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図面 (5)

課題・解決手段

本発明は、ヒトMCAMラミニンアルファ−4鎖を結合する能力阻害する抗MCAM抗体を提供する。本発明はまた、そのような抗体の医薬組成物生成方法、及び神経炎症性疾患自己免疫疾患または癌を治療するための薬物の製造におけるその使用も提供する。

概要

背景

TH17細胞(Tヘルパー17細胞)と呼ばれるCD4+T細胞のサブセットは、多数の自己免疫疾患、特に、たとえば、多発性硬化症及び動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のようなT細胞のCNS浸潤関与する神経炎症性の状態の病態形成に関与している。TH17細胞はIL−17及びIL−22を含む多数の選ばれたサイトカイン分泌することが報告されている。TH17細胞は特異的な動員及び組織の浸潤を起こすことが報告されている。MCAMはTH17細胞上で発現され、リガンドとしてラミニンα−4を結合することが報告されている。

概要

本発明は、ヒトMCAMのラミニンアルファ−4鎖を結合する能力阻害する抗MCAM抗体を提供する。本発明はまた、そのような抗体の医薬組成物生成方法、及び神経炎症性疾患、自己免疫疾患または癌を治療するための薬物の製造におけるその使用も提供する。

目的

本発明は、配列番号156の3つのKabatのCDRを含み、及び配列番号156に対して少なくとも97%同一である成熟重鎖可変領域と、配列番号160の3つのKabatのCDRを含み、及び配列番号160に対して少なくとも97%同一である成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

ヒト化抗体であって、(a)配列番号156の3つのKabatのCDRを含み、配列番号156に対して少なくとも97%同一である成熟重鎖可変領域と、(b)配列番号160の3つのKabatのCDRを含み、配列番号160に対して少なくとも97%同一である成熟軽鎖可変領域とを含む、前記ヒト化抗体。

請求項2

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156に対して少なくとも98%同一であり、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160に対して少なくとも97%同一である請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項3

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156に対して少なくとも99%同一であり、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160に対して少なくとも97%同一である請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項4

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156のアミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160に対して少なくとも97%同一である請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項5

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156に対して少なくとも97%同一であり、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160に対して少なくとも98%同一である請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項6

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156に対して少なくとも97%同一であり、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160に対して少なくとも99%同一である請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項7

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156に対して少なくとも97%同一であり、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項8

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156に対して少なくとも98%同一であり、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160に対して少なくとも98%同一である請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項9

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156に対して少なくとも99%同一であり、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160に対して少なくとも99%同一である請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項10

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156の前記アミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160の前記アミノ酸配列を有する請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項11

さらに、前記成熟重鎖可変領域の3位(Kabatの番号付け)がKによって占められるという条件で請求項1〜10または44〜46のいずれか一項に記載のヒト化抗体。

請求項12

さらに、前記成熟重鎖可変領域の93位(Kabatの番号付け)がTによって占められるという条件で請求項1〜11または44〜46のいずれか一項に記載のヒト化抗体。

請求項13

さらに、前記成熟重鎖可変領域の42位(Kabatの番号付け)がEによって占められるという条件で請求項1〜12または44〜46のいずれか一項に記載のヒト化抗体。

請求項14

さらに、前記成熟軽鎖可変領域の43位(Kabatの番号付け)がSによって占められるという条件で請求項1〜13または44〜46のいずれか一項に記載のヒト化抗体。

請求項15

さらに、前記成熟軽鎖可変領域の9位(Kabatの番号付け)がSによって占められるという条件で請求項1〜14または44〜46のいずれか一項に記載のヒト化抗体。

請求項16

さらに、前記成熟軽鎖可変領域の19位(Kabatの番号付け)がVによって占められるという条件で請求項1〜15または44〜46のいずれか一項に記載のヒト化抗体。

請求項17

抗原結合断片である請求項1〜16または44〜46のいずれか一項に記載のヒト化抗体。

請求項18

アミノ酸残基318を含むエピトープにてヒトMCAM(配列番号11)に結合する単離された抗MCAM抗体。

請求項19

前記エピトープがアミノ酸残基324を含む請求項18に記載の単離された抗MCAM抗体。

請求項20

前記エピトープがアミノ酸残基326を含む請求項18または請求項19に記載の単離された抗MCAM抗体。

請求項21

アミノ酸残基318を含むMCAMの少なくとも5つの隣接する残基を含む請求項18〜20のいずれか一項に記載の単離された抗MCAM抗体。

請求項22

前記抗体がモノクローナル抗体1749.1.3ではない、またはモノクローナル抗体1749.1.3に実質的に由来するCDRを含むモノクローナル抗体ではない請求項18〜21のいずれか1項に記載の単離された抗MCAM抗体。

請求項23

前記抗体がモノクローナルである請求項18〜22のいずれか一項に記載の単離された抗MCAM抗体。

請求項24

前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ化抗体またはヒト抗体である請求項18〜23のいずれか一項に記載の単離された抗MCAM抗体。

請求項25

前記抗体が抗原結合断片である請求項18〜23のいずれか一項に記載の単離された抗MCAM抗体。

請求項26

請求項1〜25または44〜46のいずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体を含む医薬組成物

請求項27

哺乳類対象にて炎症性疾患治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46のいずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用であって、身体における炎症の部位へのMCAM発現細胞浸潤を特徴とする、前記使用。

請求項28

哺乳類対象にて中枢神経系(CNS)の炎症性疾患を治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用であって、前記CNSへのMCAM発現細胞の浸潤を特徴とする、前記使用。

請求項29

哺乳類対象にて多発性硬化症を治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用。

請求項30

哺乳類対象にて乾癬を治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用。

請求項31

哺乳類対象にてたとえば、黒色腫のような固形腫瘍を治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用。

請求項32

哺乳類対象にてサルコイドーシスを治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用。

請求項33

哺乳類対象にて乾癬性関節炎を治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用。

請求項34

哺乳類対象にてパーキンソン病を治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用。

請求項35

哺乳類対象にてアレルギー性接触皮膚炎を治療するための薬物の製造における請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体の使用。

請求項36

炎症の部位へのMCAM発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性疾患の治療方法であって、それを必要とする哺乳類対象に有効量の、請求項1〜25または44〜46いずれか一項に記載の前記ヒト化抗体または前記単離された抗MCAM抗体を投与することを含む、前記治療方法。

請求項37

前記MCAM発現細胞がTH17細胞である請求項36に記載の方法。

請求項38

前記哺乳類対象がヒトである請求項27〜37のいずれか一項に記載の方法または使用。

請求項39

MCAMモノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸残基318を含むヒトMCAM(配列番号11)の5〜50の隣接するアミノ酸残基を含む、前記単離されたペプチド。

請求項40

前記ペプチドがキャリアポリペプチドに連結される請求項39に記載の単離されたペプチド。

請求項41

前記ペプチドがアジュバントと併用される請求項39または請求項40に記載の単離されたペプチド。

請求項42

ラミニンα−4鎖へのヒトMCAMの結合を阻害する抗体の生成方法であって、(a)請求項39〜41のいずれか一項に記載のペプチドで対象を免疫することと、(b)B細胞を対象から単離し、前記B細胞が抗体を分泌することと、(c)前記抗体をスクリーニングして、ラミニンα−4鎖へのヒトMCAMの結合を阻害する抗体を特定することとを含む、前記生成方法。

請求項43

さらに(d)培養にて前記B細胞を不死化細胞と融合させてモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成することと、(e)前記ハイブリドーマ細胞を培養することと(f)培養物からモノクローナル抗体を単離することとを含む、請求項42に記載の方法。

請求項44

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156の前記アミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160の前記アミノ酸配列を有し、前記ヒト化抗体が配列番号173のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と、配列番号170のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とを含む請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項45

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156の前記アミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160の前記アミノ酸配列を有し、前記ヒト化抗体が配列番号173のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と、配列番号171のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とを含む請求項1に記載のヒト化抗体。

請求項46

前記成熟重鎖可変領域が配列番号156の前記アミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号160の前記アミノ酸配列を有し、前記ヒト化抗体が配列番号174のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と、配列番号171のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とを含む請求項1に記載のヒト化抗体。

技術分野

0001

関連出願への相互参照
本出願は、2014年3月12日に出願された米国仮特許出願第61/952,123号、2014年7月11日に出願された米国仮特許出願第62/023,698号、及び2014年10月24日に出願された米国仮特許出願第62/068,438号に対して優先権を主張し、前述の出願はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

0002

配列表、表またはコンピュータプログラムリストへの参照
「抗MCAM抗体及び関連する使用方法」について2015年3月4日に作成したファイル459014SEQLIST.txtに書き込まれた配列表は148キロバイトである。このファイルに含有される情報は参照によって本明細書に組み入れられる。

背景技術

0003

TH17細胞(Tヘルパー17細胞)と呼ばれるCD4+T細胞のサブセットは、多数の自己免疫疾患、特に、たとえば、多発性硬化症及び動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のようなT細胞のCNS浸潤関与する神経炎症性の状態の病態形成に関与している。TH17細胞はIL−17及びIL−22を含む多数の選ばれたサイトカイン分泌することが報告されている。TH17細胞は特異的な動員及び組織の浸潤を起こすことが報告されている。MCAMはTH17細胞上で発現され、リガンドとしてラミニンα−4を結合することが報告されている。

0004

本発明は、配列番号156の3つのKabatのCDRを含み、及び配列番号156に対して少なくとも97%同一である成熟重鎖可変領域と、配列番号160の3つのKabatのCDRを含み、及び配列番号160に対して少なくとも97%同一である成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体を提供する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号156に対して少なくとも98%または99%同一であり、及び成熟軽鎖可変領域は配列番号160に対して少なくとも98%または99%同一である。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号156のアミノ酸配列を有し、及び成熟軽鎖可変領域は配列番号160のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域の93位(Kabatの番号付け)がTによって占められ;成熟重鎖可変領域の42位(Kabatの番号付け)がEによって占められ;成熟軽鎖可変領域の43位(Kabatの番号付け)がSによって占められ;成熟軽鎖可変領域の9位(Kabatの番号付け)がSによって占められ;成熟軽鎖可変領域の19位(Kabatの番号付け)がVによって占められる。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域の93位(Kabatの番号付け)がTによって占められ;成熟重鎖可変領域の42位(Kabatの番号付け)がEによって占められ;成熟重鎖可変領域の3位(Kabatの番号付け)がKによって占められ;成熟軽鎖可変領域の43位(Kabatの番号付け)がSによって占められ;成熟軽鎖可変領域の9位(Kabatの番号付け)がSによって占められ;成熟軽鎖可変領域の19位(Kabatの番号付け)がVによって占められる。一部の抗体では、成熟重鎖定常領域は配列番号173若しくは174のアミノ酸配列を有し、及び/または成熟軽鎖定常領域は配列番号170若しくは171のアミノ酸配列を有する。

0005

本発明はさらに、アミノ酸残基318を含むエピトープにてヒトMCAM(配列番号11)に結合する抗MCAM抗体を提供する。一部のそのような抗体では、エピトープはアミノ酸残基324を含む。一部のそのような抗体では、エピトープはアミノ酸残基326を含む。一部の抗体では、エピトープはアミノ酸残基318を含むヒトMCAMの少なくとも5つの隣接するアミノ酸残基を含む。一部のそのような抗体では、該抗体は、
(a)配列番号18に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号13に相当する成熟軽鎖可変領域とを有するクローン15;
(b)配列番号7に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号2に相当する成熟軽鎖可変領域とを有するクローン17;
(c)配列番号35に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号30に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する1174.1.3;
(d)配列番号45に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号40に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する1414.1.2;
(e)配列番号55に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号50に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する1415.1.1;
(f)配列番号65に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号60に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する1749.1.3;
(g)配列番号77に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号70に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する2120.4.19;
(h)配列番号89に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号84に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する2107.4.10;及び
(i)モノクローナル抗体、1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19及び2107.4.10に実質的に由来するCDRを含む抗体から成る群から選択される抗体ではない。一部のそのような抗体では、該抗体はモノクローナルである。一部のそのような抗体では、該抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ化抗体またはヒト抗体である。
一部のそのような抗体では、該抗体は、
(a)配列番号18に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号13に相当する成熟軽鎖可変領域とを有するクローン15;
(b)配列番号7に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号2に相当する成熟軽鎖可変領域とを有するクローン17;
(c)配列番号35に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号30に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する1174.1.3;
(d)配列番号45に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号40に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する1414.1.2;
(e)配列番号55に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号50に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する1415.1.1;
(f)配列番号65に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号60に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する1749.1.3;
(g)配列番号77に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号70、71または72に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する2120.4.19;
(h)配列番号89に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号82または84に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する2107.4.10;及び
(i)モノクローナル抗体、1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19及び2107.4.10に実質的に由来するCDRを含む抗体から成る群から選択される抗体ではない。一部のそのような抗体では、該抗体はモノクローナルである。一部のそのような抗体では、該抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、べニヤ抗体またはヒト抗体である。

0006

本発明はさらに、上述の抗体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。

0007

本発明はさらに、身体における炎症の部位へのMCAM発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性疾患治療のための薬物の製造における前述の抗体のいずれかの使用を提供する。そのような炎症性疾患は、中枢神経系(CNS)へのMCAM発現細胞の浸潤を特徴とするCNSの炎症性疾患であってもよい。

