図面 (/)

技術 レッドクローバーとザクロとの複合抽出物を有効成分として含む組成物の女性更年期改善用途

出願人 エイチエルサイエンスカンパニー,リミテッドイ,へ-ヨン
発明者 イ,へ-ヨン
出願日 2015年4月17日 (5年7ヶ月経過) 出願番号 2017-506242
公開日 2017年6月1日 (3年5ヶ月経過) 公開番号 2017-513949
状態 特許登録済
技術分野 医薬品製剤 食品の着色及び栄養改善 化合物または医薬の治療活性 植物物質含有医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 連動運動 X線吸収 直立型 倫理基準 群分離 重量対比 脂肪変化 含量変化
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年6月1日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、更年期症状改善効果エストロゲン様効果抗肥満効果高脂血症抑制効果脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果などで相乗効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物及びその多様な用途、特に、薬学的、食品学的、化粧学的用途に関する。

概要

背景

概要

本発明は、更年期症状改善効果エストロゲン様効果抗肥満効果高脂血症抑制効果脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果などで相乗効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物及びその多様な用途、特に、薬学的、食品学的、化粧学的用途に関する。

目的

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、更年期症状の改善に相乗効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物及びその多様な用途、特に、薬学的、食品学的、化粧学的用途を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

請求項2

前記更年期障害が、顔面紅潮発汗不眠症神経過敏うつ病めまい集中力欠乏関節痛頭痛心悸亢進膣乾燥感、疲れ興奮不眠記憶喪失心配及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択された1つ以上の更年期症状を示すことを特徴とする請求項1に記載の更年期障害改善用組成物。

請求項3

前記更年期障害改善が、更年期症状改善、抗肥満高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された1つ以上の効果を奏することを特徴とする請求項1に記載の更年期障害改善用組成物。

請求項4

請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の更年期障害改善用組成物を含む薬学的組成物

請求項5

請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の更年期障害改善用組成物を含む食品組成物

請求項6

請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の更年期障害改善用組成物を含む化粧料組成物

請求項7

ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物重量比が1:1〜4であることを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物

請求項8

ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が1:1.5〜2.5であることを特徴とする請求項7に記載の組成物。

請求項9

前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を組成物100ml当り50〜150mgで含むことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。

請求項10

ザクロ抽出物が、全体ザクロ抽出物対比0.5〜1mg/gのエラグ酸を含むことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。

請求項11

レッドクローバー抽出物が、全体レッドクローバー抽出物対比50〜150mg/gのイソフラボンを含むことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。

請求項12

前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物が、30〜100mg/gのイソフラボン及び0.15〜0.4mg/gのエラグ酸を含むことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。

請求項13

レッドクローバー抽出物が、水、炭素数1〜4の低級アルコールまたはこれらの混合物溶媒として使用して抽出したことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。

請求項14

レッドクローバー抽出物が、レッドクローバー抽出粉末であることを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。

請求項15

ザクロ抽出物が、ザクロ抽出粉末であることを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。

請求項16

ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が1:1〜4になるように混合することを特徴とするザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む組成物の更年期障害改善効果を向上させる方法。

請求項17

(S1)ザクロの果肉澱粉分解酵素を添加し加熱濃縮してザクロ果肉抽出物を製造する段階と、(S2)レッドクローバーの地上部に水、炭素数1〜4の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として添加してレッドクローバー地上部抽出物を製造する段階と、(S3)ザクロ果肉抽出物とレッドクローバー地上部抽出物とを混合して撹拌する段階と、を含む更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。

請求項18

前記レッドクローバー地上部抽出物は、さらに加熱濃縮した後、多糖類を添加し乾燥してレッドクローバー地上部抽出粉末として(S3)段階に混合されることを特徴とする請求項17に記載の更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。

請求項19

前記ザクロ果肉抽出物は、さらに多糖類を添加し乾燥してザクロ果肉抽出粉末として(S3)段階に混合されることを特徴とする請求項17に記載の更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。

請求項20

更年期障害の改善が必要な対象にザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む更年期障害を改善する方法。

請求項21

更年期障害改善用組成物を製造するためのザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の用途。

発明の詳細な説明

0001

〔技術分野〕
本発明は、多様な用途で優れた効果を奏する天然組成物に関し、より詳しくは、更年期症状の改善に優れた効果を奏する天然植物複合抽出物に関する。

0002

本出願は、2014年4月17日出願の韓国特許出願第10−2014−0046185号及び2015年4月17日出願の韓国特許出願第10−2015−0054547号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。

0003

背景技術
エストロゲン(estrogen)は、子宮骨格筋及び心血管系など女性の多様な臓器に対して必須な調節効果を有し、主に異化作用及び活性作用担当する[Couse and Korach、1999;Korach et al.、1995]。したがって、閉経による女性のエストロゲン不足は、いわゆる更年期障害と呼ばれる多様な臨床症状を引き起こす[Turner et al.、1994;Versi et al.、2001]。

0004

更年期障害とは、女性の閉経による女性ホルモン(エストロゲン)の急激な減少によってもたらされる多様な症状を通称する用語[Dennerstein et al.、2002;Wolff et al.、2006]である。更年期障害を改善するため、不足な女性ホルモンを補うホルモン療法が用いられたが[Greendale et al.、1998;Nichols et al.、1984]、長期使用の際、子宮癌乳癌、脳卒中、肺血栓塞栓症及び多様な副作用を引き起こし[Han et al.、2002;Beral et al.、2005;Kaari et al.、2006]、植物来由のフィトエストロゲン(phytoestrogen)が最近代案として注目されている[Knight and Eden、1996;Setchell、1998;del Giorno et al.、2010;Ateba et al.、2013]。フィトエストロゲンはエストロゲンと構造的に類似し、エストロゲン受容体ER‐α及びER‐βに結合して[Akiyama et al.、1987;Kuiper et al.、1997、Cornwell et al.、2004]、弱いエストロゲン様効果を示し[Kuiper et al.、1997]、女性の閉経による多様な代謝症候群抑制効果[Taku et al.、2007]とともに、比較的に優れた骨量保存効果[Ma et al.、2008]を奏すると知られている。エストロゲンの不足は、子宮と膣のような女性生殖器の急激な萎縮をもたらし[Versi et al.、2001;Ateba et al.、2013]、OVXによるエストロゲン欠乏の際にも顕著な子宮萎縮がもたらされると知られている[Kawakita et al.、2009;Ateba et al.、2013]。

0005

骨粗鬆症は、骨形成に比べて一層速い骨吸収を特徴とする骨再形成(remodeling)障害であり、身体の無機質代謝の障害をもたらし、骨折を格段に増加させる代謝性疾患である[Sakai et al.、1998]。特に、股関節周辺の骨折は生命を脅かし得る深刻な問題につながる[Yamaguchi et al.、1999]。OVXラット閉経期以後の女性に起きる骨粗鬆症とかなり類似の所見手術後4〜6週に亘って示すため、骨粗鬆症治療剤または骨保護物質の開発に非常に有用に使用されてきた[Kalu、1991;Wronski et al.、1991;Frost and Jee、1992]。特に、米国食品医薬品局では、OVXラットを骨粗鬆症治療剤の開発に必須な薬効検索動物モデルとして提示している[US Food and Drug Administration、1994]。骨重量の減少は、骨粗鬆症の進行過程で骨無機質の損失直結し[Yamamoto et al.、1998]、炭化重量減少の抑制は骨粗鬆症に対する治療効果を奏する直接的な証拠として示されている[Puel et al.、2005;Xie et al.、2005]。オステオカルシン(Osteocalcin)は代表的な骨代謝指標(bone turnover marker)として用いられ、bALP含量は代表的な血中骨形成指標として知られている[Ke et al.、2004;Rissanen et al.、2008;Yang et al.、2011;Kuo et al.、2012]。一般に、骨粗鬆症の進行に伴って、骨代謝(bone turnover)の増加によって血中オステオカルシン含量は増加し、骨形成抑制によって血中bALP含量は格段に減少する[Ismail et al.、1988;Ederveen and Kloosterboer、1999;Rissanen et al.、2008;Yang et al.、2011;Kuo et al.、2012]。骨密度(BMD)及び骨強度は骨の質を示す重要な指標であって、骨粗鬆症では、誘発原因に関係なく、著しい骨密度及び骨強度の減少が起きると知られている[Bilston et al.、2002;Diez、2002;Syed and Khan、2002]。組織学的検査は最も正確な骨の形態学的情報を提供し[Yamaguchi et al.、1999;Heikkinen et al.、2004]、骨粗鬆症の進行に従って骨量及び骨形成に関連する組織形態計測的指標が格段に減少し、骨再吸収に関連する因子は増加する[Heikkinen et al.、2004;Jakubas−Przewlocka et al.、2005]。顕著な骨量及び構造の減少と骨吸収活性増加がOVXラットで組織学的に認められるため、その骨の組織病理学的検査は常に直接的な薬効評価基準を提供した[Glatt et al.、2004;Jakubas−Przewlocka et al.、2005]。

0006

〔発明の概要
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、更年期症状の改善に相乗効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物及びその多様な用途、特に、薬学的、食品学的、化粧学的用途を提供することを目的とする。

0007

〔課題を解決するための手段〕
上記の課題を達成するため、本発明は、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を提供する。

0008

様態として、本発明は、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物を提供する。

0009

また、本発明は、更年期障害の改善が必要な対象にザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む更年期障害を改善する方法を提供する。

0010

また、本発明は、更年期障害改善用組成物を製造するためのザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の用途を提供する。

0011

以下、本発明において「ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物」に関する記載は、「更年期障害の改善が必要な対象にザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む更年期障害を改善する方法」及び「更年期障害改善用組成物を製造するためのザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の用途」にも同様に適用されるとする。

0012

レッドクローバー(Red clover、Trifolium pratense L)は、マメ科の多年草であり、紅車軸草、アカツメクサ、紅三葉、または金花菜とも呼ばれる。地中海沿岸西アジア原産地であり、全世界に広く分布栽培されている直立型牧草である。レッドクローバーは飼料用として使用され、には幼葉を軽くゆでてナムルで食べることもある。レッドクローバーは去痰効果があるため、喘息治療効能があると知られている。

0013

レッドクローバーは地上部(aerial parts)と根部とに分けられ、本発明においてはレッドクローバーの地上部抽出物を用いることが望ましいが、これに限定されることはない。

