菌薬剤は、本発明の方法における細菌もしくは細菌細胞または他の適切な微生物を殺すまたは増殖を防ぐ能力に関する肯定的な結果に続いて、以下の特性の少なくとも1つ以上について試験されてもよい:
(1)薬剤は、対象に対して無毒で、かつ有害な副作用が無いべきであり、
(2)薬剤は、対象に対して非アレルゲン性であるべきであり、
(3)薬剤は、対象の天然細菌を除去しないべきであり、
(4)薬剤は、安定であるべきであり、
(5)薬剤は、好ましくは安価かつ容易に入手可能/製造が容易であるべきであり;かつ
(6)薬剤は、病原体耐性が(顕著な程度まで)発達しないほど強力であるべきである。この特徴は、上記に記載される方法により試験されてもよい。

0112

一実施形態では、複数の適切な抗菌薬剤の組み合わせは、感染症を治療する能力および/またはそれに対する耐性について試験されてもよい。

0113

耐性について、および或る感染を治療するそれらの新規の能力についてもおそらく試験されてもよい、抗生物質またはそれらの誘導体は、限定ではなく例として提供される以下の群から選択されてもよい;ペニシリン、とりわけペニシリンGまたはVなどのベータラクタム、およびセファロチンなどのセファロスポリンアンピシリンメチシリンおよびアモキシシリンなどの半合成ペニシリン、好ましくは半合成ペニシリン製剤(例えばクラバモックスまたはオーグメンチンなど)と併せて使用されるクラブラン酸アズトレオナムなどのモノバクタムイミペネムなどのカルバペネム(carboxypenem)、ストレプトマイシンカナマイシントブラマイシンおよびゲンタマイシンなどのアミノグリコシドバンコマイシンリンコマイシンおよびクリンダマイシンなどの糖ペプチドエリスロマイシンおよびオレアンドマイシンなどのマクロライドポリミキシンおよびバシトラシンなどのポリペプチドアンホテリシンおよびニスタチンなどのポリエンリファンピシンなどのリファマイシンテトラサイクリン類、例えばドキシサイクリンクロルテトラサイクリンなどのテトラサイクリン、半合成テトラサイクリン、クロラムフェニコールナリジクス酸およびフルオロキノロンなどのキノロンならびにスルホンアミドなどの競合阻害剤、例えばガントリシンおよびトリメトプリムセフトリアキソンおよび/またはニトフラゾン(nitroflurazone)もまた、利用される。

0114

さらに本発明は、試料を含有する血小板における微生物汚染の存在を検出するための、本明細書中に記載される方法の使用を提供する。かかる態様では、当該方法は、サブステップを組み込んでもよい:
(i)微生物細胞をインタクトなままにしておく条件下での血小板の溶解。これは主に、核酸改変活性の存在について試験する前に微生物の選択的濃縮を可能にする。従って、哺乳類細胞により提供される核酸改変活性は、試験前に除去され得る
(ii)微生物の濃縮(例えば細菌細胞を含有するペレットを生産するための遠心分離による)
(iii)微生物の溶解または核酸改変活性を放出させるための微生物の透過性を増加させる処理。

0115

本発明はまた、本発明の方法を実施することにおける有用なキットに関する。従って、
(a)少なくとも1つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、少なくとも1つの試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子
(b)核酸分子とIPCの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも1つの内部陽性対照(IPC)核酸分子
を含む、本明細書中に記載される方法を実施するためのキットが提供される。

0116

キットは、本発明の方法を実施するために必要とされる成分のいずれかを組み込んでもよい。従って、本発明の方法の全ての記載は必要に応じて適用される。

0117

本発明の文脈において、核酸分子はヌクレアーゼ活性からそれを保護するために予め改変されている。

0118

いくつかの実施形態では、キットは核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブをさらに含む。キットは、IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、核酸プローブは、IPC核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない。核酸プローブおよび/またはさらなる核酸プローブは標識化されていてもよい。具体的な実施形態では、核酸プローブおよびさらなる核酸プローブは異なって標識化されている。例えば、それらは、最大発光の異なる波長を有する蛍光色素分子で標識化されていてもよい。標識の適切なペアは当業者により容易に選択されることができ、例えばFAMおよびTexas Redは、異なる標識として使用されてもよい。

