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課題・解決手段

本発明は、修飾された組換えJ鎖ポリペプチド、それを含む抗体のような結合分子、及びそれらの使用に関する。

概要

背景

J鎖は、IgMのμ重鎖またはIgAのα重鎖のC末端での18アミノ酸分泌型尾部(tp)における最後から2番目システイン残基関与するジスルフィド結合を介して五量体IgM及び二量体IgAと会合する酸性15kDaのポリペプチドである。それぞれCys12と100、Cys71と91及びCys108と133の間で3つのジスルフィド架橋が形成される。たとえば、Frutigerら.1992,Biochemistry,31,12643−12647を参照のこと。ヒトのIgMとIgAへのJ鎖の組み込みのための及びJ鎖との高分子免疫グロブリン集合と会合のための構造的要件はそれぞれ、Sorensenら.2000,Int.Immunol.12(1):19−27及びYooら.1999,J.Biol.Chem.274(47):33771−33777によって報告されている。大腸菌における可溶性J鎖の組換え生産はRedwanら.2006,Human Antibodies,15:95−102によって報告されている。

ハイブリッドIgA/IgG抗体及びIgM/IgG抗体を作製する方法は当該技術で既知である。従って、ハイブリッドIgA2/IgG1抗体の組換え生産はChintalacharuvuら.2001,Clin.Immunol,101(1):21−31によって報告されている。IgGγ重鎖の末端でのαtpまたはμtpの付加は重合を促進し、補体活性化のようなエフェクター機能を高めることが報告されている(Smithら,J.Immunol.1995,154:2226−2236)。IgA/IgGハイブリッド抗体はIgA及びIgG双方の特性を持つ。

抗体の設計で為された前進にもかかわらず、たとえば、改善された親和性、特異性及び/または結合特性のような改善された特性を持つ修飾された抗体に対するニーズが残っている。

分野が進歩するにつれて、たとえば、さらに高い親和性、さらに長い半減期及び/またはさらに良好な組織分布を提供するようなタンパク質工学創造的な手段を介して、と同様に毒性ペイロード送達(たとえば、抗体/薬剤結合体)を介した焦点を定めた細胞破壊のための小分子技術と大分子技術の組み合わせを介して抗体の機能が高められている。抗体の機能を改善する別のアプローチは、1つのIgG分子を2つの抗原に結合させる免疫グロブリンG(IgG)構造の2価の結合を利用する。実際、特定の適用では、2つの異なる標的抗原を同時に結合することによって有用な機能を発揮する非対称の抗体についての良好な潜在性が存在する。このニーズを扱うために、種々の構築物を作り、2つの異なる抗原を結合することができ、自然界で今までに見たことがない機能を可能にする単一分子が得られている。この二重特異的なアプローチの例は、それぞれT細胞B細胞上のCD3受容体とCD19受容体を結合する「ブリツモマブ」(MT103またはAMG103)である。癌様B細胞への細胞傷害性T細胞のこの連結はB細胞白血病の有効な治療を可能にする。

しかしながら、二重特異性抗体構築発現及び生産には重大な技術的困難が残っている。二重特異性抗体は、2つの異なる抗原を同時に結合するその能力の故に有望な治療剤と見なされるが、安定性及び製造の煩雑さに関する問題のためにその有用性は限定されている。

タンパク質工学の種々の形態を用いて、異質の重鎖を一致させ、重鎖と軽鎖の適当な対という点での整合を加えて二重特異性のIgGを効率的に得ている。加えて、クアドローマ化学的ヘテロ結合体、選択されたヘテロ二量体化ドメインを用いた組換え構築物および2つの最小抗原結合部位から成る最小サイズの組換え構築物を含む種々の二重特異性抗体の形式

しかしながら、これらの取り組みのすべては困難が伴っている。

従って、たとえば、二重特異性のような操作された抗体の開発に向けた取り組みにかかわらず、さらに効率的なプラットフォームを開発する大きなニーズが残っている。新規の修飾された、多重特異性を持つ抗体及び抗体様分子の設計及び生産が、そのような治療剤の発見と臨床への導入の間のスケジュールを短縮することができる治療用抗体の場合、これは特に真実である。

概要

本発明は、修飾された組換えJ鎖ポリペプチド、それを含む抗体のような結合分子、及びそれらの使用に関する。なし

目的

分野が進歩するにつれて、たとえば、さらに高い親和性、さらに長い半減期及び/またはさらに良好な組織分布を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

ネイティブ配列J鎖に導入される外来性の結合部分を含む修飾J鎖。

請求項2

ネイティブ配列のJ鎖が、配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列またはその機能的断片である請求項1に記載の修飾J鎖。

請求項3

ネイティブ配列のJ鎖が、配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列である請求項2に記載の修飾J鎖。

請求項4

外来性の結合部分が、直接的なまたは間接的な融合によって配列番号1の前記ヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項3に記載の修飾J鎖。

請求項5

結合部分が、ペプチドリンカーを介した間接的な融合によって導入される請求項4に記載の修飾J鎖。

請求項6

間接的な融合が、結合部分のC末端及び/またはN末端にてまたはその近傍にてペプチドリンカーを介する請求項5に記載の修飾J鎖。

請求項7

外来性の結合部分が、C末端にてまたはその近傍にて配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項6に記載の修飾J鎖。

請求項8

外来性の結合部分が、C末端から約10残基以内で配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項7に記載の修飾J鎖。

請求項9

外来性の結合部分が、N末端にてまたはその近傍にて配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項6に記載の修飾J鎖。

請求項10

外来性の結合部分が、N末端から約10アミノ酸残基以内で配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項9に記載の修飾J鎖。

請求項11

外来性の結合部分が、配列番号1のシステイン残基92と101の間でヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項5に記載の修飾J鎖。

請求項12

外来性の結合部分が、グリコシル化部位にてまたはその近傍にて配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項5に記載の修飾J鎖。

請求項13

前記ペプチドリンカーが約10〜20のアミノ酸の長さである請求項5に記載の修飾J鎖。

請求項14

前記ペプチドリンカーが約15〜20のアミノ酸の長さである請求項13に記載の修飾J鎖。

請求項15

前記ペプチドリンカーが15のアミノ酸の長さである請求項14に記載の修飾J鎖。

請求項16

外来性の結合部分が、化学的誘導体化または化学酵素的誘導体化によって配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項3に記載の修飾J鎖。

請求項17

外来性の結合部分が、化学リンカーによって配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される請求項16に記載の修飾J鎖。

請求項18

化学リンカーが切断可能なリンカーまたは切断可能ではないリンカーである請求項17に記載の修飾J鎖。

請求項19

切断可能なリンカーが化学的に不安定なリンカーまたは酵素に不安定なリンカーである請求項18に記載の修飾J鎖。

請求項20

前記リンカーが、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオプロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カルボキシレートSMCC)、N−スクシンイミジル−4−(2−ピリジルチオペンタノエート(SPP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステル二官能性誘導体活性エステルアルデヒドビスアジド化合物、ビス−ジアゾニウム誘導体、ジイソシアネート、及びビス−活性フッ素化合物から成る群から選択される請求項18に記載の修飾J鎖。

請求項21

酵素認識部位の挿入によって、及びペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーを介して酵素認識部位にて外来性の結合部分を翻訳後に連結することによって修飾される請求項16に記載の修飾J鎖。

請求項22

外来性の結合部分が、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体−薬剤コンジュゲート抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質リガンド受容体ウイルス様粒子タンパク質毒素、酵素、及び代替足場から成る群から選択される請求項1〜21のいずれか1項に記載の修飾J鎖。

請求項23

代替足場が、ダルピンフィブロネクチンドメインアドネクチン及びノッティンから成る群から選択される請求項22に記載の修飾J鎖。

請求項24

抗原結合断片が、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、及び単一ドメイン抗体から成る群から選択される請求項22に記載の修飾J鎖。

請求項25

抗原結合断片がscFvである請求項24に記載の修飾J鎖。

請求項26

外来性の結合部分がエフェクター細胞に結合する請求項1〜21のいずれか1項に記載の修飾J鎖。

請求項27

エフェクター細胞が、T細胞ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ及び好中球から成る群から選択される請求項26に記載の修飾J鎖。

請求項28

エフェクター細胞がT細胞である請求項27に記載の修飾J鎖。

請求項29

外来性の結合部分がT細胞上のCD3εに結合する請求項28に記載の修飾J鎖。

請求項30

エフェクター細胞がNK細胞である請求項27に記載の修飾J鎖。

請求項31

外来性の結合部分が、NK細胞上のCD16、CD64及びNKG2Dから成る群から選択される標的を結合する請求項30に記載の修飾J鎖。

請求項32

エフェクター細胞がマクロファージである請求項27に記載の修飾J鎖。

請求項33

外来性の結合部分が、マクロファージ上のCD14に結合する請求項32に記載の修飾J鎖。

請求項34

エフェクター細胞が好中球である請求項27に記載の修飾J鎖。

請求項35

外来性の結合部分が、好中球上のCD16bまたはCD177に結合する請求項35に記載の修飾J鎖。

請求項36

請求項1〜35のいずれか1項に記載の修飾J鎖またはその抗原結合断片を含む抗体。

請求項37

尾部を含むIgM抗体IgA抗体またはIgG抗体、またはその抗原結合断片である請求項36に記載の抗体。

請求項38

IgM抗体またはその抗原結合断片である請求項37に記載の抗体。

請求項39

IgA抗体またはその抗原結合断片である請求項37に記載の抗体。

請求項40

多重特異性である、またはその抗原結合断片である請求項36〜39のいずれか1項に記載の抗体。

請求項41

二重特異性である、またはその抗原結合断片である請求項40に記載の抗体。

請求項42

前記抗体が、標的細胞、可溶性結合標的細胞表面受容体マトリックスタンパク質輸送体受容体から成る群から選択される1以上の結合標的に対する結合特異性を有する請求項36〜39のいずれか1項に記載の抗体。

請求項43

前記抗体が腫瘍細胞に結合する請求項36〜39のいずれか1項に記載の抗体。

請求項44

前記抗体が、図19に列挙された腫瘍標的関連抗原に結合する請求項36〜39のいずれか1項に記載の抗体。

請求項45

J鎖が、図19に列挙されたエフェクター細胞標的のいずれかを結合するように修飾される請求項44に記載の抗体。

請求項46

修飾J鎖がV−リンカー−Jの方向である請求項45に記載の抗体。

請求項47

修飾J鎖がJ−リンカー−Vの方向である請求項45に記載の抗体。

請求項48

腫瘍が血液癌または固形腫瘍である請求項43に記載の抗体。

請求項49

血液癌が、白血病リンパ腫骨髄腫及び骨髄異形成症候群から成る群から選択される請求項48に記載の抗体。

請求項50

白血病が、急性骨髄性白血病急性リンパ芽球性白血病慢性骨髄性白血病、または慢性リンパ性白血病である請求項48に記載の抗体。

請求項51

リンパ腫が、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である請求項48に記載の抗体。

請求項52

抗体が、CDIM、CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CD56、CD138の1以上に結合する請求項48に記載の抗体。

請求項53

修飾J鎖がCD3εに結合する請求項52に記載の抗体。

請求項54

抗体がCD20に結合し、修飾J鎖がCD3εを結合する請求項53に記載の抗体。

請求項55

V−リンカー−Jの方向で修飾J鎖を含む請求項54に記載の抗体。

請求項56

J−リンカー−Vの方向で修飾J鎖を含む請求項55に記載の抗体。

請求項57

腫瘍が上皮腫瘍である請求項44に記載の抗体。

請求項48

抗体が腫瘍上の糖質系標的に結合する請求項45に記載の抗体。

請求項49

抗体がウイルス抗原に結合する請求項36〜39のいずれか1項に記載の抗体。

請求項50

ウイルス抗原がHBV抗原またはHIV抗原である請求項49に記載の抗体。

請求項51

抗原がPreS1である請求項50に記載の抗体。

請求項52

抗原がGP120である請求項50に記載の抗体。

請求項53

請求項36〜52のいずれか1項に記載の抗体を含む組成物

請求項54

さらに薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物である請求項53に記載の組成物。

請求項55

診断用組成物である請求項53に記載の組成物。

請求項56

腫瘍またはウイルス性疾患治療方法であって、必要とする対象に有効量の請求項36〜52のいずれか1項に記載の抗体を投与することを含む、治療方法。

請求項57

腫瘍またはウイルス性疾患の治療のための薬物の調製における請求項36〜52のいずれか1項に記載の抗体の使用。

請求項58

腫瘍またはウイルス性疾患の治療における請求項36〜52のいずれか1項に記載の抗体の使用。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる2014年4月3日に出願された米国仮特許出願番号61/974,738号の優先権及び利益を主張する。

0002

技術分野
本発明は、修飾された組換えJ鎖ポリペプチド及びそれを含む抗体のような結合分子に関する。

背景技術

0003

J鎖は、IgMのμ重鎖またはIgAのα重鎖のC末端での18アミノ酸分泌型尾部(tp)における最後から2番目システイン残基関与するジスルフィド結合を介して五量体IgM及び二量体IgAと会合する酸性15kDaのポリペプチドである。それぞれCys12と100、Cys71と91及びCys108と133の間で3つのジスルフィド架橋が形成される。たとえば、Frutigerら.1992,Biochemistry,31,12643−12647を参照のこと。ヒトのIgMとIgAへのJ鎖の組み込みのための及びJ鎖との高分子免疫グロブリン集合と会合のための構造的要件はそれぞれ、Sorensenら.2000,Int.Immunol.12(1):19−27及びYooら.1999,J.Biol.Chem.274(47):33771−33777によって報告されている。大腸菌における可溶性J鎖の組換え生産はRedwanら.2006,Human Antibodies,15:95−102によって報告されている。

0004

ハイブリッドIgA/IgG抗体及びIgM/IgG抗体を作製する方法は当該技術で既知である。従って、ハイブリッドIgA2/IgG1抗体の組換え生産はChintalacharuvuら.2001,Clin.Immunol,101(1):21−31によって報告されている。IgGγ重鎖の末端でのαtpまたはμtpの付加は重合を促進し、補体活性化のようなエフェクター機能を高めることが報告されている(Smithら,J.Immunol.1995,154:2226−2236)。IgA/IgGハイブリッド抗体はIgA及びIgG双方の特性を持つ。