0008

本発明はさらに多発性硬化症、パーキンソン病アレルギー性接触皮膚炎乾癬乾癬性関節炎関節リウマチサルコイドーシス炎症性大腸疾患、クローン病、または、たとえば、黒色腫のような癌(たとえば、固形腫瘍または血液腫瘍)の治療のための薬物の製造における前述の抗体のいずれかの使用を提供する。

0009

本発明はさらに、炎症の部位へのMCAM発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性疾患を治療する方法を提供し、該方法はそれを必要とする哺乳類対象に有効量の上述の抗体のいずれかを投与することを含む。一部の方法では、疾患は、多発性硬化症、パーキンソン病、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、炎症性大腸疾患、クローン病、または、たとえば、黒色腫のような癌(たとえば、固形腫瘍または血液腫瘍)である。一部の方法では、MCAM発現細胞はTH17細胞である。一部の方法では、哺乳類対象はヒトである。方法の一部では、抗体は、ラミニンα−4を含むタンパク質へのMCAMの結合を阻害する。一部の方法では、哺乳類対象はヒトである。方法の一部では、MCAM発現細胞はTH17細胞である。

0010

本発明はさらに、抗MCAMモノクローナル抗体を結合するエピトープを含む単離されたペプチドを提供し、その際、該ペプチドはアミノ酸残基318を含むヒトMCAM(配列番号11)の5〜50の隣接するアミノ酸残基を含む。これらのペプチドの一部では、該ペプチドはキャリアポリペプチドに連結される。これらのペプチドの一部では、該ペプチドはアジュバントと併用される。

0011

本発明はさらに、
(a)上述のペプチドで対象を免疫することと、
(b)B細胞を対象から単離し、該B細胞が抗体を分泌することと、
(c)抗体をスクリーニングしてラミニンα−4鎖へのヒトMCAMの結合を阻害する抗体を特定することとを含む、ラミニンα−4鎖へのヒトMCAMの結合を阻害する抗体を生成する方法を提供する。方法の一部では、該方法はさらに
(d)培養にてB細胞を不死化した細胞と融合させ、モノクローナルな抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成することと、
(e)該ハイブリドーマ細胞を培養することと、
(f)培養物からモノクローナル抗体を単離することとを含む。

図面の簡単な説明

0012

決定的なクローンの特定を示す図である。平均表面発現値の関数としてプロットした1749.1.3の平均結合値(灰色の菱形)。<30%のモノクローナル抗体の反応性と>50%のマウス血清の結合の閾値を適用して抗体結合については陰性であるが、表面発現については陽性であるクローン(黒色の菱形)を特定した。

0013

C272、Y318、C320、V340、及びW377を含む1749.1.3についての潜在的に決定的な結合部位として特定された5つの残基の位置を示す、ヒトMCAMの相同性モデルを示す図である。

0014

ヒト化1749軽鎖成熟可変領域を伴った1749.1.3のアミノ酸配列の配列比較を示す。ABA71407.1及びCAI99800.1はヒトのアクセプターVL配列である。Kabatの定義に従ったCDR領域は灰色で強調する。

0015

ヒト化1749重鎖成熟可変領域を伴った1749.1.3のアミノ酸配列の配列比較を示す。AAX82494.1及びADX65676.1はヒトのアクセプターHL配列である。Kabatの定義に従ったCDR領域は灰色で強調する。

0016

配列の簡単な説明
配列番号1は、抗体クローン17の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0017

配列番号2は、抗体クローン17の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0018

配列番号3は、抗体クローン17のCDRL1のアミノ酸配列である。

0019

配列番号4は、抗体クローン17のCDRL2のアミノ酸配列である。

0020

配列番号5は、抗体クローン17のCDRL3のアミノ酸配列である。

0021

配列番号6は、抗体クローン17の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0022

配列番号7は、抗体クローン17の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0023

配列番号8は、抗体クローン17のCDRH1のアミノ酸配列である。

0024

配列番号9は、抗体クローン17のCDRH2のアミノ酸配列である。

0025

配列番号10は、抗体クローン17のCDRH3のアミノ酸配列である。

0026

配列番号11は、ヒトMCAM受入番号CAA48332のアミノ酸配列である。

0027

配列番号12は、抗体クローン15の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0028

配列番号13は、抗体クローン15の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0029

配列番号14は、抗体クローン15のCDRL1のアミノ酸配列である。

0030

配列番号15は、抗体クローン15のCDRL2のアミノ酸配列である。

0031

配列番号16は、抗体クローン15のCDRL3のアミノ酸配列である。

0032

配列番号17は、抗体クローン15の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0033

配列番号18は、抗体クローン15の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0034

配列番号19は、抗体クローン15のCDRH1のアミノ酸配列である。

0035

配列番号20は、抗体クローン15のCDRH2のアミノ酸配列である。

0036

配列番号21は、抗体クローン15のCDRH3のアミノ酸配列である。

0037

配列番号22は、ヒトMCAMドメイン1(残基19〜129)のアミノ酸配列である。

0038

配列番号23は、ヒトMCAMドメイン2(残基139〜242)のアミノ酸配列である。

0039

配列番号24は、ヒトMCAMドメイン3(残基244〜321)のアミノ酸配列である。

0040

配列番号25は、ヒトMCAMドメイン4(残基355〜424)のアミノ酸配列である。

0041

配列番号26は、ヒトMCAMドメイン5(残基430〜510)のアミノ酸配列である。

0042

配列番号27は、ヒトラミニン411のα4−鎖アイソフォームのアミノ酸配列である(受入番号NP001098676)。

0043

配列番号28は、ヒトラミニン411のα4−鎖アイソフォームのアミノ酸配列である(受入番号CAA48332)。

0044

配列番号29は、抗体1174.1.3の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0045

配列番号30は、抗体1174.1.3の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0046

配列番号31は、抗体1174.1.3のCDRL1のアミノ酸配列である。

0047

配列番号32は、抗体1174.1.3のCDRL2のアミノ酸配列である。

0048

配列番号33は、抗体1174.1.3のCDRL3のアミノ酸配列である。

0049

配列番号34は、抗体1174.1.3の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0050

配列番号35は、抗体1174.1.3の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0051

配列番号36は、抗体1174.1.3のCDRH1のアミノ酸配列である。

0052

配列番号37は、抗体1174.1.3のCDRH2のアミノ酸配列である。

0053

配列番号38は、抗体1174.1.3のCDRH3のアミノ酸配列である。

0054

配列番号39は、抗体1414.1.2の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0055

配列番号40は、抗体1414.1.2の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0056

配列番号41は、抗体1414.1.2のCDRL1のアミノ酸配列である。

0057

配列番号42は、抗体1414.1.2のCDRL2のアミノ酸配列である。

0058

配列番号43は、抗体1414.1.2のCDRL3のアミノ酸配列である。

0059

配列番号44は、抗体1414.1.2の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0060

配列番号45は、抗体1414.1.2の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0061

配列番号46は、抗体1414.1.2のCDRH1のアミノ酸配列である。

0062

配列番号47は、抗体1414.1.2のCDRH2のアミノ酸配列である。

0063

配列番号48は、抗体1414.1.2のCDRH3のアミノ酸配列である。

0064

配列番号49は、抗体1415.1.1の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0065

配列番号50は、抗体1415.1.1の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0066

配列番号51は、抗体1415.1.1のCDRL1アミノ酸配列である。

0067

配列番号52は、抗体1415.1.1のCDRL2アミノ酸配列である。

0068

配列番号53は、抗体1415.1.1のCDRL3アミノ酸配列である。

0069

配列番号54は、抗体1415.1.1の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0070

配列番号55は、抗体1415.1.1の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0071

配列番号56は、抗体1415.1.1のCDRH1のアミノ酸配列である。

0072

配列番号57は、抗体1415.1.1のCDRH2のアミノ酸配列である。

0073

配列番号58は、抗体1415.1.1のCDRH3のアミノ酸配列である。

0074

配列番号59は、抗体1749.1.3の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0075

配列番号60は、抗体1749.1.3の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0076

配列番号61は、抗体1749.1.3のCDRL1のアミノ酸配列である。

0077

配列番号62は、抗体1749.1.3のCDRL2のアミノ酸配列である。

0078

配列番号63は、抗体1749.1.3のCDRL3のアミノ酸配列である。

0079

配列番号64は、抗体1749.1.3の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0080

配列番号65は、抗体1749.1.3の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0081

配列番号66は、抗体1749.1.3のCDRH1のアミノ酸配列である。

0082

配列番号67は、抗体1749.1.3のCDRH2のアミノ酸配列である。

0083

配列番号68は、抗体1749.1.3のCDRH3のアミノ酸配列である。

0084

配列番号69は、抗体2120.4.19の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0085

配列番号70は、配列番号69で示された抗体2120.4.19の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0086

配列番号71は、抗体2120.4.19の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0087

配列番号72は、抗体2120.4.19の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0088

配列番号73は、抗体2120.4.19のCDRL1のアミノ酸配列である。

0089

配列番号74は、抗体2120.4.19のCDRL2のアミノ酸配列である。

0090

配列番号75は、抗体2120.4.19のCDRL3のアミノ酸配列である。

0091

配列番号76は、抗体2120.4.19の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0092

配列番号77は、抗体2120.4.19の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0093

配列番号78は、抗体2120.4.19のCDRH1のアミノ酸配列である。

0094

配列番号79は、抗体2120.4.19のCDRH2のアミノ酸配列である。

0095

配列番号80は、抗体2120.4.19のCDRH3のアミノ酸配列である。

0096

配列番号81は、抗体2107.4.10の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0097

配列番号82は、配列番号81で示された抗体2107.4.10の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0098

配列番号83は、抗体2107.4.10の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0099

配列番号84は、配列番号83で示された抗体2107.4.10の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0100

配列番号85は、抗体2107.4.10のCDRL1のアミノ酸配列である。

0101

配列番号86は、抗体2107.4.10のCDRL2のアミノ酸配列である。

0102

配列番号87は、抗体2107.4.10のCDRL3のアミノ酸配列である。

0103

配列番号88は、抗体2107.4.10の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。

0104

配列番号89は、抗体2107.4.10の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0105

配列番号90は、抗体2107.4.10のCDRH1のアミノ酸配列である。

0106

配列番号91は、抗体2107.4.10のCDRH2のアミノ酸配列である。

0107

配列番号92は、抗体2107.4.10のCDRH3のアミノ酸配列である。

0108

配列番号93は、抗体1749.1.3の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0109

配列番号94は、ヒト化抗体1749のバージョン1(VH1)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0110

配列番号95は、ヒト化抗体1749のバージョン2(VH2)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0111

配列番号96は、重鎖可変フレームワークドナーU96282_VHのアミノ酸配列である。

0112

配列番号97は、抗体1749.1.3の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0113

配列番号98は、ヒト化抗体1749のバージョン1(VL1)の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0114

配列番号99は、ヒト化抗体1749のバージョン2(VL2)の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0115

配列番号100は、軽鎖可変フレームワークドナーX02990_VLのアミノ酸配列である。

0116

配列番号101は、抗体2107.4.10.18の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0117

配列番号102は、ヒト化抗体2107のバージョン1(VH1)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0118

配列番号103は、ヒト化抗体2107のバージョン2(VH2)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0119

配列番号104は、ヒト化抗体2107のバージョン3(VH3)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0120

配列番号105は、ヒト化抗体2107のバージョン4A(VH4A)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0121

配列番号106は、ヒト化抗体2107のバージョン5A(VH5A)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0122

配列番号107は、ヒト化抗体2107のバージョン6(VH6)のの成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0123

配列番号108は、重鎖可変フレームワークドナーAF062133_VHのアミノ酸配列である。

0124

配列番号109は、抗体2107.4.10.18の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0125

配列番号110は、ヒト化抗体2107のバージョン1(VL1)の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0126

配列番号111は、ヒト化抗体2107のバージョン2(VL2)の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0127

配列番号112は、ヒト化抗体2107のバージョン3(VL3)の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0128

配列番号113は、軽鎖可変フレームワークドナーU86803のアミノ酸配列である。

0129

配列番号114は、抗体2120.4.19.6の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0130

配列番号115は、ヒト化抗体2120のバージョン1(VH1)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0131

配列番号116は、ヒト化抗体2120のバージョン2(VH2)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0132

配列番号117は、ヒト化抗体2120のバージョン3(VH3)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0133

配列番号118は、ヒト化抗体2120のバージョン4(VH4)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0134

配列番号119は、ヒト化抗体2120のバージョン5(VH5)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0135

配列番号120は、抗体2120.4.19.6の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0136

配列番号121は、ヒト化抗体2120のバージョン1(VL1)の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0137

配列番号122は、ヒト化抗体2120のバージョン2(VL2)成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0138

配列番号123は、ヒト化抗体2120のバージョン3(VL3)成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0139

