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技術 バイオコンジュゲート生成において使用するための改変型宿主細胞

出願人 グラクソスミスクラインバイオロジカルズソシエテアノニム
発明者 ファリドモアイヤー,アミレザ
出願日 2015年8月6日 (5年4ヶ月経過) 出願番号 2017-506876
公開日 2017年8月24日 (3年4ヶ月経過) 公開番号 2017-523794
状態 特許登録済
技術分野 多糖類及びその誘導体 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 微生物、その培養処理 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 突然変異または遺伝子工学 医薬品製剤 微生物による化合物の製造 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 群クラス 還元単糖 フリッパー 発熱薬 雌性ウサギ テラバンシン 大形リーシュマニア イオンフラグメント
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重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

第一の反復単位還元末端ヘキソースを含まないハイブリッドオリゴ糖及び多糖を生成することができる宿主細胞が本明細書中に提供される。また、本明細書に記載の宿主細胞により生成され得るハイブリッドオリゴ糖又は多糖及びバイオコンジュゲートが本明細書中に提供され、該バイオコンジュゲートは、第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないハイブリッドオリゴ糖又は多糖に連結されたキャリアタンパク質を含む。

概要

背景

2-背景
グリコシル化は、それによって炭水化物分子又は糖(単糖二糖オリゴ糖若しくは多糖)がタンパク質又はポリペプチド中の様々なアミノ酸残基の側鎖に連結されて、糖タンパク質を生成するプロセスである。

N結合型タンパク質グリコシル化(N-グリコシル化)は、真核生物小胞体で生じる翻訳後修飾のうちの最も一般的なタイプであり、標的タンパク質ポリペプチド鎖中のアスパラギン残基への炭水化物分子の付加である。このプロセスは、小胞体中で保存された配列Asn-X-Ser/Thr(Xはプロリンを除くいずれかのアミノ酸)内での新生タンパク質のアスパラギン残基への、脂質キャリアドリコールリン酸)からの予め組み立てられたオリゴ糖の転移を担う、酵素的オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(oligosaccharyltransferase)複合体(OST)により遂行される。次に、糖鎖ゴルジ体での他の修飾に供される。天然には、N結合型グリコシル化は、真核生物及び古細菌で起こるが、細菌では非常に稀にしか起こらない。

O結合型グリコシル化は、真核生物、古細菌及び細菌で起こるグリコシル化の一形態である。これは、タンパク質標的のアミノ酸残基中の酸素原子への糖分子の連結である。

炭水化物分子又は糖に結合された(例えば、N-結合された)キャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成するための宿主細胞の使用は、当該技術分野において公知である。しかしながら、原核宿主細胞を用いたバイオコンジュゲートの生成の進歩にもかかわらず、宿主細胞におけるバイオコンジュゲート生成の改善された方法の必要性が依然として存在する。

概要

第一の反復単位還元末端ヘキソースを含まないハイブリッドオリゴ糖及び多糖を生成することができる宿主細胞が本明細書中に提供される。また、本明細書に記載の宿主細胞により生成され得るハイブリッドオリゴ糖又は多糖及びバイオコンジュゲートが本明細書中に提供され、該バイオコンジュゲートは、第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないハイブリッドオリゴ糖又は多糖に連結されたキャリアタンパク質を含む。なし

目的

バイオコンジュゲートを含む組成物
別の態様では、本明細書に記載する1種以上のバイオコンジュゲートを含む組成物(例えば医薬組成物)を本明細書において提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

構造(B)n-A→[式中、Aは、少なくとも2、3、4、5、6、7、又は8個の単糖を含み、還元末端(矢印で示される)にヘキソース単糖誘導体を有するオリゴ糖反復単位であり;Bは、少なくとも2、3、4、5、6、7、又は8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり;A及びBは異なるオリゴ糖反復単位であり;nは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は少なくとも20である]を有するハイブリッドオリゴ糖又は多糖

請求項2

Bオリゴ糖反復が、反復の還元末端にヘキソース単糖を含む、請求項1に記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

請求項3

反復の還元末端でのヘキソース単糖が、グルコースガラクトースラムノースアラビノトールフコース及びマンノースからなる群から選択される、請求項2に記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

請求項4

Aのオリゴ糖反復単位及びBのオリゴ糖反復単位が、反復の還元末端に異なる単糖を含むことでのみ相違する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

請求項5

Aのオリゴ糖反復単位が、グラム陽性細菌莢膜糖、例えば、A群連鎖球菌莢膜糖、B群連鎖球菌莢膜糖、肺炎球菌(Streptocuccus pneumoniae)莢膜糖、腸球菌莢膜糖又は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)莢膜糖の莢膜糖の反復単位である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

請求項6

Aのオリゴ糖反復単位が、肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F又は48の莢膜糖の反復単位である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

請求項7

請求項1〜6のいずれか一項に記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖に結合されたキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲート

請求項8

ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖の単糖の全てを含むことに加えて、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖と同一である、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖にN-結合されたキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲート。

請求項9

ヘキソース単糖誘導体が、そのC-2位が、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)などのアセトアミド基で修飾される任意の単糖である、請求項7又は8に記載のバイオコンジュゲート。

請求項10

ヘキソース単糖誘導体がN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)である、請求項9に記載のバイオコンジュゲート。

請求項11

ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、グラム陽性細菌莢膜糖の第一の反復の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、前記グラム陽性細菌莢膜糖と同一である、請求項7〜10のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。

請求項12

グラム陽性細菌莢膜糖が、A群連鎖球菌莢膜糖、B群連鎖球菌莢膜糖、肺炎球菌莢膜糖、腸球菌莢膜糖又は黄色ブドウ球菌莢膜糖である、請求項11に記載のバイオコンジュゲート。

請求項13

グラム陽性細菌莢膜糖が、肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F又は48莢膜糖である、請求項12に記載のバイオコンジュゲート。

請求項14

グラム陽性細菌莢膜糖が、肺炎球菌血清型8、12F、14、15A、16F、22F、23A、24F、31、33F、35B又は38莢膜糖である、請求項13に記載のバイオコンジュゲート。

請求項15

グラム陽性細菌莢膜糖が、黄色ブドウ球菌血清型5又は8莢膜糖である、請求項12に記載のバイオコンジュゲート。

請求項16

グラム陽性細菌莢膜糖が、ストレプトコッカスアガラクティエ(Streptococcus agalactiae)(B群連鎖球菌)血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII又はVIII莢膜糖である、請求項12に記載のバイオコンジュゲート。

請求項17

グラム陽性細菌莢膜糖が、エンテロコッカスフェカリス(Enterococcus faecalis)血清型A、B、C又はD莢膜糖である、請求項12に記載のバイオコンジュゲート。

請求項18

キャリアタンパク質が、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の無毒化された外毒素A(EPA)、CRM197、マルトース結合タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌(E. coli)FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌ニューモリシン及びその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C. jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(別名LcrV、EspA、SseB)、PopB(YopB、YopD、FliC)、又はOprF、OprIである、請求項7〜17のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。

請求項19

構造(B)n-A→[式中、Aは、還元末端(矢印で示される)にヘキソース単糖誘導体を有するオリゴ糖反復単位(場合により、少なくとも2、3、4、5、6、7又は8個の単糖を含む)であり;Bは、オリゴ糖反復単位(場合により、少なくとも2、3、4、5、6、7又は8個の単糖を含む)であり;A及びBは異なるオリゴ糖反復単位であり;nは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は少なくとも20である]のオリゴ糖又は多糖を合成する方法であって、A及びBを多糖ポリメラーゼとともにインキュベートすることを含む、前記方法。

請求項20

前記接触工程がインビトロで行われる、請求項19に記載の方法。

請求項21

前記接触工程が、原核細胞において、場合により原核細胞のペリプラズムにおいて行われる、請求項19に記載の方法。

請求項22

前記多糖ポリメラーゼがwzy多糖ポリメラーゼである、請求項19に記載の方法。

請求項23

Aが還元末端(矢印で示される)にヘキソース単糖誘導体を有し、Bが還元末端にヘキソースを有し、A及びBがその他の点で同一である、請求項19に記載の方法。

請求項24

AがBと同じ構造を有するが、Aが還元末端に追加の単糖を有するという1つの相違がある、請求項19に記載の方法。

請求項25

追加の単糖がヘキソース単糖誘導体である、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記ヘキソース単糖誘導体又は追加の単糖が、そのC-2位が、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、N-アセチルキノボサミン(QuiNAc)などのアセトアミド基で修飾される任意の単糖である、又は前記ヘキソース単糖誘導体が、GlcNAc、HexNAC、デオキシHexNAc若しくは2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソースである、請求項19〜25のいずれか一項に記載の方法。

請求項27

前記ポリメラーゼが、エシェリキア(Escherichia)属の種、シゲラ(Shigella)属の種、クレブシエラ(Klebsiella)属の種、キサントモナス(Xhantomonas)属の種、サルモネラ(Salmonella)属の種、エルシニア(Yersinia)属の種、アエロモナス(Aeromonas)属の種、フランシセラ(Francisella)属の種、ヘリコバクター(Helicobacter)属の種、プロテウス(Proteus)属の種、ラクトコッカス(Lactococcus)属の種、ラクトバチルス(Lactobacillus)属の種、シュードモナス(Pseudomonas)属の種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属の種、ストレプトミセス(Streptomyces)属の種、ストレプトコッカス(Streptococcus)属の種、エンテロコッカス(Enterococcus)属の種、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属の種、バチルス(Bacillus)属の種、クロストリジウム(Clostridium)属の種、リステリア(Listeria)属の種、又はカンピロバクター(Campylobacter)属の種由来である、請求項19〜26のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

前記ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位が、肺炎球菌莢膜多糖CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)、又はCP48の反復単位である、請求項19〜27のいずれか一項に記載の方法。

請求項29

a)オリゴ糖又は多糖反復単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、前記反復単位が還元末端にヘキソースを含まず、前記オリゴ糖又は多糖反復単位が還元末端にヘキソースを含むドナーオリゴ糖又は多糖反復単位に由来する、核酸;及びb)N-グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸;及びc)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び、場合によりd)ポリメラーゼ(wzy)をコードする核酸であって、ポリメラーゼがハイブリッドオリゴ糖又は多糖の生成を触媒し、ここで、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、(i)第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含み、(ii)他の全ての反復単位の還元末端にヘキソース単糖を含む、核酸を含む原核宿主細胞

請求項30

前記宿主細胞が、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項29に記載の宿主細胞。

請求項31

ドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、オペロン若しくは遺伝子クラスター又はその一部として宿主細胞に存在する、請求項30に記載の宿主細胞。

請求項32

前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むことを除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖がドナーオリゴ糖又は多糖と同一である、請求項29〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項33

前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖の単糖の全てを含むことに加えて、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖がドナーオリゴ糖又は多糖と同一である、請求項29〜32のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項34

前記宿主細胞が、(i)ヘキソース単糖誘導体をウンデカプレニルピロリン酸(UND-PP)上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼ、及び(ii)UND-PP上に集合したヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項29〜32のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項35

前記ヘキソース単糖誘導体が、そのC-2位が、アセトアミド基、例えば、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、N-アセチルキノボサミン(QuiNAc)で修飾される任意の単糖である、請求項34に記載の宿主細胞。

請求項36

UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種である、及び/又はドナーオリゴ糖反復単位を触媒する遺伝子に対して異種である、請求項34又は35に記載の宿主細胞。

請求項37

UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、請求項34〜36のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項38

UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、wecAであり、場合により大腸菌由来である、請求項34〜37のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項39

前記ヘキソース単糖がガラクトース(Gal)である、請求項34〜38のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項40

ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、シゲラ・ボイディ(Shigella boyedii)由来のガラクトシルトランスフェラーゼ(wfeD)若しくは大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であり、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、請求項34〜39のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項41

ドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、肺炎球菌CP14由来のwchL及び/又はwchMを含む、請求項30、31、又は33〜40のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項42

前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、肺炎球菌CP14の第一の反復単位の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が肺炎球菌CP14と同一である、請求項41に記載の宿主細胞。

請求項43

ドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、肺炎球菌CP33F由来のwciC、wciD、wciE、及び/又はwciFを含む、請求項30、31、又は33〜42のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項44

前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、肺炎球菌CP33Fの第一の反復単位の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が肺炎球菌CP33Fと同一である、請求項43に記載の宿主細胞。

請求項45

前記宿主細胞が、(i)ヘキソース単糖誘導体をウンデカプレニルピロリン酸(UND-PP)上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼ、及び(ii)ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位をヘキソース単糖誘導体上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項29〜34のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項46

前記ヘキソース単糖誘導体が、そのC-2位が、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)などのアセトアミド基で修飾される任意の単糖である、請求項45に記載の宿主細胞。

請求項47

UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種である、請求項45又は46に記載の宿主細胞。

請求項48

UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、請求項45〜47のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項49

UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、wecAであり、場合により大腸菌由来である、請求項45〜48のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項50

ヘキソース単糖誘導体上にドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を集合させるグリコシルトランスフェラーゼが、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項45〜49のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項51

ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在する前記ヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができる前記グリコシルトランスフェラーゼが、ガラクトシルトランスフェラーゼ(wciP)であり、場合により大腸菌O21由来である、請求項50に記載の宿主細胞。

請求項52

ヘキソース単糖誘導体上にドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を集合させるグリコシルトランスフェラーゼが、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項50〜51のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項53

ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に付加することができる前記グリコシルトランスフェラーゼが、グルコシルトランスフェラーゼ(wciQ)であり、場合により大腸菌O21由来である、請求項52に記載の宿主細胞。

請求項54

前記宿主細胞が、単糖を修飾することができる酵素、場合によりエピメラーゼ又はラセマーゼをさらに含む、請求項53に記載の宿主細胞。

請求項55

前記エピメラーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、請求項54に記載の宿主細胞。

請求項56

前記エピメラーゼが大腸菌由来である、請求項55に記載の宿主細胞。

請求項57

前記エピメラーゼが、大腸菌O157由来のZ3206である、請求項55に記載の宿主細胞。

請求項58

ドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、肺炎球菌CP14由来のwchL及びwchMを含む、請求項45〜57のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項59

前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、肺炎球菌CP14の単糖残基の全てを含むことに加えて、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が肺炎球菌CP14と同一である、請求項58に記載の宿主細胞。

請求項60

前記非ヘキソース単糖又は前記ヘキソース単糖誘導体が、2位にアセトアミド基を含む単糖である、請求項29〜59のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項61

前記ヘキソース単糖誘導体が、そのC-2位が、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)などのアセトアミド基で修飾される任意の単糖である、請求項60に記載の宿主細胞。

請求項62

前記宿主細胞が、莢膜多糖ポリメラーゼ(wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(wzy)をコードする核酸を含む、請求項29〜61のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項63

前記ポリメラーゼが、宿主細胞に対して異種である、及び/又は前記ポリメラーゼが、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を合成するための酵素をコードする遺伝子クラスターに対して異種である、請求項62に記載の宿主細胞。

請求項64

前記ポリメラーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、請求項62又は63に記載の宿主細胞。

請求項65

前記ポリメラーゼが、肺炎球菌由来であり、場合により肺炎球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A及びB)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14 CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、又はCP48由来である、請求項64に記載の宿主細胞。

請求項66

前記宿主細胞が、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含む、請求項29〜65のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項67

前記フリッパーゼが宿主細胞に対して異種である、及び/又は前記フリッパーゼが、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を合成するための酵素をコードする遺伝子クラスターに対して異種である、請求項66に記載の宿主細胞。