0119

さらなる実施形態では、核酸分子の相補鎖は、伸長を防ぐために3’末端での改変を含む。「伸長」という用語は、さらなるヌクレオチドの追加が意味される。任意の適切な改変が利用されてもよい。具体的な実施形態では、改変は、伸長不可能なヌクレオチドの組み込みであるか、または含む。任意の適切な伸長不可能なヌクレオチドが利用されてもよい。例えば、伸長不可能なヌクレオチドは、ジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)であってもよいし、または含んでもよい。

0120

さらなる実施形態では、IPCはヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。本発明の文脈において、IPCはヌクレアーゼ活性からそれを保護するために予め改変されている。適切な改変は、本明細書中に、より詳細に記載され、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択されてもよい。合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドであってもよいし、または含んでもよい。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。もし両分子が改変されているならば、ヌクレアーゼ耐性が同等であるように、それらが、同一のまたは同様の方法で改変されていることが好ましい。これにより、IPCが、基質分子に対するヌクレアーゼ活性の影響を決定するのにもっとも有用な比較機能を果たすことが可能になる。

0121

さらなる実施形態では、キットは高pH試薬をさらに含む。高pH試薬は、NaOHまたはNa2CO3であってもよいし、または含んでもよい。具体的な実施形態では、高pH試薬の濃度が約5mM以上である。キットは、pH低下剤をさらに含んでもよい。pH低下試薬はTris−HCl緩衝液(例えばpH7.2または8)などの緩衝液または酸を含んでもよい。

0122

キットは、反応が起こる適切な担体を組み込んでもよい。有利には、かかる担体は、例えば48または96穴プレートなどのマルチウェルプレートを含んでもよい。かかる担体は、検出方法が比較的少量で実施されることを可能にし、従って、スケールアップが容易になり、必要とされるサンプル量が最小限に抑えられる。