配列番号124は、軽鎖可変フレームワークドナーX84343_VLのアミノ酸配列である。

0140

配列番号125は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0141

配列番号126は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0142

配列番号127は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0143

配列番号128は、ヒト化重鎖/軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0144

配列番号129は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0145

配列番号130は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0146

配列番号131は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0147

配列番号132は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0148

配列番号133は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0149

配列番号134は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0150

配列番号135は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0151

配列番号136は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0152

配列番号137は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0153

配列番号138は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0154

配列番号139は、ヒト化抗体2120のバージョン3(VH3)のCDRH1のアミノ酸配列である。

0155

配列番号140は、ヒト化抗体2120のバージョン4(VH4)のCDRH1のアミノ酸配列である。

0156

配列番号141は、ヒト化抗体2120のバージョン5(VH5)のCDRH1のアミノ酸配列である。

0157

配列番号142は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0158

配列番号143は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0159

配列番号144は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0160

配列番号145は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0161

配列番号146は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0162

配列番号147は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0163

配列番号148は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0164

配列番号149は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0165

配列番号150は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0166

配列番号151は、ヒト化抗体2107のバージョン1(VH1)のCDRH1のアミノ酸配列である。

0167

配列番号152は、ヒト化抗体2107のバージョン4(VH4)のCDRH1のアミノ酸配列である。

0168

配列番号153は、ヒト化抗体2120のバージョン1〜5(VH1〜VH5)のCDRH3のアミノ酸配列である。

0169

配列番号154は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0170

配列番号155は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。

0171

配列番号156は、ヒト化抗体1749のバージョン3(VH3)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0172

配列番号157は、マウス重鎖可変領域の構造テンプレートPBD#1HILVHのアミノ酸配列である。

0173

配列番号158は、重鎖可変アクセプターフレームワークACC#AAX82494.1のアミノ酸配列である。

0174

配列番号159は、重鎖可変アクセプターフレームワークACC#ADX65676.1のアミノ酸配列である。

0175

配列番号160は、ヒト化抗体1749のバージョン3(VL3)の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0176

配列番号161は、マウス軽鎖可変領域の構造テンプレートPDB#2LTQVLのアミノ酸配列である。

0177

配列番号162は、軽鎖可変アクセプターフレームワークACC#ABA71407.1のアミノ酸配列である。

0178

配列番号163は、軽鎖可変アクセプターフレームワークCAI99800.1のアミノ酸配列である。

0179

配列番号164は、成熟重鎖または成熟軽鎖の可変領域に融合することができる例となるシグナルペプチドをコードする核酸配列である。

0180

配列番号165は、配列番号164の核酸配列によってコードされる例となるシグナルペプチドのアミノ酸配列である。

0181

配列番号166は、成熟重鎖または成熟軽鎖の可変領域に融合することができる例となるシグナルペプチドをコードする核酸配列である。

0182

配列番号167は、配列番号166の核酸配列によってコードされる例となるシグナルペプチドのアミノ酸配列である。

0183

配列番号168は、成熟重鎖または成熟軽鎖の可変領域に融合することができる例となるシグナルペプチドをコードする核酸配列である。

0184

配列番号169は、配列番号:168の核酸配列によってコードされる例となるシグナルペプチドのアミノ酸配列である。

0185

配列番号170は、N末端アルギニンを伴うヒト化1749軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。

0186

配列番号171は、N末端でアルギニンを伴わないヒト化1749軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。

0187

配列番号172は、ヒト化1749重鎖定常領域のアミノ酸配列である。

0188

配列番号173は、BIPバージョンの重鎖G1m3アロタイプ定常領域のアミノ酸配列である。

0189

配列番号174は、BIPバージョンの重鎖G1m3アロタイプ定常領域のアミノ酸配列である。

0190

配列番号175は、ヒト化抗体1749のバージョン3(VL3+軽鎖定常領域)の成熟軽鎖領域のアミノ酸配列である。

0191

配列番号176は、ヒト化抗体1749のバージョン3(VH3+BIPバージョンの重鎖G1m3アロタイプ定常領域)の成熟重鎖領域のアミノ酸配列である。

0192

配列番号177は、ヒト化抗体1749のバージョン3(VH3+BIPバージョンの重鎖G1m3アロタイプ定常領域)の成熟重鎖領域のアミノ酸配列である。

0193

配列番号178は、ヒト化抗体2107のバージョン4B(VH4B)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0194

配列番号179は、ヒト化抗体2107のバージョン5B(VH5B)の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。

0195

定義
モノクローナル抗体は通常単離された形態で提供される。このことは、抗体は通常、少なくとも50%w/w純粋なタンパク質及びその製造または精製から生じる他の高分子であるが、その使用を円滑にするように意図される、過剰量の薬学上許容可能なキャリアまたは他のビヒクルにモノクローナル抗体が組み合わせられる可能性を排除しないことを意味する。モノクローナル抗体は、少なくとも60%、70%、80%、90%、95または99%w/w純粋なタンパク質と製造または精製に由来する他の高分子とであることがある。

0196

その標的抗原へのモノクローナル抗体の特異的な結合は、少なくとも106、107、108、109、または1010M−1の親和性を意味する。特異的な結合は検出可能に高い規模であり、少なくとも1つの無関係な標的に対して生じる非特異的な結合とは区別可能である。特異的な結合は、特定の官能基間での結合の形成または特定の空間適合(たとえば、鍵と鍵穴型)の形成の結果であり得るのに対して、非特異的な結合は普通、ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的な結合は、モノクローナル抗体が1つの標的に結合する及び1つの標的にしか結合しないことを必ずしも意味しない。

0197

抗体の基本的な構造単位サブユニット四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対を含み、各対は1つの「軽」鎖(約25kDa)と1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は切断可能なシグナルペプチドに連結されて当初発現される。シグナルペプチドを持たない可変領域は成熟可変領域と呼ばれることがある。従って、たとえば、軽鎖成熟可変領域は軽鎖のシグナルペプチドを持たない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。

0198

軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマミューアルファデルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれIgGIgMIgAIgD及びIgEとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖及び重鎖の範囲内で、可変領域と定常領域は約12以上のアミノ酸の「J」領域によって接合され、重鎖は約10以上のアミノ酸の「D」領域も含む。(一般に、あらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられるFundamental Immunology(Paul,W.,編,第2版.Raven Press,N.Y.,1989,Ch.7を参照のこと)。

0199

各軽鎖/重鎖の対の成熟可変領域は抗体結合部位を形成する。従って、インタクトな抗体は2つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性の抗体を除いて、2つの結合部位は同一である。鎖はすべて、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって接合される相対的に保存されたフレームワーク領域(FR)の同一一般構造を示す。各対の2つの鎖に由来するCDRはフレームワーク領域によって調整されて特異的なエピトープへの結合を可能にする。N末端からC末端に向かって、軽鎖及び重鎖の双方はドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当てはKabatのSequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987及び1991),またはChothia及びLeskのJ.Mol.Biol.196:901−917(1987);Chothiaら,Nature,342:878−883(1989)の定義に従う。Kabatはまた、異なる重鎖間または異なる軽鎖間での対応する残基には同じ番号が割り当てられる(たとえば、H83は成熟重鎖可変領域におけるKabatの番号付けによる83位を意味し;同様にL36位は成熟軽鎖可変領域におけるKabatの番号付けによる36位を意味する、広く使用されている番号付け法(Kabatの番号付け)も提供している。明白に言及されない限り、抗体の可変領域における位置を参照するには全体を通してKabatの番号付けを使用する。

0200

用語「抗体」には、インタクトな抗体及びその抗原結合断片が含まれる。通常、別々の重鎖、軽鎖のFab、Fab’、F(ab’)2、F(ab)c、二重抗体、Dabs、ナノ抗体、及びFvを含む断片は、標的に対する特異的な結合についてそれらが由来するインタクトな抗体と競合する。断片は、組換えDNA法、またはインタクトな免疫グロブリン酵素的な若しくは化学的な分離によって作出することができる。

0201

用語「抗体」には、二重特異性抗体及び/またはキメラ抗体、及び/またはヒト化抗体も含まれる。二重特異性または二官能性の抗体は、2つの異なる重鎖/軽鎖の対及び2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である(たとえば、Songsivilai及びLachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315−321(1990);Kostelnyら,J.Immunol.148:1547−53(1992)を参照のこと)。一部の二重特異性抗体では、2つの異なる重鎖/軽鎖の対は、ヒト化重鎖/軽鎖の対及び異なるエピトープに特異的な重鎖/軽鎖の対を含んでもよい。

0202

一部の二重特異性抗体では、一方の重鎖軽鎖の対は以下でさらに開示されるようなヒト化抗体であり、重鎖軽鎖対は、たとえば、インスリン受容体インスリン様増殖因子(IGF)受容体レプチン受容体またはリポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体のような脳血管関門で発現される受容体に結合する抗体に由来する(Fridenら,PNAS,88:4771−4775,1991;Fridenら,Science,259:373−377,1993)。そのような二重特異性抗体は、受容体が介在するトランスサイトーシスによって脳血管関門を横切って移動することができる。二重特異性抗体を操作して脳血管関門の受容体への親和性を低下させることによって二重特異性抗体の脳での取り込みをさらに高めることができる。受容体への親和性の低下は脳におけるさらに広い分布を生じた(たとえば、Atwalら.Sci.Trans.Med.3,84ra43,2011;Yuら.Sci.Trans.Med.3,84ra44,2011を参照のこと)。

0203

例となる二重特異性抗体は、(1)二重可ドメイン抗体(DVD−Ig)であることができ、その際、各軽鎖及び重鎖は短いペプチド結合を介して2つの可変ドメイン直列に含有し(Wuら,Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD−Ig(商標))Molecule,In:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010));(2)標的抗原のそれぞれに対して2つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体を生じる2つの単鎖特異抗体融合体であるタンデム二特異抗体(Tandab)であることができ;(3)多価分子を生じるscFvと二特異抗体との組み合わせであるフレキシボディであることができ;(4)Fabsに適用すると異なるFab断片に連結された2つの同一のFab断片から成る三価の二重特異性の結合タンパク質を得ることができるタンパク質キナーゼAにおける二量体化及びドッキングドメインに基づいた、いわゆる「ドックアンドロック」分子であることができ;(5)たとえば、ヒトFc領域の両端に融合された2つのscFvを含むいわゆる、いわゆるスコーピオン分子であることができる。二重特異性抗体を調製するのに有用なプラットフォームの例には、BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab及びMab2(F−star)、Fc−操作したIgG1(Xencor)またはDuoBody(Fabアーム交換に基づく、Genmab)が挙げられるが、これらに限定されない。

0204

用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原における部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸、または1以上のタンパク質の三次折り畳みによって並置される隣接しないアミノ酸から形成することができる。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープは変性溶媒への曝露の際、通常保持されるのに対して、三次折り畳みによって形成されたエピトープは変性溶媒による処理の際、通常失われる。エピトープは通常、独特空間構成にて少なくとも3、さらに普通では少なくとも5または8〜10のアミノ酸を含む。エピトープの空間構成を決定する方法には、たとえば、X線結晶学及び二次元核磁気共鳴が挙げられる。たとえば、Epitope MappingProtocols,in Methodsin Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed.(1996)を参照のこと。

0205

アンタゴニスト」抗体または他の結合作用因子は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するものである。そのような抗体は実質的にまたは完全に抗原の生物活性を阻害する。

0206

MCAMに関する用語「生物活性」及び「生物学的に活性のある」は、そのリガンド(ラミニンα4鎖、たとえば、ラミニン411のα4鎖)を特異的に結合するその能力及び/またはMCAM発現細胞、たとえば、TH17細胞のCNSへの浸潤を促す能力を指す。

0207

「阻害する」は、少なくとも1つの標的、たとえば、MCAMの生物活性を低下させる作用因子を意味する。そのような阻害剤は、少なくとも1つの標的の活性を少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約95%または少なくとも約100%阻害する。

0208

「対象」には、予防上のまたは治療上の処置を受けるヒトまたは他の哺乳類の対象が含まれる。

0209

アミノ酸置換を保存的なものまたは非保存的なものとして分類する目的で、アミノ酸を以下のようにグループ分けする:グループI(疎水性側鎖):met、ala、val、leu、ile;グループII(中性親水性側鎖):cys、ser、thr;グループIII(酸性側鎖):asp、glu;グループIV(塩基性側鎖):asn、gln、his、lys、arg;グループV(鎖配向に影響を与える残基):gly、pro;及びグループVI(芳香族側鎖):trp、tyr、phe。保存的置換には同一クラスにおけるアミノ酸間の置換が含まれる。非保存的置換はこれらのクラスの1つのメンバーを別クラスのメンバーと交換することに相当する。

0210

配列同一性比率はKabatの番号付け法によって最大限並べられた抗体配列によって決定される。配列比較の後、対象抗体領域(たとえば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体)が参照抗体の同じ領域と比較されているのであれば、対象抗体と参照抗体の領域の間での配列同一性比率は、ギャップ計数せずに2つの領域の並べられた位置の総数によって割られた対象及び参照の抗体領域双方における同一アミノ酸によって占められる位置の数であり、100を乗じて比率に変換する。

0211

1以上の引用された要素を「含む」組成物または方法は、具体的に引用されていない他の要素を含んでもよい。たとえば、抗体を含む組成物は抗体のみを含有してもよいし、または他の成分との組み合わせで抗体を含有してもよい。