0014

他の様態として、レッドクローバー抽出物は、水、炭素数1〜4の低級アルコールまたはこれらの混合物溶媒として使用して抽出することが望ましい。

0015

本発明によるレッドクローバー抽出物は、次のような方法で製造することができる。例えば、まず、レッドクローバーを洗浄した後、レッドクローバーの地上部を分離し、望ましくは、水、炭素数1〜4の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として添加して、60℃〜90℃、0.01〜0.5MPaで1〜4時間に亘って1〜5回抽出して製造できるが、これに限定されることはない。

0016

また他の様態として、本発明の組成物は、全体レッドクローバー抽出物対比50〜150mg/gのイソフラボンを含む組成物を提供できるが、これに限定されることはない。

0017

ザクロ(Pomegranate、Punica granatum L)は、アジア西南部、インド西部及び米国カリフォルニア自生植物であって、現在は亜熱帯及び熱帯の各地に広く広がっている植物である。昔からザクロ、特に赤ザクロは強壮剤として知られ、特に、高血圧動脈硬化の予防に効果を奏すると知られている。また、水溶性糖質を38〜47%と多量含み、多様なビタミンミネラルを含む。

0018

本発明で用いるザクロの種類に特に制限はないが、赤ザクロが望ましく、具体的な例としてイラン、カリフォルニア、台湾、ウズキスタントルコ及び韓国産の赤ザクロが挙げられる。本発明によるザクロ抽出物は、用られるザクロの産地及び収獲時期などによって差があり得る。

0019

本発明は、果皮と種を含まないザクロの果肉のみを用いた抽出物を提供する。ザクロの果皮と種は副作用を引き起こす恐れがあるが、例えば、ザクロの果皮に含まれた特定アルカロイド(alkaloid)は身体機能を低下させる作用をし、呼吸系筋肉に影響を及ぼして、中毒すれば発作痙攣昏睡状態などが起き得る。また、ザクロ種の抽出物を服用すれば、一部でアレルギーである腫れなどの副作用が生じ得る。

0020

本発明によるザクロ抽出物は、次のような方法で製造することができる。例えば、まず、ザクロを洗浄した後、皮と種を完全に除去し、ペクチナーゼ(pectinase)、プロテイナーゼ(proteinase)、アミラーゼセルラーゼなどの酵素を添加してザクロに含まれている澱粉など多糖類を分解する。その後、選択的にゼラチン二酸化ケイ素ベントナイトシリカゾル(silicasol)、タンニンセルロースカゼインカリウムなどの添加剤を添加してザクロ抽出物の濁度色相、粘度などを調節し、加熱濃縮してザクロ抽出物を製造できるが、これに限定されることはない。

0021

さらに他の様態として、本発明のザクロ抽出物は、全体ザクロ抽出物対比0.5〜1mg/gのエラグ酸を含むことができるが、これに限定されることはない。

0022

本発明によるザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物は、ザクロ抽出物単独またはレッドクローバー抽出物単独の更年期障害改善効果より優れた効果を有し、少量の投与でも顕著な効果を奏することができる。ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比は、1:1〜4であることが望ましく、1:1.5〜2.5であることがより望ましいが、これらに限定されることはない。さらに望ましくは、ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比は1:2であり得る。

0023

さらに他の様態として、本発明は、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を組成物100ml当り50〜150mg含むことができる。

0024

さらに他の様態として、前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物は30〜100mg/gのイソフラボン及び0.15〜0.4mg/gのエラグ酸を含むことが望ましく、50〜70mg/gのイソフラボン及び0.2〜0.3mg/gのエラグ酸を含むことがより望ましい。

0025

さらに他の様態として、顔面紅潮発汗不眠症神経過敏うつ病めまい集中力欠乏関節痛頭痛心悸亢進膣乾燥感、疲れ興奮不眠記憶喪失心配及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択された1つ以上の更年期症状を改善することを特徴とする組成物を提供する。

0026

本発明において、前記更年期障害は、顔面紅潮、発汗、不眠症、神経過敏、うつ病、めまい、集中力欠乏、関節痛、頭痛、心悸亢進、膣乾燥感、疲れ、興奮、不眠、記憶喪失、心配またはアテローム性動脈硬化症などを意味するが、これらに限定されることはない。

0027

さらに他の様態として、前記更年期障害改善は、更年期症状改善、抗肥満高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された1つ以上の効果を奏することができる。

0028

さらに他の様態として、本発明は、前記組成物のうちいずれか1つの組成物を含む薬学的組成物を提供する。

0029

本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量のザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を単独で含むか、又は、1つ以上の薬学的に許容可能な担体賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。前記「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与するとき、活性成分の作用を阻害せず、通常胃腸障害めまいのようなアレルギー反応、またはこれと類似の反応を起こさない非毒性の組成物を言う。

0031

前記「薬学的に有効な量」とは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量であり、望ましくは、更年期障害の予防及び/または治療の効果を奏するための十分な量を言う。

0032

また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続、または遅延した放出を提供できるように、当業界で公知の方法を使用して剤形化することができる。剤形は、粉末顆粒錠剤エマルジョンシロップエアロゾル軟質または硬質ゼラチンカプセル滅菌注射液滅菌粉末の形態であり得る。

0033

本発明の薬学的組成物の投与経路は、経口的または非経口的に投与できるが、これらに限定されることはない。非経口的投与経路としては、例えば、経皮鼻腔腹腔、筋肉、皮下または静脈などの様々な経路が含まれ得る。

0034

また、本発明の薬学的組成物は、更年期障害の予防及び/または治療効果を有する公知の化合物並行して投与することができる。

0035

さらに他の様態として、本発明は、前記組成物のうちいずれか1つの組成物を含む食品組成物を提供する。

0036

本発明の食品組成物は、食品、機能性食品栄養補助剤、健康食品及び食品添加剤などのすべての天然素材加工形態を含む。前記類型の食品組成物は当業界で公知の通常の方法によって多様な形態で製造することができる。

0037

例えば、健康食品としては、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物自体を、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用するか、又は、顆粒化カプセル化または粉末化して摂取することができる。また、本発明のザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の外に、白芍薬山茱萸五加皮霊芝陳皮、杜当帰梔子、皇耆、麦芽カラタチ、ビタミンCフラクトオリゴ糖ステビオシド精製水マルトデキストリンなどを、本発明の目的から逸脱しない範囲内で単独で又は混合してさらに含むことができるが、本発明の食品組成物がさらに包含できる他の薬効成分及び/または添加剤は上記の例に限定されない。

0038

例えば、本発明による食品組成物は、水溶性ビタミンとしてチアミンビタミンB1)、リボフラビンアスコルビン酸ナイアシン及びビタミンB6を含むことができ、脂肪酸としてミリスチン酸パルミチン酸ステアリン酸オレイン酸リノレン酸などを含むことができ、弱酸成分としてグリコール酸及び酢酸を含むことができ、アミノ酸としてトレオニンバリンメチオニンイソルシン、ルシン、フェニルアラニントリプトファン及びリシン必須アミノ酸8種を含めて、アスパラギン酸セリングルタミン酸プロリングリシンアルラニン、システインチロシンヒスチジンアルギニンなどを含むことができる。

0039

さらに他の様態として、本発明は、前記組成物のうちいずれか1つの組成物を含む化粧料組成物を提供する。

0040

本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の外に、化粧料組成物に通常用いる成分を含み、例えば、抗酸化剤安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤、そして担体を含む。

0041

本発明による化粧料は、当業界で通常製造される如何なる剤形としても製造することができる。例えば、溶液、懸濁液、乳濁液ペーストゲルクリームローションパウダせっけん界面活性剤を含むクレンジングオイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化できるが、これらに限定されることはない。

0042

より詳細に、柔軟化粧水、栄養化粧水栄養クリームマッサージクリームエッセンスアイクリームクレンジングクリームクレンジングフォーム、クレンジングウォーターパック、スプレーまたはパウダの剤形で製造することができる。

0043

本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合は、担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノールイソプロパノールエチルカーボネートエチルアセテートベンジルアルコールベンジルベンゾエートプロピレングリコール、1,3‐ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステルポリエチレングリコールまたはソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。

0044

本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコールポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガントなどを用いることができる。

0045

本発明の剤形が界面活性剤を含むクレンジングである場合は、担体成分として脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェートスルホコハク酸モノエステルイセチオネートイミダゾリニウム誘導体メチルタウレートサルコシネート脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド脂肪酸ジエタノールアミド植物性油ラノリン誘導体またはエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。

0046

本発明の剤形がパウダまたはスプレーである場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダを用いることができ、特に、スプレーである場合は、クロフルオロヒドロカーボンプロパンブタンまたはジメチルエーテルのような推進体をさらに含むことができる。

0047

本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などを用いることができる。

0048

さらに他の様態として、本発明のレッドクローバー抽出物はレッドクローバー抽出粉末であり得る。

0049

さらに他の様態として、本発明のザクロ抽出物はザクロ抽出粉末であり得る。

0050

ここで、「粉末」とは、例えば冷凍乾燥粉末または乾燥粉末を意味するが、これらに限定されない。

0051

さらに他の様態として、本発明は、ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が1:1〜4になるようにレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを混合し、望ましくはザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が1:1.5〜2.5になるようにレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを混合し、より望ましくはザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が1:2になるようにレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを混合して更年期障害改善効果を向上させる方法を提供する。

0052

さらに他の様態として、本発明は、S1)ザクロの果肉に澱粉分解酵素を添加し加熱濃縮してザクロ果肉抽出物を製造する段階;(S2)レッドクローバーの地上部に水、炭素数1〜4の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として添加してレッドクローバー地上部抽出物を製造する段階;及び(S3)ザクロ果肉抽出物とレッドクローバー地上部抽出物とを混合して撹拌する段階を含む更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法を提供する。

0053

本発明において、前記S1)段階の澱粉分解酵素は、例えば、ペクチナーゼ、プロテイナーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼなどの酵素が挙げられるが、これらに限定されない。

0054

さらに他の様態として、前記レッドクローバー地上部抽出物は、さらに加熱濃縮した後、多糖類を添加し乾燥してレッドクローバー地上部抽出粉末として(S3)段階に混合される更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法を提供する。

0055

さらに他の様態として、前記ザクロ果肉抽出物は、さらに多糖類を添加し乾燥してザクロ果肉抽出粉末として(S3)段階に混合されることを特徴とする更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法を提供する。

0056

〔発明の効果〕
本発明によれば、更年期症状改善、抗肥満、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された1つ以上の効果を奏する相乗的な更年期症状改善効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物を提供することができる。

0057

〔図面の簡単な説明〕
図1〕OVXラットを用いてレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の相乗効果を実験するための実験スケジュールを示した図である。