0005

抗体の設計で為された前進にもかかわらず、たとえば、改善された親和性、特異性及び/または結合特性のような改善された特性を持つ修飾された抗体に対するニーズが残っている。

0006

分野が進歩するにつれて、たとえば、さらに高い親和性、さらに長い半減期及び/またはさらに良好な組織分布を提供するようなタンパク質工学創造的な手段を介して、と同様に毒性ペイロード送達(たとえば、抗体/薬剤結合体)を介した焦点を定めた細胞破壊のための小分子技術と大分子技術の組み合わせを介して抗体の機能が高められている。抗体の機能を改善する別のアプローチは、1つのIgG分子を2つの抗原に結合させる免疫グロブリンG(IgG)構造の2価の結合を利用する。実際、特定の適用では、2つの異なる標的抗原を同時に結合することによって有用な機能を発揮する非対称の抗体についての良好な潜在性が存在する。このニーズを扱うために、種々の構築物を作り、2つの異なる抗原を結合することができ、自然界で今までに見たことがない機能を可能にする単一分子が得られている。この二重特異的なアプローチの例は、それぞれT細胞B細胞上のCD3受容体とCD19受容体を結合する「ブリツモマブ」(MT103またはAMG103)である。癌様B細胞への細胞傷害性T細胞のこの連結はB細胞白血病の有効な治療を可能にする。

0007

しかしながら、二重特異性抗体構築発現及び生産には重大な技術的困難が残っている。二重特異性抗体は、2つの異なる抗原を同時に結合するその能力の故に有望な治療剤と見なされるが、安定性及び製造の煩雑さに関する問題のためにその有用性は限定されている。

0008

タンパク質工学の種々の形態を用いて、異質の重鎖を一致させ、重鎖と軽鎖の適当な対という点での整合を加えて二重特異性のIgGを効率的に得ている。加えて、クアドローマ化学的ヘテロ結合体、選択されたヘテロ二量体化ドメインを用いた組換え構築物および2つの最小抗原結合部位から成る最小サイズの組換え構築物を含む種々の二重特異性抗体の形式

0009

しかしながら、これらの取り組みのすべては困難が伴っている。

0010

従って、たとえば、二重特異性のような操作された抗体の開発に向けた取り組みにかかわらず、さらに効率的なプラットフォームを開発する大きなニーズが残っている。新規の修飾された、多重特異性を持つ抗体及び抗体様分子の設計及び生産が、そのような治療剤の発見と臨床への導入の間のスケジュールを短縮することができる治療用抗体の場合、これは特に真実である。

0011

本発明は、ネイティブJ鎖配列に1以上の結合部分を導入することによってIgM抗体またはIgA抗体のJ鎖を修飾することができ、レシピエント抗体の機能性またはその標的への修飾J鎖の結合を損なうことなく、修飾J鎖をIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体に導入することができるという認識に少なくともある程度基づく。これによって結合部分を持つ修飾J鎖が1セットの標的抗原と相互作用するのが可能になる一方で、IgA、IgM、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は異なるセットの標識抗原と反応することができる。

0012

本発明はさらに、たとえば、T細胞、NK細胞マクロファージまたは好中球のようなエフェクター細胞に修飾J鎖を向けることによって生体免疫応答を活性化することができ、抗体依存性細胞傷害ADCC)の応答を改善することができるという認識に基づく。

0013

態様の1つでは、本発明は、ネイティブ配列のJ鎖に導入された外来性の結合部分を含む修飾J鎖に関する。

0014

一実施形態では、ネイティブ配列のJ鎖は、配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列またはその機能的断片である。

0015

別の実施形態では、外来性の結合部分は、直接的なまたは間接的な融合によって配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される。

0016

さらに別の実施形態では、結合部分はペプチドリンカーを介した間接的な融合によって導入される。

0017

一実施形態では、間接的な融合は、結合部分のC末端及び/またはN末端でのまたはその近傍でのペプチドリンカーを介して達成される。

0018

別の実施形態では、外来性の結合部分は、C末端及び/またはN末端でのまたはその近傍で、たとえば、C末端及び/またはN末端から約10残基の範囲内で配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される。

0019

さらなる実施形態では、外来性の結合部分は、配列番号1のシステイン残基92と101の間でヒトのネイティブJ鎖配列に導入される。

0020

もっとさらなる実施形態では、外来性の結合部分は、グリコシル化部位でまたはその近傍で配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される。

0021

ペプチドリンカーは存在するならば、たとえば、約10〜20アミノ酸の長さ、または約15〜20アミノ酸の長さ、または15アミノ酸の長さであってもよい。

0022

さらなる実施形態では、外来性の結合部分は、化学的なまたは化学酵素的誘導体化によって配列番号1のヒトのネイティブJ鎖配列に導入される。化学リンカーは切断可能なリンカーまたは切断可能ではないリンカーであってもよく、その際、切断可能なリンカーは化学的に不安定なリンカーまたは酵素的に不安定なリンカーであってもよい。

0023

さらなる実施形態では、リンカーは、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオプロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カルボキシレートSMCC)、N−スクシンイミジル−4−(2−ピリジルチオペンタノエート(SPP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステル二官能性誘導体活性エステルアルデヒドビスアジド化合物、ビス−ジアゾニウム誘導体、ジイソシアネート、及びビス−活性フッ素化合物から成る群から選択される。

0024

異なる実施形態では、J鎖は、酵素認識部位の導入によって、及びペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーを介して酵素認識部位で外来性の結合部分を翻訳後に連結することによって修飾される。

0025

実施形態すべてにおいて、外来性の結合部分は、たとえば、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体/薬剤の結合体、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質リガンド、受容体、ウイルス様粒子タンパク質毒素、酵素、及び代替足場から成る群から選択されてもよい。代替足場の例には、ダルピンフィブロネクチンドメインアドネクチン及びノッティンが挙げられる。典型的な抗原結合断片にはF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、及び単一ドメイン抗体が挙げられる。好まれる実施形態では、抗原結合断片はscFvである。

0026

一実施形態では、修飾J鎖の外来性の結合部分はエフェクター細胞に結合し、その際、エフェクター細胞は、たとえば、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ及び好中球から成る群から選択されてもよい。

0027

一実施形態では、エフェクター細胞はT細胞であり、外来性の結合部分は、たとえば、T細胞上のCD3εに結合してもよい。

0028

別の実施形態では、エフェクター細胞はNK細胞であり、修飾J鎖の外来性の結合部分にとっての標的は、例えば、NK細胞上のCD16、CD64及びNKG2Dから成る群から選択されてもよい。

0029

さらに別の実施形態では、エフェクター細胞はマクロファージであり、修飾J鎖の外来性の結合部分は、たとえば、マクロファージ上のCD14に結合してもよい。

0030

さらなる実施形態では、エフェクター細胞は好中球であり、修飾J鎖の外来性の結合部分は、たとえば、好中球上のCD16bまたはCD177に結合してもよい。

0031

別の態様では、本発明は、上文に記載されたような修飾J鎖を含む抗体またはそのような抗体の抗原結合断片に関する。抗体は、IgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgAの抗体であることができ、多重特異性、たとえば、二重特異性の抗体を含む。

0032

一実施形態では、抗体は尾部を含むIgM抗体、IgA抗体またはIgG抗体、またはその抗原結合断片である。

0033

別の実施形態では、抗体は、標的細胞、可溶性結合標的細胞表面受容体マトリクスタンパク質輸送体受容体から成る群から選択される1以上の結合標的に対する結合特異性を有する。

0034

さらに別の実施形態では、抗体は腫瘍細胞に結合する。

0035

さらなる実施形態では、抗体は、図19にてリストにした腫瘍標的に関連する抗原に結合し、その際、J鎖は、たとえば、図19にてリストにしたエフェクター細胞標的のいずれか結合するように修飾されてもよい。

0036

もっとさらなる実施形態では、修飾J鎖はV−リンカー−Jの方向でまたはJ−リンカー−Vの方向で抗体に存在する。

0037

一実施形態では、腫瘍は血液癌または固形腫瘍であり、血液癌は、たとえば、具体的には、急性骨髄性白血病急性リンパ芽球性白血病慢性骨髄性白血病または慢性リンパ性白血病ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む白血病、リンパ腫骨髄腫、及び骨髄異形成症候群であってもよい。そのような実施形態では、抗体は、たとえば、CDIM、CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CD56、CD138の1以上に結合してもよく、修飾J鎖はCD3εに結合してもよい。

0038

別の実施形態では、腫瘍は上皮腫瘍である。

0039

さらに別の実施形態では、抗体は腫瘍上の糖質系標的に結合する。

0040

さらなる実施形態では、抗体は、たとえば、HBV抗原またはHIV抗原、たとえば、PreS1またはGP120のようなウイルス抗原に結合する。

0041

さらなる態様では、本発明は記載されているような修飾J鎖を含む、IgM、IgA、IgG/IgM、IgG/IgAの抗体を含む組成物に関する。組成物は、たとえば、医薬組成物または診断用組成物であってもよい。

0042

もっとさらなる態様では、本発明は、必要とする対象に本明細書で記載されているような修飾J鎖を伴った、有効量のIgM、IgA、IgG/IgM、IgG/IgAの抗体を投与することを含む腫瘍またはウイルス性疾患を治療する方法に関する。

0043

別の態様では、本発明は、腫瘍またはウイルス性疾患の治療のための薬物の調製における、本発明に記載されているような修飾J鎖を伴うIgM、IgA、IgG/IgM、IgG/IgAの抗体の使用に関する。

0044

さらに別の態様では、本発明は、腫瘍またはウイルス性疾患の治療における、本発明は記載されているような修飾J鎖を伴うIgM、IgA、IgG/IgM、IgG/IgAの抗体の使用に関する。

図面の簡単な説明

0045

ネイティブIgMにてA鎖とB鎖が同一である、J鎖を含むIgM五量体の構造を示す。
IgA、二量体IgA及び分泌型IgA(sIgA)の模式的構造を示す。
成熟ヒトJ鎖のアミノ酸配列(配列番号1)を示す。
成熟ヒトJ鎖(配列番号1)及び種々の動物種由来のJ鎖(配列番号1〜44)の配列比較を示す。Hum=ヒト NP_653247 23−159(配列番号1)Chm=チンパンジーXP_001160135 39−175(配列番号2)Gor=ゴリラXP_004038830 23−159(配列番号3)Ora=オランウータンNP_001125381 23−159(配列番号4)Gib=ギボンXP_003265761 39−175(配列番号5)Mar=マーモセットXP_003732538 32−168(配列番号6)Cyn=カニクイザルNP_001247815 23−159(配列番号7)Bab=ヒヒXP_003898844 23−159(配列番号8)Squ=リスザルXP_003931978 23−159(配列番号9)Shr=ツパイXP_006142955 25−160(配列番号10)Dol=イルカXP_004328961 25−158(配列番号11)Kil=シャチXP_004283629 25−158(配列番号12)Ele=ゾウXP_003414110 25−158(配列番号13)Sea=アシカXP_006729388 25−158(配列番号14)Rhi=サイ XP_004419202 25−157(配列番号15)Cat=イエネコXP_003985350 25−158(配列番号16)Wol=オオカミXP_532398 26−159(配列番号17)Pan=パンダEFB23253 1−134(配列番号18)Fer=フェレットXP_004766376 26−158(配列番号19)Hor=ウマNP_001271464 25−158(配列番号20)Gui=モルモットNP_001265705 25−160(配列番号21)Cam=ラクダXP_006188738 25−158(配列番号22)Goa=ヤギXP_005681786 25−158(配列番号23)Chn=チンチラXP_005392838 94−229(配列番号24)Ham=ハムスターXP_005068228 24−160(配列番号25)She=ヒツジXP_004009937 25−158(配列番号26)BBa=食虫コウモリXP_006094475 25−158(配列番号27)Ant=レイヨウXP_005983836 25−158(配列番号28)Cow=ウシNP_786967 25−157(配列番号29)Mou=マウスNP_690052 23−159(配列番号30)Rat=ラットEDL88516 23−159(配列番号31)Hed=ハリネズミXP_004703237 25−157(配列番号32)Rab=ウサギP23108 1−136(配列番号33)Opo=オポッサムXP_003341415 29−162(配列番号34)All=アメリカワニXP_006270094 26−159(配列番号35)Tur=カメXP_005304167 26−159(配列番号36)Tas=タスマニアビルXP_003772863 27−160(配列番号37)Pla=カモノハシXP_003430954 36−160(配列番号38)Par=インコ XP_005142787 28−160(配列番号39)Duc=アヒルXP_005031370 28−160(配列番号40)Chi=ニワトリNP_989594 26−158(配列番号41)Tur=シチメンチョウXP_003205717 27−159(配列番号42)Fal=ハヤブサXP_005243236 29−160(配列番号43)Spa=スズメXP_005492217 29−158(配列番号44)
成熟ヒトJ鎖(配列番号1)及び種々の動物種由来のJ鎖(配列番号1〜44)の配列比較を示す。
成熟ヒトJ鎖(配列番号1)及び種々の動物種由来のJ鎖(配列番号1〜44)の配列比較を示す。
ヒト及びコウモリ(クロオオコウモリ、Pteropus alecto)のJ鎖アミノ酸配列(それぞれ配列番号1及び45)の配列比較を示す。
そのJ鎖を欠くIgM抗体(陰性対照)及びJ鎖を含むIgM抗体を還元性SDS−PAGEで分離し、抗J鎖抗体を用いたウエスタンブロットによって検出した図を示す。抗J鎖抗体はJ鎖を含むIgMとのみ反応した。
形質移入したCHO細胞から回収した上清を抗muまたは抗mycの親和性マトリックスによる免疫沈降のために等分した。これらのCHO細胞はCDIM(細胞死誘導分子)として知られる抗B細胞特異性を持つIgMを発現していた。このIgM抗体はIGM−55.5として知られる。免疫沈降したタンパク質を還元性SDSPAGEで分離し、抗J抗体または抗myc抗体によるウエスタンブロットによって検出した。N末端にタグを付けた抗CD3scFvJ及びC末端にタグを付けたJ−抗CD3scFvを形質移入した細胞は双方とも51kD付近陽性バンドを示し、それは抗J及び抗myc抗体の双方に反応した。
T細胞(T細胞抗原CD3)に対して結合特異性を持つ修飾J鎖を含む二重特異性IgM五量体の2つの異なる方向を示す。
C末端でJ鎖を含む抗CD3単鎖Fv(抗CD3scFv−J)の配列(配列番号46)及び構造を示す。SP=シグナルペプチド
N末端でJ鎖を含む抗CD3単鎖Fv(J−抗CD3scFv)の配列(配列番号47)及び構造を示す。SP=シグナルペプチド
エフェクター細胞に対して結合特異性を持つJ鎖に共有結合された結合ドメインを含む、標的抗原に対して結合特異性を持つ非対称性の二重特異性IgM五量体の模式図である。
CD3scFv結合ドメインで共有結合により修飾されたJ鎖を持つ抗CD20−IgM五量体のウエスタンブロットを示す。クマシーブルーで染色した非還元性PAGEによっておよそ100万ダルトンのMWのフルサイズのIgMが見られる。修飾J鎖は双方の方向CD3−J及びJ−CD3にてIgM五量体に統合する。
CD3に対する結合特異性(CD3J)を提供する修飾J鎖を持つ二重特異性抗CD20−IgM(CD20IgM)の重鎖(HC)、軽鎖(LC)及び修飾J鎖による一時的な形質移入の結果を示す。
抗CD20IgMへの修飾J鎖の組み込みがCDC活性否定的な効果を有さないことを示す。加えて、データは、いずれかの方向(V15JまたはJ15V、「15」はリンカーの長さを示す)で修飾J鎖を含むIgM分子は抗CD20IgG抗体よりも有意にさらに強力であることを示す。
二重特異性のCD20IgM×CD3J鎖分子は、修飾J鎖のCD3特異性のために活性のあるT細胞によるB細胞の殺傷の結果、B細胞の枯渇で高度に強力であることを示す。CD19+CD20+のB細胞株であるRajiを、CD20−IgM×J野生型またはCD20IgM×CD3−J鎖を伴ったCD8+細胞溶解性細胞株であるT−ALLと共に37℃、5%CO2にて24時間、共培養した。細胞を回収し、CD3及びCD19に対する蛍光抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析し、生存B細胞を評価した。
CD3への結合特異性を提供する修飾J鎖を伴った二重特異性抗CD20−IgM分子は、野生型J鎖を伴った抗CD20IgM五量体よりも有意に改善された細胞傷害性活性を有することを示す。T細胞と連動する二重特異性IgM五量体は1ng/mLの濃度で有効であり、野生型J鎖を伴った抗CD20−IgMに比べて300倍強力である。
抗CD20のIgG、IgM、及び二重特異性IgMによる生体内でのB細胞の枯渇を示す。ヒトCD34+幹細胞再構築されたヒト化NSGマウス(Jackson Laboratory;ストック番号:007799)を購入し、CD19+B細胞の投与前ベルについて全血を解析した。0.5mg/kgで動物静脈投与するためにCD20IgM×CD3−J鎖を調製した。投与の6時間後に続いて、動物から全血を採取し、蛍光標識したCD19+抗体を用いてヒトB細胞の循環レベルについてフローサイトメトリーによって解析した。
CD16に特異的なVhhラクダJ鎖のウエスタンブロットである。
修飾J鎖についてのIgM抗体標識及びエフェクター細胞標的のリストである。表の左欄に載せたIgM抗体標的のいずれかを右欄に載せた修飾J鎖標的のいずれかと組み合わせることができる。