0212

値の範囲の指定には、範囲の範囲内のまたは範囲を定義するすべての整数及び範囲の範囲内の整数によって定義される部分範囲のすべてが含まれる。

0213

文脈から明らかではない限り、用語「約」は言及される値の測定値標準誤差(SEM)の範囲内の値を包含する。

0214

統計的有意性はp≦0.05を意味する。

0215

I.概要
ラミニン411のラミニンα4鎖へのMCAMの結合を阻害する有用な特性を持つ抗体はWO/2012/170071及びPCT/US2013/058773にて開示されている。本出願は、とりわけ、(a)1749.1.3抗体の新規ヒト化形態を提供し、(b)1749.1.3抗体が結合するエピトープをマッピングし、(c)同じエピトープに結合する抗体を提供する。

0216

用語「1749.1.3」、「m1749」または「マウス1749」抗体は、配列番号93に相当する成熟可変重鎖と配列番号97に相当する成熟可変軽鎖を有するマウス由来のモノクローナル抗体のクローンを指す。「ヒト化1749」または「hu1749」は1749.1.3クローンのヒト化変異体を指す。配列番号156に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号160に相当する成熟軽鎖可変領域を有する1749のヒト化変異体は本明細書では「hu1749VH3VL3」と呼ばれる。

0217

II.標的分子
天然ヒト野生型MCAM(CD146及びMUC18としても知られる黒色腫細胞接着分子)は以下のアミノ酸配列を有する646アミノ酸のペプチドである:
GLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLHVDFSHKEKRTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTVTPQDERFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYCELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPGMLKEGDRVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVSVSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEASGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRGVVIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEITLPPSRKTELVVEVKSDKLPEEMGLLQGSSGDKRAPGDQGEKYIDLRH(配列番号11)(受入番号AAA20922.1(CAA48332)のもとでのGenBankデータベース)。MCAMは、細胞接着、及び血管組織の細胞間接合部での内皮単層接着に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面の糖タンパク質である。それはまた、黒色腫及び前立腺癌を含む固形腫瘍のような多数の癌の腫瘍進行も促進する。それは同型同種親和性相互作用することが知られており、他のリガンドにも結合し得る。ヒトMCAMには、配列番号22〜26として示される5つの免疫グロブリンドメイン(1:アミノ酸残基19〜129;2:アミノ酸残基139〜242;3:アミノ酸残基244〜321;4:アミノ酸残基335〜424;及び5:アミノ酸残基430〜510)が含まれる。

0218

文脈から明らかではない限り、MCAMまたはその断片への参照には、上記で示された天然のヒト野生型アミノ酸配列及びそのヒト対立遺伝子変異体が含まれる。

0219

ラミニンα4はラミニン分子に見いだされるポリペプチド鎖の1つを指し、それは、ほとんどの細胞及び組織にとってタンパク質ネットワーク基盤である(基底膜の)基底板にて発現される。ラミニンは原形質膜分子を介して細胞膜に結合し、細胞の接着に寄与することが知られている。ラミニンα4鎖は通常、ラミニンβ鎖及びラミニンγ鎖と共に複合体を形成する。ラミニンα4鎖は、ラミニン411(ラミニン8またはα4β1γ1);ラミニン421(ラミニン9またはα4β2γ1)、及びラミニン423(ラミニン14またはα4β2γ3)を含む多数のラミニン分子で見いだされる。ヒトラミニンα4鎖には2つの主なアイソフォームがある:GenBank受入番号NP001098676及びCAA48332(配列番号27及び28)。「ラミニン411」は3つのポリペプチドのサブユニットまたは鎖:α4鎖、β1鎖及びγ1鎖で構成される三量体ポリペプチド複合体を指す。

0220

MCAMに対するアンタゴニストには、抗体、IgG定常領域に対する受容体またはリガンドの融合タンパク質、他の生物結合分子、及び小分子が挙げられる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体は、たとえば、マウス若しくはラット非ヒト霊長類のような非ヒト性であることができ、またはヒト性であることができる。抗体はキメラ抗体、ベニヤ化抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体等であることができる。

0221

MCAMアンタゴニストは、MCAMの(i)そのリガンド:ラミニンα4鎖、たとえば、ラミニン411のα4鎖を特異的に結合する能力、及び/または(ii)MCAM発現細胞、たとえば、TH17細胞が対象の組織に浸潤するまたは移動するのを促す能力を完全にまたは部分的に阻害するアンタゴニストを指す。MCAMアンタゴニストには、MCAMまたはそのリガンドラミニンアルファ4に結合する抗体または他のアンタゴニストが挙げられる。

0222

III.抗体
A.抗MCAM抗体1749のヒト化形態
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体に由来するCDRがヒトの「アクセプター」抗体配列に移植される遺伝子操作された抗体である(たとえば、Queenら,US5,530,101及びUS5,585,089;Winterら,US5,225,539;Carter,US6,407,213;Adair,US5,859,205及びUS6,881,557;及びFoote,US6,881,557を参照のこと)。アクセプター抗体配列は、たとえば、ヒト抗体成熟可変領域配列、そのような配列の複合物、ヒト抗体可変領域配列のコンセンサス配列(たとえば、Kabatの軽鎖及び重鎖の可変領域コンセンサス配列、1991上記)、または生殖系列細胞の可変領域配列であることができる。

0223

重鎖のアクセプター配列の例は、NCBI受入コードAAX82494.1(GI:62421461)及び/またはADX65676.1(GI:323432073)を持つヒトの成熟重鎖可変領域である。好ましくは、これらのアクセプターの複合物が本実施例と同様に使用される。重鎖可変領域フレームワークにおいてm1749重鎖とAAX82494.1は91%の配列同一性を有し、ADX65676.1は83%の配列同一性を有するので、これらのアクセプター配列には、同一の規定形態とじれた(kinked)塩基を持つ同じ長さのCDR−H3とを有する2つのCDRが含まれる。軽鎖については、アクセプター配列の例は、NCBI受入コードABA71407.1(GI:77379502)及び/またはCAI99800.1(GI:98956324)を持つ軽鎖成熟可変領域である。好ましくは、これらの配列の複合物が本実施例と同様に使用される。軽鎖可変領域フレームワークにてm1749軽鎖とABA71407.1が85%の配列同一性を有し、CAI99800.1が83%の配列同一性を有するので、これらのアクセプター配列には同じ規定形態を有する3つのCDRが含まれる。

0224

本発明は、ドナーm1749抗体に完全にまたは実質的に由来するKabatによって定義されたような3つの軽鎖CDR及び3つの重鎖CDRと、存在するならば、ヒトの抗体配列に完全にまたは実質的に由来する成熟可変領域フレームワーク配列及び定常領域とを有するヒト化抗体を提供する。同様に、ヒト化された重鎖は、m1749抗体の重鎖に完全にまたは実質的に由来するKabatによって定義されたような3つの重鎖CDRと、存在するならば、ヒトの抗体重鎖配列に完全にまたは実質的に由来する成熟重鎖可変配列及び重鎖定常領域配列とを有する重鎖である。同様にヒト化された軽鎖は、m1749抗体の軽鎖に完全にまたは実質的に由来するKabatによって定義されたような3つの軽鎖CDRと、存在するならば、ヒトの抗体軽鎖配列に完全にまたは実質的に由来する成熟軽鎖可変配列及び軽鎖定常領域配列とを有する軽鎖である。一部の抗体は、配列番号66のKabatのCDR1:SYIMS;配列番号67のKabatのCDR2:TISSGGSSTYYPDSVKG;配列番号68のKabatのCDR3:DDDYDVKVFAYを含むヒト化された重鎖を含む。一部の抗体は、配列番号61のKabatのCDR1:KSSRSLLNSRIRKNYLA;配列番号62のKabatのCDR2:WASTRES;配列番号63のKabatのCDR3:KQSYNLLTを含むヒト化された軽鎖を含む。一部の抗体は、配列番号66、67及び68の3つのKabatのCDRを含むヒト化された重鎖と、配列番号61、62及び63の3つのKabatのCDRを含むヒト化された軽鎖とを含む。CHRH2のKabatの60〜65位が置換され得ることを除いて、残基の少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%がm1749の対応するCDRにおける対応する残基と同一であるならば、CDRは実質的にm1749に由来する。抗体鎖の成熟可変領域フレームワーク配列及び抗体鎖の定常領域配列は、Kabatによって定義される対応する残基の少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が同一である場合、それぞれヒトの成熟可変領域フレームワーク配列またはヒトの定常領域配列に実質的に由来する。

0225

ヒトの成熟可変領域フレームワーク残基に由来する特定のアミノ酸は、幾つかある理由の中で特に、CDRの構造及び/または抗原への結合、重鎖と軽鎖の間の相互作用の介在をすること、定常領域との相互作用、所望のまたは所望ではない翻訳後修飾の部位であること、ヒト可変領域配列のその位置では稀な残基なので潜在的に免疫原性であることに対する考えられる影響に基づいて置換について選択することができる。以下の6つの可変領域フレームワークの位置(D9S、A19V、P43S、Q3K、G42E、A93T)は、実施例でさらに特定されるようにこれらの理由の1以上についての置換の候補と見なされた。

0226

他のどこでも同じようにここで、最初に述べた残基はヒトのアクセプターフレームワークにKabatのCDRを移植することによって形成されるヒト化抗体の残基であり、二番目に述べた残基はそのような残基を置き換えるために検討される残基である。従って、可変領域フレームワークの範囲内で最初に述べた残基はヒト由来であり、CDRの範囲内で最初に述べた残基はマウス由来である(たとえば、C97S)。

0227

CDRにおいてアミノ酸置換を行うことができる。考えられる変異の1つは、m1749抗体のCDRにおける特定の残基を、ヒトのCDR配列に由来する、通常、例となるヒト化抗体を設計するのに使用されるヒトアクセプター配列のCDRに由来する対応する残基によって置換することである。一部の抗体では、CDRの一部のみ、すなわち、SDRと呼ばれる結合に必要とされるCDR残基のサブセットのみがヒト化抗体にて結合を保持するのに必要とされる。抗原に接触しない及びSDR内にないCDR残基は、以前の研究(たとえば、CDRH2における残基H60〜H65は必要とされないことが多い)に基づいて、Chothiaの超可変ループ(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)の外にあるKabatのCDRの領域から、分子モデル化によって及び/または経験的に、またはGonzalesら,Mol.Immunol.41:863,2004にて記載されたように、特定することができる。そのようなヒト化抗体では、1以上のドナーCDR残基が存在しない、またはドナーCDR残基全体が省略される位置で、その位置を占めるアミノ酸はアクセプター抗体配列における対応する位置(Kabatの番号付けによる)を占めるアミノ酸であることができる。含めるためのCDRにおけるドナーアミノ酸のためのアクセプターのそのような置換の数は競合する考慮すべき事柄のバランスを反映する。そのような置換は、ヒト化抗体におけるマウスのアミノ酸の数を減らすことにおいて、及びその結果潜在的な免疫原性を減らすことにおいて潜在的に有利である。しかしながら、置換は親和性の変化を引き起こすこともでき、親和性の有意な低下は好ましくは回避される。CDR内の置換の位置及び置換するアミノ酸も経験に基づいて選択されることができる。

0228

CDR内で置換を行う理由の1つは、マウス残基が抗体の発現または集合を妨害し得る翻訳後修飾の部位であることである。

0229

本発明は、ヒト化重鎖成熟可変領域が配列番号156に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を示し、及びヒト化軽鎖成熟可変領域が配列番号160に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を示すヒト化1749抗体の変異体を提供する。一部のそのようなヒト化抗体には、マウスのドナー抗体のそれと同じである、hu1749のCDR領域に対して完全にまたは実質的に同一である3つの重鎖CDRと3つの軽鎖CDRが含まれる。CDR領域は、任意の従来の定義(たとえば、Chothia)によって定義することができるが、好ましくはKabatによって定義されたとおりである。

0230

ヒト化重鎖成熟可変領域が配列番号156であり、及びヒト化軽鎖成熟可変領域が配列番号160であるヒト化1749抗体は、1749VH3VL3と呼ばれる。ヒト化1749VH3VL3の一部の変異体はhu1749VH3VL3における逆突然変異の一部またはすべてを保持する。言い換えれば、以下の少なくとも1、2、3、4、5または好ましくは6すべてが存在し:H3はKによって占められ、H42はEによって占められ、H93はTによって占められ、L9はSによって占められ、L19はVによって占められ、及びL43はSによって占められる。

0231

hu1749VH3VL3の逆突然変異の少なくとも1、2、3、4、5または好ましくは6すべてを保持することに加えて、ヒト化1749抗体は可変領域フレームワークにおいても追加の逆突然変異も含有してもよい。そのような逆突然変異の例には、Dによって占められたH1、Dによって占められたH10、Kによって占められたH13、Kによって占められたH19、Aによって占められたH113、Sによって占められたL5、Aによって占められたL15、Kによって占められたL18、Mによって占められたL21、Tによって占められたL63、Vによって占められたL78、Lによって占められたL83、Aによって占められたL100、Lによって占められたL104、及び/またはLによって占められたL106が挙げられる。治療用製品または診断用製品のための逆突然変異の選択については、それらが一般に親和性を改善しない程度及びさらに多くのマウス残基を導入することが免疫原性の高いリスクを生じ得る程度を考慮に入れるべきである。