0123

キットは、典型的には適切な説明書を組み込むだろう。これらの説明書は、本発明のキットを使用して、本発明の方法が確実に実施されることを可能にする。

0124

本発明は、以下の一連の番号付きの項にさらに定義されてもよい。
試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法。
2. 改変がメチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護および合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項1に記載の方法。
3. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項2に記載の方法。
4. 試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子が少なくとも2nMであるが50nM未満の濃度で試料に加えられることを特徴とする、
を含む、方法。
5. 工程(a)および/または(b)が少なくとも100μMの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む、項4に記載の方法。
6. 試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)高pH条件下で試料を、非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために、5分間以内で処理すること、
(b)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(c)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(d)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法。
7. 高pH条件が、試料をNaOHまたはNa2CO3と接触させることを含む、項6に記載の方法。
8. NaOHまたはNa2CO3の濃度が約5mM以上である、項7に記載の方法。
9. 高pH条件下での処理が、pHを低下させるための試薬を加えることにより停止される、項6から8のいずれかに記載の方法。
10. pHが緩衝液または酸を加えることにより低下される、項9に記載の方法。
11. 緩衝液がTris−HCl緩衝液(例えばpH7.2または8)を含む、項10に記載の方法。
12. 工程(a)が摂氏15から30度の間の温度で実施される、項6から11のいずれかに記載の方法。
13. 工程(a)が、室温で実施される、項6から12のいずれかに記載の方法。
14. 方法が、摂氏15から30度の間の温度で実施される、項1から13のいずれかに記載の方法。
15. 方法が室温で実施される、項1から14のいずれかに記載の方法。
16. 試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)任意に、試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離
(vi)任意の分離された微生物の溶解
(vi)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(vii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(viii)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること。
または
(b)
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(iii)ペレットからの上清の除去
(iv)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために8分間以内でインキュベートすること
(v)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(vi)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
(vi)ペレットからの上清の除去
(vii)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(viii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(ix)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(x)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法。
17. 高pH試薬がNaOHまたはNa2CO3を含む、項16に記載の方法。
18. 高pH試薬の濃度が約5mM以上である、項16または17に記載の方法。
19. pH低下試薬が緩衝液または酸を含む、項16から18のいずれかに記載の方法。
20. 緩衝液がTris−HCl緩衝液(pH7.2または8)を含む、項19に記載の方法。
21. 工程(a)(iii)または(b)(iv)が摂氏15から30度の間の温度で実施される、項16から20のいずれかに記載の方法。
22. 工程(a)(iii)または(b)(iv)が、室温で実施される、項16から21のいずれかに記載の方法。
23. 方法が、摂氏15から30度の間の温度で実施される、項16から22のいずれかに記載の方法。
24. 方法が室温で実施される、項16から23のいずれかに記載の方法。
25. (液体)試料(潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
(iv)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
または
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(b)ペレットからの上清の除去
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(d)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性から保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法。
26. 核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項25に記載の方法。
27. 改変が、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項25または26に記載の方法。
28. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項27に記載の方法。
29. (液体)試料(潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
(iv)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする。
または
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(b)ペレットからの上清の除去
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(d)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法。
30. 工程(iii)および(iv)または(c)および(d)それぞれが共に実施される、項25から29のいずれかに記載の方法。
31. 核酸分子が、溶解試薬と共に試料に加えられる、項30に記載の方法。
32. 改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することが核酸増幅工程を含む、項1から31のいずれかに記載の方法。
33. 核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定する工程は、相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を加えることを含む、項32に記載の方法。
34. 工程(f)において、プライマー結合に対して競合があるように、IPC核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、項25から33のいずれかに記載の方法。
35. 核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程(f)において加えられる、項25から34のいずれかに記載の方法。
36. IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程(f)において加えられる、項25から35のいずれかに記載の方法。
37. 核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、項36に記載の方法。
38. 核酸プローブが標識化されている、項35から37のいずれかに記載の方法。
39. さらなる核酸プローブが標識化されている、項35から38のいずれかに記載の方法。
40. 核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項38または39に記載の方法。
41. 核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、項33に記載の方法。
42. 改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、項41に記載の方法。
43. 伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である、項42に記載の方法。
44. ddNTPがジデオキシシチジンである、項43に記載の方法。
45. 核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項29から44のいずれかに記載の方法。
46. 改変がメチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項45に記載の方法。
47. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項46に記載の方法。
48. 試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)任意に、試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離
(vi)任意の分離された微生物の溶解
(vii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(viii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(ix)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。
または
(a)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(b)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(c)ペレットからの上清の除去
(d)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために8分間以内でインキュベートすること
(e)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(f)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
(g)ペレットからの上清の除去
(h)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(i)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(j)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(k)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法。
49. 改変が、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項48に記載の方法。
50. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項49に記載の方法。
51. 核酸分子が、少なくとも2nMおよび50nM未満の濃度で試料に加えられることをさらに特徴とする、項48から50のいずれかに記載の方法。
52. 工程(vii)または(i)それぞれが少なくとも100μMの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む、項48から51のいずれかに記載の方法。
53. 高pH試薬がNaOHまたはNa2CO3を含む、項48から52のいずれかに記載の方法。
54. 高pH試薬の濃度が約5mM以上である、項48から53のいずれかに記載の方法。
55. pH低下試薬が緩衝液または酸を含む、項48から54のいずれかに記載の方法。
56. 緩衝液がTris−HCl緩衝液(pH7.2または8)を含む、項55に記載の方法。
57. 工程(iv)または(d)のそれぞれが、摂氏15から30度の間の温度で実施される、項48から56のいずれかに記載の方法。
58. 工程(iv)または(d)のそれぞれが、室温で実施される、項48から57のいずれかに記載の方法。
59. 方法が摂氏15から30度の間の温度で実施される、項48から58のいずれかに記載の方法。
60. 方法が室温で実施される、項48から59のいずれかに記載の方法。
61. 工程(vi)または(i)それぞれが、内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでIPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用される、項48から60のいずれかに記載の方法。
62. 工程(vi)または(i)それぞれが、内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項48から60のいずれかに記載の方法。
63. 改変が、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項62に記載の方法。
64. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項63に記載の方法。
65. 工程(vi)および(vii)または(h)および(i)それぞれが共に実施される、項48から64のいずれかに記載の方法。
66. 核酸分子が、溶解試薬と共に試料に加えられる、項65に記載の方法。
67. 工程(xi)または(k)それぞれが、核酸増幅工程を含む、項48から66のいずれかに記載の方法。
68. 核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ工程(k)が相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を加えることを含む、項48から67のいずれかに記載の方法。
69. 工程(xi)または(k)それぞれにおいてプライマー結合に対して競合があるように、IPC核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、項64から68のいずれかに記載の方法。
70. 核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程(xi)または(k)それぞれにおいて加えられる、項48から69のいずれかに記載の方法。
71. IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程(xi)または(k)それぞれにおいて加えられる、項70に記載の方法。
72. 核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない、項71に記載の方法。
73. 核酸プローブが標識化されている、項70から72のいずれかに記載の方法。
74. さらなる核酸プローブが標識化されている、項71から73のいずれかに記載の方法。
75. 核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項74に記載の方法。
76. 核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、項68から75のいずれかに記載の方法。
77. 改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、項76に記載の方法。
78. 伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である、項77に記載の方法。
79. ddNTPがジデオキシシチジンである、項78に記載の方法。
80. 核酸改変活性がポリメラーゼ活性を含む、項1から79のいずれかに記載の方法。
81. 微生物に対する薬剤に対する微生物の耐性についてスクリーニングするための、項1から80のいずれかに記載の方法の使用。
82. 1つ以上の微生物を死滅させ、または増殖を防ぐことができてもよい、候補薬剤をスクリーニングするための、項1から80のいずれかに記載の方法の使用。
83. 感染、対象中の微生物の存在に関連する疾患を診断するための、項1から80のいずれかに記載の方法の使用。
84. 試料を含有する血小板における微生物汚染の存在を検出するための、項1から80のいずれかに記載の方法の使用。
85. 項1から84のいずれかに記載の方法を実行するための以下を含むキット:
(a)少なくとも1つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、少なくとも1つの試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子
(b)核酸分子とIPCの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも1つの内部陽性対照(IPC)核酸分子。
86. キットが核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブをさらに含む、項85に記載のキット。
87. キットがIPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブをさらに含む、項85または86に記載のキット。
88. 核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない、項86または87に記載のキット。
89. 核酸プローブが標識化されている、項86から88のいずれかに記載のキット。
90. さらなる核酸プローブが標識化されている、項87から89のいずれかに記載のキット。
91. 核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項87から90のいずれかに記載のキット。
92. 核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、項85から91のいずれかに記載のキット。
93. 改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む項92に記載のキット。
94. 伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である、項93に記載のキット。
95. ddNTPがジデオキシシチジンである、項94に記載のキット。
96. IPCがヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項85から95のいずれかに記載のキット。
97. 改変が、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項96に記載のキット。
98. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項97に記載のキット。
99. キットが高pH試薬をさらに含む、項85から98のいずれかに記載のキット。
100. 高pH試薬がNaOHまたはNa2CO3を含む、項99に記載のキット。
101. 高pH試薬の濃度が約5mM以上である、項99または100に記載のキット。
102. pH低下剤をさらに含む、項85から101のいずれかに記載のキット。
103. pH低下試薬が緩衝液または酸を含む、項102に記載のキット。
104. 緩衝液がTris−HCl緩衝液(pH7.2または8)を含む、項103に記載のキット。