実施例

0046

I.定義
本発明がさらに詳細に記載される前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されないので、当然変化してもよいことが理解されるべきである。本発明の範囲は添付のクレームによってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであって、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。

0047

値の範囲が提供される場合、その範囲及び他の述べられた範囲の上限と下限の間で文脈が明瞭に指示しない限り下限の10分の1までの介在する各値またはその述べられた範囲における介在する値は本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのさらに小さい範囲の上限及び下限は、本発明の範囲内に包含され、述べられた範囲における具体的に排除される限界の対象となるさらに小さい範囲に独立して含まれてもよい。

0048

定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は本発明が属する技術における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。Singletonら,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley & Sons(New York,NY,1994)は本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供している。

0049

本明細書で言及される出版物はすべて参照によって明白に本明細書に組み入れられ、どの出版物が引用されるのかと併せて方法及び/または材料を開示し、記載する。

0050

用語「抗体」には、モノクローナル抗体(免疫グロブリンのFc領域を有する完全長の抗体を含む)、単鎖分子、と同様に抗体断片(たとえば、Fab,F(ab’)2,及びFv)が含まれる。用語「免疫グロブリン」(Ig)は本明細書では「抗体」と相互交換可能に使用される。基本的な4鎖抗体単位は、2つの同一の軽(L)鎖と2つの同一の重(H)鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。言及されない限り、用語「抗体」は本明細書では広義で使用され、具体的には、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEの抗体及びそれらの断片、好ましくは抗原結合断片を含む、抗体のすべてのアイソタイプサブクラス及び形態が含まれる。本明細書で好まれる抗体には、IgM抗体及びIgA抗体及びその抗原結合断片が挙げられ、たとえば、IgGのような他のアイソタイプ配列を含んでキメラ抗体作出するように修飾されてもよい。

0051

IgGの場合、4鎖単位は一般に約150,000ダルトンである。各L鎖は1つのジスルフィド共有結合によってH鎖に連結される一方で、2つのH鎖はH鎖のアイソタイプに応じて1以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各H鎖及びL鎖は定期的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各H鎖はN末端で可変ドメイン(VH)を有し、α鎖及びγ鎖のそれぞれについては3つの定常ドメイン(CH)が続き、μ及びεアイソタイプについては4つのCHドメインが続く。各L鎖はN末端で可変ドメイン(VL)を有し、他の末端で定常ドメインが続く。VLはVHと並び、CLは重鎖の第1定常ドメイン(CH1)と並ぶ。特定のアミノ酸残基が重鎖及び軽鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。VHとVLの対合一緒に単一の抗原結合部位を形成する。

0052

IgMは複数の免疫グロブリンがジスルフィド結合によって一緒に共有結合するポリマーを形成する糖タンパク質である。IgMはほとんど五量体として存在するが、六量体としても存在するので10〜12の抗原結合部位を含有する。五量体の形態は通常、J鎖と呼ばれる追加のポリペプチドを含有するが、J鎖の非存在下で作製することもできる。五量体のIgM分子は約970kDaの分子量を有する。そのポリマーの性質の故に、IgMは高い結合活性を持ち、補体の活性化で特に有効である。IgGとは異なって、IgM単量体の重鎖は1つの可変ドメインと4つの定常ドメインで構成される。IgMの定常ドメインは本明細書ではCM1またはCμ1、CM2またはCμ2、CM3またはCμ3、及びCM4またはCμ4と名付け、その際、「CM」と「Cμ」は相互交換可能に使用される。IgM五量体の構造を図1にて説明する。

0053

用語「IgM」は本明細書では広義で使用され、具体的には、単一特異性のIgM分子、及び、たとえば、その開示が明白に参照によって本明細書に組み入れられるPCT出願番号PCT/US2014/054079にて開示された多重特異性IgM結合分子のような多重特異性(二重特異性を含む)IgM分子を含む。

0054

用語「IgM結合単位」または「IgM抗体結合単位」は広義で使用され、具体的には、関連する抗体軽鎖可変ドメイン(VL)配列を伴ったまたは伴わない、標的(たとえば、抗原)に結合する可変ドメイン配列(VH)に融合された少なくとも1つのCM4定常ドメインを含むIgM抗体重鎖定常領域のポリペプチドを対象にする。

0055

用語「二重特異性IgM結合単位」または「二重特異性IgM抗体結合単位」は広義で使用され、具体的には、関連する抗体軽鎖可変ドメイン(VL)配列を伴ったまたは伴わない、各可変ドメイン配列が異なる標的に結合する可変ドメイン配列(VH)に融合された少なくとも1つのCM4定常ドメインを含むIgM抗体重鎖定常領域のポリペプチドの対を対象にする。一実施形態では、二重特異性IgM抗体は2つのVHV抗原結合領域を含み、それぞれが1つの抗原上の異なるエピトープまたは2つの異なる抗原上のエピトープに結合することができる。二重特異性IgM抗体結合単位は単一種の完全長であることができ、またはキメラ化若しくはヒト化されることができる。本発明の二重特異性IgM抗体は5又は6の二重特異性IgM結合単位を含む五量体または六量体の環構造を有する。

0056

用語「多重特異性IgM」は本明細書では広義で使用され、2以上の結合特異性を持つIgM抗体を指す。従って、用語「多重特異性」には、それぞれ異なる抗原(AA、BB)に結合する少なくとも2つの単一特異性を含む、またはそれぞれ2つの異なる抗原(AB、AB)に結合する5または6の二重特異性サブユニットを含むIgM五量体を含む、二重特異性の、たとえば、二重特異性の抗体または二重特異性の結合単位が含まれる。従って、二重特異性の及び多重特異性のIgM五量体には、5つの同一の二重特異性結合単位、単一特異性IgM結合単位が含まれてもよく、それらの少なくとも2つは異なる結合特異性またはそれらの組み合わせを有する。

0057

「完全長のIgM抗体重鎖」は、N末端からC末端の方向にて抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常重鎖定常ドメイン1(CM1またはCμ1)と抗体重鎖定常ドメイン2(CM2またはCμ2)と抗体重鎖定常ドメイン3(CM3またはCμ3)と抗体重鎖定常ドメイン4(CM4またはCμ4)とから成るポリペプチドである。本明細書で定義されるような二重特異性の完全長IgM抗体は、それぞれ2つの抗原結合部位を持ち、2つの異なる結合標的(エピトープ)に特異的に結合する5または6の単量体(結合単位)を含む。完全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端は、重鎖または軽鎖のC末端での最後のアミノ酸を意味する。完全長抗体の重鎖または軽鎖のN末端は重鎖または軽鎖のN末端での最初のアミノ酸を意味する。

0058

ネイティブIgAは2つの同一の軽鎖(κまたはλ)と2つの同一の重鎖(α)を含む四量体タンパク質である。ヒトでは、2つのIgAアイソタイプ、IgA1及びIgA2がある。IgAはIgGに似て、Cα1ドメインとCα2ドメインの間でヒンジ領域を伴って3つの定常ドメイン(CA1〜CA3またはCα1〜Cα3)を含有し、その際、「CA」及び「Cα」の記号は相互交換可能に使用される。IgAアイソタイプはすべて18アミノ酸の「尾部」を有し、それはCα3ドメインのC末端に位置し、高分子Igの形成を可能にする(たとえば、Garcia−Pardoら,1981,J.Biol.Chem.256,11734−11738及びDavisら,1988,Eur.J.Immunol.18,1001−1008を参照のこと)。血清IgAは単量体であるが、重合することもできる。分泌型では、IgAは、尾部を含んでもよい及び分泌成分によって会合されてもよい、J鎖によって連結された2〜5の基本4鎖単位を含む。尾部、二量体IgA及び分泌成分と会合した分泌型IgA(sIgA)の構造を図2で説明する。IgA抗体はさらにIgA1及びIgA2のサブクラスに分けることができる。用語「IgA」抗体を本明細書で用いて具体的に、分泌成分を伴った及び伴わない二量体または多量体の形態を含むサブクラスすべて、すなわち、IgA1抗体及びIgA2抗体、と同様にそのような抗体の断片、好ましくは抗原結合断片を含める。本発明の目的で、IgA抗体は好ましくは二量体であり、その際、2つの尾部はJ鎖によって接続される(図2を参照のこと)。

0059

用語「IgA」は本明細書では広義で使用され、具体的には、単一特異性のIgA分子及び、たとえば、その開示全体が明白に参照によって本明細書に組み入れられるPCT出願番号PCT/US2015/015268号にて開示された多重特異性IgA結合分子のような多重特異性IgA分子が含まれる。

0060

用語「多重特異性IgA」は本明細書では広義で使用され、2以上の結合特異性を持つIgA抗体を指す。従って、用語「多重特異性」には、それぞれ異なる抗原(AA、BB)に結合する2つの単一特異性サブユニット、またはそれぞれ2つの異なる抗原(AB、AB)に結合する2つの二重特異性サブユニットを含むIgA二量体を含む「二重特異性の」、たとえば、二重特異性抗体または二重特異性の結合単位が含まれる。

0061

一実施形態では、二量体の多重特異性IgA分子は2つの単一特異性結合単位から成り、各結合単位は異なる結合標的(AA、BB)に対して結合特異性を有する。別の実施形態では、二量体IgA分子にて、2つの結合単位の少なくとも一方が2つの異なる結合特異性(すなわち、二重特異性である、たとえば、AA、A、BまたはAA、BC)を有する。別の実施形態では、2つの結合単位のそれぞれが2つの特異性を有し、それは同一(AB、AB)であってもよいし、または異なっていてもよい(たとえば、AC、CDまたはAB、AC)。

0062

用語「二重特異性IgA抗体の結合単位」は広義で使用され、具体的には、関連する抗体の軽鎖可変ドメイン(VL)配列を伴ったまたは伴わない、各可変ドメイン配列が異なる標的に結合する、可変ドメイン配列(VH)に融合された少なくとも1つのCA3定常ドメインを含むIgA抗体の重鎖定常領域のポリペプチドの対を対象にする。一実施形態では、二重特異性のIgA抗体は1つの抗原上の異なるエピトープまたは2つの異なる抗原上のエピトープにそれぞれ結合することができる2つのVHVL抗原結合領域を含む。二重特異性のIgA抗体の結合単位は単一種の完全長であることができ、またはキメラ化若しくはヒト化されることができる。

0063

「完全長のIgA抗体重鎖」は、N末端からC末端への方向にて抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体重鎖定常ドメイン1(CA1またはCα1)と抗体定常重鎖定常ドメイン2(CA2またはCα2)と抗体重鎖定常ドメイン3(CA3またはCα3)とから成るポリペプチドである。本発明に係る二重特異性または多重特異性の完全長IgA抗体は、分泌成分を伴ってまたは伴わずにそのそれぞれが単一特異性または二重特異性であってもよい2つの単量体(結合単位)を含む。従って、本発明の多重特異性IgA抗体は、得られるIgA抗体が少なくとも2つの結合特異性を有するという条件で単一特異性の及び二重特異性の結合単位を含んでもよい。完全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端は重鎖または軽鎖のC末端での最後のアミノ酸を意味する。完全長抗体の重鎖または軽鎖のN末端は重鎖または軽鎖のN末端での最初のアミノ酸を意味する。