請求項68

前記フリッパーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、請求項66又は67に記載の宿主細胞。

請求項69

前記フリッパーゼが、肺炎球菌由来であり、場合により肺炎球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A及びB)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14 CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、又はCP48由来である、請求項68に記載の宿主細胞。

請求項70

前記オリゴ糖又は多糖が、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、請求項29〜69のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項71

前記多糖が、莢膜多糖(CP)であり、場合により肺炎球菌由来であり、場合により、前記肺炎球菌莢膜多糖がCP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)、又はCP48である、請求項29〜70のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項72

前記肺炎球菌莢膜多糖が、CP8、CP12F、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B、又はCP38である、請求項71に記載の宿主細胞。

請求項73

前記莢膜多糖が黄色ブドウ球菌由来であり、場合により前記黄色ブドウ球菌莢膜多糖がCP5又はCP8である、請求項71に記載の宿主細胞。

請求項74

前記莢膜多糖が、ストレプトコッカス・アガラクティエ(GBS)由来であり、場合により前記ストレプトコッカス・アガラクティエ莢膜多糖が、S.アガラクティエ(B群、GBS)CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII、又はCPVIIIである、請求項71に記載の宿主細胞。

請求項75

前記莢膜多糖がエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)由来であり、場合により前記エンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖が、CPA、CPB、CPC、又はCPDである、請求項71に記載の宿主細胞。

請求項76

第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないオリゴ糖又は多糖を生成する前記グリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つが、宿主細胞に対して異種である、請求項29〜75に記載の宿主細胞。

請求項77

前記キャリアタンパク質が、宿主細胞に対して異種である、請求項29〜76に記載の宿主細胞。

請求項78

前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種である、請求項29〜77のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項79

第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないオリゴ糖又は多糖を生成する前記グリコシルトランスフェラーゼ、前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、及び前記キャリアタンパク質のうちの少なくとも1つが、宿主細胞に対して異種である、請求項29〜78に記載の宿主細胞。

請求項80

前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニ由来であり、場合により前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼがC.ジェジュニのpglB遺伝子であり、場合により前記C.ジェジュニのpglB遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項29〜79のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項81

前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、真核生物又は古細菌生物に由来する、請求項29〜80のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項82

ドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項29〜81のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項83

前記キャリアタンパク質が、緑膿菌の無毒化された外毒素A(EPA)、CRM197、マルトース結合タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌ニューモリシン及びその無毒化変異体、C.ジェジュニAcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(別名LcrV、EspA、SseB)、PopB(YopB、YopD、FliC)、又はOprF、OprIである、請求項29〜82のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項84

宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活性化又は欠失されており、場合により宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活性化又は欠失されており、場合により宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置換されており、場合により宿主細胞のwaaL遺伝子がC.ジェジュニpglBによって置換されている、請求項29〜83のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項85

前記宿主細胞が大腸菌である、請求項29〜84のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項86

第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないオリゴ糖又は多糖を生成するグリコシルトランスフェラーゼを含む結果として、前記宿主細胞は、同じ表現型であるがドナーオリゴ糖又は多糖を含む宿主細胞よりも高い収量の、オリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成することができる、請求項29〜85のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項87

前記宿主細胞が、同じ表現型であるが、ドナーオリゴ糖又は多糖を含む宿主細胞より少なくとも若しくは約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、又は500%多いバイオコンジュゲートを生成し、ここで、前記バイオコンジュゲートは、オリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含む、請求項86に記載の宿主細胞。

請求項88

前記宿主細胞が、同じ表現型であるが、ドナーオリゴ糖又は多糖を含む宿主細胞より少なくとも若しくは約5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍又は100倍多いバイオコンジュゲートを生成し、ここで、前記バイオコンジュゲートは、オリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含む、請求項86に記載の宿主細胞。

請求項89

第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないオリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成する方法であって、(i)タンパク質の生成に適した条件下で、請求項29〜88のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)前記バイオコンジュゲートを単離することを含む、前記方法。

請求項90

請求項89に記載の方法によって生成される、請求項7〜18のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。

請求項91

請求項7〜18又は90のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物

請求項92

請求項19〜28のいずれか一項に記載の方法によって合成されたオリゴ糖又は多糖を含む医薬組成物

請求項93

対象における細菌感染治療又は予防に使用するための、請求項91又は92に記載の組成物。

請求項94

対象における細菌株に対する免疫応答誘導に使用するための、請求項91又は92に記載の組成物。

請求項95

請求項91又は92に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における細菌感染を治療又は予防する方法。

請求項96

請求項91又は92に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における細菌株に対する免疫応答を誘導する方法。

請求項97

前記対象がヒトである、請求項93又は94又は95又は96に記載の使用のための組成物又は方法。

技術分野

0001

1-導入
第一の反復単位還元末端ヘキソースを含まないハイブリッドオリゴ糖及び多糖を生成することができる宿主細胞が本明細書中に提供される。また、本明細書に記載の宿主細胞により生成され得るハイブリッドオリゴ糖及び多糖及びバイオコンジュゲートが本明細書中に提供され、該バイオコンジュゲートは、第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないハイブリッドオリゴ糖又は多糖に連結されたキャリアタンパク質を含む。

背景技術

0002

2-背景
グリコシル化は、それによって炭水化物分子又は糖(単糖二糖、オリゴ糖若しくは多糖)がタンパク質又はポリペプチド中の様々なアミノ酸残基の側鎖に連結されて、糖タンパク質を生成するプロセスである。

0003

N結合型タンパク質グリコシル化(N-グリコシル化)は、真核生物小胞体で生じる翻訳後修飾のうちの最も一般的なタイプであり、標的タンパク質ポリペプチド鎖中のアスパラギン残基への炭水化物分子の付加である。このプロセスは、小胞体中で保存された配列Asn-X-Ser/Thr(Xはプロリンを除くいずれかのアミノ酸)内での新生タンパク質のアスパラギン残基への、脂質キャリアドリコールリン酸)からの予め組み立てられたオリゴ糖の転移を担う、酵素的オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(oligosaccharyltransferase)複合体(OST)により遂行される。次に、糖鎖ゴルジ体での他の修飾に供される。天然には、N結合型グリコシル化は、真核生物及び古細菌で起こるが、細菌では非常に稀にしか起こらない。

0004

O結合型グリコシル化は、真核生物、古細菌及び細菌で起こるグリコシル化の一形態である。これは、タンパク質標的のアミノ酸残基中の酸素原子への糖分子の連結である。

0005

炭水化物分子又は糖に結合された(例えば、N-結合された)キャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成するための宿主細胞の使用は、当該技術分野において公知である。しかしながら、原核宿主細胞を用いたバイオコンジュゲートの生成の進歩にもかかわらず、宿主細胞におけるバイオコンジュゲート生成の改善された方法の必要性が依然として存在する。

発明が解決しようとする課題

0006

3-発明の概要
C.ジェジュニ(C. jejuni)由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(PglB)は、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖を含むグリカン(オリゴ糖又は多糖)に対して低い親和性を有することが当該技術分野において公知である(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 May 2;103(18):7088-93)。したがって、バイオコンジュゲートを生成するための宿主細胞系の使用は、典型的には、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖を含まないオリゴ糖又は多糖に結合されたキャリアタンパク質で構成されるバイオコンジュゲートの生成に限定されていた。しかしながら、多数の細菌性オリゴ糖/多糖抗原は、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖類(例えば、グルコース)を含むため、当該技術分野において公知である宿主細胞バイオコンジュゲート生成系は、このようなオリゴ糖/多糖抗原を含むバイオコンジュゲートの生成には不十分である。

課題を解決するための手段

0007

本出願の発明者は、宿主細胞がドナーオリゴ糖又は多糖に由来するハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができるようにする、宿主細胞を改変するための新規アプローチを特定した。ドナーオリゴ糖又は多糖は、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖類(例えば、グルコース)を含むオリゴ糖又は多糖であるが、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖は、第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないが、代わりにヘキソース単糖誘導体を含む。このようなヘキソース単糖誘導体は、PglBの適切な基質であり、したがって、適切な宿主細胞において、バックグラウンドは、例えば、細菌性疾患/感染症治療及び/又は細菌性疾患/感染症に対するワクチン接種に有用なバイオコンジュゲートを生じさせるように、キャリアタンパク質に結合され得る。重要なことに、本出願の発明者は、驚くべきことに、本明細書に記載されるハイブリッドオリゴ糖及び多糖の転位及び重合が、ポリメラーゼ(wzy)及びフリッパーゼ(wzx)酵素緩和された特異性に起因して、異種グリコシル化機構(例えば、フリッパーゼ、ポリメラーゼ)を含む宿主細胞において達成され得ることを発見した。一緒にすると、本明細書に記載された発見は、発明者の発見前に高収量で生成することができなかった高収量のバイオコンジュゲートを生成することができる、改変された宿主細胞の作製を可能にする。

0008

本発明は、以下に示された実施形態によって要約される。

0009

実施形態1:以下を含む原核宿主細胞:
a)オリゴ糖又は多糖反復単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、前記反復単位が還元末端にヘキソースを含まず、前記オリゴ糖又は多糖反復単位が還元末端にヘキソースを含むドナーオリゴ糖又は多糖反復単位に由来する核酸;
b)N-グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸;及び
c)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸。

0010

実施形態2:以下を含む原核宿主細胞:
a)オリゴ糖又は多糖反復単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、前記反復単位が還元末端にヘキソースを含まず、前記オリゴ糖又は多糖反復単位が還元末端にヘキソースを含むドナーオリゴ糖又は多糖反復単位に由来する核酸;
b)N-グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸;
c)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び、
d)ポリメラーゼ(wzy)をコードする核酸であって、ポリメラーゼがハイブリッドオリゴ糖又は多糖の生成を触媒し、ここで、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、(i)第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含み、(ii)他の全ての反復単位の還元末端にヘキソース単糖を含む核酸。

0011

実施形態3: 前記宿主細胞が、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、実施形態1又は2に記載の宿主細胞。

0012

実施形態4:ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、オペロン若しくは遺伝子クラスター又はその一部として宿主細胞に存在する、実施形態3に記載の宿主細胞。

0013

実施形態5:前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むことを除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖がドナーオリゴ糖又は多糖と同一である、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0014

実施形態6:前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖の単糖の全てを含むことに加えて、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖がドナーオリゴ糖又は多糖と同一である、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0015

実施形態7:前記宿主細胞が、(i)ヘキソース単糖誘導体をウンデカプレニルピロリン酸(UND-PP)上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼ、及び(ii)UND-PP上に集合したヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0016

実施形態8:前記ヘキソース単糖誘導体が、そのC-2位が、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、N-アセチルキノボサミン(QuiNAc)などのアセトアミド基で修飾される任意の単糖であり、ここで、前記ヘキソース単糖誘導体がN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)である、実施形態7に記載の宿主細胞。

0017

実施形態9:UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種である、及び/又はドナーオリゴ糖反復単位を触媒する遺伝子に対して異種である、実施形態7又は8に記載の宿主細胞。

0018

実施形態10:UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、エシェリキア(Escherichia)属の種、シゲラ(Shigella)属の種、クレブシエラ(Klebsiella)属の種、キサントモナス(Xhantomonas)属の種、サルモネラ(Salmonella)属の種、エルシニア(Yersinia)属の種、アエロモナス(Aeromonas)属の種、フランシセラ(Francisella)属の種、ヘリコバクター(Helicobacter)属の種、プロテウス(Proteus)属の種、ラクトコッカス(Lactococcus)属の種、ラクトバチルス(Lactobacillus)属の種、シュードモナス(Pseudomonas)属の種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属の種、ストレプトミセス(Streptomyces)属の種、ストレプトコッカス(Streptococcus)属の種、エンテロコッカス(Enterococcus)属の種、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属の種、バチルス(Bacillus)属の種、クロストリジウム(Clostridium)属の種、リステリア(Listeria)属の種、又はカンピロバクター(Campylobacter)属の種由来である、実施形態7〜9のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0019

実施形態11:UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼがwecAである、実施形態7〜10のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0020

実施形態12:前記wecAが大腸菌(E. coli)由来である、実施形態11に記載の宿主細胞。

0021

実施形態13:前記ヘキソース単糖がガラクトース(Gal)である、実施形態7〜12のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0022

実施形態14:ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、シゲラ・ボイディ(Shigella boyedii)由来のガラクトシルトランスフェラーゼ(wfeD)である、実施形態7〜13のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0023

実施形態15:ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(WbeY)である、実施形態7〜13のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0024

実施形態16:ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(WfdK)である、実施形態7〜13のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0025

実施形態17:ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(WbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(WfdK)である、実施形態7〜13のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0026

実施形態18:ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、肺炎球菌CP14由来のWchL(N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ)及びWchM(ガラクトシルトランスフェラーゼ)を含む、実施形態3、4、又は6〜17のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0027

実施形態19:前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、肺炎球菌CP14の第一の反復単位の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が肺炎球菌CP14と同一である、実施形態18に記載の宿主細胞。

0028

実施形態20:ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、肺炎球菌CP33F由来のWciB、WciC、WciD、WciE、及びwciFを含む、実施形態3、4、又は6〜17のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0029

実施形態21:前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、肺炎球菌CP33Fの第一の反復単位の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が肺炎球菌CP33Fと同一である、実施形態20に記載の宿主細胞。

0030

実施形態22:前記宿主細胞が、(i)ヘキソース単糖誘導体をウンデカプレニルピロリン酸(UND-PP)上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼ、及び(ii)ドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位をヘキソース単糖誘導体上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼを含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0031

実施形態23:前記ヘキソース単糖誘導体がN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)であり;あるいは、前記ヘキソース単糖誘導体が、そのC-2位が、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、N-アセチルキノボサミン(QuiNAc)などのアセトアミド基で修飾される任意の単糖である、実施形態22に記載の宿主細胞。

0032

実施形態24:UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種である、実施形態22又は23に記載の宿主細胞。

0033

実施形態25:UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、実施形態22〜24のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0034

実施形態26:UND-PP上にヘキソース単糖誘導体を集合させる前記グリコシルトランスフェラーゼが、wecAである、実施形態22〜25のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0035

実施形態27:前記wecAが大腸菌由来である、実施形態26に記載の宿主細胞。

0036

実施形態28:ヘキソース単糖誘導体上にドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を集合させるグリコシルトランスフェラーゼが、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をウンデカプリニルリン酸に結合されたヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む、実施形態22〜27のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0037

実施形態29:ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在する前記ヘキソース単糖をウンデカプリニルリン酸に結合された単糖に付加することができる前記グリコシルトランスフェラーゼが、WciQ、WfaM、WfaP、WeiL、WelO、WffJ、WfgD、WbdN、WcmMなどのガラクトシルトランスフェラーゼである、実施形態28に記載の宿主細胞。

0038

実施形態30:前記グルコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O21由来のWciQ、大腸菌O24由来のWfaM、大腸菌O56由来のWfaP、大腸菌O61由来のWeiL、大腸菌O102由来のWelO、大腸菌O130由来のWffJ、大腸菌O152由来のWfgD、大腸菌O157由来のWbdN、及び大腸菌O173由来のWcmMである、実施形態29に記載の宿主細胞。

0039

実施形態31:ヘキソース単糖誘導体上にドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を集合させるグリコシルトランスフェラーゼが、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む、実施形態28〜30のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0040

実施形態32:ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に付加することができる前記グリコシルトランスフェラーゼが、グルコシルトランスフェラーゼ(例えば、WciP又はwciQ)である、実施形態31に記載の宿主細胞。

0041

実施形態33:グルコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O21由来のwciQ又は大腸菌O21由来のガラクトシルトランスフェラーゼWciQである、実施形態32に記載の宿主細胞。

