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課題・解決手段

本発明は、ザクロ濃縮物ヒアルロン酸合成促進効果に関する。本発明によれば、澱粉分解酵素を処理し加熱濃縮工程を経て製造されたザクロ濃縮物が、エラグ酸を0.8mg/g以上、ポリフェノールを8mg/g以上の含み、ヒアルロン酸の合成促進効果を奏する。また、本発明によれば、ヒアルロン酸の合成促進が必要な対象に、ザクロ濃縮物を有効成分として含む食品または薬学組成物投与してヒアルロン酸の合成を促進させ、肌保湿を改善することに使用することができる。

概要

背景

ヒアルロン酸(hyaluronic acid)は、動物などの肌に多量存在する生体合成天然物質である。ヒアルロン酸は、ヒアルロナン(hyaluronan)とも称される。水酸化基(−OH)が多く親水性物質であり、動物などの肌で保湿作用をする。多様な上皮細胞発現されているCD44タンパク質と反応して多様な生理的作用を調節する。

一方、肌は外部と常に接する器官であって、外部から順に表皮真皮皮下脂肪組職の3つの層で大きく区分され、人体を外部の物理的及び/または化学的刺激から保護する機能をする。特に、肌は人体が有している約65〜70%の水分、すなわち人体に必要な各種の生理活性物質を運び、柔らかくてしっとりした状態を維持できるように、水分が体外に蒸発することを調節する重要な役割を果たす。

しかし、肌は、年を取るにつれて、内的には、老化の進行によって新進代謝を調節する各種ホルモン分泌が減少すると共に、免疫細胞の機能と細胞活性が低下して生体に必要な免疫及び生体タンパク質生合成が減るようになる。また、外的には、オゾン層破壊による太陽光線中の紫外線含量の増加と一層深刻化する環境汚染によってフリーラジカル及び有害活性酸素などが増加することで、肌の機能が低下するだけでなく視覚的な美しさが減少するようになる。

そこで、肌改善の有効性とともに安全性に優れた物質を見つけようとする研究が多く行われ、解決方案として化粧品のような外用的方法による肌状態の改善とともに、食餌摂取によって肌改善効果を奏する物質に関する研究が活発に行われている。

このような研究の一環として、肌改善効果を示す天然植物素材に対する関心が益々増加している。天然植物素材は、伝統的に数百年に亘って使用されて安全性や効果の側面で証明された物質が多数であるため、安全であって自然親和的である。

そこで、肌改善に効果的であると同時に安全な物質に対する必要性が増している。

概要

本発明は、ザクロ濃縮物のヒアルロン酸の合成促進効果に関する。本発明によれば、澱粉分解酵素を処理し加熱濃縮工程を経て製造されたザクロ濃縮物が、エラグ酸を0.8mg/g以上、ポリフェノールを8mg/g以上の含み、ヒアルロン酸の合成促進効果を奏する。また、本発明によれば、ヒアルロン酸の合成促進が必要な対象に、ザクロ濃縮物を有効成分として含む食品または薬学組成物投与してヒアルロン酸の合成を促進させ、肌保湿を改善することに使用することができる。

目的

本発明は、ヒアルロン酸の合成に効果的な天然植物素材を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

ヒアルロン酸合成促進が必要な対象に、ザクロ濃縮物を有効成分として含む食品組成物または薬学組成物投与する段階を含むヒアルロン酸の合成を促進する方法。

請求項2

前記対象はヒトであることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項3

前記ザクロ濃縮物は、総重量g当り0.8〜3mgのエラグ酸;及び/または総重量g当り8〜15mgのポリフェノールを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項4

前記ザクロ濃縮物は、ザクロ果実澱粉分解酵素を処理した後、加熱濃縮する工程を経て製造されたことを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項5

前記食品組成物は、強化食品食餌補充剤、ノンアルコール飲料スポーツ飲料果実飲料または牛乳ベース飲料、若しくは液状食品の形態であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項6

前記方法は、肌保湿改善に効果的であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項7

前記澱粉分解酵素の処理は、40〜65℃、60分以内で行うことを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項8

前記加熱濃縮は、3回以上、40〜110℃で加熱濃縮することを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項9

前記加熱濃縮は、順次70〜100℃、400〜850mbarで加温加圧して2回以上加濃縮し、40〜80℃、100〜350mbarで減温減圧して1回以上加熱濃縮することを特徴とする請求項8に記載の方法。

請求項10

前記加熱濃縮する段階は、70〜85℃、400〜550mbarで1次加熱濃縮、85〜92℃、550〜750mbarで2次加熱濃縮、92〜100℃、750〜850mbarで3次加熱濃縮、60〜80℃、250〜350mbarで4次加熱濃縮、及び40〜60℃、100〜250mbarで5次加熱濃縮することを特徴とする請求項8に記載の方法。

請求項11

前記加熱濃縮は、55〜90℃で1次加熱濃縮、105〜110℃で2次加熱濃縮、及び100〜105℃で3次加熱濃縮することを特徴とする請求項8に記載の方法。

請求項12

肌保湿改善が必要な対象に、ザクロ濃縮物を有効成分として含む食品組成物または薬学組成物を投与する段階を含む肌保湿を改善する方法。

請求項13

前記方法は、肌保湿改善と共に、しわ改善、美白、弾力向上及び角質除去からなる群より選択された1以上の効果をさらに奏することを特徴とする請求項12に記載の方法。

請求項14

ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理する段階及びザクロ分解物を加熱濃縮する段階を含み、ヒアルロン酸の合成促進能を有するザクロ濃縮物の製造方法。

請求項15

請求項14に記載の方法で製造されたザクロ濃縮物を有効成分として含むヒアルロン酸の合成促進効果のある肌保湿改善用食品または薬学組成物。

技術分野

0001

本発明は、天然植物素材を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進方法及びそれによって肌保湿しわ改善、美白または角質改善など肌を改善する方法に関する。

0002

本出願は、2014年7月22日出願の韓国特許出願第10−2014−0092819号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。

背景技術

0003

ヒアルロン酸(hyaluronic acid)は、動物などの肌に多量存在する生体合成天然物質である。ヒアルロン酸は、ヒアルロナン(hyaluronan)とも称される。水酸化基(−OH)が多く親水性物質であり、動物などの肌で保湿作用をする。多様な上皮細胞発現されているCD44タンパク質と反応して多様な生理的作用を調節する。

0004

一方、肌は外部と常に接する器官であって、外部から順に表皮真皮皮下脂肪組職の3つの層で大きく区分され、人体を外部の物理的及び/または化学的刺激から保護する機能をする。特に、肌は人体が有している約65〜70%の水分、すなわち人体に必要な各種の生理活性物質を運び、柔らかくてしっとりした状態を維持できるように、水分が体外に蒸発することを調節する重要な役割を果たす。

0005

しかし、肌は、年を取るにつれて、内的には、老化の進行によって新進代謝を調節する各種ホルモン分泌が減少すると共に、免疫細胞の機能と細胞活性が低下して生体に必要な免疫及び生体タンパク質生合成が減るようになる。また、外的には、オゾン層破壊による太陽光線中の紫外線含量の増加と一層深刻化する環境汚染によってフリーラジカル及び有害活性酸素などが増加することで、肌の機能が低下するだけでなく視覚的な美しさが減少するようになる。