0064

抗体の様々なクラスの構造及び特性のさらなる詳細については、たとえば、Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr及びTristram G.Parslow(編),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994,71ページ及び第6章を参照のこと。

0065

用語「界面」は本明細書で使用されるとき、第2のIgM重鎖定常領域における1以上の「接触」アミノ酸残基(または他の非アミノ酸基)と相互作用する第1のIgM重鎖定常領域における「接触」アミノ酸残基(または他の非アミノ酸基、たとえば、糖質基)を含む領域を指す。

0066

用語「非対称性の界面」は、2つの抗体鎖の間、たとえば、第1と第2のIgM重鎖定常領域の間、及び/またはIgM重鎖定常領域とそれに対応する軽鎖の間で形成される界面(上文で定義されたような)を指すのに使用され、第1の鎖と第2の鎖における接触残基は設計によって異なり、相補性の接触残基を含む。非対称性の界面は、ノブホール相互作用及び/または塩架橋カップリング電荷交換)によって、及び/または当該技術で既知の他の技法、たとえば、μ重鎖をそれに対応する軽鎖にカップリングするCrossMab法によって創り出すことができる。

0067

「空洞」または「ホール」は、第2のポリペプチドの界面からくぼみを作る少なくとも1つのアミノ酸側鎖を指すので、第1のポリペプチドの隣接界面上での対応する突出部(「ノブ」)を収容する。空洞(ホール)は元々の界面に存在してもよいし、または合成で導入されてもよい(たとえば、界面をコードする核酸を変えることによって)。通常、第2のポリペプチドの界面をコードする核酸が変更されて空洞をコードする。これを達成するには、第2のポリペプチドの界面における少なくとも1つの「元々の」アミノ酸残基をコードする核酸を、元々のアミノ酸残基よりも小さな側鎖容量を有する少なくとも1つの「移入」アミノ酸残基をコードするDNAで置き換える。1を超える元々の残基及び対応する移入残基があり得ることが十分に理解されるであろう。置き換えられる元々の残基の数の上限は第2のポリペプチドの界面における残基の総数である。空洞の形成に好まれる移入残基は普通、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、バリン(V)、及びグリシン(G)から選択される。最も好まれるアミノ酸残基はセリン、アラニンまたはスレオニンであり、最も好ましくはアラニンである。好まれる実施形態では、突出部の形成のための元々の残基は、たとえば、チロシン(Y)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)のように大きな側鎖容量を有する。

0068

「元々の」アミノ酸残基は、元々の残基よりも小さいまたは大きい側鎖容量を有することができる「移入」残基によって置き換えられるものである。移入アミノ酸残基は天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基であることができるが、好ましくは前者である。

0069

「天然に存在しない」アミノ酸残基によって意味されるのは、遺伝子コードによってコードされないが、ポリペプチド鎖にて隣接アミノ酸残基を共有結合することができる残基である。天然に存在しないアミノ酸残基の例は、ノルロイシンオルニチンノルバリンホモセリン及び、たとえば、Ellmanら,Meth.Enzym.202:301−336(1991)にて記載されたもののような他のアミノ酸残基の類似体である。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するには、Norenら.Science,244:182(1989)及びEllmanら、上記、の手順を使用することができる。手短には、これには、天然に存在しないアミノ酸残基でサプレッサtRNAを化学的に活性化し、その後そのRNAの試験管内の転写及び翻訳を行うことが含まれる。本発明の方法には、特定の実施形態では、IgM重鎖における少なくとも1つの元々のアミノ酸残基を置き換えることが関与するが、1を超える元々の残基を置き換えることができる。通常、第1または第2のポリペプチドの界面における全残基までが置き換えられる元々のアミノ酸残基を含むであろう。置き換えについて好まれる元々の残基は「埋め込まれる」。「埋め込まれる」によって意味されるのは、残基が本質的に溶媒アクセスできないことである。好まれる移入残基は考えられる酸化またはジスルフィド結合の誤対合を防ぐためにシステインではない。

0070

突出部は、それぞれ第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドの界面上の突出部及び空洞の空間的な位置と突出部及び空洞のサイズが凄いので、界面にて第1及び第2のポリペプチドの正常な会合を有意に乱すことなく突出部が空洞内に位置することができることを意味する空洞にて「位置決め可能である」。たとえば、Tyr、Phe、及びTrpのような突出部は通常、界面の軸から垂直に伸びず、好まれる構成を有するので、対応する空洞との突出部の位置合わせは、たとえば、X線結晶学または核磁気共鳴(NMR)によって得られるもののような三次元構造に基づいて突出部/空洞の対をモデル化することに頼る。このことは、分子モデル化の技法を含む当該技術で広く受け入れられている技法を用いて達成することができる。

0071

「元々の核酸」によって意味されるのは、「変化させて」(すなわち、遺伝子操作してまたは変異させて)突出部または空洞をコードすることができる対象とするポリペプチドをコードする核酸である。元々の核酸または出発核酸は天然に存在する核酸であってもよく、または事前の変化に供された(たとえば、ヒト化抗体断片)核酸を含んでもよい。核酸を「変化させること」によって意味されるのは、元々の核酸が対象とするアミノ酸残基をコードする少なくとも1つのコドンを挿入する、欠失させるまたは置換することによって変異させられることである。通常、元々の残基をコードするコドンは移入残基をコードするコドンによって置き換えられる。この方法でDNAを遺伝子操作する技法は、Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPherson,Ed.,(IRL Press,Oxford,UK.(1991)にて概説されており、それには、たとえば、部位特異的変異誘発カセット変異誘発及びポリメラーゼ鎖反応(PCR)変異誘発が挙げられる。

0072

突出部または空洞は、合成手段によって、たとえば、組換え法、試験管内ペプチド合成、以前記載された天然に存在しないアミノ酸残基を導入する技法によって、ペプチドの酵素的若しくは化学的カップリング、またはこれらの技法の幾つかの組み合わせによって第1のまたは第2のポリペプチドの界面に「導入する」ことができる。従って、「導入される」突出部または空洞は「天然に存在しない」または「非ネイティブであり」、それは、自然界または元々のポリペプチドに存在しないことを意味する(たとえば、ヒト化モノクローナル抗体)。

0073

好ましくは、突出部を形成するための移入アミノ酸残基は相対的に少数の「回転異性体」(たとえば、約3〜6)を有する。「回転異性体」はアミノ酸側鎖のエネルギー好都合な構成である。種々のアミノ酸残基についての回転異性体の数は、Ponders及びRichards,J.Mol.Biol.193:775−791(1987)にて概説されている。

0074

特に述べられない限り、用語「抗体」には具体的に、天然に存在する変異体を含む、ヒト及び非ヒトのネイティブIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD及びIgM抗体が含まれる。従って、たとえば、ヒトのIgM配列はGenBank受入番号X14940.1のもとで利用可能である一方で、変異体はGenBankCAB37838.1、CAC20458.1、AFM37312.1、X57331.1及びJ00260.1として報告されている。

0075

ポリペプチド(たとえば、抗体またはJ鎖)を参照した用語「ネイティブの」は、その調製法にかかわらず、自然界に存在する配列を有するポリペプチドを指すのに本明細書で使用される。従って、用語「ネイティブの」及び「ネイティブ配列」は本明細書では相互交換可能に使用され、自然界で見いだされる配列を持つ組換えポリペプチドを明白に包含する。

0076

用語「ネイティブ配列のJ鎖」または「ネイティブJ鎖」は本明細書で使用されるとき、そのアミノ酸配列が図3(配列番号1)で示される成熟ヒトJ鎖、及び限定しないで、図4で示される配列番号2〜44のネイティブ配列のJ鎖ポリペプチドまたは図5で示されるコウモリJ鎖ポリペプチド(配列番号45)を含む非ヒト動物種のJ鎖を含む任意の動物種のネイティブ配列のIgM抗体またはIgA抗体のJ鎖を指す。

0077

用語「修飾J鎖」は、ネイティブ配列に導入された外来性の結合部分を含むネイティブ配列J鎖ポリペプチドの変異体を指すのに本明細書で使用される。導入は、外来性の結合部分の直接的なまたは間接的な融合を含む任意の手段によって、または化学リンカーを介した連結によって達成することができる。用語「修飾されたヒトJ鎖」は、限定しないで具体的に、結合部分の導入によって修飾された配列番号1のアミノ酸配列のネイティブ配列ヒトJ鎖を包含する。その用語は限定しないで具体的に、IgMまたはIgAの効率的な重合(二量体化)及びそのようなポリマー(二量体)の標的への結合を妨害しない外来性の結合部分の導入によって修飾された配列番号1のアミノ酸配列のネイティブ配列ヒトJ鎖を包含する。

0078

用語「結合部分」は、本明細書では広義で使用されて、抗原のような標的への特異的な結合が可能である任意の化学的実体を包含する。結合部分の例には限定しないで、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体/薬剤の結合体、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質、リガンド、受容体、ウイルス様粒子、タンパク質毒素、酵素、及び代替足場が挙げられる。好まれる結合部分は、好ましくは生物機能を持つポリペプチド(ペプチドを含む)である。例となる生物機能は、たとえば、B細胞、T細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞のようなエフェクター細胞に結合し、活性化する結合部分の能力である。

0079

用語「ポリペプチド」は、本明細書では広義で使用され、ペプチド配列を含む。用語「ペプチド」は一般に、ペプチド結合によって共有結合した約60までの、好ましくは約30までのアミノ酸を含有するアミノ酸の線状分子鎖を記載する。

0080

「結合部分」を参照した用語「外来性の」は、同一位置での参照のネイティブポリペプチド配列には存在しない結合部分を指すのに本明細書で使用される。従って、外来性のポリペプチド配列(ペプチド配列を含む)は、対応するが、異なる位置で対応するネイティブ配列の範囲内に含まれる可能性がある。好まれる実施形態では、「外来性の」配列はどの位置でも対応するネイティブ配列には存在しない。

0081

用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、軽微な量で存在してもよい考えられる天然に存在する突然変異を除いて集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に向けられ、高度に特異的である。さらに、通常、様々な決定基(エピトープ)に対する様々な抗体を含む従来の(ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。修飾語モノクローナル」は抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の作出を必要とすると解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体はKohlerら.(1975),Nature,256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、または組換えDNA法(たとえば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)によって作製されてもよい。モノクローナル抗体は、たとえば、Clacksonら.(1991),Nature,352:624−628及びMarksら.(1991),J.Mol.Biol.222:581−597にて記載された技法を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。

0082

本明細書のモノクローナル抗体には具体的には、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び/または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一であるまたは相同である一方で、鎖の残りが別の種に由来する抗体における対応する配列と同一であるまたは相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、及びそのような抗体の断片が含まれる(米国特許第4,816,567号;及びMorrisonら.(1984),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855)。

0083

非ヒト(たとえば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する抗体である。ほとんどは、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)の超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び容量を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)の残基も対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体はレシピエント抗体及びドナー抗体で見いだされない残基を含んでもよい。これらの修飾を行って抗体の性能をさらに改良する。一般に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループの実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのそれらに相当し、FR領域の実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体は任意で、免疫グロブリンの定常領域(Fc)、通常ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細については、Jonesら.(1986),Nature,321:522−525;Riechmannら.(1988),Nature,332:323−329;及びPresta(1992),Curr.Op.Struct.Biol.2:593−596を参照のこと。

0084

本明細書の「単離された」抗体は、組換え宿主細胞におけるその自然環境の成分から特定され、分離され、及び/または回収されているものである。その自然環境の混入成分は、抗体についての診断上または治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質、と同様に製造の望ましくない副産物が含まれ得る。好まれる実施形態では、本明細書の単離された抗体は、(1)SDS−PAGE法若しくはSEC−HPLC法によって測定した際、95重量%を超えて、若しくは98重量%を超えて、若しくは99重量%を超えて精製され、(2)アミノ酸シークエンサーの使用によってN末端若しくは内部アミノ酸の少なくとも15残基を得るのに十分な程度に精製され、または(3)クマシーブルー染色、若しくは好ましくは銀染色を用いた還元性若しくは非還元性の条件下でのSDS−PAGEによる均質性まで精製されるであろう。普通、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程によって調製されるであろう。

0085

用語「特異的な結合」または「〜に特異的に結合する」または「〜に特異的な」は、特定のポリペプチド、ペプチドまたは他の標的(たとえば、糖タンパク質標的)上の結合標的に対する結合部分の結合、たとえば、標的抗原、たとえば、エピトープに対する抗体の結合を指し、非特異的な相互作用(たとえば、非特異的な相互作用はウシ血清アルブミンまたはカゼインに対する結合であってもよい)とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的な結合は、たとえば、対照分子に対する結合と比べて結合部分または抗体または結合部分の導入によって修飾された抗体の標的分子に対する結合を決定することによって測定することができる。たとえば、特異的な結合は、標的に類似する対照分子、たとえば、過剰な非標識の標的との競合によって決定することができる。この場合、標識された標的のプローブへの結合が過剰な非標識の標的によって競合的に阻害されれば特異的な結合が示される。特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープに対する用語「特異的な結合」または「〜に特異的に結合する」または「〜に特異的な」は本明細書で使用されるとき、たとえば、少なくとも約200nM、代わりに少なくとも約150nM、代わりに少なくとも約100nM、代わりに少なくとも約60nM、代わりに少なくとも約50nM、代わりに少なくとも約40nM、代わりに少なくとも約30nM、代わりに少なくとも約20nM、代わりに少なくとも約10nM、代わりに少なくとも約8nM、代わりに少なくとも約6nM、代わりに少なくとも約4nM、代わりに少なくとも約2nM、代わりに少なくとも約1nM以上の標的に対するKdを有する分子によって示すことができる。特定の例では、用語「特異的な結合」は、分子が他のどんなポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、特定のポリペプチド上の特定のポリペプチドまたはエピトープに結合する結合を指す。