0058

図2組織病理学的変化を観察したラットの領域を示した図である。

0059

図3〕左側は骨密度(BMD;Bone Mineral Density)測定装置であり、右側は二重エネルギX線吸収測定法(dual−energy x−ray absorptionmetry)(Norland pDEXA;Fort Atkinson、WI、USA)で検出した右側大腿骨(femur)の全体(total(T))、骨端(epiphyseal(E))及び骨幹(diaphyseal(mid−shaft;M))領域、脛骨(tibia)及びL5の全領域を示した図である。

0060

図4骨強度測定装置を示した図である。骨強度はFL破壊荷重、failure load)によって測定する。

0061

図5偽手術(sham operation)対照群またはOVXラットから採取した左側腹壁に蓄積された脂肪を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cはレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群、Dはザクロ抽出物20mg/kg投与群、Eはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)60mg/kg投与群を示した図である。

0062

〔図6〕偽手術対照群またはOVXラットから採取した子宮を示した図である。上段左側よりAからG。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cはレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群、Dはザクロ抽出物20mg/kg投与群、Eはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)60mg/kg投与群を示した図である。

0063

図7〕OVXラットの血清中エストラジオール(estradiol)数値を示した図である。a(p<0.01):マンホイットニー検定(以下、「MWテスト」とする)によって偽手術対照群と比較、b(p<0.01):MWテストによってOVX対照群と比較、c(p<0.01)及びd(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、e(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較。

0064

図8〕OVXラットの血清中のオステオカルシン数値を示した図である。a(p<0.01)及びb(p<0.05):最小有意差検定(以下、「LSDテスト」とする)によって偽手術対照群と比較、c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較、e(p<0.01)及びf(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、g(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較。

0065

図9〕OVXラットの血清bALP数値を示した図である。a(p<0.01)及びb(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較、c(p<0.01)及びd(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較、e(p<0.01)及びf(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、g(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較。

0066

図10〕OVXラットの大腿骨強度を示した図である。a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較、c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較、d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較。

0067

図11〕脛骨強度を示した図である。a(p<0.01)及びb(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較、c(p<0.01)及びd(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較、e(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、f(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較。

0068

図12〕偽手術対照群またはOVXラットの背中側腹部筋肉の腹部脂肪から採取した脂肪細胞の組織学的映像を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cはレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群、Dはザクロ抽出物20mg/kg投与群、Eはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)60mg/kg投与群を示した図である。

0069

図13〕偽手術対照群またはOVXラットから採取した左側子宮角の組織学的映像を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cはレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群、Dはザクロ抽出物20mg/kg投与群、Eはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)60mg/kg投与群を示した図である。Lはルーメン(lumen);MUは粘膜(mucosa);MLは筋肉層(muscular layer);Epは上皮(epithelium);UGは子宮腺(uterine gland)。

0070

図14〕偽手術対照群またはOVXラットから採取した左側面の肝葉(lobe)の組織学的プロファイルを示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cはレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群、Dはザクロ抽出物20mg/kg投与群、Eはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)60mg/kg投与群を示した図である。CVは中央血管(central vein);PTは門脈三つ組(portal triad)。

0071

図15〕偽手術対照群またはOVXラットから採取した大腿骨の組織学的プロファイルを示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cはレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群、Dはザクロ抽出物20mg/kg投与群、Eはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)60mg/kg投与群を示した図である。Cb皮質骨(cortical bone);Tbは柱骨(trabecular bone);Bmは骨髄(bone marrow);Gpは成長板(growth plate)。

0072

図16〕偽手術対照群またはOVXラットから採取した脛骨の組織学的プロファイルを示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cはレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群、Dはザクロ抽出物20mg/kg投与群、Eはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)60mg/kg投与群を示した図である。Cbは皮質骨;Tbは柱骨;Bmは骨髄;Gpは成長板。

0073

図17〕偽手術対照群またはOVXラットから採取したL4の組織学的プロファイルを示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cはレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群、Dはザクロ抽出物20mg/kg投与群、Eはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)60mg/kg投与群を示した図である。Cbは皮質骨;Tbは柱骨;Bmは骨髄;Gpは成長板。

0074

図18OVXマウスを用いてレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の比率による相乗効果を実験するための実験スケジュールを示した図である。

0075

図19〕組織病理学的変化を観察したマウスの領域を示した図である。

0076

図20〕BMD測定装置(左側及び中央、nAlyzer、Medikors、南、韓国)及びそれを用いて撮影した写真(右側)を示した図である。

0077

図21〕骨強度測定装置(SV−H1000、日本計測ステム(株)、日本)を示した図である。骨強度はFL(破壊荷重)によって測定する。

0078

図22〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスモデルにおける体重変化を示したグラフである。

0079

図23〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスモデルの腹腔内に蓄積された腹部脂肪パッドの代表総(gross)写真を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cは17β‐エストラジオール0.03μg/頭で処理されたOVXマウス、Dはレッドクローバー抽出物120mg/kg投与群、Eはザクロ抽出物120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1複合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)投与群、Gはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:2複合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)投与群、Hはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:4複合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)投与群、Iはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:6複合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)投与群、Jはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:8複合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)投与群、Kはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)投与群、Lはレッドクローバー:ザクロ抽出物の4:1複合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)投与群、Mはレッドクローバー:ザクロ抽出物の6:1複合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)投与群、Nはレッドクローバー:ザクロ抽出物の8:1複合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)投与群を示した図である(スケールバー=11mm)。

0080

図24〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスモデルの子宮の代表総写真を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cは17β‐エストラジオール0.03μg/頭で処理されたOVXマウス、Dはレッドクローバー抽出物120mg/kg投与群、Eはザクロ抽出物120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1複合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)投与群、Gはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:2複合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)投与群、Hはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:4複合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)投与群、Iはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:6複合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)投与群、Jはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:8複合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)投与群、Kはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)投与群、Lはレッドクローバー:ザクロ抽出物の4:1複合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)投与群、Mはレッドクローバー:ザクロ抽出物の6:1複合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)投与群、Nはレッドクローバー:ザクロ抽出物の8:1複合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)投与群を示した図である(スケールバー=10mm)。

0081

図25〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスの血清中のエストラジオール数値を示した図である。a(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較、b(p<0.01):MWテストによってOVX対照群と比較、c(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物単一組成処理群と比較、d(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物単一組成物処理群と比較(E2は17β‐エストラジオール)。

0082

図26〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスの血清中のオステオカルシン数値を示した図である。a(p<0.01)及びb(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較、c(p<0.01):MWテストによってOVX対照群と比較、d(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物単一組成物処理群と比較、e(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物単一組成物処理群と比較。

0083

図27〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスの血清bALP数値を示した図である。a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較、b(p<0.01)及びc(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較、d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較。

0084

図28及び図29〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスのDEXA(二重エネルギーX線吸収測定)写真を示した図である。モデルの腹腔内に蓄積された腹部脂肪パッドの代表総写真を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cは17β‐エストラジオール0.03μg/頭で処理されたOVXマウス、Dはレッドクローバー抽出物120mg/kg投与群、Eはザクロ抽出物120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1複合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)投与群、Gはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:2複合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)投与群、Hはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:4複合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)投与群、Iはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:6複合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)投与群、Jはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:8複合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)投与群、Kはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)投与群、Lはレッドクローバー:ザクロ抽出物の4:1複合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)投与群、Mはレッドクローバー:ザクロ抽出物の6:1複合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)投与群、Nはレッドクローバー:ザクロ抽出物の8:1複合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)投与群を示した図である。

0085

図30〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスの大腿骨強度(破壊荷重、骨強度)を示した図である。a(p<0.01)及びb(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較、c(p<0.01)及びd(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較、e(p<0.01)及びf(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較。

0086

図31及び図32〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスの腹腔脂肪細胞の組織学的映像を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cは17β‐エストラジオール0.03μg/頭で処理されたOVXマウス、Dはレッドクローバー抽出物120mg/kg投与群、Eはザクロ抽出物120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1複合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)投与群、Gはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:2複合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)投与群、Hはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:4複合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)投与群、Iはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:6複合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)投与群、Jはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:8複合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)投与群、Kはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)投与群、Lはレッドクローバー:ザクロ抽出物の4:1複合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)投与群、Mはレッドクローバー:ザクロ抽出物の6:1複合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)投与群、Nはレッドクローバー:ザクロ抽出物の8:1複合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)投与群を示した図である(スケールバー=120μm)。

0087

図33及び図34〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスから採取した左側子宮角の組織学的映像を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cは17β‐エストラジオール0.03μg/頭で処理されたOVXマウス、Dはレッドクローバー抽出物120mg/kg投与群、Eはザクロ抽出物120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1複合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)投与群、Gはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:2複合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)投与群、Hはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:4複合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)投与群、Iはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:6複合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)投与群、Jはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:8複合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)投与群、Kはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)投与群、Lはレッドクローバー:ザクロ抽出物の4:1複合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)投与群、Mはレッドクローバー:ザクロ抽出物の6:1複合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)投与群、Nはレッドクローバー:ザクロ抽出物の8:1複合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)投与群を示した図である。Lはルーメン;MUは粘膜;MLは筋肉層;Epは上皮;MGは子宮腺(スケールバー=120μm)。

0088

図35及び図36〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスから採取した左側面の肝葉の組織学的映像を示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cは17β‐エストラジオール0.03μg/頭で処理されたOVXマウス、Dはレッドクローバー抽出物120mg/kg投与群、Eはザクロ抽出物120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1複合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)投与群、Gはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:2複合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)投与群、Hはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:4複合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)投与群、Iはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:6複合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)投与群、Jはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:8複合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)投与群、Kはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)投与群、Lはレッドクローバー:ザクロ抽出物の4:1複合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)投与群、Mはレッドクローバー:ザクロ抽出物の6:1複合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)投与群、Nはレッドクローバー:ザクロ抽出物の8:1複合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)投与群を示した図である。CVは中央血管;PTは門脈三つ組(スケールバー=120μm)。

0089

図37及び図38〕偽手術対照群またはOVX ddYマウスから採取した左側大腿骨の組織学的プロファイルを示した図である。Aは偽手術対照群、BはOVX対照群、Cは17β‐エストラジオール0.03μg/頭で処理されたOVXマウス、Dはレッドクローバー抽出物120mg/kg投与群、Eはザクロ抽出物120mg/kg投与群、Fはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1複合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)投与群、Gはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:2複合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)投与群、Hはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:4複合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)投与群、Iはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:6複合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)投与群、Jはレッドクローバー:ザクロ抽出物の1:8複合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)投与群、Kはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1複合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)投与群、Lはレッドクローバー:ザクロ抽出物の4:1複合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)投与群、Mはレッドクローバー:ザクロ抽出物の6:1複合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)投与群、Nはレッドクローバー:ザクロ抽出物の8:1複合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)投与群を示した図である。Cbは皮質骨;Tbは柱骨;Bmは骨髄;Gpは成長板(スケールバー=240μm)。