0006

そこで、肌改善の有効性とともに安全性に優れた物質を見つけようとする研究が多く行われ、解決方案として化粧品のような外用的方法による肌状態の改善とともに、食餌摂取によって肌改善効果を奏する物質に関する研究が活発に行われている。

0007

このような研究の一環として、肌改善効果を示す天然植物素材に対する関心が益々増加している。天然植物素材は、伝統的に数百年に亘って使用されて安全性や効果の側面で証明された物質が多数であるため、安全であって自然親和的である。

0008

そこで、肌改善に効果的であると同時に安全な物質に対する必要性が増している。

発明が解決しようとする課題

0009

したがって、本発明は、ヒアルロン酸の合成に効果的な天然植物素材を提供することを技術的な課題とする。

0010

また、本発明は、ヒアルロン酸の合成に効果的な天然植物素材を有効成分として含む肌改善、特に保湿用組成物及びそれを用いて肌改善、特に保湿効果を向上させる方法を提供することを技術的な課題とする。

0011

また、本発明は、ヒアルロン酸の合成効果を向上させる天然植物素材組成物の加工方法を提供することを技術的な課題とする。

課題を解決するための手段

0012

上記の技術的課題を達成するため、本発明は、一態様として、ヒアルロン酸の合成促進が必要な対象にザクロ濃縮物を有効成分として含む食品または薬学組成物投与する段階を含むヒアルロン酸合成を促進する方法;及び/またはザクロ濃縮物を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進用組成物を提供する。

0013

望ましくは、前記ザクロ濃縮物中のエラグ酸が総重量g当り0.8mg以上であり、より望ましくは0.8〜3mgであり得る。

0014

また、望ましくは、前記ザクロ濃縮物中のポリフェノールが総重量g当り8mg以上であり、より望ましくは8〜15mgであり得る。

0015

本発明者は、ザクロ果実澱粉分解酵素を処理したザクロ分解物加熱濃縮する工程を経て製造されるザクロ濃縮物にヒアルロン酸の合成を促進する効果があり、このようなザクロ濃縮物を有効成分として含む組成物が優れた肌保湿効果を奏するとの驚くべき知見を得、このようなザクロ濃縮物は肌保湿効果と共に肌弾力の向上、色素沈着の改善、美白、肌つっぱりの改善、肌キメの改善、肌トーンの改善及び/または肌角質の減少などの肌改善に優れた効果を見せることを見出した。

0016

ザクロ(Punica granatum L.)は、アジア西部、インド西部及び米国カリフォルニア自生植物であって、現在は亜熱帯及び熱帯の各地に広く広がっている植物である。昔からザクロ、特に赤ザクロは強壮剤として知られ、特に、高血圧動脈硬化の予防に効果を奏すると知られている。また、水溶性糖質を38〜47%と多量含み、多様なビタミンミネラルを含む。

0017

本発明によるザクロ濃縮物は、ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理したザクロ分解物を加熱濃縮する工程を経て製造されるものを意味する。

0018

望ましくは、40〜65℃で澱粉分解酵素を処理でき、45〜60℃で澱粉分解酵素を処理することがより望ましい。澱粉分解酵素の処理時間は100分以内であることが望ましく、より望ましくは50〜70分、最も望ましくは約60分間処理することができる。

0019

また、3回以上加濃縮する段階を経ることが望ましい。より望ましくは、3回以上40〜110℃範囲内で加熱濃縮する段階を経ることができる。

0020

また、使用されるザクロの産地及び収獲時期などによって差があり得るが、最終ザクロ濃縮物の総重量g当りエラグ酸の含量が0.8mg以上、望ましくは0.8mg〜3mg、より望ましくは1.8mg〜3mg、さらに望ましくは2.4mg〜3mg、最も望ましくは2.7mg〜3mgになるザクロを使用することができる。また、最終ザクロ濃縮物の総重量g当りポリフェノールの含量が8mg以上、望ましくは8mg〜15mg、より望ましくは11.5mg〜13mg、さらに望ましくは11.79mg〜12.59mgになるザクロを使用することができる。エラグ酸の濃度が0.8mg/g未満であるか又はポリフェノールの濃度が8mg/g未満である場合は、ヒアルロン酸の合成促進効果が弱く、エラグ酸の濃度が3mg/gを超えるか又はポリフェノールの濃度が15mg/gを超える場合は、組成物を摂取したとき、肝機能数値であるGOTGPT正常範囲から外れるなどの副作用が発生する恐れがある。

0021

上述したように、ヒアルロン酸の合成促進能を有するザクロ濃縮物を使用できる理由は、後述する特定の製造方法、特に、澱粉分解酵素の処理方法、ザクロ濃縮物の濃縮方法加熱温度及び圧力などに因ると推測されるが、本発明がこのような事項に限定されることはない。より具体的に、本発明の具体的な実施例によれば、ザクロ果実を圧搾して得たザクロジュースと比べて、ザクロ果実を圧搾し澱粉分解酵素を処理した後、加熱濃縮する段階を経たザクロ濃縮物の場合、ヒアルロン酸合成促進効果の側面で格段に優れることが分かった。天然のザクロ果実に存在する多様な糖または同じ構造が繰り返して付着している構造の成分が、澱粉分解酵素の処理及び/または加熱濃縮による化学的処理工程によって非配糖体転換され、これら転換された成分による複合機序による効果であると推測されるが、本発明がこのような事項に限定されることはない。一例として、本発明によるザクロ濃縮物のポリフェノール類含量は、同じ濃縮倍数のザクロジュースのポリフェノール類含量に比べて格段に多量含まれている。

0022

本発明におけるザクロは、例えば、イラン産ザクロトルコ産ザクロ、米国産ザクロまたはこれらの混合物を使用でき、例えばトルコ産ザクロの品種にはHicaznar pomegranate cv.、Cekirdeksiz VI pomegranate cv.、Silifke Asisi pomegranate cv.、Katirbasi pomegranate cv.またはLefan pomegranate cv.などがあるが、これらに制限されない。

0023

本発明によるザクロ濃縮物を製造するため、ザクロ果皮と種を含まないザクロ果肉のみを使用することができる。ザクロの果皮と種は副作用を引き起こす恐れがあるが、例えば、ザクロ果皮に含まれたアルカロイド(alkaloid)は身体機能を低下させ得、呼吸系筋肉に影響を及ぼすため、中毒すれば発作痙攣昏睡状態などが起き得る。また、ザクロ種の濃縮物を服用すれば、一部でアレルギーである腫れなどの副作用が生じ得る。

0024

他の様態として、本発明は、ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理する段階及びザクロ分解物を加熱濃縮する段階を含み、ヒアルロン酸の合成促進能を有するザクロ濃縮物の製造方法を提供する。