0086

結合親和性」は、分子(たとえば、抗体)の単一の結合部位とその結合相手(たとえば、抗原)との間の非共有結合相互作用の総計の強さを指す。特に指示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対(たとえば、抗体と抗原)のメンバー間での1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Xのその相手Yに対する親和性は一般に解離定数(Kd)によって表すことができる。たとえば、Kdは約200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nMまたはさらに強力であることができる。親和性は本明細書で記載されるものを含む、当該技術で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性の抗体は一般にゆっくり抗原を結合し、解離し易い傾向があるのに対して、高親和性の抗体は一般に迅速に抗原を結合し、長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該技術で既知である。

0087

本明細書で使用されるとき、「Kd」または「Kd値」は、抗体と標的の対にとって適した技法によって、たとえば、表面プラスモン共鳴アッセイを用いて、たとえば、約10の反応単位(RU)で不動化した抗原CM5チップと共に25℃でBIAcore(商標)−2000またはBIAcore(商標)−3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)を用いて測定される解離定数を指す。

0088

用語「結合する」、「結合された」及び「結合」は共有結合または非共有結合の形態のいずれか及びすべてを指し、限定しないで直接的な遺伝子融合または化学融合、リンカーまたは架橋剤を介したカップリング、及び非共有結合性会合が含まれる。

0089

用語「融合」は、コーディングヌクレオチド配列インフレームでの組み合わせによる1つのポリペプチド鎖における異なる起源のアミノ酸配列の組み合わせを指すのに本明細書で使用される。用語「融合」は、その末端の一方への融合に加えて、ポリペプチド鎖の中での内部融合、すなわち、異なる起源の配列の挿入を明白に包含する。用語「融合」は異なる起源のアミノ酸配列の組み合わせを指すのに本明細書で使用される。

0090

用語「原子価の」は本明細書で使用されるとき、抗体における特定された数の結合部位の存在を示す。そのようなものとして、用語「2価」、「4価」及び「6価」はそれぞれ、2つの結合部位、4つの結合部位及び6つの結合部位の存在を示す。従って、本発明に係る二重特異性IgA抗体にて各結合単位が2価であるならば、二重特異性IgA抗体は4の価数を有するであろう。

0091

用語「エピトープ」には、抗体に対する特異的な結合が可能である分子決定基が含まれる。特定の実施形態では、エピトープ決定基には、たとえば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的に活性のある表面分類が挙げられ、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び/または特定の電荷特性を有してもよい。エピトープは抗体が結合する抗原の領域である。「結合領域」は結合分子が結合する結合標的上の領域である。

0092

ポリエピトープ特異性」は同一のまたは異なる標的上の2以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は1つだけのエピトープを結合する能力を指す。一実施形態によれば、二重特異性IgM抗体は少なくとも10−7Mまたは10−8Mのまたはさらに良好な親和性で各エピトープに結合する。

0093

用語「標的」または「結合標的」は広義で使用され、具体的にはそれらが自然界で存在するような生物機能を伴ったまたは伴わないポリペプチド、限定しないで核酸、糖質、脂質、細胞及び他の分子が含まれる。

0094

用語「抗原」は、抗体に結合することができる、または細胞性の免疫応答を引き起こすことができる実体またはその断片を指す。免疫原は、生物で、特に動物で、さらに特にヒトを含む哺乳類で免疫応答を引き起こすことができる抗原を指す。用語、抗原には上記で定義されたような抗原決定基またはエピトープとして知られる領域が含まれる。

0095

本明細書で使用されるとき、用語「免疫原性の」は、抗体の産生を引き出す、及び/またはT細胞及び/または免疫原の抗原に向けられた他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。

0096

本発明の抗体の「抗原結合部位」または「抗原結合領域」は通常、抗原に対する結合部位の親和性に種々の程度で寄与する6つの相補性決定領域(CDR)を含有する。3つの重鎖可変ドメインのCDR(CDRH1、CDRH2及びCDRH3)及び3つの軽鎖可変ドメインのCDR(CDRL1、CDRL2及びCDRL3)がある。CDR及びフレームワーク領域(FR)の範囲は、抗体/抗原複合体からの配列及び/または構造の情報の間での変動性に従ってそれらの領域が定義されているアミノ酸配列の編集されたデータベースへの比較によって決定される。本発明の範囲の中に含められるのはまた、わずかなCDRで構成される機能的な抗原結合部位である(すなわち、結合特異性が3、4または5のCDRによって決定される)。6つのCDRの完全なセットに満たないものが一部の結合標的への結合に十分であってもよい。従って、一部の例では、VHまたはVLだけのCDRで十分であろう。さらに特定の抗体は抗原に対してCDRに関連しない結合部位を有してもよい。そのような結合部位は本発明の範囲内に具体的に含められる。

0097

用語「宿主細胞」は本出願で使用されるとき、本発明に係る抗体を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を示す。一実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が宿主細胞として使用される。

0098

本明細書で使用されるとき、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は相互交換可能に使用され、そのような表現のすべてには子孫が含まれる。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」には、移行の数にはこだわらずに一次対象細胞及びそれらに由来する培養物が含まれる。故意のまたは故意ではない突然変異のために子孫すべてがDNA内容で正確に同一であるわけではないことも理解される。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫は包含される。

0099

別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、核酸は「操作可能に連結される」。たとえば、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、プレ配列または分泌リーダーのDNAがポリペプチドのDNAに操作可能に連結され;それが配列の転写に影響を与えるのであれば、プロモータまたはエンハンサコーディング配列に操作可能に連結され;それが翻訳を促進するように位置づけられるのであれば、リボソーム結合部位がコーディング配列に操作可能に連結される。一般に、「操作可能に連結される」は、連結されるDNA配列が隣接し、分泌リーダーの場合、隣接して読み取りフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは隣接しなくてもよい。連結は利便性のある制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しないならば、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。

0100

詳細な説明
修飾J鎖を持つ抗体の設計及び作出
IgMは、抗原による刺激に応答してB細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、5日間の半減期で血清中にて1.5mg/mL前後で存在する。IgMは五量体または六量体の分子である。IgGと全く同じように、IgMの単量体は2つの軽鎖と2つの重鎖から成る。しかしながら、IgGが3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)を含有する一方で、IgMの重(μ)鎖は、IgEのε重鎖に類似してさらに第4の定常ドメイン(CH4)を含有する。この追加の定常ドメインは、IgG及びIgA抗体のFcドメインに比べて抗原結合Fabドメインの回転自由度に関与するIgG及びIgAのプロリン豊富なヒンジ領域の代わりに位置する。

0101

5つのIgM単量体は追加の小さなポリペプチド鎖(J鎖)と複合体を形成し、ネイティブIgM分子を形成する。J鎖は、IgMが抗体産生細胞から分泌される前にμ鎖の重合を促進すると見なされている。IgMの結晶化は悪評の高い難題であることが判明している一方で、Czajkowsky及びShao(PNAS,106(35):14960−14965,2009)は最近、IgEのFcドメインの構造と既知のジスルフィド対合に基づいてIgMの相同性に基づく構造モデル公開した。著者らは、ヒトIgM五量体は曲げバイアスを伴ったキノコ形状の分子であることを報告している。IgM重(μ)鎖は5つのN結合グリコシル化部位:Asn−171、Asn−332、Asn−395、Asn−402及びAsn−563を含有する。

0102

ほとんどの哺乳類の粘膜からの分泌物に存在する主要なクラスの抗体としての免疫グロブリンA(IgA)は吸入された及び摂取された病原体による侵襲に対する防御の重要な最前線を表す。IgAは多数の種の血清でも有意な濃度で見いだされ、それは、粘膜表面破壊している病原体の除去に介在する副次的な防御手段として機能する。IgAのFc領域に特異的な受容体であるFcαRはIgAのエフェクター機能の重要なメディエータである。ヒトIgAは、2つのサブクラスIgA1及びIgA2を生じる2つの異なるIgA重鎖定常領域(Cα)の遺伝子を有してもよい。IgA1とIgA2との間での主な差異は、2つのFabアームとFc領域との間にあるヒンジ領域に存在する。IgA1は、IgA2には存在しないアミノ酸の重複ストレッチの挿入のために伸びたヒンジ領域を有する。IgAは二量体を形成する容量を有し、それぞれ2つの重鎖と軽鎖を含む2つの単量体単位は、ジスルフィド架橋とJ鎖の組み込みとによって安定化される端から端までの構成で配置されると仮定されている。粘膜部位局所的に産生される二量体IgAは上皮細胞境界を越えて、高分子免疫グロブリン受容体(pIgR)との相互作用によって分泌物に輸送される。この過程の間に、pIgRは切断され、分泌成分(SC)と呼ばれる主要な断片はIgA二量体と共有結合するようになる。

0103

IgA及びIgMは双方とも、C末端で「尾部」(tp)と呼ばれる18アミノ酸の伸長を持つ。IgMの尾部(μtp)及びIgAの尾部(αtp)は7つのアミノ酸位置で異なる。IgM及びIgAの尾部は種々の動物種の間で高度に保存されている。IgA及びIgMの尾部における保存された最後から2番目のシステイン残基は重合に関与することが実証されている。双方の尾部はN結合の糖質付加部位を含有し、その存在は、IgAにおける二量体形成及びJ鎖の組み込み及びIgMにおける五量体形成に必要とされる。しかしながら、尾部におけるN結合糖質の構造及び組成が異なるということは、グリコシルトランスフェラーゼによるプロセッシングへのグリカンのアクセスのしやすさにおける差異を示唆している。

0104

ヒト、及び種々の脊椎動物種、たとえば、ウシ、マウス、鳥類両生類、及びウサギのJ鎖のヌクレオチド配列及び/またはタンパク質配列が報告されている。ヒトJ鎖は8つのシステイン残基を含有し、2つ(Cys13及びCys69)はα鎖またはμ鎖(それぞれIgA及びIgM)とのジスルフィド架橋に関与し、6つは鎖内ジスルフィド架橋に関与する(Cys13:Cys101、Cys72:Cys92、Cys109:Cys134)。J鎖の三次元結晶構造は報告されていない。

0105

本発明は、IgM抗体またはIgA抗体の結合標的に結合する能力を妨害することなく、結合特異性(結合部分)を導入することによってIgM抗体及びIgA抗体のJ鎖を修飾することができるという認識に少なくともある程度基づく。従って、本発明は、ネイティブ配列のJ鎖、たとえば、配列番号1のネイティブ配列のヒトJ鎖に導入された結合部分を含む修飾J鎖に関する。本発明はさらに修飾J鎖を含む結合分子に関する。結合分子は、たとえば、IgM抗体、IgA抗体またはIgG/IgM若しくはIgG/IgAのハイブリッド抗体であることができ、それは、IgGの重鎖にてIgMまたはIgAの尾部を含有するので、本発明の修飾J鎖を組み込み、それとのポリマーを形成する能力を含む、IgGとIgAまたはIgAの特性を組み合わせてもよい。IgG/IgM及びIgG/IgAのハイブリッド抗体のさらなる詳細については、Koteswaraら,Clinical Immunology,2001,101(1):21−31を参照のこと。

0106

修飾J鎖は、結合標的または酵素様のプロテイナーゼのような触媒成分に特異的に結合することができるポリペプチド(ペプチドを含む)を含むが、これらに限定されない外来性の結合部分を含む。以前議論したように、結合部分には、限定しないで、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体/薬剤の結合体、抗体/薬剤の結合体の抗原結合断片、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質、リガンド、受容体、ウイルス様粒子、タンパク質毒素、酵素のような触媒成分、及び酵素様のプロテイナーゼ及び代替足場が挙げられる。付加の位置、種類(たとえば、直接的な融合または間接的な融合、化学的な連結等)を適当に選択することによって、本開示の教示に従って、任意の種類の結合部分をJ鎖に導入することができることが強調される。

0107

好まれる実施形態では、結合部分は、単一特異性の、二重特異性の及び多重特異性の抗体及び抗体断片を含む抗体または抗体の抗原結合断片(「抗体断片」とも呼ばれる)である。用語「抗体断片」は広義で使用され、それには、限定しないで、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、及び(scFv)2断片、相補性決定領域(CDR)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。好まれる実施形態では、抗体断片はscFvである。

0108

別の好まれる実施形態では、結合部分は、たとえば、ヒトドメイン抗体(dAb)、二重親和性再標的化(DART)分子、二重特異性抗体、四価二重特異性抗体、二重可ドメイン抗体積み上げ可変ドメイン抗体、小モジュラー免疫医薬SMIP)、サロボディ鎖交換操作ドメイン(SEED)−ボディ、またはTandAbのような抗体様分子である。

0109

結合部分は、たとえば、神経栄養因子インターロイキン、可溶性分子因子または増殖因子のようなリガンドであってもよい。

0110

結合分子としての受容体には、イオンチャンネル結合型Gタンパク質結合型、及び酵素結合型の細胞表面受容体が挙げられる。具体例には、限定しないでErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、TNFR、PDL1、及びCTLA−4が挙げられる。

0111

さらに好まれる実施形態では、結合部分は代替足場である。この文脈では、用語「足場」は、特定の標的を結合する能力をタンパク質変異体に付与する変化したアミノ酸または配列の挿入を保有することができるタンパク質フレームワークを記載することにする。タンパク質の代替足場には、限定しないで、CTLA−4、テンダミスタット、フィブロネクチンネオカルチノスタチンリポカリン、T−細胞受容体、CBM4−2、プロテインAドメイン、lm9、設計されたARタンパク質、設計されたTPRタンパク質、亜鉛フィンガー、pVIII、鳥類膵臓ポリペプチドGCN4、WWドメイン、SRC相同性ドメイン2及び3、PDZドメインTEM−1、β−ラクタマーゼ、GFPチオレドキシンブドウ球菌ヌクレアーゼ、PHD−フィンガー、cl−2、BPTI、APPI、HPSTI、エコチン、LACI−D1、LDTI、MTI−II、サソリ毒素、ノッティン、昆虫デフェンシンAペプチド、EETI−II、Min−23、CBD、PBP、チトクロームb562、LDL受容体ドメインA、γ−クリスタリンユビキチントランスフェリン、C−型レクチン様ドメインが挙げられる。好まれる代替足場はダルピン、フィブロネクチンドメイン及びアドネクチンである。さらなる詳細については、Binz,HKら,2005,Nature Biotechnologies,23(10):1257−1268を参照のこと。