0125

実験の項
本発明は、以下の非限定的な実施例に関して理解されるだろう:

0126

実施例1−ETGA試験改変
方法−一般的なプロトコール
それぞれの試料に関して、1mLの血液培養(加えられた微生物の有無に関わらず、血液の有無に関わらず)を、1.5mLのマイクロ遠心チューブにおいて0.333mLの試薬A(5%w/vのサポニン、5%w/vのTween20、8.5g/Lの塩化ナトリウム)と混合し、室温で15分間インキュベートした。それぞれの試料を、3分間、7300gで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、0.75mLの試薬B(5mMのNaOH)において再懸濁し、5分間インキュベートし、その後0.5mLの試薬C(1.32g/Lのアンモニウム硫酸、0.49g/Lのマグネシウム硫酸七水和物、0.75g/Lの塩化カリウム、20mMのTris−HCl、pH8.0)を加えることによりpHを低下させた。インキュベーション後、試料を再度遠心分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、0.5mLの試薬Cにおいて再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する新しいチューブ(0.1mmおよび0.5mmのガラスビーズ;CamBio cat 13118−400および13116−400によってそれぞれ供給される)に移した。さらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。

0127

ETGA基質(LM;試薬L1、L2、L3を7:2:1の比で含有する、表1を参照されたい)を含有する50μLの微生物溶解混合物を、ガラスビーズに加え、微生物細胞を溶解するために、6分間2800rpmでディスラプターGenie(サイエンティフィックインダストリーズ社)細胞ディスラプターに置いた。破壊後、試料を37℃のヒートブロックに置き、20分間インキュベートし、次いで95℃の別のヒートブロックに移し、5分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を室温まで冷やし、PCR試薬を調製した。