0025

本発明によるザクロ濃縮物は、次のような方法で製造することができる。ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理する段階及びザクロ分解物を加熱濃縮する段階を含む方法で製造することができる。例えば、先にザクロを洗浄した後、皮と種を完全に除去し、短時間殺菌し、澱粉分解酵素を添加してザクロに含まれている澱粉など多糖類を分解する。その後、選択的にゼラチン二酸化ケイ素ベントナイトシリカゾル(silicasol)、タンニンセルロースまたはカゼインカリウムなどの添加剤を添加してザクロ濃縮物の濁度色相、粘度などを調節し、加熱濃縮してザクロ濃縮物を製造することができる。また、各段階の間に濾過する段階をさらに含むことができ、例えば、皮と種を除去する段階と高温殺菌する段階との間、澱粉分解酵素を処理する段階と濃縮段階との間、または濃縮段階の後のいずれか1つ以上の段階で濾過する工程をさらに含むことができる。

0026

ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理したザクロ分解物を得る工程は、より具体的に下記のような段階を含むことができる:
S1)イラン産ザクロ、トルコ産ザクロ、米国産ザクロまたはこれらの混合物から皮と種を除去してザクロ果肉のみを得る段階
一実施例によれば、ザクロの皮と種を含まないザクロ果肉のみを使用した濃縮物を提供する。

0027

S2)ザクロ果肉を殺菌する段階
ザクロ果肉は順次殺菌する段階を経る。高温殺菌または低温殺菌することができ、短時間(例えば、50〜80秒間)行うことが望ましい。

0028

S3)殺菌したザクロ果肉に澱粉分解酵素を処理する段階
殺菌したザクロ果肉に澱粉分解酵素を処理する段階を経る。望ましくは40〜65℃で澱粉分解酵素を処理することができ、45〜60℃で澱粉分解酵素を処理することがより望ましい。また、酵素処理時間は、望ましくは100分以内、より望ましくは50〜70分、さらに望ましくは60分以内であり、約60分であることが最も望ましい。使用可能な澱粉分解酵素は、特に制限されず、当業界で知られた多様な澱粉分解酵素が使用でき、例えばペクチナーゼ(pectinase)、プロテイナーゼ(proteinase)、アミラーゼセルラーゼなどを使用することができるが、ペクチナーゼを使用することが望ましい。

0029

ザクロ分解物を加熱濃縮する工程は、望ましくは3回以上繰り返して加熱濃縮し、40〜110℃範囲で行うことができる。より具体的に、下記のように2種の方式で加熱濃縮することができる:
S4−1)ザクロ果肉分解物を順次70〜100℃及び400〜850mbarで加温加圧して2回以上加熱濃縮し、40〜80℃及び100〜350mbarで減温減圧して1回以上加熱濃縮する段階によって加熱濃縮することができる。

0030

ザクロ果肉分解物を順次加温加圧して加熱濃縮し、減温減圧して加熱濃縮する段階を経る。

0031

望ましくは、加温加圧して2回以上、より望ましくは3回以上加熱濃縮し、減温減圧して1回以上、さらに望ましくは2回以上加熱濃縮することができ、総3回以上加熱濃縮することができる。

0032

加温加圧して加熱濃縮することは、温度条件70〜100℃及び圧力条件400〜850mbarの範囲で行われ、加熱濃縮次数回数)毎に温度及び圧力を変えるが、前記温度及び圧力範囲内で温度を上げて圧力を加えるものであれば、制限されず本発明の範囲に含まれ得る。望ましくは、70〜85℃、400〜550mbarで1次加熱濃縮、85〜92℃、550〜750mbarで2次加熱濃縮、及び92〜100℃、750〜850mbarで3次加熱濃縮することができる。より望ましくは、78〜82℃、450〜500mbarで1次加熱濃縮、85〜90℃、600〜650mbarで2次加熱濃縮、及び92〜98℃、800〜850mbarで3次加熱濃縮することができる。

0033

減温減圧して加熱濃縮することは、温度条件40〜80℃及び圧力条件100〜350mbarの範囲で行われ、加熱濃縮次数(回数)毎に温度及び圧力を変えるが、前記温度及び圧力範囲内で温度を下げ減圧するものであれば、制限されず本発明の範囲に含まれ得る。望ましくは、60〜80℃、250〜350mbarで4次加熱濃縮及び40〜60℃、100〜250mbarで5次加熱濃縮することができる。より望ましくは、65〜72℃、300〜330mbarで4次加熱濃縮及び45〜55℃、100〜150mbarで5次加熱濃縮することができる。

0034

または、
S4−2)55〜90℃で1次加熱濃縮、105〜110℃で2次加熱濃縮、及び100〜105℃で3次加熱濃縮することができる。

0035

一実施例によれば、本発明によるザクロ濃縮物は、ヒアルロン酸の合成を促進する効果を有するため、ヒアルロン酸合成増加による有利な生理的効果を期待することができる。例えば、肌保湿改善に効果的である。

0036

そこで、一態様として、肌保湿を改善する方法;及び/または肌保湿用組成物を提供することができる。より具体的に、ザクロ濃縮物を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進用組成物を含む肌保湿用組成物を提供することができる。また、一態様として、肌保湿の改善が必要な対象にザクロ濃縮物を有効成分として含む食品または薬学組成物を投与する段階を含む肌保湿を改善する方法を提供することができる。

0037

また、一態様として、ザクロ濃縮物を有効成分として含む組成物を、分離した細胞にインビトロ(in vitro)処理してヒアルロン酸の合成を促進する方法を提供することができる。

0038

前記対象は、例えばげっ歯類哺乳類などを含む動物が該当し、望ましくはヒトである。

0039

また、前記細胞は、例えばげっ歯類、哺乳類などを含む動物から由来した細胞であり、望ましくはヒト由来であり得る。

0040

さらに、本発明者は、ザクロ濃縮物は上述したヒアルロン酸合成促進能の外にも、MMP−1及びエラスターゼ(elastase)を濃度依存的に減少させてしわを改善する効果があり、メラニンを濃度依存的に減少させて美白に優れた効果があることを確認した。また、臨床評価を通じて、角質の除去、弾力向上、色、しわ、美白などの全般的な肌改善に顕著な効果があることを確認した。

0041

そこで、本発明によるザクロ濃縮物を有効成分として含む組成物は、肌保湿の外に、全般的な肌改善のために使用でき、例えば肌弾力の向上、色素沈着の改善、美白、肌つっぱりの改善、肌キメの改善、肌トーンの改善及び/または肌角質の減少、望ましくは、保湿の外にしわ改善、美白、弾力向上及び角質改善からなる群より選択された1以上の肌改善効果のために使用することができる。

0042

本発明による組成物は、ヒアルロン酸不足症状及び/または肌保湿不足症状が現れた後投薬しても良いが、ヒアルロン酸不足及び/または肌保湿不足が予想または診断される場合予め服用することも望ましい。

0043

本発明による組成物は、上述した効果を目的とする多様な用途で活用でき、例えば食品(健康機能食品を含む)組成物、薬学組成物または化粧料組成物に使用することができる。

0044

そこで、本発明は、上述した組成物を含む食品組成物、薬学組成物または化粧料組成物を提供する。より具体的に、上述した方法で製造されたザクロ濃縮物を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進効果のある肌保湿改善用食品、薬学組成物または化粧料組成物を提供することができる。