0042

実施形態34:前記宿主細胞が、単糖を修飾することができる酵素をさらに含む、実施形態32又は33に記載の宿主細胞。

0043

実施形態35:酵素がエピメラーゼ又はラセマーゼである、実施形態34に記載の宿主細胞。

0044

実施形態36:前記エピメラーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、実施形態35に記載の宿主細胞。

0045

実施形態37:前記エピメラーゼが大腸菌由来である、実施形態36に記載の宿主細胞。

0046

実施形態38:前記エピメラーゼが、大腸菌O157由来のZ3206である、実施形態37に記載の宿主細胞。

0047

実施形態39:ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、肺炎球菌CP14由来のwchL及びwchMを含む、実施形態22〜38のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0048

実施形態40:前記宿主細胞がハイブリッドオリゴ糖又は多糖を生成することができ、ここで、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、肺炎球菌CP14の単糖残基の全てを含むことに加えて、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が肺炎球菌CP14と同一である、実施形態39に記載の宿主細胞。

0049

実施形態41:前記非ヘキソース単糖又は前記ヘキソース単糖誘導体が、2位にアセトアミド基を含む単糖である、実施形態1〜40のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0050

実施形態42:前記非ヘキソース単糖又は前記ヘキソース単糖誘導体が、GlcNAc、HexNAc、デオキシHexNAc、FucNAc、GalNAc、QuiNAc、ManNAc、又は2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソースである、実施形態41に記載の宿主細胞。

0051

実施形態43:前記宿主細胞が、莢膜多糖ポリメラーゼ(wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(wzy)をコードする核酸を含む、実施形態1〜42のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0052

実施形態44:前記ポリメラーゼが、宿主細胞に対して異種である、及び/又は前記ポリメラーゼが、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を合成するための酵素をコードする遺伝子クラスターに対して異種である、実施形態43に記載の宿主細胞。

0053

実施形態45:前記ポリメラーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、実施形態43又は44に記載の宿主細胞。

0054

実施形態46:前記ポリメラーゼが肺炎球菌由来である、実施形態45に記載の宿主細胞。

0055

実施形態47:前記ポリメラーゼが肺炎球菌由来CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A及びB)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14 CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、又はCP48である、実施形態46に記載の宿主細胞。

0056

実施形態48:前記宿主細胞が、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含む、実施形態1〜47のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0057

実施形態49:前記フリッパーゼが宿主細胞に対して異種である、及び/又は前記フリッパーゼが、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を合成するための酵素をコードする遺伝子クラスターに対して異種である、実施形態48に記載の宿主細胞。

0058

実施形態50:前記フリッパーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、実施形態48又は49に記載の宿主細胞。

0059

実施形態51:前記フリッパーゼが肺炎球菌由来である、実施形態50に記載の宿主細胞。

0060

実施形態52:前記フリッパーゼが肺炎球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A及びB)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14 CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、又はCP48由来である、実施形態51に記載の宿主細胞。

0061

実施形態53:前記オリゴ糖又は多糖が、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、実施形態1〜52のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0062

実施形態54:前記多糖が莢膜多糖(CP)である、実施形態1〜53のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0063

実施形態55:前記莢膜多糖が肺炎球菌由来である、実施形態54に記載の宿主細胞。

0064

実施形態56:前記肺炎球菌莢膜多糖が、CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)、又はCP48である、実施形態45に記載の宿主細胞。

0065

実施形態57:前記肺炎球菌莢膜多糖が、CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B、又はCP38である、実施形態56に記載の宿主細胞。

0066

実施形態58:前記肺炎球菌莢膜多糖がCP14である、実施形態56に記載の宿主細胞。

0067

実施形態59:前記肺炎球菌莢膜多糖がCP33Fである、実施形態56に記載の宿主細胞。

0068

実施形態60:前記莢膜多糖が黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来である、実施形態54に記載の宿主細胞。

0069

実施形態61:前記黄色ブドウ球菌莢膜多糖がCP5又はCP8である、実施形態60に記載の宿主細胞。

0070

実施形態62:前記莢膜多糖が、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)(GBS)由来である、実施形態54に記載の宿主細胞。

0071

実施形態63:前記ストレプトコッカス・アガラクティエ莢膜多糖が、S.アガラクティエ(B群、GBS)CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII、又はCPVIIIである、実施形態62に記載の宿主細胞。

0072

実施形態64:前記莢膜多糖が、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)由来である、実施形態54に記載の宿主細胞。

0073

実施形態65:前記エンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖が、CPA、CPB、CPC、又はCPDである、実施形態64に記載の宿主細胞。

0074

実施形態66:第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないオリゴ糖又は多糖を生成する前記グリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つが、宿主細胞に対して異種である、実施形態1〜65のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0075

実施形態67:前記キャリアタンパク質が、宿主細胞に対して異種である、実施形態1〜66のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0076

実施形態68:前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種である、実施形態1〜67のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0077

実施形態69:第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないオリゴ糖又は多糖を生成する前記グリコシルトランスフェラーゼ、前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、及び前記キャリアタンパク質のうちの少なくとも1つが、宿主細胞に対して異種である、実施形態1〜65のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0078

実施形態70:前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニ由来である、実施形態1〜69のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0079

実施形態71:前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼがC.ジェジュニのpglB遺伝子である、実施形態70に記載の宿主細胞。

0080

実施形態72:前記C.ジェジュニのpglB遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれる、実施形態71に記載の宿主細胞。

0081

実施形態73:前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、真核生物又は古細菌生物に由来する、実施形態1〜72のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0082

実施形態74:ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞のゲノムに組み込まれる、実施形態3〜73のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0083

実施形態75:前記キャリアタンパク質が、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の無毒化された外毒素A(EPA)、CRM197、マルトース結合タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌ポリヒスチジントリアッドタンパク質D(PhtD)、肺炎球菌ニューモリシン及びその無毒化変異体(dPly)、C.ジェジュニAcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(別名LcrV、EspA、SseB)、PopB(YopB、YopD、FliC)、又はOprF、OprIである、実施形態1〜74のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0084

実施形態76:宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活性化又は欠失されている、実施形態1〜75のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0085

実施形態77:宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活性化又は欠失されている、実施形態76に記載の宿主細胞。

0086

実施形態78:宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置換されている、実施形態77に記載の宿主細胞。

0087

実施形態79:宿主細胞のwaaL遺伝子がC.ジェジュニpglBによって置換されている、実施形態78に記載の宿主細胞。

0088

実施形態80:前記宿主細胞が大腸菌である、実施形態1〜79のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0089

実施形態81:第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないオリゴ糖又は多糖を生成するグリコシルトランスフェラーゼを含む結果として、前記宿主細胞は、同じ表現型であるがドナーオリゴ糖又は多糖を含む宿主細胞より高い収量の、オリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成することができる、実施形態1〜80のいずれか1つに記載の宿主細胞。

0090

実施形態82:前記宿主細胞が、同じ表現型であるが、ドナーオリゴ糖又は多糖を含む宿主細胞より少なくとも若しくは約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、又は500%多いバイオコンジュゲートを生成し、ここで、前記バイオコンジュゲートは、オリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含む、実施形態81に記載の宿主細胞。

0091

実施形態83:前記宿主細胞が、同じ表現型であるが、ドナーオリゴ糖又は多糖を含む宿主細胞より少なくとも若しくは約5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍又は100倍多いバイオコンジュゲートを生成し、ここで、前記バイオコンジュゲートは、オリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含む、実施形態81に記載の宿主細胞。

0092

実施形態84:第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないオリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成する方法であって、(i)タンパク質の生成に適した条件下で、実施形態1〜83のいずれか1つに記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)前記バイオコンジュゲートを単離することを含む、前記方法。

0093

実施形態85:実施形態84に記載の方法によって生成されるバイオコンジュゲート。

0094

実施形態86:莢膜多糖(CP)に結合されたキャリアタンパク質を含む、実施形態85のバイオコンジュゲート。

0095

実施形態87:前記莢膜多糖が肺炎球菌由来である、実施形態86に記載のバイオコンジュゲート。

0096

実施形態88:前記肺炎球菌莢膜多糖が、CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)、又はCP48である、実施形態87に記載のバイオコンジュゲート。

0097

実施形態89:前記肺炎球菌莢膜多糖が、CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B、又はCP38である、実施形態88に記載のバイオコンジュゲート。

0098

実施形態90:前記肺炎球菌莢膜多糖がCP14である、実施形態88に記載のバイオコンジュゲート。

0099

実施形態91:前記肺炎球菌莢膜多糖がCP33Fである、実施形態88に記載のバイオコンジュゲート。

0100

実施形態92:前記莢膜多糖が、黄色ブドウ球菌由来である、実施形態86に記載のバイオコンジュゲート。

0101

実施形態93:前記黄色ブドウ球菌莢膜多糖がCP5又はCP8である、実施形態92に記載のバイオコンジュゲート。

0102

実施形態94:前記莢膜多糖がストレプトコッカス・アガラクティエ(GBS)由来である、実施形態86に記載のバイオコンジュゲート。

0103

実施形態95:前記ストレプトコッカス・アガラクティエ莢膜多糖が、S.アガラクティエ(B群、GBS)CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII、又はCPVIIIである、実施形態94に記載のバイオコンジュゲート。

0104

実施形態96:前記莢膜多糖がエンテロコッカス・フェカリス由来である、実施形態86に記載のバイオコンジュゲート。

0105

実施形態97:前記エンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖が、CPA、CPB、CPC、又はCPDである、実施形態96に記載のバイオコンジュゲート。

0106

実施形態98:実施形態85〜97のいずれか1つに記載のバイオコンジュゲートを含む組成物

0107

実施形態99:実施形態98に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における細菌感染症を治療又は予防する方法。

0108

実施形態100:実施形態98に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における細菌株に対する免疫応答誘導する方法。

0109

実施形態101:対象がヒトである、実施形態99又は100に記載の方法。

0110

実施形態102:構造
(B)n-A→
[式中、
Aは、還元末端(矢印で示される)にヘキソース単糖誘導体を有するオリゴ糖反復単位であり;
Bは、オリゴ糖反復単位であり;
A及びBは異なるオリゴ糖反復単位であり;
nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は少なくとも20である]
のオリゴ糖又は多糖を合成する方法であって、該方法は、A及びBを多糖ポリメラーゼとともにインキュベートすることを含む、前記方法。

0111

実施形態103:前記接触工程がインビトロで行われる、実施形態102に記載の方法。

0112

実施形態104:前記接触工程が、原核細胞において行われる、実施形態102に記載の方法。

0113

実施形態105:前記接触工程が、原核細胞のペリプラズムにおいて行われる、実施形態102に記載の方法。

0114

実施形態106:前記多糖ポリメラーゼがwzy多糖ポリメラーゼである、実施形態102に記載の方法。

0115

実施形態107:Aが還元末端(矢印で示される)にヘキソース単糖誘導体を有し、Bが還元末端にヘキソースを有し、A及びBがその他の点で同一である、実施形態102に記載の方法。

0116

実施形態108:前記非ヘキソース単糖又は前記ヘキソース単糖誘導体が、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、QuiNAc、ManNAc、HexNAc、デオキシHexNAc、又は2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソースである、実施形態102〜107のいずれか1つに記載の方法。

0117

実施形態109:AがBと同じ構造を有し、Aが還元末端に追加の単糖を有するという1つの相違がある、実施形態102に記載の方法。

0118

実施形態110:追加の単糖がヘキソース単糖誘導体である、実施形態109に記載の方法。

0119

実施形態111:追加の単糖が、GlcNAc、HexNAc、デオキシHexNAc、又は2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソースである、実施形態109〜110のいずれか1つに記載の方法。

0120

実施形態112:前記ポリメラーゼが、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である、実施形態102〜111のいずれか1つに記載の方法。

0121

実施形態113:前記ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位が、肺炎球菌莢膜多糖CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)、又はCP48の反復単位である、実施形態102〜111のいずれか1つに記載の方法。

0122

実施形態114:実施形態102〜111のいずれか1つに記載の方法によって合成されたオリゴ糖又は多糖を含む医薬組成物

0123

実施形態115:ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖の単糖の全てを含むことに加えて、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖と同一である、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲート。

0124

実施形態116:ヘキソース単糖誘導体が、そのC-2位が、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)などのアセトアミド基で修飾される任意の単糖である、実施形態115に記載のバイオコンジュゲート。

0125

実施形態117:ヘキソース単糖誘導体がN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)である、実施形態116に記載のバイオコンジュゲート。

0126

実施形態118:ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、グラム陽性細菌莢膜糖の第一の反復の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、前記グラム陽性細菌莢膜糖と同一である、実施形態115又は116又は117に記載のバイオコンジュゲート。

0127

実施形態119:グラム陽性細菌莢膜糖が、A群連鎖球菌莢膜糖、B群連鎖球菌莢膜糖、肺炎球菌莢膜糖、腸球菌莢膜糖又は黄色ブドウ球菌莢膜糖である、実施形態118に記載のバイオコンジュゲート。

0128

実施形態120:グラム陽性細菌莢膜糖が、肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F又は48莢膜糖である、実施形態119に記載のバイオコンジュゲート。

0129

実施形態121:グラム陽性細菌莢膜糖が、肺炎球菌血清型8、14、15A、16F、22F、23A、24F、31、33F、35B又は38莢膜糖である、実施形態120に記載のバイオコンジュゲート。

0130

実施形態122:グラム陽性細菌莢膜糖が、黄色ブドウ球菌血清型5又は8莢膜糖である、実施形態118に記載のバイオコンジュゲート。

0131

実施形態123:グラム陽性細菌莢膜糖が、ストレプトコッカス・アガラクティエ(B群連鎖球菌)血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII又はVIII莢膜糖である、実施形態118に記載のバイオコンジュゲート。

0132

実施形態124:グラム陽性細菌莢膜糖が、エンテロコッカス・フェカリス血清型A、B、C又はD莢膜糖である、実施形態118に記載のバイオコンジュゲート。

0133

実施形態125:キャリアタンパク質が、緑膿菌の無毒化された外毒素A(EPA)、CRM197、マルトース結合タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌ニューモリシン及びその無毒化変異体、C.ジェジュニAcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(別名LcrV、EspA、SseB)、PopB(YopB、YopD、FliC)、又はOprF、OprIである、実施形態115〜124のいずれか1つに記載のバイオコンジュゲート。

0134

実施形態126:構造
(B)n-A→
[式中、
Aは、還元末端(矢印で示される)にヘキソース単糖誘導体を有する、少なくとも2、3、4、5、6、7又は8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり;
Bは、少なくとも2、3、4、5、6、7又は8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり;
A及びBは異なるオリゴ糖反復単位であり;
nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は少なくとも20である]
を有するハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

0135

実施形態127:Bオリゴ糖反復が、反復の還元末端にヘキソース単糖を含む、実施形態126に記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

0136

実施形態128:反復の還元末端でのヘキソース単糖が、グルコース、ガラクトース、ラムノースアラビノトールフコース及びマンノースからなる群から選択される、実施形態127に記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

0137

実施形態129:Aのオリゴ糖反復単位及びBのオリゴ糖反復単位が、反復の還元末端に異なる単糖を含むことでのみ相違する、実施形態126〜128のいずれか1つに記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

0138

実施形態130:Aのオリゴ糖反復単位が、グラム陽性細菌莢膜糖、例えば、A群連鎖球菌莢膜糖、B群連鎖球菌莢膜糖、肺炎球菌莢膜糖、腸球菌莢膜糖又は黄色ブドウ球菌莢膜糖の莢膜糖の反復単位である、実施形態126〜129のいずれか1つに記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