0090

〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明の理解を助けるために製造例と実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本発明による製造例と実施例は多くの他の形態で変形でき、本発明の範囲が後述される製造例と実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の製造例と実施例は当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。

0091

[0.レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の製造方法]
(1)レッドクローバー抽出物の製造
まず、レッドクローバーを洗浄した。レッドクローバーの地上部のみを分離して総重量80〜120kgのレッドクローバー地上部を準備した。レッドクローバー重量対比約3倍の重量で70%エタノールを添加し、75℃〜80℃、0.05MPaで2.5時間に亘って2〜3回抽出してレッドクローバー抽出物300kgを得た。固液分離工程を通じて分離した後、100meshで濾過した。濾過されたレッドクローバー抽出物を70℃、0.06Mpaで6時間加熱濃縮し、レッドクローバー濃縮抽出物25kgを得た。濃縮物にマルトデキストリン0〜1kgを添加して噴霧乾燥し、8meshで粉砕して10%イソフラボンが含まれたレッドクローバー抽出粉末10kgを得た。
(2)ザクロ抽出物の製造
まず、ザクロ1000kgの異物を除去し、割れ果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、圧搾して種を分離してザクロの果肉450kgを得た。濾過後、100〜105℃で60秒間殺菌し、48〜55℃に冷却した。ペクチナーゼをザクロジュース1000L当り70〜100ml投入し、48〜55℃で30分間澱粉を分解した。その後、濁度及び色相の維持、服用に有利な粘度のため、ザクロジュース10000L当りベントナイト900gを投入し、48〜55℃で10分間撹拌した。次いで、1.5mm及び1mm真空濾過し、加熱濃縮(順次に、80℃、475mbarで12Brixまで、87℃、626mbarで17Brixまで、95℃、847mbarで31Brixまで、70℃、312mbarで43Brixまで、そして49℃、118mbarで65Brixまで加熱濃縮)した後、さらに0.15mm濾過してエラグ酸1.8〜3.0mg/gを含むザクロ濃縮液を得た。その後、前記ザクロ濃縮液をデキストリンと混合し、噴霧乾燥過程を通じてエラグ酸0.5〜1.0mg/gを含むザクロ濃縮粉末を製造した。
(3)レッドクローバー及びザクロ複合抽出物の製造
上記のようにして製造したレッドクローバー抽出粉末40kg(イソフラボン10%含有)とザクロ抽出粉末20kg(0.8mg/gエラグ酸含有)とを混合して撹拌し、最終的なレッドクローバーとザクロとの複合抽出物60kg(イソフラボン66.7mg/g、エラグ酸0.26mg/g含有)を得た。

0092

[1.レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との組合せによる効果]
レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを特定の比率で組み合わせるとき、イソフラボノイド含有量多様化による著しい相乗効果が奏されると予想し、実験を計画した。

0093

本研究では、ザクロ抽出物の添加によるレッドクローバー抽出物の更年期障害に対する生理活性増大効果卵巣摘出(Ovariectomy;OVX)ラットモデルを用いて評価した。すなわち、OVX28日後から、レッドクローバー抽出物:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg及び60mg/kgを滅菌蒸留水に溶解または希釈し、5ml/kgの用量で毎日1回ずつ84日(12週;3ヶ月)間経口投与して、エストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の5種の薬理効果区分して評価した。

0094

エストロゲン様効果及び抗肥満効果を評価するため、体重及び増体量、水及び飼料の摂取量、尿量及び糞便の排出量、血清中エストラジオールの含量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量変化、蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞の直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の変化をそれぞれ評価した。また、肝重量、血清中AST(Aspartate aminotransferase)及びALT(Alanine aminotransferase)の含量、平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位の変化を測定して脂肪肝に対する肝保護効果を評価し、高脂血症改善効果を血中総コレステロール(TC)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質HDL)及びトリグリセリド(TG)の含量変化で評価し、骨粗鬆症改善効果、すなわち骨保護効果を評価するため、大腿骨、脛骨及び腰椎骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、骨密度(BMD)(図3)、骨強度(図4)、血中オステオカルシン及び骨特異的アルカリホスファターゼ(bone specific alkaline phosphatase(bALP))の含量、骨量及び構造と骨吸収に対する組織病理学的変化をそれぞれ測定した。本実験において、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物の結果をレッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgをそれぞれ投与したラットにおける結果と比較評価した。

0095

(実施例1−1.実験動物及び実験方法
(1)実験動物
処女雌Sprague−Dawleyラット(6週齢、OrientBio、城南、韓国)を使用した。本実験において、すべての実験動物は大邱漢医大学実験動物倫理委員会動物倫理基準に従って取り扱い、事前承認下で実験を施した[Approval No.DHU2013−042]。
(2)実験方法
群分離(総7ヶ群;群当り8匹)して実験した(表1、図1)。

0096

すなわち、偽手術対照群(Sham control)、OVX対照群、OVX手術後、レッドクローバー乾燥抽出物の単独組成物40mg/kg投与群、OVX手術後、ザクロ抽出物の単独組成物20mg/kg投与群、OVX手術後、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合組成物120mg/kg投与群、及びOVX手術後、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合組成物60mg/kg投与群に分離して実験した。

0097

適正量のレッドクローバー抽出物、ザクロ抽出物、またはレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を滅菌蒸留水に懸濁または溶解させ、5ml/kgの用量でOVX28日後から、毎日1回ずつ84日間経口投与した。すなわち、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kgをそれぞれ84日間経口投与し、偽手術対照群及びOVX対照群では実験物質の代わりに媒体である滅菌蒸留水のみを同じ用量で同期間経口投与した(表1)。

0098

0099

OVX=両側卵巣摘出術(Bilateral ovariectomy)
PCP=ザクロ抽出物(Pomegranate Concentrate Powder)
RC=レッドクローバー乾燥抽出物(Red clover dry extracts)
OVXによる更年期障害誘発のため、下記のように実験した。

0100

すなわち、偽手術対照群を除いたすべての実験動物を無作為選定し、両側の卵巣を完全に切除して骨粗鬆症を誘発した。一方、偽手術群では同じ方法で両側の卵巣を確認した後、切除せずに腹腔を閉じた。偽手術群を含むすべての実験動物は手術28日後、体重(OVXラット:323.81±4.77g、304〜354g;偽手術ラット:253.25±9.08g、240〜265g)を基準に、群当り8匹ずつ選定して実験に用いた。

0101

更年期障害に対する効果をエストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の5種の薬理効果に区分して評価した。

0102

より具体的に、抗肥満及びエストロゲン様効果は次のように実験した。OVX手術日、投与1日前(OVX27日後)、最初投与日、投与1日目から最小週1回ずつ最終犠牲日までの体重をそれぞれ記録し、OVX後の回復期(更年期障害誘発期)及び投与開始後12週間の体重変化量、すなわち増体量を測定した。水及び飼料の摂取量、尿量及び糞便の排出量(投与開始後28、49及び83日目)、血清中エストラジオールの含量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量、子宮及び蓄積腹部脂肪の組織病理学的変化(蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞の直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の変化)を観察した。

0103

また、脂肪肝に対する保護効果を確認するため、次のように実験した。肝重量、血清中AST及びALTの含量、肝の組織病理学的変化(平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位の変化)を観察した。

0104

高脂血症抑制効果は、血中TC、LDL、HDL及びTG含量の変化を通じて確認した。

0105

骨粗鬆症改善効果は、大腿骨、脛骨及び腰椎骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、BMD(図3)、骨強度、血中オステオカルシン及びbALPの含量、骨量及び構造(柱骨量、柱骨髄、厚さ、長さ、皮質骨の厚さ)、骨吸収(破骨細胞数及び破骨細胞面積(OS/BS))に対する組織病理学的変化を通じて確認した。

0106

(実施例1−2.体重及び増体量の変化)
OVX手術28日後、偽手術対照群に比べて体重の増加が顕著な実験動物のみを選定して使用したため(OVXラット:323.81±14.77g、304〜354g;偽手術ラット:253.25±9.08g、240〜265g)、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重及びOVX後誘発期である4週間の増体量の増加が全体OVX手術群で認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg投与群では投与開始後49日目からOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が認められ始め、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物60mg/kg投与群ではそれぞれ投与開始後56、63及び70日目からOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が認められ始めた。また、すべての実験物質投与群から、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)投与期間である84日間の増体量の減少も認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が投与開始後77日目から認められ、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群ではレッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01)投与期間である84日間の増体量の減少も認められた(表2)。

0107

0108

*すべての動物は夜間に絶食した。
a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較、
b(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較、
c(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、
d(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較、
e(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較、
f(p<0.01):MWテストによってOVX対照群と比較、
g(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
h(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与期間中の増体量が96.55%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−23.64、−23.00、−38.90、及び−31.87%の変化を示した。

0109

(実施例1−3.飼料摂取量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)飼料摂取量の増加が投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ認められた。OVX対照群と比べて、レッドクローバー抽出物、ザクロ抽出物及びレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物投与に関連する飼料摂取量の変化は、測定日である28、49及び83日でそれぞれ認められず、すべての用量のレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物投与群の全体からも、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べて、有意な飼料摂取量の変化が認められなかった(表3)。

0110

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後28、49及び83日目の飼料摂取量がそれぞれ30.53、32.50及び37.35%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−5.60、−6.48、−8.86、−3.17%の飼料摂取量の変化を投与開始後28日目に、0.68、−7.11、−8.95、5.94%の変化を投与開始後49日目に、−1.40、−0.98、−1.77、4.57%の変化を投与開始後83日目にそれぞれ示した。

0111

0112

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
(実施例1−4.水摂取量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)水摂取量の増加が投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ認められた。OVX対照群と比べて、レッドクローバー抽出物、ザクロ抽出物及びレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物投与に関連する水摂取量の変化は、測定日である28、49及び83日でそれぞれ認められず、ザクロ抽出物20mg/kg投与群に比べて有意な(p<0.05)水摂取量の減少が投与開始後83日目に限ってレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg投与群で認められた以外は、すべての用量のレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物投与群の全体からも、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kg投与群のそれぞれと比べて、有意な水摂取量の変化が認められなかった(表3)。

0113

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後28、49及び83日目の水摂取量がそれぞれ24.77、32.09及び40.31%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ4.12、8.24、5.99、14.98%の水摂取量の変化を投与開始後28日目に示し、−5.63、−3.32、−5.88、4.60%の変化を投与開始後49日目に示し、−1.10、14.92、−8.56、11.60%の変化を投与開始後83日目にそれぞれ示した。