0045

ここで、「食品」とは、健康補助食品、健康機能食品、機能性食品などを含み、これらに制限されず、天然食品加工食品、一般的な食材などに本発明によるザクロ濃縮物を添加したものも含むことができる。

0046

本発明による食品組成物は、ザクロ濃縮物の外に、他の食品または食品組成物と共に使用でき、通常の方法によって適切に使用することができる。天然植物濃縮物、例えば、白芍薬山茱萸五加皮霊芝陳皮、杜当帰梔子、皇耆、麦芽カラタチ;及びビタミンCフラクトオリゴ糖ステビオシド精製水、またはマルトデキストリンなどを、本発明の目的から逸脱しない範囲内で単独で又は混合してさらに含むことができるが、本発明の食品がさらに包含できる他の薬効成分及び/または添加剤は上記の例に限定されない。例えば、本発明による食品は、水溶性ビタミンとしてチアミンビタミンB1)、リボフラビンアスコルビン酸ナイアシン及びビタミンB6を含むことができ、脂肪酸としてミリスチン酸パルミチン酸ステアリン酸オレイン酸リノレン酸などを含むことができ、弱酸成分としてグリコール酸及び酢酸を含むことができ、アミノ酸としてトレオニンバリンメチオニンイソルシン、ルシン、フェニルアラニントリプトファン及びリシン必須アミノ酸8種を含めて、アスパラギン酸セリングルタミン酸プロリングリシンアラニンシステインチロシンヒスチジンアルギニンなどを含むことができる。有効成分の混合量は、その使用目的に応じて(予防、改善または治療的処置など)好適に決定することができる。一般に、本発明による食品組成物は、食品または飲料の製造時、最終製品に対して10重量%〜90重量%で添加することができる。食品組成物のザクロ濃縮物の有効用量は、薬学組成物の有効用量に準じて使用できるが、長期間摂取する場合は、上記の範囲以下であり得、有効成分は安全性の側面で何ら問題もないため、上記の範囲以上の量で使用しても良い。

0047

本発明による食品の種類には特別な制限がない。例えば、錠剤硬質または軟質カプセル剤液剤懸濁剤などの経口投与用製剤の形態で使用でき、これら製剤は許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合は、賦形剤結合剤崩壊剤滑沢剤可溶化剤懸濁化剤保存剤または重量剤などを使用して調剤することができる。

0048

本発明による食品形態の例には特に制限がない。例えば、強化食品(fortified food)、食餌補充剤(dietary supplement)、ノンアルコール飲料(non−alcoholic drink)、スポーツ飲料(sport drink)、果実飲料(fruit drink)、または牛乳ベース飲料(tea or milk based drink)、若しくは液状食品(liquid food)の形態であり得るが、これらに制限されない。

0049

本発明による薬学組成物は、経口的または非経口的に投与でき、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。望ましい薬剤学的製剤は、錠剤、硬質または軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤などのような経口投与用製剤があり、これら薬剤学的製剤は薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤または重量剤などを使用して調剤することができる。

0050

本発明によるザクロ濃縮物を有効成分として含む薬学組成物の投与用量は、患者の状態、年齢性別及び合併症などの多様な要因に応じて専門家によって決定できるが、一般には、成人体重1kg当り0.1mg〜10mg、望ましくは10mg〜1gの用量で投与することができる。また、単位剤形当り前記薬学組成物の1日用量またはその1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9または1/10の用量が含有され、1日1〜10回投与できる。しかし、長期間摂取する場合は、上記の量は上記の範囲以下であり得、有効成分は安全性の側面で何ら問題もないため、上記の範囲以上の量で使用しても良い。一実施例によれば、本発明によるザクロ濃縮物を1日に10ml服用する場合、服用後にも人体の健康指標(例えば、赤血球数RBC)、血液尿素窒素(BUN)数値、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(aspartate aminotransferase;AST)数値、アラニンアミノ基転移酵素(alanine aminotransferase;ALT)数値、クレアチン数値、グルコース数値、S−G数値など)がすべて正常範囲内にあり、生体に副作用なく、安全にヒアルロン酸合成促進効果及び/または保湿を含む肌改善の効果を達成することができる。

発明の効果

0051

本発明によれば、ザクロ濃縮物を通じてヒアルロン酸合成促進効果を期待でき、顕著な肌保湿効果は勿論、外にも肌しわの改善、美白及び角質除去などに優れた効果を期待することができる。

図面の簡単な説明

0052

ザクロ濃縮物のHaCaT細胞に対する毒性試験結果を示した図である。
ザクロ濃縮物のヒアルロナン生成能試験を用いて保湿効能を評価した結果を示した図である(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.005)。
ザクロ濃縮物のHDFN細胞に対する毒性試験結果を示した図である。
ザクロ濃縮物のメラン−A(melan−A)細胞に対する毒性試験結果を示した図である。
プロコラーゲン合成能試験を用いてしわ改善効能を評価した結果を示した図である(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.005)。
MMP−1抑制能試験を用いてしわ改善効能を評価した結果を示した図である(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.005)。
エラスターゼ抑制能試験を用いてしわ改善効能を評価した結果を示した図である(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.005)。
チロシナーゼ抑制活性分析を通じて美白効能を評価した結果を示した図である。
メラニン合成抑制能試験を用いて美白効能を評価した結果を示した図である。
メラニン合成抑制試験を通じてメラニン細胞を観察した結果を示した図である。
時点毎目元しわを目視で評価した結果を示した図である。
製品服用による被験者の目元しわの程度変化を示した図である。
時点毎に製品服用による肌水分量の変化を示した図である。
時点毎に製品服用による経皮水分損失量の変化を示した図である。
時点毎に製品服用による肌角質量の変化を示した図である。
製品服用による被験者の顔及び前膊部位の肌角質量の変化を示した図である。
時点毎に製品服用による目元しわ(レプリカ)の変化を示した図である。
製品服用による被験者の目元しわの程度変化を示した図である。
時点毎に製品服用による肌弾力パラメータの変化を示した図である。
時点毎に製品服用による肌弾力パラメータの変化を示した図である。
時点毎に製品服用による肌弾力パラメータの変化を示した図である。
時点毎に製品服用による肌弾力パラメータの変化を示した図である。
時点毎に製品服用による肌色の明るさの変化を示した図である。
製品服用による被験者の肌色の明るさの変化を示した図である。

実施例

0053

以下、本発明の理解を助けるために実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態で変形でき、本発明の範囲が後述される実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。

