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課題・解決手段

本発明は、脂質ナノ粒子製剤及びmRNAカプセル化のための改善されたプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、mRNA溶液脂質溶液を混合するステップを含み、前記mRNA溶液及び/または前記脂質溶液が周囲温度を超える所定の温度である、前記プロセスを提供する。本発明は、なかでも、脂質ナノ粒子製剤及びmRNAカプセル化のための改善されたプロセスを提供する。特に、本発明は、混合する前にmRNA溶液及び/または脂質溶液を前もって加熱することが、有意に改善されたカプセル化効率、mRNA回収率、及びより均質かつより小さい粒子サイズ(例えば、100nm未満)をもたらすという驚くべき発見に基づく。

概要

背景

メッセンジャーRNA療法(MRT)は、様々な疾患の処置のためのますます重要な手法となっている。MRTは、患者体内でのmRNAによりコードされるタンパク質の産生のためにその治療を必要とする患者へのメッセンジャーRNA(mRNA)の投与を必然的に含む。脂質ナノ粒子は、mRNAの効率的なインビボでの送達のためにmRNAをカプセル化するためによく使用される。しかしながら、mRNA搭載脂質ナノ粒子を産生するための現行の方法は、カプセル化効率が乏しい、低いmRNA回収及び/または不均質粒子サイズという問題を抱える。

概要

本発明は、脂質ナノ粒子製剤及びmRNAカプセル化のための改善されたプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、mRNA溶液脂質溶液を混合するステップを含み、前記mRNA溶液及び/または前記脂質溶液が周囲温度を超える所定の温度である、前記プロセスを提供する。本発明は、なかでも、脂質ナノ粒子製剤及びmRNAカプセル化のための改善されたプロセスを提供する。特に、本発明は、混合する前にmRNA溶液及び/または脂質溶液を前もって加熱することが、有意に改善されたカプセル化効率、mRNA回収率、及びより均質かつより小さい粒子サイズ(例えば、100nm未満)をもたらすという驚くべき発見に基づく。

目的

本発明は、なかでも、脂質ナノ粒子製剤及びmRNAカプセル化のための改善されたプロセスを提供する

効果

実績

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牽制数
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請求項1

メッセンジャーRNAmRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、mRNA溶液脂質溶液を混合するステップを含み、前記mRNA溶液及び/または前記脂質溶液が、周囲温度を超える所定の温度である、前記プロセス。

請求項2

前記所定の温度が、約30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、または70℃であるかそれを超える、請求項1に記載のプロセス。

請求項3

前記所定の温度が、約25〜70℃、約30〜70℃、約35〜70℃、約40〜70℃、約45〜70℃、約50〜70℃、または約60〜70℃の範囲である、請求項1または2に記載のプロセス。

請求項4

前記所定の温度が、約65℃である、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項5

前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、前記混合の前に別々に前記所定の温度まで加熱される、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項6

前記混合の前に、前記mRNA溶液が前記所定の温度まで加熱され、前記脂質溶液が周囲温度である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項7

周囲温度のmRNA原液を加熱された緩衝液に加えて前記所定の温度にすることによって、前記mRNA溶液が前記所定の温度まで加熱される、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項8

前記緩衝液が、約4.5以下のpHを有する、請求項7に記載のプロセス。

請求項9

前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、低パルス流ポンプにより混合される、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項10

前記ポンプが、ギアポンプである、請求項9に記載のプロセス。

請求項11

前記ポンプが、渦巻きポンプである、請求項9に記載のプロセス。

請求項12

前記mRNA溶液が、約150〜250ml/分、250〜500ml/分、500〜1000ml/分、1000〜2000ml/分、2000〜3000ml/分、3000〜4000ml/分、または4000〜5000ml/分の範囲の流速で混合される、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項13

前記mRNA溶液が、約200ml/分、約500ml/分、約1000ml/分、約2000ml/分、約3000ml/分、約4000ml/分、または約5000ml/分の流速で混合される、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項14

前記脂質溶液が、約25〜75ml/分、約75〜200ml/分、約200〜350ml/分、約350〜500ml/分、約500〜650ml/分、約650〜850ml/分、または約850〜1000ml/分の範囲の流速で混合される、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項15

前記脂質溶液が、約50ml/分、約100ml/分、約150ml/分、約200ml/分、約250ml/分、約300ml/分、約350ml/分、約400ml/分、約450ml/分、約500ml/分、約550ml/分、約600ml/分、約650ml/分、約700ml/分、約750ml/分、約800ml/分、約850ml/分、約900ml/分、約950ml/分、または約1000ml/分の流速で混合される、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項16

前記プロセスが、クエン酸塩緩衝液をmRNA原液と混合することにより前記mRNA溶液をまず生成するステップを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項17

前記クエン酸塩緩衝液が、約10mMクエン酸塩、約150mMNaCl、約4.5のpHを含む、請求項16に記載のプロセス。

請求項18

前記mRNA原液が、前記mRNAを、約1mg/ml、約10mg/ml、約50mg/ml、約100mg/ml以上の濃度で含む、請求項16または17に記載のプロセス。

請求項19

前記クエン酸塩緩衝液が、約100〜300ml/分、300〜600ml/分、600〜1200ml/分、1200〜2400ml/分、2400〜3600ml/分、3600〜4800ml/分、または4800〜6000ml/分の間の範囲の流速で混合される、請求項16〜18のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項20

前記クエン酸塩緩衝液が、約220ml/分、約600ml/分、約1200ml/分、約2400ml/分、約3600ml/分、約4800ml/分、または約6000ml/分の流速で混合される、請求項16〜19のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項21

前記mRNA原液が、約10〜30ml/分、約30〜60ml/分、約60〜120ml/分、約120〜240ml/分、約240〜360ml/分、約360〜480ml/分、または約480〜600ml/分の間の範囲の流速で混合される、請求項16〜20のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項22

前記mRNA原液が、約20ml/分、約40ml/分、約60ml/分、約80ml/分、約100ml/分、約200ml/分、約300ml/分、約400ml/分、約500ml/分、または約600ml/分の流速で混合される、請求項16〜21のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項23

前記脂質溶液が、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質をエタノール中に含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項24

前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、20%エタノール中へと混合され、脂質ナノ粒子の懸濁液を結果もたらす、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項25

前記脂質ナノ粒子が、タンジェンシャルフローろ過によりさらに精製される、請求項24に記載のプロセス。

請求項26

前記精製されたナノ粒子の約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%超が、100nm未満のサイズを有する、請求項25に記載のプロセス。

請求項27

実質的に全ての前記精製されたナノ粒子が、100nm未満のサイズを有する、請求項26に記載のプロセス。

請求項28

前記精製されたナノ粒子の約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%超が50〜80nmの範囲のサイズを有する、請求項25〜27のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項29

実質的に全ての前記精製されたナノ粒子が、50〜80nmの範囲のサイズを有する、請求項25〜28のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項30

前記精製されたナノ粒子が、約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるカプセル化率を有する、請求項25〜29のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項31

前記プロセスが、約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるmRNAの回収をもたらす、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。

請求項32

脂質ナノ粒子内にメッセンジャーRNA(mRNA)をカプセル化するプロセスであって、a.mRNA溶液及び/または脂質溶液を、周囲温度を超える所定の温度まで別々に加熱すること;b.脂質ナノ粒子の懸濁液を生成するために前記加熱したmRNA溶液及び/または前記加熱した脂質溶液を混合すること;及びc.前記脂質ナノ粒子を精製することを含む、前記プロセス。

請求項34

先行請求項のいずれか一項に記載のプロセスにより生成された脂質ナノ粒子の組成物

請求項35

精製された脂質ナノ粒子を含む組成物であって、前記精製された脂質ナノ粒子の約90%超が約100nm未満のサイズの個別の粒子を有し、前記精製された脂質ナノ粒子の約70%超が各個別の粒子内にmRNAをカプセル化している、前記組成物。

請求項36

前記精製された脂質ナノ粒子の約95%、96%、97%、98%、または99%超が、約100nm未満の個別粒子サイズを有する、請求項35に記載の組成物。

請求項37

実質的に全ての前記精製された脂質ナノ粒子が、約100nm未満の個別の粒子サイズを有する、請求項35または36のいずれか一項に記載の組成物。

請求項38

前記精製された脂質ナノ粒子の約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%超が、各個別の粒子内にmRNAをカプセル化する、請求項35〜37のいずれか一項に記載の組成物。

請求項39

実質的に全ての前記精製された脂質ナノ粒子が、各個別の粒子内にmRNAをカプセル化する、請求項35〜38のいずれか一項に記載の組成物。

請求項40

前記組成物が、少なくとも1mg、5mg、10mg、100mg、500mg、または1000mgのカプセル化されたmRNAを含む、請求項35〜39のいずれか一項に記載の組成物。

請求項41

各個別の脂質ナノ粒子が、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質を含む、請求項35〜40のいずれか一項に記載の組成物。

請求項42

前記1つ以上のカチオン性脂質が、C12−200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK−E12、ICE(イミダゾール系)、、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA及びDMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin−K−DMA、DLin−K−XTC2−DMA、HGT4003、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項24に記載のプロセスまたは請求項41に記載の組成物。

請求項43

前記1つ以上の非カチオン性脂質が、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−(ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−フォスホチジルコリン)DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(、2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))から選択される、請求項24に記載のプロセスまたは請求項41に記載の組成物。

請求項44

前記1つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロールまたはPEG化コレステロールである、請求項24に記載のプロセスまたは請求項41に記載の組成物。

請求項45

1つ以上のPEG修飾された脂質が、C6−C20長さのアルキル鎖複数可)を有する脂質に共有付着した最大で5kDaまでの長さのポリエチレングリコール鎖を含む、請求項24に記載のプロセスまたは請求項41に記載の組成物。