0232

上記抗体のいずれかでは、成熟可変領域フレームワークにて、たとえば、CDRに接触しない残基にて他のアミノ酸置換を行うことができる。変異体ヒト化配列で行われる置換は、置換されたアミノ酸に関して保存性があることが多い。

0233

B.定常領域の選択
キメラ抗体、ベニヤ化抗体またはヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域はヒトの定常領域の少なくとも一部と連結することができる。定常領域の選択はある程度、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性、抗体依存性細胞性貪食作用及び/または補体依存性細胞傷害性が所望であるかどうかに左右される。たとえば、ヒトのアイソタイプIgG1及びIgG3は補体依存性細胞傷害性を有し、ヒトのアイソタイプIgG2及びIgG4は有さない。ヒトのIgG1及びIgG3はヒトのIgG2及びIgG4よりも強力な細胞介在性のエフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパであることができる。

0234

軽鎖及び/または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端における1または数個のアミノ酸、たとえば、重鎖のC末端リジンは、ある割合の分子でまたはすべての分子で欠けていてもよく、または誘導体化されてもよい。定常領域にて置換を行って補体依存性細胞傷害性若しくはADCCのようなエフェクター機能を増減することができ(たとえば、Winterら,米国特許第5,624,821号;Tsoら,米国特許第5,834,597号;及びLazarら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:4005,2006を参照のこと)、またはヒトにおける半減期延長することができる(たとえば、Hintonら,J.Biol.Chem.279:6213,2004を参照のこと)。例となる置換には、抗体の半減期を増やすための250位でのGln及び/または428位でのLeuが挙げられる(この段落では定常領域についてEU番号付けを使用する)。234位、235位、236位及び/または237位のいずれかまたはすべてにおける置換は、Fcγ受容体、特にFcγRI受容体についての親和性を低下させる(たとえば、US6,624,821を参照のこと)。エフェクター機能を低下させるには、ヒトIgG1の234位、235位及び237位におけるアラニン置換を使用することができる。一部の抗体は、エフェクター機能を低下させるためにヒトIgG1の234位、235位及び237位にてアラニン置換を有する。任意で、ヒトIgG2の234位、236位及び/または237位をアラニンによって置換し、235位をグルタミンによって置換する(たとえば、US5,624,821を参照のこと)。一部の抗体では、ヒトIgG1のEU番号付けによる241位、264位、265位、270位、296位、297位、322位、329位、及び331位の1以上における変異を使用する。一部の抗体では、ヒトIgG1のEU番号付けによる318位、320位及び322位の1以上における変異を使用する。一部の抗体では、234位及び/または235位がアラニンによって置換され、及び/または329位がグリシンによって置換される。一部の抗体では、配列番号174におけるように234位及び235位がアラニンによって置換される。一部の抗体では、アイソタイプはヒトのIgG2またはIgG4である。例となるヒト軽鎖カッパ定常領域は配列番号170のアミノ酸配列を有する。配列番号170のN末端アルギニンは省略することができ、その場合、軽鎖カッパ定常領域は配列番号171のアミノ酸配列を有する。例となるヒトIgG1重鎖定常領域は配列番号172のアミノ酸配列を有する(C末端リジンを伴ってまたは伴わずに)。抗体は、2つの軽鎖及び2つの重鎖を含有する四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFvとして、または重鎖及び軽鎖の成熟可変ドメインがスペーサーを介して連結される単鎖抗体として発現され得る。

0235

ヒトの定常領域は、様々な個体間でアロタイプ変異及びイソアロタイプ変異を示し、すなわち、定常領域は1以上の多型位置で様々な個体にて異なることができる。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清は1以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点でアロタイプとは異なる。従って、たとえば、別の重鎖定常領域はIgG1 G1m3アロタイプものであり、配列番号173のアミノ酸配列を有する。別の重鎖定常領域は、それがC末端リジンを欠くことを除いて配列番号173のアミノ酸配列を有する。別の重鎖定常領域は、配列番号174のアミノ酸配列を有する。さらに別の重鎖定常領域は、それがC末端リジンを欠くことを除いて配列番号174のアミノ酸配列を有する。

0236

本発明はさらに、上記定常領域のいずれかをコードする核酸を提供する。任意で、そのような核酸はさらにシグナルペプチドをコードし、定常領域に連結されたシグナルペプチドと共に発現され得る。

0237

C.組換え抗体の発現
抗体を組換え発現によって作出することができる。抗体をコードする核酸は、所望の細胞型(たとえば、CHOまたはSp2/0)における発現のためにコドンを最適化することができる。組換え核酸構築物には通常、天然に会合したまたは異種のプロモータ領域を含む、抗体鎖のコーディング配列に操作可能に連結される発現制御配列が含まれる。発現制御配列は、真核宿主細胞形質転換するまたはそれに形質移入することが可能であるベクターにおける真核細胞プロモータ系であることができる。ベクターはいったん適当な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列高レベル発現、及び交差反応する抗体の回収と精製に好適な条件下で維持される。抗体鎖をコードするベクター(単数)またはベクター(複数)は、たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素のような選択可能な遺伝子を含有して抗体鎖をコードする核酸のコピー数増幅を可能にすることもできる。

0238

大腸菌は、抗体、特に抗体断片を発現させるのに特に有用な原核細胞宿主である。酵母のような微生物も発現に有用である。サッカロミセスは、所望のような発現制御配列、複製開始点終結配列等を有する好適なベクターを伴った、酵母宿主の一例である。典型的なプロモータには3−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の糖分解酵素が含まれる。誘導性の酵母プロモータには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームC、及びマルトースガラクトースの利用に関与する酵素に由来するプロモータが挙げられる。

0239

哺乳類細胞は免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチド断片を発現させるのに使用することができる。Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)を参照のこと。インタクトな異種タンパク質を分泌することが可能である多数の好適な宿主細胞株が当該技術で開発されており、それには、CHO細胞株、種々のCOS細胞株HeLa細胞HEK293細胞、L細胞、及びSp2/0やNS0を含む抗体を産生しない骨髄腫が挙げられる。非ヒト細胞を使用することが有利であり得る。これらの細胞のための発現ベクターは、たとえば、複製開始点、プロモータ、エンハンサのような発現制御配列(Queenら,Immunol.Rev.89:49(1986))、及び、たとえば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位ポリアデニル化部位及び転写終結配列のような必要なプロセッシング情報部位を含むことができる。好適な発現制御配列は、内在性遺伝子サイトメガロウイルスSV40アデノウイルスウシパピローマウイルス等に由来するプロモータである。Coら,J.Immunol.148:1149(1992)を参照のこと。

0240

抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクターを細胞培養物に導入して、無血清培地における増殖生産性及び産物の質について細胞プールをスクリーニングすることができる。次いで最も生産性の高い細胞プールをFACSに基づく単一細胞クローニングに供してモノクローナル株を生成することができる。培養物のL当たり7.5gを超える産物タイターに相当する1日当たり細胞当たり50pgまたは100pgを上回る特定の生産性が有利であり得る。単一細胞クローンによって産生された抗体を、濁度濾過特性、PAGE、IEF、UV走査、HP−SEC、炭水化物オリゴ糖マッピング、質量分光法、及び、たとえば、ELISAまたはBiacoreのような結合アッセイについて調べることもできる。次いで選択されたクローンを複数のバイアルに貯め、その後の使用のために凍結保存することができる。

0241

いったん発現されると、プロテインA捕捉カラムクロマトグラフィ(たとえば、疎水性相互作用またはイオン交換)、ウイルス不活化用の低pH等を含む、当該技術の標準手順(一般にScopes,Protein Purification(Springer−Verlag,NY,1982)を参照のこと)に従って抗体を精製することができる。

0242

コドンの最適化、プロモータ、転写要素及びターミネータの選択、無血清単一細胞クローニング、細胞バンク、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、CHOターミネータ、無血清単一細胞クローニング、タンパク質タイターの改善を含む抗体の商業的な製造の方法(たとえば、US5,786,464、US5,888,809、US6,063,598、US6,114,148、US7,569,339、WO2004/050884、WO2005/019442、WO2008/012142、WO2008/012142、WO2008/107388及びWO2009/027471を参照のこと)。

0243

D.核酸
本発明はさらに、上述の重鎖及び軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する。通常、核酸は成熟の重鎖及び軽鎖に融合されたシグナルペプチドもコードする(たとえば、配列番号164、166及び168によってコードされ得る配列番号165、167及び169のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド)。核酸におけるコーディング配列は、コーディング配列の発現を確保する調節性配列、たとえば、プロモータ、エンハンサ、リボソーム結合部位、転写終結シグナル等と操作可能な連結状態にあることができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は単離された形態で存在することができ、または1以上のベクターにクローニングすることができる。核酸は、たとえば、重複するオリゴヌクレオチド固相合成またはPCRによって合成することができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、たとえば、発現ベクターの中で1つの隣接する核酸として連結することができ、または、分離して、たとえばそれ自体の発現ベクターにクローニングすることができる。

0244

E.抗体結合のためのMCAMエピトープの性状分析及びそれに結合する抗体の生成
1.抗体結合のためのMCAMエピトープ
本発明は、ヒトMCAMタンパク質の中での特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明の一部の抗体は1749.1.3(m1749)と名付けられた抗体と同じまたは重複するエピトープに結合する。

0245

本発明は、m1749と名付けられた抗体と同じまたは重複するエピトープに結合する抗体を提供する。MCAMの残基272、318、320、340及び377での変異は、m1749の特異的な結合を妨害する(たとえば、実施例として記載されるように陽性対照野生型MCAMと比べて変異MCAMに対する<30%の結合)。相対的に少ない残基が結合に影響し、残基は典型的な線状のエピトープ(たとえば、3〜20の隣接したアミノ酸)よりも広く間隔を空けているので、これらの結果はm1749が立体構造エピトープに結合するという指摘を提供する。或いは、結合に影響を及ぼす残基の1以上は抗体と直接接触しないでそのようにアロステリックであって良い。

0246

MCAMの残基272、318、320、324、326、340及び377の1以上を含むエピトープに、特に残基318、324及び326の1以上を含むエピトープに結合する抗体は、有用な阻害特性をm1749と共有すると思われる。従って、その特異的な結合がMCAMの残基318、324及び326の1以上、特に残基318の変異誘発によって阻害される抗体は、m1749に類似する特性を共有と思われる。一部のそのような抗体は、MCAMの残基318、324及び/または326を含むまたはそれから成るエピトープに結合する。エピトープは、たとえば、特定のアミノ酸(318、324及び326)の1、2若しくは3を含むエピトープ(たとえば、2〜5、3〜5、3〜10、3〜15、3〜20、5〜10、5〜15、5〜20、5〜30、5〜40、5〜50、5〜60、または5〜70の隣接するアミノ酸)のような線状であることができ、または特定のアミノ酸の1、2若しくは3を含むまたはそれから成る立体構造であることができる。

0247

2.特定のMCAMエピトープを結合する抗体の生成
本発明の一部の抗体はm1749抗体と同じまたは重複するエピトープに結合する。ヒトMCAMに対する他の非ヒトモノクローナル抗体、たとえば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットのモノクローナル抗体の作出は、たとえば、ヒトMCAMまたは所望のエピトープ(免疫原)を含むそのペプチド断片動物を免疫し、任意でm1749との競合にてMCAMへの結合について得られた抗体をスクリーニングすることによって達成することができる(あらゆる目的で参照によって組み入れられるHarlow & Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988)を参照のこと)。任意で、免疫原をキャリア分子抱合する。任意で、免疫原をアジュバントと共に投与する。以下に記載されるように幾つかの型のアジュバントを使用することができる。実験動物の免疫には不完全アジュバントがその後に続く完全フロイントアジュバントが好まれる。ウサギまたはモルモットは通常ポリクローナル抗体を作製するのに使用される。マウスは通常モノクローナル抗体を作製するのに使用される。抗体は、MCAM内での所望のエピトープに対する特異的な結合についてスクリーニングされる。

0248

本発明は、上述のエピトープに向けられた抗体を創り出すのに使用されるMCAMのペプチド断片を提供する。そのようなペプチドの例には、長さ2〜5、3〜5、3〜10、3〜15、3〜20、5〜10、5〜15、5〜20、5〜30、5〜40、5〜50、5〜60、または5〜70の間の隣接するアミノ酸であるペプチドが挙げられ、それにはMCAMのアミノ酸残基318、324及び326の少なくとも1つが含まれる。これらのペプチドの一部では、ペプチドにはアミノ酸残基318、324及び326の3つすべてが含まれる。

0249

免疫原はキャリア分子、通常、キャリアポリペプチドに抱合されてもよいので、キャリアに抱合された断片に対する免疫応答を引き出すのに役立つ。単一の作用因子を単一のキャリアに連結することができ、複数コピーの作用因子を複数コピーのキャリアに連結することができ、それは次々に互いに連結され、複数コピーの作用因子を単一コピーのキャリアに連結することができ、または単一コピーの作用因子を複数コピーのキャリアまたは異なるキャリアに連結することができる。好適なキャリアには、血清アルブミンスカシガイヘモシアニン免疫グロブリン分子サイログロブリン卵白アルブミン破傷風毒素、または、たとえば、ジフテリア(たとえば、CRM197)、大腸菌、コレラピロリ菌のような他の病原性細菌に由来する毒素、または弱毒化毒素誘導体が挙げられる。