0054

<製造例>ザクロ濃縮物の製造
試験例1.加熱濃縮工程を経たザクロ濃縮物の製造
(1)12NK26の製造
まず、トルコ産ザクロ1000kgの異物を除去し、割れ果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、圧搾して種を分離することでザクロ果肉450kgを得た。濾過後、100〜105℃で60秒間殺菌し、48〜55℃に冷却した。ペクチナーゼをザクロジュース1000L当り70〜100ml投入し、48〜55℃で1時間澱粉を分解した。その後、濁度及び色相の維持、服用に有利な粘度のため、ザクロジュース10000L当りベントナイト900gを投入し、48〜55℃で10分間撹拌した。次いで、1.5mm及び1mm真空濾過し、加熱濃縮(順次に、70〜85℃、400〜550mbarで12brixまで、85〜92℃、550〜750mbarで17brixまで、92〜100℃、750〜850mbarで31Brixまで、60〜80℃、250〜350mbarで43Brixまで、そして40〜60℃、100〜250mbarで65Brixまで総5次加熱濃縮)した後、さらに0.15mm濾過して、エラグ酸1.8〜3.0mg/g及びポリフェノール12.59mg/g(没食子酸発色法によって分析した数値)を含むザクロ濃縮物を製造した。ザクロ濃縮物の果実:濃縮物の重量比は10:1であった。該ザクロ濃縮物を試料12NK26と称する。

0055

(2)12910910の製造
まず、イラン産ザクロの異物を除去し、割れた果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、160barで圧搾して種を分離した。その後、低温殺菌し、ペクチナーゼをザクロジュース6000L当り100〜150g投入して48〜60℃で1時間澱粉を分解した。その後、濁度及び色相の維持、服用に有利な粘度のため、ザクロジュース6000L当りゼラチン1200〜1800g、二酸化ケイ素6000g、及びザクロジュース10000L当りベントナイト14kgを投入し、50〜60℃で30分間撹拌した。次いで、真空濾過し、加熱濃縮(順次に、55〜90℃(3分間)、105〜110℃(90秒間)、及び100〜105℃(90秒間))して、エラグ酸0.8〜1.4mg/g及びポリフェノール11.79mg/g(没食子酸発色法によって分析した数値)を含むザクロ濃縮物を製造した。果実:ザクロ濃縮物の重量比は5:1であった。該ザクロ濃縮物を試料12910910と称する。

0056

比較例1.ザクロジュース(921217)の製造
まず、トルコ産ザクロ1000kgの異物を除去し、割れた果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、圧搾して種を分離することでザクロ果肉450kgを得た。濾過後、90〜94℃で20秒間殺菌し、15〜20℃に冷却して、エラグ酸含量0.2〜0.32mg/g及びポリフェノール含量0.7〜1.55mg/g(没食子酸発色法によって分析した数値)を含むザクロジュースを製造した。ザクロジュースの果実:ジュースの重量比は2:1であった。該ザクロジュースを試料921217と称する。

0057

<実施例2>ザクロ濃縮物のヒアルロナン合成促進効果の評価
1.試験材料
前記試料12NK26、12910910、921217の液相原液を100%と見なし、細胞培地で適切な濃度に希釈して検液を製造した。また、WST−1アッセイを通じて予備実験を行った後、細胞毒性を示さない濃度を設定して検液の肌関連効能を評価した。陽性対照群細胞培養培地で希釈して処理した。

0058

0059

2.細胞株及び培養
保湿効能試験で使われる細胞株は、ヒト角質細胞であるHaCaT細胞(Human Keratinocyte、HaCaT、ATCC)で培養皿の底に接種した後、ペニシリン(100 IU/ml)、ストレプトマイシン(10 μg/ml)、10%FBSを含むダルベッコ改変イーグル培地DMEM、Welgene、韓国)を入れて37℃に維持し、5%二酸化炭素を含む培養器内で培養した。

0060

3.細胞毒性試験
検液の毒性を確認するため、HaCaT細胞における細胞毒性を測定した。HaCaT細胞を96ウェルプレートにそれぞれ5×104細胞/ウェルに分株した後、細胞培養条件で24時間培養した。培養後、12時間の飢餓状態を維持した後、検液及び新たな培地(培地サプリメントを除く)を入れて、24時間培養した。24時間後、細胞の生存率を測定するため、WST−1反応液をサプリメントが除外された培地で1/10に希釈して、それを各ウェル当り100μlずつ処理して1時間反応させた後、450nmで吸光度を測定した。

0061

その結果、HaCaT細胞に対して試料3種のうち12NK26は0.5%以下で80%以上の細胞生存率、921217は1%以下で80%以上の細胞生存率、そして12910910は0.5%以下で80%以上の細胞生存率を示した。

0062

0063

4.ヒアルロナン合成増加試験
角質細胞におけるヒアルロナンの合成程度をELISAで測定することで試料の保湿効能を評価した。そのため、HaCaT細胞をプレートに5×104細胞/ウェルに分株して24時間培養した。24時間後、試験物質を細胞培養培地であるDMEM(培地サプリメントを除く)に希釈し、濃度毎に細胞に処理した後、24時間培養した。その後、培養された細胞の培地を回収し、ヒアルロナンELISA(R&D system、DY3614)を使用してヒアルロナン量を測定した。一方、底に付着している細胞はPBSで洗浄した後、1N NaOHで溶解(lysis)させて総タンパク質量を測定し、一定タンパク質当りヒアルロナン合成量を計算した。

0064

*タンパク質量測定法
タンパク質測定法のうちローリー法(Lowry method)に基づくBio−Rad DCプロテインキットを使用して測定した。

0065

(1)細胞溶解物上澄液)をそれぞれ5μlずつ96ウェルプレートに入れる。

0066

(2)プロテインスタンダード(protein standard)の製造
1.5mg/ml濃度のウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin(BSA)、Bio−Rad、500−0007)を細胞溶解バッファに8種の濃度に希釈して5μlずつ96ウェルプレートに入れる。

0067

(3)キットに含まれた試薬Aと試薬Sとを40:1の比率で混ぜて各ウェルに25μlずつ入れる。

0068

(4)キットに含まれた試薬Bをそれぞれ200μlずつ入れる。

0069

(5)常温で15分間反応させた後、750nmで吸光度を測定する。

0070

(6)BSA検量線に沿って細胞の総タンパク質量を計算する。

0071

5.統計
全ての資料は平均±標準偏差で示し、統計処理スチューデントt検定を使用し、有意確率P<0.005、両側検定を使用した。

0072

6.結果
本試験は、ELISAを用いてヒアルロナン合成様相を測定することで、試料12NK26、921217、12910910の3種がヒアルロナン合成に及ぼす影響を評価しようとした。そのため、試料を処理した後、ヒアルロナンELISAキット(R&D system、DY3614)で測定した。その結果、12NK26は対照群に比べて0.01%、0.05%、0.1%の濃度でそれぞれ179.6%、214.4%、305.1%のヒアルロナンが測定され、濃度依存的に増加する傾向を見せた。特に、3つの濃度全てで統計的に有意にヒアルロナンの合成が増加した。一方、921217は0.1%、0.5%、1%の濃度で対照群に比べてそれぞれ84.0%、98.3%、106.2%のヒアルロナンが測定され、3つの濃度全てで統計的有意差は示さなかった。また、12910910は対照群に比べて0.01%、0.05%、0.1%の濃度でそれぞれ162.4%、262.4%、298.2%のヒアルロナンが測定され、濃度依存的に増加する傾向を見せた。特に、3つの濃度全てで統計的に有意にヒアルロナンの合成が増加した。また、陽性対照群として使用したNAGは、20mMを処理したとき、対照群に比べて224.8%のヒアルロナンが生成され、HaCaT細胞はNAGによってヒアルロナンの生合成が促進されることが分かった(表3及び図2参照)。