0114

(実施例1−5.尿量の変化)
OVX対照群では、測定日である投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ偽手術対照群に比べて有意な尿量の変化が認められなかったが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)尿量の増加を測定日である投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ示し、特にレッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kg投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)尿量の増加がすべての測定日で認められた(表4)。

0115

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後28、49及び83日目の尿量がそれぞれ1.61、4.35及び11.99%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ5.82、−1.59、80.95、65.08%の尿量の変化を投与開始後28日目に示し、53.33、33.33、115.83、82.08%の変化を投与開始後49日目に示し、36.70、34.25、163.00、115.29%の変化を投与開始後83日目にそれぞれ示した。

0116

0117

a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較
b(p<0.01)及びc(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
m(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
h(p<0.01)及びi(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
j(p<0.01)及びk(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
l(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
(実施例1−6.糞便排出量の変化)
OVX対照群では、測定日である投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ偽手術対照群に比べて有意でない軽微な糞便排出量の増加を示したが、OVX対照群と比べてレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg投与群では、投与開始後49日及び83日目に有意な(p<0.01又はp<0.05)糞便排出量の増加をそれぞれ示し、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)糞便排出量の増加を測定日である投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ示し、特にレッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kg投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)糞便排出量の増加が、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群で、それぞれ投与開始後49日及び83日目に認められた。OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後28、49及び83日目の糞便の排出量がそれぞれ13.29、26.96及び25.76%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ28.46、7.87、25.15、33.63%の糞便排出量の変化を投与開始後28日目に示し、42.80、39.56、90.16、77.55%の変化を投与開始後49日目に示し、35.89、32.54、60.58、57.03%の変化を投与開始後83日目にそれぞれ示した。(表4)
(実施例1−7.蓄積腹部脂肪重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)、左側腹壁に蓄積された脂肪の絶対重量及び体重に対する相対重量の増加がそれぞれ認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)、腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01)腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められた(表5、図5)。

0118

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて左側腹壁に蓄積された脂肪の絶対重量及び体重に対する相対重量がそれぞれ307.47及び183.68%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−40.94、−36.38、−64.82、−55.77%の絶対重量の変化を示し、−35.49、−30.82、−59.59、−50.86%の腹部脂肪の相対重量の変化をそれぞれ示した。

0119

0120

a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較
b(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
e(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
h(p<0.01)及びi(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
j(p<0.01)及びk(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
l(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
(実施例1−8.子宮重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮の絶対重量及び体重に対する相対重量の減少がそれぞれ認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01)子宮重量の増加がそれぞれ認められた(表5、図6)。

0121

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて子宮の絶対重量及び体重に対する相対重量がそれぞれ−87.37及び−91.35%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ26.76、23.39、66.36、52.75%の絶対重量の変化を示し、38.78、33.80、91.02、70.17%の子宮の相対重量の変化をそれぞれ示した。

0122

(実施例1−9.肝重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重に対する肝の相対重量の減少が認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)肝の相対重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)肝の絶対重量の増加も示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)肝の絶対及び相対重量の増加がそれぞれ認められた(表5)。

0123

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて肝の絶対重量及び体重に対する相対重量がそれぞれ−0.03及び−30.91%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ4.18、3.96、14.99、15.49%の絶対重量の変化を示し、13.95、12.75、32.21、28.83%の相対重量の変化をそれぞれ示した。

0124

(実施例1−10.骨重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)、体重に対する大腿骨、脛骨及び腰椎骨(L5)の湿/乾燥相対重量の減少とともに、大腿骨、脛骨及びL5の炭化絶対及び相対重量の減少が認められたが、ザクロ抽出物20mg/kgを含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて著しい骨の湿/乾燥相対重量の増加が認められ、炭化骨の相対及び絶対重量の有意な(p<0.01又はp<0.05)増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい骨の湿重量の増加を示し、有意な(p<0.01又はp<0.05)骨の乾燥/炭化絶対及び相対重量の増加がそれぞれ認められた(表6〜表8)。

0125

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨の湿、乾燥及び炭化骨の体重に対する相対重量がそれぞれ−29.34、−31.02及び−42.92%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ7.81、12.49、17.16、14.78%の湿相対重量の変化を示し、12.82、11.11、29.59、24.58%の乾燥骨相対重量の変化をそれぞれ示し、25.36、29.70、53.23、42.77%の炭化大腿骨相対重量の変化をそれぞれ示した。

0126

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて脛骨の湿、乾燥及び炭化骨の体重に対する相対重量がそれぞれ−27.38、−32.82及び−44.13%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ7.22、9.78、22.73、18.15%の湿相対重量の変化を示し、13.83、19.44、36.30、29.55%の乾燥骨相対重量の変化をそれぞれ示し、30.03、32.77、62.18、50.77%の炭化脛骨相対重量の変化をそれぞれ示した。

0127

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べてL5の湿、乾燥及び炭化骨の体重に対する相対重量がそれぞれ−29.62、−34.86及び−44.49%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ6.91、10.84、34.79、27.46%の湿相対重量の変化を示し、15.82、15.44、42.68、31.84%の乾燥骨相対重量の変化をそれぞれ示し、26.19、18.74、48.36、39.84%の炭化L5相対重量の変化をそれぞれ示した。

0128

0129

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較

0130

0131

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較

0132

0133

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
m(p<0.01)及びn(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
o(p<0.01)及びp(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
(実施例1−11.血液の生化学的変化(1):AST、ALT、TC、LDL、HDL及びTG)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中AST、ALT、TC(Total Cholesterol)、LDL(Low Density Lipoprotein)及びTG(Triglyceride)含量の増加が、有意な(p<0.05)HDL(High Density Lipoprotein)含量の減少とともに認められたが、すべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の減少が認められ、血中HDL含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)血中HDL含量の増加も認められ、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の減少及びHDL含量の増加がそれぞれ認められた(表9)。

0134

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中AST及びALT含量がそれぞれ77.03及び72.53%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−14.50、−12.10、−31.63、−25.80%のAST含量の変化を示し、−20.70、−16.77、−34.93、−29.30%の血中ALT含量の変化をそれぞれ示した。

0135

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中TC及びLDL含量がそれぞれ105.00及び163.08%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−24.00、−20.98、−40.39、−36.78%のTC含量の変化を示し、−22.37、−24.56、−44.30、−39.62%の血中LDL含量の変化をそれぞれ示した。

0136

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中HDL及びTG含量がそれぞれ−18.62及び121.81%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ5.88、13.73、52.92、41.83%のHDL含量の変化を示し、−27.51、−24.69、−42.68、−36.92%の血中TG含量の変化をそれぞれ示した。

0137

0138

(実施例1−12.血液の生化学的変化(2):エストラジオール)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中エストラジオール含量の減少が認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた(図7)。

0139

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中エストラジオール含量が−86.58%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ165.55、141.18、307.56、247.90%の血中エストラジオール含量の変化をそれぞれ示した。

0140

(実施例1−13.血液の生化学的変化(3):オステオカルシン及びbALP)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中オステオカルシン含量の増加が、有意な(p<0.01)bALP含量の減少とともに認められたが、すべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)血中オステオカルシン含量の減少が、血中bALP含量の増加とともにそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)血中オステオカルシン含量の減少及びbALP含量の増加がそれぞれ認められた(図8、9)。

0141

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中オステオカルシン及びbALP含量がそれぞれ69.33及び−49.94%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−17.75、−13.83、−31.27、−27.36%のオステオカルシン含量の変化を示し、26.37、21.16、64.38、47.53%の血中bALP含量の変化をそれぞれ示した。

0142

(実施例1−14.骨密度の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて大腿骨及び脛骨の全体、部及び中軸部位の骨密度とともに、L4(第4腰椎)全体の骨密度が有意に(p<0.01)減少した一方、すべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)骨密度増加が全体測定部位でそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい骨密度の増加が全体測定部位でそれぞれ認められた(表10)。

0143

大腿骨の全体、脛部及び中軸部位の骨密度は、OVX対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−18.42、−20.06及び−16.44%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ5.67、5.46、14.64、11.13%の全体骨密度の変化を示し、9.33、6.65、22.12、16.77%の脛部骨密度の変化を示し、7.94、5.81、16.47、13.51%の中軸骨密度の変化をそれぞれ示した。

0144

脛骨の全体、脛部及び中軸部位の骨密度は、OVX対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−22.65、−20.24及び−28.62%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ8.92、6.75、19.28、16.75%の全体骨密度の変化を示し、8.39、6.45、18.71、14.95%の脛部骨密度の変化を示し、13.22、11.01、30.21、19.38%の中軸骨密度の変化をそれぞれ示した。

0145

L4全体部位の骨密度は、OVX対照群では、偽手術対照群に比べて−21.38%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ9.60、7.43、18.74、15.20%変化をそれぞれ示した。

0146

0147

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
m(p<0.01)及びn(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
o(p<0.01)及びp(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
(実施例1−15.骨強度の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて大腿骨及び脛骨の中軸部位の骨強度がそれぞれ有意に(p<0.01)減少した一方、2種の用量のレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨及び脛骨の骨強度の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)骨強度の増加が大腿骨及び脛骨の中軸部位でそれぞれ認められた(図10、11)。

0148

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨及び脛骨の中軸部位の骨強度がそれぞれ−51.06及び−53.22%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ51.66、48.93、87.20、78.09%の大腿骨中軸部位の骨強度の変化を示し、26.38、24.75、80.90、50.49%の脛骨中軸部位の骨強度の変化をそれぞれ示した。

0149

(実施例1−16.組織病理学的変化(1):蓄積腹壁脂肪、子宮及び肝)
(1)蓄積腹壁脂肪
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい腹部脂肪の腹壁蓄積増加による蓄積腹壁脂肪厚さの有意な(p<0.01)増加と脂肪細胞平均直径の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められたが、すべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)蓄積腹壁脂肪及び脂肪細胞直径の減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)脂肪の腹壁蓄積及び脂肪細胞肥大所見の抑制が認められた(表11、図12)。

0150

蓄積腹壁脂肪の厚さ及び脂肪細胞の平均直径は、OVX対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ122.59及び92.42%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−21.81、−18.61、−43.66、−35.33%の蓄積腹壁脂肪厚さの変化を示し、−25.72、−19.19、−37.39、−35.67%の脂肪細胞平均直径の変化をそれぞれ示した。
(2)子宮
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい子宮粘膜の減少を特徴とする不溶性萎縮が認められ、子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、そして粘膜内子宮腺が占める比率の有意な(p<0.01)減少がそれぞれ認められたが、すべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の増加がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)子宮の不溶性萎縮所見の組織病理学的抑制が認められた(表11、図13)。