請求項46

前記mRNAが、1つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセスまたは組成物。

請求項47

前記mRNAが、未修飾である、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセスまたは組成物。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、その開示がその全体において参照により本明細書に組み込まれる、2014年7月2日に出願された、米国仮特許出願第62/020,163号に対する優先権を主張する。

背景技術

0002

メッセンジャーRNA療法(MRT)は、様々な疾患の処置のためのますます重要な手法となっている。MRTは、患者体内でのmRNAによりコードされるタンパク質の産生のためにその治療を必要とする患者へのメッセンジャーRNA(mRNA)の投与を必然的に含む。脂質ナノ粒子は、mRNAの効率的なインビボでの送達のためにmRNAをカプセル化するためによく使用される。しかしながら、mRNA搭載脂質ナノ粒子を産生するための現行の方法は、カプセル化効率が乏しい、低いmRNA回収及び/または不均質粒子サイズという問題を抱える。

課題を解決するための手段

0003

本発明は、なかでも、脂質ナノ粒子製剤及びmRNAカプセル化のための改善されたプロセスを提供する。特に、本発明は、混合する前にmRNA溶液及び/または脂質溶液を前もって加熱することが、有意に改善されたカプセル化効率、mRNA回収率、及びより均質かつより小さい粒子サイズ(例えば、100nm未満)をもたらすという驚くべき発見に基づく。

0004

ゆえに、いくつかの実施形態では、本発明は、メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、mRNA溶液と脂質溶液を混合するステップを含み、mRNA溶液及び/または脂質溶液が、周囲温度を超える所定の温度である、前記プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、または70℃以上である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約25〜70℃、約30〜70℃、約35〜70℃、約40〜70℃、約45〜70℃、約50〜70℃、または約60〜70℃の範囲である。特定の実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約65℃である。

0005

いくつかの実施形態では、mRNA溶液及び脂質溶液は、混合前に別々に所定の温度まで加熱される。いくつかの実施形態では、混合する前に、mRNA溶液は、所定の温度まで加熱され、脂質溶液は、周囲温度である。いくつかの実施形態では、周囲温度のmRNA原液を加熱された緩衝液に加えて所定の温度にすることによって、mRNA溶液は所定の温度まで加熱される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約4.5以下(例えば、約4.4、4.2、4.0または3.8以下)のpHを有する。

0006

いくつかの実施形態では、mRNA溶液及び脂質溶液は、低パルス流ポンプにより混合される。いくつかの実施形態では、好適なポンプは、ギアポンプである。いくつかの実施形態では、好適なポンプは、蠕動ポンプである。いくつかの実施形態では、好適なポンプは、渦巻きポンプである。

0007

いくつかの実施形態では、mRNA溶液は、約150〜250ml/分、250〜500ml/分、500〜1000ml/分、1000〜2000ml/分、2000〜3000ml/分、3000〜4000ml/分、または4000〜5000ml/分の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では、mRNA溶液は、約200ml/分、約500ml/分、約1000ml/分、約2000ml/分、約3000ml/分、約4000ml/分、または約5000ml/分の流速で混合される。

0008

いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約25〜75ml/分、約75〜200ml/分、約200〜350ml/分、約350〜500ml/分、約500〜650ml/分、約650〜850ml/分、または約850〜1000ml/分の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約50ml/分、約100ml/分、約150ml/分、約200ml/分、約250ml/分、約300ml/分、約350ml/分、約400ml/分、約450ml/分、約500ml/分、約550ml/分、約600ml/分、約650ml/分、約700ml/分、約750ml/分、約800ml/分、約850ml/分、約900ml/分、約950ml/分、または約1000ml/分の流速で混合される。

0009

いくつかの実施形態では、本発明に係るプロセスは、クエン酸塩緩衝液をmRNA原液と混合することによりmRNA溶液をまず生成するステップを含む。ある特定の実施形態では、好適なクエン酸塩緩衝液は、約10mMクエン酸塩、約150mM NaCl、約4.5のpHを含有する。いくつかの実施形態では、好適なmRNA原液は、mRNAを、約0.10mg/ml、1mg/ml、約10mg/ml、約50mg/ml、または約100mg/ml以上の濃度で含有する。

0010

いくつかの実施形態では、クエン酸塩緩衝液は、約100〜300ml/分、300〜600ml/分、600〜1200ml/分、1200〜2400ml/分、2400〜3600ml/分、3600〜4800ml/分、または4800〜6000ml/分の間の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では、クエン酸塩緩衝液は、約220ml/分、約600ml/分、約1200ml/分、約2400ml/分、約3600ml/分、約4800ml/分、または約6000ml/分の流速で混合される。

0011

いくつかの実施形態では、mRNA原液は、約10〜30ml/分、約30〜60ml/分、約60〜120ml/分、約120〜240ml/分、約240〜360ml/分、約360〜480ml/分、または約480〜600ml/分の間の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では、mRNA原液は、約20ml/分、約40ml/分、約60ml/分、約80ml/分、約100ml/分、約200ml/分、約300ml/分、約400ml/分、約500ml/分、または約600ml/分の流速で混合される。

0012

いくつかの実施形態では、脂質溶液は、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質をエタノール中に含有する。いくつかの実施形態では、mRNA溶液及び脂質溶液が20%エタノール中へと混合され、脂質ナノ粒子の懸濁液を結果もたらす。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、タンジェンシャルフローろ過によりさらに精製される。

0013

いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%超が、約100nm未満(例えば、約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm、または約50nm未満)のサイズを有する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製されたナノ粒子が、100nm未満(例えば、約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm、または約50nm未満)のサイズを有する。

0014

いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%超が、約40〜90nm(例えば、約40〜85nm、約40〜80nm、約40〜75nm、約40〜70nm、約40〜65nm、または約40〜60nm)の範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製されたナノ粒子が、約40〜90nm(例えば、約40〜85nm、約40〜80nm、約40〜75nm、約40〜70nm、約40〜65nm、または約40〜60nm)の範囲のサイズを有する。

0015

いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子は、約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるカプセル化効率を有する。いくつかの実施形態では、本発明に係るプロセスは、約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるmRNAの回収をもたらす。

0016

いくつかの実施形態では、本発明は、メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、(a)mRNA溶液及び/または脂質溶液を、周囲温度を超える所定の温度まで別々に加熱すること;(b)脂質ナノ粒子の懸濁液を生成するために加熱したmRNA溶液及び/または加熱した脂質溶液を混合すること;及び(c)脂質ナノ粒子を精製することを含む、前記プロセスを提供する。

0017

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のプロセスによって生成される脂質ナノ粒子の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、精製された脂質ナノ粒子を含む組成物であって、精製された脂質ナノ粒子の約90%超が、約100nm未満(例えば、約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm、または約50nm未満)の個別の粒子サイズを有し、精製された脂質ナノ粒子の約70%超が、各個別の粒子内にmRNAをカプセル化する、前記組成物を提供する。いくつかの実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の約95%、96%、97%、98%、または99%超が、約100nm未満(例えば、約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm、または約50nm未満)の個別の粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製された脂質ナノ粒子が、約100nm未満(例えば、約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm、または約50nm未満)の個別の粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%超が、各個別の粒子内にmRNAをカプセル化する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製された脂質ナノ粒子が、各個別の粒子内にmRNAをカプセル化する。いくつかの実施形態では、本発明に係る組成物は、少なくとも約1mg、5mg、10mg、100mg、500mg、または1000mgのカプセル化されたmRNAを含有する。

0018

いくつかの実施形態では、各個別の脂質ナノ粒子は、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のカチオン性脂質は、C12−200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK−E12、ICE(イミダゾール系)、、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA及びDMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin−K−DMA、DLin−K−XTC2−DMA、HGT4003、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。

0019

いくつかの実施形態では、1つ以上の非カチオン性脂質は、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−フォスホチジルコリン)DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))から選択される。

0020

いくつかの実施形態では、1つ以上のコレステロール系脂質は、コレステロールまたはPEG化コレステロールである。いくつかの実施形態では、1つ以上のPEG修飾された脂質は、C6−C20長さのアルキル鎖複数可)を有する脂質に共有付着した最大で5kDaまでの長さのポリエチレングリコール鎖を含有する。

0021

いくつかの実施形態では、本発明は、1つ以上の修飾されたヌクレオチドを含有するmRNAをカプセル化するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、未修飾であるmRNAをカプセル化するために使用される。

0022

本発明の他の特性、目的、及び利点は、以下の発明を実施するための形態、図面及び特許請求の範囲において明らかである。しかしながら、発明を実施するための形態、図面、及び特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示す一方で、制限ではなく、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。本発明の範囲内で種々の変更及び修正が、当業者には明らかになるだろう。

0023

図面は、例示のみを目的とし、制限を目的としない。

図面の簡単な説明

0024

均質流ポンプを用いた例示的な規模を大きくした脂質ナノ粒子カプセル化mRNAの製剤プロセスの概略図を示す。
脂質ナノ粒子の例示的な精製及び緩衝液交換システムを示す。
蠕動ポンプを用いた例示的な規模を大きくした脂質ナノ粒子カプセル化mRNA製剤プロセスの概略図を示す。
精製及び緩衝液交換のための代替の例示的なタンジェンシャルフローろ過システムを示す。
蠕動ポンプを用いた例示的な規模を大きくした脂質ナノ粒子カプセル化mRNA製剤プロセスの代替的な概略図を示す。

0025

定義
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語に対する追加の定義は、本明細書全体を通して明記する。

0026

おおよそまたは約:本明細書で用いるとき、「おおよそ」または「約」という用語は、対象となる1つ以上の値に適用されるとき、記された基準値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、「おおよそ」または「約」という用語は、別段の記述がない限り、または文脈からそうでないと明確でない限り、(かかる数字が可能な値の100%を超える場合を除いて)記された基準値のいずれかの方向(より大きいまたはより小さい)で、25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%またはそれ未満に入る値の範囲を指す