0073

0074

<実施例3>ザクロ濃縮物の肌生理活性効果の評価
1.試験材料
本試験で使用される検液は、上述した<試験例1>の方法で製造されたザクロ濃縮物(すなわち、試料12NK26)の液相原液を100%と見なし、細胞培地で適切な濃度に希釈して製造した。また、WST−1アッセイを通じて予備実験を行った後、細胞毒性を示さない濃度を設定して検液の肌関連効能を評価した。陽性対照群も細胞培養培地で希釈して処理した。

0075

その他、本試験で使った試験材料は下記のようである。

0076

0077

2.細胞株及び培養
細胞株は試験項目によって適切に選別して使用した。しわ改善試験ではヒト新生児包皮に由来した正常ヒトプライマリー皮膚線維芽細胞新生児(Normal Human Primary Dermal Fibroblasts−Neonatal;HDF−N)を使用し、培養皿の底に接種した後、0.1%インシュリン、0.1% rhFGF、0.1%ゲンタマイシン、2% FBSを含む線維芽細胞基本培地(FBM、lonza、CC−3131)培地を入れて37℃に維持し、5%二酸化炭素を含む培養器内で培養した。

0078

美白効能評価で使用されるメラン−A(melan−A)細胞は、C57BL/6J(black、a/a)マウスに由来した不死化細胞系(immortalized cell line、Bennett DC、Cooper PJ、Hart IR.A line of non−tumorigenic mouse melanocyte、syngeneic with the B16 melanoma and requiring a tumor promoter for growth.Int J Cancer 1987;39:414〜418)であって、Dr.Dorothy C Benette(St George’s Hospital、London、UK)から提供を受けて使用した。細胞は、RPMI1640培地にウシ胎児血清10%、50U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、200nMのホルボール12−ミリスタート13−アセタート(PMA)を添加した培地で37℃、10%CO2条件下で培養した。

0079

3.細胞毒性試験
検液の毒性を確認するため、HDF−N細胞及びメラン−A細胞における細胞毒性を測定した。HDF−N細胞及びメラン−A細胞を96ウェルプレートにそれぞれ6×103細胞/ウェル、9×103細胞/ウェルに分株した後、細胞培養条件で24時間培養した。培養後、12時間飢餓状態を維持した後、検液及び新たな培地(培地サプリメントまたはFBSを除く)を入れて、24時間培養した。24時間後、細胞の生存率を測定するため、WST−1反応液をサプリメントが除外された培地で1/10に希釈し、それを各ウェル当り100μlずつ処理して1時間反応させた後、450nmで吸光度を測定した。

0080

その結果、試料ザクロ濃縮液は、HDF−N細胞に対して0.1%以下の濃度で80%以上の細胞生存率を示し(表5)、メラン−A細胞に対して0.05%以下で80%以上の細胞生存率を示した(表6)。

0081

0082

0083

4.しわ改善効能の評価
4−1.プロコラーゲン(Procollagen)増加試験
検液のプロコラーゲン合成能を評価するため、HDF−N細胞を48ウェルプレートに1×104細胞/ウェルに分株して細胞培養条件で24時間培養した。その後、培地を除去し、24時間細胞の飢餓状態を維持した後、試験物質を細胞培養培地であるFBM(培地サプリメントを除く)で希釈して濃度毎に細胞に処理し、24時間培養した。その後、培養された細胞の培地を回収してプロコラーゲンI型ペプチド(PIP)EIAキット(TAKARA、MK101)を使用してプロコラーゲン量を測定した。一方、底に付着している細胞はPBSで洗浄した後、1N NaOHに溶解させて総タンパク質量を測定し、一定タンパク質当りプロコラーゲンの合成量を計算した。

0084

その結果、陽性対照群として使用したTGF−βは、10ng/mlを処理した結果、対照群に比べて150.8%のプロコラーゲンが生成され、HDF−N細胞はTGF−βによってプロコラーゲンの生合成が促進されることが分かった。一方、試料を0.01%、0.05%、0.1%の濃度で処理した後、プロコラーゲン合成能を評価した結果、それぞれ96.3%、53.3%、53.0%のプロコラーゲン生成を見せ、対照群に比べて統計的有意差は示さなかった(表7)。

0085

0086

4−2.紫外線によるMMP−1発現抑制試験
本試験を通じて検液が紫外線によるMMP−1発現に及ぼす影響を評価した。MMP−1(マトリックスメタロプロテアーゼ;Matrix metalloproteinases)の活性程度を免疫ELISAアッセイを使用して測定することで、試料のしわ改善効能を評価するためである。HDF−N細胞を24ウェルプレートに2×104細胞/ウェルに分株した後、細胞培養条件で24時間培養した。24時間後、培地を捨ててDPBSで洗浄し、DPBS 200μlを添加してUV−A 5J/cm2を照射した。試料を培地で適切な濃度に希釈した後、細胞に処理して細胞培養条件で24時間培養した。その後、培養液採取してヒトトータルMMP−1 ELISAキット(R&D system、DY901)でMMP−1の量を測定し、測定されたMMP−1の量は総タンパク質量で補正した。

0087

その結果、UVA照射群は非照射群に比べてMMP−1が240.2%生成され、それを通じてHDF−N細胞はUVA 5J/cm2によってMMP−1の発現が誘導されることが分かった。一方、HDF−N細胞にザクロ濃縮液を0.001%、0.005%、0.01%の濃度で処理した後、ヒトトータルMMP−1ELISAキット(R&D system、DY901)で測定した結果、UV非照射群に比べてそれぞれ137.1%、69.3%、7.1%のMMP−1の生成を示して、濃度依存的に減少する傾向を見せ、UV照射群に比べて統計的に有意に減少した。また、本試験で使用された陽性対照群であるレチノイン酸は、UV非照射群に比べて171.6%のMMP−1生成を示して、UV照射群に比べて統計的に有意に減少した。

0088

0089

4−3.エラスターゼ抑制分析(Elastase inhibition assay)
本試験は、検液のエラスターゼ活性を測定するため、肌線維芽細胞であるHDF−N細胞を酵素エラスターゼとして使用した。そのため、培養されたHDF−N細胞に0.1%トリトンX−100が含有された0.2Mトリス−HCl(pH 8.0)を添加した後、超音波粉砕機を用いて溶かした後、3,000rpmで20分間遠心分離して上澄液を採取し、それを定量して総タンパク質量で酵素の活性を測定した。

0090

試料のエラスターゼ活性測定のため、均質化された線維芽細胞エラスターゼ200μg/ml、0.2Mトリス−HCl緩衝液及び試料を濃度毎に添加した後、エラスターゼ特異的な基質である50mM STANAを入れて37℃で培養し、405nmで吸光度を測定した。効能は検液を入れていない対照群に比べてエラスターゼ活性抑制程度を計算した。陽性対照群としてはホスホラミドン(phosphoramidon)を使用した。