0112

レシピエントIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA分子のその結合標的(単数)または結合標的(複数)への結合を妨害することなく、結合部分のその結合標的への結合を可能にする位置にて結合部分をネイティブJ鎖配列に導入してもよい。好まれる位置には、J鎖の三次元構造に基づいてアクセス可能であるC末端またはその近傍、N末端またはその近傍、または内部位置が挙げられる。好まれる実施形態では、結合部分は、C末端から約10残基外でまたはN末端から約10残基外でネイティブ配列のJ鎖に導入され、ネイティブ配列のJ鎖は好ましくは配列番号1のヒトJ鎖である。別の実施形態では、結合部分は、配列番号1のシステイン残基92と101の間で配列番号1のネイティブ配列のヒトJ鎖に、または別のネイティブ配列のJ鎖の同等の位置で導入される。さらなる実施形態では、結合部分は、グリコシル化部位でまたはその近傍で配列番号1のJ鎖のようなネイティブ配列のJ鎖に導入される。最も好ましくは、結合部分は、C末端から約10アミノ酸残基以内で配列番号1のネイティブ配列のヒトJ鎖に導入される。

0113

導入は、直接的なまたは間接的な融合によって、すなわち、ペプチドリンカーを伴ったまたは伴わない、そのコーディングヌクレオチド配列のインフレーム結合による1つのポリペプチド鎖におけるJ鎖と結合部分のアミノ酸配列の組み合わせによって達成することができる。ペプチドリンカー(間接的な融合)は使用するならば、たとえば、約1〜50、または約1〜40、または約1〜30、または約1〜20、または約1〜10、または約10〜20のアミノ酸残基であってもよく、J鎖配列に導入される結合部分の一方の末端または双方の末端に存在してもよい。好まれる実施形態では、ペプチドリンカーは約10〜20または10〜15のアミノ酸の長さである。別の好まれる実施形態では、ペプチドリンカーは約15のアミノ酸の長さである。

0114

結合部分はまた、それら自体の反応性及び選択性を有する2つの異なる官能基を含有するヘテロ二官能性タンパク質架橋剤を用いて化学結合によってネイティブJ鎖配列に付加されてもよい。これらの架橋剤は一工程法で使用することができ、またはそれを使用して活性化されたタンパク質を創り出すことができ、それが保存され、別の工程で第2の生体分子と反応できることが多い。従って、たとえば、ヘテロ二官能性の架橋試薬を用いてJ鎖と結合部分との結合体を形成することができる。反応基には、限定しないで、イミン反応基(たとえば、NHSまたはスルホ−NHS)、マレイミド基等が挙げられる。切断可能または切断不可能であり得るそのような架橋剤は、たとえば、ハプテンキャリアタンパク質の形成及び酵素/抗体の結合体の調製で使用されている。化学的に、切断可能な架橋剤には、限定しないで、具体的にジスルフィド系リンカー、ヒドラゾン及びペプチドリンカーが挙げられる。周知の及びよく研究された酵素に不安定なリンカーはバリン/シトルリンリンカーであるが、他のペプチドリンカーも既知であり、好適である。切断できないリンカーの典型的な代表には、たとえば、SMCC(N−スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート)のようなチオエーテルが挙げられる。さらなる詳細については、たとえば、その開示全体が明白に参照によって本明細書に組み入れられるDucry,L及びStump,B,Bioconjugate Chem.2010,21:5−13を参照のこと。さらなる好適なリンカーのリストについては、たとえば、その開示全体が明白に参照によって本明細書に組み入れられるKleinら,Protein Engineering,Design & Selection;2014,27(10):325−330を参照のこと。

0115

修飾J鎖が普通、1つの外来性結合部分を含有する一方で、1を超える結合部分をJ鎖に導入することも可能である。

0116

修飾J鎖は、組換えDNA技術の周知の技法によって、たとえば、CHO細胞または大腸菌のような好適な原核または真核宿主生物にて修飾J鎖をコードする核酸を発現させることによって作出されてもよい。従って、修飾J鎖は、たとえば、Symerskyら,Mol.Immunol.2000,37:133−140によって記載されたように大腸菌で発現されてもよい。

0117

一実施形態では、J鎖は先ず酵素認識部位の挿入によって修飾され、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーによって翻訳後修飾されることができ、リンカーが、たとえば、細胞傷害性小分子のような外来性結合部分をJ鎖に繋ぎ、抗体/薬剤結合体(ADC)を作製することができる。

0118

修飾J鎖は、レシピエントIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体の重鎖及び軽鎖と同時発現させることもできる。その複雑な構造の故に、組換えIgMの大規模な製造は困難であるけれども、C6グリア細胞、CHO細胞及びHeLa細胞におけるIgMの重鎖(H)及び軽鎖(L)の同時発現を含む、非リンパ系細胞を用いたIgMのための幾つかの組換え産生系が報告されている(たとえば、CHO細胞における発現についてはW089/01975及びWoodら,J.Immunol.145,3011−3016(1990)を参照のこと)。J鎖を伴ったまたは伴わない、大腸菌におけるIgMモノクローナル抗体の発現は、たとえば、Azumaら,Clin.Cancer Res.2007,13(9):2745−2750にて記載されている。アデノウイルスのE1A及びE1Bのタンパク質を発現している不死化ヒト網膜細胞株におけるIgMの産生は、米国特許出願公開番号20060063234にて記載されている。

0119

レシピエント抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってもよい。抗体を含む二重特異性及び多重特異性のIgM及びIgA結合分子は、たとえば、その内容全体が明白に参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号61/874,277号及び61/937,984号にて記載されている。

0120

修飾J鎖を持つ抗体の適用
本発明の修飾J鎖を含む抗体は幅広い治療応用及び診断応用を有する。

0121

一実施形態では、修飾J鎖を含む抗体は、同一可溶性標的、たとえば、VEGF、TNFαまたはIL6における2以上の部位に結合する。目的は、たとえば、タンパク質上の複数の部位に拮抗すること及び/または所与の標的への結合活性を高めることであってもよい。

0122

別の実施形態では、本明細書の修飾J鎖を含む抗体は、たとえば、EGFRまたはHER2(ErbB2)のような同一細胞表面(受容体)標的上の2以上の部位を結合する。従って、たとえば、そのような抗体はHER2分子上で4D5及び2C4双方のエピトープを標的としてもよい。このアプローチは所与の標的への生体効果及び/または結合活性を高めてもよい。

0123

さらに別の実施形態では、本発明の修飾J鎖を含む抗体は、2以上の異なる可溶性標的(球状のタンパク質またはペプチド)、たとえば、TNFαとIL6、VEGFαとAng2または2つのサイトカインを結合する。このアプローチは、たとえば、特定の経路をさらに完全に遮断すること;いわゆる「サイトカインストーム」、すなわち、CD3抗原に対する二重特異性抗体のような特定の多価の二重特異性抗体から生じる望ましくないT細胞の活性化の遮断を生じ、または、酵素とその基質、たとえば、第IXa因子と第X因子調和させ得る。具体例には、限定しないで、修飾J鎖を伴った二重特異性抗体が挙げられ、その際、第1の特異性はVEGFに向けられ、第2の特異性はAng2若しくはDLL4(抗血管形成)に向けられ、または第1の特異性はTNFに向けられ、第2の特異性はAng2若しくはIL−17(抗炎症特性)に向けられ、いずれかの特異性が、IgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体またはその抗原結合断片のJ鎖に導入されてもよい。

0124

さらなる実施形態では、修飾J鎖を含む抗体は、1以上の可溶性標的と1以上の細胞表面の受容体標的、たとえば、血管形成因子及び新血管特異的受容体とを結合してもよい。このアプローチの目的は特定の部位または組織での送達の増加及び遮断であってもよい。

0125

もっとさらなる実施形態では、修飾J鎖を含む抗体は、たとえば、HER1、HER2(ErbB2)及びHER3(ErbB3)のような2以上の異なる細胞表面の受容体標的を結合し、同一のまたは異なる経路を介して複数の標的を阻害するように設計される。これによって、特異性及び選択性の上昇及び/または所与の経路のさらに完全な遮断を生じてもよい。そのような抗体の具体例には、限定しないで修飾J鎖を伴った二重特異性抗体が挙げられ、その際、一方の特異性はHER2に向けられ、別の特異性はHER3向けられ;または一方の特異性はEGFR(HER1)に向けられ、別の特異性はHER2に向けられる。修飾J鎖を伴った他の二重特異性のIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は、たとえば、EGFRとHER3、IL−1αとIL−1β、IL−4とIL−13、Ang−2とVEGF−A、第IXA因子と第X因子、またはIL−17AとIL−17Fに結合してもよい。

0126

本発明の修飾J鎖を含む抗体はまた、1以上の可溶性標的または細胞表面受容体標的と1以上の長滞留時間標的とを、たとえば、TNFα及び/またはVEGFと血清アルブミンとを結合するようにも設計されてもよい。これらの分子は、アルブミン特異性を持たない結合分子よりも長い循環半減期を有することが期待される。

0127

さらなる実施形態では、本明細書の修飾J鎖を含む抗体は、1以上の可溶性標的と1以上のマトリックスタンパク質及び/または基質、たとえば、VEGFαとヒアルロン酸とを結合してもよい。得られる多重特異性の結合分子は、眼内空間におけるその長い滞留時間の故に、たとえば、加齢黄斑変性症(AMD)のような眼の状態の抗血管形成療法で有用性が見いだされてもよい。

0128

修飾J鎖を含み、且つ1以上の可溶性標的または受容体標的に加えて1以上の輸送体受容体(すなわち、トランスフェリン受容体)を結合する抗体、たとえば、抗トランスフェリン特異性と組み合わせた膠芽細胞腫で見られる抗EGFRvIII(エクソンIIIの欠失を伴った変異体形態)は、脳血管関門を横切る抗体の送達で有用性を見いだすことができる。

0129

好まれる実施形態では、本明細書のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は、免疫細胞、たとえば、T細胞、NK細胞、マクロファージまたは好中球に対して結合特異性を持つ修飾J鎖を含み、病んだ細胞または病原体上で発現される抗原に結合する。IgM分子は5つの結合単位を含み、IgA分子は2つの結合単位を含む二量体なので、そのような分子はその大きな結合活性の故に二重特異性のIgG抗体よりも有意に強力である。加えて、エフェクター細胞、たとえば、エフェクターT細胞を活性化し、標的とされる病んだ細胞、組織または病原体に向け直すことによって、本明細書のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は標的に対する免疫応答を誘導し、それによって効能及び有効性をさらに高める。これらの有益な特性の故に、修飾J鎖を含む本明細書のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体はIgG抗体が低い親和性でその標的に結合する状況で特に有利である。従って、一実施形態では、本明細書のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は治療用IgG抗体の結合ドメインを含んでもよい。

0130

特定の実施形態では、修飾J鎖を含む本明細書のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は癌の治療に使用されてもよい。どんな種類の腫瘍及びどんな種類の腫瘍関連抗原も標的とされてもよいことが十分に理解される。癌の例となる種類には、限定しないで、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆嚢癌乳癌子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌子宮内膜癌食道癌胃癌頭頚部の癌、ホジキンリンパ腫、肺癌甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫腎癌卵巣癌膵臓癌神経膠腫黒色腫肝臓癌前立腺癌、及び膀胱癌が挙げられる。しかしながら、技量の有る熟練者は、実際上どんな種類の癌についても腫瘍関連抗原が当該技術で既知であることに気付くであろう。

0131

本発明のIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体によって標的とされてもよい腫瘍関連抗原には、限定しないで、α−フェトタンパク質(AFP)、関連抗原、Ba733、BAGE、BrE3−抗原、CA125、CAMEL、CAP−1、炭酸脱水酵素IX、CASP−8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a−e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK−4/m、CDKN2A、CTLA−4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF−1a、結腸特異抗原−p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c−Met、DAM、EGFR(HER1、ErbB1)、ErbB2(HER2)、ErbB4(HER3)、EGFRvIII、EGP−1(TROP−2)、EGP−2、ELF2−M、Ep−CAM、線維芽細胞増殖因子(FGF)、Flt−1、Flt−3、葉酸受容体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO−β、HLA−DR、HM1.24、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンHCG)及びそのサブユニット、HER2/neu、HMGB−1、低酸素症誘導性因子(HIF−1)、HSP70−2M、HST−2、Ia、IGF−1R、IFN−γIFN−α、IFN−β、IFN−λ、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R、IL−17R、IL−18R、IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−23、IL−25、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、KC4−抗原、KS−1−抗原、KS1−4、Le−Y、LDR/FUT、マクロファージ移動阻害因子MIF)、MAGE、MAGE−3、MART−1、MART−2、NY−ESO−1、TRAG−3、mCRPMCP−1、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM−1/2、MUM−3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM4抗原、膵臓癌ムチン、PD−1受容体、胎盤増殖因子、p53、PLAGL2、前立腺酸性ホスファターゼ、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF−1R、IL−6、IL−25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、サバイビン、サバイビン−2B、TAC、TAG−72、テネイシン、TRAIL受容体、TNF−α、Tn抗原、Thomson−Friedenreich抗原、腫瘍壊死抗原、VEGFR、ED−Bフィブロネクチン、WT−1、17−1A−抗原、補体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管形成マーカー、bcl−2、bcl−6、Krasが挙げられる。

0132

上記で議論したように、腫瘍学の応用については、修飾J鎖を含む抗体は、標的とされた癌細胞に対する免疫細胞の殺傷機能をもたらすように設計することができる。従って、たとえば、IgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体またはその抗原結合断片のJ鎖は、T細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞のような免疫細胞に対する結合特異性をネイティブJ鎖に導入することによって修飾することができる一方で、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は、標的細胞、たとえば、上記でリストにした腫瘍関連抗原のいずれかまたはそれ以上を含む、腫瘍細胞の表面上の腫瘍マーカー、たとえば、腫瘍遺伝子に対する結合特異性を提供する。