0128

冷却後、3μLの試料上清を、SmartCyclerPCRチューブ(Cepheid)において27μLのPCRマスターミックス(MM;一般的なTaqポリメラーゼPCRマスターミックス(Roche−cat 04902343001)、ETGA基質のためのプライマー、内部陽性対照−IPC−DNA、ETGA基質のためのFAM−標識化されたプローブ、IPCのためのTexas Red標識化されたプローブ、および(1.2μl)UDG酵素(Bioline−cat no BIO−27044)を含有する)に加えた。試料を、SmartCycler PCRに置き、以下の反応条件に供した;
1サイクル;40℃、10分、50℃、10分、95℃、5分
40−50サイクル:95℃、5秒、61℃、20秒、72℃、20秒。
増幅を、SmartCyclerのTexas RedおよびFAM励起検出チャネルにおいて、リアルタイムで反応を通してモニターした。

0129

表1溶解混合物組成

0130

PCR反応成分の配列は、以下の通りである;
Fam標識化されたプローブ(分子ビーコン):
FAM−cgc tgc gac cga ccg ata agc tag aac agg cag cg−BHQ1
(配列番号1)
Texas red標識化されたプローブ(分子ビーコン):
TxR− cgc gat cag cag gcc aca cgt taa aga cat cgc g−BHQ2
(配列番号2)
IPC
gcc gat atc gga caa cgg ccg aac tgg gaa ggc gag atc agc agg cca cac gtt aaa gac aga gag aca aca acg ctg gcc gtt tgt cac cga cgc cta
(配列番号3)
フォワードプライマー
ccg ata tcg gac aac ggc cga act gg (配列番号4)
リバースプライマー
tag gcg tcg gtg aca aac ggc cag c (配列番号5)
基質要素は;
AS
uaggcgucggugacaaacggccagcguuguugucucu−DDC(3’末端はジデオキシ−Cである)(配列番号6)
S1
gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagactgaccgaccgataagctagaacagagagacaacaac (配列番号7)
である。

0131

結果および考察1−基質濃度を増加させること
一般的なプロトコールを、LM中のETGA基質の量を10倍まで(0.001μMから0.01μMまで)増加させること、およびdNTPの量を2倍(50μMから100μMまで)増加させることにより改変した。

0132

基質およびdNTPの量の増加は、C.アルビカンス(図1a)、E.コリ(図1b)、S.アウレウス(図1c)、E.フェカリス(図1d)、P.エルギノーサ(図1e)、またはH.インフルエンザの2つの異なる株(繊細な臨床株を含む)(図1fおよび図1g)の改善した検出を可能にした。データは、図1に示される。

0133

結果および考察2−ETGA試験感度を改善すること、およびオリゴ成分を改変することによりバックグラウンドを低下させること

0134

ヌクレアーゼ活性の証拠
ETGA基質分子と同時にIPC分子を加えることは、元のプロトコールの改良であると考えられた。IPCをLM中に加えた場合、IPCはETGA基質と全く同一の試験条件の対象であり、したがって、より正確な試験対照を提供するだろう。例えば、基質を消化できるヌクレアーゼ活性などの、基質分子に負の影響を与え得る条件もまた、IPCに影響する。IPCが後に加えられる場合(例えばMMにおいて)、同一の条件の対象ではなく、データの誤った解釈をもたらし得る。ETGA基質と同時にIPCを加える場合、核酸鋳型への試験条件の影響の大きさが測定され得る。

0135

これを例示するために、図2は、試験条件がETGA基質の検出に負の衝撃を有し得ることを示し;MM中よりもむしろLM中のIPC DNAに匹敵する量を加えると、陰性対照試料(血液無し)と比較して、血液培養検体中のIPCを検出する能力が実際に喪失していたことが見出された。同一の検出の喪失は、MM中のIPCを使用する時には見られなかった。LM中に加えた場合のIPCの喪失は、ETGAプロトコールの37℃のインキュベーション工程中に活性であり得たヌクレアーゼに起因した。ヌクレアーゼは血液検体に由来する可能性が高かった。