0027

カプセル化:本明細書で用いるとき、「カプセル化」という用語または文法等価物は、個別のmRNA分子をナノ粒子内に閉じ込めるプロセスを指す。

0028

改善する、増加させる、または低下させる:本明細書で用いるとき、「改善する」「増加させる」または「低下させる」という用語または文法的等価物は、本明細書に記載の処置の開始前の同じ個体での測定値、または本明細書に記載の処置の不在下での対照対象(または複数の対照対象)における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照対象」は、処置される対象と大体同じ年齢の、処置される対象と同じ形態の疾患に罹患している対象である。

0029

不純物:本明細書で用いるとき、「不純物」という用語は、標的材料または化合物化学組成とは異なる、限られた量の液体気体、または固体内部物質を指す。不純物は、混入物とも称される。

0030

インビトロ:本明細書で用いるとき、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内よりむしろ人工的環境下、例えば、試験管または反応槽内、細胞培養物内等で生じる事象を指す。

0031

インビボ:本明細書で用いるとき、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースとするシステムの文脈において、本用語は、(例えば、インビトロシステムと反対に)生存細胞内で生じる事象を指すように使用されてよい。

0032

単離された:本明細書で用いるとき、「単離された」という用語は、(1)(天然及び/または実験設定のいずれかで)最初に産生された時にそれが会合していた成分の少なくともいくつかから分離されている、ならびに/または(2)人の手により産生された、調製された、及び/または製造されている、物質及び/または実体を指す。単離された物質及び/または実体は、それらが最初は会合していた他の成分の約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約99%超から分離されてよい。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約99%を超えて純粋である。本明細書で用いるとき、物質は、実質的に他の成分を含まない場合に「純粋」である。本明細書で用いるとき、単離された物質及び/または実体の純度率(%)の算出は、賦形剤(例えば、緩衝液、溶媒、水等)を含むべきでない。

0033

メッセンジャーRNA(mRNA):本明細書で用いるとき、「メッセンジャーRNA(mRNA)」という用語は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。mRNAは、本明細書で用いるとき、修飾及び未修飾RNAの両方を包含する。mRNAは、1つ以上のコード領域及び非コード領域を含有してよい。

0034

核酸:本明細書で用いるとき、「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込まれることができる任意の化合物及び/または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込まれることができる化合物及び/または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基(例えば、ヌクレオチド及び/またはヌクレオシド)を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、RNAならびに単鎖及び/または二重鎖DNA及び/またはcDNAを包含する。さらには、「核酸」、「DNA」、「RNA」という用語及び/または同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル主鎖以外を有する類似体を含む。例えば、いわゆる「ペプチド核酸」は、当該分野で既知であり、主鎖にてホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本発明の範囲内であると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの変性したものである及び/または同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及び/またはRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでよい。核酸は、天然源から精製されることができる、組み換え発現システムを使用して産生されることができる、及び任意選択で精製される、化学的に合成されること等ができる。適切な場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖、主鎖修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、別段の指定がない限り、5’から3’方向で存在する。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド(例えば、アデノシンチミジングアノシンシチジンウリジンデオキシアデノシンデオキシチミジンデオキシグアノシン、及びデオキシシチジン);ヌクレオシド類似体(例えば、2−アミノアデノシン、2−チオチミジン、イノシンピロロピリミジン、3−メチルアデノシン、5−メチルシチジン、C−5プロピニル−シチジン、C−5プロピニル−ウリジン、2−アミノアデノシン、C5−ブロモウリジン、C5−フルオロウリジン、C5−ヨードウリジン、C5−プロピニル−ウリジン、C5−プロピニル−シチジン、C5−メチルシチジン、2−アミノアデノシン、7−デアザアデノシン、7−デアザグアノシン、8−オキソアデノシン、8−オキソグアノシン、O(6)−メチルグアニン、及び2−チオシチジン);化学的に修飾された塩基;生物学的に修飾された塩基(例えば、メチル化塩基);挿入された塩基;修飾された糖(例えば、2’−フルオロリボース、リボース、2’−デオキシリボースアラビノース、及びヘキソース);及び/または修飾されたリン酸基(例えば、ホスホロチオエート及び5’−N−ホスホラミダイト結合)であるか、これを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、送達を促進するまたは達成するために化学的に修飾されていない核酸(例えば、ヌクレオチド及び/またはヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチド及び残基)を意味する「未修飾核酸」に特異的に関連する。

0035

塩:本明細書で用いるとき、「塩」という用語は、酸と塩基間の中和反応から結果生じるまたは生じ得るイオン性化合物を指す。

0036

実質的に:本明細書で用いるとき、「実質的に」という用語は、全てまたはほぼ全ての程度または度合いの対象となる特徴または特性を呈する定性的状態を指す。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が、もしあっても、完成する及び/または完成へと進むもしくは絶対的結果を達成するまたは回避することがめったにないことを理解するだろう。「実質的に」という用語は、それゆえ、本明細書で、多くの生物学的及び化学的現象に固有完全性の潜在的な欠如を捕らえるように使用される。

0037

収率:本明細書で用いるとき、「収率」という用語は、出発物質としての総mRNAと比較してカプセル化後に回収されたmRNAの割合(%)を指す。いくつかの実施形態では、「回収」という用語は、「収率」という用語と互換可能に使用される。

0038

本発明は、脂質ナノ粒子を製剤する及びmRNAをカプセル化するための改善されたプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、mRNA溶液と脂質溶液を混合するステップを含み、mRNA溶液及び/または脂質溶液が、周囲温度を超える所定の温度である、前記プロセスを提供する。

0039

本発明の様々な態様は、以下の項において詳細に記載される。項の使用は、本発明を制限することを意図しない。各項は、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願では、「または」の使用は、別段の記述がない限り、「及び/または」を意味する。

0040

mRNA
本発明は、任意のmRNAをカプセル化するために使用されてよい。mRNAは、典型的には、DNAからリボソームへと情報を運ぶRNAのタイプであると考えられる。mRNAの存在は、典型的には、非常に短く、プロセシング及び翻訳を含み、それに分解が続く。典型的には、真核生物では、mRNAプロセシングは、N末端(5’)端への「キャップ」の付加、及びC末端(3’)端への「尾部」の付加を含む。典型的なキャップは、7−メチルグアノシンキャップであり、これは、5’−5’−三リン酸結合を通して第一の転写されたヌクレオチドに結合するグアノシンである。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞において見いだされるヌクレアーゼに対する耐性の提供において重要である。尾部は、典型的には、ポリアデニル化事象であり、それによりポリアデニル部分はmRNA分子の3’末端に付加される。この「尾部」の存在は、エクソヌクレアーゼ分解からmRNAを保護する役割を果たす。メッセンジャーRNAは、リボソームによりタンパク質を構成する一連アミノ酸へと翻訳される。

0041

mRNAは、任意の様々な既知の方法に従って合成されてよい。例えば、本発明に係るmRNAは、インビトロ転写(IVT)を介して合成されてよい。簡潔には、IVTは、典型的には、プロモーターを含有する線状または環状のDNA鋳型リボヌクレオチド三リン酸プール、DTT及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝系と、適切なRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、またはSP6RNAポリメラーゼ)、デオキシリボヌクレアーゼIピロホスファターゼ、及び/またはリボヌクレアーゼ阻害薬とで実行する。厳密な条件は、具体的な用途に従って変動するだろう。

0042

いくつかの実施形態では、インビトロで合成されたmRNAは、mRNA合成中に使用される様々な酵素及び他の試薬を含む望ましくない不純物を除去するために製剤及びカプセル化の前に精製されてよい。

0043

本発明は、様々な長さのmRNAを製剤及びカプセル化するために使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明は、約1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、または20kb以上の長さのインビトロで合成されたmRNAを製剤及びカプセル化するために使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明は、約1〜20kb、約1〜15kb、約1〜10kb、約5〜20kb、約5〜15kb、約5〜12kb、約5〜10kb、約8〜20kb、または約8〜15kbの範囲の長さのインビトロで合成されたmRNAを製剤及びカプセル化するために使用してよい。

0044

本発明は、未修飾であるmRNAまたは典型的に安定性を向上させる1つ以上の修飾を含有するmRNAを製剤する及びカプセル化するために使用してよい。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾されたヌクレオチド、修飾された糖リン酸塩主鎖、5’及び/または3’非翻訳領域から選択される。

0045

いくつかの実施形態では、mRNAの修飾は、RNAのヌクレオチドの修飾を含んでよい。本発明に係る修飾されたmRNAは、例えば、主鎖修飾、糖修飾または塩基修飾を含むことができる。いくつかの実施形態では、mRNAは、プリンアデニン(A)、グアニン(G))またはピリミジン(チミン(T)、シトシン(C)、ウラシル(U))を、ならびにプリン及びピリミジンの修飾されたヌクレオチド類似体または誘導体として、例えば、1−メチル−アデニン、2−メチル−アデニン、2−メチルチオ−N−6−イソペンテニル−アデニン、N6−メチル−アデニン、N6−イソペンテニル−アデニン、2−チオ−シトシン、3−メチル−シトシン、4−アセチル−シトシン、5−メチル−シトシン、2,6−ジアミノプリン、1−メチル−グアニン、2−メチル−グアニン、2,2−ジメチル−グアニン、7−メチル−グアニン、イノシン、1−メチル−イノシン、シュードウシル(5−ウラシル)、ジヒドロ−ウラシル、2−チオ−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウラシル、5−(カルボキシヒドロキシメチル)−ウラシル、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、5−メチル−2−チオ−ウラシル、5−メチル−ウラシル、N−ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、5−メチルアミノメチル−ウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオ−ウラシル、5’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、5−メトキシ−ウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、1−メチル−シュードウラシル、キューシン、.ベータ.−D−マンノシル−キューオシン、ワイブトキソシン、及びホスホロアミド酸、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、7−デアザグアノシン、5−メチルシトシン及びイノシンを含むがこれらに限定されない、天然に生じるヌクレオチド及び/またはヌクレオチド類似体(修飾されたヌクレオチド)から合成されてよい。そのような類似体の調製は、例えば、その開示が参照によりその全範囲において本明細書に含まれる米国特許第4,373,071号、米国特許第4,401,796号、米国特許第4,415,732号、米国特許第4,458,066号、米国特許第4,500,707号、米国特許第4,668,777号、米国特許第4,973,679号、米国特許第5,047,524号、米国特許第5,132,418号、米国特許第5,153,319号、米国特許第5,262,530号及び同第5,700,642号から当業者に既知である。