0091

ザクロ濃縮液を0.05%、0.1%、1%の濃度で反応させた後、405nmで測定した結果、対照群に比べてそれぞれ92.3%、89.5%、63.6%のエラスターゼ活性が測定され、濃度依存的に減少する傾向を見せた。特に、3つの濃度全て対照群に比べて統計的に有意に減少した。また、本試験で使用された陽性対照群であるホスホラミドンは対照群に比べて74.9%のエラスターゼ活性が測定され、統計的に有意に減少した。

0092

0093

5.美白効能の評価
5−1.チロシナーゼ抑制分析(Tyrosinase inhibition assay)
検液をエタノールや適切な溶媒に溶かしてチロシナーゼ活性を抑制するための適切な濃度範囲に希釈したものを試料液にした。試験管に0.1Mのリン酸緩衝液220μl、試料液20μl、そしてマッシュルームチロシナーゼ(1500 U/mL〜2000 U/mL)液20μlを順に入れ、該溶液に1.5mMのチロシン液40μlを入れて37℃で10〜15分間反応させた。そして、それをELISAリーダーを用いて490nmで吸光度を測定した。空試料液として試料液の代わりに0.1Mのリン酸緩衝液(pH 6.5)を入れる。活性阻害率が50%であるときの試料の濃度(IC50)を適切なプログラムを用いて算出した。

0094

0.1%濃度以下のチロシナーゼ酵素活性抑制率を測定した結果、ザクロ濃縮液は濃度0.1%までチロシナーゼ酵素の活性を抑制することができなかった。一方、陽性対照群として使用したコウジ酸(Kojic acid)のIC50値は3.634ppmと測定された。

0095

0096

5−2.メラニン合成阻害試験
メラン−A細胞を3×104細胞/ウェルになるように24ウェルプレートに分株した後、細胞がプレートによく付着するように24時間細胞培養器で培養した後、各ウェル当り多様な濃度に希釈された検液が入っている培地を入れた。実験試料は濃度毎に培地に溶かして使用した。同じ方法で実験試料を3日に一回ずつ、6日間処理した。細胞内のメラニンは光学顕微鏡(bright field microscope)で確認した。その後、細胞は細胞溶解バッファに溶かした後、遠心分離を通じて上澄液を分離してタンパク質定量し、メラニンは1NのNaOHを添加して405nmで吸光度を測定して、測定したタンパク質量に対するメラニン量換算した。

0097

その結果、検液を処理しない対照群に比べてそれぞれ95.4%、86.3%、67.1%のメラニン合成が測定され、統計的に有意に濃度依存的に減少した。陽性対照群として使用したアルブチンを10μM処理した結果、濃度依存的なメラニン合成抑制効能を示した。

0098

0099

6.統計
全ての資料は平均±標準偏差で示し、統計処理はスチューデントのt検定を使用し、有意確率P<0.005、両側検定を使用した。

0100

<実施例4>ザクロ濃縮物の肌生理活性効果に対する臨床評価
<実施例4−1>実験方法
1.被験者選定
乾燥肌であり、目元しわ、色素沈着が生じ始めたか又は既に生じた25〜60歳の女性被験者62名を対象に実験を行った。選定された被験者に上述した<試験例1>の方法で製造したザクロ濃縮物(すなわち、試料12NK26)含有飲料試験製品)とザクロ濃縮物未含有飲料(対照製品)とを二重盲検無作為割り当てて8週間毎日1包ずつ(50ml/包)服用させた後、試験製品の服用前、服用4週後、8週後の各時点で、目視評価、肌水分量、肌角質量、TEWL(Trans Epidermal Water Loss)、目元しわ(レプリカ)、肌弾力、肌色の明るさ(L*値)及びアンケート評価、安全性評価、食餌調査、体重(BMIを含む)調査を行って肌改善効果を評価した。また、製品服用前と服用8週後の時点で血液検査を行った。

0101

ザクロ濃縮物(すなわち、試料12NK26)含有飲料(試験製品)とザクロ濃縮物未含有飲料(対照製品)に含まれた成分及び含量は次のようである:

0102

0103

2.測定及び評価
被験者は、ブロクランダム化(block randomization)を通じて対照製品グループと試験製品グループとに分け、被験者の顔、左側前膊または右側前膊を測定部位にした。顔では、被験者の顔の目尻先とが接する頬部位(水分量、角質、TEWL、弾力、色測定)、色素沈着部位(色測定)、目じりの小じわ(crow’s feet)部位(しわ測定)を対象にし、前膊内側は前膊内側の屈側部位から5cm離れた部位を対象にした。被験者は、洗顔した後、空気の移動と直射光線のない恒温恒湿条件(22±2℃、50±5%)が保たれる空間で30分間肌を安定させた後、目視評価、機器測定(肌水分量、角質量、経皮水分損失量、肌弾力、色、目元しわ−レプリカ)、アンケート評価、体重(BMI)測定、食餌調査及び安全性評価に参加した。

0104

3.目視評価
目視評価は、被験者の目元しわの程度を2名の試験者が、2005.7食品医薬品安全処機能性化粧品の有効性評価のためのガイドラインIIに開示された目視評価基準に基づいて、0〜9段階で評価した。時点毎の目尻部位のしわの状態は顔面撮影装置(VISIA、Canfield Imaging System、米国)を使用して撮影FLmode)した。

0105

0106

4.機器測定
機器測定は、製品服用前、服用4週後、服用8週後の時点でそれぞれ被験者の左側又は右側頬の肌水分量、経皮水分損失量、角質量、肌弾力、肌色をそれぞれ測定し、左側又は右側の目じりの小じわを測定した。

0107

(1)Corneometer(登録商標)CM825を使用した肌水分量の測定
Corneometer(登録商標)CM825(Courage+Khazaka GmbH、ドイツ)は電気容量(capacitance)を測定する原理で肌の角質層下30〜40μmの水分量を測定する機器であって、プローブから電流を流せば肌の水分含有量による肌の電気伝導度によってプローブヘッドに残っている絶縁イオン値が数値化(AU:arbitrary unit)されて示されるため、肌の水分含量が多いほど測定値が高くなる。本試験では正確な測定値を得るため、評価時点毎に試験部位(頬、前膊内側)をそれぞれ3回繰り返して測定してその平均値を分析した。

0108

(2)Vapometer(登録商標)を使用した経皮水分損失量の測定
経皮水分損失は、肌から水分が発散されることを言い、保湿機能と密接な関係がある。乾燥が悪化する場合、TEWL値が増加するため、保湿力の有無はTEWL測定程度で判断することができる。測定機器であるVapometer(登録商標)(Delfin、フィンランド)は、温度と湿度センサーが測定部位の単位面積当りの経時的水分蒸発量(g/m2h)を測定する。本試験では各評価時点毎に試験部位(頬、前膊内側)を測定して水分蒸発量を分析した。