0133

T細胞の場合、分化抗原群3(CD3)は、T3複合体として歴史的に知られる多量体タンパク質複合体であり、3対の二量体(εγ、εδ、ζζ)として集合し、機能する4つの異なるポリペプチド鎖(ε、γ、δ、ζ)で構成される。CD3複合体はT細胞受容体(TCR)と非共有結合で会合するT細胞共受容体として役立つ。このCD3複合体、特にCD3εの成分は腫瘍関連抗原を特異的に結合するIgM抗体の修飾J鎖にとっての標的である。エフェクターT細胞に特異的な修飾J鎖は好ましくはCD3(CD3ε)抗原に結合するけれども、エフェクターT細胞上で発現される他の抗原が知られており、修飾J鎖によって標的とされてもよい。例となるT細胞抗原には、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69及びCD90が挙げられるが、これらに限定されない。

0134

CD3結合特異性を持つ修飾J鎖を含む例となるIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体には、腫瘍関連抗原に対する既知のIgG抗体の結合領域、たとえば、その開示が明白に参照によって本明細書に組み入れられるブリナツモマブ(MT103としても知られる)(抗−CD19)、CD19hA19(抗−CD19,米国特許第7,109,304号)、hPAM4(抗−ムチン,米国特許第7,282,567号)、hA20(抗−CD20,米国特許第7,251,164号)、hIMMU31(抗−AFP,米国特許第7,300,655号)、hLL1(抗−CD74,米国特許第7,312,318号)、hLL2(抗−CD22,米国特許第7,074,403号)、hMu−9(抗−CSAp,米国特許第7,387,773号)、hL243(抗−HLA−DR,米国特許第7,612,180号)、hMN−14(抗−CEACAM5,米国特許第6,676,924号)、hMN−15(抗−CEACAM6,米国特許第7,541,440号)、hRS7(抗−EGP−1,米国特許第7,238,785号)、hMN−3(抗−CEACAM6,米国特許第7,541,440号)、Ab124及びAb125(抗−CXCR4,米国特許第7,138,496号)が挙げられてもよい。

0135

特定の実施形態では、ブリナツモマブのCD19結合領域を含むIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は、ブリナツモマブのCD3結合領域を含む修飾J鎖を含む。この抗体は、たとえば、非ホジキンリンパ腫、またはB細胞シリーズの急性リンパ芽球性白血病(B−ALL)の治療に使用することができる。

0136

別の特定の実施形態では、リツキシマブのCD20結合領域を含むIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は、ブリナツモマブのCD3結合領域を含む修飾J鎖のようなCD3特異性を持つ修飾J鎖を含む。

0137

さらに別の特定の実施形態では、MT110のEpCAM結合領域を含むIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は、MT110のCD3結合領域を含む修飾J鎖のようなCD3特異性を持つ修飾J鎖を含む。そのような二重特異性抗体は消化器癌の治療に使用することができる。

0138

CD3結合特異性を持つ修飾J鎖との併用で使用するために結合領域を提供することができる代替抗体には、たとえば、アブシキマブ(抗−糖タンパク質IIb/IIIa)、アレムツズマブ(抗−CD52)、ベバシズマブ(抗−VEGF)、セツキシマブ(抗−EGFR)、ゲムツズマブ(抗−CD33)、イブリツモマブ(抗−CD20)、パニツムマブ(抗−EGFR)、トシツモマブ(抗−CD20)、トラスツズマブ(抗−ErbB2)、ラムブロリズマブ(抗−PD−1受容体)、ニボルマブ(抗−PD−1受容体)、イピリムマブ(抗−CTLA−4)、アバゴボマブ(抗−CA−125)、アデカツムマブ(抗−EpCAM)、アトリズマブ(抗−IL−6受容体)、ベンラリズマブ(抗−CD125)、オビヌツズマブ(GA101、抗−CD20)、CC49(抗−TAG−72)、AB−PG1−XG1−026(抗−PSMA、米国特許出願番号11/983,372、ATCCPTA−4405及びPTA−4406として寄託された)、D2/B(抗−PSMA、WO2009/130575)、トシリズマブ(抗−IL−6受容体)、バシリキシマブ(抗−CD25)、ダクリズマブ(抗−CD25)、エファリズマブ(抗−CD11a)、GA101(抗−CD20;Glycart Roche)、アタリズマブ(抗−α4インテグリン)、オマリズマブ(抗−IgE);CDP571(Ofeiら、2011、Diabetes,45:881−85)のような抗−TNF−α抗体、MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B、M303(Thermo Scientific、Rockford、Ill.)、インフリキシマブ(Centocor、Malvern、Pa.)、セルトリズマブペゴール(UCB、Brussels、Belgium)、抗−CD40L(UCB、Brussels、Belgium)、アダリムマブ(Abbott、Abbott Park、Ill.)、BENLYSTA(登録商標)(Human Genome Sciences);Alz50(Ksiezak−Redingら、1987、J.Biol.Chem.263:7943−47)のようなアルツハイマー病の治療のための抗体、ガンネルマブ、ソラネズマブ及びインフリキシマブ;59D8、T2G1s、MH1のような抗−フィブリン抗体;MOR03087(MorphoSys AG)、MOR202(Celgene)、HuMax−CD38(ゲンマブ)またはダラツムマブ(Johnson & Johnson)のような抗−CD38抗体;P4/D10(米国特許第8,333,971号)、Ab75、Ab76、Ab77(Paulikら、1999、Biochem.Pharmacol.58:1781−90)のような抗−HIV抗体、と同様に米国特許第5,831,034号、米国特許第5,911,989号、及びVcelarら、AIDS,2007;21(16):2161−2170及びJoosら、Antimicrob.Agents Chemother.2006;50(5):1773−9にて記載された抗−HIV抗体が挙げられる。

0139

図19は、血液癌、上皮腫瘍及びグリコシルが豊富な腫瘍の治療のための例となる標的抗原及び修飾J鎖による標的化のためのT細胞、NK細胞、マクロファージ及び好中球上の例となる抗原を載せている。載せられた腫瘍抗原のいずれかに結合するIgM分子を載せられた結合特異性のいずれかを持つ修飾J鎖と組み合わせることができることが理解されるべきである。従って、表の左欄に載せられた抗体標的を右欄に載せられた修飾J鎖の標的と組み合わせることができる。

0140

好まれる実施形態では、IgM五量体は、B細胞のような標的細胞に対する結合特異性を提供する一方で、エフェクター細胞、たとえば、T細胞に対する結合ドメインはIgM抗体のJ鎖に共有結合することができる。従って、J鎖はCD3(CD3ε)の結合ドメインの共有結合によって修飾することができる。この構成では、IgM五量体(10コピーの重鎖と10コピーの軽鎖を含む)は標的B細胞への結合特異性を提供する一方で、J鎖のT細胞連結は細胞傷害能を送達する。言い換えれば、腫瘍標的に結合するIgM抗体はT細胞の結合機能をさらに獲得する。ネイティブJ鎖またはネイティブJ鎖の変異体に共有結合したCD3結合ドメインは、たとえば、抗CD3抗体の単鎖Fv(scFv)、または天然に存在する重鎖のみの抗体、たとえば、ラクダ科動物(ラクダ、ラマアルパカ)の抗体、または軟骨魚類サメエイ)の単鎖抗体、足場、たとえば、CD3結合特異性を持つフィブロネクチン(たとえば、フィブロネクチンIII)であり得る。特定の好まれる実施形態が本明細書で具体的に引用される一方で、腫瘍抗原のような標的に対する結合特異性を持ち、T細胞マーカーに結合する修飾J鎖を含むIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体が熟考され、それらは本発明の範囲の範囲内にある。

0141

一実施形態では、多重特異性のIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は上記でリストにされた腫瘍抗原の1以上に結合する一方で、J鎖はCD3εに結合するように修飾される。好まれる実施形態では、多重特異性のIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は図19にてリストにされた腫瘍抗原の1以上に結合する一方で、J鎖はCD3εに結合するように修飾される。

0142

ナチュラルキラー(NK)細胞は自然免疫の重要な成分であり、サイトカインを放出し、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する細胞溶解活性に介在する能力によって宿主防御で重要な役割を担う。NK細胞抗原には、限定しないで、CD16、CD32a、CD56、CD57、CD64、CD117(またはc−キット)、リンパ球関連分子−2(LFA−2またはCD2)、LFA−3(CD58)、及びLFA−1(CD11a/CD18)を含む接着分子が挙げられる。

0143

NK細胞が関与する、修飾J鎖を持つ二重特異性抗体の例には、NK細胞に結合する修飾J鎖を含む、上記でリストにされた腫瘍抗原のいずれかに対して結合特異性を持つIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体が挙げられる。特定の実施形態では、HER2結合特異性を持つ二重特異性のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は、CD16、CD32a、CD56、またはCD64を結合するように修飾されたJ鎖を含む。別の好まれる実施形態では、多重特異性のIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は、図19の表の左欄に載せられた腫瘍標的のいずれかに結合し、J鎖はNK細胞上のCD16、CD64またはNKG2Dを結合するように修飾される。

0144

たとえば、CD14特異性をJ鎖に導入することによって、本発明のJ鎖で修飾された抗体におけるマクロファージの関与が提供され得る。

0145

一実施形態では、多重特異性のIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は、上記でリストにした腫瘍標的の1以上に結合する一方で、J鎖はCD14に結合するように修飾される。好まれる実施形態では、多重特異性のIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体は、図19にてリストにした腫瘍標的の1以上に結合する一方で、J鎖はCD14に結合するように修飾される。

0146

修飾J鎖を伴ったIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は、糖質系抗原を標的とすることができる。たとえば、Cazetら,Breast Cancer Research;2010,12:204による概説論文を参照のこと。糖質系の腫瘍抗原は、理に適った特異性を持つが、必ずしも高い親和性ではないそのような抗原に結合するIgG抗体の作出を可能にするグリコシル化の代替型と共に確実な腫瘍との関連を有することが示されている。このクラスの抗原に対して関連する高い結合活性を持つIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体を使用することは、特にJ鎖の修飾によって達成されたエフェクター細胞の移動と併せた新規の治療用抗体についての大きな機会を表す。好まれる一実施形態では、IgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は1以上の糖質系腫瘍抗原に結合する一方で、J鎖は図19にてリストにしたエフェクター細胞のいずれかを結合するように修飾される。

0147

別の好まれる実施形態では、修飾J鎖を伴ったIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は、病原体に向けられたIgM、IgA、IgG/IgMまたはIgG/IgA抗体の一部として使用することができる。好まれる実施形態では、病原体は、HIVウイルスヒト型結核菌、Streptococcus agalactiae、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、Legionella pneumophilia、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌髄膜炎菌肺炎球菌、Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、インフルエンザ菌B、梅毒トレポネーマライム病スピロヘータ緑膿菌らい菌、Brucella abortus、狂犬病ウイルスインフルエンザウイルスサイトメガロウイルス単純性ヘルペスウイルスI、単純性ヘルペスウイルスII、ヒト血清パル様ウイルス呼吸器合胞体ウイルス水痘帯状疱疹ウイルスB型肝炎ウイルスC型肝炎ウイルス麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトT−細胞白血病ウイルス、エプステイン−バーウイルスマウス白血病ウイルスおたふく風邪ウイルス、水疱性口炎ウイルスシンドビスウイルスリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスイボウイルス、ブルータングウイルスセンダイウイルスネコ白血病ウイルスレオウイルスポリオウイルスサルウイルス40、マウス乳癌ウイルスデングウイルス風疹ウイルス西ナイルウイルスマラリア原虫、Plasmodium vivax、Toxoplasma gondii、Trypanosoma rangeli、Trypanosoma cruzi、Trypanosoma rhodesiensei、Trypanosoma brucei、Schistosoma mansoni、Schistosoma japonicum、Babesia bovis、Elmeria tenella、Onchocerca volvulus、Leishmania tropica、Trichinella spiralis、Theileria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、Taenia saginata、Echinococcus granulosus、Mesocestoides corti、関節炎マイコプラズマ、M.hyorhinis、M.orale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M.salivarium及び米国特許第6,440,416号にて開示されたような肺炎マイコプラズマから成る群から選択される。

0148

この実施形態では、免疫エフェクター細胞は、たとえば、好中球であってもよい。

0149

図19は、修飾J鎖によって標的化され得る好中球マーカーと組み合わせて、本明細書のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体についての標的としてのウイルス抗原を具体的に載せている。

0150

本明細書のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は、糖質の豊富な癌における糖質抗原も標的とすることができることが言及される。そのような抗原には、たとえば、CEA、CA−125、TADG78、シアリルルイス−X(CD15)が挙げられる。

0151

実施形態すべてにおいて、ネイティブJ鎖を修飾するために使用される結合部分(結合単位)はJ鎖の前または後に導入されてもよい。従って、CD3結合特異性を伴った修飾J鎖は抗CD3scFv−JまたはJ−抗CD3scFvの構成を有してもよい。C末端にてJ鎖を含む抗CD3単鎖Fv(抗CD3scFv−J)の配列(配列番号46)及び構造を図8に示す。N末端にてJ鎖を含む抗CD3単鎖Fv(J−抗CD3scFv)の配列(配列番号47)及び構造を図9に示す。その高い結合活性の故に、そのような抗体は二重特異性のIgG抗体よりも優れている。たとえば、その結果、低レベルのCD20の発現を特徴とするリツキサン耐性バーキットリンパ腫細胞のようなコピー数の少ない標的を標的とするのにそれらは好適である。加えて、修飾J鎖を含む本明細書のIgM、IgA、IgG/IgM及びIgG/IgA抗体は、二重特異性のIgG抗体に比べて大きく向上した効能を有する。

0152

修飾J鎖を伴った抗体の医薬組成物
治療用途について、修飾J鎖を含む抗体を医薬組成物に製剤化してもよい。本発明の医薬組成物は当該技術で既知の種々の方法によって投与することができる。技量のある熟練者によって十分に理解されるように、投与の経路及び/または方式は標的の疾患または状態及び所望の成績に応じて変化するであろう。投与の特定の経路によって本発明の化合物を投与するには、その不活化を防ぐ物質によって化合物を被覆する、またはその物質と化合物を同時投与することが必要であってもよい。たとえば、化合物は、適当なキャリア、たとえば、リポソームまたは希釈剤にて対象に投与されてもよい。薬学上許容可能な希釈剤には生理食塩水及び水性緩衝溶液が挙げられる。医薬キャリアには、無菌水溶液または水性分散液及び無菌の注射用溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。薬学上活性のある物質のためのそのような媒体及び作用剤の使用は当該技術で既知である。