0046

典型的に、mRNA合成は、N末端(5’)端への「キャップ」の付加、及びC末端(3’)端への「尾部」の付加を含む。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞において見いだされるヌクレアーゼに対する耐性の提供において重要である。「尾部」の存在は、エクソヌクレアーゼ分解からmRNAを保護する役割を果たす。

0047

ゆえに、いくつかの実施形態では、mRNAは、5’キャップ構造を含む。5’キャップは、典型的には以下のように付加される:まず、RNA末端ホスファターゼ末端リン酸基の1つを5’ヌクレオチドから取り除き、末端リン酸を2つ残し;次いで、グアノシン三リン酸GTP)がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、5’5’5三リン酸結合を生じさせ:次いで、グアニンの7−窒素メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。2’−O−メチル化は、7−メチルグアノシン三リン酸残基後の第一塩基及び/または第二塩基でも生じ得る。キャップ構造に例には、m7GpppNp−RNA、m7GpppNmp−RNA及びm7GpppNmpNmp−RNA(mは、2’−Oメチル残基を指す)が含まれるが、これらに限定されない。

0048

いくつかの実施形態では、mRNAは、5’及び/または3’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、5’非翻訳領域は、mRNAの安定性または翻訳に影響する1つ以上のエレメント、例えば、鉄応答エレメントを含む。いくつかの実施形態では、5’非翻訳領域は、約50〜500ヌクレオチドの長さであってよい。

0049

いくつかの実施形態では、3’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞内のmRNAの位置の安定性に影響するタンパク質に対する結合部位、またはmiRNAに対する1つ以上の結合部位の1つ以上を含む。いくつかの実施形態では、3’非翻訳領域は、50〜500ヌクレオチドの長さまたはそれより長くてよい。

0050

インビトロ転写反応から提供されるmRNAがいくつかの実施形態で望ましくあり得る一方で、mRNAの他の源が、本発明の範囲内であると企図され、それには細菌、真菌類、植物、及び/または動物から産生されたmRNAを含む。

0051

本発明は、様々なタンパク質をコードするmRNAを製剤する及びカプセル化するために使用してよい。本発明に好適なmRNAの非限定的な例には、脊髄運動ニューロン1(SMN)、アルファガラクトシダーゼ(GLA)、アルギニノコハク酸合成酵素(ASS1)、ホタルルシフェラーゼ、第IX因子(FIX)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、及び嚢胞性線維症膜コンダクタンス受容体(CFTR)をコードするmRNAが挙げられる。例示的なmRNA配列は、実施例の項において詳述される。

0052

mRNA溶液
mRNAは、mRNAが脂質ナノ粒子内にカプセル化され得るように脂質溶液と混合される溶液中で提供されてよい。好適なmRNA溶液は、様々な濃度でカプセル化されるmRNAを含有する任意の水溶液であってよい。例えば、好適なmRNA溶液は、mRNAを、約0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、または1.0mg/ml以上の濃度で含有してよい。いくつかの実施形態では、好適なmRNA溶液は、mRNAを、約0.01〜1.0mg/ml、0.01〜0.9mg/ml、0.01〜0.8mg/ml、0.01〜0.7mg/ml、0.01〜0.6mg/ml、0.01〜0.5mg/ml、0.01〜0.4mg/ml、0.01〜0.3mg/ml、0.01〜0.2mg/ml、0.01〜0.1mg/ml、0.05〜1.0mg/ml、0.05〜0.9mg/ml、0.05〜0.8mg/ml、0.05〜0.7mg/ml、0.05〜0.6mg/ml、0.05〜0.5mg/ml、0.05〜0.4mg/ml、0.05〜0.3mg/ml、0.05〜0.2mg/ml、0.05〜0.1mg/ml、0.1〜1.0mg/ml、0.2〜0.9mg/ml、0.3〜0.8mg/ml、0.4〜0.7mg/ml、または0.5〜0.6mg/mlの範囲の濃度で含有してよい。いくつかの実施形態では、好適なmRNA溶液は、mRNAを、最大で約5.0mg/ml、4.0mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、.09mg/ml、0.08mg/ml、0.07mg/ml、0.06mg/ml、または0.05mg/mlまでの濃度で含有してよい。

0053

典型的には、好適なmRNA溶液は、緩衝剤及び/または塩も含有してよい。通常、緩衝剤は、HEES硫酸アンモニウム炭酸水素ナトリウムクエン酸ナトリウム酢酸ナトリウムリン酸カリウム及びリン酸ナトリウムを含むことができる。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約0.1mM〜100mM、0.5mM〜90mM、1.0mM〜80mM、2mM〜70mM、3mM〜60mM、4mM〜50mM、5mM〜40mM、6mM〜30mM、7mM〜20mM、8mM〜15mM、または9〜12mMの範囲であってよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、または50mM以上である。

0054

例示的な塩は、塩化ナトリウム塩化マグネシウム、及び塩化カリウムを含むことができる。いくつかの実施形態では、mRNA溶液中の塩の好適な濃度は、約1mM〜500mM、5mM〜400mM、10mM〜350mM、15mM〜300mM、20mM〜250mM、30mM〜200mM、40mM〜190mM、50mM〜180mM、50mM〜170mM、50mM〜160mM、50mM〜150mM、または50mM〜100mMの範囲であってよい。好適なmRNA溶液中の塩濃度は、約1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、または100mM以上である。

0055

いくつかの実施形態では、好適なmRNA溶液は、約3.5〜6.5、3.5〜6.0、3.5〜5.5.、3.5〜5.0、3.5〜4.5、4.0〜5.5、4.0〜5.0、4.0〜4.9、4.0〜4.8、4.0〜4.7、4.0〜4.6、または4.0〜4.5の範囲のpHを有してよい。いくつかの実施形態では、好適なmRNA溶液は、約3.5、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.3、及び6.5以下のpHを有してよい。

0056

様々な方法を使用して本発明に好適なmRNA溶液を調製してよい。いくつかの実施形態では、mRNAは、本明細書に記載の緩衝液に直接溶解してよい。いくつかの実施形態では、mRNA溶液は、mRNA原液をカプセル化のために脂質溶液と混合する前に、緩衝液と混合することによって生成されてよい。いくつかの実施形態では、mRNA溶液は、mRNA原液をカプセル化のために脂質溶液と混合する直前に、緩衝液と混合することによって生成してよい。いくつかの実施形態では、好適なmRNA原液は、約0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、または1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、または5.0mg/ml以上の濃度で水中にmRNAを含有してよい。

0057

いくつかの実施形態では、mRNA原液は、ポンプを使用して緩衝液と混合される。例示的なポンプには、限定されないが、ギアポンプ、蠕動ポンプ及び渦巻きポンプが挙げられる。

0058

典型的には、緩衝液は、mRNA原液のそれよりも大きい割合で混合される。例えば、緩衝液は、mRNA原液の割合より少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、または20倍大きい割合で混合されてよい。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約100〜6000ml/分(例えば、約100〜300ml/分、300〜600ml/分、600〜1200ml/分、1200〜2400ml/分、2400〜3600ml/分、3600〜4800ml/分、4800〜6000ml/分、または60〜420ml/分)の範囲の流速で混合されてよい。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約60ml/分、100ml/分、140ml/分、180ml/分、220ml/分、260ml/分、300ml/分、340ml/分、380ml/分、420ml/分、480ml/分、540ml/分、600ml/分、1200ml/分、2400ml/分、3600ml/分、4800ml/分、または6000ml/分以上の流速で混合される。

0059

いくつかの実施形態では、mRNA原液は、約10〜600ml/分(例えば、約5〜50ml/分、約10〜30ml/分、約30〜60ml/分、約60〜120ml/分、約120〜240ml/分、約240〜360ml/分、約360〜480ml/分、または約480〜600ml/分)の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では、mRNA原液は、約5ml/分、10ml/分、15ml/分、20ml/分、25ml/分、30ml/分、35ml/分、40ml/分、45ml/分、50ml/分、60ml/分、80ml/分、100ml/分、200ml/分、300ml/分、400ml/分、500ml/分、または600ml/分以上の流速で混合される。

0060

脂質溶液
本発明に従い、脂質溶液は、mRNAをカプセル化するための脂質ナノ粒子を形成するのに好適な脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノールをベースとする。例えば、好適な脂質溶液は、純エタノール(すなわち、100%エタノール)中に溶解された所望の脂質の混合物を含有し得る。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、イソプロピルアルコールをベースとする。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、ジメチルスルホキシドをベースとする。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、限定されないが、エタノール、イソプロピルアルコール及びジメチルスルホキシドを含む好適な溶媒の混合物である。