0136

明らかに、IPC分子が試験中に喪失した場合、ETGA基質分子もまた喪失し得る。陽性血液培養試料中のETGA基質分子の喪失は、検出感度の減少を明らかにもたらし、または潜在的に偽陰性の結果につながるだろうが、IPCをLMに加えることにより、疑わしいヌクレアーゼ活性を決定し(そしておそらく定量化し)、それに応じて結果を解釈することができるだろう。IPC量の低下が観察された試料(陰性試薬対照と比較してCt値における上昇により見られる)は、‘陰性’よりもむしろ‘未解明’であるとして報告でき、従って、試料がヌクレアーゼ活性の対象であったこと、実際には陽性であってもよいことを示す。

0137

IPC分子をLMに加えることはETGA試験を改善することができた。しかしながら、どのようにして一般的なヌクレアーゼ活性が臨床検体に見出されたかということに依存して、これは、未解決の結果の全体の数を高めることができ、高い認識失敗率に起因して、試験を潜在的な利用者にとってあまり魅力的なものでないものにする(および従って、なぜIPCを最初からLMよりもむしろMMに加えたのかを説明する)。

0138

試験をすることは、IPC分子をLM中の試験に加え、濃度を20−50倍に増加させることにより推定されるヌクレアーゼ活性の存在下で依然として検出することができることを示したが、陰性血液培養試料でも高レベルのバックグラウンドが検出された(図3)。この場合、バックグラウンドは、検出PCR反応を妨害する部分的に消化されたオリゴヌクレオチドの存在により引き起こされてもよい。特に非常に少数の細菌を検出しようとする場合は、明らかに、高レベルのバックグラウンドが試験の感度を減少させ得る。

0139

LM中のIPCの量を増加させることは、ヌクレアーゼ活性に起因する標的DNA分子の喪失の問題に対する解決策と考えられるが、それは問題を隠すのみであり、かつ前述のようにより高いバックグラウンドレベルに寄与し得る。汚染ヌクレアーゼ活性が低い試料中のIPC分子の量を増加させることもまた、検出PCRにおける反応成分についての競合を増加させることにより試験感度を減少させることができ、それによって標的基質を検出する試験の能力を減少させる。推定上のヌクレアーゼ問題に対するより良い解決策が必要とされた。

0140

ヌクレアーゼ活性からETGA基質およびIPCを保護すること
IPC分子はLM中に含まれるべきであり、ヌクレアーゼ活性はETGA試験に有害な効果を有し得るという仮定に基づいて、ヌクレアーゼ分解からDNA標的(IPCおよびETGA基質)を保護する試みがなされた。

0141

DNAは、様々な手段により、改変(例えばメチル化、末端改変)により、または合成オリゴヌクレオチド(例えばロックド核酸、ホスホロチオエートヌクレオチド)の合成の間に非標準ヌクレオチドを使用して、ヌクレアーゼ活性から保護され得る。

0142

ETGA試験は、細菌よりも酵母に対して感受性が低いことがわかっている。この理由は知られていないが、細菌性酵素と比較して、真菌酵素のインビトロ活性もしくは細胞中の絶対的な量における差異、または阻害剤に対する感受性などの理由の組み合わせに起因するようである。

0143

ETGA試験におけるPTOオリゴの使用の実証
標準ETGA基質およびIPCオリゴは、一般的なプロトコールにおけるLM中の同一のヌクレオチド配列を有するホスホロチオエートオリゴ(PTO)と置き換えられた。PTO−改変されたETGA基質を、0.01μMでLMに加え、PTO−改変されたIPCを十分な量で加え、50サイクルPCR反応において37−41のCt値を達成した。

0144

血液培養中の酵母細胞の希釈系列(105、104、103および0cfu/ml)を、標準オリゴを用いる、およびPTO改変オリゴを用いる、元のETGA試験プロトコールで試験した。両試験は全く同一の添加された血液培養で行った(図4)。

0145

データは、標準オリゴを用いるETGA試験は、低レベルの酵母細胞の検出を妨げ得る高レベルのバックグラウンドを含む結果を得た一方で、PTO改変オリゴで得られた結果は、同一の効果を受けなかったことを示した。実際、結果は、PTOオリゴは、同一の培養検体で検出不可能なレベルまで全体のバックグラウンドを減少させ、従ってqPCR反応における閾値レベルの低下をさせ、ETGA試験の感度を潜在的に増加させたことを示した。標準オリゴを使用する場合、検出されるバックグラウンド蛍光の量に起因して、閾値レベルを50ユニットに設定したが、PTOオリゴを使用する場合には、閾値レベルは必要ならば10ユニット以下に低下させることができたということを注意されたい。PTOオリゴは標準オリゴを使用する場合よりも、PCR反応の後期に検出されたが、バックグラウンドのレベルが非常に低いので、PTO qPCR反応も、より長く実行できた(40よりもむしろ50サイクル)。