0151

子宮の全体及び上皮の平均厚さは、OVX対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−83.08及び−74.62%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ62.99、34.94、167.13、102.53%の子宮全体平均厚さの変化を示し、73.09、96.22、148.66、133.62%の子宮上皮平均厚さの変化をそれぞれ示した。

0152

子宮粘膜の平均厚さ及び粘膜内子宮腺が占める比率は、OVX対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−81.70及び−83.16%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ56.88、47.96、174.02、137.75%の子宮粘膜平均厚さの変化を示し、91.41、127.57、314.70、264.53%の粘膜内子宮腺が占める比率の変化をそれぞれ示した。
(3)肝
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい肝細胞内の脂肪蓄積による肥大を特徴とする肝脂肪病症が引き起こされ、肝の脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められたが、レッドクローバー抽出物40mg/kgを含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)肝脂肪病症の減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01)肝脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の減少が認められた(表11、図14)。

0153

肝脂肪変性部位及び平均肝細胞直径は、OVX対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ1001.19及び152.94%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−38.93、−29.44、−65.97、−59.16%の肝脂肪変性部位の変化を示し、−20.83、−19.11、−45.46、−35.65%の平均肝細胞直径の変化をそれぞれ示した。

0154

0155

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
h(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
k(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
l(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
表11において、略語の意味は次のようである。
Th=thickness、厚さ
DM=diameter、直径
Epi=epithelium、上皮
MG=uterinegland、子宮
FC=fatty change、脂肪変化
(実施例1−17.組織病理学的変化(2):大腿骨、脛骨及び腰椎骨(L4))
偽手術群の大腿骨、脛骨及びL4では比較的によく発達した柱骨と皮質骨が観察された一方、OVX対照群では破骨細胞(Osteoclast cell)の著しい数的増加及び活性増加による柱骨及び皮質骨の著しい組織学的減少が認められたが、ザクロ抽出物20mg/kgを含むすべての実験物質投与群では、大腿骨、脛骨及びL4の破骨細胞活性抑制による柱骨及び皮質骨の骨量及び厚さの著しい増加が認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい破骨細胞活性抑制及び骨量保存効果が認められた(表12〜14、図15〜17)。
(1)骨質量(Bone mass)及び構造
OVX対照群の場合、大腿骨、脛骨及びL4の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、中軸部分の皮質骨の厚さがそれぞれ偽手術対照群に比べて有意に(p<0.01)減少したが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨、脛骨及びL4の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、皮質骨の厚さの増加が認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい骨質量及び構造に対する組織病理学的指標の減少抑制効果が認められた。

0156

大腿骨の柱骨量及び中軸皮質骨の厚さは、OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ−66.40%及び−25.69%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ43.75、20.91、111.04、82.21%の柱骨量の変化を示し、17.00、14.54、27.73、24.76%の皮質骨厚さの変化をそれぞれ示した。

0157

脛骨の柱骨量及び中軸皮質骨の厚さは、OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ−63.65及び−46.83%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ35.78、23.25、101.87、72.78%の柱骨量の変化を示し、16.05、11.62、58.61、29.80%の皮質骨厚さの変化をそれぞれ示した。

0158

L4の柱骨量及び中軸皮質骨の厚さは、OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ−44.84及び−38.59%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ30.88、24.90、56.05、44.72%の柱骨量の変化を示し、23.16、17.86、40.78、39.53%の皮質骨厚さの変化をそれぞれ示した。
(2)骨吸収
OVX対照群の場合、大腿骨、脛骨及びL4の破骨細胞の数と比率(OS/BS)が、それぞれ偽手術対照群に比べて有意に(p<0.01)増加したが、すべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて著しい大腿骨、脛骨及びL4の破骨細胞の数及びOS/BSの減少が認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい骨吸収増加の抑制効果が認められた(表12〜14)。

0159

大腿骨の破骨細胞の数及びOS/BSは、OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ280.30及び229.41%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−37.05、−30.28、−60.16、−52.59%の破骨細胞数の変化を示し、−21.94、−10.44、−44.78、−35.85%のOS/BSの変化をそれぞれ示した。

0160

脛骨の破骨細胞の数及びOS/BSは、OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ145.69及び351.02%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−29.82、−23.86、−44.21、−37.89%の破骨細胞数の変化を示し、−24.34、−17.04、−68.83、−51.81%のOS/BSの変化をそれぞれ示した。

0161

L4の破骨細胞の数及びOS/BSは、OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ188.89及び254.62%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−18.68、−13.19、−52.75、−45.60%の破骨細胞数の変化を示し、−21.41、−16.01、−62.69、−54.16%のOS/BSの変化をそれぞれ示した。

0162

0163

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
m(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
h(p<0.01)及びi(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
j(p<0.01)及びk(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
l(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較

0164

0165

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
f(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
m(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較

0166

0167

a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
m(p<0.01)及びn(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
o(p<0.01)及びp(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
参考までに、表12〜表14における略語の意味は次のようである。
Cbt=Cortical bone thickness(Cross thickness;μm)、皮質骨の厚さ
Tbl=Trabecular bone length(Longitudinal thickness;mm)、柱骨の長さ
Tbn=Trabecular bone number(N/epiphyseal)、柱骨の数
Tbt=Trabecular bone thickness(Cross thickness;μm)、柱骨の厚さ
TV/BV=Trabecular bone volume(%)、柱骨の体積
OS/BS=Osteoclast cell surface/bone surface(%)、破骨細胞の面積/骨面積
Ocn=Osteoclast cell number(N/epiphyseal)、破骨細胞の数
[実施例1のまとめ]
本研究では、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む複合物の更年期障害に対する生理活性増大効果を、ヒトの閉経期による更年期障害と類似すると知られたOVXラットモデル[Tominaga et al.、2001、2002;Iwamoto et al.、2005;Cheng and Tian、2012]を用いて評価した。

0168

すなわち、OVX28日後から、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kgを滅菌蒸留水に溶解または希釈して、5ml/kgの用量で毎日1回ずつ84日(12週;3ヶ月)間経口投与し、エストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の5種の薬理効果に区分して評価した。

0169

エストロゲン様効果及び抗肥満効果を評価するため、体重及び増体量、水及び飼料の摂取量、尿量及び糞便の排出量、血清中エストラジオールの含量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量変化、蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の変化をそれぞれ評価した。また、肝重量、血清中AST及びALTの含量、平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位の変化を測定して脂肪肝に対する肝保護効果を評価し、高脂血症改善効果を血中総コレステロール(TC)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)及びトリグリセリド(TG)含量の変化で評価し、骨粗鬆症改善効果、すなわち骨保護効果を評価するため、大腿骨、脛骨及び腰椎骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、骨密度(BMD)、骨強度、血中オステオカルシン及び骨特異的アルカリホスファターゼ(bALP)の含量、骨量及び構造と骨吸収に対する組織病理学的変化をそれぞれ測定した。本実験において、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物の結果をレッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgをそれぞれ投与したラットにおける結果と比較評価した。

0170

本実験の結果、OVX対照群では、偽手術媒体対照群に比べて著しい体重及び増体量、飼料及び水摂取量、蓄積腹部脂肪重量、血清中AST、ALT、TC、LDL、TG及びオステオカルシン含量の増加が、子宮、肝、大腿骨、脛骨及びL5の重量と血中bALP及びエストラジオール含量の減少とともに認められ、著しい腹壁蓄積脂肪厚さの増加及び脂肪細胞の肥大、肝の脂肪病症、子宮の不溶性萎縮、大腿骨、脛骨及びL4の骨量及び構造の減少所見が、骨吸収指標(Ocn及びOS/BS)の著しい増加とともに組織病理学的及び組織形態計測学的にそれぞれ認められた。すなわち、肥満、高脂血症、肝脂肪病症及び骨粗鬆症の多様な障害がOVXによって誘発された。一方、このようなOVXによって誘発された障害所見が、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kgの84日間の連続経口投与によって格段に抑制された。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な肥満、高脂血症、肝脂肪病症及び骨粗鬆症のようなOVXで誘発される障害の改善効果が認められた。したがって、適切な比率のザクロ抽出物の添加(レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物)は、含有するイソフラボノイドの多様性増加を通じて、OVXによって誘発される更年期障害に対するレッドクローバー抽出物の改善効果を相乗的に増加させると予想されるが、本発明がこのような内容に限られることはない。

0171

本研究では、OVXによって有意な尿及び糞便排出量の変化なく、著しい飼料及び水摂取量の増加が認められ、結果的に著しい体重増加とともに腹壁脂肪の蓄積と脂肪細胞の肥大が引き起こされた。一方、このようなOVXによって誘発された肥満所見が、それぞれレッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kgの84日間の連続経口投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な体脂肪蓄積及び体重増加の抑制所見が認められた。また、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与ラットでは、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与ラットに比べても著しい尿量及び糞便排出量の増加が測定日(投与開始後28、49及び83日目)にそれぞれ認められた。このような結果は、適切な比率のザクロ抽出物の添加(レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物)が肥満に対するレッドクローバー抽出物の改善効果を相乗的に増加させる証拠であると判断され、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kgは、一般に知られたイソフラボノイドの満腹感に関連する消化ホルモンであるCCK[Asarian and Geary、2007;Thammacharoen et al.、2008]及びグルカゴン(glucagon)[Geary and Asarian、2001]の調節を通じたエストロゲン様効果とともに、消化管連動運動の増加及び利尿効果を通じて肥満に非常に有効な効果を奏すると考えられるが、本発明がこれらに限定されることはない。一般に、消化管連動運動が増加すれば、糞便排出量の増加がもたらされ、結果的に体重減少のような抗肥満効果が奏されて[Hyland et al.、2010;Bertrand et al.、2011;Snedeker and Hay、2012]、利尿作用も同様の体重減少効果を奏すると知られている[Dagnault et al.、1996;Verlander et al.、1998]。

0172

本実験の結果をみれば、OVXによって、有意な子宮重量の減少が引き起こされ、組織病理学的で著しい子宮全体、粘膜及び上皮厚さの減少とともに粘膜内子宮腺の減少が引き起こされたが、このような子宮萎縮所見が、それぞれレッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kgの経口投与によって格段に抑制され、特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な子宮萎縮の抑制所見が認められる。

0173

本研究の結果、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kgの経口投与により、著しい血中TC、LDL及びTG含量の減少とともにHDL含量の増加が認められ、特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な抗高脂血症効果がそれぞれ認められ、本発明による比率でザクロ抽出物を添加することでレッドクローバー抽出物の抗高脂血症効果が、少なくとも本実験の条件下で相乗的に増加すると判断され、このような抗高脂血症効果はコレステロール合成に関与する酵素であるHMG‐CoA[Di Croce et al.、1996]を経由すると思われる。