0153

組成物は、たとえば、保存剤湿潤剤乳化剤及び/または分散剤のような補助剤も含有してもよい。微生物の存在の予防は、無菌化手順によって、及び種々の抗菌剤抗真菌剤、たとえば、パラベンクロロブタノールフェノールソルビン酸等の包含によっての双方で保証されてもよい。等張剤、たとえば、糖類、塩化ナトリウム等を組成物に含めることも望ましくてもよい。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる作用剤の包含によって注射用医薬形態延長された吸収がもたらされてもよい。

0154

本発明の医薬組成物における有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者のための所望の治療応答、組成物及び投与の方式を達成するのに有効である有効成分の量を得るために変化してもよい。選択される投与量レベルは、採用される本発明の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、採用される特定の化合物の排泄の速度、治療の持続時間、採用される特定の化合物と併用して使用される他の薬剤、化合物及び/または物質、治療される患者の年齢性別、体重、状態、全身状態及び既往症、及び医療技術で周知の同様の因子を含む種々の薬物動態因子に左右されるであろう。

0155

組成物は無菌でなければならず、且つ、組成物が注射器によって送達可能な程度に流体でなければならない。水に加えて、キャリアは好ましくは等張の緩衝化された生理食塩水溶液である。

0156

以下の実施例の配列表及び図は本発明の理解に役立つように提供され、その真の範囲は添付のクレームで述べられる。本発明の精神から逸脱することなく述べられた手順にて改変を行うことができることが理解される。

0157

本発明のさらなる詳細は以下の非限定の実施例によって説明される。

0158

実施例1
CD3を結合する修飾J鎖を含む二重特異性抗CDIMIgM抗体の調製
(1)設計された変異を持つDNA構築物の生成
(a)DNA構築物の合成:設計された変異を持つDNA構築物はすべて、各発現ベクターへのサブクローニング用の両端での適合性の制限部位と共に供給業者(Genescript)によって合成される。
(b)発現ベクターの構築:合成されたDNA構築物を1μg/mlでTris−EDTA緩衝液再懸濁する。DNA(1μg)を酵素消化に供し、合成された遺伝子を電気泳動によってキャリアプラスミドDNAから分離する。消化されたDNAを標準的な分子生物学の技法によって事前に消化したプラスミドDNA(J鎖についてはpCAGGS、Gene,108(1991),193−200)にライゲーションする。ライゲーションしたDNAでコンピテント細菌を形質転換し、複数の選抜抗生剤を伴ったLBプレートに播く。幾つかの細菌コロニーを採取し、標準的な分子生物学の技法によってDNA調製物を作製する。調製されたDNAを配列決定によって検証する。設計されたDNA配列と100%一致したDNA配列を持つ細菌クローンだけをプラスミドDNAの調製及びその後の細胞の形質移入に使用する。
(c)異なるJ鎖:J鎖変異体がIgMと結合することができることを実証するために、抗CD3抗体(OKT3scFv)を組み込む別個融合部位を持つ2つの異なるJ鎖変異体を構築する。
(i)この構築物は、ヒトJ鎖のN末端に融合されたOKT3(抗CD3)のscFvで構成される(CD3scFv−15aaリンカー−J)。
QVQLQQSGAELARPGSVMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPDGGGSEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH−(配列番号46)

0159

この構築物は、約45kDの分子量を有し、CD3の可溶性イプシロン鎖(Sino Biological)またはT細胞に結合することができ、及び抗mycモノクローナル抗体4A6または他の抗myc抗体に結合することができる。
(ii)この構築物は、ヒトJ鎖のC末端に融合されたOKT3(抗CD3)のscFvで構成される(J−15aaリンカー−CD3scFv)。
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPDGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH−(配列番号47)

0160

このJ−CD3scFv構築物は約45kDの分子量を有し、CD3の可溶性イプシロン鎖(Sino Biological)またはT細胞に結合することができ、及び抗mycモノクローナル抗体4A6または他の抗myc抗体に結合することができる。
(d)IgM重鎖:この重鎖構築物は、B細胞の表面上のCDIMを結合するIGM55.5についての完全長μ鎖を有する。
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGRMAWGASVNFDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQAGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY(配列番号3)。

0161

この重鎖構築物は、分子量約64kDを有し、軽鎖と同時発現させると、得られるIgMはCDIM陽性B細胞に結合することができる。
(e)B細胞の表面上のCDIM(細胞死誘導分子)を結合するIGM−55.5として知られるIGM−55.5の軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号5)

0162

軽鎖構築物は分子量約24kDを有し、適当な重鎖(配列番号3)と同時発現させるとCDIM陽性B細胞に結合することができる。

0163

(2)タンパク質の発現、精製及び性状分析
(a)形質移入:重鎖、軽鎖及び修飾J鎖のDNAでCHO細胞に形質移入する。発現ベクターのDNAを通常1:1:1の比率でPEIと混合し、次いでCHO−S細胞に加える。CHO−S細胞によるPEI形質移入は、確立された技法(「BioTechnology and Bioengineering,Vol.87,553−545」を参照のこと)に従って実施する。
(b)免疫沈降
(i)Capture SelectIgM(BAC、Thermo Fisher):製造元プロトコール(GE Life Sciences)に従ってCapture Select IgM親和性マトリクスによる免疫沈降によって、形質移入したCHO細胞上清からのIgMタンパク質を部分的に精製する。室温にて2時間インキュベートした後、遠心分離によって親和性マトリクスを上清から分離する。マトリクスをPBSで3回さらに洗浄した後、PBSを慎重に取り除く。捕捉したタンパク質を、NuPageLDSタンパク質緩衝液(Life Technology)と共に5分間インキュベートすることによってマトリクスから溶出する。

0164

(ii)抗mycアガロース親和性マトリクス(Sigma):製造元のプロトコールに従って抗myc親和性マトリクスによる免疫沈降によって、形質移入したCHO細胞上清からのIgMタンパク質を部分的に精製する。室温にて2時間インキュベートした後、遠心分離によって親和性マトリクスを上清から分離する。マトリクスをPBSで3回さらに洗浄した後、最後の洗浄後PBSを慎重に取り除く。捕捉したタンパク質を、NuPageLDSタンパク質緩衝液(Life Technology)と共に5分間インキュベートすることによってマトリクスから溶出する。

0165

(c)ゲル電気泳動
(i)非還元性SDS−PAGE

0166

(ii)非還元性SDS−PAGEはサイズに従ってネイティブIgM及びその変異体形態を分離する。ホモ二量体の重鎖及び軽鎖で構成される五量体IgMはおよそ1,000,000の分子量のタンパク質バンドを生じる。NuPageLDS試料緩衝液(Life Technologies)を25℃で30分間IgMタンパク質試料に加えた後、ゲル上に負荷する。NativePage Novex 3−12%のBis−Trisゲル(Life Technologies)をNovex Tris−酢酸SDS泳動緩衝液(Life Technologies)と共に使用する。染料の先端がゲルの底に達するまでゲルを泳動させる。

0167

(iii)還元性SDS−PAGE:NuPageLDS試料緩衝液(Life Technologies)及びNuPage還元剤ジチオスレイトール(Life Technologies)をIgMタンパク質試料に加え、80℃に10分間加熱した後、NuPage Novex 4−12%のBis−Trisゲル(Life Technologies)上に負荷する。NuPageMESSDS泳動緩衝液(Life Technologies)をゲル電気泳動に使用する。染料の先端がゲルの底に達するまでゲルを泳動させる。電気泳動が完了した後、ゲルを装置から外し、コロイドブルー染色(Life Technologies)を用いてゲルを染色する。
(iv)ウエスタンブロット検出:電気泳動が完了した後、ゲルをXCell SureLock Mini−セルから外す。30ボルトで1時間PVDF膜に移す(Life Technologiesのマニュアルを参照)。PBST中3%BSA20mLにて25℃で1時間ブロックする。

0168

抗J鎖のウエスタンブロットについては、PBST中3%BSAにて1:500での抗J(SP105,Thermo Fisher)を4℃で一晩加える。室温にてPBSTで4回洗浄する。PBST中3%BSAにて1:5,000でのHRP−ヤギ抗ウサギIgG(Jackson Immunology)を室温で1時間加える。室温にてPBSTで4回洗浄する。HRP化学発光基質(Thermo Fisher)10mlを10分間加えた後、ブロットフィルム露光する。抗J鎖抗体は未修飾J鎖(図6)または修飾J鎖(図7)と同時発現したIgMとのみ反応する。

0169

抗mycのウエスタンブロットについては、PBST中3%BSAにて1:200での抗myc(4A6、Millipore)を4℃で一晩加える。室温にてPBSTで4回洗浄する。PBST中3%BSAにて1:5,000でのHRP−ヤギ抗マウスIgG(Jackson Immunology)を室温で1時間加える。室温にてPBSTで4回洗浄する。HRP化学発光基質(Thermo Fisher)10mLを10分間加えた後、ブロットをフィルムに露光する。抗myc抗体はmycタグを持つ修飾J鎖とのみ反応する(図2)。

0170

(3)二重特異性機能解析
(a)標的結合FACS解析:T細胞株(Jurkat、CD3陽性細胞株)及びB細胞株(Nalm6、陰性対照細胞株)への抗体の結合によって、T細胞に結合するCD3scFv−Jを伴ったIGM−55.5またはJ−CD3scFvを伴ったIGM−55.5を確認する。洗浄の後、ローダミン標識した4A6を細胞浮遊液に加える。細胞の標的結合は、CD3抗原を伴ったまたは伴わない陽性対照細胞及び陰性対照細胞双方のMFIによって検出される。陽性細胞株(Daudi、陽性細胞株)及び陰性細胞株(Peer)への抗体の結合によって、CDIM発現細胞に結合するCD3scFv−Jを伴ったIGM−55.5またはJ−CD3scFvを伴ったIGM−55.5を確認する。洗浄後、ローダミン標識した4A6を細胞浮遊液に加える。細胞の標的結合は、CDIM抗原を伴ったまたは伴わない陽性細胞及び陰性対照細胞双方のMFIによって検出される。
(b)共培養におけるT細胞が介在するB細胞の殺傷のFACS解析:CD20IgM×J−野生型またはCD20IgM×CD3−J鎖と共に、CD19+CD20+B細胞株であるRajiをCD8+細胞溶解性T細胞株であるT−ALLと37℃、5%CO2にて24時間共培養した。細胞を回収し、CD3に対する蛍光抗体(552852/BD Biosciences)及びCD19に対する蛍光抗体(555413/BD Biosciences)によって染色し、フローサイトメトリーによって解析し、生きているB細胞を評価した。
(c)B細胞の補体依存性の細胞傷害:96ウェルハーフエリアホワイトプレートにて25,000個/ウェルでCD20+細胞株であるRamosを播いた。抗体及びヒト補体(最終5%、Quidel)を加え、補体依存性の細胞傷害を開始し、細胞タイターGlo及び製造元のプロトコールを用いて生細胞の数を測定した。ウェル当たり0.1秒の積分時間を用いたEnvisionマルチモドリーダー(Perkin Elmer)にて発光を測定した。薬剤を加えなかったウェルに対して発光値基準化すること(相対発光単位、RLU)によって生細胞の比率を算出した。GraphPad Prismと、それぞれ100%及び0%で固定された最上及び最下の値を伴った4パラメータ適合とを用いてデータを解析した。

0171

上述のもののような当該技術で既知の技法を用いて多重特異性結合解析及び多重特異性機能解析を同様に行うことができる。

0172

実施例2
抗CD3結合scFvを保有する修飾J鎖を伴った二重特異性抗CD20−IgMの分子クローニング、発現及び精製
この実施例は、異なるB細胞抗原(CD20)を標的とするさらなるIgM抗体及びCD3に結合する修飾J鎖の分子クローニングの調製、発現及び精製を記載する。実施例1にて記載されたような方法を用いて以下の重鎖及び軽鎖の配列に相当するDNAを調製した。
配列番号48:抗CD20抗体(リツキシマブ)のIgM軽鎖の配列
DMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号49:抗CD20抗体(リツキシマブ)のIgM重鎖の配列
MGWSYIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY

0173

これらの重鎖及び軽鎖に相当するDNAと同様に野生型(wt)J鎖、実施例1で記載されたO15JまたはJ15OのJ鎖配列に相当するものをHEK293細胞に同時形質移入し、タンパク質を発現させ、前に記載されたようなラクダ樹脂を用いて精製した。図13に示すように4つのタンパク質はすべて上手く発現する。J鎖を伴わない抗CD20のIgM六量体は、野生型J鎖を伴ったIgM五量体について、並びに抗CD3scFvがいずれかの方向でJ鎖に連結されている(O15JまたはJ15O)二重特異性IgMについてのJ鎖含有五量体から明らかに分割される。

0174

実施例3
異なる抗CD3結合scFvを保有する修飾J鎖を含む二重特異性抗CD20−IgMの分子クローニング、発現及び精製
二重特異性IgMの集合体が、実施例1及び2で使用されたものとは異なる配列の抗CD3scFvを保有する修飾J鎖によって実現可能であることを立証するために、抗体ビシリズマブ(Nuvion)に由来する可変領域を保有するJ鎖を機能させた。以下に示すのは、2つの異なる方向で15aaを含有するリンカーを介してJ鎖に融合されるビシリズマブ(V)に相当するscFvを伴った2つのJ鎖の配列−V15J及びJ15Vである。
配列番号50:V15JについてのJ鎖の配列
MGWSYIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
配列番号51:J15VについてのJ鎖の配列
MKNHLLFWGVLAVFIKAVHVKAQEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPDGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK

0175

実施例1に記載されたように、これらの配列に相当するDNAを合成し、抗CD20のIgMの重鎖及び軽鎖と共にHEK293細胞に形質移入し、タンパク質を産生させ、次いでIgMに特異的なラクダ抗体親和性マトリクスを用いて精製した。図13に示すように、15aaのリンカーと共に新規の抗CD3scFvに融合されたJ鎖はIgMに組み込むことができ、相当するJ鎖を持つ二重特異性IgMの五量体形態はJ鎖を伴わない六量体形態から明らかに区別できる。

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