0146

バックグラウンドにおけるこの減少の結果は、標準オリゴを使用した場合に以前には検出不可能だったであろうより低レベルの微生物負荷(この例では103cfu/ml)を、PTOオリゴを用いて検出することができることを意味した。

0147

さらなる実験では、ヌクレアーゼ耐性のPTOバージョンの基質分子(MWG−Eurofins)をETGA試験において使用した。酵母一晩培養の希釈系列を血液培養に人工的に添加して使用した(その後血液培養の試料を総生存数を確認するためにSDAに広げた)。それぞれの懸濁液を、その後標準オリゴを使用するETGA試験およびPTOオリゴを使用するETGA試験で試験した。酵母の検出感度はPTOの使用によりかなり改善された。異なるPCRサイクル数に起因して、PTO結果は標準試験とは異なるy軸にプロットされたということに注意されたい。破線は、陰性対照(いずれの微生物もない血液培養)のCt値を示す。この実験からのデータは、PTO基質は、1000倍まで酵母の検出を改善することが示されており(図5)、さらに、バックグラウンドレベルを上昇させる効果を示さなかったことを示す。PTO基質を、ETGA試験の感度を増加させるために使用できるという知見は非常に重要であった。

0148

実施例2−ETGA試験における偽陰性試験結果を減少させること
一般的なプロトコール
10mLの検体に関して
それぞれの試料に関して、10mLの血液培養(加えられた微生物の有無に関わらず、血液の有無に関わらず)を、15mLのファルコンチューブにおいて3.33mLの試薬A(5%w/vのサポニン、5%w/vのTween20、8.5g/Lの塩化ナトリウム)と混合し、室温で15分間インキュベートした。それぞれの試料を8分間3600gで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、5mLの試薬B(5mMのNaOH)において再懸濁し、5分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を再度遠心分離分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、1mLの試薬C(1.32g/Lのアンモニウム硫酸、0.49g/Lのマグネシウム硫酸七水和物、0.75g/Lの塩化カリウム、20mMのTris−HCl、pH8.0)において再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。3分間7300xgでのさらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。

0149

50μLの微生物溶解混合物(LM;ETGA基質を含有する、上記実施例1における表1を参照されたい)を、ガラスビーズに加え、微生物細胞を溶解するために、6分間2800rpmでディスラプターGenie細胞ディスラプターに置いた。破壊後、試料を37℃のヒートブロックに置き、20分間インキュベートし、次いで95℃の別のヒートブロックに移し、5分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を室温まで冷やし、PCR試薬を調製した。

0150

冷却後、3μLの試料上清を、SmartCyclerPCRチューブ(Cepheid)において27μLのPCRマスターミックス(MM;一般的なTaqポリメラーゼPCRマスターミックス、ETGA基質のためのプライマー、内部陽性対照−IPC−DNA、ETGA基質のためのFAM−標識化されたプローブ、IPCのためのTexas Red標識化されたプローブ、およびUDG酵素を含有する)に加えた。試料を、SmartCycler PCRに置き、以下の反応条件に供した;
1サイクル;40℃、10分、50℃、10分、95℃、5分
40−50サイクル:95℃、5秒、61℃、20秒、72℃、20秒。
増幅を、SmartCyclerのTexas RedおよびFAM励起/検出チャネルにおいて、リアルタイムで反応を通してモニターした。

0151

1mLの検体に関して
それぞれの試料に関して、1mLの血液培養を、1.5mLのマイクロ遠心チューブにおいて0.333mLの試薬A(5%w/vのサポニン、5%w/vのTween20、8.5g/Lの塩化ナトリウム)と混合し、室温で15分間インキュベートした。それぞれの試料を、3分間、7300gで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、1mLの試薬B(5mMのNaOH)において再懸濁し、5分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を再度遠心分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、0.5mLの試薬C(1.32g/Lのアンモニウム硫酸、0.49g/Lのマグネシウム硫酸七水和物、0.75g/Lの塩化カリウム、20mMのTris−HCl、pH8.0)において再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する新しいチューブに移した。さらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。