0061

好適な脂質溶液は、様々な濃度で所望の脂質の混合物を含有してよい。例えば、好適な脂質溶液は、約0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、または100mg/ml以上の総濃度で所望の脂質の混合物を含有してよい。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、約0.1〜100mg/ml、0.5〜90mg/ml、1.0〜80mg/ml、1.0〜70mg/ml、1.0〜60mg/ml、1.0〜50mg/ml、1.0〜40mg/ml、1.0〜30mg/ml、1.0〜20mg/ml、1.0〜15mg/ml、1.0〜10mg/ml、1.0〜9mg/ml、1.0〜8mg/ml、1.0〜7mg/ml、1.0〜6mg/ml、または1.0〜5mg/mlの範囲の総濃度で所望の脂質の混合物を含有してよい。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、最大で約100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml、30mg/ml、20mg/ml、または10mg/mlまでの総濃度で所望の脂質の混合物を含有してよい。

0062

任意の所望の脂質は、mRNAをカプセル化するために好適な任意の比率で混合されてよい。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質(例えば、非カチオン性脂質及び/またはコレステロール脂質)及び/またはPEG化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質(例えば、非カチオン性脂質及び/またはコレステロール脂質)及び1つ以上のPEG化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。

0063

カチオン性脂質
本明細書で用いるとき、「カチオン性脂質」という語句は、生理的pHなどの、選択されたpHで実効正電荷を有する多くの脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は、文献において記載されており、その多くが市販されている。本発明の組成物及び方法において使用するのに特に好適なカチオン性脂質には、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開WO2010/053572(及び特に、段落[00225]で記載されるC12−200)及びWO2012/170930において記載されるものが含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法に好適なカチオン性脂質には、2012年3月29日に出願された、米国仮特許出願第61/617,468号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のイオン化可能なカチオン性脂質、例えば、(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−15,18−ジエン−1−アミン(HGT5000)、(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−4,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5001)、及び(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−5,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5002)が含まれる。

0064

いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法に好適なカチオン性脂質には、その両方が参照により本明細書に組み込まれるWO2013063468及び“Lipid Formulations for Delivery of Messenger RNA”という表題の米国仮特許出願に記載のカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式I−c1−a:



式中、各R2は、独立して、水素またはC1−3アルキルであり;
各qは、独立して、2〜6であり;
各R’は、独立して、水素またはC1−3アルキルであり;
各RLは、独立して、C8−12アルキルである、
の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を含む。

0065

いくつかの実施形態では、各R2は、独立して、水素、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、各R2は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、各R2は、水素である。

0066

いくつかの実施形態では、各qは、独立して、3〜6である。いくつかの実施形態では、各qは、独立して、3〜5である。いくつかの実施形態では、各qは、4である。

0067

いくつかの実施形態では、各R’は、独立して、水素、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、各R’は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、各R’は、独立して、水素である。

0068

いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、C8−12アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、n−C8−12アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、C9−11アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、n−C9−11アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、C10アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、n−C10アルキルである。

0069

いくつかの実施形態では、各R2は、独立して、水素またはメチルであり;各qは、独立して、3〜5であり;各R’は、独立して、水素またはメチルであり;各RLは、独立して、C8−12アルキルである。

0070

いくつかの実施形態では、各R2は、水素であり;各qは、独立して、3〜5であり;各R’は、水素であり;各RLは、独立して、C8−12アルキルである。

0071

いくつかの実施形態では、各R2は、水素であり;各qは、4であり;各R’は、水素であり;各RLは、独立して、C8−12アルキルである。

0072

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式I−g:



式中、各RLは、独立して、C8−12アルキルである、の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を含む。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、n−C8−12アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、C9−11アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、n−C9−11アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、独立して、C10アルキルである。いくつかの実施形態では、各RLは、n−C10アルキルである。

0073

ある特定の実施形態では、好適なカチオン性脂質は、cKK−E12、または(3,6−ビス(4−(ビス(2−ヒドロキシドデシル)アミノ)ブチルピペラジン−2,5−ジオン)である。cKK−E12の構造を以下に示す:

0074

いくつかの実施形態では、本発明に好適な1つ以上のカチオン性脂質は、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシプロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「DOTMA」であってよい(Feignerら、(Proc.Nat’l Acad.Sci.84,7413(1987);米国特許第4,897,355号)。他の好適なカチオン性脂質には、例えば、5−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「DOGS」、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパミニウムまたは「DOSPA」(Behrら、Proc.Nat.’l Acad.Sci.86,6982(1989);米国特許第5,171,678号;米国特許第5,334,761号)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウムプロパンまたは「DODAP」、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「DOTAP」が挙げられる。

0075

さらなる例示的なカチオン性脂質には、1,2−ジステアリルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパンまたは「DSDMA」、1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパンまたは「DODMA」、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパンまたは「DLinDMA」、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパンまたは「DLenDMA」、N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリドまたは「DODAC」、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウム(arnrnonium)ブロミドまたは「DDAB」、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロプ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「DMRIE」、3−ジメチルアミノ−2−(コレスタ−5−エン−3−ベータ−オキシブタン−4−オキシ)−1−(シス,シス−9,12−オクタデカジエンオキシ)プロパンまたは「CLinDMA」、2−[5’−(コレスタ−5−エン−3−ベータ−オキシ)−3’−オキサペントキシ)−3−ジメチル−1−(シス,シス−9’,l−2’−オクタデカジエンオキシ)プロパンまたは「CpLinDMA」、N,N−ジメチル−3,4−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「DMOBA」、1,2−N,N’−ジオレイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパンまたは「DOcarbDAP」、2,3−ジリノレオイルオキシ−Ν,Ν−ジメチルプロピルアミンまたは「DLinDAP」、1,2−N,N’−ジリノレイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパンまたは「DLincarbDAP」、1,2−ジリノレオイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパンまたは「DLinCDAP」、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソランまたは「DLin−−DMA」、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソランまたは「DLin−K−XTC2−DMA」、及び2−(2,2−ジ((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)−1,3−ジオキソラン−4−イル)−N,N−ジメチルエタンアミン(DLin−KC2−DMA))(WO2010/042877;Sempleら、Nature Biotech.28:172−176(2010)を参照されたい)、またはそれらの混合物が挙げられる(Heyes,J.ら、J Controlled Release 107:276−287(2005);Morrissey,DV.ら、Nat.Biotechnol.23(8):1003−1007(2005);PCT公開WO2005/121348A1)。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質の1つ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジウム部分の少なくとも1つを含む。

0076

いくつかの実施形態では、1つ以上のカチオン性脂質は、XTC(2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン)、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート)、ALNY−100((3aR,5s,6aS)−N,N−ジメチル−2,2−ジ((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルテトラヒドロ−3aH−シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール−5−アミン))、NC98−5(4,7,13−トリス(3−オキソ−3−(ウンデシルアミノ)プロピル)−N1,N16−ジウンデシル−4,7,10,13−テトラアザヘキサデカン−1,16−ジアミド)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、HGT4003(WO2012/170889、その教示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる)、ICE(WO2011/068810、その教示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる)、HGT5000(米国仮特許出願第61/617,468号、その教示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる)またはHGT5001(シスまたはトランス)(仮特許出願第61/617,468号)、WO2010/053572に開示されているものなどのアミノアルコールリピドイド、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA(Heyes,J.;Palmer,L.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276−287)、DLin−KC2−DMA(Semple,S.C.ら、“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172−176)、C12−200(Love,K.T.ら、“Lipid−like materials for low−dose in vivo gene silencing”PNAS 2010,107,1864−1869)から選択されてよい。

0077

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約5%、10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、または70%を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質(複数可)は、重量またはモルで、総脂質混合物の約30〜70%(例えば、約30〜65%、約30〜60%、約30〜55%、約30〜50%、約30〜45%、約30〜40%、約35〜50%、約35〜45%、または約35〜40%)を構成する。

0078

非カチオン性/ヘルパー脂質
本明細書で用いるとき、「非カチオン性脂質」という語句は、任意の中性双性イオンまたはアニオン性の脂質を指す。本明細書で用いるとき、「アニオン性脂質」という語句は、生理学的pHなどの選択されたpHで、正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(DOPE−mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、16−O−モノメチルPE、16−O−ジメチルPE、18−1−トランスPE、1−ステアロイル−2−オレオイル−ホスファジエタノールアミン(SOPE)、またはそれらの混合物を含むがこれらに限定されない。

0079

いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%または70%を構成してよい。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質(複数可)は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約30〜50%(例えば、約30〜45%、約30〜40%、約35〜50%、約35〜45%、または約35〜40%)を構成する。

0080

コレステロール系脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、1つ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質は、例えば、DC−Choi(N,N−ジメチル−N−エチルカルボキサミドコレステロール)、1,4−ビス(3−N−オレイルアミノ−プロピル)ピペラジン(Gaoら、Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991);Wolfら、BioTechniques 23,139(1997);米国特許第5,744,335号)、またはICEを含む。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質(複数可)は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質(複数可)は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約30〜50%(例えば、約30〜45%、約30〜40%、約35〜50%、約35〜45%、または約35〜40%)を構成する。

0081

PEG化脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、1つまたは複数のPEG化脂質を含む。ポリエチレングリコール(PEG)修飾されたリン脂質及び誘導化された脂質、例えば、N−オクタノイルスフィンゴシン−1−[スクシニルメトキシポリエチレングリコール)−2000](C8PEG−2000セラミド)を含む、誘導体化されたセラミド(PEG−CER)の使用も本発明により企図される。企図されるPEG修飾された脂質は、C6−C20長さのアルキル鎖(複数可)で脂質に共有付着する最大で5kDaまでの長さのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、PEG修飾されたまたはPEG化脂質は、PEG化コレステロールまたはPEG−2Kである。いくつかの実施形態では、特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖(例えば、C14またはC18)を有するPEG−セラミドである。

0082

PEG修飾されたリン脂質及び誘導体化脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%を構成してよい。いくつかの実施形態では、PEG化脂質脂質(複数可)は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約30〜50%(例えば、約30〜45%、約30〜40%、約35〜50%、約35〜45%、または約35〜40%)を構成する。