0250

免疫原は薬学上許容可能なアジュバントと共に投与されることが多い。アジュバントは、ペプチドが単独で使用された状況に比べて誘導される抗体の力価を高め、及び/または誘導される抗体の結合親和性を高める。MCAMの免疫原性断片と組み合わせて種々のアジュバント使用し、免疫応答を引き出すことができる。好まれるアジュバントは応答定性的形態に影響を与える免疫原に構造変化を生じさせることなく免疫原に対する内在性の応答を増強する。好まれるアジュバントには、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、3De−O−アシル化モノホスホリル脂質A(MPL(商標))(GB2220211(RIBI ImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Montana,現在Corixaの一部を参照)が挙げられる。Stimulon(商標)QS−21はアメリカで見いだされる樹木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮から単離されるトリテルペングリコシドまたはサポニンである(Kensilら、in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell & Newman,PlenumPress,NY,1995);US5,057,540を参照のこと)、(Aquila BioPharmaceuticals,Framingham,MA;現在Antigenics,Inc.,New York,NY)。他のアジュバントは、任意で、モノホスホリル脂質A(Stouteら,N.Engl.J.Med.336,86−91(1997)を参照のこと)、プロニックポリマー及び殺傷マイコバクテリウムのような免疫刺激剤と組み合わせた水中油エマルジョン(たとえば、スクアレンまたはピーナッツ油)である。別のアジュバントはCpG(WO98/40100)である。アジュバントは、活性剤を伴った治療用組成物の成分として投与することができ、または治療剤の投与の前に、それと同時に、若しくはその後に別に投与することができる。

0251

3.抗体の種類
抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体は、たとえば、マウスまたはラット、非ヒト霊長類のような非ヒト抗体であることができ、またはヒトの抗体であることができる。抗体はキメラ抗体、ベニヤ化抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体等であることができる。

0252

モノクローナル抗体は上述の方法及びQueen,US5,530,101及び5,585,089;Winter,US5,225,539;Carter,US6,407,213;Adair,US5,859,205、6,881,557;Foote,US6,881,557にて記載された方法を用いてヒト化される。

0253

本発明はさらに、上述のMCAMエピトープに特異的に結合する非ヒト抗体のキメラ形態及びベニヤ化形態を提供する。

0254

キメラ抗体は、非ヒト抗体(たとえば、マウス)の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域がヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と組み合わせられる抗体である。そのような抗体は実質的にまたは完全にマウス抗体の結合特異性を保持し、約3分の2がヒトの配列である。

0255

ベニヤ化抗体は、通常、非ヒト抗体のCDRの一部と非ヒト可変領域フレームワークの一部を保持するが、B細胞若しくはT細胞のエピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、たとえば、ヒト抗体配列の相当する位置に由来する残基に接触する残基を置き換えるヒト化抗体の一種である(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)。結果は、CDRが完全にまたは実質的に非ヒト抗体に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってさらにヒト様にされる抗体である。

0256

MCAMに対するヒト抗体は以下で記載される種々の技法によって提供される。一部のヒト抗体は、実施例で記載されるマウスモノクローナル抗体の1つのような特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように、競合結合実験によって、Winterの、上記のまたはほかのファージディスプレイ法によって選択される。標的抗原としてのMCAMの断片のみを用いることによって、及び/またはMCAMの欠失変異の回収に対して抗体をスクリーニングすることによって特定のエピトープ特異性についてヒト抗体をスクリーニングすることもできる。

0257

ヒト抗体の製造方法には、Oestbergら、Hybridoma,2:361−367(1983);Oestberg,米国特許第4,634,664号;及びEnglemanら,US特許第4,634,666号のトリオーマ法、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用(たとえば、Lonbergら、WO93/12227(1993);US5,877,397、US5,874,299、US5,814,318、US5,789,650、US5,770,429、US5,661,016、US5,633,425、US5,625,126、US5,569,825、US5,545,806、Nature、148,1547−1553(1994),Nature Biotechnology、14,826(1996),Kucherlapati,WO91/10741(1991)を参照のこと)、及びファージディスプレイ法(たとえば、Dowerら、WO91/17271及びMcCaffertyら、WO92/01047、US5,877,218、US5,871,907、US5,858,657、US5,837,242、US5,733,743及びUS5,565,332を参照のこと)が挙げられる。

0258

キメラ抗体、ヒト化(ベニヤ化を含む)抗体及びヒト抗体は通常、上述のような組換え発現によって作出される。

0259

本発明はさらに、非抗体結合分子を提供する。非抗体結合分子には、たとえば、リガンド結合部位を形成する4つの超可変ループを支える堅いβバレルを特徴とするタンパク質構造であるリポカリン足場に基づくアンチカリンが挙げられる。新規の結合特異性は、機能的なディスプレイ及び誘導された選択と組み合わせた、ループ領域における標的化された無作為な変異誘発によって操作される(Skerra(2008),FEBSJ.275:2677−2683)。他の好適な足場には、たとえば、ヒトのフィブロネクチンIIIの第10細胞外ドメインに基づくアドネクチンまたはモノボディ(Koide及びKoide(2007)MethodsMol.Biol.352:95−109)、ブドウ球菌プロテインAのZドメインに基づくアフィボディ(2008)FEBS J.275:2668−2676));アンキリン反復タンパク質に基づくDARPins(Stumppら.(2008),Drug.Discov.Today,13:695−701);ヒトのFynタンパク質キナーゼのSH3ドメインに基づくフィノマー(Grabulovskiら.(2007),J.Biol.Chem.282:3196−3204);Sulfolobus acidolariusに由来するSac7dに基づくアフィチン(Krehenbrinkら.(2008),J.Mol.Biol.383:1058−1068);ヒトのy−B−クリスタリンに基づくアフィリン(Ebersbachら.(2007),J.Mol.Biol.372:172−185);膜受容体タンパク質のAドメインに基づくアビマー(Silvermanら.(2005),Biotechnol.23:1556−1561);システイン豊富ノッチンペプチド(Kolmar(2008),FEBS J.275:2684−2690);及び操作されたKunitz型阻害剤(Nixon及びWood(2006),Curr.Opin.Drug.Discov.Dev.9:261−268)が挙げられてもよい。概説については、Gebauer及びSkerra(2009),Curr.Opin.Chem.Biol.13:245−255を参照のこと。

0260

これらの抗体の一部では、抗体は、WO/2012/170071及びPCT/US2013/058773にて記載された抗体に完全にまたは実質的に由来するCDR(Kabat、Chothiaまたはそれらの複合物によって定義されるような)を含む抗体のいずれか1つまたは抗体ではなく、特に、WO/2012/170071にてクローン15(配列番号12〜21によって定義された)及びクローン17(配列番号1〜10によって定義された)と名付けられた抗体及び1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1及び1749.1.3と名付けられたマウス抗ヒトMCAMモノクローナルクローン及びPCT/US2013/058773に記載された2120.4.19及び2107.4.10と名付けられたラット抗ヒトMCAMモノクローナル抗体クローンではない。

0261

4.活性について抗体をスクリーニングする方法
本明細書で記載されるMCAM抗体の阻害活性は、同じまたは実質的に類似するエピトープ(たとえば、m1749)を結合する抗体との競合結合アッセイ及びそのリガンドであるラミニン411のラミニンα4鎖とのMCAMの結合の阻止を含む当該技術で既知の方法によってアッセイすることができる。

0262

たとえば、MCAMとラミニン411のラミニンα4鎖との間の相互作用を阻止するMCAM抗体の活性は以下のようにスクリーニングすることができる。MCAM発現細胞を、(a)候補抗体の存在下または非存在下でラミニンα4鎖、たとえば、ラミニン411のα4鎖を含む組換えポリペプチドと共にインキュベートし;(b)たとえば、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって細胞へのラミニンα4の結合のレベルモニターし;(c)候補抗体の非存在下よりも存在下のほうがラミニンα4の結合のレベルが低ければMCAM/ラミニンα4の相互作用の阻害剤として前記候補抗体を特定する。代替のスクリーニングプロトコールには、候補抗体の存在下または非存在下でMCAMと共にインキュベートすることができるラミニンα4鎖を発現している細胞の集団の使用と、モニターされる細胞集団へのMCAMの結合が関与する。候補抗体の存在下での細胞集団へのMCAMの結合が非存在下よりも低ければ、候補抗体はMCAMのアンタゴニストである。

0263

モニタリングの他の方法には、蛍光活性細胞選別(FACS)及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が挙げられる。

0264

そのリガンド、たとえば、ラミニンα4鎖へのMCAMの結合を阻害するその能力に基づいて特定されるMCAMアンタゴニストは、MCAM発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性状態の治療のための候補である。

0265

MCAM抗体の阻害活性は生体内でも評価することができる。MCAM抗体の阻害活性を評価する方法の一例は、実験自己免疫脳脊髄炎(EAE)モデルによる。EAEはヒトにおける多発性硬化症(MS)の症状に類似する症状を生じるように実験動物で生成される疾患である。たとえば、Bauerら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,106:1920−1925(2009)を参照のこと。EAEは一般に、他の動物の中枢神経系に由来する様々なタンパク質、たとえば、ミエリン塩基性タンパク質及び脊髄全体若しくは脳組織抽出物を、またはミエリンに特異的に反応するT細胞を動物に注射することによって作出される。EAEは一般に、MSの再発または進行形態の経過に従うように使用される。EAEはMSの治療剤を開発すること及びMSの特定の疾患過程を研究することの双方で好適な動物モデルとして役立っている。たとえば、Goldら、Brain,129:1953−1971(2006)を参照のこと;Steinmanら、Ann.Neurol.60:12−21(2006)も参照のこと。

0266

疾患の進行に対するMCAM遮断の効果は、TH17の分極形成が生体内で生じるEAEの治療モデルで調べることができる。マウスをPLP139−151ペプチドで免疫してEAEを誘導する。疾患の発症後、候補の抗MCAM抗体またはアイソタイプ対照のいずれかによってマウスを腹腔内で処理し、その後、毎日処理する。マウスを毎日モニターし、盲検法スコア化し、2〜3日ごとに体重を得た。候補MCAM抗体によって処理したマウスにおける再発の遅延及び症状の重症度の有意な軽減は成功した候補抗体を示す。

0267

F.標識抗体
MCAMに特異的に結合する標識抗体は、破壊のために癌細胞若しくは腫瘍細胞を標的とすることにおいて、または自己免疫疾患若しくは神経炎症性疾患に関与する細胞を標的とすることにおいて有用であり得る。そのような抗体は、少なくとも部分的にMCAMの発現が介在する疾患を標的とすることにおいても有用であり得る。たとえば、そのような抗体は、他の治療剤、他のタンパク質、他の抗体、及び/または検出可能な標識で標識することができる。WO03/057838;US8,455,622を参照のこと。そのような治療剤は、たとえば、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、または癌のような患者における望ましくない状態または疾患を治療する、それと闘う、それを和らげる、予防するまたは改善するために使用することができる作用因子であることができる。治療剤には、細胞傷害剤細胞増殖抑制剤放射性治療剤、免疫調節剤、または抗体の活性を促進する、若しくは高める生物活性剤を挙げることができる。細胞傷害剤は細胞に対して毒性である任意の作用因子であることができる。細胞増殖抑制剤は細胞の増殖を阻害する任意の作用因子であることができる。免疫調節剤は免疫的応答の発生または維持を刺激するまたは阻害する任意の作用因子であることができる。放射性治療剤は放射線を発する分子または化合物であることができる。そのような治療剤が、本明細書で記載される抗体のようなMCAM特異的な抗体に結合されるのであれば、結合された治療剤は、他の細胞よりもMCAM発現細胞(たとえば、TH17発現細胞のような免疫細胞、または悪性メラニン細胞のような癌細胞)に対して特異的な親和性を有するであろう。その結果、標識抗体の投与は、他の周辺細胞及び周辺組織に対する最少限の影響でMCAM発現細胞を直接標的とする。このことは、単独で投与するには毒性でありすぎる治療剤にとって特に有用であることができる。加えて、さらに少量の治療剤を使用することができる。

0268

抗体を抗毒素として作用するように修飾することができる。たとえば、米国特許第5,194,594号を参照のこと。たとえば、植物由来細胞毒素であるリシンは、抗体について二官能性試薬である無水S−アセチルメルカプトコハク酸を用い、リシンについて3−(2−ピリジルジチオプロピオン酸スクシンイミジルを用いて、抗体に結合することができる。Pieterszら、Cancer Res.48(16):4469−4476(1998)を参照のこと。結合は、リシンのB鎖結合活性喪失を生じる一方で、リシンのA鎖の毒性能も抗体の活性も損傷しない。同様に、リボソーム集合の阻害剤であるサポリンは、化学的に挿入されたスルフヒドリル基間のジスルフィド結合を介して抗体に結合することができる。Politoら、Leukemia,18:1215−1222(2004)を参照のこと。