0139

実施形態131:Aのオリゴ糖反復単位が、肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F又は48の莢膜糖の反復単位であり;又はAのオリゴ糖反復単位が、肺炎球菌血清型2、3、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F又は48の莢膜糖の反復単位である、実施形態126〜130のいずれか1つの記載のハイブリッドオリゴ糖又は多糖。

0140

実施形態132:実施形態126〜131のいずれか1つのハイブリッドオリゴ糖又は多糖に結合されたキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲート。

0141

3.1 用語
OPS:O多糖;グラム陰性細菌のO抗原。OPSはまた、本明細書中でO抗原とも称される。
CP:莢膜多糖。
LPSリポ多糖
waaL:ペリプラズムに位置する活性部位を有する膜結合型酵素をコードするO抗原リガーゼ遺伝子。コードされる酵素は、ウンデカプレニルリン酸(undecaprenylphosphate;UPP)結合型O抗原をリピドAコアへと転移させ、リポ多糖を形成させる。
RU:反復単位。本明細書中で用いる場合、RUは、生物学的反復単位(BRU)と一致する。BRUとは、in vivoで合成される場合のO抗原のRUを表わす。
Und-PP:ウンデカプレニルピロリン酸(undecaprenyl pyrophosphate)。
LLO:脂質連結型オリゴ糖。

0142

本明細書で使用するとき、「バイオコンジュゲート」との用語は、宿主細胞バックグラウンド中で調製されるタンパク質(例えば、キャリアタンパク質)と抗原(例えば、オリゴ糖又は多糖)との間のコンジュゲートを意味し、このとき、宿主細胞の機構が抗原をタンパク質に結合(例えば、N結合)させる。

0143

「約」との用語は、数字と共に用いられる場合、参照された数字の±1%、±5%又は±10%以内のいずれかの数を意味する。

0144

本明細書で使用するとき、対象への療法(例えば、本明細書中に記載される組成物)の投与との関連での「有効量」との用語は、予防的効果及び/又は治療的効果を有する療法の量を意味する。特定の実施形態では、「有効量」とは、以下の効果のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれ以上を達成するのに十分な療法の量を意味する:(i)細菌感染又はそれに伴う症状の重症度を低減又は改善する;(ii) 細菌感染又はそれに伴う症状の持続期間を減少させる;(iii) 細菌感染又はそれに伴う症状の進行を防止する;(iv) 細菌感染又はそれに伴う症状の退行を生じさせる;(v) 細菌感染又はそれに伴う症状の発症又は開始を防止する;(vi) 細菌感染又はそれに伴う症状の再発を防止する;(vii) 細菌感染に伴う臓器不全を減少させる;(viii) 細菌感染を有する対象の入院を減少させる;(ix) 細菌感染を有する対象の入院期間を減少させる;(x) 細菌感染を有する対象の生存率を増加させる;(xi) 対象での細菌感染を排除する;(xii) 対象での細菌増殖阻害するか又は減少させる;かつ/又は(xiii) 別の療法の予防的効果若しくは治療的効果を強化又は改善する。

0145

本明細書で使用するとき、対象への2種以上の療法の投与との関連で、「組み合わせて(併用)」との用語は、2種以上の療法の使用を意味する。「組み合わせて(併用)」との用語の使用は、療法が対象に投与される順序を制限するものではない。例えば、第1の療法(例えば、本明細書中に記載される組成物)を、対象への第2の療法の投与の前に(例えば、5分間、15分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間前)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分間、15分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間後)に投与することができる。

0146

本明細書で使用するとき、「対象」との用語は、動物(例えば、鳥類爬虫類、及び哺乳動物)を意味する。別の実施形態では、対象は、非霊長類(例えば、ラクダロバシマウマウシブタウマヤギヒツジネコイヌラット、及びマウス)及び霊長類(例えば、サルチンパンジー、及びヒト)をはじめとする哺乳動物である。特定の実施形態では、対象は非ヒト動物である。一部の実施形態では、対象は家畜又はペット(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ロバ、又はニワトリ)である。具体的な実施形態では、対象はヒトである。「対象」、「個体」及び「患者」との用語は、相互に交換可能に本明細書中で用いることができる。

0147

本明細書で使用するとき、用語「ドナーオリゴ糖又は多糖類」とは、オリゴ糖又は多糖類が由来するオリゴ糖又は多糖類を意味する。ドナーオリゴ糖及び多糖は、本明細書で使用するとき、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖(例えば、グルコース)を含む。ドナーオリゴ糖又は多糖という用語の使用は、オリゴ糖又は多糖がインサイチュで修飾されることを示唆することを意味するものではない。むしろ、ドナーオリゴ糖又は多糖という用語の使用は、その野生型状態において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、PglB)活性の弱い基質である又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、PglB)活性の基質ではない、オリゴ糖又は多糖を示すことを意味する。例示的なドナーオリゴ糖又は多糖には、細菌由来のものが含まれ、例えば、肺炎球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)、及びCP48が挙げられる。当業者は、オリゴ糖又は多糖が、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖(例えば、グルコース)を含むかどうかを容易に決定することができ、したがって、このようなオリゴ糖又は多糖が、本明細書に包含されるドナーオリゴ糖又は多糖であるかどうかを容易に決定することができる。

0148

本明細書で使用するとき、用語「ヘキソース単糖誘導体」とは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性の基質となり得る非ヘキソース単糖を意味する。一般に、ヘキソース単糖誘導体は、2位にアセトアミド基を含む単糖を含む。例示的なヘキソース単糖誘導体には、GlcNAc、HexNAc、デオキシHexNAc、又は2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソースが含まれる。

0149

本明細書で使用するとき、用語「ハイブリッドオリゴ糖又は多糖」とは、第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないが、むしろ第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体又は非ヘキソース単糖を含む、遺伝子操作されたオリゴ糖又は多糖を意味する。
4-図面の簡単な説明