0083

カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、及びPEG修飾された脂質の例示的な組み合わせを実施例の項にて記載する。例えば、好適な脂質溶液は、cKK−E12、DOPE、chol、及びDMG−PEG2K;C12−200、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2K;HGT5000、DOPE、chol、及びDMG−PEG2K;HGT5001、DOPE、chol、及びDMG−PEG2K;cKK−E12、DPPC、chol、及びDMG−PEG2K;C12−200、DPPC、コレステロール、及びDMG−PEG2K;HGT5000、DPPC、chol、及びDMG−PEG2K;またはHGT5001、DPPC、chol、及びDMG−PEG2Kを含有してよい。脂質混合物を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び/またはPEG修飾された脂質の選択、ならびにそのような脂質の相互に対する相対的モル比は、選択された脂質(複数可)の特徴、ならびにカプセル化されるmRNAの特徴及び性質に基づく。さらなる考慮事項は、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択された脂質(複数可)のサイズ、電荷、pH、pKa、膜融合性、及び毒性を含む。ゆえに、モル比は適宜調整されてよい。

0084

混合プロセス
本発明は、mRNAカプセル化効率及び回収率に及ぼす温度の予期しない効果の発見に基づく。ゆえに、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の、mRNA溶液と脂質溶液を混合することによって脂質ナノ粒子中にメッセンジャーRNA(mRNA)をカプセル化するプロセスであって、mRNA溶液及び/または脂質溶液が周囲温度を超える所定の温度まで加熱される前記プロセスを提供する。本明細書で用いるとき、「周囲温度」という用語は、室温の温度、または加熱または冷却無しに、対象となる目的物(例えば、mRNA溶液または脂質溶液)を囲む温度を指す。いくつかの実施形態では、周囲温度は、約20〜25℃の範囲の温度を指す。

0085

それゆえ、周囲温度を超える所定の温度は、典型的には約25℃を超える。いくつかの実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、または70℃以上である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約25〜70℃、約30〜70℃、約35〜70℃、約40〜70℃、約45〜70℃、約50〜70℃、または約60〜70℃の範囲である。特定の実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約65℃である。

0086

mRNA溶液、または脂質溶液、またはその両方は、混合の前に周囲温度を超える所定の温度まで加熱されてよい。いくつかの実施形態では、mRNA溶液及び脂質溶液は、混合の前に別々に所定の温度まで加熱される。いくつかの実施形態では、mRNA溶液及び脂質溶液は、周囲温度で混合されるが、それから混合後所定の温度まで加熱される。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、所定の温度まで加熱され、周囲温度でmRNA溶液と混合される。いくつかの実施形態では、mRNA溶液は、所定の温度まで加熱され、周囲温度で脂質溶液と混合される。

0087

いくつかの実施形態では、mRNA溶液は、周囲温度のmRNA原液を加熱された緩衝液に加えて所望の所定の温度を達成することによって所定の温度まで加熱される。

0088

mRNA溶液及び脂質溶液は、ポンプを使用して混合されてよい。カプセル化手順は、広範な規模で生じることができるため、所望の規模に適応するために異なるタイプのポンプを使用してよい。しかしながら、概して、低パルス流ポンプを使用することが望ましい。本明細書で用いるとき、低パルス流ポンプは、安定した流速で連続的な流れを確立することができる任意のポンプを指す。好適なポンプの種類には、これらに限定されないが、ギアポンプ及び渦巻きポンプが含まれる。例示的なギアポンプには、これらに限定されないが、Cole−ParmerまたはDienerのギアポンプが含まれる。例示的な渦巻きポンプには、これらに限定されないが、GraingerまたはCole−Parmerにより製造されたものが含まれる。

0089

mRNA溶液及び脂質溶液は、様々な流速で混合されてよい。典型的には、mRNA溶液は、脂質溶液のそれを超える割合で混合されてよい。例えば、mRNA溶液は、脂質溶液のそれより少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、または20倍大きい割合で混合されてよい。

0090

混合に好適な流速は、規模に基づいて決定されてよい。いくつかの実施形態では、mRNA溶液は、約40〜400ml/分、60〜500ml/分、70〜600ml/分、80〜700ml/分、90〜800ml/分、100〜900ml/分、110〜1000ml/分、120〜1100ml/分、130〜1200ml/分、140〜1300ml/分、150〜1400ml/分、160〜1500ml/分、170〜1600ml/分、180〜1700ml/分、150〜250ml/分、250〜500ml/分、500〜1000ml/分、1000〜2000ml/分、2000〜3000ml/分、3000〜4000ml/分、または4000〜5000ml/分の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では、mRNA溶液は、約200ml/分、約500ml/分、約1000ml/分、約2000ml/分、約3000ml/分、約4000ml/分、または約5000ml/分の流速で混合される。

0091

いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約25〜75ml/分、20〜50ml/分、25〜75ml/分、30〜90ml/分、40〜100ml/分、50〜110ml/分、75〜200ml/分、200〜350ml/分、350〜500ml/分、500〜650ml/分、650〜850ml/分、または850〜1000ml/分の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約50ml/分、約100ml/分、約150ml/分、約200ml/分、約250ml/分、約300ml/分、約350ml/分、約400ml/分、約450ml/分、約500ml/分、約550ml/分、約600ml/分、約650ml/分、約700ml/分、約750ml/分、約800ml/分、約850ml/分、約900ml/分、約950ml/分、または約1000ml/分の流速で混合される。

0092

典型的には、mRNA溶液及び脂質溶液は、脂質が、mRNAをカプセル化するナノ粒子を形成することができるように、溶液中に混合される。そのような溶液は、製剤またはカプセル化溶液とも称される。好適な製剤またはカプセル化溶液は、エタノールなどの溶媒をベースとしてよい。例えば、好適な製剤またはカプセル化溶液は、約10%エタノール、約15%エタノール、約20%エタノール、約25%エタノール、約30%エタノール、約35%エタノール、または約40%エタノールをベースとしてよい。

0093

好適な製剤またはカプセル化溶液は、イソプロピルアルコールなどの溶媒をベースとしてよい。例えば、好適な製剤またはカプセル化溶液は、約10%イソプロピルアルコール、約15%イソプロピルアルコール、約20%イソプロピルアルコール、約25%イソプロピルアルコール、約30%イソプロピルアルコール、約35%イソプロピルアルコール、または約40%イソプロピルアルコールをベースとしてよい。

0094

好適な製剤またはカプセル化溶液は、ジメチルスルホキシドなどの溶媒をベースとしてよい。例えば、好適な製剤またはカプセル化溶液は、約10%ジメチルスルホキシド、約15%ジメチルスルホキシド、約20%ジメチルスルホキシド、約25%ジメチルスルホキシド、約30%ジメチルスルホキシド、約35%ジメチルスルホキシド、または約40%ジメチルスルホキシドをベースとしてよい。

0095

好適な製剤またはカプセル化溶液は、緩衝剤または塩も含有してよい。例示的な緩衝剤は、HEPES、硫酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸ナトリウムを含んでよい。例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、及び塩化カリウムを含んでよい。

0096

精製
典型的には、製剤及びカプセル化の後、脂質ナノ粒子は、精製される及び/または濃縮される。様々な精製技術を使用してよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、タンジェンシャルフローろ過を使用して精製される。クロスフローろ過とも称される、タンジェンシャルフローろ過(TFF)は、ろ過される材料が、フィルタを通り抜けるよりむしろ接線的に通過するろ過の種類である。TFFでは、望ましくない透過水はフィルタを通り抜ける一方で、所望の被保持物はフィルタに沿って通り下流に集められる。従来のデッドエンドろ過において通常遭遇するものと反対に、TFFでは、典型的には、所望の材料が被保持物中に含有されていることに留意することが重要である。

0097

ろ過される材料に依存して、TFFは、精密ろ過または限外ろ過のいずれかのために使用される。精密ろ過は、典型的には、フィルタが、0.05μmから1.0μmの間、両端値を含む、の孔サイズを有する事例として定義され、一方で限外ろ過は、典型的には、0.05μm未満の孔サイズを有するフィルタを必然的に含む。孔サイズは、特定のフィルタに対する分子量カットオフ(MWCO)とも称される、公称分画分子量(NMWL)も決定し、典型的には、精密ろ過膜は、1,000キロダルトン(kDa)を超えるNMWLを有し、限外ろ過フィルタは、1kDaから1,000kDaの間のNMWLを有する。

0098

タンジェンシャルフローろ過の主要な利点は、従来の「デッドエンド」ろ過中に凝集してフィルタを遮断し得る非透過性粒子(ときに「ろ過ケーキ」とも称される)が、代わりにフィルタの表面に沿って運ばれることである。この利点により、概してフィルタを除去して清掃する必要がなくなり、そのため作業中断時間が著しく低下するために、タンジェンシャルフローろ過は連続運転を要する工業プロセスにおいて広く使用されることが可能になる。

0099

タンジェンシャルフローろ過は、なかでも、濃縮及びダイアフィルトレーションを含むいくつかの目的のために使用することができる。濃縮は、それにより溶質分子が保持される一方で溶媒が溶液から除去される、プロセスである。試料を効率的に濃縮するために、保持される溶質分子の分子量よりも実質的に低いNMWLまたはMWCOを有する膜が使用される。通常、当業者は、標的分子(複数可)の分子量を3〜6倍下回るNMWLまたはMWCOを有するフィルタを選択し得る。