0269

放射性同位元素を抗体に連結することもできる。好まれる放射性同位元素には、イットリウム90(90Y)、インジウム111(111In)、131I、99mTc、放射性銀−111、放射性銀−199及びビスマス213が挙げられる。放射性同位元素の抗体への結合は従来の二官能性キレートによって行われてもよい。放射性銀−11及び放射性銀−199については、イオウリンカーが使用されてもよい。Hazraら、Cell Biophys.24−25:1−7(1994)を参照のこと。銀放射性同位元素の結合にはアスコルビン酸によって免疫グロブリンを還元することが関与してもよい。111In及び90Yのような放射性同位元素については、イブツモマブ・チウキセタンを用いることができ、それはそのような同位元素と反応してそれぞれ111In/イブリツモマブ・チウキセタン及び90Y/イブリツモマブ・チウキセタンを形成する。Witzig,Cancer Chemother.Pharmacol.,48,Suppl,1:S91−S95(2001)を参照のこと。

0270

他の治療剤も抗体に連結させてもよい。治療剤は普通、細胞傷害性または細胞増殖抑制性である。たとえば、抗体は、たとえば、マイタンシン、ゲルダナマイシンのような毒性化学療法剤、たとえば、アウリスタチンのようなチューブリン阻害剤、またはカリケアミシンのような副溝結合作用因子に結合することができる。他の代表的な治療剤には、自己免疫疾患、神経炎症性疾患若しくは癌、または自己免疫疾患、神経炎症性疾患若しくは癌の症状の治療、管理または改善に有用であることが知られる作用因子が挙げられる。そのような治療剤の例は本明細書の他のどこかに開示されている。

0271

抗体は他のタンパク質にも結合することができる。たとえば、抗体はフィノマーに結合することができる。フィノマーはヒトFynのSH3ドメインに由来する小さな結合タンパク質(たとえば、7kDa)である。それらは安定した、及び可溶性であることができ、システイン残基及びジスルフィド結合を欠くことができる。フィノマーは、抗体と同じ親和性と特異性で標的分子に結合するように操作することができる。それらは、抗体に基づいて多重特異性の融合タンパク質を創り出すのに好適である。たとえば、フィノマーは、抗体のN末端及び/またはC末端に融合されて異なる構造を持つ二重特異性及び三重特異性のFynomAbを創り出すことができる。フィノマーは、FACS、Biacore、及び最適な特性を持つフィノマーの効率的な選択を可能にする細胞に基づくアッセイを用いたスクリーニング法を介してフィノマーライブラリを用いて選択することができる。フィノマーの例は、Grabulovskiら、J.Biol.Chem.282:3196−3204(2007);Bertschingerら、Protein Eng.Des.Sel.20:57−68(2007);Schlatterら、MAbs.4:497−508(2011);Bannerら、Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.69(Pt6):1124−1137(2013);及びBrackら、Mol.Cancer Ther.13:2030−2039(2014)にて開示されている。

0272

本明細書で開示されている抗体は1以上の他の抗体に結合するまたは抱合することもできる(たとえば、抗体のヘテロ抱合体を形成するために)。そのような他の抗体はMCAM内の異なるエピトープに結合することができ、または異なる標的抗原に結合することができる。

0273

抗体はまた検出可能な標識にも結合することができる。そのような抗体を、たとえば、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、または癌の診断のために、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、または癌の進行をモニターするために、及び/または治療の有効性を評価するために使用することができる。そのような抗体は、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、若しくは癌を有するまたはそれが疑われる対象にて、またはそのような対象から得られる適当な生物試料にて、そのような判定を行うのに有用であることができる。抗体に結合または連結されてもよい代表的な検出可能な標識には、たとえば、西ワサビペルオキシダーゼアルカリホスファターゼβ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼのような種々の酵素;たとえば、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン/ビオチンのような補欠分子族;たとえば、ウンベリフェロンフルオレセインフルオレセインイソチオシアネートローダミンジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンのような蛍光物質;たとえば、ルミノールのような発光物質;たとえば、ルシフェラーゼルシフェリン及びエクオリンのような生物発光物質;たとえば、放射性銀−111、放射性銀−199、ビスマス213、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、イオウ(5S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、111In、)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フルオリン(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、及び117スズのような放射性物質;種々のポジトロン放出断層撮影を用いたポジトロン放出金属;非放射性常磁性金属イオン;並びに特定の放射性同位元素に放射性標識されるまたは抱合される分子が挙げられる。

0274

治療剤、他のタンパク質、他の抗体及び/または検出可能な標識は、当該技術で既知の技法を用いてマウス抗体、キメラ抗体、ベニヤ化抗体またはヒト化抗体に直接または中間体(たとえば、リンカー)を介して間接的に結合されてもよく、または抱合されてもよい。たとえば、Arnonら、"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,"in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeldら(編)、pp.243−56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstromら、"Antibodies For Drug Delivery,"in Controlled Drug Delivery(第2版)、Robinsonら(編)、pp.623−53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,"in Monoclonal Antibodies,84:Biological And Clinical Applications,Pincheraら(編)、pp.475−506(1985);"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,"in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwinら(編)、pp.303−16(Academic Press,1985);及びThorpeら、Immunol.Rev.,62:119−58(1982)を参照のこと。好適なリンカーには、たとえば、切断可能リンカー及び切断可能ではないリンカーが挙げられる。酸性条件下または還元条件下または特定のプロテアーゼへの曝露の際、薬剤遊離する様々なリンカーを採用することができる。同様に、特定のプロテアーゼへの曝露の際の酸性条件下または還元条件下、または他の定義された条件下、結合された治療剤、タンパク質、抗体及び/または検出可能な標識を遊離する様々なリンカーを採用することができる。

0275

IV.治療方法及び医薬組成物
本発明の抗体または他のアンタゴニストは、とりわけ、自己免疫疾患、神経炎症性疾患及び癌を有する(たとえば、DSM−IV−TRまたはDSM−Vのもののような当該技術にて承認された基準を満たす)対象を、または一般集団に比べて自己免疫疾患、神経炎症性疾患及び癌の高いリスクがある対象を治療することまたは対象の予防を達成することに使用することができる。高いリスクは、疾患に関連する1以上の遺伝的マーカー若しくは生化学的マーカーの存在、または疾患と矛盾しないが確定診断を行うには不十分な1以上の症状の存在から評価することができる。上述のカテゴリーまたは疾患は必ずしも相互に互いに排他的ではなく;たとえば、多発性硬化症は神経炎症性または自己免疫性として分類することができる。本方法によって治療可能な一部の具体的な例となる疾患には、多発性硬化症、パーキンソン病、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、炎症性大腸疾患、クローン病、または癌、特に黒色腫のような固形腫瘍が挙げられる。方法の実践メカニズムの理解に左右されないが、一部の方法では、抗体または他のアンタゴニストは、T細胞(たとえば、TH17細胞)上に発現されるMCAMと内皮細胞の表面上に発現されるラミニンα4鎖、たとえば、ラミニン411のα4鎖との相互作用を阻害することによって少なくともある程度機能すると考えられる。抗体/薬剤の抱合体は、通常、標的とされる細胞内に取り込まれた後、連結された作用因子の細胞傷害性効果または細胞増殖抑制効果を含む追加の作用機序を有することができる。抗体/薬剤の抱合体は腫瘍関連マクロファージ毒性も誘導してもよい。

0276

神経炎症性状態は、CNSの炎症及び/または細胞/組織の損傷を特徴とする。兆候には、高いグリア活性、高い炎症誘発性サイトカインケモカイン(たとえば、TNFα、INFγ、IL−1β)レベル、脳血管関門の透過性の上昇、及び/または免疫細胞(たとえば、白血球)のCNSへの動員/浸潤の上昇を挙げることができる。神経炎症は、免疫系の細胞の慢性的な活性化(すなわち、自己免疫関連の神経炎症)に関連して慢性であることが多いが、代わりにまたはさらに急性の症状の出現を有し得る。

0277

多発性硬化症は、少なくとも4つの亜型のいずれかにて治療について望ましい疾患である。再発/寛解型MS(RR−MS)はMSの最も一般的な形態であり、明瞭に定義される悪化/再発(急性発作)に続く部分的なまたは完全な回復を特徴とする。再発期間の間に疾患の進行はない。当初(診断時)、RR−MSは新しく診断された対象すべての約85%に相当する。再発の定義には、高い体温無症状病変または古い病変を暴き得るので、少なくとも24時間存在し、発熱または併発疾患(「風邪」または尿道感染)に関連しない新しい症状または兆候を必要とする。

0278

原発進行型(PP−MS)は明瞭な再発無しで初めから継続する。安定期(安定の期間)があり得る。MSの対象すべての10〜15%はこの群であり、高齢者に生じる傾向がある。女性男性の比は、女性が約2:1で優勢である他の形態とは異なってこの群では均等である。PP−MSはまた、脳MRIの変化は少なく、脊髄症/脊髄関連の変化が多い傾向がある。

0279

二次進行型(SP−MS)はRR−MSとして出発し、その後、再発を伴ってまたは伴わずに着実な進行が生じる。再発/寛解型の対象のおよそ50%が二次進行型に進む。

0280

個人の約5%で生じる進行性再発型(PR−MS)は混合型の再発(回復を伴うまたは伴わない)と共に発症から進行性である。

0281

MSの診断は普通、既往症神経検査、及び磁気共鳴画像診断(MRI)、誘発電位(EP)及び脊髄液分析を含む種々の検査に基づく。MSの確定診断には、脳、脊髄及び視神経を含む中枢神経系(CNS)の少なくとも2つの別々の領域での損傷の証拠及び損傷が少なくとも1ヵ月離れて生じた証拠及び他の考えられる診断すべての排除が必要とされる。当該技術で承認された基準によるMSの診断を有する対象を治療上処置することと同様に、本方法を予防上用いて、健常な個体の一般集団に比べてMSの進行の高いリスクに彼らを置くMSの少なくとも1つの兆候または症状を有する個体を治療することもできる。たとえば、方法を用いて、MSを発症し始めてもよいし、そうでなくてもよい、初回臨床症状(CIS)と呼ばれる−MS様の症状の1回の発作(再発または悪化とも呼ばれる)を有した個体を治療することができる。MSを発症するリスクがある個体は、幾つかある方法の中でその血清中のタンパク質KIR4.1に対する抗体の存在によっても特定することができる。

0282

神経炎症性疾患にはパーキンソン病も含まれる。パーキンソン病の症状には、震え(たとえば、手、腕、脚、及び顔面の震え)、四肢及び体躯硬直またはこわばり;動作の緩慢または遅さ;姿勢の不安定または損傷されたバランス及び協調;うつ及び他の情動変化飲み込み咀嚼及び会話の困難さ;排尿問題または便秘;皮膚の問題;睡眠障害が挙げられる。パーキンソン病は、そのような症状、及び/または脳の走査、及び/または他の疾患を除外する他の検査から診断することができる。

0283

本方法を用いて癌の増殖または転移を阻害することができる。癌は、造血悪性腫瘍または固形腫瘍、すなわち、前癌様病変を含む良性または悪性の、細胞の過剰な成長または増殖の結果生じる細胞塊であることができる。癌は良性、悪性または転移性であることができる。転移癌はそれが最初に生じた場所から身体の別の場所に広がっている癌を指す。転移性癌細胞によって形成される腫瘍転移性腫瘍または転移と呼ばれ、それは癌細胞が身体の他の部分に広がる過程を指すのにも使用される用語である。一般に、転移性癌は元々の癌または原発の癌と同じ名称及び同じ型を有する。癌の例には、たとえば、黒色腫、癌腫芽腫及び肉腫のような固形腫瘍が挙げられる。癌にはまた、たとえば、白血病、またはリンパ腫のようなリンパ系悪性腫瘍のような血液悪性腫瘍も挙げられる。そのような癌のさらに詳しい例には、扁平上皮癌肺癌腹膜の癌、肝細胞癌胃癌またはの癌を含む消化器癌膵臓癌神経膠腫神経膠芽腫子宮頸癌卵巣癌肝臓癌膀胱癌肝癌乳癌結腸癌直腸癌結腸直腸癌子宮内膜癌または子宮癌唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頚部の癌が挙げられる。

0284

自己免疫疾患には全身性の自己免疫疾患、臓器または組織に特異的な自己免疫疾患、及び自己免疫型の発現を示す疾患が挙げられる。これらの疾患では、生体はそれ自身の抗原の1つに対する細胞性の及び/または液性の免疫応答を発生し、その抗原の破壊及び潜在的な不能化及び/または致命的な結末をもたらす。細胞性の応答は、存在するならば、B細胞またはT細胞またはその双方であることができる。インターロイキン(IL)−17及びIL−22の産生を特徴とするTヘルパー細胞系列であるTH17細胞は組織に侵入して、ヒトにおける多発性硬化症及びマウスにおける実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)を含む病原性自己免疫応答を促すことが報告されている。たとえば、Cuaら、Nature,421:744−748(2003);Ivonovら,Cell,126:1121−1133(2006)を参照のこと。TH17細胞は組織へのその特異的な動員及び浸潤によって炎症性の応答を開始してもよいし、または伝播してもよい。