図面の簡単な説明

0150

肺炎球菌莢膜多糖(CP)14及びCP33Fの反復単位の構造を示す図である。
肺炎球菌CP14の野生型クラスターの遺伝子構成及び各々の遺伝子の推定機能の概略図を示す。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼによってタンパク質キャリアに効率的に転移され得る、修飾された肺炎球菌CP14ポリマーを生成するための合成グリコシル化経路を示す図である。A:肺炎球菌CP14の野生型生合成経路。B:野生型サブユニットと比較して、還元末端単糖で相違するCP14の遺伝子操作されたサブユニットの生合成。C:野生型CP14多糖の重合及び単一の遺伝子操作されたサブユニット上の野生型多糖の集合。
肺炎球菌CP14の遺伝子操作されたサブユニットの生成及び転位に適した成分、並びに生成及び転位を確認するデータを示す図である。A:糖鎖工学的に操作されたCP14サブユニットの合成に必須のグリコシルトランスフェラーゼの模式図:シゲラ・ボイディのガラクトシルトランスフェラーゼ(wfeD)、肺炎球菌CP14のGlcNAcトランスフェラーゼ(wchL)、及び肺炎球菌CP14のガラクトシルトランスフェラーゼ(wchM)。B:(A)と同じであるが、肺炎球菌CP14のフリッパーゼ遺伝子(wzx)の付加を伴うCP14の糖鎖工学的に操作されたサブユニットを合成することができるグリコシルトランスフェラーゼの模式図。C:(A)の遺伝子を含むプラスミド(「pGVX1190」)(レーン1)又は(B)の遺伝子を含むプラスミド(「pGVX1366」)(レーン2)で形質転換された大腸菌Sф874のプロテイナーゼK消化後のリポオリゴ糖銀染色。銀染色の前に試料を4〜12%SDS-PAGEゲルで分離した。示された結果は、肺炎球菌莢膜多糖類のフリッパーゼが、緩和されたグリカン特異性を有し、遺伝子操作されたサブユニットを細胞質からペリプラズムに転位させることができることを示す。D:遺伝子操作されたCP14サブユニットの構造。矢印は、対応するグリコシルトランスフェラーゼを示す。
大腸菌において生成された、遺伝子操作されたCP14サブユニットの分析を示す図である。脂質結合オリゴ糖(LLO)を抽出し、2ABで標識し、蛍光検出器が一体となったHPLCに供した。A:プラスミドpGVX1366又はその対応する空ベクター(空ベクターのピークが示される)で形質転換された大腸菌Sф874(ΔwaaL)から抽出されたCP14遺伝子操作されたサブユニットであるLLOのHPLCクロマトグラム。矢印(57.6分で)は、質量分析に供されたCP14遺伝子操作されたサブユニットに対応するピークを示す。
B:57.5分のピークのMS/MS分析イオンフラグメントは、遺伝子操作されたCP14サブユニットの予想される構造と一致した。
遺伝子操作されたCP14サブユニットがC.ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBの基質であることを示す。PglBを発現するためのプラスミド(pGVX970) 及びAcrAを発現するためのプラスミド(pGVX1;キャリアタンパク質) 及びCP14を生成するためのプラスミド(pGVX1366)又は空ベクター(pGVX8)で形質転換された大腸菌Sф874(ΔwaaL)から抽出されたタンパク質についてウェスタンブロット分析を行った。誘導後、細胞回収し、タンパク質をペリプラズムから抽出し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)により濃縮し、イミダゾールを含むTris緩衝液溶出した。A:精製された試料をSDS-PAGE(4〜12%ゲル)に供し、抗Hisによって発色させたニトロセルロース膜上でエレクトロブロットした。レーン1、非グリコシル化AcrA;レーン2、単一のCP14遺伝子操作されたサブユニットを有するグリコシル化AcrA。
B:インタクトな非グリコシル化AcrA(i) 及びグリコシル化AcrA(ii)の質量分析スキャン。39957.74Daの質量は非グリコシル化AcrAと一致し、39227.27Daは1つの遺伝子操作されたCP14サブユニットを有するグリコシル化AcrAに対応する。
B:インタクトな非グリコシル化AcrA(i) 及びグリコシル化AcrA(ii)の質量分析スキャン。39957.74Daの質量は非グリコシル化AcrAと一致し、39227.27Daは1つの遺伝子操作されたCP14サブユニットを有するグリコシル化AcrAに対応する。
遺伝子操作されたCP14サブユニット(pGVX1433)を生成するために合成された合成遺伝子クラスターの概略図を示す。矢印は、プラスミドpGVX81において遺伝子操作されたCP14サブユニットを生成するために一緒に集合させた遺伝子を示す。灰色の矢印は、β(1,4)結合を介して、UDP-GalからのGalをGlcNAc-P-P-ウンデカプレニルに集合させるガラクトーストランスフェラーゼを発現するシゲラ・ボイディ由来のwfeD遺伝子を示す(J Bacteriol. 2011; 193(2):449-59)。黒色の矢印は、プライミングGlcトランスフェラーゼwchAを除いて、CP14クラスターを生成するために必要な全ての肺炎球菌遺伝子を示す(代わりに、内因性大腸菌wecAは、ウンデカプレノールピロリン酸にGlcNAcを集合させるプライミングトランスフェラーゼとして作用し、したがってプラスミドの一部ではない)。
大腸菌宿主細胞における野生型及び異種の経路の組み合わせによるハイブリッド肺炎球菌CP14の生成を示す。CP14野生型クラスターは、CP14遺伝子操作プラスミド(pGVX1433)又は空ベクター(pGVX81)で形質転換された大腸菌W3110ΔwaaLのコラン酸に組み込まれた。A:CP14の糖鎖工学的に操作されたプラスミド(レーン1)又は空プラスミド(レーン2)で形質転換された全細胞大腸菌W3110コラン酸::CP14ΔwaaLのプロテイナーゼK消化されたもののウェスタンブロット分析。試料(LLO)を4〜12%SDSゲルで分離し、膜上でブロットした。血清型決定抗CP14抗体は、CP14を発色させるための一次抗体として使用した。
B:CP14糖鎖工学的に操作されたプラスミド(実線)又は空プラスミド(点線)で形質転換された大腸菌W3110(コラン酸::CP14)から抽出され、2ABによって標識されたLLO。指示されたピーク(矢印による)を回収し、MS分析に供した。糖鎖工学的に操作されたCP14ポリマーにおいて、全ての試料に見出される遺伝子操作されたサブユニットは第一のサブユニットだけであり、遺伝子操作されていないサブユニットはポリマーとして又はポリマーの途中で同定された。
PglBが、野生型CP14ポリマーではなく、遺伝子操作されたCP14ポリマーをタンパク質キャリアに転移することができることを示す図である。大腸菌W3110コラン酸::CP14ΔwaaLΔwecA-wzzE及び大腸菌W3110コラン酸:CP14ΔwaaLは、RcsA(CP14合成のアクチベーター)を含むプラスミド、pGVX970(PglBを発現する)、pGVX1(AcrAタンパク質キャリアを発現する)で形質転換された;誘導後に細胞を回収した。ウェスタンブロット分析は、SDS-PAGE(4〜12%ゲル)で分離し、ニトロセルロース膜上でエレクトロブロットし、CP14抗体とともにインキュベートした全細胞プロテイナーゼK消化され及びIMAC濃縮されたペリプラズム抽出物について行われた。A:形質転換された大腸菌W3110コラン酸:CP14ΔwaaL(レーン1)及び大腸菌W3110コラン酸::CP14ΔwaaLΔwecA-wzzE(レーン2)のプロテイナーゼK消化された試料のウェスタンブロット。B:形質転換された大腸菌W3110コラン酸:CP14ΔwaaL(レーン1)及び大腸菌W3110コラン酸::CP14ΔwaaLΔwecA-wzzE(レーン2)のIMAC濃縮された試料のウェスタンブロット分析。パネルAにおいて、全ての菌株がLLOを生成し、抗CP14抗体によって認識された。しかしながら、パネルBにおいて、糖タンパク質(CP14-AcrA)だけは大腸菌W3110コラン酸::CP14、waaL株において検出され、wecA(GlcNAcをUndPに付加するプライミングトランスフェラーゼをコードする)の欠如のために、CP14遺伝子操作サブユニットを生成することができず、したがって、野生型CP14構造(第一の反復単位の還元末端にヘキソースの存在に起因して、PglBの基質ではない)だけを生成する大腸菌W3110コラン酸::CP14、ΔwaaL、ΔwecA-wzzEにおいて検出されなかった。
遺伝子操作されたCP14ポリマーがPglBによって、様々なキャリアタンパク質に転移され得ることを示す図である。大腸菌W3110コラン酸::CP14、ΔwaaLは、CP14遺伝子操作プラスミド(pGVX1433)及びRcsAを発現させるためのプラスミド(pGVX970、PglBを発現する)及びpGVX538(キャリアタンパク質EPAを発現する)で形質転換された。全ての試料を誘導後に回収し、タンパク質をペリプラズムから抽出し、IMACにより濃縮した。濃縮されたタンパク質試料をSDS-PAGE(4〜12%ゲル)により分離し、ニトロセルロース膜上でエレクトロブロットし、一次抗体として抗His抗体(A)又はCP14抗体(B)とともにインキュベートした。
遺伝子操作されたCP14ポリマーでグリコシル化されたEPAの生成及び精製を示す図である。大腸菌W3110コラン酸::CP14ΔwaaLは、CP14遺伝子操作されたプラスミド(pGVX1433)及びPglBを発現させるためのプラスミド(pGVX970)及びEPA(pGVX538)及びRcsA(CP14合成を活性化するため)で形質転換された。形質転換された菌株を発酵に使用し、バイオマスを回収した。ペリプラズムタンパク質を抽出し、IMAC及びレクチンアフィニティークロマトグラフィー(トウゴマ(Ricinus communis)凝集素-アガロース)に供して、CP14-EPAコンジュゲートを均質に精製した。精製した試料をSDS-PAGEに供し、ニトロセルロース上でエレクトロブロットした。ウェスタンブロット分析は、抗His(b)又は抗CP14血清型決定抗体(B)を用いて行った。C:精製されたCP14-EPAバイオコンジュゲートのクーマシー染色されたゲル。
肺炎球菌CP33F野生型クラスターの遺伝子構成及び各々の遺伝子の推定機能の概略図を示す。クラスターの一部(調節遺伝子を除く遺伝子)を大腸菌W3110のコラン酸クラスターに置換することによって大腸菌W3110に組み込んだ。
肺炎球菌CP33Fカプセルを発現する大腸菌株の発色を示す。A:CP33Fによって置換された大腸菌W3110コラン酸。CP33Fタイピング抗体を用いたプロテイナーゼK消化された全細胞抽出物のウェスタンブロット分析であり、全てのクローンはCP33Fを発現する。B:大腸菌株のリポ多糖リガーゼ(waaL)をpglBで置換して、大腸菌W3310CA::CP33F waaL::pglBを作製した。形質転換された菌株を発酵に使用し、バイオマスを回収した。プロテイナーゼK消化された全細胞抽出物のウェスタンブロット分析は、CP33Fタイピング抗体を用いて行われた。2つの異なるクローン(A、B)を試験した。
遺伝子操作されたCP33Fサブユニット(プラスミドpGVX2342に組み込まれている)の生成のために合成された合成遺伝子クラスターの概略図を示す。A:矢印は、プラスミドpGVX81における遺伝子操作されたCP33Fサブユニットを生成させるために集合された遺伝子を示す。灰色の矢印は、GlcNAc-P-P-ウンデカプレニル及びgalE(UPD-ガラクトースエピメラーゼ)及びglf(UDP-ガラクトピラノースムターゼ)にUDP-GalfからのGalfを付加するGalf-トランスフェラーゼ(wfdK及びwbeY)を発現する様々な大腸菌株由来の遺伝子を表す。黒色の矢印は、プライミングGlcトランスフェラーゼwchAを除いて、CP33Fクラスターを生成するために必要な肺炎球菌遺伝子を示す(代わりに、内因性大腸菌wecAは、ウンデカプレニルピロリン酸でGlcNAcを集合させるプライミングトランスフェラーゼとして作用し、したがってプラスミドの一部ではない)。B:CP33Fの遺伝子操作されたサブユニットの構造、矢印は、様々な細菌からの対応するグリコシルトランスフェラーゼを示す。
肺炎球菌CP33Fの遺伝子操作されたサブユニットの生成及び転位を示す図である。A:CP33Fwzxフリッパーゼを含まないプラスミドpGVX2098(レーン1)又はCP33Fwzxフリッパーゼを含むpGVX2342(レーン2)で形質転換された大腸菌W3110のプロテイナーゼK消化後のリポ-オリゴ糖の銀染色。銀染色又はウェスタンブロットの前に、試料を4〜12%のSDS-PAGEゲルで分離した。B:一次抗体としてのタイピングCP33F抗体を用いた、上記と同じ試料のウェスタンブロット分析。このデータは、肺炎球菌莢膜多糖のフリッパーゼが、緩和されたグリカン特異性を有し、遺伝子操作されたサブユニットを細胞質からペリプラズムに転位し得ることを示す。
大腸菌において生成された、遺伝子操作されたCP33Fサブユニットの生成を示す図である。脂質結合オリゴ糖(LLO)を抽出し、2ABで標識し、蛍光検出器が一体となったHPLCに供した。A:CP33F遺伝子操作されたサブユニットのHPLCクロマトグラム。LLOは、遺伝子操作された(eng.)CP33Fプラスミド、pGVX2342又は空ベクターで形質転換された大腸菌Sф874ΔwaaLから精製された。矢印は、MS分析用に回収されたCP33F遺伝子操作されたサブユニットに対応するピークを示す。
B:70.5分のピークのMS/MS分析。イオンフラグメントは、遺伝子操作されたCP33Fサブユニットの予想される構造と一致した。
遺伝子操作されたCP33FサブユニットがPglBによって転移され得ることを示す。タンパク質試料のウェスタンブロット分析:PglB発現プラスミド(pGVX970)、タンパク質キャリアAcrA発現プラスミド(pGVX1)及び空プラスミド(pGVX1387)又はプラスミドpGVX2306(CP33Fの遺伝子操作されたサブユニットを発現する)で形質転換された大腸菌W3110ΔwaaL。誘導後に細胞を回収し、タンパク質をペリプラズムから抽出し、IMACにより濃縮した。精製した試料をSDS-PAGE(4〜12%ゲル)に供し、一次抗体として抗His(A)によって、又はタイピングCP33F抗体(B)を用いて、発色させたニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。レーン1、空プラスミドを有する大腸菌株由来のタンパク質試料;レーン2、遺伝子操作CP33Fプラスミド(pGVX2306)を有する大腸菌株由来のタンパク質試料。
PglBが、遺伝子操作されたCP33Fポリマーをタンパク質キャリアに転移することができるが、野生型CP33Fを転移することができないことを示す。RcsAプラスミド(CP33F合成のアクチベーター)及びEPAを発現するpGVX2310(タンパク質キャリア)及び空ベクター(レーン1、2)又はCP33F遺伝子操作されたプラスミド(pGVX2346)(レーン3及び4) (パネルA及びB)でそれぞれ形質転換された大腸菌W3110コラン酸::CP33F waaL::PglBの、プロテイナーゼK消化全細胞(A)及びIMAC濃縮ペリプラズム抽出物(B及びC)のウェスタンブロット分析。全ての試料をSDS-PAGE(4〜12%ゲル)で分離し、ニトロセルロース膜上でエレクトロブロットし、タイピングCP33F抗体(A及びB)及びa-His抗体(C)とともにインキュベートした。パネルAに示されるように、全ての菌株は、抗CP33F抗体によって認識されるLLOを生成した;しかしながら、糖タンパク質(CP33F-EPA)は、CP33F Engを発現する菌株においてのみ検出され、PglBのみは、第一の反復単位の還元末端にヘキソースを含まないように修飾されたCP33Fを転移し得ることを確認した。
A:肺炎球菌CP14の野生型クラスターの遺伝子構成及び各々の遺伝子の推定機能の模式図を示す。点線のボックスは、大腸菌W3110コラン酸クラスターを置換することによって、大腸菌W3110染色体内に組み込まれたクラスターの部分を示す。B:野生型CP14の1つの反復単位(RU)の構造であり、集合に関与する酵素が示される。
A:遺伝子操作されたCP14サブユニットの生成に使用される合成クラスターの模式図を示す。矢印は、アラビノース誘導性プラスミドにおいて遺伝子操作されたCP14サブユニットを生成するために一緒に集合させた遺伝子を示す。明るい灰色の矢印は、大腸菌O21由来のwciP(UDP-GalからGalをGlcに集合させるガラクトーストランスフェラーゼ)及びwciQ(UDP-GlcからGlcをGalNAc-UndPPに集合させるグルコシルトランスフェラーゼ)遺伝子を表す。濃い灰色の矢印は、GlcNAc-UndPP(大腸菌wecAの生成物)をGalNAc-UndPPに変換するZ3206エピメラーゼを表す(Rush JS, Alaimo C, Robbiani R, Wacker M, Waechter CJ. J Biol Chem. 2010 Jan 15;285(3):1671-80)。黒色の矢印は、肺炎球菌CP14由来のwchL(GlcNAcトランスフェラーゼをコードする)及びwchM(ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする)を表す。白い矢印は、C.ジェジュニのフリッパーゼであるpglKを表す。B:ハイブリッドCP14の1つの反復単位(RU)の構造であり、集合に関与する酵素が示される(ここでは、ヘキソース単糖誘導体は、還元末端に単糖として存在し、完全な野生型CP14反復単位はヘキソース単糖誘導体に集合される)。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、C.ジェジュニPglB)によって転移され得るハイブリッドCP14ポリマーを生成する方法を例証する概略図を示す。A:大腸菌に組み込まれたCP14の野生型生合成経路を示す。B:GalNAc-ウンデカプレニルピロリン酸で1つのCP14の完全な野生型サブユニットを合成するための、様々なグリコシルトランスフェラーゼを用いたCP14の1つの遺伝子操作されたサブユニットの生合成を例証する。C:1つの遺伝子操作されたサブユニットの上部に野生型CP14多糖の重合を示す。このハイブリッドポリマーは、高効率でPglBによって転移される。
PglBが、遺伝子操作されたCP14ポリマーをタンパク質キャリアに転移することができることを示す図である。大腸菌W3110コラン酸::CP14ΔwaaLは、RcsAプラスミド(CP14合成のアクチベーター)、遺伝子操作されたCP14サブユニットを生成するためのプラスミド、PglBを発現するプラスミド、及びEPA(タンパク質キャリア)を発現するプラスミドで形質転換された。細胞を増殖させ、誘導後に回収した。ペリプラズムタンパク質を抽出し、アフィニティークロマトグラフィー(非グリコシル化精製EPAタンパク質のヤギ血清注入からの精製IgGをBior-RadのAffi-Gel(登録商標)にカップリングさせた)によってEPAコンジュゲートを濃縮した。濃縮されたタンパク質試料をSDS-PAGE(4〜12%ゲル)によって分離し、ニトロセルロース膜上でエレクトロブロットした。A:ブロットを抗Hisモノクローナル抗体とともにインキュベートした。B:ブロットを肺炎球菌のタイピングCP14抗体とともにインキュベートした。両方のウェスタンブロット分析では、CP14-EPAコンジュゲートに対応するラダーバンド可視化された。
CP14-EPA精製を示す図である。C.ジェジュニPglB(オリゴサッカリルトランスフェラーゼ)及びEPA-6His(タンパク質キャリア)を発現する、CP14の遺伝子操作されたサブユニットを生成するために、RcsA(CP14合成のアクチベータ)を発現するためのプラスミドで大腸菌W3110のコラン酸::CP14ΔwaaLを形質転換した。形質転換された大腸菌細胞バイオリアクター中で増殖させ、誘導後に細胞を回収した。タンパク質を浸透圧ショックによってペリプラズムから抽出し、IMAC、レクチンアフィニティークロマトグラフィー(トウゴマ凝集素)、サイズ排除クロマトグラフィー、及びソースQクロマトグラフィーを用いて精製した。精製した試料をSDS-PAGE(4〜12%ゲル)で分離し、クーマシー染色(A)、又は一次抗体として抗Hisモノクローナル抗体(B)若しくは一次抗体としてタイピング抗CP14抗体(C)を用いた、ニトロセルロース膜上でのエレクトロブロットに供した。
公知の肺炎球菌ワクチン(プレブナー13;Wyeth/Pfizer)と比較した、CP14-EPAバイオコンジュゲートの免疫原性を分析するための実験設計を示す図である。
プレブナー13と比較した、CP14-EPAバイオコンジュゲートに対して生じた抗体の免疫原性及び機能性を示す図である。CP14-EPAコンジュゲートは、水酸化アルミニウム(アジュバント)とともに、3匹の別々のウサギに2つの投薬量0.4μg CP14及び2.2μg CP14で注射された(図24参照)。対照として、プレブナー13(2.2μg)を3匹の別々のウサギに注射した。A:ウサギのCP14特異的抗体濃度を示す。野生型CP14莢膜多糖(対応するヒト血清に基づいて標準化された)を用いてELISAを行った。B:オプソニン貪食作用指数により示される、Aに対する対応する血清の機能性。
第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖を含む、野生型対応物と比較した、糖鎖工学的に操作された(ハイブリッド)莢膜多糖の生成を示す漫画を示す図である。
肺炎球菌CP15A遺伝子クラスターを示す図である。
肺炎球菌CP15Aの反復単位構造を示す図である。
A:CP15Aを遺伝子操作するために使用されるプラスミドpGVXN3058の遺伝子構成、B:遺伝子操作されたCP15Aの糖鎖構造を示す図である。
pGVXN3058(遺伝子操作)ベクターの存在下でのCP15A-AcrAバイオコンジュゲートの生成を示す。A:抗CP15A抗体を用いた全細胞プロテイナーゼK消化抽出物のウェスタンブロット分析;B:ペリプラズムから抽出され、抗CP15A抗体を用いてIMACにより濃縮されたタンパク質のウェスタンブロット分析;C:ペリプラズムから抽出され、抗His抗体を用いてIMACにより濃縮されたタンパク質のウェスタンブロット分析。

0151

5-発明の詳細な説明
肺炎球菌莢膜多糖は、肺炎球菌細胞のCPクラスター中に典型的にコードされる酵素のセットの協働により、キャリア脂質上に合成される(Whitfield C, Roberts IS: Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 1999, 31(5):1307-1319)。wzy依存性CPの合成は、膜の細胞質側でウンデカプレニルリン酸(Und-P)への単糖-リン酸の付加から開始される。短いオリゴ糖が、異なるグリコシルトランスフェラーゼによる活性化型糖ヌクレオチドからの単糖の連続的付加により伸長され、脂質連結型オリゴ糖はフリッパーゼにより膜を介してフリップ(flip)される。抗原-反復単位(RU)は、タンパク質wzyにより行なわれる酵素反応により重合(ポリマー化)される。続いて、多糖が、最終的なアクセプター構造へと転移される。ポリマー化及び細胞表面への輸送は、CPCPクラスターの5’末端に位置する3〜4種類の酵素のセットにより制御されると考えられている。

0152

グリコシルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼwzy、フリッパーゼwzx、及び単糖-リン酸トランスフェラーゼは、ほとんどの場合に、dexB〜aliAクラスター内にコードされるが、ヌクレオチド活性化型単糖生合成経路は、一般的なハウスキーピング活性の場合にゲノム中のどこかで、及び単糖がCPに特異的である場合には特異的にCPクラスター内にコードされる(Bentley SD, AanensenDM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes.PLoS genetics 2006, 2(3):e31)。

0153

CPを生成する大部分の生合成経路は、ヌクレオチド二リン酸(NDP)活性化型単糖を基質として用い、すなわち、UDP-Glc及びUDP-GlcNAcである。これらのNDP糖は、ハウスキーピング遺伝子によりグラム陰性宿主及びグラム陽性宿主で与えられ、つまり、特定の糖の合成のための出発材料として利用可能である。特定のNDP糖の合成又は他の修飾のための生合成遺伝子は、ほとんどいつもCPクラスター中にコードされる。

0154

O抗原合成とCP合成とは、生合成の最後のステップが異なる。O抗原は、リガーゼWaaLによりリピドAコアへと付加され、外膜へとさらに輸送される一方で、CPは細胞上に莢膜構造として存在する。平均では、最終的なO抗原糖の長さはCPよりもかなり短い。

0155

肺炎球菌CPは、その合成につながる特異的な生化学的経路により、I群CPとして分類される。グラム陰性細菌もまたI群CP経路を含み、これは、外膜輸送を担う追加の膜トランスポータータンパク質遺伝子の存在により、肺炎球菌I群クラスターとは異なる。例えば、これらはコラン酸(colanic acid)(CA)生合成機構遺伝子クラスターwca(Stevenson G, Andrianopoulos K, Hobbs M, Reeves PR: Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colanic acid. J Bacteriol 1996, 178(16):4885-4893)、及びK30 CPクラスター(Whitfield C: Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 2006, 75:39-68)である。