0100

ダイアフィルトレーションは、それにより、小さい望ましくない粒子がフィルタを通り抜け、一方で大きな所望のナノ粒子が、溶液中のそのナノ粒子の濃度を変えることなく、被保持物中に維持される、分画プロセスである。ダイアフィルトレーションは、溶液から塩また反応緩衝液を除去するためにしばしば使用される。ダイアフィルトレーションは、連続的または非連続的であってよい。連続ダイアフィルトレーションでは、ダイアフィルトレーション溶液は、ろ液が生成される速度と同じ速度で試料へと加えられる。非連続ダイアフィルトレーションでは、溶液をまず希釈し、次いで濃縮して出発濃度へと戻す。非連続ダイアフィルトレーションは、所望の濃度のナノ粒子に達するまで反復されてよい。

0101

精製された及び/または濃縮された脂質ナノ粒子は、例えば、PBSなどの所望の緩衝液中で製剤されてよい。

0102

mRNAをカプセル化するナノ粒子の提供
本発明に係るプロセスは、従来技術のプロセスと比較して、より均質で小さい粒子サイズ(例えば、100nm未満)、ならびに、著しく改善されたカプセル化効率及び/またはmRNA回収率をもたらす。

0103

ゆえに、本発明は、本明細書に記載の精製されたナノ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物中の精製されたナノ粒子の大半、すなわち、精製されたナノ粒子の約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%超は、約100nm未満(例えば、約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm、または約50nm未満)のサイズを有する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製されたナノ粒子が、100nm未満(例えば、約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm、または約50nm未満)のサイズを有する。

0104

加えて、狭いナノ粒子サイズ範囲を有するより均質なナノ粒子が、本発明のプロセスによって達成される。例えば、本発明により提供される組成物中の精製されたナノ粒子の約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%超が、約40〜90nm(例えば、約40〜85nm、約40〜80nm、約40〜75nm、約40〜70nm、約40〜65nm、または約40〜60nm)の範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製されたナノ粒子が、約40〜90nm(例えば、約40〜85nm、約40〜80nm、約40〜75nm、約40〜70nm、約40〜65nm、または約40〜60nm)の範囲のサイズを有する。

0105

いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物中のナノ粒子の分散性、または分子のサイズにおける均質性尺度PDI)は、約0.16未満(例えば、約0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.10、0.09、または0.08未満)である。

0106

いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物中の精製された脂質ナノ粒子の約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%超が、各個別の粒子内にmRNAをカプセル化する。いくつかの実施形態では、組成物中の実質的に全ての精製された脂質ナノ粒子が、各個別の粒子中にmRNAをカプセル化する。

0107

いくつかの実施形態では、本発明に係る組成物は、少なくとも約1mg、5mg、10mg、100mg、500mg、または1000mgのカプセル化されたmRNAを含有する。いくつかの実施形態では、本発明に係るプロセスは、約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるmRNAの回収をもたらす。

0108

本発明のある特定の化合物、組成物及び方法が、ある特定の実施形態に従って特異性とともに記載されている一方で、以下の実施例は、本発明の化合物を単に例示する役割を果たし、それを制限することを意図しない。

0109

実施例1.ナノ粒子カプセル化プロセスに及ぼす温度の効果
この実施例は、ナノ粒子カプセル化プロセス中の温度の増加が、収率及び/またはカプセル化効率の増加をもたらすことを実証する。

0110

脂質材料
以下の実施例に記載する製剤は、別段の指定がない限り、様々な核酸材料をカプセル化するように設計された1つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質(例えば、非カチオン性脂質及び/またはコレステロール脂質)及びPEG化脂質を採用する様々な比率の多成分の脂質混合物を含有する。本プロセスのためのカチオン性脂質は、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA(Heyes,J.;Palmer,L.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276−287)、DLin−KC2−DMA(Semple,S.C.ら、“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172−176)、C12−200(Love,K.T.ら、“Lipid−like materials for low−dose in vivo gene silencing”PNAS 2010,107,1864−1869)、cKK−E12(3,6−ビス(4−(ビス(2−ヒドロキシドデシル)アミノ)ブチル)ピペラジン−2,5−ジオン)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、ICE、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジウム系等を含むことができるが、これらに限定されない。ヘルパー脂質は、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−フォスホチジルコリン)DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))、コレステロール等を含むことができるが、これらに限定されない。PEG化脂質は、C6−C20長さのアルキル鎖(複数可)で脂質に共有付着する最大で5kDaまでの長さのポリ(エチレン)グリコール鎖を含むことができるが、これに限定されない。

0111

メッセンジャーRNA材料
コドン最適化ヒト脊髄運動ニューロン1(SMN)メッセンジャーRNA、アルギニノコハク酸合成酵素(ASS1)メッセンジャーRNA、修飾嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(SNIM登録商標)CFTR、25%シュードウリジン、25%5−メチル−シチジン)メッセンジャーRNA、ホタルルシフェラーゼ(FFL)メッセンジャーRNA、第IX因子(FIX)メッセンジャーRNA、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phelyalanine hydroxylase)(PAH)メッセンジャーRNA及びアルファ−ガラクトシダーゼ(GLA)メッセンジャーRNAを、遺伝子をコードするプラスミドDNA鋳型からのインビトロ転写により合成し、その後、5‘キャップ構造(キャップ1)(Fechter,P.;Brownlee,G.G.“Recognition ofmRNAcap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239−1249)及びゲル電気泳動により決定されたおおよそ250ヌクレオチドの長さの3’ポリA尾部が付加された。各mRNA生成物中に存在する5’及び3’非翻訳領域は、それぞれX及びYとして表され、(下に)記載のように定義される。
コドン最適化ヒト脊髄運動ニューロン1(SMN)mRNA:
XAUGGCCAUGAGCAGCGGAGGCAGCGGCGGAGGAGUGCCCGAGCAGGAGGACAGCGUGCUGUUCAGGAGAGGCACCGGCCAGAGCGAUGACAGCGAUACUGGGACGAUACCGCUCUGAUCAAGGCCUACGACAAGGCCGUGGCCAGCUUCAAGCACGCCCUGAAAAACGGCGACAUCUGCGAGACCAGCGGCAAGCCCAAGACAACCCCCAAGAGAAAGCCCGCCAAGAAGAAUAAGAGCCAGAAAAAGAACACCGCCGCCAGCCUGCAGCAGUGGAAGGUGGGCGACAAGUGCAGCGCCAUCUGGAGCGAGGACGGCUGCAUCUACCCCGCCACCAUCGCCAGCAUCGACUUCAAGAGAGAGACCUGCGUGGUCGUGUACACCGGCUACGGCAACAGAGAGGAGCAGAACCUGAGCGACCUGCUGAGCCCCAUUUGUGAGGUGGCCAAUAACAUCGAACAGAACGCCCAGGAGAACGAGAAUGAAAGCCAGGUGAGCACCGACGAGAGCGAGAACAGCAGAUCUCCUGGCAACAAGAGCGACAACAUCAAGCCUAAGUCUGCCCCUUGGAACAGCUUCCUGCCCCCUCCUCCACCCAUGCCCGGACCCAGACUGGGACCCGGAAAACCUGGCCUGAAGUUCAACGGACCACCUCCCCCUCCACCUCCUCCCCCACCUCAUCUCCUGAGCUGCUGGCUGCCACCCUUCCCCAGCGGACCCCCUAUCAUCCCACCACCCCCUCCCAUCUGCCCCGACAGCCUGGACGACGCCGAUGCCCUGGGCAGCAUGCUGAUCAGCUGGUACAUGAGCGGCUACCACACAGGAUACUACAUGGGCUUCAGACAGAACCAGAAGGAGGGCAGAUGCUCCCACUCCCUGAACUGAY
ヒトアルファ−ガラクトシダーゼ(GLA)mRNA:
XAUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAGAGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGACCCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY
コドン最適化ヒトアルギニノコハク酸合成酵素(ASS1)mRNA:
XAUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGAY
コドン最適化ホタルルシフェラーゼmRNA:
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAAY
ヒト第IX因子(FIX)mRNA:
XAUGCAGCGCGUGAACAUGAUCAUGGCAGAAUCACCAGGCCUCAUCACCAUCUGCCUUUUAGGAUAUCUACUCAGUGCUGAAUGUACAGUUUUUCUUGAUCAUGAAAACGCCAACAAAAUUCUGAGGCGGAGAAGGAGGUAUAAUUCAGGUAAAUUGGAAGAGUUUGUUCAAGGGAACCUUGAGAGAGAAUGUAUGGAAGAAAAGUGUAGUUUUGAAGAAGCACGAGAAGUUUUUGAAAACACUGAAAGAACAACUGAAUUUUGGAAGCAGUAUGUUGAUGGAGAUCAGUGUGAGUCCAAUCCAUGUUUAAAUGGCGGCAGUUGCAAGGAUGACAUUAAUUCCUAUGAAUGUUGGUGUCCCUUUGGAUUUGAAGGAAAGAACUGUGAAUUAGAUGUAACAUGUAACAUUAAGAAUGGCAGAUGCGAGCAGUUUUGUAAAAAUAGUGCUGAUAACAAGGUGGUUUGCUCCUGUACUGAGGGAUAUCGACUUGCAGAAAACCAGAAGUCCUGUGAACCAGCAGUGCCAUUUCCAUGUGGAAGAGUUUCUGUUUCACAAACUUCUAAGCUCACCCGUGCUGAGGCUGUUUUUCCUGAUGUGGACUAUGUAAAUUCUACUGAAGCUGAAACCAUUUUGGAUAACAUCACUCAAAGCACCCAAUCAUUUAAUGACUUCACUCGGGUUGUUGGUGGAGAAGAUGCCAAACCAGGUCAAUUCCCUUGGCAGGUUGUUUUGAAUGGUAAAGUUGAUGCAUUCUGUGGAGGCUCUAUCGUUAAUGAAAAAUGGAUUGUAACUGCUGCCCACUGUGUUGAAACUGGUGUUAAAAUUACAGUUGUCGCAGGUGAACAUAAUAUUGAGGAGACAGAACAUACAGAGCAAAAGCGAAAUGUGAUUCGAAUUAUUCCUCACCACAACUACAAUGCAGCUAUUAAUAAGUACAACCAUGACAUUGCCCUUCUGGAACUGGACGAACCCUUAGUGCUAAACAGCUACGUUACACCUAUUUGCAUUGCUGACAAGGAAUACACGAACAUCUUCCUCAAAUUUGGAUCUGGCUAUGUAAGUGGCUGGGGAAGAGUCUUCCACAAAGGGAGAUCAGCUUUAGUUCUUCAGUACCUUAGAGUUCCACUUGUUGACCGAGCCACAUGUCUUCGAUCUACAAAGUUCACCAUCUAUAACAACAUGUUCUGUGCUGGCUUCCAUGAAGGAGGUAGAGAUUCAUGUCAAGGAGAUAGUGGGGGACCCCAUGUUACUGAAGUGGAAGGGACCAGUUUCUUAACUGGAAUUAUUAGCUGGGGUGAAGAGUGUGCAAUGAAAGGCAAAUAUGGAAUAUAUACCAAGGUAUCCCGGUAUGUCAACUGGAUUAAGGAAAAAACAAAGCUCACUUAAY
コドン最適化ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)mRNA:
XAUGAGCACCGCCGUGCUGGAGAACCCCGGCCUGGGCCGCAAGCUGAGCGACUUCGGCCAGGAGACCAGCUACAUCGAGGACAACUGCAACCAGAACGGCGCCAUCAGCCUGAUCUUCAGCCUGAAGGAGGAGGUGGGCGCCCUGGCCAAGGUGCUGCGCCUGUUCGAGGAGAACGACGUGAACCUGACCCACAUCGAGAGCCGCCCCAGCCGCCUGAAGAAGGACGAGUACGAGUUCUUCACCCACCUGGACAAGCGCAGCCUGCCCGCCCUGACCAACAUCAUCAAGAUCCUGCGCCACGACAUCGGCGCCACCGUGCACGAGCUGAGCCGCGACAAGAAGAAGGACACCGUGCCCUGGUUCCCCCGCACCAUCCAGGAGCUGGACCGCUUCGCCAACCAGAUCCUGAGCUACGGCGCCGAGCUGGACGCCGACCACCCCGGCUUCAAGGACCCCGUGUACCGCGCCCGCCGCAAGCAGUUCGCCGACAUCGCCUACAACUACCGCCACGGCCAGCCCAUCCCCCGCGUGGAGUACAUGGAGGAGGAGAAGAAGACCUGGGGCACCGUGUUCAAGACCCUGAAGAGCCUGUACAAGACCCACGCCUGCUACGAGUACAACCACAUCUUCCCCCUGCUGGAGAAGUACUGCGGCUUCCACGAGGACAACAUCCCCCAGCUGGAGGACGUGAGCCAGUUCCUGCAGACCUGCACCGGCUUCCGCCUGCGCCCCGUGGCCGGCCUGCUGAGCAGCCGCGACUUCCUGGGCGGCCUGGCCUUCCGCGUGUUCCACUGCACCCAGUACAUCCGCCACGGCAGCAAGCCCAUGUACACCCCCGAGCCCGACAUCUGCCACGAGCUGCUGGGCCACGUGCCCCUGUUCAGCGACCGCAGCUUCGCCCAGUUCAGCCAGGAGAUCGGCCUGGCCAGCCUGGGCGCCCCCGACGAGUACAUCGAGAAGCUGGCCACCAUCUACUGGUUCACCGUGGAGUUCGGCCUGUGCAAGCAGGGCGACAGCAUCAAGGCCUACGGCGCCGGCCUGCUGAGCAGCUUCGGCGAGCUGCAGUACUGCCUGAGCGAGAAGCCCAAGCUGCUGCCCCUGGAGCUGGAGAAGACCGCCAUCCAGAACUACACCGUGACCGAGUUCCAGCCCCUGUACUACGUGGCCGAGAGCUUCAACGACGCCAAGGAGAAGGUGCGCAACUUCGCCGCCACCAUCCCCCGCCCCUUCAGCGUGCGCUACGACCCCUACACCCAGCGCAUCGAGGUGCUGGACAACACCCAGCAGCUGAAGAUCCUGGCCGACAGCAUCAACAGCGAGAUCGGCAUCCUGUGCAGCGCCCUGCAGAAGAUCAAGUAAY
コドン最適化嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)mRNA:
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5’及び3’UTR配列
X=
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG
Y=
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU

0112

脂質ナノ粒子製剤
脂質の混合物(カチオン性脂質、ヘルパー脂質、双生イオン脂質、PEG脂質等)のエタノール性溶液を調製して、報告された容量にし、選択された温度まで加熱した。個別に、mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)を、1mg/mLの原液から調製し、選択された温度まで5〜10分間加熱した。

0113

小規模製剤については、脂質溶液を、シリンジポンプを使用してmRNA水溶液に迅速に注入し(3.71mL/秒)、結果得られた懸濁液を振とうして、脂質ナノ粒子を含む20%エタノールを得た。結果得られたナノ粒子懸濁液を、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保管した。

0114

25℃での代表的な実施例
cKK−E12、DOPE、Chol及びDMG−PEG2Kの50mg/mLエタノール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して3mLの最終容量とした。個別に、FFLmRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)を、1mg/mLの原液から調製した。脂質溶液を、mRNA水溶液に迅速に注入し、振とうして20%エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保管した。最終濃度=0.20mg/mL FFL mRNA(カプセル化)。Zave=91nmPDI(0.16)。

0115

37℃での製剤
cKK−E12、DOPE、Chol及びDMG−PEG2Kの50mg/mLエタノール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して3mLの最終容量とした。個別に、FIXmRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLの原液から調製した。脂質溶液を、mRNA水溶液に迅速に注入し、振とうして20%エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保管した。最終濃度=0.20mg/mL FIX mRNA(カプセル化)。Zave=64nm;PDI(0.12)。

0116

65℃での製剤
cKK−E12、DOPE、Chol及びDMG−PEG2Kの50mg/mLエタノール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して3mLの最終容量とした。個別に、FIXmRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLの原液から調製した。脂質溶液を、mRNA水溶液に迅速に注入し、振とうして20%エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保管した。最終濃度=0.20mg/mL FIX mRNA(カプセル化)。Zave=73nm;PDI(0.13)。

0117

ナノ粒子カプセル化プロセスに及ぼす温度の効果
エタノール脂質溶液及びmRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)の両方を、製剤プロセスの前に異なる選択温度で加熱して、製剤の最終収率及びカプセル化効率に及ぼす温度の効果を決定した。

0118

ナノ粒子製剤プロセスに及ぼす温度の効果を、サイズ、サイズ分散性、カプセル化効率及び収率(または回収)について評価した。例示的なデータを表1に示す。見られるように、温度における増加(例えば、周囲温度を超える)は、カプセル化効率及び/または収率/回収の増加、ならびに粒子サイズ及び/またはサイズ分散性の低下をもたらす。

0119

実施例2.規模を大きくした製剤プロセス
本実施例は、増加した温度でmRNAをカプセル化するための例示的な規模を大きくした製剤プロセスを例証する。

0120

例示的な規模を大きくした製剤プロセスを図1に示す。Ismatecのプログラム可能デジタル駆動ポンプ(Cole Parmer型番CP78008−10)を使用した。MicropumpのAマウント吸引シューポンプヘッド316SS本体/グラファイトギアPTFEシール、0.084mL/rev、内部バイパス無し(Cole Parmer型番07002−27)及びPharma Pureのチューブサイズ#14、0.06“ID、1/16”(Spectrum labs品番ACTU−P14−25N)を使用した。

0121

ナノ粒子製剤及びmRNAのカプセル化は、エタノール脂質溶液とmRNAをクエン酸塩緩衝液(10mMクエン酸塩緩衝液、150mM NaCl、pH4.5)中で「T」ジャンクション(または「Y」ジャンクション)を使用して混合することにより調製される。mRNAを含むクエン酸塩緩衝液及び脂質を含むエタノール溶液の例示的な流速は、それぞれ、200ml/分及び50ml/分である。このプロセス中に、両方のポンプを同時に開始する。製剤の開始時及び終了時の分画は廃棄し、中間製剤のみを収集した。正確な流速及び低パルス流は、このプロセスの2つの重要なパラメータである。

0122

精製及び緩衝液交換
上記ステップから得た製剤の精製及び緩衝液交換を、Spectrum labsからのKrosFlo(登録商標)Research IIiタンジェンシャルフローろ過システムで、修飾ポリエーテルスルホン中空糸フィルタモジュールを使用して行う。緩衝液交換は、6倍容量滅菌PBS(pH7.4)で、連続ダイアフィルトレーション形態において行う。図2を参照されたい。製剤を、サイズ(PDI)及びカプセル化(収率)について分析する。例示的なデータを表2に表す。

0123

このプロセスを使用して、非常に狭い粒子サイズ範囲、及び高いカプセル化効率(例えば、90%を超える平均)が達成される。

0124

低パルス均質流の重要性検査するために、ある程度の脈動流を有する蠕動ポンプを製剤プロセスのために使用した。図3を参照されたい。mRNAを含むクエン酸塩緩衝液及び脂質を含む純エタノールを、それぞれ、200ml/分及び50ml/分の流速で混合した。例示的な結果を表3に示した。見ることができるように、このプロセス内での蠕動ポンプの使用は、より大きなサイズを有するナノ粒子の製剤をもたらす。これは、脈動流を要因とする非均質な混合による可能性が高い。

実施例

0125

等価物及び範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するだろう、または通常の実験のみを使用して確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の説明により制限されることを意図しないが、以下の特許請求の範囲に明記される。

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