0285

自己免疫疾患の例には、グレーブス病、ハシモト甲状腺炎、多腺性自己免疫性症候群インスリン依存性糖尿病1型糖尿病)、インスリン抵抗性糖尿病2型糖尿病)、免疫介在性不妊症、自己免疫性アジゾン病、尋常性天疱瘡落葉状天疱瘡疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症白斑自己免疫性溶血性貧血特発性血小板減少性紫斑病自己免疫性血小板減少性紫斑病悪性貧血重症筋無力症ギランバレー症候群全身硬直症候群、急性リウマチ熱交感性眼炎グッドパスチャー症候群、自己免疫性ブドウ膜炎側頭動脈炎ベーチェット病、炎症性大腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎原発性胆汁性肝硬変自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎線維筋痛多発性筋炎皮膚筋炎強直性脊椎炎タカヤス関節炎脂肪織炎、類天疱瘡起源の分からない血管炎、ANCA陰性血管炎、ANCA陽性血管炎、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、全身性壊死性血管炎、ワーグナー肉芽腫症、CREST症候群、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群好酸球胃腸炎非定型局所皮膚炎心筋症、感染後症候群、感染後心内膜心筋炎セリアック病、多発性硬化症、サルコイドーシス及び乾癬が挙げられる。

0286

抗体または他のアンタゴニストは、発症を遅らせる、重症度を軽減する、さらなる悪化を抑制する、及び/または治療される疾患(たとえば、癌)の少なくとも1つの兆候若しくは症状を改善する投与量、投与経路及び投与回数を意味する有効な投薬計画で投与される。患者がすでに疾患を患っているのであれば、投薬計画は治療上有効な投薬計画と呼ばれ得る。患者が一般集団に比べて疾患のリスクは高いが、未だに症状を経験していないのであれば、投薬計画は予防上有効な投薬計画と呼ばれ得る。一部の例では、治療上または予防上の有効性は、同じ患者における歴史的対照または過去の経験に比べて個々の患者で観察することができる。他の例では、治療上または予防上の有効性は、未治療患者の対照集団に比べた治療された患者の集団における前臨床試験または臨床試験で実証することができる。

0287

抗体の例となる投与量は、0.1〜20、または0.5〜5mg/kg体重(たとえば、0.5、1、2、3、4または5mg/kg)または固定投与量として10〜1500mgである。投与量は、患者の状態及び以前の治療への応答、もしあれば、数ある因子の中で、治療が予防上である、または治療上であるか、及び疾患が急性である、または慢性であるかに左右される。

0288

投与は、非経口静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、クモ膜下、腹腔内、局所、鼻内また筋肉内であることができる。静脈内投与または皮下投与による全身性循環への投与が好まれる。静脈内投与は、たとえば、30〜90分間のような時間にわたる点滴によることができる。

0289

投与の頻度は、数ある因子の中で、循環における抗体の半減期、患者の状態及び投与の経路に左右される。頻度は、毎日、毎週、毎月、四半期ごとに、または患者の状態若しくは治療される疾患の進行における変化に応じて不定期の間隔であることができる。静脈投与の例となる頻度は、さらに多くのまたは少ない頻度の投与も可能ではあるけれども、治療の持続的な目標に対して毎週と四半期ごととの間である。皮下投与については、例となる投与頻度は、さらに多くのまたは少ない頻度の投与も可能ではあるけれども、毎日から毎月である。

0290

投与される投薬の数は疾患が急性であるかまたは慢性であるか、及び治療に対する疾患の応答に左右される。急性の疾患または慢性の疾患の急性悪化については、1〜10回の投与が十分であることが多い。場合によっては、単一ボーラス容量が、任意で分割した形態にて急性の疾患または慢性の疾患の急性悪化のために十分である。治療は急性の疾患の再発または急性悪化のために繰り返すことができる。慢性の疾患については、抗体は、規則的な間隔で、たとえば、毎週、2週ごとに、毎月、四半期ごとに、6ヵ月ごとに少なくとも1、5または10年間、または患者の生涯、投与することができる。

0291

非経口投与のための医薬組成物は好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、及びGMP条件下で製造される。医薬組成物は単位剤形(すなわち、単回投与のための剤形)で提供することができる。1以上の生理学的に及び薬学上許容可能なキャリア、希釈剤賦形剤及び補助剤を用いて医薬組成物を製剤化することができる。製剤化は選択される投与の経路に左右される。注射については、抗体は、水溶液、好ましくは、生理的に適合性緩衝液、たとえば、ハンクス溶液リンガー溶液、または生理的な生理食塩水または酢酸緩衝液にて製剤化することができる(注射の部位での不快感を軽減するために)。溶液は、たとえば、懸濁剤、安定剤及び/または分散剤のような製剤化剤を含有することができる。あるいは、抗体は、使用前に好適なビヒクル、たとえば、無菌の発熱物質を含まない水で構成するための凍結乾燥された形態であることができる。

0292

本発明の抗体による治療は、治療される疾患に対して有効な他の治療と併用することができる。併用治療は別々に投与するために製剤化することができる。多発性硬化症の治療のための追加の治療剤には、以下:テリフルノミドインターフェロンベータ−1a、インターフェロンベータ−1b、グラチラマー酢酸塩フィンゴリモド、及びミトキサントロン、または、たとえば、プレドニゾンメチルプレドニゾロン、若しくはデキサメタゾンのようなコルチコステロイドの1以上が挙げられる。

0293

癌のための追加の治療剤には、たとえば、カルムスチンクロラムブシルシスプラチンカルボプラチンオキサリプラチンプロカルバジン、及びサイクロホスファミドのようなアルキル化剤;たとえば、フルオロウラシルフロクスウリジンフルダラビンゲムシタビンメソトレキセート及びヒドロキシ尿素のような代謝拮抗剤;植物アルカロイド及び抗生物質を含む天然産物、たとえば、ブレオマイシンドキソルビシンダウノルビシンイダルビシンエトポシドマイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチンビンクリスチン、及びタキソールパクリタキセル)または関連化合物、たとえばトキソテレ登録商標);トポイソメラーゼ1阻害剤イリノテカンテモゾロミド及びギリアデル(登録商標)、カルムスチン;及びチロシンキナーゼの阻害剤、たとえば、グリベック(登録商標)、ステント(登録商標)(スニチニブリンゴ酸塩)、ネクサバール(登録商標)(ソラフェニブ)及びタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)またはイレッサ(登録商標)(ゲフィチニブ);血管形成の阻害剤;及びHER2抗原に対するハーセプチン(商標);VEGFに対するアバスチン(登録商標);または表皮増殖因子(EGF)受容体に対する抗体、たとえば、アービタクス(登録商標)(セツキシマブ)及びベクチビックス(登録商標)(パニツムマブ)を含むモノクローナル抗体が挙げられる。

0294

パーキンソン病を治療するための追加の治療剤には、レボドパベンセリド、カルビドパドーパミンアゴニスト非麦角系ドーパミンアゴニスト、カテコール−O−メチル("COMT")阻害剤、たとえば、エンタコポンまたはトルコポン、モノアミンオキシダーゼ("MAO")阻害剤、たとえば、ラサガリン、アマンタジンまたは抗コリン作用因子が挙げられる。

0295

V.キット
本発明はさらに、本発明のMCAM抗体または他のアンタゴニスト及び関連用具、たとえば、使用のための指示書(たとえば、「添付文書」)を含むキット(たとえば、容器)を提供する。使用のための指示書は、たとえば、MCAMアンタゴニストの投与のための指示書及び任意で1以上の添加剤を含有してもよい。MCAMアンタゴニストの容器は単位用量、大量包装(たとえば、複数回用量の包装)または副次単位用量であってもよい。

0296

添付文書は、そのような製品の使用に関する適応、用途、投与量、投与、禁忌及び/または警告についての情報を含有する、治療用製品の商業包装に通例含まれる文書を指す。

0297

キットはまた、薬学上許容可能な緩衝液、たとえば、注射用殺菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第2の容器を含むこともできる。それはまた、他の緩衝液、希釈剤、充填剤、針及び注射器を含む、商業的な見地及びユーザーの見地から望ましい他の物質も含むことができる。

0298

上記または下記で引用されている特許出願、ウェブサイト、他の出版物、受入番号等は、各個々の項目が具体的に及び個々に参照によって組み入れられるように指示されるかのようにと同じ程度にてあらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられる。配列の異なるバージョンが異なる時に受入番号に関連するのであれば、本出願の有効な出願日での受入番号に関連するバージョンを意味する。有効な出願日は、実際の出願日または該当する場合、受入番号を指す優先権出願の出願日のいずれか早い方を意味する。同様に、出版物、ウェブサイト等の異なるバージョンが異なる時に公開されるのであれば、指示されない限り、出願の有効な出願日で最も新しく公開されたバージョンを意味する。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態または態様は、特に指示されない限り、他と組み合わせて使用することができる。明瞭さと理解を目的として説明と例示のために本発明を多少詳しく記載してきたが、添付のクレームの範囲内で特定の変更及び改変が実践され得ることが明らかであろう。

0299

材料及び方法
抗体の生成/性状分析
マウスMCAMに結合することができる抗体の生成については、ヒトIgGにマウスMCAMの細胞外ドメインを融合することによってMCAM−Fcを生成し、常法を用いてCHO細胞にて産生させた。CFA中100μgのMCAM−Fcタンパク質(1:1容量)でLou/Mラットを免疫した。不完全フロイントアジュバント(IFA)中のMCAM−Fcタンパク質(1:1容量)によって2週間間隔で2回ラットを追加免疫した。免疫したラットから標準のプロトコールを用いてハイブリドーマを生成し、Clonepixによってクローンを選択した。完全長のマウスMCAM遺伝子でCHO細胞に形質移入し、ネオマイシンと常法を用いて安定な発現について細胞を選抜した。常法を用いて親CHO細胞(MCAM陰性)をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)によって蛍光標識し、1:1の比で非標識のMCAMを形質移入したCHO細胞と混合した。細胞のこの混合物と共にハイブリドーマ上清を30分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって可能性のあるMCAM特異的な抗体の結合を蛍光標識した抗ラット二次抗体(Jackson Immuno)により検出した。

0300

MCAM特異的な抗体について陽性とスクリーニングされたハイブリドーマの上清を蛍光標識したマウスMCAM−Fcタンパク質(5μg/mL)と共に30分間事前にインキュベートした後、ラミニンα4発現細胞株WM2664に加え、フローサイトメトリーによって細胞株へのMCAM−Fcタンパク質の結合の中和を測定した。

0301

ヒトMCAMに結合することができるラット抗体の生成のために、ヒトIgGにヒトMCAMの細胞外ドメインを融合することによってhMCAM−Fcを生成し、常法を用いてCHO細胞にて産生させた。CFA中250μgのhMCAM−Fcタンパク質(1:1容量)でLou/Mラットを免疫した。不完全フロイントアジュバント(IFA)中のhMCAM−FCタンパク質(1:1容量)によって2週間間隔で2回ラットを追加免疫した。免疫したラットから標準のプロトコールを用いてハイブリドーマを生成し、Clonepixによってクローンを選択した。完全長のヒトMCAM遺伝子でCHO細胞に形質移入し、ネオマイシンと常法を用いて安定な発現について細胞を選抜した。常法を用いて親CHO細胞(MCAM陰性)をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)によって蛍光標識し、1:1の比で非標識のヒトMCAMを形質移入したCHO細胞と混合した。細胞のこの混合物と共にハイブリドーマ上清を30分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって可能性のあるヒトMCAM特異的な抗体の結合を蛍光標識した抗ラット二次抗体(Jackson Immuno)により検出した。

0302

ヒトMCAMに結合することができるマウス抗体の生成のために、ヒトIgGにヒトMCAMの細胞外ドメインを融合することによってhMCAM−Fcを生成し、常法を用いてCHO細胞にて産生させた。CFA中50μgのhMCAM−Fcタンパク質(1:1容量)でBalb/cマウスを免疫した。不完全フロイントアジュバント(IFA)中のhMCAM−Fcタンパク質(1:1容量)によって2週間間隔で2回マウスを追加免疫した。免疫したマウスから標準のプロトコールを用いてハイブリドーマを生成し、Clonepixによってクローンを選択した。完全長のヒトMCAM遺伝子でCHO細胞に形質移入し、ネオマイシンと常法を用いて安定な発現について細胞を選抜した。常法を用いて親CHO細胞(MCAM陰性)をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)によって蛍光標識し、1:1の比で非標識のヒトMCAMを形質移入したCHO細胞と混合した。細胞のこの混合物と共にハイブリドーマ上清を30分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって可能性のあるヒトMCAM特異的な抗体の結合を蛍光標識した抗マウス二次抗体(Jackson Immuno)により検出した。

0303

ヒトMCAM特異的な抗体について陽性とスクリーニングされたハイブリドーマの上清を蛍光標識したhMCAM−Fcタンパク質(5μg/mL)と共に30分間事前にインキュベートした後、ラミニンα4発現細胞株WM2664に加え、フローサイトメトリーによって細胞株へのhMCAM−Fcタンパク質の結合の中和を測定した。

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