0156

大腸菌の染色体組み込み及び遺伝子改変による肺炎球菌の野生型莢膜多糖の生成のための方法は記載されている。国際特許出願WO2014/072405号(参照によりその全体を本明細書に組み入れる)を参照されたい。しかしながら、野生型グラム陽性莢膜多糖の生成の成功にもかかわらず、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(C.ジェジュニPglB)を使用した大腸菌における肺炎球菌CPバイオコンジュゲートの効率的な生成は、肺炎球菌莢膜多糖の90%以上が、還元末端に次善のPglBの基質であるヘキソース(例えばグルコース)を含むという事実のために妨げられている(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 May 2;103(18):7088-93)。

0157

上記第3節、以下の実施例及び添付の特許請求の範囲に記載の通り、本出願の発明者は、PglBの好適な基質であるウンデカプレノール-ピロリン酸に結合した還元単糖上でのハイブリッドオリゴ糖及び多糖の生合成を可能とする、肺炎球菌莢膜多糖を含む修飾されたオリゴ糖及び多糖の生成のための新規な方法を同定した。したがって、本明細書に記載する方法は、初めて、通常はオリゴサッカリルトランスフェラーゼの基質、例えばPglB(例としてC.ジェジュニ由来のPglB)ではない(又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼの弱い基質である)細菌抗原(オリゴ糖及び多糖)に連結した、高収量のバイオコンジュゲートの生成において改変型宿主細胞の使用を可能にする。

0158

一実施形態では、多糖の生成のための遺伝子操作されたグラム陰性細菌が本明細書中に提供され、該グラム陰性細菌は、グラム陰性細菌の染色体に組み込まれた莢膜多糖遺伝子クラスターの経路を含む。特定の実施形態では、グラム陰性細菌は、莢膜多糖遺伝子クラスターのオープンリーディングフレームの少なくとも25%、50%、75%、85%、90%、又は少なくとも95%を含む。特定の実施形態では、グラム陰性細菌は、完全な莢膜多糖遺伝子クラスターを含む。特定の実施形態では、多糖は莢膜多糖のエピトープを含む。

0159

一実施形態では、操作されたサブユニットの生成のためのグラム陰性細菌が本明細書中に提供され、該グラム陰性細菌は、莢膜多糖の操作された反復単位の生成のための経路を含む。特定の実施形態では、グラム陰性細菌は、莢膜多糖遺伝子クラスターのオープンリーディングフレームの少なくとも25%、50%、75%、85%、90%、又は少なくとも95%を含む。特定の実施形態では、グラム陰性細菌は、異なるグラム陰性細菌及び陽性細菌に由来するグリコシルトランスフェラーゼをコードするいくつかの遺伝子を含む。

0160

特定の実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌は、エシェリキア属の種、大腸菌、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、ナイセリア属の種、ビブリオ属の種、プロテウス属の種、シュードモナス属の種、アエロモナス属の種、及びプロテウス属の種からなる群より選択される。具体的な実施形態では、グラム陰性細菌は大腸菌である。

0161

特定の実施形態では、先行する段落のグラム陽性細菌は、ストレプトコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、エンテロコッカス属の種、及びラクトコッカス属の種からなる群より選択される。

0162

特定の実施形態では、先行する段落のいずれか1つのグラム陰性細菌へと遺伝子操作されるグラム陽性細菌の莢膜多糖遺伝子クラスターは、肺炎球菌である。具体的な実施形態では、肺炎球菌調節遺伝子は肺炎球菌14型由来である。具体的な実施形態では、肺炎球菌調節遺伝子は肺炎球菌33F型由来である。

0163

本発明の具体的な実施形態では、肺炎球菌調節遺伝子は、肺炎球菌8型、12F型、15A型、16F型、22F型、23A型、24F型、31型、33F型、35B型及び38型に由来する。

0164

特定の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、該グラム陰性細菌にとって異種である。

0165

特定の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、少なくとも1種の異種グリコシルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、異種グリコシルトランスフェラーゼは、原核生物グリコシルトランスフェラーゼである。具体的な実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、調節遺伝子と同じグラム陽性細菌から得られる。

0166

特定の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、該グラム陰性細菌にとってネイティブである1種以上の遺伝子の欠失又は不活性化を含む。具体的な実施形態では、1種以上の欠失される遺伝子は、waaL遺伝子を含む。具体的な実施形態では、1種以上の欠失される遺伝子は、該グラム陰性細菌でのO抗原生合成に関連するすべての遺伝子を含む。

0167

特定の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、該グラム陰性細菌にとってネイティブである1種以上の遺伝子の置換を含む。具体的な実施形態では、1種以上の置換される遺伝子は、waaL遺伝子を含む。具体的な実施形態では、waaLは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼで置換される。具体的な実施形態では、waaLは、C.ジェジュニpglBで置換される。

0168

特定の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、グリコシル化のためのコンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸を含む。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質をコードする核酸は、該グラム陰性細菌にとって異種である。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質は、緑膿菌(P. auruginosa)由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、及び肺炎球菌ニューモリシンである。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質は肺炎球菌タンパク質であり、例えば、肺炎球菌ニューモリシン、肺炎球菌NOX、肺炎球菌PspA、肺炎球菌PcpA、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌PhtE、肺炎球菌Ply、又は肺炎球菌LytBである。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる。

0169

特定の実施形態では、以下の莢膜多糖の操作されたサブユニットの1つを生成するためにグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は陰性細菌(-negative bacterium)へと遺伝子操作される:肺炎球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A及びB)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、若しくはCP48;又は黄色ブドウ球菌CP5、若しくはCP8;B群溶血性連鎖球菌(B群、GBS)CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII、若しくはCPVIII;又はエンテロコッカス・フェカリスCPA、CPB、CPC、若しくはCPD。

0170

具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、該グラム陰性細菌にとって異種である。

0171

具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌は、該グラム陰性細菌にとって異種である少なくとも1種のグリコシルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、原核生物グリコシルトランスフェラーゼである。具体的な実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、古細菌又は真核生物グリコシルトランスフェラーゼである。

0172

具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌は、グリコシル化のためのコンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸を含む。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質をコードする核酸は、該グラム陰性細菌にとって異種である。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質は、緑膿菌(P. auruginosa)由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、及びC.ジェジュニ天然糖タンパク質である。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる。

0173

具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陽性細菌の多糖は、肺炎球菌の莢膜多糖である。

0174

具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌の多糖は、以下のものである:大腸菌O抗原(O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187)、サルモネラ属の種(S.エンテリカ亜種エンテリカ(S. enterica subsp. Enterica)、S.エンテリカ亜種サラマエ(S. enterica subsp. Salamae)、S.エンテリカ亜種アリゾナエ(S. enterica subsp. arizonae)、S.エンテリカ亜種ジアリゾナエ(S. enterica subsp. Diarizonae)、S.エンテリカ亜種ホウテナエ(S. enterica subsp. Houtenae)、S.ボンゴリ(S. bongori)、及びS.エンテリカ亜種インディカ(S. enterica subsp. Indica)、及びO 1〜67型、シュードモナス属の種(緑膿菌O血清型1〜20)、クレブシエラ属の種(特に、K.ニューモニエ(K. pneumonia)血清型O1、O2(及び下位血清型)、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12)、アシネトバクター属O抗原(特に、A.バウマンニイ(A. baumannii)O抗原)、クラミジアトラコマチス(Chlamydia trachomatis)O抗原(血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3)、コレラ菌(Vibrio cholera)O抗原O1〜155、リステリア属の種、特にL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)1型、2型3型、4型及びそれらの下位血清型、レジオネラニューモフィラ(Legionella pneumophila)血清型1〜15 O抗原、ボルデテラパラペルツッシス(Bordetella parapertussis)O抗原、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)及びシュードマレイ(pseudomallei)O抗原、野兎病菌(Francisella tularensis)、カンピロバクター属の種(C.ジェジュニ);クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)(血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5、及びウェルシュ菌(C. perfringens)血清型A、B、C、D及びE)の莢膜多糖、黄色ブドウ球菌5型及び8型、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyrogenes)(B群連鎖球菌莢膜血清型多糖)、大腸菌、B群溶血性連鎖球菌(Streptococcus agalacticae)(A群連鎖球菌莢膜多糖)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)(血清型A、B、C、W、Y、X)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、エンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖I〜V型;並びに他の表面多糖構造、例えば、ボレリアブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)糖脂質)、髄膜炎菌ピリン(pilin)Oグリカン及びリポオリゴ糖(lipooligosaccharide)(LOS)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)LOS、リューシュマニア属主要リポホスホグリカン(Leishmania major lipophosphoglycan)、腫瘍関連炭水化物抗原マラリアグリコシルホスファチジルイノシトール(malaria glycosyl phosphatidylinositol)、又はヒト型結核菌(mycobacterium tuberculosis)アラビノマンナン

0175

具体的な実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、先行する段落のグラム陰性細菌の多糖遺伝子クラスター、大腸菌(E. coli)のO抗原(O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187)、サルモネラ属(Salmonella)の種(S.エンテリカ亜種エンテリカ(S.enterica subsp. Enterica)、S.エンテリカ亜種サラメ(S.enterica subsp. Salamae)、S.エンテリカ亜種アリゾネ(S.enterica subsp. arizonae)、S.エンテリカ亜種ジアリゾネ(S.enterica subsp. Diarizonae)、S.エンテリカ亜種ハウテネ(S.enterica subsp. Houtenae)、S.ボンゴリ(S.bongori)及びS.エンテリカ亜種インディカ(S.enterica subsp. Indica)並びにO型1〜67、シュードモナス属(Pseudomonas)の種(緑膿菌(P.aeruginosa)O血清型1〜20)、クレブシエラ属(Klebsiella)の種(特に、K.ニューモニア(K.pneumonia)血清型O1、O2(及び亜血清型)、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12)、アシネトバクター(Acinetobactor)O抗原(特に、A.バウマンニイ(A.baumannii)O抗原)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)O抗原(血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I J、K、L1、L2、L3)、コレラ菌(Vibrio cholera)O抗原O1〜155、リステニア属(Listeria)の種、特に、L.モノサイトゲネス(L.monocytogenes)1、2、3、4型及びそれらの亜血清型、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)血清型1〜15 O抗原、ボルデテラ・パラペルツシス(Bordetella parapertussis)O抗原、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)及びシュードマレイ(pseudomallei)O抗原、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、カンピロバクター属(Campylobacter)の種(C.ジェジュニ(C.jejuni));クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)(血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5、及びC.パーフリンジェンス(C.perfringens)血清型A、B、C、D及びE)の莢膜多糖、黄色ブドウ球菌(staphylococcus aureus)5及び8型、ストレプトコッカス・ピロゲネス(Streptococcus pyrogenes)(B群連鎖球菌莢膜血清型多糖)、大腸菌(E. coli)、ストレプトコッカス・アガラクチカエ(Streptococcus agalacticae)(A群連鎖球菌莢膜多糖)、ナイセリアメニンギティディス(Neisseria meningitidis)(血清型A、B、C、W、Y、X)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ヘモフィルスインフルエンザ(Haemophilus influenza)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)莢膜多糖I〜V型;及びその他の表面多糖構造、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)糖脂質、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meringitidis)ピリンOグリカン及びリポオリゴ糖(LOS)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)LOS、大形リーシュマニア(Leishmania major)リポホスホグリカン、腫瘍関連炭水化物抗原、マラリアグリコシルホスファチジルイノシトール、又は結核菌アラビノマンナンに由来する。テイコ酸及びエキソ多糖は、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ピロゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチカエ、ウェルシュ菌(C. perfringens)、L.ラクティス、L.クレモリスに由来する。

0176

具体的な実施形態では、先行する段落のいずれか1つのグラム陰性細菌により生成される組み換え糖タンパク質が、本明細書中に提供される。

0177

具体的な実施形態では、タンパク質の生成に好適な条件下で、先行する段落のいずれか1つのグラム陰性細菌を培養するステップを含む、組み換え糖タンパク質を生成する方法が、本明細書中に提供される。具体的な実施形態では、該方法は、組み換え糖タンパク質を精製するステップをさらに含む。

0178

特定の実施形態では、以下の操作された莢膜多糖の反復単位を生成するために、異なる相同及び異種グリコシルトランスフェラーゼをin vivoで組み合わせている:肺炎球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6(A及びB)、CP7(A、B、C)、CP8、CP9(A、L、N、V)、CP10(A、B、C、F)、CP11(A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、CP48及び(Bentley SD, AanensenDM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes.PLoS genetics 2006、2(3):e31)で言及されている通りのすべての追加の莢膜。具体的には、これらの莢膜多糖としては、肺炎球菌CP14及びCP33Fが挙げられる。

0179

本発明の具体的な実施形態では、ワクチン生成物は、肺炎球菌血清型CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B及びCP38の操作された莢膜多糖反復単位を含む。

0180

他の実施形態では、ヘキソース又は他のいずれかの単糖を有する他のグラム陽性細菌の莢膜多糖を本発明の方法を用いて修飾することができる。他のグラム陽性細菌としては、黄色ブドウ球菌及びB群溶血性連鎖球菌(GBS)が挙げられる。そのような莢膜多糖の例としては、黄色ブドウ球菌CP5、B群溶血性連鎖球菌(B群、GBS)CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII、CPVIII、エンテロコッカス・フェカリスCPA、CPB、CPC、CPDが挙げられる。

0181

特定の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞及び本明細書中に記載されるそのような細菌宿主細胞により生成されるコンジュゲートは、有利な特性を有する。例えば、特定の実施形態では、グラム陽性細菌由来の調節遺伝子(該調節遺伝子はオリゴ糖又は多糖生合成に関与する)を含む、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、該調節遺伝子の存在の結果として増加した長さの糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)を生成することが可能である。さらに、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、グラム陽性細菌由来の調節遺伝子を欠損するグラム陰性細菌宿主細胞と比較して、増大した量の糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)を生成することが可能である。細菌細胞により生成されるコンジュゲートがより高い糖抗原-タンパク質比を有する点で、及び細菌細胞がより多数のコンジュゲートを生成するので、これらの特徴のそれぞれが有利である。

0182

特定の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖又は多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を欠損する細菌宿主細胞よりも、約5%、10%、15%、20%、約25%、約30%、約40%、約50%、又は50%超、多くのコンジュゲートを生成する。特定の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖又は多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を欠損する細菌宿主細胞よりも、5%〜10%、10%〜20%、20%〜30%、30%〜40%、又は40%〜50%、多くのコンジュゲートを生成する。

0183

特定の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖又は多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を欠損する細菌宿主細胞よりも、約5%、10%、15%、20%、約25%、約30%、約40%、約50%、又は50%超、多くの糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)を生成する。特定の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖又は多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を欠損する細菌宿主細胞よりも、5%〜10%、10%〜20%、20%〜30%、30%〜40%、又は40%〜50%、多くの糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)を生成する。

0184

特定の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖又は多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を欠損する細菌宿主細胞により生成される糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)よりも、約5%、10%、15%、20%、約25%、約30%、約40%、約50%、又は50%超、長い糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)を生成する。特定の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖又は多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を欠損する細菌宿主細胞により生成される糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)よりも、5%〜10%、10%〜20%、20%〜30%、30%〜40%、又は40%〜50%、長い糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)を生成する。

0185

本明細書中に記載されるコンジュゲートを特性決定するために、例えば、キャリアタンパク質、結合された糖抗原(例えば、オリゴ糖及び/又は多糖)、又はその両者を特性決定するために、例えば、高速サイズ排除クロマトグラフィー、等電点電気泳動、SDS-PAGE及びウエスタンブロット、MSによる分子量測定N末端配列決定アミノ酸分析逆相液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析、タンデム質量分析(MS/MS)、及びトリプシン消化後質量分析によるペプチドマッピングをはじめとする、様々なアッセイを用いることができる。