0174

本研究において、OVX対照群では、著しい肝脂肪病症が血液生化学的及び組織病理学的にそれぞれ認められた。一方、このようなOVXによる脂肪肝所見が、それぞれレッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kgの経口投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な肝保護効果が認められた。このような結果も、適切な比率のザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合物の肝保護効果が相乗的に増加したことを示すさらに1つの証拠であると思われる。本実験の結果、OVX対照群では、偽手術媒体対照群に比べて著しい血中オステオカルシン含量の増加が、大腿骨、脛骨及びL5の重量と血中bALP含量の減少とともに認められ、大腿骨、脛骨及びL4の骨量及び構造の減少所見が骨吸収指標(Ocn及びOS/BS)の著しい増加とともに組織病理学的及び組織形態計測学的にそれぞれ認められ、骨粗鬆症がOVXによって誘発されることが観察された。一方、このような骨粗鬆症所見は、それぞれレッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kgの84日間の連続経口投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な骨粗鬆症の改善効果が認められた。従って、本発明による比率のザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合物は、骨粗鬆症改善効果を相乗的に増加させることが観察された。

0175

[2.ザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合比率設定に関する研究]
(実施例2−1.実験動物及び実験方法)
(1)実験動物
処女雌Sprague−Dawleyラット(6週齢)を入手して、偽手術対照群を除いたすべての実験動物を無作為に選定し、両側の卵巣を完全に切除して更年期を誘発した。一方、偽手術群では同じ方法で両側の卵巣を確認した後、切除せずに腹腔を閉じた。すべての実験動物は手術28日後、体重(OVXラット:312.21±12.3g、偽手術ラット:255.12±12.11g)を基準に、群当り4匹ずつ設定して実験に用いた。
(2)実験方法
更年期障害に対する効果を抗肥満効果、高脂血症抑制効果及び骨粗鬆症抑制効果の3種の薬理効果に区分して評価した。

0176

試験物質を滅菌蒸留水に懸濁または溶解させ、5ml/kgの用量でOVX28日後から、毎日1回ずつ56日間経口投与した。偽手術及びOVX対照群では実験物質の代わりに媒体である滅菌蒸留水のみを同じ用量で同期間経口投与した。

0177

体重の変化は、OVX手術日、投与1日前(OVX27日後)、最初投与日、及び最終犠牲日に測定して記録した。高脂血症抑制効果は最終犠牲日に血液を採取して血中TCを測定し、骨粗鬆症改善効果は大腿骨のBMD測定を通じて確認した。

0178

(実施例2−2.ザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合比率設定によるエストロゲン活性結果)
レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との複合物の更年期誘導モデルにおける更年期症状改善効果の相乗効果を確認するため、レッドクローバー抽出物40mg/kgの摂取量にザクロ抽出物を配合した後、更年期誘導動物モデルにおける抗肥満効果、高脂血症抑制効果及び骨粗鬆症抑制効果を通じてザクロ抽出物の添加による更年期症状改善相乗効果を測定した。

0179

その結果、OVXによる更年期誘導モデルにおけるレッドクローバー抽出物(RC)40mg/kgとザクロ抽出物(PCP)との複合物の8週間経口投与による更年期症状改善度を確認した。

0180

OVXによる更年期誘導モデルでは、体重が約146g増加することが確認され、レッドクローバー単独処理群と比べてザクロ抽出物10mg/kg以上を複合処方した場合で改善が確認され、ザクロ抽出物20mg/kg以上では有意な改善が確認されたが、ザクロ抽出物40mg/kg以上の配合では用量依存的な改善が確認できなかった。

0181

BMDの変化でも体重の変化と同様に、20mg/kg以上で有意な改善が確認されたが、用量依存的な改善は確認できなかった。

0182

血中TCの測定結果、10mg/kgで有意な改善が確認されたが、80mg/kg〜160mg/kgでは用量依存的変化は確認されなかった。

0183

このような結果から、レッドクローバー抽出物(RC)の単独投与より、ザクロ抽出物(PCP)との複合投与によって更年期誘導モデルで有意な改善が確認され、最適な投与濃度は10〜80mg/kgで用量依存的な結果が得られた。

0184

したがって、レッドクローバー抽出物(RC)とザクロ抽出物(PCP)との複合物製造時の配合は、レッドクローバー抽出物40〜80mg/kgにザクロ抽出物10〜80mg/kgを添加する場合に相乗効果を得ることができる。

0185

[3.ザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合比率設定による相乗効果の確認]
(実施例3−1.実験動物及び実験方法)
(1)実験動物
処女雌ddYマウス(6週齢、紀和実験動物研究所、和山、日本)を使用した。本実験において、すべての実験動物は大邱漢医大学実験動物倫理委員会の動物倫理基準に従って取り扱い、事前承認下で実験を施した[Approval No.DHU2014−020]。
(2)実験方法
群分離(総14ヶ群;群当り8匹)して実験した(表15、図18)。

0186

すなわち、偽手術後滅菌蒸留水10ml/kg投与媒体対照群(以下、偽手術対照群)、OVX手術後滅菌蒸留水10ml/kg投与媒体対照群(以下、OVX対照群)、OVX手術後ザクロ抽出物単独組成物120mg/kg投与群(PCP)、及びOVX手術後9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物(g/g)投与群であって、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(1−1)、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:2(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(1−2)、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:4(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(1−4)、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:6(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(1−6)、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:8(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(1−8)、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(2−1)、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の4:1(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(4−1)、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の6:1(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(6−1)、OVX手術後レッドクローバー:ザクロ抽出物の8:1(g/g)複合組成物120mg/kg投与群(8−1)に分離して実験した。

0187

適正量のレッドクローバー抽出物またはザクロ抽出物を滅菌蒸留水に懸濁または溶解させ、10ml/kgの用量でOVX28日後から、毎日1回ずつ84日間経口投与した。すなわち、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合物120mg/kgをそれぞれ84日間経口投与し、偽手術対照群及びOVX対照群では実験物質の代わりに媒体である滅菌蒸留水のみを同じ用量で同期間経口投与し、従来研究者の方法[Chiba et al.、2003;Murakami et al.、2007;Tousen et al.、2011]に従って、0.03μgの17β‐エストラジオール(Sigma−Aldrich、St.Louise、MO、USA)を0.2mlの滅菌生理食塩水に溶解させて、0.2ml/マウスの用量(0.03μg/頭/日)でOVX手術28日後から毎日1回ずつ84日間背中の肌に皮下投与した(表15、図18)。複合組成物の投与用量は、マウスの体表面積を考慮してヒト臨床用量600mgの12倍、すなわち、(600mg/60kg)×12=120mg/kgに選定し、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物の用量も直接的な薬効の比較評価のため120mg/kgにそれぞれ選定した。

0188

0189

OVX=両側卵巣摘出術
PCP=ザクロ抽出物
RC=レッドクローバー乾燥抽出物
RC:PCP=RCとPCPとで構成された混合剤形(g/g)
OVXによる更年期障害誘発のため、下記のように実験した。

0190

すなわち、偽手術対照群を除いたすべての実験動物を無作為に選定し、両側の卵巣を完全に切除してエストロゲン不足更年期障害を誘発した。一方、偽手術群では同じ方法で両側の卵巣を確認した後、切除せずに腹腔を閉じた。偽手術群を含むすべての実験動物は手術27日後、体重(OVXマウス:30.71±1.65g、28.0〜35.1g;偽手術マウス:26.99±1.46g、24.4〜28.7g)を基準に、群当り8匹ずつ選定して実験に用いた。

0191

更年期障害に対する効果をエストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の5種の薬理効果に区分して評価し、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物のそれぞれと比べて、同時に統計学的に有意な(p<0.01又はp<0.05)薬効相乗を示す複合組成物を、相乗効果を奏するレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物として最適な複合組成の比率を確認した。

0192

より具体的に、抗肥満及びエストロゲン様効果は次のように実験した。OVX手術日、投与1日前(OVX27日後)、最初投与日、投与1日目から最小週1回ずつ最終犠牲日までの体重をそれぞれ記録し、OVX後の回復期(更年期障害誘発期)及び投与開始後12週間の体重変化量、すなわち増体量を測定した。飼料摂取量(投与開始後1、3、7、28、56及び83日目)、血清中エストラジオールの含量、体脂肪及び腹部脂肪量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量、子宮及び蓄積腹部脂肪の組織病理学的変化(蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の変化(図19))を観察した。

0193

また、脂肪肝に対する保護効果を確認するため、次のように実験した。肝重量、血清中AST及びALTの含量、肝の組織病理学的変化(平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位の変化)を観察した。

0194

高脂血症抑制効果は、血中TC、LDL、HDL及びTG含量の変化を通じて確認した。

0195

骨粗鬆症改善効果は、大腿骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、BMD(図20)、骨強度(図21)、血中オステオカルシン及びbALPの含量、骨量及び構造(柱骨量、柱骨数、厚さ、長さ、皮質骨の厚さ)、骨吸収(破骨細胞数及び破骨細胞面積(OS/BS))に対する組織病理学的変化を通じて確認した。

0196

(実施例3−2.体重及び増体量の変化)
OVX手術28日後、偽手術対照群に比べて体重の増加が顕著な実験動物のみを選定して使用したため(OVXマウス:30.71±1.65g、28.0〜35.1g;偽手術マウス:26.99±1.46g、24.4〜28.7g)、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重及びOVX後誘発期である4週間の増体量の増加が全体OVX手術群で認められたが、エストラジオール、ザクロ抽出物及びレッドクローバー抽出物の単独組成物投与群では投与開始後14、21及び28日目からOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が認められ始め、全9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合物投与群でも投与開始後14、21または28日目からそれぞれOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が認められ始め、すべての実験物質投与群ではOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)、投与期間である84日間の増体量の減少も認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、2:1及び4:1複合物投与群では、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が投与開始後28、42及び49日目から認められ始め、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べて有意な(p<0.01)投与期間中の増体量の減少がレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1複合物投与群の順に認められた(表16、図22)。

0197

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与期間中の増体量が351.54%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−52.56、−44.46、−41.91、−67.72、−54.51、−51.28、−53.33、−52.30、−74.19、−64.40、−48.89及び−44.55%の変化を示した。