0152

微生物の溶解およびPCR検出は、10mLのプロトコールについて先に記載されたように、その後実施された。

0153

PCR反応成分および基質は上記の実施例1に従う。

0154

バックグラウンド
ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)として同定された単一の臨床微生物単離物は臨床性能評価の間にETGA試験において偽陰性結果を示した。微生物がBiomerieux Bact/ALERT血液培養培地において標準的な自動血液培養により検出された。

0155

培養微生物細胞のスパイクを、ETGA試験の異なる段階に加えた場合、H.インフルエンザ株はNaOH洗浄工程(試薬B)後に加えた場合のみ検出されたことがわかった。他のより頑丈な細菌株は、開始時から試験に加えた場合に検出可能であることがわかった(図6を参照されたい)。結果は、H.インフルエンザの株がNaOH洗浄工程(またはNaOH洗浄工程まで、およびそれを含む工程の組み合わせ)に特に感受性であることを示した。

0156

この結果は、H.インフルエンザの全ての株に典型的なものではなく、これまでのところ、この株にだけ関連していた。当該単離株を、あまり頑丈でない微生物を検出するのにより良い、新規のETGA法を開発するための‘弱い’モデル生物として使用した。

0157

NaOH中でのインキュベーションは、遊離のポリメラーゼを失活させ、汚染物を減少させ、バックグラウンドを減少させるために実施されなければならないETGAプロトコールにおける必須の工程である。従って、試験結果に有害な影響を与えずにNaOHの有害な影響を減少させる試みがなされた。当該NaOHの濃度は十分な汚染物質を除去せず、これは試験の失敗につながるので、NaOHの濃度を低下させることができなかった。

0158

結果−NaOHへの試料暴露を減少させること
一般的な10mLのプロトコールでは、試料を遠心分離するのに要する時間は、試料がNaOHに曝される合計時間を8分まで増加させるということに注意されたい。時間の短縮は、アルカリの中和により、またはインキュベーション時間の至適な期間後に、NaOHに1mLの200mMのTris−HCl緩衝液、pH7.2を加えることにより少なくとも試料のpHを低下させることで達成され、制御され得る。

0159

10mLの検体についての一般的なプロトコールを、BacT/ALERTSAビン(血液は加えられていない)から採取した培養培地におけるH.インフルエンザの懸濁液について実施した。結果は、NaOHの中和(またはpHを顕著に低下させる)は、より低いCt値(同一の試料から)につながり、検出感度を改善した(図7を参照されたい)ことを示す。

0160

データはまた、インキュベーション時間がより短いほどより良いだろうが、また、短いインキュベーション時間は、信頼できるPCR増幅を可能にするための汚染物質の十分な除去ができず、反応の失敗または高いバックグラウンドレベルおよび偽陽性結果をもたらすということも示唆した。

0161

NaOH処理後の試料のpHを低下させることは、任意の適切な緩衝液または酸を加えることにより潜在的に達成され得る。試薬C(Tris−HCl緩衝液、pH8)は既に試験において使用されているので、pHを低下させる好ましい方法は当該試薬を使用することである。

0162

結果−好ましい実施形態、1mL
H.インフルエンザおよびS.アウレウスの両方の検出は、元のNaOH工程を、0.75mLのNaOHにおける再懸濁、室温で5分間のインキュベーションからなるより複雑な工程に置き換え、その後0.5mLの試薬Cを加えてpHを低下させることにより、1mLの検体についての一般的なプロトコールで改善することができた。図8に要約された結果は、全ての微生物含有試料でのETGA試験からのCt値は、元の1mLのプロトコールと比較してpH低下プロトコールを使用する場合により低く、これはpH低下プロトコールが検出を改善したことを示すことを示した。

0163

実施例3−95℃の重要性およびPTO基質の使用の解析
目的
この実施例において概説される研究の目的は、コグニターマイナス試験の性能での95℃工程の影響を評価することであった。コグニターマイナス試験を95℃工程の有無について細菌添加血液ブロス試料を使用して実施して、以下の特徴を比較した:
・得られたCt値
・試料調製の完了後の異なる時点でのQPCRにより測定されるETGA鋳型DNAの安定性
・溶解混合物(LM)が、ホスホロチオエート改変オリゴヌクレオチド(PTO)ETGA基質とは対照的に、未改変のオリゴヌクレオチド(UMO)ETGA基質を含有する場合に、得られたCt値およびETGA鋳型DNAの安定性。

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