0186

5.1宿主細胞
本明細書中に記載されるハイブリッドオリゴ糖及び多糖並びに本明細書中に記載されるハイブリッドオリゴ糖及び多糖を含むバイオコンジュゲートを生成するために、当業者に公知の宿主細胞のいずれも、例えば古細菌、原核宿主細胞及び真核宿主細胞を含む宿主細胞を使用することができる。本明細書中に記載されるハイブリッドオリゴ糖及び多糖並びに本明細書中に記載されるハイブリッドオリゴ糖及び多糖を含むバイオコンジュゲートの生成に使用するための原核宿主細胞の例としては、限定するものではないが、エシェリキア属(Escherichia)の種、シゲラ属(Shigella)の種、クレブシエラ属(Klebsiella)の種、キサントモナス属(Xhantomonas)の種、サルモネラ属(Salmonella)の種、エルシニア属(Yersinia)の種、ラクトコッカス属(Lactococcus)の種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)の種、シュードモナス属(Pseudomonas)の種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)の種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)の種、バチルス属(Bacillus)の種、及びクロストリジウム属(Clostridium)の種が挙げられる。具体的な実施形態では、本明細書中に記載されるハイブリッドオリゴ糖及び多糖並びに本明細書中に記載されるハイブリッドオリゴ糖及び多糖を含むバイオコンジュゲートの生成に使用される宿主細胞は大腸菌である。

0187

ある特定の実施形態では、本明細書に記載のハイブリッドオリゴ糖及び多糖並びに本明細書に記載のバイオコンジュゲートを生成するために使用する宿主細胞は、異種核酸を含むように操作されており、例えば、1種以上のキャリアタンパク質をコードする異種核酸及び/又は1種以上のタンパク質をコードする異種核酸(例えば、1種以上のタンパク質をコードする遺伝子)を含むように操作されている。ある具体的な実施形態では、グリコシル化経路(例えば、原核生物の及び/又は真核生物のグリコシル化経路)に関与するタンパク質をコードする異種核酸を、本明細書に記載の宿主細胞中に導入することができる。そのような核酸は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼが挙げられるがこれらに限定されないタンパク質をコードすることができる。当業者に既知の任意の方法(例えば、エレクトロポレーション熱ショックによる化学的形質転換、天然形質転換、ファージ形質導入及びコンジュゲーション)を使用して、異種核酸(例えば、キャリアタンパク質をコードする核酸及び/又はその他のタンパク質(例えばグリコシル化に関与するタンパク質)をコードする核酸)を、本明細書に記載の宿主細胞中に導入することができる。具体的な実施形態では、プラスミドを使用して異種核酸を本明細書に記載の宿主細胞中に導入し、例えば、この異種核酸は、プラスミド(例えば発現ベクター)により宿主細胞中で発現される。別の具体的な実施形態では、国際特許出願第PCT/EP2013/068737号(WO 14/037585として公開)に記載の挿入方法を使用して、異種核酸を本明細書に記載の宿主細胞中に導入する。

0188

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞中に、(例えば組換え技法を使用して)追加の改変を導入することができる。例えば、競合する可能性がある又は干渉する可能性があるグリコシル化経路(例えば、組換えにより宿主細胞中に導入されているグリコシル化に関与する1種以上の異種遺伝子と競合する又はこの異種遺伝子に干渉するグリコシル化経路)の一部を形成するタンパク質をコードする宿主細胞の核酸(例えば遺伝子)を、この核酸を不活性させる/機能不全にさせる(即ち、欠失した/改変された宿主細胞の核酸は、機能するタンパク質をコードしない、又はいかなるタンパク質もコードしない)ような方法で、宿主細胞バックグラウンド(ゲノム)中で欠失させることができる、又は改変することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞のゲノムから核酸が欠失する場合、この核酸を所望の配列に置き換えることができ、例えば糖タンパク質の生成に有用である配列に置き換えることができる。

0189

宿主細胞中で欠失させることができる(及び、ある場合にはその他の所望の核酸配列で置き換えることができる)例示的な遺伝子として、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子が挙げられ、例えば、waaL(例えばFeldmanら, 2005, PNAS USA 102:3016-3021を参照されたい)、リピドAコア生合成クラスター(waa)、ガラクトースクラスター(gal)、アラビノースクラスター(ara)、コロン酸(colonic acid)クラスター(wc)、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール-p生合成遺伝子(例えばuppS、uppP)、und-Pリサイクリング遺伝子、ヌクレオチドにより活性化された糖生合成に関与する代謝酵素腸内細菌共通抗原クラスター、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原改変クラスターが挙げられる。

0190

5.2キャリアタンパク質
コンジュゲートワクチン(例えば、ワクチンにおいて使用するためのバイオコンジュゲート)の生成での使用に好適ないずれかのキャリアタンパク質を本明細書中で用いることができ、例えば、キャリアタンパク質をコードする核酸を、ハイブリッドオリゴ糖及び多糖と連結されたキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートの生成のために本明細書中に提供される宿主細胞へと導入することができる。例示的なキャリアタンパク質としては、限定するものではないが、無毒化緑膿菌外毒素A(EPA;例えば、Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61を参照されたい)、CRM197、マルトース結合タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌ニューモリシン(Pneumolysin)及びその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、及びC.ジェジュニ天然糖タンパク質が挙げられる。EPAに関して、種々の無毒化タンパク質変異体は文献に記載され、キャリアタンパク質として使用されうる。

0191

特定の実施形態では、本明細書中に記載されるバイオコンジュゲートの生成で用いられるキャリアタンパク質は改変され、例えば、該タンパク質の毒性が低く、かつ/又はグリコシル化をより受けやすく改変される。具体的な実施形態では、本明細書中に記載されるバイオコンジュゲートの生成で用いられるキャリアタンパク質は改変され、それにより、そのバイオコンジュゲート形態での、例えば免疫原性組成物中の投与対象のタンパク質の比較的低い濃度を可能にする様式で、キャリアタンパク質中のグリコシル化部位の数が最大化される。

0192

特定の実施形態では、本明細書中に記載されるキャリアタンパク質は、該キャリアタンパク質に通常伴うであろうよりも(例えば、その未改変/天然(例えば、「野生型」)状態でキャリアタンパク質に伴うグリコシル化部位の数と比較して)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10箇所、又はそれ以上のグリコシル化部位を含むように改変される。具体的な実施形態では、グリコシル化部位の導入は、タンパク質の一次構造のどこかでの、グリコシル化コンセンサス配列(例えば、Asn-X-Ser(Thr)、ここで、XはPro以外のいずれかのアミノ酸であり得る;又はAsp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)、ここで、X及びZは独立して、Pro以外のいずれかの天然アミノ酸から選択される(国際公開第2006/119987号を参照されたい))の挿入により達成される。そのようなグリコシル化部位の導入は、例えば、タンパク質の一次構造へと新規アミノ酸を付加する(すなわち、完全に又は部分的に、グリコシル化部位が追加される)ことにより、又はグリコシル化部位を作製するためにタンパク質中の既存のアミノ酸を突然変異させる(すなわち、アミノ酸はタンパク質に追加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が突然変異されて、グリコシル化部位を形成する)ことにより、達成できる。当業者は、タンパク質のアミノ酸配列が、当技術分野で公知のアプローチ(例えば、タンパク質をコードする核酸配列の改変を含む組み換えアプローチ)を用いて容易に改変できることを認識するであろう。具体的な実施形態では、グリコシル化コンセンサス配列は、キャリアタンパク質の特定の領域、例えば、タンパク質の表面構造中、タンパク質のN若しくはC末端で、及び/又はタンパク質の塩基ジスルフィド橋によって安定化されているループ中に導入される。特定の実施形態では、古典的な5アミノ酸のグリコシル化コンセンサス配列が、より効率的なグリコシル化のためにリシン残基によって伸長され得、したがって、挿入されるコンセンサス配列は、挿入されるべき、若しくはアクセプタータンパク質アミノ酸と置き換わる5、6又は7個のアミノ酸をコードし得る。1つの特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、4つのコンセンサスグリコシル化配列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thrを含む無毒化EPAである。

0193

特定の実施形態では、本明細書中に記載されるバイオコンジュゲートの生成で用いられるキャリアタンパク質は、「タグ」、すなわち、キャリアタンパク質の単離及び/又は同定を可能にするアミノ酸の配列を含む。例えば、本明細書中に記載されるキャリアタンパク質へタグを付加することは、そのタンパク質の精製、ひいては、タグのついたキャリアタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製にて有用であり得る。本明細書中で用られ得る例示的タグとしては、限定するものではないが、ヒスチジン(HIS)タグ(例えば、ヘキサヒスチジンタグ又は6×His-タグ)、FLAG-タグ、及びHAタグが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書中で用いられるタグは、除去可能であり、例えば、それらがもはや必要でなくなれば、例えば、タンパク質が精製された後に、化学薬剤によるか、又は酵素的手段による除去で除去可能である。

0194

特定の実施形態では、本明細書中に記載されるキャリアタンパク質は、キャリアタンパク質を発現する宿主細胞のペリプラズム腔へとキャリアタンパク質を標的化するシグナル配列を含む。具体的な実施形態では、シグナル配列は、大腸菌DsbA、大腸菌外膜ポーリンA(porin A;OmpA)、大腸菌マルトース結合タンパク質(MalE)、エルウィニアコロトボランス(Erwinia carotovorans)ペクテートリアーゼ(pectate lyase)(PelB)、FlgI、NikA、又はバチルス属sp.エンドキシラナーゼ(XynA)、易熱性大腸菌エンテロトキシンLTIIb、バチルス属エンドキシラナーゼXynA、又は大腸菌フラゲリン(flagellin)(FlgI)由来のものである。

0195

5.3グリコシル化機構
本明細書において提供される宿主細胞は、ハイブリッドオリゴ糖及び/又は多糖を生成することができる遺伝子機構(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ及び/又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ)、並びにこのようなハイブリッドオリゴ糖及び/又は多糖をキャリアタンパク質に結合することができる遺伝子機構、をコードする核酸を含む及び/又は含むように改変され得る。

0196

グリコシルトランスフェラーゼ
本明細書において提供される宿主細胞は、オリゴ糖又は多糖反復単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み、ここで、前記反復単位は、還元末端にヘキソースを含まず、前記オリゴ糖又は多糖反復単位は、還元末端でヘキソースを含むドナーオリゴ糖又は多糖反復単位に由来する。当業者は、宿主細胞が、対象とするドナーオリゴ糖又は多糖に基づくハイブリッドオリゴ糖又は多糖の反復単位を生成することができるように、宿主細胞内でどのようなグリコシルトランスフェラーゼが遺伝子操作され得るかを容易に決定することができる。実際に、グリコシルトランスフェラーゼは当該技術分野において周知である。

0197

特定の実施形態において、本明細書において提供される宿主細胞は、ヘキソース単糖誘導体をウンデカプレニルピロリン酸(UND-PP)上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。前記グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来であり得る。特定の実施形態において、前記グリコシルトランスフェラーゼは、wecAである。

0198

特定の実施形態において、本明細書において提供される宿主細胞は、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。このようなグリコシルトランスフェラーゼは、問題となっているドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位が一度選択されると、当業者に容易に明らかになる。特定の実施形態において、ドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼは、肺炎球菌(S.pneumoniae)CP14由来のwchL及び/又はwchMを含む。特定の実施形態において、ドナーオリゴ糖又は多糖の反復単位の合成に十分な前記グリコシルトランスフェラーゼは、肺炎球菌CP33F由来のwciC、wciD、wciE及び/又はwciFを含む。

0199

特定の実施形態において、本明細書において提供される宿主細胞は、UND-PP上に集合したヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。特定の実施形態において、単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、シゲラ・ボイディ由来のガラクトシルトランスフェラーゼ(wfeD)である。別の特定の実施形態において、単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)である。別の特定の実施形態において、単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である。別の特定の実施形態において、単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である。

0200

別の特定の実施形態において、本明細書において提供される宿主細胞は、ヘキソース単糖誘導体上にドナーオリゴ糖又は多糖反復単位を集合させるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。

0201

一実施形態において、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位をヘキソース単糖誘導体上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ(wciP)、例えば大腸菌O21由来のwciPを含む。

0202

一実施形態において、ドナーオリゴ糖又は多糖反復単位をヘキソース単糖誘導体上に集合させるグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に、ドナーオリゴ糖又は多糖の第一の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、グルコシルトランスフェラーゼ(wciQ)、例えば、大腸菌O21由来のwciQを含む。

0203

オリゴサッカリルトランスフェラーゼ
オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、脂質連結型オリゴ糖を、N-グリコシル化コンセンサスモチーフ、例えば、Asn-X-Ser(Thr)(ここで、XはPro以外のいずれかのアミノ酸であり得る);又はAsp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(ここで、X及びZは独立に、Pro以外のいずれかの天然アミノ酸から選択される)(国際公開第2006/119987号を参照されたい)を含む新生ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に転移させる。例えば、国際公開第2003/074687号及び同第2006/119987号を参照されたい(これらの開示は、全体が参照により本明細書中に組み入れられる)。

0204

特定の実施形態では、本明細書中に提供される宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞に対して天然(native)であり得るか、又は上記の通りの遺伝学的アプローチを用いて宿主細胞に導入することができる。オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、当技術分野で公知のいずれかの供給源からのものであり得る。具体的な実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター属由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。別の具体的な実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(すなわち、pglB;例えば、Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793を参照されたい;また、例えば、NCBI Gene ID: 3231775、UniProt登録番号O86154も参照されたい)である。別の具体的な実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、NCBI Gene ID: 7410986を参照されたい)である。

0205

フリッパーゼ
特定の実施形態において、フリッパーゼ(Wzx)は、本明細書に記載される宿主細胞に導入される(すなわち、フリッパーゼは宿主細胞に対して異種である)。種々の生物のフリッパーゼ(例えば、細菌性フリッパーゼ)は、当該技術分野において公知である。フリッパーゼは、野生型反復単位及び/又はそれらの対応する遺伝子操作された(ハイブリッド)反復単位を宿主細胞(例えば、大腸菌)の細胞質からペリプラムに転位する。

0206

特定の実施形態において、莢膜多糖生合成経路のフリッパーゼは、本明細書に記載される宿主細胞に導入される。

0207

別の特定の実施形態において、肺炎球菌の莢膜多糖生合成経路のフリッパーゼは、本明細書に記載される宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、本明細書に記載される宿主細胞に導入されるフリッパーゼは、肺炎球菌の莢膜多糖遺伝子クラスターCP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A及びB)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14 CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、又はCP48由来のwzx遺伝子である。特定の実施形態において、本明細書に記載される宿主細胞に導入されるフリッパーゼは、CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B又はCP38の莢膜多糖遺伝子クラスター由来のwzx遺伝子である。

0208

本明細書に記載される宿主細胞に導入することができる他のフリッパーゼは、Bentley SD, AanensenDM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes.PLoS genetics 2006, 2(3):e31に記載されている肺炎球菌由来である。

0209

ある種の実施形態において、本明細書に記載される宿主細胞に導入されるフリッパーゼは、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である。

0210

ポリメラーゼ
ある種の実施形態において、ポリメラーゼ(Wzy)は、本明細書に記載される宿主細胞に導入される(すなわち、ポリメラーゼは宿主細胞に対して異種である)。種々の生物のポリメラーゼ(例えば、細菌ポリメラーゼ)は当該技術分野で公知である。