0198

0199

値はマウス8個体の平均±標準偏差で示した。
*すべての動物は夜間に絶食した。
a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較
b(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物投与群と比較
e(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物投与群と比較
f(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
i(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物投与群と比較
j(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物投与群と比較
RC:PCP=レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との配合物(g/g)。

0200

(実施例3−3.飼料摂取量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)飼料摂取量の増加が投与1日目から83日目まですべての測定日でそれぞれ認められ、OVX対照群と比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)飼料摂取量の減少がエストラジオール投与群に限って投与開始後7日目から認められ始めた以外は、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物(g/g)複合組成物投与群で、OVX対照群と比べて有意な飼料摂取量の変化は認められず、全9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物(g/g)複合組成物投与群でも、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれと比べて、有意な飼料摂取量の変化が認められなかった(表17)。

0201

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後1、3、7、28、56及び83日目の飼料摂取量がそれぞれ58.37、75.12、79.42、72.71、75.06及び95.69%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ0.87、−1.21、4.52、0.59、−2.78、−1.34、−0.93、1.96、2.36、0.22、0.70及び−0.46%の飼料摂取量の変化を投与1日目に示し、−5.24、−0.92、2.22、−1.19、−1.41、2.02、1.42、0.48、1.23、1.25、−1.52及び0.15%の変化を投与開始後3日目に、−13.04、−2.04、2.05、−1.44、0.37、2.51、0.66、0.70、−2.27、0.91、−0.22及び0.68%の変化を投与開始後7日目に、−16.34、−2.35、−1.00、−0.79、−1.73、4.05、0.25、0.48、−0.56、−0.34、2.52及び0.74%の変化を投与開始後28日目に、−20.01、−1.12、−0.59、−2.86、1.89、−2.76、−1.35、1.19、−0.75、−0.30、−2.73及び0.46%の変化を投与開始後56日目に、−27.82、−1.01、−0.57、−1.57、0.24、−2.64、−4.01、−0.71、−1.08、0.54、−0.85及び0.95%の変化を投与開始後83日目にそれぞれ示した。

0202

0203

値はマウス8個体の平均±標準偏差で示した。
a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較
b(p<0.01)及びc(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較
e(p<0.01):MWテストによってOVX対照群と比較
(実施例3−4.蓄積腹部脂肪重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)蓄積腹部脂肪の絶対重量及び体重に対する相対重量の増加がそれぞれ認められたが、エストラジオールを含むすべての投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)腹部脂肪重量の減少が認められた(表18、図23)。

0204

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて蓄積腹部脂肪の絶対重量が2375.48%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−82.20、−50.38、−45.23、−73.29、−49.86、−54.48、−45.27、−48.56、−80.93、−70.89、−52.72及び−49.28%の変化を示した。

0205

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて蓄積腹部脂肪の体重に対する相対重量が1491.59%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−78.86、−41.76、−36.56、−65.51、−39.48、−45.64、−34.56、−38.46、−74.73、−62.83、−42.68及び−38.75%の変化を示した。

0206

(実施例3−5.子宮重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮の絶対重量及び体重に対する相対重量の減少がそれぞれ認められたが、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)子宮重量の増加が認められた(表18、図24)。

0207

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて子宮の絶対重量が−88.57%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ288.64、47.73、45.00、90.45、50.00、42.73、45.45、44.55、125.00、90.00、71.82及び52.73%の変化を示した。

0208

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて子宮の体重に対する相対重量が−92.53%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ372.56、74.57、67.51、145.55、84.03、72.76、76.97、73.48、200.64、142.46、109.43及び80.95%の変化を示した。

0209

(実施例3−6.肝重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重に対する肝の相対重量の減少が認められたが、全9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物投与群を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)肝の相対重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)肝の相対重量の増加が認められた。一方、偽手術対照群と比べて有意な肝の絶対重量の変化はすべてのOVX対照群で認められず、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物投与群でも、OVX対照群に比べて有意な肝の絶対重量の変化が認められなかった(表18)。

0210

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて肝の絶対重量が4.28%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ5.37、3.34、4.95、10.29、−1.80、−0.24、−1.10、1.49、12.28、11.71、1.66及び0.54%の変化を示した。

0211

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて肝の体重に対する相対重量が−31.75%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ27.16、21.96、21.28、42.26、19.79、21.18、19.73、22.57、49.99、42.54、23.11及び18.01%の変化を示した。

0212

0213

値はマウス8個体の平均±標準偏差で示した。
a(p<0.01)及びb(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(実施例3−7.大腿骨重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重に対する大腿骨の相対湿重量の減少とともに、乾燥及び炭化骨の絶対及び相対重量の減少が認められたが、エストラジオールを含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて著しい大腿骨重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨の相対湿重量の増加、そして乾燥及び炭化骨の絶対及び相対重量の増加が認められた(表19)。

0214

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨絶対湿重量及び体重に対する相対湿重量がそれぞれ−4.19及び−37.68%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ5.79、1.27、2.68、3.67、0.85、0.56、2.82、−0.71、4.94、3.39、0.56及び0.58%の絶対湿重量の変化を示し、それぞれ27.75、19.30、18.35、33.90、23.11、21.48、23.97、19.47、39.91、31.87、21.50及び18.54%の相対湿重量の変化を示した。

0215

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨絶対乾燥重量及び体重に対する相対乾燥重量がそれぞれ−21.64及び−49.05%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ14.93、8.96、8.46、17.16、10.70、10.45、12.69、9.70、20.65、16.92、10.70及び9.95%の絶対乾燥重量の変化を示し、それぞれ38.22、28.18、24.70、50.75、35.13、33.14、35.43、31.69、60.65、48.83、33.29及び29.00%の相対乾燥重量の変化を示した。

0216

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨絶対炭化重量及び体重に対する相対炭化重量がそれぞれ−34.74及び−57.77%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ30.35、21.39、19.40、38.81、23.88、25.87、23.88、22.39、51.24、36.32、24.38及び21.39%の絶対炭化重量の変化を示し、それぞれ57.03、43.35、37.53、79.44、51.03、52.74、49.80、47.40、102.33、74.11、50.56及び43.57%の相対炭化重量の変化を示した。

0217

0218

値はマウス8個体の平均±標準偏差で示した。
a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
f(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
m(p<0.01)及びn(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(実施例3−8.血液の生化学的変化(1):AST、ALT、TC、LDL、HDL及びTG)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の増加が、有意な(p<0.01)HDL含量の減少とともに認められたが、レッドクローバー抽出物単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の減少が認められ、血中HDL含量の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の減少とともに血中HDL含量の増加が認められた(表20)。

0219

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中AST及びALT含量がそれぞれ92.30及び100.66%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−33.98、−13.94、−12.56、−26.73、−14.10、−13.71、−12.25、−12.17、−32.67、−25.96、−16.26及び−13.10%の血中AST含量の変化を示し、それぞれ−31.58、−17.11、−16.28、−31.74、−16.78、−19.08、−18.82、−17.60、−37.17、−30.43、−19.74及び−18.26%の血中AST含量の変化を示した。

0220

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中TC及びLDL含量がそれぞれ100.00及び189.26%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−25.94、−20.01、−17.85、−28.87、−20.64、−19.94、−18.27、−17.50、−36.33、−26.85、−21.27及び−19.46%の血中TC含量の変化を示し、それぞれ−26.87、−14.98、−11.96、−26.87、−14.57、−13.40、−12.92、−12.03、−36.49、−23.71、−15.40及び−15.05%の血中LDL含量の変化を示した。
OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中HDL及びTG含量がそれぞれ−50.45及び305.74%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ52.09、37.17、33.25、60.99、36.91、32.98、34.55、34.03、87.70、59.42、39.27及び34.29%の血中HDL含量の変化を示し、それぞれ−34.80、−17.99、−17.07、−31.56、−19.48、−18.98、−18.48、−17.74、−43.55、−28.56、−18.65及び−18.23%の血中TG含量の変化を示した。

0221

0222

値はマウス8個体の平均±標準偏差で示した。
a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(実施例3−9.血液の生化学的変化(2):エストラジオール)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中エストラジオール含量の減少が認められたが、ザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)血中エストラジオール含量の増加が認められた(図25)。

0223

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中エストラジオール含量が−72.46%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ185.69、37.14、30.62、84.78、37.86、36.23、35.87、31.34、116.30、83.70、49.64及び44.02%の変化を示した。

0224

(実施例3−10.血液の生化学的変化(3):オステオカルシン及びbALP)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中オステオカルシン含量の増加とともに有意な(p<0.01)bALP含量の減少が認められたが、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)血中オステオカルシン含量の減少が、血中bALP含量の増加とともにそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)血中オステオカルシン含量の減少及び血中bALP含量の増加が認められた(図26、27)。

0225

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中オステオカルシン及びbALP含量がそれぞれ77.11及び−42.35%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−31.95、−18.80、−17.20、−31.43、−19.54、−19.35、−17.27、−16.83、−34.29、−30.05、−20.62及び−18.39%の血中オステオカルシン含量の変化を示し、それぞれ39.72、22.04、17.04、36.32、22.87、19.17、18.92、17.31、49.67、34.38、24.84及び22.84%の血中bALP含量の変化を示した。

0226

(実施例3−11.骨密度の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて平均全身骨密度及び大腿骨全体骨密度がそれぞれ有意に(p<0.01)減少した一方、全9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて全身骨密度及び大腿骨全体骨密度の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)平均全身骨密度及び大腿骨全体骨密度の増加が認められた(表21、図28及び29)。

0227

OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて平均全身骨密度が−12.75%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ9.86、4.41、3.48、8.00、5.10、4.29、4.00、3.77、10.84、7.42、5.57及び5.16%の変化を示した。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

  • 国立大学法人金沢大学の「 ヌクレオチド除去修復阻害剤、それを含有する腫瘍治療の増強剤及び抗腫瘍剤」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題】大量に入手し易く、簡素な化学構造であって、損傷を受けたヌクレオチドの除去修復を阻害する活性が強くて、毒性が低く安全性が高いヌクレオチド除去修復阻害剤、それを含有し原発巣の癌細胞のような腫瘍細胞... 詳細

  • 株式会社マンダムの「 口臭抑制剤」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題】安全性が高く、経口摂取することが可能な口臭抑制剤を提供する。【解決手段】 ジュンサイ抽出物を含むことを特徴とする口臭抑制剤を提供する。前記の口臭抑制剤は、さらに、ルイボス抽出物及びリンゴンベ... 詳細

  • 阿万恵理の「 モリンガ発酵食品」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題】モリンガを発酵させるのに最適な食品を選択し、モリンガの有効成分を強化させたモリンガ発酵食品を提供すること。【解決手段】モリンガに大豆乾燥粉砕物を混合し、当該モリンガを発酵させる。また、使用する... 詳細

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