0109

(3)D−squame(登録商標)を使用した肌角質量の測定
肌水分程度を評価する他の指標である角質量測定は、D−squame(登録商標)Black Tapeを使用して試験部位(頬、前膊内側)の角質を採取する。本試験ではD500 D−squame(登録商標)Disc Applicatorで約5秒間225g/cm2の圧力で肌に付着してから引き離す。採取した角質標本はCharm view(Moritex、日本)で700倍拡大して撮影し、イメージプログラム(Image−Pro(登録商標)plus)を用いて角質の面積を分析した。

0110

(4)Visioline(登録商標)VL−650を使用した目元しわ(レプリカ)の測定
Visioline(登録商標)VL−650(Courage+Khazaka GmbH、ドイツ)は、製作されたレプリカのしわの深さ、長さなどを測定する装備である。特別な光源が通過するように製作された標準カートリッジにレプリカを入れ、光源を通過させて影明暗映像CCDカメラを使用してファイル化した後、最大しわの深さ(Max wrinkle depth)を分析した。

0111

(5)Cutometer(登録商標)を使用した肌弾力の測定
肌弾力はCutometer(登録商標)MPA 580(Courage+Khazaka、ドイツ)を使用して測定する。近年、最も多く使用される方法は吸入力(負圧)を使用したものであって、再現性が高い方法である。Cutometerの測定値は0〜1の値(mm、比率)で示される。本試験では、各評価時点毎に試験部位(頬の正面)を3回測定して各パラメータ(R0〜R9)の平均値を分析した。弾力パラメータは下記の表に基づいて解釈した。

0112

0113

(6)Spectrophotometer(登録商標)CM−700dを使用した肌色測定
Spectrophotometer(登録商標)CM−700dは物体色分光反射率を測定する装備であって、三刺激値を測定してCIELABの表色系であるL*、a*、b*で計算する。L*a*b*表色系では、明度をL*、色相と彩度を示す色度をa*、b*で表す。a*、b*は色の方向を示し、a*は赤色方向、−a*は緑色方向、b*は黄色方向、−b*は青色方向を表している。L*、a*、b*の数値が中央になるほど無彩色になり、逆になれば色度が高くなることを示す。本試験では試験部位(頬正面、色素沈着部位)を3回測定して肌色の明るさ(L*値)の平均値を計算して分析した。

0114

5.血液分析
試験製品の服用前及び服用8週後の被験者の血液を検査し、試験製品が人体の代謝に影響を及ぼさなかったことを確認した。

0115

6.食餌調査及び体重測定
被験者の食習慣の変化が実験結果に影響を及ぼさなかったことを確認するため、試験製品の服用前、服用4週後、服用8週後の時点で体重を測定し、食餌調査を通じて試験期間中の食習慣が普段通りに維持されたか否かを確認した。被験者は提供される食餌調査評価書に本人の食事量程度を自ら評価して訪問時に持参し、試験者が確認及び記録した。
*食事量程度:(食べない:0、少ない:1、普通:2、多い:3)。

0116

7.アンケート評価
試験製品の服用4週後、服用8週後に被験者が作成した応答に基づいて試験製品の効能と服用性に対する満足度を評価した。

0117

8.安全性評価
試験製品の服用4週後、服用8週後に、試験者が被験者の肌の状態を観察し、被験者との質疑応答を通じて肌の状態と身体の状態、製品の刺激有無を確認して記録、評価した。

0118

9.データ分析
試験製品の服用前、服用4週後、服用8週後の時点で機器測定値の平均及び標準偏差値(S.D)をそれぞれ求め、測定値の時点毎、群毎の差異有無を統計分析した。製品服用時点毎の比較はペアt検定(Paired t−test)(p<0.05)によって、製品群毎の比較は対応のないt検定(Independentt−test)(p<0.05)によって分析し、統計分析プログラムはSPSS(登録商標)20.0を使用し、アンケート調査の結果は頻度分析した。

0119

<実施例4−2>実験結果
1.目視評価
時点毎に製品服用前後の目元しわを目視で評価分析した結果、製品服用前と比べて製品服用8週後の時点で試験製品(B製品)の目元しわの目視評価点数が統計的に有意に減少(改善)した(p<0.05)(表14、図11〜12)。

0120

0121

2.肌水分量
分析の結果、製品服用4週後、8週後のいずれも顔及び前膊部位で対照群(A製品)に比べて試験群(B製品)で統計的に有意に肌水分量が増加(改善)した(p<0.05)(表15、図13)。

0122

0123

3.経皮水分損失量(TEWL)
分析の結果、製品服用4週後、8週後の時点いずれも前膊部位でA製品(対照群)に比べてB製品(試験群)で統計的に有意にTEWLが減少(改善)した(p<0.05)(表16、図14)。

0124

0125

4.肌角質量
分析の結果、製品服用前と比較して、製品服用4週後の時点では試験群の顔部位で、製品服用8週後の時点では顔及び前膊部位で肌角質量が統計的に有意に減少(改善)した(p<0.05)。肌角質量の最大減少率は、製品服用8週後の時点で、顔部位ではA製品(対照群)が1.84%、B製品(試験群)が6.12%の減少率を見せ、前膊部位ではA製品が0.37%、B製品が4.09%の減少率を見せた(p<0.05)(表17)。

0126

0127

また、顔及び前膊部位いずれも製品服用8週後の時点でA製品に比べてB製品で統計的に有意に肌角質量が減少(改善)した(p<0.05)(表18、図15図16)。

0128

0129

5.目元しわ(レプリカ)
分析の結果、製品服用前と比較して、製品服用8週後にB製品(試験群)において、パラメータのうちしわの最大深さ(Max wrinkle depth)が有意に減少(改善)した(p<0.05)(表19、図18)。

0130

0131

6.肌弾力
分析の結果、群同士を比較したとき、パラメータのうちR1(元の状態に戻る能力)とR4(最終カーブ最低点)は、製品服用8週後の時点でA製品(対照群)に比べてB製品(試験群)で統計的に有意に減少(改善)し、R5(ネット弾力)とR7(生物学的弾力)は有意に増加(改善)した。また、R2(総弾力)は製品服用4週後、8週後の時点いずれもA製品に比べてB製品で統計的に有意に増加(改善)した(p<0.05)(表20、図19a図19d)。

0132

0133

7.肌色の明るさ
製品服用4週後の時点では頬部位で、製品服用8週後の時点では頬、色素沈着部位で、A製品(対照群)に比べてB製品(試験群)で統計的に有意に肌色の明るさ値が増加(改善)した(p<0.05)(表21、図20図21)。

0134

0135

8.血液分析
分析の結果、群同士を比較したとき、すべてのパラメータで2つの群の間に統計的に有意な差は見せなかった(p<0.05)(表22)。

0136

0137

9.食餌調査及び体重調査
分析の結果、製品服用前と比べて、製品服用4週後、8週後の時点で、A製品とB製品のいずれも食餌調査、体重、BMI指数に有意な差は見せなかった(p<0.05)(表23)。

0138

0139

10.アンケート評価
試験製品の服用4週後、服用8週後に被験者が作成した応答に基づいて試験製品の効能に対する満足度を評価した。評価結果は次のようである(表24)。

0140

0141

11.安全性評価
本試験の期間中、いずれの被験者からも肌、身体の症状に何ら異常反応が観察されなかった(表25)。

0142

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