0211

特定の実施形態において、莢膜多糖生合成経路のポリメラーゼは、本明細書に記載される宿主細胞に導入される。

0212

別の特定の実施形態では、肺炎球菌の莢膜多糖生合成経路のポリメラーゼは、本明細書に記載される宿主細胞に導入される。

0213

特定の実施形態において、本明細書に記載される宿主細胞に導入されるポリメラーゼは、肺炎球菌の莢膜多糖遺伝子クラスターCP1、CP2、CP4、CP5、CP6 (A及びB)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14 CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、又はCP48由来のwzy遺伝子である。特定の実施形態において、本明細書に記載される宿主細胞に導入されるポリメラーゼは、CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B又はCP38の莢膜多糖遺伝子クラスター由来のwzy遺伝子である。

0214

本明細書に記載される宿主細胞に導入することができる他のポリメラーゼは、Bentley SD, AanensenDM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes.PLoS genetics 2006, 2(3):e31に記載される肺炎球菌由来である。

0215

特定の実施形態において、本明細書に記載される宿主細胞に導入されるポリメラーゼは、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である。

0216

単糖を修飾する酵素
特定の実施形態において、単糖を修飾することができる酵素は、本明細書に記載される宿主細胞に導入される(すなわち、単糖を修飾することができる酵素は宿主細胞に対して異種である)。このような酵素には、例えば、エピメラーゼ及びラセマーゼが含まれる。

0217

様々な生物のエピメラーゼ及びラセマーゼ(例えば、細菌エピメラーゼ及びラセマーゼ)は、当該技術分野において公知である。特定の実施形態において、本明細書に記載される宿主細胞に導入されるエピメラーゼ及び/又はラセマーゼは、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、キサントモナス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア属の種、アエロモナス属の種、フランシセラ属の種、ヘリコバクター属の種、プロテウス属の種、ラクトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、シュードモナス属の種、コリネバクテリウム属の種、ストレプトミセス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種、クロストリジウム属の種、リステリア属の種、又はカンピロバクター属の種由来である。

0218

特定の実施形態において、大腸菌O157由来のエピメラーゼZ3206は、本明細書に記載される宿主細胞に導入される。

0219

5.4バイオコンジュゲート
特定の実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞を使用して、キャリアタンパク質に連結されたハイブリッドオリゴ糖又は多糖を含むバイオコンジュゲートを生成することができる。宿主細胞を使用したかかるバイオコンジュゲートの生成方法は当技術分野で公知である。例えば、WO 2003/074687号及びWO 2006/119987号を参照のこと(それぞれを参照によりその全体を本明細書に組み入れる)。

0220

本明細書に記載されるようなバイオコンジュゲートは、化学的に生成された糖コンジュゲートと比べて有利な特性を有し、例えば、バイオコンジュゲートは製造において必要な化学物質がより少ないこと、生成される最終生成物の点でより一貫性があることである。したがって、バイオコンジュゲートは化学的に生成された糖コンジュゲートよりも好ましい。

0221

本明細書中に記載の宿主細胞及び方法によって、特定の糖の通常の反復単位が最終糖の大部分に使用されるが、第一の反復単位は還元末端にヘキソース単糖誘導体を含む新規なハイブリッド糖構造の生成が可能となる。かかるハイブリッド糖は、糖の大部分の天然構造を保持する利点を有し、その結果、通常の抗原が保持されるが、集合したオリゴ糖又は多糖の還元末端におけるヘキソース単糖誘導体の存在によって、これがPglBなどのグリコシルトランスフェラーゼの適切な基質となり、かかるハイブリッド糖のキャリアタンパク質に結合してバイオコンジュゲートを作製する効率が増大する。以下に記載する特徴は、本発明のハイブリッドオリゴ糖又は多糖、あるいは本発明のオリゴ糖又は多糖の合成方法のために好適である。

0222

本発明のさらなる実施形態は、構造
(B)n-A→
[式中、
Aは、還元末端(矢印で示される)にヘキソース単糖誘導体を有する、少なくとも2、3、4、5、6、7又は8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり;
Bは、少なくとも2、3、4、5、6、7又は8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり;
A及びBは異なるオリゴ糖反復単位であり;
nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、100若しくは少なくとも200であるか、又は
nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、100若しくは少なくとも200である]
を有するハイブリッドオリゴ糖又は多糖である。

0223

一実施形態において、Aは、20個、15個、12個、10個、9個又は8個以下の単糖を含むオリゴ糖である。一実施形態において、Bは、20個、15個、12個、10個、9個又は8個以下の単糖を含むオリゴ糖である。一実施形態において、A及びBは、20個、15個、12個、10個、9個又は8個以下の単糖を含むオリゴ糖である。一実施形態において、nは、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10又は5以下である。

0224

一実施形態において、Aは少なくとも3個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも3個の単糖を含むオリゴ糖反復単位である。一実施形態において、Aは少なくとも3個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも3個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも5である。一実施形態において、Aは少なくとも3個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも3個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも20である。

0225

一実施形態において、Aは少なくとも4個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも4個の単糖を含むオリゴ糖反復単位である。一実施形態において、Aは少なくとも4個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも4個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも5である。一実施形態において、Aは少なくとも4個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも4個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも20である。

0226

一実施形態において、Aは少なくとも5個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも5個の単糖を含むオリゴ糖反復単位である。一実施形態において、Aは少なくとも5個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも5個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも5である。一実施形態において、Aは少なくとも5個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも5個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも20である。

0227

一実施形態において、Aは少なくとも6個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも6個の単糖を含むオリゴ糖反復単位である。一実施形態において、Aは少なくとも6個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも6個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも5である。一実施形態において、Aは少なくとも6個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは少なくとも6個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも20である。

0228

一実施形態において、Aは2〜8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは2〜8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位である。一実施形態において、Aは2〜8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは2〜8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも5であり500以下である。一実施形態において、Aは2〜8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは2〜8個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも20であり100以下である。

0229

一実施形態において、Aは2〜10個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは2〜10個の単糖を含むオリゴ糖反復単位である。一実施形態において、Aは2〜10個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは2〜10個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも5であり500以下である。一実施形態において、Aは2〜10個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、Bは2〜10個の単糖を含むオリゴ糖反復単位であり、nは少なくとも20であり100以下である。

0230

ハイブリッドオリゴ糖又は多糖の一実施形態において、Bオリゴ糖反復は、反復の還元末端にヘキソース単糖を含む。ハイブリッドオリゴ糖又は多糖の一実施形態において、反復の還元末端におけるヘキソース単糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノトール、フコース及びマンノースからなる群、好適にはグルコース及びガラクトースからなる群から選択される。

0231

ハイブリッドオリゴ糖又は多糖の一実施形態において、Aのオリゴ糖反復単位及びBのオリゴ糖反復単位は、反復の還元末端に異なる単糖を含むことでのみ相違する。

0232

ハイブリッドオリゴ糖又は多糖の一実施形態において、Aのオリゴ糖反復単位は、グラム陽性細菌莢膜糖、例えば、A群連鎖球菌莢膜糖、B群連鎖球菌莢膜糖、肺炎球菌莢膜糖、腸球菌莢膜糖又は黄色ブドウ球菌莢膜糖の莢膜糖の反復単位であり、例えば肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F若しくは48、好適には血清型8、12F、14、15A、16F、22F、23A、24F、31、33F、35B若しくは38の莢膜糖の反復単位であり;又は、肺炎球菌血清型2、3、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F若しくは48の莢膜糖の反復単位である。

0233

ハイブリッドオリゴ糖又は多糖の一実施形態において、Aのオリゴ糖反復単位は、血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII又はVIIIから選択されるB群連鎖球菌莢膜糖の莢膜糖の反復単位である。

0234

ハイブリッドオリゴ糖又は多糖の一実施形態において、Aのオリゴ糖反復単位は、黄色ブドウ球菌血清型5若しくは血清型8の莢膜糖の、又はエンテロコッカス・フェカリス血清型A、B、C若しくはDの反復単位である。

0235

本発明のさらなる態様は、上記のハイブリッドオリゴ糖又は多糖に結合された、上記のキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートである。

0236

本発明のさらなる態様は、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖の単糖の全てを含むことに加えて、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、前記ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、ドナーオリゴ糖又は多糖と同一である、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖にN-結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートである。言い換えると、そのアスパラギン残基がハイブリッドオリゴ糖又は多糖と結合しているAsn-X-Ser/Thrコンセンサス配列を含有するキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートであって、該ハイブリッドオリゴ糖又は多糖は、ドナーオリゴ糖又は多糖の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40又は50の単糖反復単位と、キャリアタンパク質にN-結合したさらなる反復単位(ヘキソース単糖誘導体がそのさらなる反復単位の還元末端にある)を含む。

0237

一実施形態において、ヘキソース単糖誘導体は、そのC-2位が、アセトアミド基で修飾される任意の単糖である。好適なヘキソース単糖誘導体としては、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactoseamine)(GalNAc)、HexNAc、デオキシHexNAc、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(N-acetylfucoseamine)(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)が挙げられる。好適なヘキソース単糖誘導体はN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)である。

0238

一実施形態において、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖が、グラム陽性細菌莢膜糖の第一の反復の還元末端に通常存在するヘキソース単糖の代わりに、第一の反復単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含むという事実を除いて、ハイブリッドオリゴ糖又は多糖は、前記グラム陽性細菌莢膜糖と同一である。

0239

一実施形態において、グラム陽性細菌莢膜糖は、A群連鎖球菌莢膜糖、B群連鎖球菌莢膜糖、肺炎球菌莢膜糖、腸球菌莢膜糖又は黄色ブドウ球菌莢膜糖である。糖という用語はオリゴ糖及び多糖の両方を含む。

0240

一実施形態において、グラム陽性細菌莢膜糖は、肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F若しくは48莢膜糖である;又は肺炎球菌血清型2、3、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F若しくは48の莢膜糖の反復単位である;又は好適には、肺炎球菌血清型8、12F、14、15A、16F、22F、23A、24F、31、33F、35B若しくは38莢膜糖である。

0241

一実施形態において、グラム陽性細菌莢膜糖は、黄色ブドウ球菌血清型5又は8莢膜糖である。

0242

一実施形態において、グラム陽性細菌莢膜糖は、ストレプトコッカス・アガラクティエ(B群連鎖球菌)血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII又はVIII莢膜糖である。

0243

一実施形態において、グラム陽性細菌莢膜糖は、エンテロコッカス・フェカリス血清型A、B、C又はD莢膜糖である。

0244

一実施形態において、キャリアタンパク質は、緑膿菌の無毒化された外毒素A(EPA)、CRM197、マルトース結合タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌ニューモリシン及びその無毒化変異体、肺炎球菌PhtDタンパク質、C.ジェジュニAcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(別名LcrV、EspA、SseB)、PopB(YopB、YopD、FliC)、又はOprF、OprIである。一実施形態において、各キャリアタンパク質は、少なくとも1、2、3、4、5又は6つのグリコシル化コンセンサス配列(例えばAsn-X-Ser/Thr、より具体的にはAsp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr。ここでX及びZはPro以外の任意の天然アミノ酸であり得る)を含む。

0245

5.5組成物
宿主細胞を含む組成物
一態様では、本明細書において記載される宿主細胞を含む組成物が本明細書において提供される。このような組成物は、本明細書において記載されるバイオコンジュゲートを生成するための方法において使用することができ、例えば、組成物は、タンパク質の生成に適した条件下で培養され得る。その後、バイオコンジュゲートは、当技術分野で公知の方法を使用して、前記組成物から単離され得る。

0246

本明細書において提供される宿主細胞を含む組成物は、本明細書において記載される宿主細胞の維持及び生存に適したさらなる構成成分を含んでもよく、宿主細胞によるタンパク質の生成にとって必要又は有益なさらなる構成成分、例えば、アラビノース、IPTGなどの誘導プロモーターのための誘導物質をさらに含んでもよい。

0247

バイオコンジュゲートを含む組成物
別の態様では、本明細書に記載する1種以上のバイオコンジュゲートを含む組成物(例えば医薬組成物)を本明細書において提供する。具体的な実施形態において、本明細書で提供する組成物は、本明細書に記載する1種以上のバイオコンジュゲートを含む。本明細書に記載の組成物は、抗原性オリゴ糖及び/又は多糖を有することが知られる細菌による対象(例えばヒト対象)の細菌感染の治療及び予防に有用である。

0248

具体的な実施形態において、ハイブリッド肺炎球菌莢膜多糖を含むバイオコンジュゲートを含む組成物が本明細書中に提供される。別の具体的な実施形態において、それぞれが異なるハイブリッド肺炎球菌莢膜多糖を含む2つのバイオコンジュゲートを含む組成物(すなわち二価組成物)が本明細書中に提供される。別の具体的な実施形態において、それぞれが異なるハイブリッド肺炎球菌莢膜多糖を含む3つのバイオコンジュゲートを含む組成物(すなわち三価組成物)が本明細書中に提供される。具体的な実施形態において、前記肺炎球菌莢膜多糖は、CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP 26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)、又はCP48である。具体的な実施形態において、前記三価組成物は、(i)ハイブリッド肺炎球菌CP1莢膜多糖を含むバイオコンジュゲート;(ii)(i)ハイブリッド肺炎球菌CP4莢膜多糖を含むバイオコンジュゲート;及び(iii)(i)ハイブリッド肺炎球菌CP14莢膜多糖を含むバイオコンジュゲート、を含む。

0249

具体的な実施形態において、ハイブリッド黄色ブドウ球菌莢膜多糖(例えば黄色ブドウ球菌莢膜多糖がCP5又はCP8である)を含むバイオコンジュゲートを含む組成物が本明細書中に提供される。

0250

具体的な実施形態において、ハイブリッドストレプトコッカス・アガラクティエ(GBS)莢膜多糖、例えばS.アガラクティエ (B群、GBS) CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII、又はCPVIIIを含むバイオコンジュゲートを含む組成物が本明細書中に提供される。

0251

具体的な実施形態において、ハイブリッドエンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖、例えばエンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖CPA、CPB、CPC、又はCPDを含むバイオコンジュゲートを含む組成物が本明細書中に提供される。

0252

特定の実施形態において、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを含むことに加えて、本明細書に記載の組成物(例えば医薬組成物)は、製薬上許容される担体を含む。本明細書において使用する用語「製薬上許容される」とは、連邦若しくは州政府規制当局により認可されている、又は米国薬局方若しくは動物(より具体的にはヒト)における使用のために一般的に認識されている他の薬局方に記載されていることを意味する。製薬上許容される担体の文脈で本明細書において使用する用語「担体」とは、医薬組成物と一緒に投与される希釈剤助剤賦形剤又はビヒクルを指す。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた液体担体として、特に注射用液のために使用することができる。好適な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトーススクロースゼラチン麦芽、コメ、小麦粉白亜シリカゲルステアリン酸ナトリウムグリセロールモノステアレートタルク塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。好適な医薬担体の例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」(E.W. Martin著)に記載されている。

0253

本明細書において記載されるバイオコンジュゲートを含む組成物は、医薬投与において使用するのに適した任意のさらなる構成成分を含み得る。特定の実施形態では、本明細書において記載される組成物は、一価製剤である。その他の実施形態では、本明細書において記載される組成物は、多価製剤、例えば二価、三価及び四価製剤である。例えば、多価製剤は、2種以上の本明細書において記載されるバイオコンジュゲートを含む。

0254

ある特定の実施形態では、本明細書において記載される組成物は、保存料、例えば、水銀誘導体チメロサールをさらに含む。特定の実施形態では、本明細書において記載される医薬組成物は、0.001%〜0.01%のチメロサールを含む。その他の実施形態では、本明細書において記載される医薬組成物は、保存料を含まない。

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